ES2277099T3

ES2277099T3 - Inmunoadyuvante.

Info

Publication number: ES2277099T3
Application number: ES03746173T
Authority: ES
Inventors: Tadao Ohno; Eiji c/o RIKEN TSUKUBA INSTITUTE UCHIMURA; Lan c/o RIKEN TSUKUBA INSTITUTE HUANG; Ming c/o RIKEN TSUKUBA INSTITUTE KUANG
Original assignee: Cell-Medicine Inc; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Cell-Medicine Inc; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2002-04-18
Filing date: 2003-04-15
Publication date: 2007-07-01
Anticipated expiration: 2023-04-15
Also published as: JP2003306444A; KR20050026382A; DE60309307T2; JP3492671B2; KR100922675B1; EP1495767A1; US20060008478A1; EP1495767B1; CN1305528C; AU2003235158A1; CA2482929A1; CA2482929C; CN1646159A; WO2003086455A1; ATE343397T1; EP1495767A4; AU2003235158A8; DE60309307D1

Abstract

Inmunoadyuvante para administración a un tejido tumoral desnaturalizado por un medio físico, que comprende: precipitados formados mediante coacervación de (a) una proteína soluble, siempre que se excluya una proteína soluble contenida en la tuberculina, y (b) un mucopolisacárido y que comprende, además: (c) una proteína soluble contenida en la tuberculina en el cual dicha (c) es coprecipitada con los precipitados.

Description

Inmunoadyuvante.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un inmunoadyuvante.

Antecedentes de la técnica

La tuberculina se ha utilizado desde hace tiempo como un reactivo de prueba para detectar una infección anamnéstica con tuberculosis Micobacterium o para detectar una conversión positiva después de administración de Micobacterium bovis BCG (en lo que sigue abreviada como "BCG"). Una tuberculina purificada obtenida por purificación de componentes proteicos en tuberculina bruta a través de precipitación de sulfato amónico es considerablemente segura, ya que no se inducen respuestas inflamatorias hipersensibles de la piel, incluso cuando la propia tuberculina se administra repetidamente a un humano, aunque algún efecto elevador de tensión se ha observado en la denominada prueba de reacción a tuberculina (Singh, D. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. Sep. 15, 2001; 164(6):962-4).

Los inventores de la presente hallaron que pueden inducirse eficazmente inmunorreacciones antitumorales contra células tumorales mediante administración de un tejido tumoral solidificado o microparticulado a un cuerpo, junto con al menos un tipo de citoquina o inductor de citoquina (PCT/JPOO/00692). También hallaron que en el proceso anterior puede inducirse una potente inmunorreacción antitumoral contra células tumorales mediante administración simultánea de una tuberculina purificada en forma soluble como un inmunoadyuvante general (PCT/JP00/0692). Según se mencionó anteriormente, los componentes de la tuberculina pueden utilizarse como un inmunoadyuvante. Sin embargo, dado que los componentes de la tuberculina son solubles, presentan el inconveniente de que desaparecen rápidamente de la zona de administración por difusión.

Es sabido que los componentes en un filtrado de un cultivo de M. tuberculosis promueven reacciones de células T después de ligarse a micropartículas de poliestireno, aunque presenten solamente una débil actividad adyuvante en estado disuelto (Wilkinson, K. A., et al., J. Immunol. Methods, 235:1-9, 2000). Cuando un adyuvante en estado disuelto se inmoviliza sobre un portador adyuvante insoluble, el adyuvante no desaparece rápidamente por difusión y por ello presenta una potente actividad adyuvante. Sin embargo, aunque las micropartículas de poliestireno en este producto de inmovilización son fagocitadas por las células que presentan antígenos, estas no son degradadas en las células y constituyen plásticos de permanencia indeseable en un cuerpo.

