DE3236298C2

DE3236298C2 -

Info

Publication number: DE3236298C2
Application number: DE3236298A
Authority: DE
Inventors: Masakazu Takasaki Gunma Jp Adachi
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-10-01
Filing date: 1982-09-30
Publication date: 1987-09-24
Also published as: DE3249568A1; ATA363782A; AU554858B2; MX7437E; NZ201112A; NO161601B; SE8204058D0; FR2513882A1; NO822215L; AT382080B; CH655660B; ATA354585A; IT8248724A0; FI77157C; FI822325A0; DE3249568C2; PT75148B; DE3236298A1; FR2513882B1; AR230731A1

Description

Immunansprechende Effektorzellen, insbesondere T-Lymphocyten, die eine Hauptrolle bei einer zellausgelösten Immunreaktion spielen, verursachen eine Zurückweisung von Pfropfstellen aufgrund eines Fremdzellen-Antigens, bewirken jedoch keine merkliche oder nur eine sehr begrenzte Immunoinhibierung gegen Krebszellen. Infolgedessen werden die Krebszellen nicht zerstört, sondern vervielfältigen sich in vivo und verursachen schließlich den Tod des von Krebs befallenen Trägers.

Der hierbei vorhandene Mechanismus ist noch nicht vollständig klar und es sind verschiedene Untersuchungen angestellt worden, um nähere Erkenntnisse zu erlangen über die Art der Materialbasis, die in einem solchen System vorkommt. Z. B. werden Zelloberflächenmarkierungen auf Mäuseleukämiezellen oder Embrionalkarzinomzellen unter Verwendung von Lektinen, wie Dolichos biflorus-Agglutinin (DBA) und Erdnussagglutinin (PNA) in Biochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2) 448-455 (1979), Ibid. 96 (4) 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 473-481 (1981) und Cell 18 183-191, September 1979 beschrieben.

Soweit bekannt ist, sind bisher jedoch noch keine Versuche unternommen worden, um neue Lymphocyten zur Verfügung zu stellen, die Krebszellen spezifisch bekämpfen können, und die Anti-Krebsmittel darstellen.

Untersuchungen über die Immunansprechung des Trägers gegenüber Krebszellen und deren Anwendung zur Behandlung von Krebs haben nun ergeben, daß in einem krebszellenspezifischen Antigen, das nicht in differentierten Normalzellen zu finden ist, ein von Krebszellen abgeleitetes glykoverwandtes Antigen, nachfolgend als GRA bezeichnet, vorhanden ist, das als Immunogen für den Träger wirkt und eine sehr hohe Immunogenität aufweist, das eine Immunreaktion, die spezifisch auf Krebszellen ist, verursacht. Es wurde weiterhin festgestellt, daß dann, wenn man GRA zum Sensibilisieren von Lymphocyten verwendet, man Killerzellen erhält, die spezifisch auf GRA-enthaltende Krebszellen wirken und daß man bei Verabreichung der Killerzellen an einen Träger diese GRA erkennen und auf GRA-enthaltende Krebszellen einwirken, diese zerstören und daß man auf diese Weise eine sehr gute Wirkung bei der Behandlung und Vorbeugung von Krebs erzielen kann.

Die Erfindung betrifft die Krebszellen-cytotoxischen Lymphocyten, die spezifisch gegenüber einem von Krebszellen abgeleiteten glykoverwandten Antigen sind (Anspruch 1), ein Verfahren zur Herstellung der Lymphocyten sowie die Verwendung der Lymphocyten bei der Bekämpfung von Krebs (Ansprüche 2 und 3).

Fig. 1 ist eine Mikrofotografie von Daudi- Krebszellen,

Fig. 2 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen von GRA-1-K-T auf Krebszellen gemäß Fig. 1 zeigt,

Fig. 3 ist eine Mikrofotografie von KATO-III- Zellen,

Fig. 4 ist eine Mikrofotografie, die die Belichtung von Belägen durch GRA-1-K-T auf Krebszellen gemäß Fig. 3 zeigt,

Fig. 5 ist eine Mikrofotografie von BT-I- Krebszellen,

Fig. 6 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T auf den Krebszellen von Fig. 5 zeigt,

Fig. 7 ist eine Mikrofotografie von MKN-45- Krebszellen,

Fig. 8 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T auf Krebszellen gemäß Fig. 7 zeigt,

Fig. 9 ist eine Mikrofotografie von MOLT- Krebszellen,

Fig. 10 ist eine Mikrofotografie, welche die Bildung von Belägen durch GRA-1-K-T auf Krebszellen gemäß Fig. 9 zeigt,

Fig. 11 ist eine Mikrofotografie von BT-1, das mit einer Mischung von unsensibilisierten humanen peripheren Blutlymphocyten behandelt wurde,

Fig. 12 und 13 sind jeweils Mikrofotografien von Krebszellengewebe einer krebsigen Maus, der GRA-M-1-K-T verabreicht wurde,

Fig. 14 ist eine Fotografie und zeigt einen Krebszustand bei einer krebsigen Mäusegruppe, der GRA-M-1 verabreicht wurde,

Fig. 15 ist eine Fotografie und zeigt den Krebszustand bei einer krebsigen Mäusegruppe, der kein GRA-M-1 verabreicht wurde.

Fig. 16 ist eine Mikrofotografie und zeigt Krebszellengewebe einer krebsigen Mäusegruppe, der kein GRA-M-1 verabreicht wurde,

Fig. 17 ist eine Mikrofotografie von Krebszellengewebe einer Gruppe, die mit GRA-M-1 behandelt wurde,

Fig. 18 zeigt ein SDS-Gel-Elektrophorese-Diagramm von GRA unter Verwendung von Protein-Färbung nach der C.B.B.-Methode,

Fig. 19 bis 21 zeigen SDS-Gel. Elektrophorese-Diagramme unter Verwendung von Zuckerfärbungen mittels der PAS-Methode.

Fig. 22 ist eine schematische Darstellung der Ergebnisse vom SDS-Gel-Elektrophoreses- Diagramm von GRA unter Verwendung der Proteinfärbung mittels der C.B.B.-Methode.

Fig. 23 ist eine grafische Darstellung, welche die Tumorwachstumsrate bei C3H/HE/6 Mäusen, denen X5563 Immunmäuse-Milzzellen und Y5563-Zellen transplantiert worden waren.

Das GRA erhält man aus GRA enthaltenden Krebszellen von Menschen oder Tieren, z. B. von kultivierten Krebszellen, transplantierten Krebszellen, spontan auftretenden Krebszellen, durch chemische Substanzen oder durch Viren induzierte Krebszellen oder Krebszellen, die man aus Geweben herausoperiert hat unter Anwendung der folgenden Verfahren.

Zellmembrankomponenten werden von Krebszellen der vorerwähnten Art abgetrennt und mit einem Lektin behandelt, welches sich spezifisch mit terminaler Galaktose oder endständigem N-Acetylgalactosamin verbindet, wobei GRA mit dem Lektin verbunden leicht abgetrennt werden kann (s. J.B.C., 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975); Z. Immunitätsforsch., 138, 423-433 (1966); Br. J. Exp. Pathol., 27, 228-236 (1946); Proc. Nath. Acad. Sci. USA, 75, Nr. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry, 13, 196-204 (1974); und Carbohydrate Research, 51, 107- 118 (1976)).

