JP2005514326A - ミクロスフェア中に封入されたタンパク質およびアジュバントを送達するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

タンパク質および/またはアジュバントを有機媒体中に可溶化するために疎水的イオン対形成（HIP）を利用する。ポリマーを培地中にともに可溶化し、タンパク質および/またはアジュバントを封入したミクロスフェアをシングルエマルション法によって作製することができる。本方法によって調製されたミクロスフェアは、タンパク質の初期バーストの小ささおよび経時的な段階的放出を示し、強くかつ広範囲にわたる免疫応答を誘発する。ミクロスフェア中に共封入されたタンパク質およびアジュバントを含む組成物を提供する。

Description

本出願は、2001年7月10日に出願された米国仮特許出願第60/304,590号および2001年11月9日に出願された第60/346,013号に対する恩典を主張し、これらそれぞれの内容は参照として本明細書に組み入れられる。本出願の全体を通じて、さまざまな刊行物が参照される。これらの刊行物の開示内容は、本発明に関係する技術分野の現状をより詳細に記載する目的で、その全体が参照として本出願に組み入れられる。

発明の技術分野
本発明は、ワクチンおよびアジュバントの送達のために用いうる製剤、組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質ワクチンおよびアジュバントのより効率的かつ効果的な送達を可能にするミクロスフェア、ならびにミクロスフェアを調製するための方法に関する。

発明の背景
癌および慢性感染症の予防のため、さらには治療のための新たなワクチンの開発が進められている。最も効果的なワクチンは、Tヘルパー反応および抗体応答に加えてCTL応答も誘発する可能性が高いと考えられる。興味が持たれるワクチン送達様式の一つは、ミクロスフェア中への封入を介するものである。しかし、ほとんどのタンパク質は有機溶媒に不溶性のため、タンパク質を封入したミクロスフェアは通常、ダブルエマルション（double-emulsion）法によって作製される必要がある。ダブルエマルション法によって作製されたミクロスフェア製剤は、インビトロ放出試験によって示される放出動態が望ましくない（例えば、初期バーストが大きい、および/または経時的な追加放出が極めて緩徐である）ことが多い。

より効率的かつ効果的なタンパク質ワクチンの送達手段、特に、望ましい放出動態が得られるとともにタンパク質の安定性も維持する方法が、未だに必要とされている。

発明の概要
本発明は、生分解性高分子ミクロスフェア中に封入されたアジュバントおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。1つの態様においては、タンパク質がミクロスフェア中にアジュバントとともに封入される。一般にタンパク質には、癌、自己免疫疾患または感染症と関連のある抗原が含まれる。本発明によれば、タンパク質およびアジュバントを、同じミクロスフェア中への共封入、または第1のセットのミクロスフェア中に封入されたタンパク質および第2のセットのミクロスフェア中に封入されたアジュバントとしての同時投与のいずれかを介する、高分子ミクロスフェア中への封入を介して送達することができる。好ましい態様において、タンパク質および/またはアジュバントは、疎水的イオン対形成（hydrophobic ion pairing；HIP）を介してミクロスフェア中に封入される。

本発明はさらに、タンパク質をミクロスフェア中に封入するための方法であって、タンパク質を有機媒体中に可溶化するためにHIPを利用することを含む方法を提供する。本方法は、タンパク質を含む有機相を生成させるために、HIP剤および有機溶媒の存在下でタンパク質を可溶化することを含む。本方法はさらに、ポリマーを有機溶媒中または有機相中に溶解させることを含む。続いて、有機相、タンパク質およびポリマーを含むポリマー溶液からミクロスフェアを調製する。1つの好ましい態様においては、タンパク質を水溶液から有機相中に抽出する。もう1つの態様において、可溶化段階は、有機溶媒を乾燥HIP剤-タンパク質複合体と混合する段階を含む。HIP剤-タンパク質複合体は、例えば、凍結乾燥または蒸発によって乾燥されうる。

疎水的イオン対形成によってタンパク質の有機媒体中への抽出が可能になることから、本方法はシングルエマルション（single emulsion）によるミクロスフェア製剤の調製を可能にする。その結果得られたミクロスフェアは、望ましい放出動態、すなわち、初期バーストの小ささ、およびタンパク質の経時的な制御放出を示す。驚いたことに、この封入方法は予想されたよりも大きいサイズのタンパク質を封入しうることが示されており、これらの封入されたタンパク質は生理的条件下で有効に放出されることが示されている。このような封入されたタンパク質は、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を含む、強くかつ広範囲にわたる免疫応答を誘発する。本発明のミクロスフェア中に封入されるタンパク質の例には、分子量が少なくとも約3kDaであり、好ましくは少なくとも約8kDaであり、より好ましくは少なくとも約20kDaであるタンパク質が含まれる。her-2/neuのICD（分子量約66kDa）を含む、分子量が少なくとも約50kDaであるものを含め、より大きなタンパク質を、本発明によるミクロスフェア中に封入することもできる。また、本発明のミクロスフェア中に封入されるタンパク質抗原は、少なくとも約20アミノ酸残基長の抗原を含め、かなりの長さのものでありうる。好ましくは、タンパク質抗原の長さは少なくとも約60アミノ酸残基であり、より好ましくは少なくとも約80アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約100アミノ酸長である。

1つの態様において、HIP剤はドキュセートナトリウムなどの陰イオン性HIP剤であり、かつHIP剤はタンパク質の正味の正電荷の数と等しいかそれよりも大きい化学量論量として存在する。もう1つの態様において、HIP剤は、ジメチルジオクタデシル-臭化アンモニウム（DDAB18）、1,2-ジオレオイルオキシ-3(トリメチルアンモニウム)プロパン（DOTAP）、または臭化セトリモニウム（CTAB）などの陽イオン性HIP剤である。この態様において、HIP剤はタンパク質の正味の負電荷の数と等しいかそれよりも大きい化学量論量として存在する。有機媒体におけるHIP剤とタンパク質との比は最大で約70：1であることが好ましい。

HIP剤および水溶液は、封入されるタンパク質の特性に応じて選択される。一般に、等電点（pI）が7.0またはそれ未満であるタンパク質に対しては陰イオン性HIP剤が好ましい。同様に、pIが7.0またはそれ以上であるタンパク質に対しては陽イオン性HIP剤が好ましい。pIが約7.0であるタンパク質の封入には、陽イオン性HIP剤または陰イオン性HIP剤のいずれを用いることもできる。水溶液のpHは、適切な電荷特性が得られるように調整しうる。一般に、塩濃度の低い水溶液が好ましい。1つの態様において、水溶液の総塩濃度は約30mM未満である。本方法は、pIが少なくとも約7.5、少なくとも約8.0、最大で約6.0、最大で約6.5のもの、ならびにpIが最大で約7.0のもの、または約7.0よりも大きいものを含む、さまざまな等電点のタンパク質に適している。

本発明の方法に用いるのに適した有機溶媒には、塩化メチレン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルまたはジメチルスルホキシドが非制限的に含まれる。ミクロスフェアは、水中油型シングルエマルション（single oil-in-water emulsion）、水中油型ダブルエマルション（single oil-in-water emulsion）、ポリマー溶液の噴霧乾燥またはコアセルベーションを含む、当技術分野で知られた種々の方法によって調製しうる。本発明の方法の利点の一つは、シングルエマルションによるミクロスフェアの調製を可能にし、それにより、改良された放出動態を示すミクロスフェアを入手することを可能にする点にある。ミクロスフェアの少なくとも約90％は直径が約1μm〜約10μmであることが好ましい。

