JPS58889A - 改良されたキモパパイン及びその製法ならびに用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は改良され友キモ・奢・臂イン（ｃｈｙｍｏ−ｐ
蟲ｐａ、Ｉｎ）、キモ・臂・母インの改良された処方及
びキモ・譬・臂インの製法に関する。また本発明は本発
明の純化キモ・譬・ダイン使用による椎間板異状症候の
治療法にも関連する。

キ４　ａ４ノ臂インは・ダ・譬イヤ科の・平・臂イヤ（
Ｃａｒｌｃａｐａｐａｙａ　）　　の粗乳液の主要なタ
ンノ臂り質分解成分をなす酵素である。このものは・々
ノ譬インに類似するスル２ヒドリル酵素として特徴づけ
られるけれども基質、特性、電気泳動、安定性及びＮ１
Ｉｌ性の点で・４／ｆインとは異る。このものはタンセ
ン及びｄｌ−）ｋｔ−ＪａｒＮｌ＠ｎ　ａｎｄ　Ｂａ　
ｌ　Ｉｓ　＃　Ｊ−８ｌｏ　Ｉ　−Ｃｈ＠ｍ−＃Ｖ　ｏ
ｌ　−／ｊ７ｅｐｐ−４’ｊターｔｏ（／り１１／　）
ａｎｄＬＪ、！！、　Ｐａｔ、　２３／ｊ１７ｊｃ／り
４Ａｊ）　　）によｐ最初に配述寄れ特徴づけられえ。

なおメルクインデスク（Ｔｈ＠　Ｍｅｒｃｋ　ｌｎｄ＠
ｘ、Ｎ１ｎｔｈ　ＥｄｌｔｌＯｎ、　Ｅｎｔｒｌ　Ｎｏ
。

λ２４／、ｐ、２ｆ３　　）を参照されたい。

キモ／４イイン製造のための上記のタンセン及びＩ−ル
の方法は本質的には塩析法であって・（・ザイヤ乳液の
可溶性部分のＳ＊を酸性化してｐＢを約−とし、液相か
ら不溶性−ン・譬り質フックシ１ンを分別し、ｐｌｔ≠
に上げ更に、タン・々り質を除去し。

液相を塩化ナトリウムで飽和させ、−を約２に下げてキ
モ・譬・９インを沈殿させる。

蟲該技術分野の他・の研究書違はタンセン及びＩ−ルの
方法を市販・臂・譬イヤ乳液に適用しても単−結晶性タ
ン・譬り質を生成しないと報告している。

例えば諸文献（Ｃａｙｌｅ　ａｎｄＬｏｐ＠ｚ　Ｒａｍ
ｏ協。

Ａｂｓｔｒａｃｔｇ　　ｏｆ　　Ｐａｐｅｒｓ　　ｏｆ
　　ｔｈｅ　　／　　ｕ　　Ｏｔｈ　　Ｍｅｅｔｉｎｇ
ｏｆ　ｔｈｅ＾ｍ、　Ｃｈ＠ｍ、Ｓｏｃ’ｙ、、　Ｃｈ
ｉｃａｇｏ　ａ　ｐ、　／りＣ（／　５’Ａ／　）　；
　Ｅｂａｔａ　ａｎｄ　Ｙａｓｕｎｏｂｕ　、　Ｊ、　
Ｂｌｏｌ。

Ｃｈ＠ｍ、　　、　ｖｏｌ　、λ３７．ｐｐ、１０１６
−２１／り４２）；にｕｎｌｍｌｔｓｕ　ａｎｄ　Ｙａ
ｓｕｎｏｂｕ　、　Ｂｌｏ＠ｈｉｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ
。

Ａｃｔａ　、ｗｏｅ、／３ｙ、ｐｐ、４４０ｊ−／Ｇ（
／？ｊ？）　　）を参照されたい。塩析法及び（又は）
ｉｌｌｌｌ画分及び（又ｔｉ　）　ｐｇ調整法によ〉、
或は類似方法により／量ｔ＃イヤから分離されえキモ・
ぐ／４インを１文においては粗キモ・譬ツインと称する
。粗キモ／４ノ量インは明瞭な−イオク系１臭気を有し
、を九Ｓ＊中で顕著な黄褐色を呈する。

粗キモ、譬、量インがタン、ダク系の性質の種々ノ物質
を含有することは事実であってそのうちの僅か２種のみ
が確実に活性なタン・譬り分解因子である。

例えばシエテルン（Ｓｔ・ｒｎ、　／り７１年１月２６
日登碌米Ｓ特許ｆｌｌＡ３ｊｊｔｌ１３３号明ｍ書）　
ｔｔ三成分、　ｍちキモ・ぐ・９インｌ及び扉として知
られる２種のタン・譬り分解活性フラクシ■ン及び７種
のタン・母り分解不活性−／バク様成分の三成分、を含
有する粗中毫・ナイインの該鎖成分の純化と同定とにつ
いて記載している・ １掲の米国特許第３ｊにＩ弘３３号明細書記載の方法は
緩衡水＃Ｉ液で予めｐＨ約ｇ〜約ｒ、ｊに平衡化させた
カル？キシメチル置換交差デキストランコポ９−’−交
１１に樹１ｉ１のクロマトグラフコラムの使用を特定し
ており、これに対して粗午峰ノ臂・皆インを適用し、次
に交換体に緩衝水溶液を通して溶出させるのであるが＜
ｌ　Ｌこの緩衝水溶液は初めの場合のクロマトグラフコ
ラムの平衡化に使用された緩責゛Ｓ＊と同じ１値をもつ
けれどもイオン強度の点では始めの場合よりも高いイオ
ン強度をもつものである。この操作で得られ九キモ・母
・量イン製品はタンセン及びメールの粗キモノ９ノ譬イ
ンよシも高い純度をもつ叶れども米国特許第３３２０／
３／　号明細書記載の如き椎間、板ヘルニアの治療には
全く使用されなかった。

前記シエテルンの米国特許第３ｊｊｌ弘３３号明細書は
骸方法で＠纒され九純化ヤ毫・豐・譬インが本質的に曜
−タン・量“り質であるかのように作動することを教示
するが該作動は分析学的趨遠心分１ｉＫおける◆一対称
境界線（ｓｌｎｇｌ＊　ｓｙｒｎｍ＠ｔｒｌｃａｌｂｏ
ｕｎｄａｒｙ　）　　の形成によると共ＫｑＩＩＡ天ｒ
ル拡散系内での免疫拡散試験における単一沈降線の形成
によるものである。

更に近＊に至り、シエテルンの特許方法によるりａマド
グラフコラムから溶出されたキモノ譬ノダインの第一フ
ックジョンであって該特許方法においてはタン・譬り分
解１不活性０と記載され死骸フラクシｌンは新方法（Ｂ
ａｒｎ−ａｔ　ｍｌ、、　＠ｌｏｃｈ１ｍ、　Ｊ。

／７７、＃／−≠ＩＣ／？７り）〕により調製された・
４・４イヤ抽出物の或場合において、原料供給源の差に
よ染、実際にはタン・臂り分解活性であることが見出さ
れた。