Die Trennung der Krebszellenmembrankomponenten kann man auf einfache bekannte Weise erzielen, z. B. durch eine Homogenisierungsmethode und eine Solubilisierungsmethode unter Verwendung eines Auflösungsmittels. Vorteilhaft ist es, eine Methode anzuwenden, bei welcher Krebszellen in physiologischer Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Puffer homogenisiert werden, ein Teil des Niederschlags durch beispielsweise Zentrifugenabtrennung gesammelt wird und in physiologischer Kochsalzlösung oder einem Puffer mittels eines Lösungsmittels gelöst wird, worauf man den überstehenden Teil dann beispielsweise durch Zentrifugenabscheidung abtrennt. Als Auflösungsmittel kann man beispielsweise oberflächenaktive Mittel, wie sie allgemein bekannt sind, um Zellmembranen aufzulösen, verwenden, z. B. nichtionische oberflächenaktive Mittel, Digitonin und Harnstoff, oder anionische oberflächenaktive Mittel, z. B. Natriumdodecylsulfonat (SDS).

Aus den so erhaltenen Zellmembrankomponenten kann man GRA abtrennen. Beispiele für solche Verfahren sind eine Affinitätschromatografie, bei der man einen ein Lektin enthaltenden Säulenträger verwendet, eine Immunausfällungsmethode, unter Verwendung von GRA-Antikörper, eine Dialysemethode, eine Gelfiltrationsmethode, eine Elektrophoresemethode oder eine physikalische Ausfällung unter Verwendung eines Zuckerprotein ausfällenden Mittels, z. B. Polyethylenglykol und Aceton, oder eine Kombination solcher Verfahren. Besonders bevorzugt ist die Affinitätschromatografie unter Verwendung einer Säule, die ein Lektin enthält, wobei man den Säulenträger leicht herstellen kann, indem man Lectin auf einem unlöslichen Träger immobilisiert. Die Immobilisierung von Lektin auf einem unlöslichen Träger kann man in bekannter Weise, wie sie für die Immobilisierung von Biosubstanzen angewendet wird, durchführen. Von diesen Methoden wendet man bevorzugt die Cyanobromidaktivierungs-Polysaccharid- Methode und eine Immobilisierungsmethode unter Verwendung von N-Hydroxysuccimidester an. Die Cyanobromidaktivierungs- Polysaccharid-Methode ist eine Methode, bei der ein unlöslicher Träger mit Cyanobromid behandelt wird und das so erhaltene aktivierte Produkt wird dann unter milden Bedingungen einer Kupplungsreaktion mit einem Lektin unterworfen, wobei das Lektin immobilisiert wird. Bei der Behandlung des unlöslichen Trägers mit Cyanbromid wendet man beispielsweise basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid und Natriumhydrogenkarbonat an, um den pH auf 7,5 bis 12 einzustellen und dann behandelt man den Träger in einem Lösungsmittel, wie Wasser, Acetonitril oder einem bei pH 7,5 bis 12 gehaltenen Puffer, z. B. einem 0,1M Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH etwa 8,7) und 0,01M Phosphatpuffer (pH etwa 7,7) bei Raumtemperatur während etwa 1 bis 12 Minuten. Im allgemeinen wendet man vorzugsweise eine dem unlöslichen Träger äquivalente Menge an Cyanbromid an.

Jeder bekannte unlösliche Träger, der gegenüber allen Biosubstanzen eine niedrige nichtspezifische Adsorption zeigt, der eine hohe Porosität hat und der eine funktionelle Gruppe aufweist, die unter milden Bedingungen in der Lage ist, Biosubstanzen zu immobilisieren und der chemisch und physikalisch ausreichend stabil ist, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Verwendbare unlösliche Träger sind beispielsweise Träger, die aus Zellulose hergestellt wurden, z. B. Aminoethylzellulose, Carboxymethylzellulose, Bromoacetylzellulose und p-Anilinozellulose, oder ein Träger aus vernetztem Dextran, z. B. Sephadex® und CM- Sephadex® und ein Träger aus Agarose, z. B. Sepharose®2B, Sepharose 4B und Sepharose 6B.

Bei der Kupplungsreaktion des wie oben erhaltenen, mit Cyanbromid aktivierten Trägers wird der mit Cyanbromid aktivierte Träger in einer Menge angewendet, die 30 bis 80 mal der des Lektins entspricht und man führt die Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einer 0,1 Mol/l wäßrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat (enthaltend 0,5 Mol/l Natriumchlorid; pH 8,4) bei einer Temperatur zwischen 0 und 40°C und vorzugsweise 2 und 8°C während einer Zeit von etwa 10 bis 20 Stunden durch. Auf diese Weise erhält man einen Lektin enthaltenden Träger für diese Affinitätschromatografie.

Bei der Chromatographie unter Verwendung des Lektin enthaltenden, wie oben beschrieben hergestellten Trägers, kombiniert sich das GRA mit dem auf dem Träger enthaltenen Lektin und wird in der Säule festgehalten. Anschließend werden Substanzen, die zu einer Kombination in der Lage sind, z. B. mit einem Lektin, durch die Säule laufen gelassen, wobei einer Austauschreaktion stattfindet, oder man führt alternativ eine Adsorptionsabtrennung (mit einer Eluierlösung) durch, z. B. mit einem hochkonzentrierten Salz, einen wäßrigen Lösung von Kaliumthiocyanat und einem Nitratpuffer, um das gewünschte GRA abzutrennen und zu gewinnen.

Bei der Austauschreaktion sind Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, wenn ein Träger für die Affinitätschromatografie, enthaltend ein galaktosebindendes Lektin, verwendet wird, beispielsweise solche, die sich mit einem endständigen galaktoseverbindendem Lektin kombinieren, z. B. Galaktose, Disaccharide, enthaltend endständige Galaktose, und Oligosaccharide, enthaltend eine endständige Galaktose. Beispiele für Substanzen, die in der Lage sind, sich mit einem Lektin zu verbinden, wenn als Träger für die Affinitätschromatografie ein N-Acetylgalaktosamin- bindendes Lektin verwendet wird, sind solche, die sich mit einem endständigen N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin verbinden könnten, z. B. N-Acetylgalaktosamin, Disaccharide, enthaltend ein endständiges N-Acetylgalaktosamin und Oligosaccharide, enthaltend ein endständiges N-Acetylgalaktosamin.

Das so erhaltene GRA enthält Glykoprotein, enthaltend eine Galaktose und/oder N-Acetylgalaktosamin-Endgruppe, Glykolipide und/oder Saccharide.

Das so hergestellte GRA kann gewünschtenfalls lyophiliisert werden und auch in üblicher Weise unter Anwendung üblicher Trennmethoden gereinigt werden. Beispielsweise kann man solche GRA-Zubereitungen, die mit einem galaktosebindenden Lektin isoliert wurden, einer Trennmethode unterwerfen, unter Anwendung eines N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektins und GRA, das mit einem N-Acetylgalaktosamin verbindenden Lektin dann isoliert wurde, kann nach einer Trennmethode behandelt werden, unter Verwendung eines galaktosebindenden Lektins.

Die hier verwendeten Lymphocyten sind nicht kritisch und alle Lymphocyten von normalen oder krebsigen Menschen oder Tieren können verwendet werden. Beispielsweise hierfür sind Lymphocyten, die man von peripherem Blut, Knochenmark, Lymphknoten, aus der Milz, den Mandeln oder der Thymusdrüse erhält. Diese Lymphocyten werden beispielsweise durch physikalische oder chemische Methoden isoliert.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Krebszellen-cytotoxischen Lymphocyten erfolgt dadurch, daß man Lymphocyten von Menschen oder Tieren durch 1- bis 10-tägiges Züchten in einem üblichen Nährmedium, das zusätzlich das glykoverwandte Antigen in einer Menge von 1 bis 1000 ng/ml, vorzugsweise 1 bis 500 ng/ml, berechnet als Menge Zucker pro 1 × 10⁶ Lymphocyten/ml enthält. Da GRA eine spezifische Zuckerbindung enthält, kann man den Gehalt an GRA, ausgedrückt durch die Menge des Zuckers, bestimmen.