本方法に用いるのに好ましいポリマーには、乳酸グリコール酸共重合体（PLG）が含まれる。その他の適したポリマーには、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸および/またはそれらの共重合体が含まれる。ポリマー溶液はさらに、MPL、サポニン、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、アミノアルキルグルコサミニドリン酸、イソツセラソール（isotucerasol）、細胞壁骨格および/またはCpG含有オリゴヌクレオチドなどのアジュバントを含むことが好ましい。

ミクロスフェア中に封入されるタンパク質は一般に、癌、自己免疫疾患または感染症と関連のある抗原などの、抗原を含む。1つの態様において、感染症は結核である。代表的な結核抗原には、Mtb8.4、TbH9（Mtb 39A）、38-1、Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9.9A、Mtb9.8、Mtb16、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46fおよびMtb31fが含まれる。もう1つの態様において、抗原は、her-2/neuの細胞内ドメイン（ICD）または細胞外ドメイン（ECD-PD）などのように、乳癌と関連のあるものである。

本発明はさらに、本発明の方法によって作製されたミクロスフェア中に封入されたタンパク質を含む組成物を提供する。本組成物はさらに、MPL、サポニン、AS-2、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、アミノアルキルグルコサミニドリン酸、イソツセラソール（isotucerasol）、細胞壁骨格および/またはCpG含有オリゴヌクレオチドなどのアジュバントを含むことが好ましい。1つの態様において、アジュバントは、ミクロスフェア中に抗原とともに封入される。他の態様において、アジュバントは、封入されたタンパク質抗原とともに同時投与される。また、ミクロスフェア中に封入された1つまたは複数のアジュバントを含む組成物、および、このような組成物中に用意されたアジュバントの送達方法も提供する。

本発明はまた、抗原を対象に送達するための、対象における抗原に対する免疫応答を誘発するための、および対象における癌、自己免疫疾患または感染症を治療または予防するための方法も提供する。これらの方法は、対象に本発明の組成物を投与することを含む。一般に、本発明の方法によって誘発される免疫応答には、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方が含まれる。

発明の詳細な説明
本明細書において開示する本発明は、ミクロスフェア中に共封入されたタンパク質およびアジュバントを含むワクチン組成物に対して強くかつ広範囲にわたる免疫応答を得ることができるという驚くべき発見に基づく。癌、自己免疫疾患および感染症と関連のある抗原を用いて、強い免疫応答が得られている。封入されたタンパク質抗原および別個に封入されたアジュバントの同時投与は広範囲にわたる免疫応答を誘発し、同一セットのミクロスフェア中に共封入されたタンパク質およびアジュバントを用いるとさらに強い広範囲にわたる免疫応答を得ることができる。すなわち、本明細書中に提供する例において試験したアジュバントは疎水性であるにもかかわらず、ミクロスフェア中に封入されたアジュバントを用いて有効なアジュバント送達が達成されている。タンパク質および/またはアジュバントの封入は当技術分野で知られた種々の方法によって達成しうるが、封入は本明細書に記載の疎水的イオン対形成を介して行われることが好ましい。

驚くべきことに、この封入方法はかなり大きなタンパク質を封入しうることが示されており、これらの封入されたタンパク質は生理的条件下で有効に放出されることが示されている。このような封入されたタンパク質は、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を含む、強くしかも広範囲にわたる免疫応答を誘発する。本発明のミクロスフェア中に封入されるタンパク質の例には、分子量が少なくとも約3kDaであり、好ましくは少なくとも約8kDaであり、より好ましくは少なくとも約20kDaであるタンパク質が含まれる。her-2/neuのICD（分子量約66kDa）を含む、分子量が少なくとも約50kDaであるものを含め、より大きなタンパク質を、本発明によるミクロスフェア中に封入することもできる。また、本発明のミクロスフェア中に封入されるタンパク質抗原はかなりの長さであり、少なくとも約20アミノ酸残基長の抗原を含む。好ましくは、タンパク質抗原の長さは少なくとも約60アミノ酸残基であり、より好ましくは少なくとも約80アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約100アミノ酸長である。

疎水的イオン対形成（HIP）は、極性対イオンの、類似した電荷を有するがより溶媒和されにくい種への化学量論的な置換を伴う。本明細書中に開示するように、本発明は、HIPを利用してタンパク質の溶解特性を変化させ、塩化メチレンなどの有機溶媒中へのタンパク質の抽出を可能にする方法を提供する。ドキュセートナトリウム（スルホコハク酸ビス（2-エチルヘキシル）ナトリウム）は、適したイオン対形成剤の一例である。1つの態様においては、ドキュセートナトリウムを含む塩化メチレンをタンパク質水溶液と混合する。これによってドキュセートイオンとタンパク質とのイオン対形成が生じ、引き続いてタンパク質の油相への分配が生じる。タンパク質の塩化メチレン中への溶解により、ミクロスフェア中に封入されるタンパク質を、水中油型シングルエマルション法を介して調製することが可能になる。

本方法によって調製されたミクロスフェアは、初期バースト放出の小ささ、およびタンパク質が経時的に徐々に放出されることを含む、望ましいタンパク質放出特性を示す。有機溶媒中に可溶性のコレステロールおよび脂肪酸エステルなどの添加物を組み入れることにより、放出動態をさらに改良することもできる。本発明は、タンパク質抗原を封入したミクロスフェア製剤であって、タンパク質抗原が経時的に徐々に放出されるミクロスフェア製剤を提供する。本発明によるミクロスフェアの作製にHIPを利用することにより、ミクロスフェア内部にタンパク質をより均等に分布させることが可能になり、ミクロスフェア中のタンパク質の凝集が軽減される。

定義
別に指定する場合を除き、本明細書で用いられるすべての科学用語および技術用語は、当技術分野で一般に用いられているものと同じ意味を有する。本出願において用いる場合、以下の用語および語句は指定された意味を有する。

本明細書で用いる場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、少なくとも約20個、またはより一般的には、少なくとも約50個のアミノ酸からなるポリマーを意味する。このようなタンパク質またはポリペプチドは、一次構造、二次構造、三次構造、および場合によっては四次構造を有する。タンパク質またはポリペプチドは、天然の源から単離すること、組換え法によって作製すること、または化学合成することができる。

本明細書で用いる場合、「免疫応答」には、抗体の産生、IFN-γなどの免疫調節物質の産生およびCTL活性の誘導が含まれる。免疫応答の誘発には、免疫応答の惹起、刺激または増強が含まれる。「広範囲にわたる（comprehensive）免疫応答」という用語には、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を含む応答が含まれる。

本明細書で用いる場合、ある状態または疾患を「予防する」、またはある状態または疾患から「防御する」とは、その状態または疾患の発症または進行を妨げる、抑制する、または遅延させることを意味する。

本明細書で用いる場合、「抗原提示細胞」または「APC」は、抗原を処理してリンパ球に提示することができる細胞を意味する。APCの例には、マクロファージ、ランゲルハンス樹状細胞、濾胞樹状細胞、B細胞、単球、線維芽細胞および線維細胞が非制限的に含まれる。樹状細胞は好ましいタイプの抗原提示細胞である。樹状細胞は多くの非リンパ系組織に認められるが、輸入リンパ液または血流を経由してリンパ系器官のT依存性領域に移動することができる。非リンパ系器官における樹状細胞にはランゲルハンス細胞および間質樹状細胞が含まれる。リンパ液および血液中では、それぞれ輸入リンパ管ベール細胞および血中樹状細胞が含まれる。リンパ系器官では、リンパ系樹状細胞および相互連結細胞が含まれる。

本明細書で用いる場合、エピトープを提示するように「改変された」とは、自然な方法または組換え方法によってエピトープを提示するように操作された抗原提示細胞（APC）を指す。例えば、単離した抗原に対する曝露（単独または混合物の一部として）により、ペプチドローディングにより、または1つもしくは複数のエピトープを含むポリペプチドを発現するようにAPCを遺伝的に改変することにより、APCを改変できる。