添付図面に示される通りの溶出物吸収極大値によってシ
エテルン特許方法はキモノ譬／譬インの諸種成分を同定
しているのであるが、ｗＩ％許明細書における実施例は
キモ・譬・臂イン溶出物の全部のフラクシＭ７を一緒に
して蒸留水に対して透析し凍結乾燥して純化キモ・譬・
母イン製品を得ている。

タンセ／及びＩ−ルの方法により調製されたキセノ９ノ
ダインはスイス（５ｒｎｌｔｈ　）の米ｓ特許ｍ３３コ
Ｏノ３ノ　号の方法に従い患者（ヒト）の凸出椎間板を
化学的細胞核分解（ｃｈ＠ｍ５ｎｕｃｌ＊ｏｌｙｓｌｓ
　）により縮減させるための臨床的試み、即ち動物にお
ける背骨からの凸出円板に対し皺櫛関板の髄＠（ｎムｃ
ｌ＠ｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ）（中心膠質部分）の選択
的溶解に充分□な量のキモ・４／４イ゛ン゛を用いる注
目、に汎用されていることに留意される。但し皺臨床的
試みは患者の約０．　ｊ　１Ｇについて生命゛をおびや
かすア゛し゛ルゼー　的副反応の有意に可能な存在を示
した。

のみならず被処理患者の約３−に及ぶ少数の患者につい
ては遅発性アレルギー反応を呈するのであった。タンセ
ン及びゴールの方法により調製された市販キモ・譬・母
インを凸出円板の縮減と治療とに用いた臨床研究者に°
より報告され九過敏症的則反応の高いＳ＊がいかなる理
由によるかの詳細は未知であって現在に至るまで充分に
明らかＫされず説明鳴されていない。

とはいうものの従前の臨床的試みにおいて使用されたタ
ンセン及びＩ−ルの粗中モ・童・母インハ。

キモ・ヤ・・臂インの第一溶出フラクシ■ンの存在によ
り、不必要な過敏症的危険性を包蔵しているのであり、
＃縞−溶出７２クシ冒ンはジエチル／特許明細書におい
てはタン・ダク分解不活性と記載されている。しかも哺
乳動物に異質タン・母り抗原を注射して該動物がそれを
やむなく保持するならば過敏症によるショックの危険を
招くことは周知である。抗原の種類が多数上あればある
程患者は敏感となる。しかしながら該注射により求め得
る有利な効果は或濃境下１例えば狂犬病の感染の治療に
おけるワクチンの使用下又は動物源から調製された破傷
風抗毒素の使用下、でのやむを得ない付随的危険よりも
勝るのである。

とはいえ堅実な医療の実際ｌにおいて、致命的毒性を呈
する可能性を持つと共に医療効果に疑問のある余計なタ
ンパク成分を追加的に含有するタン・ダク系物質の注射
は治療を受ける患者に過敏症を起させる無用で受容され
難い危険性を与えるということがいわれているのである
。

医学的に異種タン・々り物質であることがわかっている
もの例えば粗キモ・譬・９インの哺乳動物に対する注射
は或危険性をはらむのであるからこの治療操作の最高利
益の達成のためには所期の医学上の目的達成のために可
及的に純粋で可及的に濃化され丸形のものであって過敏
症を起させる抗原の疑をもつ成分を本質的に含まない活
性タン・母り性酵素成分のみを得ること、かようにして
タンノ９り質による免疫学的原性を最少化させその結果
患者の過敏症的７ｍツクを最少化させることが望まれる
。

更に着色タン・やり性物質及び有臭物質を粗キ毫・母・
ぐインから最少化させると患者の過敏症的シ日ツクを減
する。それは該物質は免疫学的反応において通常疑われ
る特性的物質であるからである。

また従前技術は米°国特許＃！≠０３り６ｔλ号明細書
（／り７７年）記載の通り、損傷し又は異状化した椎間
板の治療に当９保存料として添加される重亜硫酸ナトリ
ウムを含有する粗キモ・り・量イン溶液を用いることを
記述している。

けれども該重亜硫酸ナトリウムの使用は突然変異を起す
活性の危険性をもつので受容され得ない。

例えばムカイ等（Ｆ、　Ｍｕｋａｌ　＠ｔ　ｍｌ。Ｂｌ
ｏｃ旧ｍ。

Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ｒｓｓ、　Ｃｏｍｍ、　ｊり、り１ｌ
ｒ３−タｔ？（／り７０刀は大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１　
）を重亜硫酸す）ＩＪコラム処理した結果、復帰突然変
異（ｒ＠ｖ＠ｒｓｌｏｎ　）の数の有意の増加を認めた
ことで戚種の突然変異活性を証し友。シャピｏ　（５ｈ
ａｐｌｒｏ　、　Ｍｕｔａｇ＠ｎ　Ｒ＠５ｅａｒｃｈ　
。

ｖｏｌ、　ｊ　ｆ’　、　／＆！ｉ’−／７Ａ（／Ｖ７
７））　　もまた低濃度の重亜硫酸塩がＯＮ八へ成、細
胞分裂及び有糸分裂１に阻害するのみならず染色体の異
常化（ａｂ・ｒａｔｌｏｎ　）と突然変異とヲ鋳起する
ことを示した。同様にサスマス等（Ｓｕｓｓｍｕｔｈ　
＠ｔ　ｍｌ、。

Ｍｕｔａｇｅｎ　Ｒ＠１．１７０　、２２ター３６（／
り７６）〕は重亜硫酸ナトリウムでｐ目において大腸菌
（Ｅ、　ｃｏｌｌ　）を処理した結果該生残曹１００万
当り１７ｊ００（Ｏ，／−）の変異菌を証明した。従っ
て保存料としての重亜硫酸塩の利益もこれを摂取した患
者に前ガン様変形の無用の危険をもたらすように見受け
られ、特に製薬学的安定性が重亜硫酸塩の存在に依存し
ないという証拠もあるのであるから鋏危険をもたらすよ
うに見受けられる。

本発明は改良方法により製造された免疫学的に低鳳性で
低毒性の純化＝キモ・ダ・母インに関し、更に詳細ＫＦ
ｉ純化キモ・臂・９インと製薬掌上許容され得　　　す
る無毒性還元剤とから本質的に成る薬学的組成物に関す
る。この薬学的組成物は重亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴ＾
及び余計な有臭物並びに着色物を含有しないことにより
更に特徴づけられる。

本発明はまた下記の各工程即ち　　　　　　　　　１（
ａ）　　コラム状のカルゲキシメチル置換交差結合アガ
ロースｒルから成る弱酸性カチオン性交換体であってｐ
ｔｔ約ｔ、ｊ〜７ｊの緩衝水＃Ｉ液で予め平衡化されて
いて／−当りＯｌｏ、２〜０．１０ｉＵ尚　、’量の水
酸化ナトリウムに対し中和能を鳴する骸１カチオン性イ
オン交換体１に粗キモノン・平インの緩衝水溶液を接触
させ： （ｂ）　　カル♂キシメチル瞳換アガロースｒルの平衡
化に用いられた緩衝水溶液のｐＢと同じ数値範囲のｐｎ
をもつけれども溶出液容積に関し共存性。