Als Kulturmedium für die Verwendung zum Sensibilisieren der Lymphocyten können verschiedene übliche Nährmedien verwendet werden, die üblicherweise für solche Zellkultivierungen verwendet werden. Bevorzugte Beispiele schließen ein PMPI 1640-Medium, eine Eagle-MEM- Kultur, dem Humanserum, Kalbsfötusserum (FCS), Kalbsserum oder Pferdeserum zugegeben wurde.

Die Kultivierung wird in üblicher Weise, z. B. bei einem pH von 7,2 und bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt.

Die so hergestellten Killerzellen gemäß der Erfindung sind im wesentlichen normale Lymphocyten und haben eine GRA-spezifische Zellenbekämpfungsaktivität. Beispielsweise hat GRA-1-KT, eine der erfindungsgemäßen Killerzellen, Eigenschaften, die bei humanen peripheren Blut-T-Zellen vorkommen und zeigt eine zellbekämpfende Aktivität, die spezifisch gegenüber Krebszellen, enthaltend GRA, ist, wie in den später folgenden Beispielen gezeigt wird.

Typische Beispiele für die neuen Killerzellen gemäß der Erfindung sind GRA-1-KZ und GRA-M-1, die in den nachfolgend beschriebenen Beispielen hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Killerzellen kann man unlimitiert vervielfältigen, unter Verwendung des vorerwähnten Kulturmediums, enthaltend einen T-Zellen-Wachstumsfaktor (TCGF, IL-2). In diesem Falle kann man eine selektive Kultivierung von Klonen der Killerzellen mittels einer üblichen Ultraverdünnungsmethode durchführen. Die Killerzellen können stabil über lange Zeiträume in beispielsweise flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.

Bei der Verwendung als Anti-Krebsmittel können die cytotoxischen Lymphocyten einmal oder wiederholt über längere Zeiträume einem Krebspatienten zur Behandlung von Krebs verabreicht werden oder man kann es jemandem verabreichen, der krebsanfällig ist, um dadurch dem Krebs vorzubeugen.

Die LD₅₀ (Maus, intraperitoneal) von GRA beträgt wenigstens 500 mg/kg, berechnet als Zuckermenge. Hinsichtlich der Dosierung als Anti-Krebsmittels wird im allgemeinen bevorzugt, das Mittel in einer Menge von 0,001 bis 1000 µg/kg/Tag auf einmal oder in verschiedenen Anteilen zu verabreichen, wobei jedoch diese Dosierung von dem Krankheitsgrad, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten abhängt.

Das so hergestellte Anti-Krebsmittel, welches die Killerzellen als aktiven Bestandteil enthält, wird vorzugsweise als injizierbare Lösung in Kombination mit Trägern, die bei der Herstellung von Blutmedizinen Anwendung finden, verwendet. Die hier verwendeten Träger sind nicht kritisch, jedoch bevorzugt man Träger, die die gleiche Toxizität wie Blut aufweisen. Besonders wird physiologische Kochsalzlösung bevorzugt. Bei der Herstellung des Mittels wäscht man vorzugsweise die Killerzellen ausreichend mit einer physiologischen Kochsalzlösung oder dergleichen, um das vorerwähnte Kulturmedium zu entfernen und anschließend wird es dann in einem Träger aufgenommen.

Die Konzentration an Killerzellen in dem Mittel ist nicht besonders begrenzt, sie beträgt jedoch vorzugsweise zwischen 10⁵ und 10⁹ pro Milliliter. Verabreicht man die Killerzellen intraperitoneal in einer Dosis von 10⁸ pro Maus, so stellt man keine Toxizität fest. Zwar hängt die Dosis von dem Grad der Krankheit, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten ab, jedoch wird im allgemeinen in einer Dosis von 10⁵ bis 10¹² Zellen/kg/Tag auf einmal oder in verschiedenen Anteilen verabreicht.

Die folgenden Beispiele, Referenzbeispiele, Versuchsbeispiele und Vergleichsbeispiele beschreiben die Erfindung.

Referenzbeispiel 1 Lokalität von GRA (1)-A Herstellung von FITC (Fluorescein-Isothiocyanat)-markiertem Lektin (PNA-FITC)

10 mg Erdnusslektin (PNA) wurde in 2 ml eines 0,01M Phosphatpuffers, enthaltend 0,85% NaCl (pH 7,2), gelöst. In 1 ml eines 0,5M Hydrogenkarbonatpuffers (pH 9,0) wurden 2 mg FITC gelöst und ein 0,5 ml Anteil der gebildeten Lösung wurde zu dem zuvor hergestellten PNA-Puffer gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend über Sephadex®G25 (10 mm × 300 mm) getrennt. Das Anfangspeak wurde gesammelt. FITC/PNA-Verhältnis: 1,0.

(1)-B Zubereitung von FITC-markiertem Lektin (DBA-FITC)

In gleicher Weise wie in (1)-A oben erhielt man DBA- FITC unter Verwendung von DBA, EITC/DBA-Verhältnis = 0,9.

(1)-C Sojabohnenagglutinin-FITC(TIFT-SBA)

FITC/SBA-Verhältnis = 1,4.

(2) Lokalität von GRA auf verschiedenen Krebszellen

(a) Human kultivierte Krebszellen (1 × 10⁶) wurden dreimal mit einem 0,05 M tris-Salzsäurepuffer, enthaltend 0,85% NaCl (pH 7,2), durch Zentrifugenverfahren gereinigt und dann wurden 100 µl PNA-FITC, DBA-FITC oder SBA-FITC, (200 µg/ml), hergestellt und gemäß (1), zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten zur Umsetzung bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch dreimal mit einem 0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,85% NaCl (pH 7,2) gewaschen und anschließend wurden die Zellen auf eine Glasplatte gelegt und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Krebszellen sind alle bekannt und wurden von "First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University", bezogen.

Tabelle 1

(b) Das maligne Gewebe von Krebszellen wurde durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl (0,105 Maschenweite) gegeben, unter Erhalt einer Einzelzellensuspension. Nach zweimaligem Waschen mit 0,01M · HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 2mMol CaCl₂, 2mMol MgCl₂ und 0,85% NaCl, wurden 5 × 10⁵ Zellen in 100 µl Puffer resuspendiert. 100 µl FITC-PNA oder FITC-DBA (200 µg/ml) wurden zu der Zellsuspension gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit kaltem PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Referenzbeispiel 2 Herstellung von GRA (1)-A Herstellung von immobilisiertem Lektin (PNA-Sepharose)

3 g CNBr-aktivierte Sepharose®4B wurden gründlich mit 1 mmol HCl gewaschen und in 200 ml 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) suspendiert. Dazu wurden 5 ml eines 0,01M Phosphatpuffers (pH 8,5), enthaltend 20 mg PNA, gegeben und dann erfolgte die Umsetzung bei 25°C während 2 Stunden, wobei man einige Male rührte unter Erhalt von PNA-Sepharose.

(1)-B

In gleicher Weise wie bei (1)-A oben, mit der Ausnahme, daß DBA anstelle von PNA verwendet wurde, erhielt man DBA-Sepharose.