本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保ち、望ましくない毒性学的作用を付与しない塩を指す。このような塩の例には、以下のものが非制限的に含まれる：（a）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などとともに形成される酸付加塩；および、有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などとともに形成される塩；（b）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属陽イオンとともに形成される塩；または（c）N,N'-ジベンジルエチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンとともに形成される塩；または（d）（a）および（b）または（c）の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩；など。好ましい酸付加塩はトリフルオロ酢酸塩および酢酸塩である。

本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」には、活性成分と混合した場合に、成分の生物活性を保つとともに、対象の免疫系とは反応しない、任意の材料が含まれる。その例には、リン酸緩衝食塩水、水、水中油型エマルションなどのエマルション、およびさまざまな種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体の任意のものが非制限的に含まれる。エアロゾルまたは非経口的投与のために好ましい希釈剤には、リン酸緩衝食塩水または生理（0.9％）食塩水がある。

このような担体を含む組成物は、よく知られた従来の方法によって製剤化される（例えば、「レミントン薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1990を参照されたい）。

本明細書で用いる場合、「アジュバント」には、免疫応答の刺激を促すために当技術分野で一般的に用いられるアジュバントが含まれる。

本明細書で用いる場合、「ある（aまたはan）」とは、別に明確に示さない限り、少なくとも1つを意味する。

ミクロスフェア中への封入
タンパク質および/またはアジュバントの封入は当技術分野で知られた種々の方法によって達成しうるが、封入は本明細書に記載の疎水的イオン対形成を介して行われることが好ましい。その他のミクロスフェア封入法は国際公開公報第02/03961号（PCT/US01/21780号、2001年7月9日に出願）および2002年1月7日に出願されたPCT/US02/00235号に記載されている。

本発明は、タンパク質および/またはアジュバントを、疎水的イオン対形成（HIP）を介してミクロスフェア中に封入するための方法を提供する。本方法は、タンパク質を含む水溶液を、HIP剤を含む有機溶媒によって抽出し、タンパク質を含む有機相を有する抽出産物を生じさせる段階を含む。本方法はさらに、有機相を抽出産物から回収する段階、および、ポリマーを水溶液中または有機相中に溶解する段階を含む。続いて、回収した有機相、タンパク質およびポリマーを含むポリマー溶液から、ミクロスフェアを調製する。疎水的イオン対形成はタンパク質の有機媒体中への抽出を可能にし、それによってミクロスフェアをシングルエマルションによって調製することを可能にする。その結果得られたミクロスフェアは、望ましい放出動態、すなわち、初期バーストの小ささ、およびタンパク質の経時的な制御放出を示す。

1つの態様において、HIP剤はドキュセートナトリウムなどの陰イオン性HIP剤であり、HIP剤はタンパク質の正味の正電荷の数と等しいかそれよりも大きい化学量論量として存在する。もう1つの態様において、HIP剤は、ジメチルジオクタデシル-臭化アンモニウム（DDAB18）、1,2-ジオレオイルオキシ-3(トリメチルアンモニウム)プロパン（DOTAP）、または臭化セトリモニウム（CTAB）などの陽イオン性HIP剤である。この態様において、HIP剤はタンパク質の正味の負電荷の数と等しいかそれよりも大きい化学量論量として存在する。有機媒体におけるHIP剤とタンパク質との比は最大で約70：1であることが好ましい。

HIP剤および水溶液は、封入されるタンパク質の特性に応じて選択される。一般に、等電点（pI）が7.0またはそれ未満であるタンパク質に対しては陰イオン性HIP剤が好ましい。同様に、pIが7.0またはそれ以上であるタンパク質に対しては陽イオン性HIP剤が好ましい。pIが約7.0であるタンパク質の封入には、陽イオン性HIP剤または陰イオン性HIP剤のいずれを用いることもできる。水溶液のpHは、適切な電荷特性が得られるように調整しうる。一般に、塩濃度の低い水溶液が好ましい。1つの態様において、水溶液の総塩濃度は約30mM未満である。本方法は、pIが少なくとも約7.5、少なくとも約8.0、最大で約6.0、最大で約6.5のもの、ならびにpIが最大で約7.0のもの、または約7.0よりも大きいものを含む、さまざまな等電点のタンパク質に適している。

一般的には、低濃度の塩化カルシウムおよび他の塩（好ましくは合計で30mM未満）を含むタンパク質溶液をpH 3〜5（タンパク質のpIよりも少なくとも2 pH単位低いことが好ましい）に調整する。続いて、水性タンパク質溶液を、ドキュセートナトリウムなどのHIP剤を含む有機媒体によって抽出する。ドキュセートナトリウムは、タンパク質の正電荷の数と等しいかそれよりも大きい化学量論量として存在する。有機相は遠心処理によって抽出物から回収しうる。続いて、ポリマー、および塩化メチレンなどの有機溶媒中に可溶性の添加物を、タンパク質とともに有機相に溶解する。ポリマーを有機相に溶解することがより実際的であるが、ポリマーを抽出前にタンパク質溶液に添加することも可能と考えられる。さらに、タンパク質溶液中の塩濃度およびHIP剤の濃度は、遠心処理後に2つの相がより完全に分離されるように変更しうる。同様に、pHを所定のタンパク質に対して最適化することもできる。

本発明の方法に用いるのに適した有機溶媒の例には、塩化メチレン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルまたはジメチルスルホキシドが非制限的に含まれる。塩化メチレンが好ましい。

ミクロスフェアは、水中油型シングルエマルション、水中油型ダブルエマルション、ポリマー溶液の噴霧乾燥またはコアセルベーションを含む、当技術分野で知られた種々の方法によって調製しうる。本発明の方法の利点の一つは、シングルエマルションによるミクロスフェアの調製を可能にし、それにより、改良された放出動態を示すミクロスフェアを入手することを可能にする点にある。

一般的には、本発明の方法は、タンパク質の、特にワクチンとしての、投与および送達のために適したサイズのミクロスフェアの形成をもたらすと考えられる。ミクロスフェアの少なくとも約90％は直径が約1μm〜約10μmであることが好ましい。

本発明のミクロスフェアは、乳酸グリコール酸共重合体（PLG）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸および/またはそれらの共重合体などの生分解性ポリマーを含むことが好ましい。または、ミクロスフェアが別の壁形成材料を含むこともできる。適した壁形成材料には、ポリ（ブタジエン）などのポリ（ジエン）；ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリ（アルケン）；ポリ（アクリル酸）などのポリ（アクリル樹脂）；ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）などのポリ（メタクリル樹脂）；ポリ（ビニルエーテル）；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（ビニルケトン）；ポリ（塩化ビニル）などのポリ（ハロゲン化ビニル）；ポリ（ビニルニトリル）、ポリ（酢酸ビニル）などのポリ（ビニルエステル）；ポリ（2-ビニルピリジン）、ポリ（5-メチル-2-ビニルピリジン）などのポリ（ビニルピリジン）；ポリ（スチレン）；ポリ（カーボネート）；ポリ（エステル）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（エステルアミド）；ポリ（無水物）；ポリ（ウレタン）；ポリ（アミド）；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロースエステル；酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸酪酸セルロースなどのセルロースエステル；多糖類、タンパク質、ゼラチン、デンプン、ゴム、樹脂などが非制限的に含まれる。これらの材料は単独で用いてもよく、物理的混合物（製剤）または共重合体として用いてもよい。担体として用いるための生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコール酸）は、、例えば、米国特許第4,897,268号；第5,075,109号；第5,928,647号；第5,811,128号；第5,820,883号；第5,853,763号；第5,814,344号；第5,407,609号；および第5,942,252号に記載されており、これらのそれぞれの開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。