不反応性、水溶性、製薬学上詐容可能性を有する中性の
無機塩の直線的に増加するイオン濃度をもつ緩衝水溶液
を用いて上記の交換体に保持されたキモノ母・譬インを
溶出させ； （Ｃ）＃出液中の該ｏＪ−溶性塩のモル数が０．２ｊ〜
０、弘にまで増加し到達するまで粗キモノ譬・ｊ′４／
から最初に溶出する着色性有臭性タン・平り成分を含有
する該交換体からの溶出フラクシ耐ンの最初の糸を集め
て排棄し； ［ｄ）　　実質的全部の吸着キモ・量・中インが回収さ
れるまで約０．２３−０．μモルより大きい可溶性塩濃
［において２種のタンノ譬り分解活性命毫／４ノやイン
７５クシ冒ンを含有する交換体から溶出されるキモノ譬
・ぐイン７ツクシーｌ／の系（複数）を連続的罠集めて
保存しニ ー）工程（ｄ）からの活性フックシ瑠ン（複数）を合併
し、中モ・ダ・９インのタンノ譬り分解活性成分を含有
する保存フックシ瑠ンを処理することによって溶存イオ
ン性無機塩と緩衝成分とを除去し；そして （ｆ）　　塩を本質的Ｋｔｔない純化キモ・ダ・ぐイン
＃液を凍結乾燥してメン・譬り分解不活性成分を本質的
に含まない乾燥状純化キ４　、？−譬イ／を製造する各
工程から成る純化キモ・臂・中イン製造方法を４包含す
る。

本発明の純化キモ・譬・臂インは余計な有臭物と着色物
とを含有していないことで更に特徴づけられる。本発明
方法を本質的に連続式で実施し得るがこｔＬｔｉ力ＡＩ
中ジメチルアガロースｒル交換体カ使用中に収縮せずコ
ラムから堆出される必要がなく、但し塩を除くために追
加の緩衝溶液で処理するだけで済む故である。このこと
は従前技術の交換体とは対照的であって例えば従前技術
の力Ａ？キシメチル置換ｒキスト２ンＦｉ使用中に収縮
を起すのでコラムから取出されねばならず水洗、再膨潤
化、緩衝液による再平彎化、そして再使用のためのコラ
ムへの再注入の操作を受けねばならない。

上記方法で製造され免疫学的原性を減じた純化キモパ・
譬イ／は不活性タ、ン・ｆり成分を本質的に含まないが
これは酸性化溶液中で塩化パリクムと沈殿を形成しない
ことで更に特徴づけられる。これは同じ条件下で沈殿を
つくる粗キモ・母・ぐイ／とは対照的であるっ不純キモ
・譬・９インが何故に絆沈殿を生成するのかは未知であ
るけれども粗キモ・母・臂インと既述の純化工程で交換
体から最初に溶出されるキモトリグシン排秦部分との双
方は共に上記沈殿を形成することが特徴的であると決定
されている、 不発Ｆ！４＃ｉまた酸性化塩化パリクムと沈殿を形成す
る有臭物、高度着色物を本質的に含まずタン・９り分解
不活性成分又は他成分物質を含まない純化キモ・譬・譬
インと活性化必要量の製薬年上許容可能な還元剤とから
成る改歳された安定性をもつ凍結乾燥された乾燥状薬学
的組成物であって真空条件下に容器又はバイアル中に包
装され九該組成物にも関する。

異常又は損傷された椎間板の髄核の溶解化又は髄核の治
療に注射して使用するのに適当な好ましい単位投与形は
本発明方法で製造され丸線化キモ・譬・臂インの約１０
０００−　　／／１００　　タンノ臂り分解−位（公称
１ｏｏｏｏ　曝位）と活性化剤としてのナトリウムシス
ティネート塩酸塩（舊ｏｄｌＩＪｎｃｙｓｔ＊１ｎａｔ
ｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｌｄｅ　）とから成り、真空
バイアル内に包装されたものであるニ一般にこの投与孝
位は真空容器中／ｊ〜３０（好ましくはλ３）雫の純化
中モハ・母インと３、Ｏ〜ｊ、　ｔ　Ｎ９のナトリウム
システィネート塩酸塩とから成る。好まＬ＜ａｌ１元剤
（システィン）は中モ・譬・譬イｙｆ）約１１重量−１
それより広い範囲としては７０〜−〇重量−の量で存在
する。

更に本発明は損傷され凸出し或は他の不正常状塾にある
哺乳動物の椎間板の化学的細胞核分解による治療方法に
も関連しており、これは被処理哺乳動物に対する毒性の
危険を減じたことで特徴づけられるが１不法ＩＩｉ製薬
学的に許答司能で椎間板の選択的溶解９董どして充分な
量の上記の純化キモ・９・やインの水浴液を該椎間板の
中へ注射する操作過程から成る。

本発明Ｆｉまた被処理哺乳動物の不正常状態下の椎間板
の治療方法に関連しており、この方法は下記諸操作過程
すなわち： （１）　　該椎間板の中へ針を挿入し：（Ｉｔ）　　Ｘ
線により針の位置を確認し；（ＩＩ）　　不活性成分を
本質的に含゛まない比較的無毒の製薬年上許容可能な量
の純化キモ・ダ・ぐイン溶液を椎間板の中へ注射してそ
の髄核を選択的に溶解させること から成る。

本発明の一目的＃′ｉ、Ｎ化され見金に活性であって毒
性及び（又＃′ｉ）過敏症を呈する危険性を減じたキモ
・９・９インを１製薬学上受答可能な浴液として凸出し
又は他の不正常状態下にある哺乳動物の椎間板に対し注
射して椎間板の髄核を選択的に＃ｌ解させることによる
上記椎間板治療方法の提供にある。

本性はま九哺乳動物の異常な椎間板の化学的細胞核分解
方法をも包含する。

本発明の他の目的は実濃度の本質的に完全ＫＭ化された
タン・々り分解性キモ・譬パインと製薬宇土許容可能な
無毒性還元剤とから成る薬学的組成物であって哺乳動物
への注射に適轟であり哺乳動物に対する毒性が少〈タン
ノ譬り分解不活性のメン・譬夕質又はその他の有毒成分
を本質的に含まない上記の組成物の提供にある。

更に本発明の他の目的は凍結乾燥状口にあるキモ・母・
譬インを活性化させる九めの還元剤と純化キモ・９・々
インとから成る高度安定性旭方物の提供にある。

なお他の目的＃ｉ純化中峰・ダ・譬インと天然還元剤と
から成る乾燥状投与単位の提供にある。

本発明の他の目的は着色物、有臭物及びタン・譬り非分
解性の即ち、不活性のタンΔ夕成分を本質的に含ます哺
乳動物に注射され九場合にも毒性少く及び改は）過敏症
を呈することのない純化キモ・ン・母インの製造方法の
提供にある。