(2) Herstellung von GRA

(a) BT-1 (Burkitt Lymphoma)-Zellen (1,3 × 10⁸) wurden 3mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wurden 30 ml eines 0,01M tris-Salzsäurepuffers (pH 7,4), enthaltend 2% Triton®X-100, 0,85% NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4°C gerührt und dann einer Ultrazentrifugenabscheidung mit einer Rate von 100 000 × g unterworfen. Von 28 ml der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde ein 14 ml-Anteil durch eine Säule (Durchmesser 0,5, Länge 1 cm) für die Affinitätschromatografie geschickt, wobei die Säule mit PNA-Agaroseperlen, die zuvor mit einem tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,1% Triton®X-100, 0,85% NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂ ins Gleichgewicht gebracht worden waren, geschickt. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer, wie er oben verwendet wurde, wurde mit einem 0,01M tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,1M Laktose, 0,85% NaCl, 2 mmol CaCl₂, 2 mmol MgCl₂ und 0,1% Triton®X-100, eluiert. Der so eluierte Anteil wurde mit einer 0,1M tris-Salzsäurepufferlösung, enthaltend 0,85% NaCl, 2 mmol MgCl₂ und 2 mmol CaCl₂ 48 Stunden dialysiert, wobei man 17 mg einer GRA-Lösung erhielt. In dieser GRA-Lösung wurde die Menge an Protein und die Menge an Zucker nach der Folin-Lowry- Methode bzw. nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode bestimmt; diese Mengen betrugen 644 µg bzw. 120 µg. Dieses Produkt wird nachfolgend als "GRA-1" bezeichnet.

(b) C3/HE-Mäuse-Brustkrebs-MMT-Zellen (1 × 10¹⁰) wurden 3mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wurden 30 ml einer 0,01M tris-Salzsäurepufferlösung (pH 7,4), enthaltend 2% Triton®X-100, 0,85% NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 4°C gerührt. Anschließend wurde die Mischung einer Ultrazentrifugenabscheidung in einer Rate von 100 000 × g während 2 Stunden unterworfen, und die überstehende Flüssigkeit wurde über Nacht mit einem 0,1M tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,85% NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, dialysiert. Die so dialysierte Flüssigkeit wurde auf 3 ml konzentriert und ein 1 ml-Anteil wurde durch eine Säule (Durchmesser 0,5, Länge 2 cm), die mit der gleichen PNA-Sepharose, wie zuvor verwendet, gefüllt worden war und die mit einem tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,05% Triton®X-100, 0,85% NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂, ins Gleichgewicht gebracht worden war, einer Affinitätschromatografie unterworfen. Nachdem man gründlich mit der gleichen Pufferlösung wie zuvor gewaschen hatte, eluierte man mit einer 0,1M tris-Salzsäurepufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,1 M Laktose, 0,85% NaCl, 2 mmol CaCl₂, 2 mmol MgCl₂ und 0,005% Triton®X-100, und der so eluierte Anteil wurde dann 48 Stunden dialysiert mit einem 0,01M tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4), enthaltend 0,85% NaCl, 2 mmol CaCl₂ und 2 mmol MgCl₂. Man erhielt 2 ml einer GRA-Lösung. In dieser GRA-Lösung betrug der Proteingehalt 156 µg und der Zuckergehalt 94 µg. Diese Lösung wird nachfolgend als "GRA-M-1" bezeichnet.

(c) Annähernd 120 g (Naßgewicht) KATO-III wurde in einem Waring-Mischer in 100 ml PBS homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren mit 100 000 g während einer Stunde wurden die Pellets in 100 ml einer 2% Triton®X-100-Lösung in 0,01M Tris · HCl-Puffer (pH 7,6), enthaltend 0,15M NaCl, gelöst. Die bei der Zentrifugierung mit 100 000 g während 1 h erhaltene überstehende Lösung wurde auf eine Säule von PNA-Sepharose 4B (0,8 × 15 cm) zugegeben, die zuvor mit 0,015% Triton®X-100 in 0,01M Tris · HCl (pH 7,6), enthaltend 0,15M CaCl, ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetragen. Nach dem Waschen mit 50 ml des Puffers wurde GRA mit dem 0,1M Laktose enthaltenden Puffer eluiert. Das eluierte GRA wurde gegen 0,85% NaCl dialysiert, konzentriert mittels Sephadex und bei -20°C vor der Anwendung gelagert.

Die Mengen an Protein und Zucker, in gleicher Weise bestimmt wie bei (a) oben, betrugen 2,0 mg bzw. 0,8 mg. Dieses Produkt wird nachfolgend als "GRA-2" bezeichnet.

(d) Wie in (c) wurden die folgenden GRA-Proben erhalten:

Tabelle 3

(e) In gleicher Weise wie bei (c), jedoch unter Verwendung von NKN-45 (etwa 29 g) anstelle von Kato-III und unter Verwendung von DBA-Sepharose, erhalten gemäß (1)-B, anstelle von PNA-Sepharose 4B und unter Eluieren mit N-Acetylgalaktosamin erhielt man eine GRA-Zubereitung mit einem Proteingehalt von 0,03 mg und einem Zuckergehalt von 0,01 mg. Dies wird nachfolgend als GRA-8 bezeichnet.

(f) GRA-3, hergestellt gemäß (d) (5 ml), wurde auf eine DBA-Sepharose-Säule gegeben und mit Tris-HCl-Puffer (0,015% Triton X-100, 2 mMol MgCl₂, CaCl₂, 0,85% NaCl) eluiert, wobei man 4 ml-Fraktionen Nr. 1-12 erhielt. Fraktionen 1-3 werden als "GRA-3-A" bezeichnet und Fraktionen 4-12 als "GRA-3-B". Dann wurde die Säule mit dem gleichen Puffer eluiert, der jedoch 0,1M N-Acetylgalaktosamin enthielt und wobei man Fraktionen erhielt die mit "GRA-β-C" bezeichnet werden.

(g) SDS-Gelelektrophorese

Jede der obigen GRA-Zubereitungen wurde einer Elektrophorese unterworfen, wobei die Methode von Fairbanks et al: Biochemistry, Band 10, S. 2606, 1971, angewendet wurde.

Die Ergebnisse werden in den Fig. 18 bis 22 gezeigt.

In den Fig. 18-19 bedeuten die Zahlen 1 bis 5 folgendes:
1 . . . Standard; 2 . . . GRA-M-3; 3 . . . GRA-7; 4 . . . GRA-1; und 5 . . . GRA-2.

In Fig. 20 bedeuten die Zahlen 1 bis 4 folgendes:
1 . . . Standard; 2 . . . GRA-M-2; 3 . . . GRA-6; 4 . . . GRA-5.

In Fig. 21 bedeuten die Zahlen 1 bis 3 folgendes:
1 . . . GRA-M-4; 2 . . . GRA-M-5; 3 . . . Standard.

In Fig. 22 bedeuten die Zahlen 1 bis 4 folgendes:
1 . . . GRA-3; 2 . . . GRA-3-A; 3 . . . GRA-3-B; 4 . . . GRA-3-C.

Fig. 18 zeigt den Zustand von GRA nach einer Proteinanfärbung gemäß C.B.B. (Fairbanks et al: Biochemistry, Band 10, S. 2606, 1971).

Fig. 19 bis 21 zeigen den Zustand von GRA nach Behandlung mit einer Zuckerfarbreaktion gemäß PAS-Methode (R.M. Zacharius et al: Anal. Biochem. Band 30, S. 128 (1962)).

Fig. 22 ist eine schematische Darstellung der Ergebnisse von Anfärbungen gemäß der vorerwähnten C.B.B.-Methode.