1つの好ましい態様において、ポリマーにはPLGが含まれる。いくつかの態様において、PLGはエステル末端基またはカルボン酸末端基を含むことができ、分子量は約4kDa〜約120kDa、または好ましくは約8kDa〜約65kDaでありうる。

ポリマー溶液はさらにアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントの例には、ヘルパーペプチド；水酸化アルミニウムゲル（alum）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories、Detroit、MI）；Merckアジュバント65（Merck and Company, Inc.、Rahway、NJ）；AS-2（Smith-Kline Beecham）；QS-21（Aquilla）；MPL（商標）免疫刺激物質または3d-MPL（Corixa Corporation）；LEIF；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；陽イオン性または陰イオン性に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびクィルA（quil A）；ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン、またはサイトカイン（例えば、GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7もしくは-12）および免疫刺激性DNA配列を含む免疫刺激複合体が非制限的に含まれる。好ましいアジュバントには、MPL、サポニン、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、アミノアルキルグルコサミニドリン酸、イソツセラソール（isotucerasol）、細胞壁骨格および/またはCpG含有オリゴヌクレオチドなどのアジュバントを含むことが好ましい。

ミクロスフェアの放出速度は、用いる緩衝液の特性によって影響されると考えられる。例えば、HEPES緩衝液ではTris緩衝液よりも放出が遅くなると考えられる。さらに、封入された薬剤の不出動態を変更するために脂肪酸エステルおよびコレステロールをミクロスフェア中に組み入れることが、Urataら、1999、J. Controlled Release 58: 133-141に記載されており、これらの原理を封入されたタンパク質の使用に適応させうる。脂肪酸エステルの例には、ミリスチン酸エチル（C14）、カプリン酸エチル（C10）およびステアリン酸エチル（C18）が非制限的に含まれる。

ミクロスフェア中に封入されるタンパク質は一般に、癌、自己免疫疾患または感染症と関連のある抗原などの、抗原を含む。癌の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横絞筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上皮腫、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および重鎖病が非制限的に含まれる。癌抗原の例には、her2/neu、乳癌抗原（Bargmannら、1986、Nature 319(6050): 226-30；Bargmannら、1986、Cell 45(5): 649-57）がある。her-2/neu抗原の例には、her-2/neuの細胞内ドメイン（ICD、アミノ酸残基676〜1255；上記のBargmannらの参考文献を参照のこと）、her-2/neuの細胞外ドメインp369（E75としても知られる；KIFGSLAFL；配列番号：1）、ECD-PD（細胞外ドメインと細胞内ドメインリン酸化部分との融合体；2002年2月14日に公開された国際公開公報第02/12341号、および2000年8月3日に公開された国際公開公報第00/44899号を参照のこと）およびher-2/neuの膜貫通領域であるp546（VLQGLPREYV；配列番号：2）が非制限的に含まれる。

感染症の例には、病原体、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物による感染症が非制限的に含まれる。ウイルスの例には、B型肝炎ウイルスまたはC型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスI型またはII型、牛痘ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、乳頭腫ウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスI型またはII型が非制限的に含まれる。細菌の例には、結核菌、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリアおよびレジオネラが非制限的に含まれる。寄生生物の例には、リケッチアおよびクラミジアが非制限的に含まれる。

1つの態様において、感染症は結核である。代表的な結核抗原には、Mtb8.4、TbH9（Mtb 39A）、38-1、Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9.9A、Mtb9.8、Mtb16、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46fおよびMtb31fが含まれる。「f」とは、2つまたはそれ以上のタンパク質の融合体を意味する。

組成物
本発明は、タンパク質および/またはアジュバントを送達するために有用な組成物を提供する。ミクロスフェア中に封入されるタンパク質には、癌または感染症を治療および予防するための組成物を提供する、癌、自己免疫疾患または感染症と関連のある抗原が含まれうる。1つの態様において、組成物は薬学的組成物である。組成物は、癌、自己免疫疾患または感染症と関連のある1つまたは複数の抗原を含む、タンパク質の治療的または予防的有効量を含みうる。有効量とは、例えば、T細胞を活性化することにより、免疫応答を誘発または増強するのに十分な量のことである。T細胞の活性化の指標の一つは、以下の実施例の項に記載するような、細胞毒性アッセイまたはインターフェロン-γ放出アッセイである。いくつかの態様において、組成物はワクチンである。

組成物は選択的には、薬学的に許容される担体などの担体を含みうる。薬学的に許容される担体は、一部には、投与される個々の組成物、ならびに組成物を投与するために用いられる個々の方法によって決まる。このため、本発明の薬学的組成物には非常にさまざまな適切な製剤がある。非経口的投与、例えば、例えば、関節内（関節の内部）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路などによる投与のために適した製剤、ならびに担体には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を意図したレシピエントの血液と等張性にする溶質を含みうる水性等張滅菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、保存料および乳濁液を含みうる水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。

本発明の組成物はさらに、または代替的に、1つまたは複数のアジュバントを含みうる。アジュバントは、タンパク質とともに、または別個にミクロスフェア中に封入しうる。代替的または追加的に、アジュバントを、ミクロスフェア中への封入ではなく従来の製剤を用いた組成物として提供することができる。アジュバントの例には、ヘルパーペプチド、ミョウバン、フロイントアジュバント、ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン、または、サイトカインを含む免疫刺激複合体が非制限的に含まれる。好ましいアジュバントには、MPL、サポニン、AS-2、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、アミノアルキルグルコサミニドリン酸、イソツセラソール（isotucerasol）、細胞壁骨格および/またはCpG含有オリゴヌクレオチドが含まれる。

ほとんどのアジュバントは、抗原を異化作用から防御するように設計された物質（水酸化アルミニウムまたは鉱油など）、および免疫応答刺激物質（百日咳菌もしくは結核菌由来のタンパク質など）を含む。適したアジュバントは市販されており、これには例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories、Detroit、MI）；Merckアジュバント65（Merck and Company, Inc.、Rahway、NJ）；水酸化アルミニウムゲル（alum）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシン アシル化糖の不溶性懸濁液；陽イオン性または陰イオン性に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン 生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびクィルA（quil A）がある。GM CSFまたはインターロイキン-2、-7もしくは-12などのサイトカインをアジュバントとして用いてもよい。

本明細書中に提供するワクチンにおけるアジュバント組成物は、主としてTh1型の免疫応答を誘導するように設計されることが好ましい。高レベルのTh1型サイトカイン（例えば、IFN-γ、IL-2およびIL-12）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を促す傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン（例えば、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10およびTNF-β）は体液性免疫応答の誘導を促す傾向がある。本明細書中に提供するワクチンの適用後に、罹患生物はTh1型応答およびTh2型応答を含む免疫応答を維持すると考えられる。応答が主としてTh1型である1つの好ましい態様において、Th1型サイトカインのレベルはTh2型サイトカインのレベルを上回る程度に上昇すると考えられる。これらのサイトカインのレベルは標準的なアッセイを用いて容易に評価しうる。サイトカインファミリーに関する総説については、MosmannおよびCoffman、1989、Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173を参照されたい。