Como forma de resolver el problema mencionado, se cita un método en dicha literatura en el que los componentes de un filtrado de un cultivo de bacteria se ligan a micropartículas de un polímero sintético biodegradable (Vordermeier, H. M., et al., Vaccine, 13, 1576-1582, 1995; Ertl, H. C., et al., Vaccine, 14, 879-885, 1996; Jones D. H., et al., J. Biotechnology, 44, 29-36, 1996; Venkataprasad, N., et al., Vaccine, 17, 1814-1819, 1999). Sin embargo, es sabido que el polímero sintético descrito, por ejemplo, poli(DL-Iáctido co-glicólido) (PLG), genera ácido láctico tras degradación, y ello resulta en acidificación del entorno local en el que tiene lugar la degradación, y por ello este método es también indeseable para los cuerpos vivos.

La solicitud de patente europea EP 1159967 describe inmunoadyuvantes compuestos por GM-CSF o IL-2 incorporados en microesferas de heparina/albúmina de suero humano, que se utilizaron como vacuna en combinación con células Hepa 1-6 fijas o tejido tumoral fijo, respectivamente, y el adyuvante TiterMax Gold o tuberculina, respectivamente. En el documento se demuestra la eficacia terapéutica de la vacuna. Además, se describen procedimientos para preparar micropartículas elaboradas a partir de material tumoral solidificado y métodos para fijar antígenos tumorales solubles a micropartículas sólidas. Las células pueden inactivarse por medios físicos.

Por lo tanto, un adyuvante que sea sólido y biodegradable y esté libre de las reacciones contrarias antes mencionadas ha devenido deseable en el campo de la inmunología tumoral. Además, entre las técnicas convencionales, no está disponible inmunoadyuvante alguno que pueda eficazmente estimular inmunorreacciones antitumorales contra células tumorales vivas cuando se administra a un tejido desnaturalizado, cuyo tejido se obtiene previamente mediante desnaturalización física de un tejido tumoral o células tumorales que contienen complejos y diversos antígenos tumorales en el cuerpo de un individuo de un animal singeneico.

Descripción de la invención

Según se mencionó anteriormente, la tuberculina es muy segura incluso cuando se administra repetidamente a un humano, aunque la tuberculina posee solamente una actividad adyuvante débil en estado disuelto. Un objetivo de la presente invención es proporcionar, mediante la utilización de tuberculina, un inmunoadyuvante que puede mostrar eficazmente una actividad adyuvante potente, al tiempo que evita condiciones indeseables para los cuerpos
vivos.

Los inventores de la presente invención realizaron diversas investigaciones para alcanzar el anterior objetivo. Como resultado, hallaron que una actividad adyuvante potente se obtuvo con éxito mediante la provisión de una preparación de liberación sostenida de tuberculina. Además, durante el estudio de la preparación de liberación sostenida de tuberculina, los inventores de la presente invención también hallaron que, cuando se mezclan albúmina y heparina para formar precipitados mediante coacervación, las proteínas de la tuberculina se incorporan a esos precipitados, y con ello se forman micropartículas insolubles, y que cuando esas micropartículas insolubles se administran a un cuerpo junto con un antígeno y tuberculina soluble purificada presentan un potente efecto preventivo de tumores, y cuando se administran en vivo a un tejido tumoral térmicamente desnaturalizado se inducen con éxito inmunorreacciones antitumorales. La presente invención se logró a partir de estos hallazgos.

La presente invención proporciona, por tanto, un inmunoadyuvante, que comprende:

precipitados formados mediante coacervación de

(a): una proteína soluble (siempre que se excluya una proteína soluble contenida en la tuberculina), y

(b): un mucopolisacárido

y que comprende, además:

(c): una proteína soluble contenida en la tuberculina

en el cual dicha (c) es coprecipitada con los precipitados.

De acuerdo con realizaciones preferibles de la anterior invención, se proporciona el inmunoadyuvante antes mencionado, en el cual la proteína soluble del componente (a) es albúmina, y el mucopolisacárido del componente (b) es heparina; el inmunoadyuvante antes mencionado, en el cual los precipitados están entrecruzados con un agente de reticulación intermolecular para proteínas; el antes mencionado inmunoadyuvante, en el cual el citado componente (c) consiste en una combinación de una proteína soluble contenida en la tuberculina y una proteína soluble que presenta antigenicidad; y el antes mencionado inmunoadyuvante, en el cual la proteína soluble que presenta antigenicidad está derivada de un tejido tumoral, célula tumoral, componente de célula tumoral, y/o péptido derivado de antígeno tumoral/antígeno tumoral.