Als Standard wurden die nachfolgenden, von Biorad Lab. Calif. USA erhaltenen Substanzen verwendet:

200 K Dalton; Myosin
116 K Dalton; β-Galactosidase
92,5 K Dalton; Phosphorylase
66,2 K Dalton; BSA
45 K Dalton; Ovalbumin
21,5 β; Sojabohnentrypsin-Inhibitor

Referenzbeispiel 3 Herstellung von TCGF

(a) Die Milz von japanischen Affen wurde herausoperiert und 2 mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium gewaschen. Die Zellen wurden durch ein Sieb filtriert und einem Schwerkraftzentrifugenverfahren (Schwerkraft 1,076) unterworfen, wobei man 2 l von 2 × 10⁹/ml Lymphocyten erhielt. Die so erhaltenen Lymphocyten wurden 3mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium gewaschen und die Anzahl der Lymphocyten wurde auf 5 × 10⁷/ml unter Verwendung des gleichen Mediums wie zuvor, enthaltend 10% FCS, eingestellt. Dann ließ man sie in einer Kohlendioxid-Fermentationsvorrichtung 1 Stunde bei 37°C stehen. Die überstehenden Lymphocyten wurden gewonnen und die Anzahl der Lymphocyten wurde unter Verwendung des gleichen Kulturmediums wie vorher angegeben, enthaltend 1% FCS auf 1 × 10⁶/ml, eingestellt. Anschließend wurden 1 µg Indomethacin/ml und 0,2% PHA-P zugegeben und dann wurde die Kultivierung in einer Kohlendioxidgas-Fermentationsvorrichtung 48 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nachdem man 10 Minuten eine Zentrifugenabscheidung (3000 UpM) durchgeführt hatte, wurde die gebildete überstehende Flüssigkeit gewonnen und sterilisiert, indem man sie durch ein Millipore-Filter (0,2 µm) filtrierte und wobei man 2 l TCGF erhielt.

(b) Als Quelle von TCGF wurde die überstehende Flüssigkeit von mischkultivierten peripheren Blutlymphocyten von 10 gesunden Spendern verwendet. Von nicht zusammenhängenden Lymphocyten abgetrennte Lymphocyten durch Adsorption auf Plastikoberflächen bei 37°C während 1 h wurden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 1% FCS (1,5 × 10⁶ Zellen/ml) suspendiert und mit 0,2% PHA-P, Indomethacin (1 µg/ml) und Human-B-Zellen (BT-1) (1,5 × 10⁵ Zellen/ml), vorbehandelt mit Mitomycin C (50 µm/ml), inkubiert. Nach 48 Stunden wurde die aufschwemmende Kultur geerntet und als TCGF- Quelle verwendet (H. Inoue et al., Scand. J. Immunol. 12, S. 149-145 (1980)).

Referenzbeispiel 4 Herstellung von Lymphocyten (1) Human-periphere Blutlymphocyten

50 ml Blut, erhalten von gesunden Erwachsenen oder Patienten mit verschiedenen Krebsen durch Häparinisierung, wurden unter Verwendung von Ficol Pack® einer Zentrifugenabscheidung unterworfen, wobei man 5 × 10⁷ periphere Blutlymphocyten erhielt.

(2) Mäuse-Milzlymphocyten

Die Milz einer C3H/He-Maus (männlich, 6w) wurde exzidiert und 2-mal mit einem RPMI-1640-Kulturmedium gewaschen. Dann wurde die Milz mittels einer Injektionsnadel gelockert und durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl (0,149 mm Maschenweite) zur Entfernung großer Teile passiert. Die so filtrierten Zellen wurden 2mal mit dem gleichen Kulturmedium wie oben gewaschen und dann einer Zentrifugentrennung mit 1200 UpM während 10 Minuten unterworfen, wobei man 4 × 10⁷ Milzlymphocyten erhielt.

Beispiel 1

GRA-1 (Menge an Protein 40 µg/ml; Menge an Zucker 7,5 µg/ml, erhalten gemäß Referenzbeispiel 2(2a)) wurden auf das 1000-fache des Ursprungsvolumens mit einem RPMI-1640-Kulturmedium, enthaltend 15% FCS, verdünnt, unter Erhalt eines Sensibilisierungs-Kulturmediums.

Lymphocyten von humanem peripheren Blut (5 × 10⁶/5 ml), erhalten gemäß Referenzbeispiel 4(1), wurden zu 5 ml des Sensibilisierungs-Kulturmediums, hergestellt wie oben, gegeben und dies wurde dann in eine Laborschale gegeben und 2 Tage bei 37°C kultiviert. Anschließend erfolgte eine weitere Kultivierung auf einem RPMI-1640- Kulturmedium, enthaltend 20% TCGF und 15% FCS, erhalten gemäß Referenzbeispiel 3, für weitere 5 Tage, wobei man 20 ml einer Killerzellenlösung, enthaltend 1 × 10⁶ Killerzellen/ml, erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-1-K-T bezeichnet.

Beispiel 2

Die Mäuse-Milzlymphocyten, die im Referenzbeispiel 4(2) erhalten worden waren, wurden unter Verwendung eines RPMI-1640-Kulturmediums, enthaltend 15% FCS, auf eine Zahl von 5 × 10⁶/ml eingestellt. Dazu wurde GRA-M-1, erhalten gemäß Referenzbeispiel 2(2b) gegeben, so daß das Endprodukt 1,5 µg/ml Protein und 0,9 µg/ml Zucker enthielt. Ein 5 ml-Anteil des erhaltenen Gemisches wurde in eine Laborschale (60 mm × 15 mm) 2 Tage bei 37°C kultiviert. Es wurde die Bildung von Klonen beobachtet. Der Anteil wurde weiter in einem RPMI-1640-Kulturmedium mit 15% FCS, enthaltend 20 Vol.% TCGF während 4 Tagen kultiviert, wobei man 50 ml einer Killerzellenlösung, enthaltend 1 × 10⁶ Killerzellen/ml erhielt. Diese wird nachfolgend als GRA-M-1-K-T bezeichnet.

Beispiel 3

Lymphocyten (5 × 10⁶) von peripherem Blut gesunder Spender wurde in einem RPMI-1640-Medium, enthaltend 40 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-2 und 15% FCS bei 37°C inkubiert. Am zweiten Tag wurde das vorerwähnte Human-TCGF zu dem Medium zugegeben, bis dessen Konzentration 20% erreichte und die Inkubierung wurde 3 Tage fortgesetzt, wobei man Killer-Zellen erzielt, diese werden nachfolgend als "GRA-2-K-T" bezeichnet.

Beispiel 4

Killerzellen-Zubereitungen GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T und GRA-3-C-K-T wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von fRA-8, GRA-3-A und GRA-3-C hergestellt (Proteingehalt: 50 ng/ml und des TCGF, das im Referenzbeispiel 3-(b) erhalten wurde.

Beispiel 5

C3HE/Mäusen (weiblich 8 Wochen alt) wurde intradermal X5563-Zellen (10⁶) des gleichen Stammes implantiert und nach 7 Tagen wurde der Tumor chirurgisch herausgeschnitten. Nach weiteren 7 Tagen wurden X5563-Zellen (10⁵) gleichen Stammes inokuliert und Mäuse, die gegenüber der Inokulierung resistent waren, wurden als Immun- Mäuse bezeichnet.

Die Milzzellen der Immunmäuse und von C3H/HE-Mäusen wurden unter üblich angewendeten Methoden präpariert.

Jedes Lot von Milzzellen (5 × 10⁶/Well) wurde mit 40 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-M-5 in RPMI-1640-Medium, enthaltend 15% FCS während 5 Tagen sensibilisiert unter Erhalt von Killerzellen.