Th1型応答を主として誘発するために用いるのに好ましいアジュバントには、例えば、モノホスホリルリピドA、好ましくは3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）とアルミニウム塩との混合物が含まれる。MPLアジュバントはCorixa Corporation（Hamilton、MT）から入手可能である（米国特許第4,436,727号；第4,877,611号；第4,866,034号および第4,912,094号を参照されたい）。CpG含有オリゴヌクレオチド（CpG二ヌクレオチドはメチル化されていない）もTh1応答を主として誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは公知であり、例えば、国際公開公報第96/02555号に記載されている。もう1つの好ましいアジュバントはサポニン、好ましくはQS21であり、これは単独で用いてもよく、または他のアジュバントと併用してもよい。例えば、強化された系には、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体との組み合わせ、例えば国際公開公報第94/00153号に記載されたようなQS21と3D-MPLとの組み合わせ、または国際公開公報第96/33739号に記載されているように、QS21の作用をコレステロールで弱めた、反応性を低下させた組成物が含まれる。他の好ましい製剤は、水中油型エマルションおよびトコフェロールを含む。QS21、3D-MPLおよびトコフェロールを水中油型エマルション中に含めた特に強力なアジュバント製剤が国際公開公報第95/17210号に記載されている。用いうるもう1つのアジュバントにAS-2（Smith-Kline Beecham）がある。本明細書中に提供する任意のワクチンを、抗原、免疫応答エンハンサーおよび適した担体または添加剤の混合が得られる周知の方法を用いて調製しうる。

ワクチン調製については、例えば、M.F. PowellおよびM.J. Newman編、「Vaccine Design（the subunit and adjuvant approach）」Plenum Press（NY、1995）に概論が記載されている。本発明の範囲に含まれる薬学的組成物およびワクチンは他の化合物を含んでもよく、それには生物活性があってもなくてもよい。

このような組成物が、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、EDTAもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および/または保存料を含んでもよい。または、本発明の組成物を凍結乾燥物として製剤化してもよい。

本明細書に記載の組成物を、持続放出製剤（すなわち、投与後に化合物の緩徐な放出を生じるカプセルまたはスポンジなどの製剤）の一部として投与することもできる。このような製剤は公知の技術を用いて一般に調製され、例えば、経口的、直腸内もしくは皮下移植により、または所望の標的部位への移植により、投与される。持続放出製剤は、ポリペプチドもしくはタンパクを、担体マトリックス中に分散された、および/または律速性の膜に囲まれた貯蔵部内に包含された状態で含みうる。このような製剤の内部に用いるための担体は生体適合性があり、さらに生分解性であってもよい；製剤により、有効成分の比較的一定したレベルの放出が得られることが好ましい。持続放出製剤内に含まれる活性化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予想期間ならびに治療または予防しようとする状態の性質に依存する。

方法
本発明はまた、タンパク質またはアジュバントを対象に送達するための、対象における抗原に対する免疫応答を誘発するための、および対象における状態を治療または予防するための方法も提供する。これらの方法は、対象に本発明の組成物を投与することを含む。投与は以下の記載の通りに行いうる。

いくつかの態様において、治療または予防しようとする状態は癌または前癌状態（例えば、過形成、化生、異形成）である。癌の例は本明細書の上記の箇所に列挙されている。いくつかの態様において、治療または予防しようとする状態は自己免疫疾患または感染症である。感染症の例には、本明細書の上記の箇所に記載したウイルス性、細菌性および寄生生物性の疾患がある。感染症の一例は結核である。自己免疫疾患の例には、アレルギー、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、悪性貧血、橋本甲状腺炎、アジソン病、皮膚筋炎および関節リウマチが含まれる。

組成物の投与
治療（treatment）には予防および治療法（therapy）が含まれる。予防または治療は、単一時点または複数時点における単回の直接注射によって実施しうる。投与をほぼ同時に複数部位に行うこともできる。罹患生物または対象には、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタおよびヒツジなどの哺乳動物が含まれる。罹患生物または対象はヒトであることが好ましい。

組成物は一般にインビボで非経口的経路（例えば、静脈内、皮下および筋肉内）または他の従来の直接的経路、例えば口腔内/舌下、直腸内、経口的、経鼻的、局所外用（経皮的および点眼など）、腟内、肺内、動脈内、腹腔内、眼内もしくは鼻腔内の経路によって投与されるか、または特定の組織中に直接投与される。筋肉内投与が好ましい。

罹患生物に対して投与される用量は、本発明の状況下では、罹患生物にある期間にわたって有益な治療反応を生じさせる、または感染症もしくは感染に起因する疾患を抑制するのに十分である必要がある。したがって、組成物は、特異的抗原に対する有効な免疫応答を誘発するのに十分な量、および/または、疾患もしくは感染による症状および/もしくは合併症を緩和、軽減、治癒もしくは少なくとも部分的に停止もしくは予防するのに十分な量として、罹患生物に投与される。これを達成するのに十分な量は「治療的有効量」と定義される。

用量は、作製される組成物の活性、および罹患生物の状態、さらには治療しようとする罹患生物の体重または体表面積によって決まると考えられる。用量の程度は、個々の組成物の個々の罹患生物への投与に付随する有害な副作用の存在、性質および程度によっても決まると考えられる。疾患の治療または予防において投与される組成物の有効量を決定する際に、臨床医は、病原体に対する免疫応答の発生、疾患の進行および治療に伴う毒性を評価する必要がある。

免疫細胞を含む組成物は、組成物を投与しようとする対象から採取した免疫細胞から調製することが好ましい。または、免疫細胞を、HLA適合性のあるドナーから調製することもできる。免疫細胞を対象またはドナーから当技術分野で知られた従来の技法を用いて採取し、本発明のエピトープを提示するように改変されたAPCに対して曝露させ、エクスビボで増殖させた上で対象に投与する。エクスビボ治療法のためのプロトコールは、Rosenbergら、1990、New England J. Med. 9: 570-578に記載されている。

免疫細胞は一般に、本明細書における記載の通り、インビトロ増殖により、養子免疫療法を行うのに十分な量として入手されうる。抗原特異的な単一のエフェクター細胞を、インビボでの抗原認識性を保った上で数十億個に増殖させるための培養条件は、当技術分野で周知である。このようなインビトロ培養条件では一般に抗原による間欠的刺激が用いられ、これはしばしばサイトカイン（IL-2など）および非分裂性フィーダー細胞の存在下で行われる。上記の通り、本明細書中に提供するような免疫反応性ポリペプチドは、免疫療法のための十分な数の細胞を生成させる目的で抗原特異的T細胞培養物を富化させ、急速に増殖させるために用いうる。特に、樹状細胞マクロファージ、単球、線維芽細胞および/またはB細胞などの抗原提示細胞に対して、当技術分野で周知の標準的な技法を用いて、免疫反応性ポリペプチドによるパルス刺激を加えることができる。例えば、抗原提示細胞に対して、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増強させるのに適したプロモーターを有するポリヌクレオチドをトランスフェクトすることができる。治療法に用いるための培養エフェクター細胞は、広範囲に増殖して分布することができ、インビトロで長期間生存できなければならない。複数の研究から、IL-2を添加した抗原による反復刺激により、培養エフェクター細胞をインビボで増殖してかなり多数が長期間生存するように誘導しうることが示されている（例えば、Cheeverら、1997、Immunological Reviews 157: 177を参照されたい）。

本明細書中に記載した多くの投与経路または当技術分野で知られた他のものによる投与は、単に、単一時点または複数の時点での、針、カテーテルまたは関連装置を用いた直接投与によって行うことができる。