Desde otro aspecto, la presente invención proporciona un inmunoadyuvante en forma de una micropartícula insoluble que comprende (c) una proteína soluble contenida en la tuberculina y (d) una molécula proteica soluble, en la cual los componentes (c) y (d) están entrecruzados con un agente de reticulación intermolecular para proteínas. Según una realización preferida de esta invención, se proporciona el inmunoadyuvante antes mencionado en el cual la molécula proteica soluble es colágeno.

De acuerdo con otras realizaciones, se proporciona el inmunoadyuvante antes mencionado que se administra en vivo a un mamífero, incluyendo el humano, después de mezclarse con un antígeno y se utiliza para inducir una inmunorreacción sistémica contra dicho antígeno; y el inmunoadyuvante antes mencionado, en el cual el antígeno se deriva de un tejido tumoral, célula tumoral, componente de célula tumoral, y/o péptido derivado de antígeno tumoral/antígeno tumoral.

La presente invención proporciona, además, una vacuna antitumoral que contiene el antes mencionado inmunoadyuvante. Según realizaciones preferibles de esta invención, se proporciona la vacuna antitumoral antes mencionada, destinada a inducir una inmunorreacción antitumoral mediante administración a un tejido tumoral desnaturalizado por un medio físico; la antes mencionada vacuna antitumoral, en la cual el medio físico está seleccionado dentro del grupo formado por irradiación de microondas, coagulación por radiofrecuencia, criocoagulación, calentamiento por bisturí eléctrico, inyección de agua caliente, inyección de alcohol, embolización, irradiación mediante rayos radioactivos, irradiación mediante rayos láser y disrupción ultrasónica; la antes mencionada vacuna antitumoral, destinada a estimular una inmunorreacción en vivo mediante administración después de mezcla con una célula inmunocompetente fuera del cuerpo; la antes mencionada vacuna antitumoral, en la cual la célula inmunocompetente está seleccionada dentro del grupo formado por célula dendrítica, linfocito B, linfocito T y célula asesina (citocida) natural; y la antes mencionada vacuna antitumoral, destinada a mezclarse extracorporalmente con una célula inmunocompetente y un antígeno y luego ser administrada.

Además, desde otros aspectos, se proporciona un procedimiento para inducir una inmunorreacción sistémica, que comprende la etapa de administrar el inmunoadyuvante antes mencionado a un mamífero, incluyendo el humano; un procedimiento para el tratamiento terapéutico de un tumor, que comprende la etapa de administrar la vacuna antitumoral antes mencionada a un tejido tumoral desnaturalizado por un medio físico; un procedimiento para inducir una inmunorreacción antitumoral, que comprende la etapa de administrar la vacuna antitumoral antes mencionada a un tejido tumoral desnaturalizado por un medio físico; y un procedimiento para estimular una inmunorreacción en vivo, que comprende las etapas de mezclar la vacuna antitumoral antes mencionada ex vivo con una célula inmunocompetente, y luego administrar la mezcla a un cuerpo de un mamífero, incluyendo el humano.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el efecto supresor de la vacuna antitumoral de la presente invención contra la proliferación de cáncer de hígado. La línea de puntos indica la tasa de supervivencia acumulada (grupo de control) y la línea sólida indica la tasa de supervivencia acumulada (grupo administrado con la vacuna de tuberculina microparticulada). La línea de puntos finos indica la del grupo de control positivo.

La Figura 2 representa el efecto preventivo de la vacuna antitumoral de la presente invención contra la recurrencia tumoral, que fue administrada a un tejido tumoral sometido a coagulación por microondas.

Forma preferible de realizar la invención

El inmunoadyuvante de la presente invención se caracteriza porque comprende precipitados formados mediante coacervación de:

(a): una proteína soluble (excepto una proteína soluble contenida en la tuberculina), y

(b): un mucopolisacárido, y

(c): una proteína soluble contenida en la tuberculina

en el cual dicha (c) es coprecipitada con los precipitados.