Killerzellen-Zubereitungen, die aus normalen Milzzellen erhalten wurden, werden nachfolgend als "GRA-M-5-K-t-1" bezeichnet, und solche, die von Immunen Milzzellen erhalten wurden, werden mit "GRA-M-5-K-T-2" bezeichnet.

Beispiel 6

Lymphocyten von peripherem Human-Blut (5 × 10⁶) wurden in 5 ml RPMI-1640-Medium, enthaltend 50 ng/ml (Proteingehalt) GRA-1 bei 37°C während 2 Tagen inkubiert. Am dritten Tag wurden die Lymphocyten in das RPMI-1640-Medium, enthaltend 10% Serum von dem Spender der Lymphocyten, und 0 bis 100 ng/ml (Proteingehalt) von GRA-1 übertragen und die Inkubierung wurde noch weitere 5 Tage fortgeführt, wobei man die in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigten Killerzellen-Zubereitungen erhielt.

Tabelle 4

GRA-Konzentration (ng/ml)

Beispiel 7

(a) Lymphocyten von peripherem Blut (PBL) von verschiedenen Krebspatienten nach der Operation wurden mit GRA-3 sensibilisiert unter Erhalt von Killerzellen-Zubereitungen. PBL (5 × 10⁶) von den Patienten wurde in RPMI-1640-Medium, enthaltend 50 ng/ml (Proteingehalt) von lRA-3, während 2 Tagen inkubiert und dann inkubierte man in RPMI-1640-Medium, enthaltend 20% TCGF und 15% FCS, weitere 5 Tage unter Erhalt der Killerzellen, die in Tabelle 5 gezeigt werden.

Tabelle 5

Periphere Blut-Lymphocyten

In der obigen Tabelle bedeutet P-GRA und D-GRA die Lokalität von GRA, ausgedrückt als Maligne-Gewebe (durch Operation entnommen) von Krebspatienten, von denen PBL in gleicher Weise gesammelt worden war, wie im Referenzbeispiel 1, 2-(b). P-GRA und D-GRA wurden erhalten unter Verwendung von FITC-PNA bzw. FITC-DBA. Die Tage nach der Operation geben die Zeit an, wann BPL nach der Operation gesammelt worden war.

(b) PBL (5 × 10⁶), gesammelt von Brustkrebspatienten 21 Tage nach der Operation wurde in RPMI-1640-Medium, enthaltend 50 ng/ml (Proteingehalt) GRA-3 und 10% Serum von den Patienten, während 7 Tagen inkubiert, um das PBL zu sensibilisieren und unter Erhalt von Killerzellen-Zubereitungen. Diese werden nachfolgend als GRA-3-K-T-7 bezeichnet.

Beispiel 8

(i) GRA-M-1, erhalten gemäß Referenzbeispiel 2(2b), wurde mit physiologischer Kochsalzlösung so verdünnt, daß der Gehalt an Zucker 1,0 µg/ml und an Protein 1,6 µg/ml betrug. Auf diese Weise erhielt man ein Anti-Krebsmittel Nr. 1.

(ii) Ein Krebsgewebe von C3H/He spontan auftretendem Brustkrebs wurde steril zu einem 5 mm kubischen Klumpen geschnitten und unter die Rückenhaut von jeweils 10 C₃H/He-Mäusen des gleichen Stammes wie oben (7 Wochen alt, männlich) transplantiert. 7 Tage nach der Transplantation wurde die Fixierung und Multiplizierung des Krebses bestätigt. 5 dieser Mäuse erhielten subkutan das gemäß (i) hergestellte Anti- Krebsmittel Nr. 1 in einer Dosis von 300 µl/Tag in 2-tätigem Abstand. Die restlichen 5 Mäuse wurden als unbehandelte Kontrolle verwendet. 10 Tage nach der ersten Verabreichung wurde der Tumor operativ entfernt und dessen mittleres Gewicht gemessen. Gleichzeitig wurde eine pathohistologische Untersuchung durchgeführt.

Tumorvolumen

behandelte Gruppe: 22,3 mm³ (Fig. 14) Kontrolle:162,7 mm³ (Fig. 15)

Dies bedeutet, daß der Tumor um 86,3% zurückging.

Pathohistologische Untersuchung

In der Kontrollgruppe (Fig. 16) wurden vogelnestähnliche Krebskörper gebildet, wobei die Art des Gewebes einem markähnlichen kanalförmigen Krebs entsprach und eine Vervielfachung der Krebszellen über das Gesamtgewebe festgestellt wurde. Andererseits verursachten bei der Gruppe, die mit dem Mittel behandelt wurde (Fig. 17) die Krebszellen eine Verflüssigungsnecrosis an den Stellen, wo sich die Krebszellen gebildet hatten und eine Verkalkung und Fibrosis wurden festgestellt, wobei nur eine sehr geringe Menge an Krebszellen zurückblieb. Dies bestätigte die Anti- Krebseigenschaften des erfindungsgemäßen Anti-Krebsmittels.

Testbeispiel 1

GRA-1-K-T (1 µl), erhalten gemäß Beispiel 1, wurde auf eine Mikroplatte gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurden 4 µl FCS zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Neuraminidasebehandelte rote Blutzellen von Schafen (SRBC^N), eingestellt auf eine Anzahl von 1 × 10⁹/ml, und 5 µl eines 0,1M Phosphatpuffers (pH 7,2) zudem 0,85% NaCl zugegeben worden waren, wurden zugegeben und dann wurde die Platte einer Zentrifugenabscheidung mit 6000 Upm während 5 Minuten unterworfen. Dann wurde die Platte umgedreht und nicht-umgesetzte SRBC^N wurde entfernt. Eine Färbelösung (Brilliant Cresyl Blau) wurde zum Färben der Lymphocyten zugegeben und eine rosettenförmig ausgebildete Positivität wurde festgestellt. Wenigstens 98% zeigten die rosettenförmige Positivität (T-Zellen).

Testbeispiel 2 Spezifische Krebszellen abtötende Aktivität

(a) Von den in Tabelle 1 gezeigten Krebszellen wurden die nachfolgenden 5 Zellstämme mit unterschiedlichen GRA-Positivitätsverhältnissen als zu bekämpfende Human-Krebszellen verwendet:
Zu bekämpfende Krebszellen:

Nr. 1  BT-1 (Burkitt Lymphoma)
Nr. 2  Daudi (Burkitt Lymphoma)
Nr. 3  KATO-III (Magenkrebs)
Nr. 4  MKN-45 (Magenkrebs)
Nr. 5  MOLT (T-Zellen Leukemia)

Auf einer Mikroplatte wurden pro Vertiefung 5 × 10⁴ der zu bekämpfenden Krebszellen durch Zentrifugenabscheidung mit 8 000 Upm während 5 Minuten aufgebracht. Dann wurden vorsichtig 4 × 10⁸ Zellen pro Vertiefung des nach Beispiel 1 erhaltenen GRA-1-K-T zugegeben und dann wurde 1 Stunde inkubiert.

Die Abtötungsaktivität wurde je nach dem Grad der Belagbildung festgestellt und wie folgt bewertet:

++eine merkliche Abtötungsaktivität wird festgestellt +eine Abtötungsaktivität wird festgestellt ±eine geringe Abtötungsaktivität wird festgestellt -eine Abtötungsaktivität kann nicht festgestellt werden.

In einer Kontrollgruppe wurden unsensibilisierte humane periphere Blutlymphocyten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden waren, jedoch ohne Verwendung von GRA, verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt.