抗原提示細胞
本発明の組成物は、癌細胞または感染細胞を標的とする抗原特異的免疫応答の発生を促進するために用いうる。本発明のある種の好ましい態様では、樹状細胞またはその前駆細胞を抗原提示細胞（APC）として用いる。樹状細胞は非常に作用の強いAPC（BanchereauおよびSteinman、Nature 392: 245-251、1998）であり、予防的または治療的な免疫を誘発させるための生理的アジュバントとして有効なことが示されている（TimmermanおよびLevy、Ann. Rev. Med. 50: 507-529、1999を参照のこと）。一般に、樹状細胞はその典型的な形態（原位置で星状であり、インビトロで顕著な細胞質突起（樹状突起）が認められる）、ならびに、標準的なアッセイを用いた評価でB細胞（CD19およびCD20）、T細胞（CD3）、単球（CD14）およびナチュラルキラー細胞（CD56）の分子マーカーが存在しないことに基づいて同定しうる。当然ながら、樹状細胞を、インビボまたはエクスビボの樹状細胞には一般に認められない特定の細胞表面受容体またはリガンドを発現するように操作することもでき、このような改変樹状細胞を本発明では考慮している。樹状細胞に代わるものとして、分泌小胞を含む樹状細胞（エキソソームと呼ばれる）をワクチンに用いることもできる（Zitvogelら、1998、Nature Med. 4: 594-600）。

樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血または任意の他の適した組織または液体から入手しうる。例えば、末梢血から収集した単球の培養物にGM-CSF、IL-4、IL-βおよび/またはTNFαなどのサイトカインの混合物を添加することにより、樹状細胞をエクスビボで分化させることもできる。または、GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40リガンド、LPS、flt3リガンドならびに/または樹状細胞の成熟および増殖を誘導する他の化合物の混合物を培地に添加することにより、末梢血、臍帯血または骨髄から収集したCD34陽性細胞を樹状細胞に分化させることもできる。

樹状細胞は「未熟」および「成熟」細胞として分類することが好都合であり、これは詳細に特徴が判明している2つの表現型を区別する簡単なやり方である。しかし、この命名法は、可能性のあるすべての中間的な分化段階を除外するものとみなされるべきではない。未熟樹状細胞は抗原の取り込みおよびプロセシングを行う能力が高いAPCとして特徴づけられ、この能力はFcγ受容体、マンノース受容体およびDEC-205マーカーの高発現と相関している。成熟表現型は一般にこれらのマーカーの低発現を特徴とするが、クラスIおよびクラスII MHC分子、接着分子（例えば、CD54およびCD11）および補助刺激分子（例えば、CD40、CD80およびCD86）などのT細胞活性化の原因となる細胞表面分子は高発現される。APCが細胞表面上に発現されるポリペプチドまたはその免疫原性部分を取り込んで発現しうるように、APCを本発明のミクロスフェア中に封入されたタンパク質と併用してもよい。樹状細胞への抗原添加は、樹状細胞または前駆細胞を封入されたタンパク質とともにインキュベートすることによって行いうる。樹状細胞に対して、T細胞の補助をもたらす免疫学的パートナー（例えば、担体分子）によるパルス刺激を行ってもよい。

実施例
以下の実施例は、本発明を提示し、当業者がそれを作製および使用するのを補助する目的で提示するものである。これらの実施例はいかなる形でも本発明の範囲を制限することを意図してはいない。

実施例1：タンパク質-ミクロスフェア製剤
本実施例では、タンパク質-ミクロスフェアおよびタンパク質-アジュバント-ミクロスフェア製剤の調製について述べる。

MJ071bおよびMJ087b
これらのミクロスフェア製剤を、アジュバントの非存在下で、疎水的イオン対形成（HIP）法を用いて調製した。3mgの凍結乾燥タンパク質を2.7mlの超純水中に溶解した。このタンパク質溶液に対して、0.3mlの100mM CaCl₂溶液および55μlの0.1M HClを添加し、pHをpH 3〜5の範囲に低下させた。ボルテックス混合により、タンパク質を有機相である4.3mM AOT（ドキュセートナトリウム）ジクロロメタン溶液中に抽出した。タンパク質を含むこの有機相を遠心処理によって水相から分離した。水相を廃棄し、DCMの添加によって有機相の容積を10mlに増やした。続いて、PLGポリマー（300mgのRG502H；Boehringer Ingelheim GmbH（Ingelheim、ドイツ））を溶媒に溶解した。ミクロスフェアの形成は、有機相中にあるタンパク質およびポリマーを400mlの5％PVA（ポリビニルアルコール）水溶液に添加し、Silverson混合機を用いて9000rpmで約1分間処理することによって行った。ミクロスフェアを硬化させるために2時間〜3時間ゆっくりと攪拌した後に洗浄し、遠心処理によって回収した。凍結および凍結乾燥の前にマンニトールを添加剤として添加した。

MJ082
これらのミクロスフェアには、タンパク質（Mtb8.4；本明細書ではDPVとも称する）およびアジュバント（MPL）の両方を含めた。共封入の間、タンパク質とMPLとの比は約1：1に固定した。この製剤は、タンパク質抽出後かつプロセス媒体（すなわち、400mlの5％PVA）への添加前に有機相に3mgのMPLを添加した点を除き、MJ071b/MJ087bと同じやり方で調製した。

MJ083
これらのミクロスフェアには、タンパク質（Mtb8.4）およびアジュバント（MPL）の両方を含めた。それらを共封入する際のタンパク質とMPLとの比は固定し、1：1とした。この製剤は、MPLを添加した点を除き、MJ071b/MJ087bと同じ一般的なやり方で調製した。、MPL（3rng）は内水相を介して組み入れた。すなわち、まず3mgのMPLを1.0mlの水中に激しいボルテックス混合によって分散させた。PLGポリマーをDCMを含むタンパク相に添加した後に、水相中にあるこのMPLの1mlを添加し、30秒間のボルテックス混合によって乳化させた。この一次エマルションを前と同じように400mlの5％PVA中で乳化させた。

MJ084
これらのミクロスフェアにはタンパク質（Mtb8.4）およびアジュバント（MPL）の両方を含めた。タンパク質とMPLとの比は固定し、0.37とした。この製剤は、3mgのMPLをPVAの代わりに400mlのプロセス媒体に添加した点を除き、MJ071b/MJ087bと同じやり方で調製し、エマルションを9000rpmで2分間〜1/2分間混合した後に、さらに300mlの超純水を添加することによって分散物をさらに希釈した。

ミクロスフェア特性

実施例2：HIPミクロスフェアからのDPV（Mtb8.4）タンパク質の放出
本実施例には、150mM Tris、pH 8.1および0.01％Tween 20から構成される放出媒体へのDPVタンパク質のインビトロ放出を示す。DPVは9キロダルトンのタンパク質であり、pIは6.5である。図1は、DPVの放出を、5種類のミクロスフェア製剤に関して、時間の関数としてプロットしたものを示している。製剤には、JA-024、40％ミリスチン酸エチル（C14）（菱形印）；AS-011（四角印）；AS-012、15％コレステロール（三角印）；AS-014、20％カプリン酸エチル（C10）（×印）；AS-013、20％ステアリン酸エチル（C18）（星印）；およびJA-002、RG-502（＋印）を含めた。

製剤はそれぞれ、DPVタンパク質をドキュセートナトリウムとの疎水的イオン対形成（HIP）を介して塩化メチレン中に可溶化する、シングルエマルション法によって調製した。製剤AS-011からAS-014まではPLG RG-592Hポリマーを用いて調製した。JA-002は、RG-502Hよりも疎水性の強いエンドキャップ処理ポリマーであるPLG RG-502を用いて調製した。上記の通り、いくつかの態様においてはコレステロールおよび脂肪酸エステルを含めた。