La combinación de los antes mencionados (a) proteína soluble y (b) mucopolisacárido no está particularmente limitada, siempre que ambos produzcan precipitados mediante coacervación bajo una condición bien conocida por los expertos en la materia. Una explicación técnica de la coacervación se describe en detalle en, por ejemplo, la patente US-5759582. Sin embargo, este término no debe interpretarse en sentido limitativo y debe entenderse en su más amplio significado. Por ejemplo, pueden utilizarse albúmina y heparina preferiblemente como (a) la proteína soluble y el mucopolisacárido, respectivamente, no obstante la combinación de (a) la proteína soluble y (b) el mucopolisacárido no se limita a la combinación antes mencionada. Como proteína soluble contenida en la tuberculina puede utilizarse, por ejemplo, el total de proteínas contenidas en tuberculina purificada, así como todo o parte de las proteínas solubles preparadas a partir de tuberculina por un método bien conocido por los expertos en la materia. Mediante agitación de las antes mencionadas tres clases de componentes, se forman precipitados mediante coacervación de los componentes (a) y (b), y en este proceso, el componente (c) se incorpora a los precipitados y es coprecipitado para producir los precipitados.

La proporción de (c) la proteína soluble contenida en la tuberculina y (a) la proteína soluble no está particularmente limitada siempre que la proporción esté seleccionada dentro de un intervalo en el que (a) la proteína soluble y (b) el mucopolisacárido produzcan coacervación. Por ejemplo, cuando se utiliza como proteína soluble una solución al 2,5% de albúmina de suero humano a pH 2,5, se utiliza una solución de heparina comercialmente disponible de aproximadamente 5 mg/ml como el mucopolisacárido, 2,5 \mug de una proteína soluble de la tuberculina se disuelven en 600 \mul del mucopolisacárido, y la solución de albúmina de suero humano antes mencionada se añade por goteo a la mezcla con agitación a diferentes proporciones en volumen de 1/1,75, 1/1,5, 1/1,25 y 1/1 para formar micropartículas mediante coacervación. Es preferible que cada suspensión sea centrifugada y cuantificado el contenido de proteína en el sobrenadante, y se elige una proporción de volumen en la que la mayor parte de la proteína mezclada se incorpore a las micropartículas. Debe advertirse que la proporción entre los componentes (a) y (c), las condiciones de coacervación y similares pueden seleccionarse adecuadamente por los expertos en la materia. El tamaño de partícula en las micropartículas contenidas en los precipitados resultantes es generalmente de 1 \mum o menor, pero no queda limitado a un tamaño particular.

Los precipitados resultantes, preferiblemente precipitados en forma de micropartículas, pueden utilizarse como un inmunoadyuvante sin tratamiento alguno. Si es necesario, los precipitados pueden ser lavados con agua destilada. Además, para estabilización de los precipitados, las micropartículas insolubles pueden prepararse mediante formación de entrecruzamientos bajo tratamiento con un agente de reticulación intermolecular para proteínas. El tipo de agente de reticulación intermolecular para proteínas no está particularmente limitado y cualquier agente bien conocido por los expertos en la materia puede utilizarse en una forma bien conocida. Por ejemplo, cuando a 20 mg/ml de una solución acuosa de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida se añaden proteínas a una concentración final de 0,8 a 1,5 mg/ml con agitación mediante utilización de una mezcladora vórtex, y luego la mezcla se deja reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos, se forman entrecruzamientos suficientemente estables entre las moléculas de proteína en los precipitados. Sin embargo, la formación de entrecruzamientos no se limita a la aplicación de la condición particular antes mencionada y al uso del particular agente de reticulación intermolecular para proteínas. Según se mencionó anteriormente, el inmunoadyuvante obtenido, preferiblemente el sometido a un tratamiento de reticulación, no se disuelve incluso cuando se lava con agua, y puede utilizarse preferiblemente como el inmunoadyuvante de la presente invención.