更に本発明の目的は収縮せず再使用の際に取出サレる必
要のないカルメキシメチルアガロースｒルコラムの使用
による純化キモ・９ノ量インの製造方法の提供にある。

本発明方法で用いられる純化キ毛・り・母イン製造のた
めの出発＃料物質として使用される粗キモノｌノ母イン
はキモツヤ・９インとして既知されているものを構成す
る３種フックシｌン即ち３〜成分を含むがこれらはクロ
マトグラフィ技術により互に分別され得る。該３株数分
はタン・（り分解不活性（タンツク分解不能）の着色有
臭成分（／ｅｌ）とタン・９り益解活性（タン・ぐり分
解可能）の２１１成分ルち本明細書でキモ・９・母イン
ｌ及び璽と称する成分を包含する。粗キモ・譬・母イン
はインセン及び７２−ル法（Ｊａｎｓ＊ｎ　ａｎｄ　Ｂ
ａ１ｌｓ　、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ
。

／　’Ｊ　ｅ　９９．弘３９−１．ＯＣ／り＠／））に
よって得られるがこの方法は市販・ゼ・母イン濃縮物を
酸性浴液とし、この溶液を高いｐＨ値において塩イヒナ
ト１ノウムにより飽和させ１．Ｉｆを下げ、その後に粗
キモ・母・９イン溶液を透析して塩不含溶液を作り１次
にこのＳ液を凍結乾燥して乾燥状粗キモ・ぐ・豐イン製
品を得る操作を包含する。

上記のタンセ／及び−−ル法によ動詞製され九／を本発
明方法により純化して不活性、着色、有臭及び免疫学的
原性諸成分を除去する。下記の諸例はインセン及び？−
ル法で調製されえ粗キモ・臂・々イン出発出発含料いる
純化操作を例証する３７≠のリン酸ナトリウム緩衝液中
にとｄ−し２〜め０．　Ｏｊ　Ｍリノ＃にナトリウム緩
衝液で平衡イヒさせておいだ容横約／、　７　ｔ　（お
よその原寸法は・ｊｘｆＯｃａ）のカルげキシメチル置
換交ａ結合アがロース樹脂のコラムに対［７て加えた。

該樹脂は／　ａｔ当り約０．Ｏｊｉ’）１鳳の水酸化ナ
トリウム中和能を有していた。

Ｃ００，０５Ｍリン酸ナトリウムでｐ［１７≠に緩衝化
された塩化ナト１７ウム溶液の勾配（ｇｒａｄｌｅｎｔ
　）をコラム入口に適用し、かようにして塩化ナトリウ
ム濃度がθ〜／、ＯＭ　（／容積当り）に［＃ｓ的に増
加するようにした、該勾配の約１１．ｔｔがコラムに適
用された場合に塩化ナトリウム添加濃度が１モルとなる
ように該勾配を調製しておいたのである。

Ｄ、　コラムからの流出液を滴数針の助けにより試験管
中にλｊＷＬｔのフラクシヨンとなるように約≠θ時間
かかつて集めた。

Ｅ、各部分の夕／・！り質含量と各７ラクシヨンの活性
とを分析した。各フラクン＝１）から０．５１１１４の
試料を採取しこれについてピクレノトテストにより総タ
ンノリ１１に測定した　キモ・！・！イイを用いるエル
ラ／ゲ０ル４　（Ｅｒｌａｎｇｅｒ、＾ｒｃｈ。

Ｂｌｏｃｈｌｍ、　ＢＩＯｐｈｙｓ、　９ｊ、２７／−
７１ＣＩ５／６／　））に従い各フラクシヨンからの０
．θｊ　ｍｌの試料についてＤＬ−α−ベンゾイル−ア
ルギニン−Ｐ−二トロアニリドの加水分解能を測定する
ことによりインノ４り分解活性を定めた。連続的に集め
られ九フラクションに対し相対的タンＡ　ｌ　を量をｌ
ロットした。各フラクション。、ｊｙｄｆビウレット試
薬ｊａＪＫ対して加えて１６分後のｊ　ｕ　ＯｎｍＫ　
オけるｔｋ党ｇ（＾）Ｃ＾ｊ４！０　）　を測定するこ
とＫよりタン・譬り含量を便利に測定し得る（第７図参
照）。

Ｆ、　塩化ナトリウム濃度θ〜約０．１７ｔモルにおけ
るコラムからの最初の流出分（濃褐色成分）に該当する
インノ９り成分含有２ラクシｉンを排秦した。

Ｑ、　　０．　＄　−１モルの塩化ナトリウム１ｌＩｆ
において回収された残りのフラクシヨン（複数）を合併
し２〜Ｊ”Ｃで蒸留水（数回とりかえ九）に対して透析
して塩化ナトリウムと溶解緩衝剤とを除Ｈ０この脱囁生
成物を次に／　Ｎ　ＮａＯＨを用いることによりｐｌ？
ＪＫ崗整し凍結乾燥して約／ｌ、ｊｇの純化キモ・しＰ
イ／を生成させた。

添付図口において゛極大１−（＾）を有する第７キモ・
豐・母インタン・９り成分は塩化ナトリウムモル濃度約
θ〜約０．２ｔ　−Ｏ，４Ａモルにおいてコラムかう溶
出されるがこれｔま高度着色有臭フラクションであるユ
このフラクシヨンを排葉した。極大値＾（しばしばタン
・９り分解不活性である）として同定されるタン・９り
質は粗キモ・母・母イン中に見出される着色要素の大部
分を含有していて酸性化塩化バリウム溶液で沈殿物を形
成する特性をも有する。

これに−〕＜流出物フラクションは塩化ナトリクム諷度
θ揮〜／七ルにおいて二つの重加の主甑大値を生じ、こ
れらはキモ・母・９イン１及び輩として四足された。

上記の例１にろぐされた通りコラムから回収され　　　
□たキモパゼイン！及び田の構成分はタン・母り分解活
性であって酸性化塩化バリウムａ液で沈殿を生成しなか
った、 コラムに吸着されていたタンパク分解不活性成分を言’
Ｗする＠−ｔモノ譬・ンイン及び、２ａｉのインノ＋り
分解活性成分であるキモ・母・！イン１及び■はＩＪＩ
ｌ乙、ｊ〜７ｊ、好ましくけｐｔｌ　７．３〜７．５　
Ｋ維持された緩衝溶液中で勾配をもつ堰（即ちＮａα）
溶ｉ１＆によりコラムから溶出される。

最初の成分（極大値Ａを有する）はコラムから溶出され
てから排秦されたがこれは総揚質量の約／ｊム１％を構
成する。

溶出物残分はタン・ｆり分解活性キモ・セ・ゼイ／成分
Ｉ及び鳳から成るがこれらは塩濃度的０．．２６〜Ｏ８
≠〜１モルにおいて回収される。該２種の特性的主極大
成分即ち夕／・９り構成分は収集された勧賞の約ざま優
を占め、添付図面に示される通り約０．５及び０１ｇモ
ル塩の濃度において溶出される。

上記の吸着及び溶出工程を約２〜ｇ℃の冷蔵庫温度の下
で遂行する。キモ・千・Ｉイン１及び履を含む収集され
た溶出ノフクシ５ｙ（４％数）を合併し水に対して透析
して塙並びに可溶性緩衝成分を除去してから濾過し滅１
する０次いで該塩不含の不買的に純化されたタン／４り
分解活性のキモ・そ・ザイン夏及び厘の溶液を凍結乾燥
する。出発原料としての粗中モ・４パインにもとづく全
収率は約５０〜６０−である、酸量あ不活性物質を除去
したけれどもｉ＆繍調製品単位重量当りの活性は増加し
ていない。これは恐らく操作過程で酵ＩＬ（活性）が損
失される故であろう。