実施例3：HIPミクロスフェア中に封入されたMtb8.4抗原はマウスにおいて強いCTL応答を誘発する
本実施例には、HIP法を用いて調製したMtb8.4タンパク質ミクロスフェアが、強力なアジュバントとの混合物およびタンパク質のみよりも強いCTL応答を誘発したことを示す。マウス脾細胞の1回のインビトロ刺激によるクロム放出アッセイを用いた個々のマウスに関するCTL応答を図2A〜図2Cに示している。マイクロカプセル封入されたタンパク質（図2A）による免疫処置を受けたマウスでは、タンパク質＋MPL/サポニン（図2B）およびタンパク質のみ（図2C）によって誘発された応答と比べて、最も強く最も一貫した免疫応答が誘発された。マウスは、0日目および21日目に5μgのタンパク質で皮下に免疫処置された。脾臓を35日目に採取した。未処置マウスでは特異的溶解は観察されなかった。Mtb8.4タンパク質-ミクロスフェアはタンパク質＋MPL/サポニン群またはタンパク質のみの群（図2A〜図2C）のいずれよりも強く一貫したCTL応答を誘発した。

実施例4：HIPミクロスフェアはマウスにおいて強い抗体応答を誘発する
本実施例では、取り出した日に得た血清からの抗体応答（IgG1）を測定した実験について述べる。図3A〜図3Cに示されているように、本発明のHIP法を用いて調製したタンパク質ミクロスフェアは、5匹の被験マウスのすべてにおいて強い抗体応答を誘発した（図3A）。これらの応答はタンパク質のみによって誘発されたものよりも有意に強く（図3B）、MPL/サポニンアジュバント混合物によって誘発されたものと同程度であった（図3C）。各群5匹ずつのマウスに対して0日目および21日目に5μgのタンパク質を皮下に免疫処置した。血清を35日目に採取し、特異的抗体レベルをELISAによって測定した。個々のマウスによる結果を示している。

実施例5：HIPミクロスフェアはマウスにおいてDNAまたはタンパク質/アジュバント混合物による免疫処置よりも強く一貫した免疫応答を誘発する
本実施例には、本発明のタンパク質ミクロスフェア製剤が免疫応答の誘発に有効であるというさらなる証拠を提供する。図4は、Mtb8.4タンパク質ミクロスフェアがCTL応答を誘発する能力と、DNA免疫処置およびタンパク質＋MPL/サポニンアジュバント混合物によって誘発される能力と比較した、マウスでの実験の結果を示している。CTL応答を、脾臓をプールしたマウス群に関して（n＝7）、マウス脾細胞の単回インビトロ刺激によるクロム放出アッセイを用いて測定した。マウスに対して0日目および21日目に15μgのタンパク質を皮下に免疫処置するか、または50μgのDNAを筋肉内に免疫処置した。脾臓を43日目に採取した。塗りつぶした記号はMtb8.4 DNAによる形質導入を受けた標的の溶解を表している。白抜き記号は対照EL4標的の溶解を表している。図4に示されているように、タンパク質-ミクロスフェアを投与した群では強いCTL応答が測定された（丸印）。この反応はタンパク質＋MPL/サポニン群で測定された反応（三角印）よりも有意に強く、驚いたことに、DNAを投与した群での反応と同程度であった（四角印）。

この実験から得られた抗体により、タンパク質-ミクロスフェアおよびタンパク質＋MPL/サポニンアジュバント混合物は、強さが同程度の抗体応答を誘発するが、一方DNA免疫処置群では検出可能な抗体応答が誘発されないことが示された。DNAワクチンが強い抗体応答を誘発できないことは、例えば、中和抗体を誘発するように設計されたHIVワクチンを、タンパク質-ミクロスフェアに含めることの主な理由となる。

図5〜図7は、12μgのMtb8.4-ミクロスフェアまたはタンパク質＋アジュバントで1回または2回免疫処置されたC57BL/6マウスに関する、ICC、ELISAおよびCTLのデータをそれぞれ示している。ワクチンは皮下投与によって投与し、一次免疫処置と二次免疫処置との間には21日間をおいた。Mtb8.4-DNA免疫処置に関しては、マウスに50μgのプラスミドDNAを筋肉内注射によって投与した。マウスを二次免疫処置後のさまざまな時点で回収し、抗Mtb8.4免疫応答に関して分析した。

1. CTLアッセイ：CD8+T細胞によるMtb8.4-EL4標的の特異的溶解
2. ICCアッセイ：Mtb8.4ペプチドによる5時間の活性化後のCD8+およびCD4+T細胞の細胞内サイトカイン染色
3. IFNγ ELISA：rMtb8.4で活性化された脾細胞培養物からのIFNγ放出
4. 抗Mtb8.4血清IgG₁およびIgG_2b

図5は、組換えMtb8.4タンパク質＋PBS、ミクロスフェア中に封入されたMtb8.4（MJ-071b）、Mtb8.4タンパク質＋アジュバント（RC-529-AF）またはMtb8.4表面吸着ミクロスフェア（AM-008）による、単回の皮下（SC）または皮内（ID）免疫処置を受けたC57Bl/6マウスを示している。これらのデータは、単回のSCまたはID免疫処置から14日後の個々のマウスの脾臓におけるCD8+IFNγ+細胞（ICCによる）の比率を示している。

図6は、組換えMtb8.4タンパク質＋PBS、ミクロスフェア中に封入されたMtb8.4（MJ-071b）、Mt8.4タンパク質＋アジュバント（MPL-AF、557-AF、544-AF）またはMtb8.4 DNA（筋肉内免疫処置）による1回もしくは2回の皮下（SC）免疫処置を受けたC57Bl/6マウスを示している。これらのデータは、組換えMtb8.4によって活性化された脾細胞培養物（マウス3匹からプールした脾臓）からのIFNγ放出（ELISA）を72時間にわたって示している。

図7は、組換えMtb8.4タンパク質＋PBS、ミクロスフェア中に封入されたMtb8.4（MJ-071b）、Mtb8.4タンパク質＋アジュバント（MPL-AF、557-AF、544-AF）またはMtb8.4（筋肉内免疫処置）による単回の皮下（SC）免疫処置を受けたC57Bl/6マウスを示している。これらのデータは、放射線を照射したMtb8.4-EL4細胞による5日間の活性化後のCD8+T細胞によるMtb8.4-EL4標的の特異的溶解（CTLアッセイ）を示している。

これらのデータは、タンパク質-ミクロスフェアワクチンの単回投与が、結核菌抗原Mtb8.4に対する細胞性および体液性免疫応答の両方を誘導するのに有効であることを示している。Mtb8.4-ミクロスフェアによる一次免疫処置後に、強い抗Mtb8.4 CD8 T細胞応答が、細胞内サイトカイン染色およびMtb8.4発現標的の特異的溶解（CTLアッセイ）の両方を用いて検出された。

実施例6：ミクロスフェア中に共封入されたMtb8.4タンパク質およびアジュバント（MPL）は、Mtb8.4に対するTh1およびB細胞媒介性免疫を増強する相乗的応答を誘導する
本実施例には、MPLなどのアジュバントの存在下でのタンパク質ミクロスフェアの共封入の、Th1およびB細胞媒介性免疫に対する相乗効果を示す。

図8および図9は、MPLを共封入したミクロスフェアによる単回免疫処置後のMtb8.4に対するCD8およびCD4 T細胞免疫応答の増強をそれぞれ示している。C57Bl/6マウスに対して、Mtb8.4-ミクロスフェア（MJ-073）または3種類の方法を用いて調製したMPL共封入Mtb8.4-ミクロスフェア（MJ-O82、MJ-083またはMJ-084）による免疫処置を行った（ID）。これらのデータは、一次免疫処置から14日後のIFNγに関するICCによるMtb8.4反応性CD8+（図8）およびCD4+（図9）細胞の比率を示している。