Además, de acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, un inmunoadyuvante que contiene una proteína soluble que presenta antigenicidad y una proteína soluble contenida en la tuberculina que presenta actividad adyuvante, puede producirse mediante la obtención de precipitados en la misma forma antes descrita, excepto que la proteína soluble que presenta antigenicidad y la proteína soluble contenida en la tuberculina están mezcladas de antemano, y luego la mezcla resultante se utiliza en lugar de la anterior (c).

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Desde otro aspecto, la presente invención también proporciona un inmunoadyuvante en forma de micropartículas insolubles, que comprende una proteína soluble contenida en la tuberculina y un molécula proteica soluble, ambas de las cuales están entrecruzadas mediante un agente de reticulación intermolecular para proteínas. Como molécula proteica soluble, pueden utilizarse moléculas proteicas solubles biodegradables. Por ejemplo, puede utilizarse colágeno. Sin embargo, la molécula proteica soluble no está necesariamente limitada al colágeno y puede utilizarse cualquier molécula proteica soluble que sea degradable en vivo. El tipo de agente de reticulación intermolecular para proteínas no está particularmente limitado, y puede utilizarse cualquier agente bien conocido por los expertos en la materia en una forma bien conocida. Por ejemplo, pueden utilizarse 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y similares. En general, un tamaño de partícula de las micropartículas es preferiblemente de 1 \mum o menos, y sin embargo, no se limita a ese tamaño particular.

El inmunoadyuvante de la presente invención puede utilizarse como un inmunoadyuvante general. El inmunoadyuvante puede simplemente ser mezclado con un antígeno y administrado a un cuerpo de un humano o un animal, con lo cual pueden inducirse inmunorreacciones sistémicas contra el antígeno. Cuando el antígeno se deriva de tejido tumoral, célula tumoral, componente de célula tumoral, y/o péptido derivado de antígeno tumoral/antígeno tumoral, el inmunoadyuvante puede utilizarse como una vacuna antitumoral. Por ejemplo, mediante mezcla del inmunoadyuvante de la presente invención con células cancerosas aisladas desde un paciente e inmovilizadas, y luego administrando la mezcla intracutáneamente al paciente, pueden inducirse en vivo inmunorreacciones antitumorales contra las células cancerosas en el paciente. Sin embargo, el procedimiento de utilización del inmunoadyuvante de la presente invención no se limita al procedimiento antes mencionado y puede aplicarse cualquier procedimiento convencional que utilice un inmunoadyuvante.

Además, mediante desnaturalización de un tejido tumoral en el cuerpo de un paciente por un medio físico y luego administrando el inmunoadyuvante de la presente invención al tejido, pueden inducirse inmunorreacciones antitumorales contra células tumorales sobrevivientes en el cuerpo del paciente. El medio físico para desnaturalizar el tejido tumoral no está particularmente limitado, y sus ejemplos incluyen, por ejemplo, medios de irradiación de microondas, coagulación por radiofrecuencia, criocoagulación, calentamiento por bisturí eléctrico, inyección de agua caliente, inyección de alcohol, embolización, irradiación mediante rayos radioactivos, irradiación mediante rayos láser, disrupción ultrasónica, y similares. Sin embargo, los medios no se limitan a esos ejemplos, y cualquier otro podría utilizarse siempre que pueda inducir la muerte celular de las células tumorales en un tejido tumoral. Pueden utilizarse dos o más tipos de medios físicos en apropiada combinación.

Por ejemplo, cuando un tejido tumoral es coagulado por calor mediante irradiación de microondas, y el inmunoadyuvante de la presente invención se administra en el tejido coagulado, pueden inducirse inmunorreacciones antitumorales contra las células tumorales que sobreviven dentro o alrededor del tejido tumoral. Cuando se administra el inmunoadyuvante de la presente invención, es también preferible administrar una solución de tuberculina al mismo tiempo. Sin embargo, el método de administrar el inmunoadyuvante de la presente invención no se limita a las realizaciones antes mencionadas. Cualquier método puede aplicarse siempre que el método pueda proporcionar un entorno en el cual el inmunoadyuvante de la presente invención se incorpore a células con antígenos que migren hacia el tejido tumoral desnaturalizado junto con los antígenos tumorales contenidos en el tejido tumoral desnaturalizado, o el inmunoadyuvante de la presente invención puede estimular directamente células portadoras de
antígenos.