Aus Tabelle 6 geht hervor, daß die erfindungsgemäß gebildeten Killer-T-Zellen eine starke GRA-spezifische cytotoxische Aktivität aufweisen.

Tabelle 6

(b) Die gleichen zu bekämpfenden Krebszellen, wie sie in (a) verwendet wurden (3,2 × 10⁶), wurden mit 8 × 10⁵ GRA-1-K-T (Zellverhältnis 5/1) vermischt und das gebildete Zellgemisch (Gesamtanzahl 4 × 10⁶) wurde in einem 15% FCS enthaltenden RPMI-1640-Medium kultiviert. Nach 1 Stunde wurde die Anzahl der verbliebenen Zellen gezählt und das Inhibierungsverhältnis wurde gemäß folgender Gleichung errechnet:

Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

(c) Das Verfahren von (b) wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das Mischverhältnis von GRA-1-K-T zu den zu bekämpfenden Krebszellen auf 5/3 verändert wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 8

Testbeispiel 3

C3H/He-spontan brustkrebsige Mäuse erhielten subkutan GRA-M-1-KT-, erhalten gemäß Beispiel 2, in einer Dosis von 2 × 10⁶/0,3 ml Mais 3-mal wöchentlich jeden zweiten Tag. Nach 10 Tagen wurde der Fokus herausgenommen und untersucht. Bei diesem Versuch stellt man fest, daß GRA-1-K-T eine hohe Bindungsaktivität gegenüber Daudi, KATO-III und BT-1, aber nur eine niedrige Bindungsaktivität gegenüber MKN-45 und MOLT zeigt.

Wie in Fig. 12 gezeigt wird, fand eine Infiltration von Lymphocyten in die Krebszellen statt und ein Aufbrechen des Tumorbereiches wurde festgestellt. Aus Fig. 13 geht hervor, daß eine Kalzifizierung der Tumorfläche stattgefunden hat und daraus kann man sehen, daß die erfindungsgemäßen Krebszellen eine Antitumoraktivität aufweisen.

Vergleichsbeispiel 1

In diesem Beispiel wurden Krebszellen per se als spezifische Antigene anstelle von GRA für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet.

Krebszellen-sensibilisierte Lymphocyten wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten, wobei jedoch anstelle von GRA, BT-1, Daudi, KATO-III oder MKN-45 in einer Menge von 1 × 10⁵ pro Laborschale verwendet wurden.

Mit diesen Lymphocyten wurde die cytotoxische Aktivität in gleicher Weise wie im Testbeispiel 2(a) untersucht und die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt.

Aus Tabelle 9 geht hervor, daß die oben hergestellten Lymphocyten keine cytotoxische Aktivität aufweisen.

Tabelle 9

Testbeispiel 4

In gleicher Weise wie im Testbeispiel 2-(b) wurde die krebszellenabtötende Aktivität von GRA-(-K-T, GRA-3-A-K-T und GRA-3-C-K-T, erhalten in Beispiel 4, bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 10 gezeigt.

Tabelle 10

Testbeispiel 5

(a) Die Cytotoxizität der Killerzellen-Zubereitungen, erhalten gemäß Beispiel 6, wurde mittels eines ⁵¹Cr-Färbetests (J. Immunol., 122, 2527-2533 (1979)) bestimmt. Dazu wurden 50 µCi radioaktives ⁵¹Cr zu KATO-III (2 × 10⁷) gegeben und die Zellen wurden 1 h bei 37°C in RPMI-1640-Medium inkubiert und anschließend durch Zentrifugieren gewaschen unter Erhalt von ⁵¹Cr-markierten Target-Zellen. Die Killerzellen (Effektorzellen) (2 × 10⁶) wurden zu den Target-Zellen (1 × 10⁵) gegeben (das Verhältnis E/T betrug 20/1) und die Mischung wurde 4 h bei 37°C in RPMI-1640-Medium inkubiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugieren gesammelt und die Radioaktivität wurde durch einen Flüssigsintillator gezählt.

Die spezifische ⁵¹Cr-Freigabe (%), die der cytolytischen Aktivität der Effektorzellen entspricht, wurde nach folgender Gleichung bestimmt:

Die maximale Freigabe zeigt die Radioaktivität wenn alle Zellen aufgelöst sind.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 11 gezeigt:

Tabelle 11

Aus den Ergebnissen in Tabelle 11 ist erkennbar, daß TCGF und FCS keine Beziehung auf die Induzierung der Killerzellen haben.

(b) Cytotoxizität von GRA-2-K-T erhalten in Beispiel 3 wurde in gleicher Weise wie in (a) oben mittels des ⁵¹Cr- Freigabetestes bestimmt. Die spezifische ⁵¹Cr-Freigabe betrug 14,3% bei einem ⁵¹Cr-markiertem KATO-III als Target-Zelle (E/T = 20/1).

Testbeispiel 6

(a) Unter Verwendung von KATO-III (E/T = 20/1) wurde die Cytotoxizität von Killerzellen, erhalten gemäß Beispiel 7-(a) in gleicher Weise wie im Testbeispiel 2-(b) bestimmt.

Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt:

Tabelle 12

(b) Die Cytotoxizität von GRA-3-K-T-7, erhalten gemäß Beispiel 7-(b) wurde unter Verwendung von ⁵¹Cr-KATO-III (E/T = 29/1) als Target-Zellen in gleicher Weise wie im Testbeispiel 5 bestimmt. Die spezifische ⁵¹Cr-Freigabe der Killerzellen betrug 25,5%.

Testbeispiel 7

Die Cytotoxizität von Killerzellen, erhalten in Beispiel 5, wurde mittels des ⁵¹Cr-Freigabetests in gleicher Weise wie im Testbeispiel 5 bestimmt. Die verwendeten Target-Zellen waren ⁵¹Cr-markierte X5563-Zellen. Als Kontrolle wurden Lymphocyten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhalten worden waren mit der Ausnahme, daß die Sensibilisierung der Milzzellen durchgeführt worden war mit 1 × 10⁵/Vertiefung von Mitomycin C-behandelten X5563-Zellen (5 × 10⁶/ml von X5563-Zellen wurden mit 50 µg/ml Mitomycin C während 60 Minuten behandelt) anstelle von GRA-M-5, verwendet.

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 13 gezeigt:

Tabelle 13

Spezifische ⁵¹Cr-Freigabe (%)

Testbeispiel 8 (H-2-Assay)

GRA-M-1, GRA-M-3 und GRA-M-4, erhalten gemäß Referenzbeispiel 2 wurden einer Serienverdünnung mit PBS (0,85% NaCl) unterworfen, unter Erhalt von Proben.

Anti-H2-Serum vom National Institute of Genetic Research und die obigen Proben wurden vermischt und bei 4°C 2 h inkubiert und dann wurden Target-Zellen entsprechend dem verwendeten Anti-H-2-Serum zugegeben. Milzzellen oder Lymphknotenzellen, erhalten aus B10 (H-2^b) und B10 · BR (H-2^k) Mäusen nach üblichen Methoden wurden als Target-Zellen verwendet. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wurde Komplement (Kaninchen) zu den Zellen zugegeben und die Zellen wurden 1 h bei 37°C inkubiert und mit 0,2 5Trypan-Blau-PBS angefärbt zur Bestimmung der prozentualen Cytotoxizität. Das Anti-H-2-Serum wurde in einer Maximalverdünnung verwendet, so daß es wenigstens 95%ige Cytotoxizität bei Abwesenheit von GRA zeigte.

Die Blockierungswirkung von GRA in den Systemen wird in Tabelle 14 gezeigt:

Tabelle 14

Die Ergebnisse werden in Tabelle 15 gezeigt.