不旧常又はヘルニアを起している唯間板の治療に従来使
用されていた粗キモ−々・譬インは多数のフラクション
を持っていたことが明かである。核粗及び本発明゛の純
化キモ・臂・臂インを動物試験によって比較したが、−
物試験で観察された通りの高毒性を呈するタン・ダクフ
ラクション（４大値＾ニ咳旨するンを本発明方法をこよ
り除去したのである。

本発明の純化キモ・等・９インはｉｌｌ　（ＨＣ／ｉ！
　＞溶液中の塩化バリウム試験により従前技術の粗中モ
・ｆ−タイ／から区別され得ることは指摘し良通りであ
る。

塩化パリ９ム番（よる沈殿生成は従前技術の粗（又は有
毒）４−モ・譬・臂インに特性的であるけねども本発明
の純化キモ・母・ダインは該沈殿を生成しない。

下記の１＃１Ｆｉ粗牟モ・譬・臂インと純化キモ・臂・
母インとを区別するのに用いられる塩化バリウム試験の
操作を示すものである： 例　　２ ）記の各中モ／ｆ／ｆイン試料の夫々の１〇−（Ｗ／Ｖ
　）水溶液を１−のＩ　Ｎ　ＨＣＪで酸性化し、これに
対し、米国薬局方ｘｘｊ［Ｊｌ１１１０！５１所載の通
り１２Ｍの８ａＣ）２を蒸留水にとかして１０〇−とす
ることによ抄米局方試験溶液として調製され九１２１Ｇ
（Ｗ／Ｖ）塩化パリワＡ　（８ａＣＪ２　）の１ｗ１ｔ
を添加して下記の結果が得もｆ′した：型中モ、４Δイ
ン　　　　結　　　　果実　験　＾　　　中等度乃・至
重度の沈戚実　験−Ｂ　　　中等［０沈駿 夷　験　ｃ　　　　４Ｍ等度の沈殿 実　験　０　　　中等度乃至重度の沈殿純化中モ・青・
臂イン　　　結　　　　果夷験Ｅ　ａ明 純化キモ・ヤ・臂イン　　　結　　　　果実　　験　　
Ｆ　　　　　　、ｉｉｌ　　　明実　験　Ｇ　　　本質
的に透明（かすかなく　　も　　リ　　） 実験Ｈ透明 本発明の純化キモ・母パインは出発原料としての相中モ
／４・苛インに比し着色と臭気とを減じたことによって
も特徴つけられる。粗キモ・４パインをζ兇られる着色
及び（又は）臭気の７アクターはりＵマドグラフコラム
から溶出されるキモ／４’　ｔ４インの第一成分（＾）
（癖集成分）に伴うものであって上衣の通り塩化パリウ
＾浴液により沈殿を形成する。

＠キモ・４パイン甲に見出される着色及び有臭成分を有
する排秦沈毅成分は准関板に注射され１１ｃ罹患哺乳勧
物にＩｌｉ察される粗キモ・臂・臂インの毒性（過敏症
的ショック）と明かに関連を有する。

本発明の純化キモ・４パイ／＃品の減少又＃ｉ最少化さ
れえ着色度と該純化製品の酸性条件下の塩化バリウム溶
液による沈殿不生成とは椎間板治療目的に使用される徂
キモ・譬・臂インを注射され良数多のＪｌ′４に生起し
九過敏症的又は毒性的反応の大部分に関係あ妙と信ぜら
れた該製品に伴う＾毒性の危険性のないことの尺度であ
ると考えられる。

本発明方法で製造されたキモ・々・ダインは砿処場哺乳
勅物の罹患した、不正常又は凸出し良准関板の治療のた
めに４１ｉ４１板の髄１１ｏｓ解に充分な量の純化中モ
・譬・母イン＊＊を被処理動物の槽関板円へ注射針によ
り１豊注射することに使用される。天然俸遁元１ｌｉ１
例えばナトリワムシステイネート塩酸庫を中モ・臂・臂
インと１＃柑することが通常好ましいけれども池の系学
的Ｋｆｆ１！される還元剤例えばグルタチオン、ナトリ
ウムチオグリコレート、システイニルグリシン、ノテオ
エリスリトール、ジテオスレイトール又Ｆｉ異性体嬌（
Ｄ％　Ｌ又社ＤＬ）をｌ用し得る。ナトリ９ムシステイ
ネート塩酸塩が着も好適な活性剤即ち還元剤である。

従萌ｆｉ術は准閾板治療に際しキモ・膏〆青インを保存
料としての重＃！値績ナトリワム及びＥＤＴ＾と併用す
ることを好適とし友がこれらの感剤Ｉｍ！用は毒性の可
能性を有するのみ彦らず不必要でもある。

事実、重亜硫酸ナトリウムの使用はその毒性の故に禁忌
であるＬまたその突然変異活性にかんがみ発ザン性の危
険を伴う。

本発明の純化キモ・譬・ナインの特殊な投与単位形とし
ては本発明方法で製造さねぇ純化凍結乾燥キモ・譬／＃
インであって酵素活性度約１００００〜１１５００単位
を有する線中モ・譬・中イン２５■及びナトリウムシス
ディネート塩酸填め３．５〜を含有し真空バイアル中に
包装されていて重亜硫酸ナトリ９ムを含まず又はＥＤＴ
＾（エチレンシアばンテトツ酢＃）を含まないことを特
徴とする該投与単位形が企図されている。

一般をこ、システィン及びその他の還元剤はエルランダ
ル法で分析して両足された中モーぐイイン酵素率位で責
示して１００Ω０＃素単位当り約０．５〜１０ＩＩ９の
量で使用される。

下記の例は典型的な単位投与形をもつ凍結乾燥製品製造
の一例である。

配合物の代表的ｌｌｌ！法 ｊ　　ＤＬ−α−ペンソイル−ｐ＃ニトロアニリド１の
加水分解重包含する方法を（工り試験された純化中モ・
４／４インは１■当り５２２単位を含有していた。

２、ヤモ・！・臂イン（純化埼み）の１００１４イアル
を製造するために１２５−の容積の溶液が会費であった
。８バイアルに対し１１５００酵素単位富有＃ｌ液の１
．０−とナトリウムシスティネート塩酸塩の０．０２ミ
リモルとを加ええ。操作中にこのｆｆｊ液を１０Ｃ以下
１ｃ保持した。

五　上装置！−のＷ！液を次のようをむして製造した；
畠、注射用の煮沸水又は冷却水約１００−に対しＬ−（
イ）システィン塩酸塩−水和物を加え最＃Ｉ容積１−当
り０．０２ミリモルを提供するようにし斤。

所＊ｉｉη＝０．０２ミリモル／ｊ　　Ｘ　　１７５．
４幇／ミリモル　ｘ　　１２５ｍｇ 添加量■＝４５９ 所豪量の躊寅を編加し喪後に約２−のｌＮＮａ０Ｈｔ用
いてｐＨ（ｒｊ−”よそ５．５に＠＠Ｌ、ｆｃ。