Además, pueden ser también estimuladas inmunorreacciones en el cuerpo mediante previa mezcla extracorpórea del inmunoadyuvante de la presente invención y células inmunocompetentes, y luego administrando la mezcla al cuerpo de un paciente. Como células inmunocompetentes pueden utilizarse preferiblemente células dendríticas, linfocitos B, linfocitos T, y/o células asesinas (citocidas) naturales, o similares. Sin embargo, las células inmunocompetentes no se limitan a dichas células.

Desde otro aspecto adicional, la presente invención proporciona una vacuna que comprende el inmunoadyuvante antes mencionado como un ingrediente activo. Cuando se administra esta vacuna, también pueden ser mezcladas las células inmunocompetentes. Además, puede utilizarse un tejido tumoral y/o células tumorales como antígenos mediante mezcla con la vacuna. Mediante la administración de una vacuna obtenida según se ha descrito a un paciente de quien se deriva el tumor, este tumor puede ser tratado terapéuticamente.

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Ejemplos

La presente invención se explicará más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, el objetivo de la presente invención no se limita a estos ejemplos. El inmunoadyuvante de la presente invención preparado en los ejemplos puede referirse a tuberculina microparticulada (o su sinónimo).

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Ejemplo 1

Efecto supresor de la vacuna antitumoral de la presente invención sobre el crecimiento de cáncer hepático A.- Materiales y procedimientos 1. Preparación del inmunoadyuvante

1) Una solución al 25% de albúmina de suero humano (HSA, Baxter Albumac, Baxter) fue diluida con agua esterilizada hasta una concentración del 2,5% y se ajustó a pH 2,5 con HCl 4 N.

2) La solución resultante al 2,5% de albúmina de suero humano y una solución de heparina (Heparina Novo 1000, 1000 U/ml, aproximadamente 7,69 mg/ml o menos, Aventis Pharma Ltd.) fueron mezcladas previamente en diversas proporciones para determinar las proporciones de mezcla óptimas de la solución de heparina. Se prepararon inicialmente micropartículas con una proporción de mezcla arbitraria y se centrifugaron a 2.500 rpm (1.300 g) durante 15 minutos, y el contenido de proteína en el sobrenadante fue cuantificado mediante utilización del "Protein Assay Kit 1" (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Tokio). Las proporciones óptimas de mezcla se definieron como aquellas que satisfacen la condición bajo la cual no menos del 99,9% de las proteínas mezcladas se incorporó a las
micropartículas.

3) Se suspendió tuberculina [Japan BCG Manufacturing Co., Ltd., tuberculina purificada para diagnosis general (derivado de proteína de tuberculina purificada, PPD) para una persona, cantidad equivalente a 0,25 \mug de un producto estándar] en una solución de heparina para inyección y se añadió por goteo con una solución al 2,5% de albúmina de suero humano en una proporción determinada, con agitación mediante empleo de una mezcladora vórtex.

4) La mezcla se centrifugó a 4.300 rpm (1.300 g) durante 15 minutos, y los precipitados se lavaron dos veces con agua destilada esterilizada y fueron resuspendidos en agua destilada esterilizada.

5) La suspensión se añadió con una solución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, SIGMA, disuelta en agua a 20 mg/mi) en una concentración final de 0,8 a 1,5 mg/ml con agitación mediante empleo de una mezcladora vórtex y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

6) La mezcla se centrifugó a 4.300 rpm (1.300 g) durante 15 minutos, y los precipitados se lavaron 6 veces con agua destilada esterilizada y fueron resuspendidos en solución salina fisiológica esterilizada a la concentración requerida para obtener una suspensión de tuberculina microparticulada.