Tabelle 15

% Cytotoxizität

Aus den Ergebnissen in Tabelle 15 kann man entnehmen, daß GRA-M-1, GRA-M-3 und GRA-M-4 keine H-2 haben.

Testbeispiel 9

C57BL/6 Mäusen wurde unter S. C. LLC (2 × 20⁶) des gleichen Stammes transplantiert und nach 6 Tagen wurde 1ng (Protein) GRA-M-3, erhalten gemäß Referenzbeispiel 2-(d), subkutan verabreicht. Diese Verabreichung wurde einmal täglich in gleicher Dosierung an 4 Tagen wiederholt. Am Tage nach der letzten Verabreichung wurden die Tumorzellen herausgeschnitten und gewogen. Zur Kontrolle wurden Tiere verwendet, denen nur physiologische Kochsalzlösung verabreicht worden war. Jede Testgruppe bestand aus 5 Tieren.

Als Ergebnis stellte man fest, daß das durchschnittliche Krebsgewicht bei der Kontrollgruppe etwa 500 mg war. Bei der GRA-M-3-behandelten Gruppe zeigten 3 ein Verschwinden der Tumore und zwei zeigten ein durchschnittliches Tumorgewicht von 100 mg.

Testbeispiel 10

C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit 1 ng (Protein) GRA-M-3, erhalten in Referenzbeispiel 2(d), einmal täglich während 3 Tagen immunisiert und am 5. Tag wurden Milzzellen von den Tieren zur Gewinnung von Effektor-Zellen gesammelt. Eine Mischung der Effektorzellen und von Lewis-Lungencarcinom (LLC) als Target-Zellen in einem Verhältnis von E/T = 50/1 wurde hergestellt und ein Teil (1 × 10⁵) davon wurde in Mäusen des gleichen Stammes transplantiert und eine Winn-Assay wurde durchgeführt (J. Immunol. 86, S. 228-239 (1961)).

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 16 gezeigt.

Tabelle 16

Testbeispiel 11

C3H/He Mäuse wurden mit 4,5 µg (Protein) GRA-M-4, erhalten in Referenzbeispiel 2-(d), und 0,1 ml Freund's Complete Adjuvant sacrococcygeal immunisiert. Nach 2 Wochen wurden Lymphknotenzellen in üblicher Weise gesammelt und als Responder-Zellen für die Bestimmung der proliferativen Ansprechung durch GRA-M-4 verwendet.

Zu diesem Zweck wurden Responder-Zellen (4 × 10⁵) mit RPMI-1640- Medium, enthaltend 15% FCS, in Gegenwart von GRA-M-4 während 5 Tagen inkubiert. Während der letzten 18 Stunden der Inkubierungszeit wurde 1 µCi von ³H-Thymidine (³H-TdR) zu dem Medium zugegeben und die Inkorporation in die Zellen wurde gezählt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt.

Tabelle 17

Testbeispiel 12

Die verzögerte Hypersensibilisierung (DTH)-Ansprechung von C3H/HE-Normalmäusen, X5563-Immunmäusen und MH134-Immunmäusen, erhalten in gleicher Weise wie in Beispiel 5, und von GRA-M-4-Immunmäusen und GRA-M-5-Immunmäusen, erhalten in gleicher Weise wie im Testbeispiel 11, wurde durch die Fußsohlen-Reaktion (FPR) bestimmt. Dazu wurden GRA- oder MMC-behandelte Tumorzellen in die Haut der Fußsohle im Hinterbein der Tiere eingegeben und das Anschwellen der Fußsohle 24 h nach der Behandlung wurde festgestellt. Die DTH-Ansprechung wurde berechnet, indem man die Anschwellung vor der Behandlung von der nach der Behandlung (10^-2mm) abzog.

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 18-22 gezeigt.

Tabelle 18

Mittleres Fußsohlenanwachsen (10^-2mm)

Tabelle 19

Mittleres Fußsohlenanwachsen (10²mm)

Tabelle 20

Mittleres Fußsohlenanwachsen (10^-2mm)

Tabelle 21

Mittleres Fußsohlenanwachsen (10^-2mm)

Tabelle 22

Mittleres Fußsohlenanwachsen (10^-2mm)

Referenzversuch

X5563-Immunmäuse wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 5 erhalten. Die Milzzellen dieser Immunmäuse wurden als Effektorzellen verwendet und die Effektorzellen (10⁷) und die Target-Zellen (X5563, 10⁵) wurden zusammen auf Mäusen des gleichen Stammes transplantiert. Dann wurde eine Winn-Assay in gleicher Weise wie im Testbeispiel 10 durchgeführt.

Die erzielten Ergebnisse werden in Fig. 23 gezeigt, in welcher die Abszisse die Tage und die Koordinate die mittlere Krebsgröße (cm²) ± Standardirrtum anzeigt, und in welcher die verschiedenen Markierungen folgende Bedeutung haben:

⚫-⚫:Gruppe, zu welcher keine Effektor-Zellen gegeben wurden; ○ ○:Gruppe, zu welcher nicht-behandelte Effektor- Zellen gegeben wurden; ∆-∆:Gruppe, zu welcher Effektorzellen, die mit Kaninchen- Komplement behandelt worden waren, gegeben wurden; x-x:Gruppe, zu welcher Effektor-Zellen, die mit Anti- Thy 1 behandelt worden waren, und zu der Kaninchen-Komplement gegeben wurde; -:Gruppe, zu der Effektorzellen, die mit Anti-Lyt 1 behandelt worden waren, und zu der Kaninchen-Komplement gegeben wurde; ∎-∎:Gruppe, zu der Effektor-Zellen, die mit Anti-Lyt 2 behandelt und zu der Kaninchen-Komplement gegeben wurde.

Aus den Ergebnissen von Fig. 23 wird ersichtlich, daß Lyt 1 Typ T-Zellen eine wichtige Rolle in dem Mechanismus des in vivo-Effektes bei der Tumorimmunität spielen.

Weiterhin ist es bekannt, daß die DTH-Ansprechung durch Lyt-1 T-Zellen (J. Exp.Med. 143, S. 1543-39 (1976)) hervorgerufen wird.

Claims

1. Krebszellen-cytotoxische Lymphocyten, die spezifisch gegenüber einem von Krebszellen abgeleiteten glykoverwandten Antigen sind, wobei dieses Antigen dadurch erhalten worden ist, daß man Zellmembrankomponenten von Krebszellen von Menschen oder Tieren mit einem Lektin behandelt, welches sich spezifisch mit terminaler Galactose und/oder endständigem N-Acetylgalactosamin verbindet, das mit dem Lektin vereinte glykoverwandte Antigen und davon das glykoverwandte Antigen abtrennt.

2. Verfahren zur Herstellung der Lymphocyten des Anspruchs 1, bei dem man Zellmembrankomponenten von Krebszellen von Menschen oder Tieren mit einem Lektin behandelt, welches sich spezifisch mit terminaler Galactose und/oder endterminalem N-Acetylgalactosamin verbindet, das mit dem Lektin vereinte glykoverwandte Antigen und davon das glykoverwandte Antigen abtrennt, dadurch gekennzeichnet, daß man Lymphocyten von Menschen oder Tieren sensibilisiert durch 1- bis 10-tägiges Züchten in einem üblichen Nährmedium, das zusätzlich das glykoverwandte Antigen in einer Menge von 1 bis 1000 ng/ml, berechnet als Menge Zucker pro 1 × 10⁶ Lymphocyten/ml, enthält.

3. Verwendung der Lymphocyten des Anspruchs 1 bei der Bekämpfung von Krebs.