４、　次ＶＣキモ・譬／譬インを加えて蝋終容積中１−
当り１１５００単位を提供するよう−こした＝添加量〜
＝２７５３．８ この溶液を攪拌して全５ｅｔｓ解させ、１ＮＮａＯＨを
加えてｐＨを６．０とし、注射のために充分な量の水を
加え千容積を１２５−に至らせた。

５、　威曹するためにこの溶液を代価０．２ミクロンの
フルイを通過させた。

６　次に８１５−の１００個のがラス類・４イアルの夫
々に１．０−の純化中モ／譬１４４ンーシステイン漕液
を加えた０分鏝血清パイアルストツ・母（ｓｐＨｔ　ｓ
・ｒｕｍ　ｖｉａｌ　５ｔｏｐｐ・「ｓ）を部分的に挿
入し、・−イアルを自−停止装置付−の凍結乾燥器へ装
入した。

Ｚ　固体として凍結するまで凍結乾燥室中に真空下に一
５０℃にバイアルを保持してから約９０ミクロン（Ａｅ
対値）の圧下に約５０時間かけてしずかに鴎度を上げて
水を分−させた。

８、　ストン・Ｉ−を完全をこしてから凍結乾燥室の真
空を破抄、アルミニワムの封を加えた。

９、　　各ハ（フルは２３■のキモノ母パイン、３．５
■のナトリウムシスティネート塩酸塩を含み１１５００
単位の酵素活性ｌ＃：含有する白色綿毛状製品を含有し
ていた。

下車は本発明の純化キモ／４）（イン製品の低毒性と効
果とを証明するために遂行された一連の試験を記述する
本のである。

カナダで購入した従前技術による市販キモ・ヤ・母イン
〔製造元はバクスタートラベノールラがラトリ　−　！
　　（Ｂａｘｔ　・ｒ　　Ｔｒａｖ＠ｎｏｌ　　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ）　　）　　Ｃ本Ｉｊ＋１＃１ｌ
Ｉｌ書において検体＾と称する）、本発明の純化キ毛・
母パイン（本明細書において検体Ｂと称する）及び対照
として滅菌水（本明細書において対照Ｃと称する）を異
る被検−物に対し静脈注射することにより静脈注射急性
毒性比較試験を行つ良、検体Ｂは既述の例１〔記載の方
法曇ζより２３．０■の純化キモ）譬パインと３．５１
ｋｇのナトリウムシスディネート塩酸塩とを言む凍結乾
燥投与単位の水嬉液として製造された。対照の検体＾は
約２７■の粗キ篭ノ臂ノ臂イン、０．５７ＷｋｇのＥＤ
Ｔ＾ニナトリ９ム及び３．５〜のナトリウムシスティネ
ート塩＃塩を含有していた。

試験１（・・ツカネズば） ＣＤ−１系の１０匹の若い成熟７９ス（雄５及び−５）
の夫々に対し検体＾及びＢのｌａｇ　（ｄｌ＆夫々２０
００及び２５００拳位／−を有する）の０．０１ｍ／９
（停電１−当り２００００及び２５００口単位に該当す
る）を静脈注射しに、圧側部位は尾の１４１圓の静脈で
あり、注射速縦は３０秒間壷こ１−であった。投与後２
１／２　及び４＃ｊ関目、その後は１日２（ロ）（午前
と午後）だけ全期間１４日間にわたり被検マウスをＩｌ
ｉ察した。

検体（対照製品）＾を与えられたマウス１０匹のうち４
匹は注射後４時間以内１〔死亡した。検体＾を注射され
た生残マウス６匹の尾＃−ｊ１１死の徴症を示し九、検
体（発明製品）Ｂを注射されたマウス１０匹のうちの４
匹は２日目（雄１及び雌１）及び４日目（朧２）Ｋ死亡
した。生残マウスのうちの１匹は試験期間の終りに翅の
壊死の徴症を示した。検体（対照）Ｃを注射されたマウ
スに死亡はなかった。

、各＃４頭のウサギ（塩２雌２）から成る３鮮に対し体
重１４当り１０００単位（検体＾）及び１０００単位（
検体Ｂ）の投与単位で体重１４当り０．５−の各検体を
静脈注射した６４頭のウサｆ（ｉ’）５ち３１ｉ（Ｍｋ
２雌１）Ｆｉ検体＾注射ｖｋ４時間以内に死亡した。検
体Ｂを注射され九すべてのウサギは対照（検体Ｃ）を注
射されたウサギと同様に生き永らえ友。

以上の試験結果は従来技術によるキモノ９・母インが本
発明の純化キモｉ母）４／インよりもかなシ高い毒性の
危険性を有することを示している。

アレルギー性の減少化（モルモットの皮膚感作）健康教
育福祉省刊行物［ｔｈｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　Ｈｅ
ａｌｔｈＥｃｌｕｃａｔｌｏｎ　　ａｎｄ　　Ｗｅｔず
ａｒｓ　　Ｐｕｂ、　　Ｎｏ、　　７　８　　２　３（
Ｎ、ｌ、Ｈ，）］　紀献の操作により研究着手前１７日
間にわたり保守されたハトリ系（Ｈａｒｔｌｅｙｓｔｒ
ａｉｎ　）　　の白色種成熟モルモット雄３２頭につい
てモルモットＶＣよる皮膚感作試験全行った。試験前２
６〜２７時間の時に各モルモットの横腹と背とから毛管
剃り路した。皮膚異常（ＤＩ］ち紅斑、抽傷）及び体重
の偏りを呈する動物全試験から除外（７た。選択された
３２ｗＡの群からランダムに３０頭の被検動物をえらん
た。前記の検体Ａ及び８に滅菌水管配合して注射用液を
作った。検体Ａ（市販キモ・ｉ−量イン）のＩＩｋＩｆ
は２０００単位／−であり、検体Ｂ（純化キモ・ぐ・９
イン）のｌ１ｌｌｌｆは２５００単位／−であった。陽
性対照（ｐｏｓｌｔｌｖ・ｃｏｎｔｒｏｌ　）として２
，４−ジニトロ−１−クロロベンゼンのｏ、ｔｌ（Ｗ／
Ｖ）溶液管作りこれを検体りと称する。陰性対照（水）
會検体Ｃと称する。各被検群に１０ｉｉ１ｉの動物’を
使用した。

動物の右横腹に対し検体＾、８及び陽性対照楡＄４Ｄを
皮肉注射（２て感作試ｔＩＩＩ４を行った。、陰性対照
の江射物（検体Ｃ，滅−薗水）を各群の全被検動物の左
横腹に皮肉注射した。試験及び対照動物に対し一１０置
部作投与が終るまで１日おきに、１週間当り３回注射し
た。箪１番注射１は０．０５ｍでそれに続く９回分の感
作投与量Ｆ′１０　、１０−であった。