2. Medida del efecto supresor de la vacuna antitumoral sobre el crecimiento de cáncer hepático en ratones

1) Se inmovilizaron células cancerosas hepáticas Hepa 1-6, cultivadas hasta que resultaron confluentes en un plato de cultivo en plástico que presenta un diámetro de 10 cm, con una solución al 3% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 2 horas. Las células fueron lavadas con tampón salino fosfatado de Dulbecco que contiene calcio y magnesio (PBS(+)), lavadas y esterilizadas adicionalmente con 70% de etanol, y lavadas con esmero nuevamente con PBS(+).

2) Estas células se añadieron con 10 ml por plato de medio DMEM y se incubaron a 37ºC durante 2 días.

3) Las células fueron lavadas con esmero con PBS(+), se añadieron con 3 ml por plato de una solución de poli-L-lisina (25 \mug/ml) y se incubaron durante 2 horas.

4) Las células fueron lavadas con esmero con PBS(+), y luego las células inmovilizadas totales fueron recogidas con un rascador y suspendidas en PBS(+).

5) Un volumen de 200 \mul de la suspensión correspondiente a las células de 4 platos se situó en un tubo Eppendorf, se añadió con 100 \mul de una solución de tuberculina (0,25 \mug/100 \mul PBS(+)) y se incubaron durante 2 horas.

6) La mezcla se añadió con 150 \mul de la suspensión de tuberculina microparticulada (que contiene tuberculina a una concentración de 3 \mug/ml), y adicionalmente se añadió con 50 \mul de PBS(+) para obtener una vacuna de tuberculina microparticulada. De la misma forma, 200 \mul de una solución obtenida mediante dilución de 5 KE/ml OK432 (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Picibanil 5KE) 10 veces con PBS(+) se situaron en un tubo Eppendorf en lugar de la tuberculina microparticulada y PBS(+), para obtener una vacuna para el grupo de control positivo.

7) Nueve ratones singeneicos con células cancerosas hepáticas Hepa 1-6 (C57L/J, de 6 a 9 semanas de edad, machos) fueron inyectados intracutáneamente con 50 \mul por animal de la anterior vacuna de tuberculina microparticulada. Este proceso se repitió una semana más tarde. Nueve ratones en el grupo de control fueron inyectados con solamente tampón salino fosfatado de Dulbecco que no contenía calcio o magnesio (PBS(-)). Además, los animales del grupo de control positivo fueron inyectados con la vacuna para el grupo de control positivo preparada en la anterior etapa 6) de una forma similar.

8) Otra semana más tarde, los animales fueron inyectados subcutáneamente con células Hepa 1-6 (1 x 10^{7} células/0,2 ml PBS(-)) en las patas derechas.

9) Después del anterior desafío, los animales fueron inyectados intracutáneamente con 50 \mul por animal de una vacuna de tuberculina microparticulada preparada de la misma forma que hasta la anterior etapa 6) (siempre que la tuberculina microparticulada utilizada para la preparación de esta vacuna contuviera tuberculina a una concentración de 2 \mug/ml). Los 9 ratones en el grupo de control fueron inyectados solamente con PBS(-). Además, los ratones en el grupo de control positivo fueron inyectados con la vacuna para el grupo de control positivo preparada en la anterior etapa 6) de una forma similar.

10) Posteriormente, se determinó la tasa de supervivencia de los ratones después del crecimiento del cáncer hepático subcutáneo.

B.- Resultados

Los resultados se representan en la Figura 1. Esta figura muestra las curvas de Kaplan-Meier para el grupo de control, el grupo administrado con la vacuna de tuberculina microparticulada y el grupo de control positivo. El grupo administrado con la vacuna de tuberculina microparticulada mostró una tasa de supervivencia mayor que la del grupo de control con una diferencia estadísticamente significativa (prueba log-rank, p<0,0001). Además, el grupo administrado también mostró un efecto antitumoral superior al observado en el grupo de control positivo.