第１０置部作投与量管注射してから２週間後に試験及び
対照検体の０．０５−の攻撃投与ｔｔ＝感作投与量きし
て同様に注射した。

死亡動物の有無について１日２回（午前及び午後）６７
日間にわたり観察した。

注射ｆ２４及び４８時間目に皮膚損傷について配録し、
紅斑強度についてＩＩ′ｉｉｉ径（ひろ力１す）と＃腫
の高さく吹出物）ｆｒｉｌｌ定し九。

下表ｔｊ２４時間及び４８時間目の観察結果の平均値で
ある。

紅斑直径＄　　浮腫の高さ率 検体＾　　　　　１４．８ＪＥｊ　　　２．２７ｄＬＭ
検体Ｂ　　　　　　　９．９ｉｇＪ　　　　１．７３ｕ
検体Ｄ　　　　　　１１．０６ｕ　　　２．７１ｉｕ（
１ｍ性対照） （注）＊動物１０１ｊＫついての平均値：但し検体りの
場合ＫＦｉ２１［死亡のため８験についての平均値 上表の結果は本発明の純化キモ・４’／母イン配合物よ
りも市販キモノリ母イン配合物の方が有意に高い感作値
會有することを示［７ている。検体＾は陽性対照検体り
即ち公知感作物２．４−ジニトロー１−クロロベンゼン
よりも高い感作値を有していた。

統計学的分析によシ検体ＡとＢとの紅斑（Ｐ＜＼ ０−０２５）及び浮腫（Ｐ＜０．００２）Ｋ関する差異
は有意であることを示した。

核の溶解化（効果） 未成熟の綿糸ピーグル犬（Ｂｅａｇｌａ　ｄｏｇｓ　）
の４１１１について腰部の連続２個椎骨関の円板の髄核
に対し検体８１１１９２５００単位／−１検体ＡＩＩＩ
ｔ２０００単位／ｓｄ、椎間板１個轟り投与量としては
検体８１１５単位、検体Ａ１００単位において試験用検
体Ｂ及び＾、並びに検体Ｃ（対照）を夫々注射し喪、背
柱の×線写真、血液学、臨床化学的検査及び剖検により
、それＶＣ続く特に注射個所の選択された組織の順黴鏡
検査により被検犬を検査した。

１４日後に検体Ｂ（純化キモパ・母イン）注射大の４３
１すべてについて推骨間の間隙が扶〈なっていることが
Ｘ線フィルムで示された。検体＾の場合Ｋｔｆ４−のう
ち５頭の犬について１４日後の骸関師が挾〈なっていた
。

注射後１４日目に検体８注射大４頭中４頭について椎間
板の肉眼的組織変化の徴症が示されたがこれとは一対照
的に検体＾注射犬４１１ｉのうち２ｉａのみについて該
重症が示されただけであった。対照については何の変化
もなかった。検体Ｂ（純化キモ・９パイン）注射犬ａ僅
かに乃至中勢度に軟骨形成（髄　核の杏生長）′に不し
たが検体＾注射犬は着しく僅か乃至僅かな変化を示した
のみであった。

上記の事実から本発明方法で製造された純化キモ／ｆ　
ａ＋インは特に前記のモルモット感作試験で示された通
り従来技法の粗キモパパインよりも有意に低毒性である
新型キモツバインであることが明らかである。

その他の諸検査により本発明の改良され純化された新型
のキモノｅパインはヒトを含む哺乳動物の不正常で損傷
し又は凸出した椎間板の治療に確信分もって使用され得
ることが明かである。

上文に示された通り純化キモノ母パインは本発明方法に
より一本實的に連続的な方式で製造され得る。

それはカル？キシメチル置換アガロースｒル樹脂が使用
に当り容積収縮を起さず洗浄による再生及び緩ｓｉを用
いる再平衡化並びに再りＩ＃潤化のためにコラムから取
出される心壁性が無いからである。

しかるに例えはセファデクス〔ｌＳ・ｐｈａｄ＠ｘ　’
ＣＭ−５Ｑ（カル？キシメナル置換交差結合デキストラ
ン共重合体）〕のごときイオン交交換側についてけ上記
の作業の必璧性があるし、その後にコラム内へ注入され
るのであるから費用を要し時間管消費する方法である１
本質的に連続的な方式で本発明方法を操作するためには
カルがキシメチルアガロースグルの再生はコラムを通し
て追加量の緩衝液をその場所で注入するのみであってか
ようにして木枯における即時の再使用のための平衡化が
行われる。樹脂の収縮は無く、取出し、洗浄又は再膨潤
化の必要けない、その他の本発明で使用されるために適
当な不収縮性樹脂支持体はアクリルミドグル樹脂である
。