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Ejemplo 2

Prevención del efecto de recurrencia tumoral de la tuberculina microparticulada administrada en tejido tumoral coagulado con microondas A.- Materiales y procedimientos

1. Se preparó tuberculina microparticulada de la misma forma que en la etapa 1 del Ejemplo 1.

2. Fueron inyectados intracutáneamente ratones C57BL/6 (hembras, 6 animales por grupo) con 1 x 10^{6} células cancerosas pulmonares singeneicas (células de carcinoma pulmonar de Lewis) en las patas derechas, y cuando el tamaño del tejido canceroso pulmonar subcutáneo alcanzó aproximadamente 75 mm^{3} al 8º día, los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico. Luego, se recortó la piel alrededor del tejido canceroso pulmonar, y un electrodo tipo Microtaze monoesfera para endoscopia (E-24N, diámetro: 2,4 mm) se insertó en el tejido canceroso de la
sección.

3. El electrodo se conectó al Microtaze (modelo HSE-8M, Azwell Inc.) y el tejido fue irradiado con microondas a 10 W durante 3 minutos hasta que el tejido canceroso mostró aparentemente coagulación completa por calor.

4. La herida fue suturada, y una solución de tuberculina (obtenida por disolución de 25 ng de tuberculina purificada en 25 \mul de solución salina fisiológica) y tuberculina microparticulada suspendida (que contiene 50 ng de tuberculina purificada, suspendida en 5 \mul de solución salina fisiológica) se inyectaron en el tejido canceroso al 10º día. En el 14º día, se repitió nuevamente esta inyección (grupo a). Los ratones en el grupo de control (grupo b) fueron sometidos solamente a irradiación de microondas. Además, se preparó también un grupo de control no irradiado con microondas (grupo c), un grupo administrado con OK-432 (1 KE/25 \mul) en lugar de la tuberculina microparticulada (grupo d) y un grupo administrado con OK-432 (1 KE/25 \mul) en lugar de la solución de tuberculina (grupo e).

5. Posteriormente, se midieron a lo largo del tiempo las variaciones en el tamaño (mm^{3}) del tejido canceroso aumentado a causa de la recurrencia.

B.- Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 2. Cada punto representa un valor medio del tamaño del tejido canceroso pulmonar en 6 ratones. Durante la observación hasta el 33º día después del transplante de las células cancerosas pulmonares, la recurrencia del cáncer de pulmón en los tejidos se suprimió claramente en el grupo "a" en comparación con los grupos "b" y "c". En particular, no se observó recurrencia en cualquiera de los 6 animales en el grupo "a" que recibió la tuberculina microparticulada y la solución de tuberculina, y por tanto el grupo mostró supresión completa. Mientras tanto, en el grupo "d" que no recibió la tuberculina microparticulada y el grupo "e" que no recibió la solución de tuberculina, los tejidos cancerosos mermaron después de la irradiación de microondas y crecieron nuevamente, y cada uno de ellos era un tejido canceroso pequeño. Aunque la proliferación del cáncer se suprimió en comparación con los grupos "b" y "c", se observó recurrencia en 5 de los 6 animales de esos grupos
(Tabla 1).

TABLA 1 Recurrencia después del transplante de células cancerosas pulmonares

Número de ratones, entre 6 animales por grupo, que mostraron recurrencia del cáncer de pulmón

1

Aplicación industrial

El inmunoadyuvante de la presente invención puede mostrar eficazmente una actividad adyuvante potente y evitar condiciones indeseables para cuerpos vivos.

Claims

1. Inmunoadyuvante para administración a un tejido tumoral desnaturalizado por un medio físico, que comprende:

precipitados formados mediante coacervación de

(a): una proteína soluble, siempre que se excluya una proteína soluble contenida en la tuberculina, y

(b): un mucopolisacárido

y que comprende, además:

(c): una proteína soluble contenida en la tuberculina

en el cual dicha (c) es coprecipitada con los precipitados.

2. El inmunoadyuvante según la reivindicación 1, en el cual el medio físico está seleccionado dentro del grupo formado por irradiación de microondas, coagulación por radiofrecuencia, criocoagulación, calentamiento por bisturí eléctrico, inyección de agua caliente, inyección de alcohol, embolización, irradiación mediante rayos radioactivos, irradiación mediante rayos láser y disrupción ultrasónica.

3. Una vacuna antitumoral que comprende el inmunoadyuvante según la reivindicación 1 ó 2.