【図面の簡単な説明】

添付図面の館１図は粗キモ・９ノ母インの純化における
フラクションの図示であって樹脂コラムからの溶出液の
順次に集められたフラクションのタン／ｌり含量（ビウ
レット試験における吸光Ｉり（左方の縦軸〕とそれに対
応する収集流出液容積（−）〔横軸〕についてプロット
された図示である。オ九破１１（Ｉｉ［Ｉｉ的）けＮａ
（ｊ［ｌち塩Ｉｌｌ：（右方縦軸）であって直線的勾配
にそって流出液容積に対応して７”ｏットされ九０−１
モルのＮａα濃度を表す。 タンノ臂り含量はビウレット１桑５ｄＫ対し各フラクシ
ョンの０．５ａｄｆ加λ１加分１５５４０ｎｍＦおける
吸光度＾（Ａ５４Ｑ）を測定して定められる。タンノ母
り分解活性はキモパ／４’インに適用されたエルラング
ル法の変改法により、キモ７９１９１７６１合物に関し
４１”Ｏｎｍ　Ｋおける吸光１（Ａ４１Ｑ）１ｆｒｌロ
ツトして定められる。 Ａ・・・インノ４り分解不活性部分の極大値ｌ・・・キ
モノ千ノ母イン成分１ ■・・・キモノ臂ノやイン成分Ｕ 代理人 弁理士　　中　　　村　　　　　　　捻回　　　　１１
１　　　　　本　　　　　　　　　部同　　　　串　　
　　岡　　　　八　　　　部間　　　大　　　　塚　　
　　文　　　　開開　　　・−′　　　戸−嘉　　　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ａｍされ純化されたキモ・４′〜・ｌイ／製造
   の友めｆ）祖＋＋Ａ・？インの純化方法において。 ｌａ）　　ｐＨ約４．３−−７．５の緩衝水溶液で予め
   平衡化されたカル？キシメチル置換交差Ｍｅアガロ−Ｘ
   　ｐ　＆のコラムカラ成る弱酸性化カチオン性交換体と
   祖キモ・母パインの緩衝化水＃８液とを接触させ； （ｂ）　　カルＩキシメチル置換ア１ｆａ−スｒルの平
   衡化に使用され同じｐＨ値を有する同一緩衝水溶液であ
   るけれども但し溶出液容積に関し共存性、不反応性、水
   溶性、製薬学上許容可能性を有する中性無機塩の１１８
   的に増加するイオン濃度をもつ該緩衝水溶液を用いて上
   記の交換体に保持されたキモ・９／４インを溶出させ；
   ｉｃ）　　！出液中の一司溶性塩のモル数が増加して０
   、．２　ｊ−０，＋に到達するまで交換体からの粗キモ
   ・譬・９イ／の最初の夕／・ンク成分を含む最初の浴出
   液フフクンーンの糸ｔ″ＩＩｋむて排業し；（ｄ）　　
   実質上すべての吸着キモ・ゼ・やインが回収されるまで
   約０．．２ｊ〜０．≠モルよりも尚い町浴性−増加＃度
   において２樵のタン・炉り分解活性キモ・ぐ・ヤイン成
   分を有する交換体からのキモノンノ４イ／＃出フノクン
   ヨ／のｉｎ！ｉ）を連続的に集めて保存し； （ｅ）　　キモ・ゼ・平インのタン・９り分解活性成分
   （複数）を含む該保存フック７日／を処理することによ
   って俗存イす／性無機塩と稜債成分とを除去し；そして （ｆ）　　場を本質的に含まないキモ・臂・奢イン溶液
   を凍結乾燥して夕／・ぜり分解不活性のＲＯち有毒の成
   分を本質的に會まないタン・９り分勢后性乾燥状純化キ
   モ・９・ゼイ／を製造することを特徴とする剖紀の方法
   。 （２）　　使用される彪出用鉦４＃浴液が０〜１モルの
   濃度勾配をもつ水＃性無機塩を富有することを特徴とす
   るｖｉＩｆｆＩＴＩＩ＋求の範囲第１積に記載の方法。 （３）　　溶出液に使用される水溶性塩が塩化す）　Ｉ
   Ｊウムであることを特徴とする特許請求のｆｇ８納／項
   に記載の方法。 （４）　　工程（Ｃ）における可溶性塩濃度が約０．３
   モルに達することを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 （５）　　工程（ａ）乃至（切が約−〜ｆｃの温度下に
   遂行されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 （６）　　カルｌキシメチル置換交差結合アガロースｒ
   ルカチオン性交換体が／ｌｌＬｉ当り約０．０．２〜約
   ０．１０ミリ当量の水酸化ナトリウム中和能を有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の方法５ （７）　　回収された純化キモ・９ノダインが酸性化塩
   化バリウム溶液で沈殿を生ぜず着色物質を本質的に含ま
   ないととｔ−特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   方法ユ （８）　　９７ｔｌｌ塩カ約０．０！モｔノ濃ＷｔＯ／
   、２〜／１−一度（重量対容横）のリン酸塩酸術液中に
   着１．へ、 色相キモ・！・９イ／′ｔ−溶解させることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （９）　　ＯＪ溶性イオン化無機塩が工程（ｅ）で透析
   によってキモ・臂・量インから除去されることを特徴と
   する特許請求の範囲°第１項に記載の方法。 α１　工程（ｅ）がｌＰ遍及び滅菌の工程を包含するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 Ｈ交換体から最初に溶出される粗キモ・ぐ・ダイン着色
   タン・やり成分の充分量が除去され、それによって交換
   体から溶出され回収される残分としてのタン・豐り分解
   活性キモ・臂・臂イン成分の酸性化溶液が塩化バリウム
   溶液（米国薬局方）と沈殿を生じないことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （２）特許請求の範囲第１項に記載の方法によって製造
   されたことを特徴とする純化キモノ譬・譬イ／製品。 （２）　溶出液から純化キモ・譬・９インを回収し友後
   に残留塩を除去するのに充分な容積の塩不含緩衝＃を欲
   をコラムへ適用してコラムから残留塩を除去し交換体を
   子側化させて特＃ｆ饋求の範囲第１項に記載の方法を嵯
   返し遂行することｔ−特徴とする本質的に連続式である
   特１ＦＦｉ１１求の範囲第７項にｉＣ−の方法っ α◆　タン・臂り分解不活性、抗原性の増色物質を本質
   的に含まない純化キモ・セ・臂インの同定方法において
   、純化キモ・母・母インの酸性化溶液を塩化バリウム離
   液と処理したときに沈殿を本質的に生成しないことを特
   徴とする上記の方法。 榊　夕／・千り分解不活性成分を＊質的に含まない純化
   キモノｆノ量インであって該純化千七ノ９ノ母インの７
   ０−（嶌ｔ／容積）ｌ！８液を塩酸で酸性化して塩化バ
   リウムと処理したときに沈殿を生成しない該純化キモ・
   臂・母イン製品と少量の製薬学上許容司能な無毒の還元
   剤とから本質的に成ること′ｋｖｔ値とする！＆１１薬
   学的組成物。 ０４　　ａ　元剤カナトリウムンステイネート塩酸塩で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１ｊ項に記載の
   組成物。 （ロ）重亜硫酸ナトリウム及びエチレンノアンンテトラ
   酢酸を含まないことを特徴とする特許。請求の範囲第／
   ｊ項に６ピ載の純化された製薬学的組成物。 （２）純化され本質的に無色の夕／・９り分解活性キモ
   ・ｊ−母インにおいて、その１０％（重量／容積）溶液
   が塩酸で酸性化され塩化バリウムで処理されたときに沈
   殿を生じないことを特徴とする上わ己のキモノｆ、４’
   イン。 （６）凍結乾燥された純化キモ・母・９インであってタ
   ン・母り分解不活性成分を本質的に含まず比較的Ｖこ無
   毒であり、その１０％ＣＭ量／容積）溶液を塩酸で酸性
   化して塩化バリウムと処理したときに沈殿を生成しない
   該凍結乾燥純化中モ・臂ノダインと少量の慣性化量の薬
   学上許答可能の還元剤とから成り；但し該還元剤が純化
   キモ・昔・臂インの約７θ〜約、２０重量−の量で存在
   することを特徴とする安定な製薬学的組成物。 （ホ）還元剤がナトリウムシスティネート塩酸塩である
   ことを特徴とする特Ｉｒｆ鋺求の範囲第１り項に記載の
   組成物。 Ｑυ　ナトリウムシスティネートが固体の純化中モ・臂
   ・ぐインの少くとも約１ｓＴＬ量饅の量で存在すること
   を特徴とする特許請求の範囲Ｉｓ、２０項に記載の組成
   物。 四　約４３ダの純化キモ・譬・ダインを含むことを特徴
   とする特１ｔ’ｆ請求の範囲第１り項に記載の組成物。 （２）約３〜３．６〜のナトリウムシスティネート塩酸
   塩を含むことを特徴とする特許請求の範囲第、２２項に
   記載の組成物。 −椎間板の髄核を注射によって溶解させる丸めに使用さ
   れる投与単位形の安定な製薬学的組成物において、タン
   ｉ４り分解不活性のタンツク成分を本質的に含まない純
   化キモ・譬・譬インであってその酸性化水溶液を塩化バ
   リウム試薬で処理したときに沈殿を起さない該本質的に
   無色の純化キモ／臂／嫁インの約１ｏｏｏｏ〜／／！０
   ０タンノぐり分解単位と活性化剤としてのナトリウムシ
   スティネート塩酸塩とが真空下に容器内に色値されてい
   ることを特徴とする前記の組成物。 曽純化キモノ臂ノダインが２３ダ、ナトリウムシスティ
   ネート塩酸塩が約３．　ｊ　ｑの量で存在することを特
   徴とする特許請求の範Ｓ第２弘項に記載の投与巣位形の
   製薬学的組成物。