図10および図11は、MPL共封入ミクロスフェアによる単回免疫処置後のMtb8.4に対するIgG_１およびIgG_２ｂ抗体応答の増強をそれぞれ示している。Mtb8.4-ミクロスフェア（MJ-073）、MPLを共封入したMtb8.4ミクロスフェア（MJ082、MJ083、MJ084）またはMtb8.4表面吸着ミクロスフェア（MJ085）による二次免疫処置から14日後にC57Bl/6マウスから血清を採取し、ELISAにより抗Mtb8.4 IgG₁およびIgG_2b抗体に関して評価した（それぞれ図10および11）。

これらのデータは、モノホスホリルリピドA（MPL（登録商標））などのアジュバントをMtb8.4ミクロスフェア中に共封入した場合のCD4およびCD8 T細胞免疫応答に対する相乗効果を示している。さらに、特定の機序理論に限定されるわけではないが、MPLを含むミクロスフェアはIgG_２ｂ血清抗体レベルおよび脾細胞上清からのIFNγ放出を有意に増加させており、このことはMPLなどのアジュバントをタンパク質-ミクロスフェア中に共封入することによってTh1免疫応答への分極化が生じることを示している。これらのデータは、タンパク質-ミクロスフェアが、抗原特異的免疫を誘導するためのTh1誘導性アジュバント/送達システムとして有効であることを示している。

実施例7：Mtb8.4およびMPLを共封入したミクロスフェアの用量反応性
本実施例には、Mtb8.4-EL4標的細胞の特異的CTL媒介性溶解の、CD4+T細胞のIFNγ放出の、およびCD8+T細胞のIFNγ放出（それぞれ図12、図13および図14）の誘導に対する、MJ-082タンパク質-MPL共封入物の用量反応性を開示する。CTLアッセイおよびICCアッセイを本明細書の別の箇所に記載した通りに行ったところ、モノホスホリルリピドA（MPL（登録商標））などのアジュバントをMtb8.4-ミクロスフェア中に共封入した場合のCD4およびCD8 T細胞免疫応答に対する相乗効果がさらに裏づけられた。

実施例8：タンパク質およびアジュバントの混合物の最適化
本実施例には、本発明による最適なワクチン製剤のいくつかの様相を示す。第1に、タンパク質（Mtb8.4）と別のアジュバント（RC529）との共封入は、CD8+およびCD4+T細胞応答、CTL、IFN-γおよび抗体（IgG1およびIgG2a）免疫応答を誘発するのに有効である。このため、共封入されたタンパク質およびアジュバントに対する広範囲にわたる免疫応答は単一のアジュバントには限定されない。第2に、タンパク質およびアジュバントを別個に封入して混合しても、広範囲にわたる免疫応答は誘発されない。しかし、第3に、抗原およびアジュバントを同じ粒子中に封入すると、別個の粒子中に封入して混合した場合よりも強い応答が誘発される。第4に、ミクロスフェア中に封入されたアジュバント（MPLまたは529）は、標準的水性製剤（すなわち、リポソーム）中に製剤化されたアジュバントと少なくとも同程度に有効である。ミクロスフェア中への封入を介してアジュバントを送達するこの新規な手段は、従来のアジュバント送達に代わる魅力的な選択肢となる。

Mtb8.4をタンパク質抗原として用いた。第1の点に対処するためには、合成アミノアルキルグルコサミニドリン酸であるRC529を用い、それ以降の点に対処するにはMPLおよび529の両方を用いた。以下のものを含むミクロスフェアを調製した：（a）Mtb8.4タンパク質のみ、（b）MPL（登録商標） アジュバントのみ、（c）RC529アジュバントのみ、（d）Mtb8.4タンパク質およびMPLを共封入、および（e）Mtb8.4タンパク質および529を共封入。添加した成分の違いを除き、5種類のミクロスフェアすべての調製には本質的に同じ方法を用いた。

方法
ミクロスフェアの調製：
添加した成分の違いを除き（Mtb8.4タンパク質の有無、MPL（登録商標） アジュバントの有無、RC529アジュバントの有無）、本実施例のための種々の製剤の調製には同じミクロスフェア調製法を用いた。これは上記の実施例1、実施例6および実施例7に記載したものと同じ方法である。簡潔に述べると、ドキュセートナトリウムのジクロロメタン溶液を用いて水相酸性溶液の抽出を行った。タンパク質を有する製剤に関しては、水溶液中にあるMtb8.4タンパク質（3mg）を有機相中に抽出した。続いてアジュバント（MPLまたは529）を有機相に必要に応じて添加し、その後に300mgのPLG（RG502H）を添加した。続いて有機相を400mlの5％PVA中にてSilversonホモジナイザーを用いて乳化させた。ヒュームフード内で数時間攪拌することによって溶媒を抽出した。続いてミクロスフェアを数回洗浄し、凍結乾燥した。凍結乾燥の前にマンニトールを添加した。

ミクロスフェアの特徴分析：
ミクロスフェアのタンパク質含量およびアジュバント含量を、HPLC分析またはアミノ酸分析およびバートレット無機リンアッセイを用いて決定した。サイズ分布の測定にはHoriba LA920を用いたほか、走査型電子顕微鏡による視覚的判定によっても行った。放出動態は、10mg〜20mgの製剤を100mM Tris緩衝液中に分散させ、上清から経時的に試料を採取した上で、逆相HPLCによってタンパク質濃度を定量することによって測定した。

免疫処置：
7匹ずつのC57Bl/6からなる群に対して表8.1に記載した通りに免疫処置を行った。対照群のマウスには、未処置（naive）、Mtb8.4タンパク質のみ、Mtb8.4-DNAおよびMtb8.4タンパク質-ミクロスフェアを含めた。アジュバントMPLおよび529の各々に対する被験群は5つとし、試薬のさまざまな組み合わせをカバーした。Mtb8.4タンパク質の用量は5μgとした。MPLまたは529に関するアジュバント目標用量はマウス1匹当たり5μgとした。しかし、共封入ミクロスフェアによって投与されたアジュバントの実際の量を測定して設定した。すなわち、Mtb8.4-MPL共封入ミクロスフェアおよびMtb8.4-529共封入ミクロスフェアを投与されたマウスに関するアジュバント用量はそれぞれマウス1匹当たり4.0μgおよび6.5μgであった。したがって、MPLを投与したすべての群はマウス1匹当たり4.0μgを投与され、529を投与したすべての群はマウス1匹当たり6.5μgを投与された。

（表１）インビボ分析のための実験群の説明

注：「-AF」製剤（「水性製剤」）は、水中脂質リポソームアジュバント製剤である。

全タンパク質製剤は、尾の基部への皮内経路によって投与され、一方、DNAは筋肉内に投与された。各群のマウス3匹または4匹を一次免疫処置から2週間後に取り出して脾臓および血清を採取し、評価のためにプールした。残りの1群当たり3匹または4匹のマウスには一次免疫処置から3週間後に追加免疫処置を行い、その2週間後に取り出した。

免疫応答：
脾細胞を、CTLアッセイ、CD8+およびCD4+T細胞応答ならびにIFN-γに関するICCアッセイに用いた。Mtb8.4特異抗体の測定には血清を用いた。これらの方法は上記の実施例1〜7に用いたものと同じである。

結果
ミクロスフェアの特徴分析：
ミクロスフェアのインビトロ物理化学分析の結果を表2に示している。タンパク質ミクロスフェア（a）、タンパク質-MPL共封入ミクロスフェア（d）およびタンパク質-529共封入ミクロスフェア（e）に関するMtb8.4タンパク質のコア充填率（core-loading）は同程度であり、0.62％〜0.87％の範囲であった。MPL-ミクロスフェア（b）およびタンパク質-MPL共封入ミクロスフェア（d）に関するMPLのコア充填率はそれぞれ0.64％および0.70％であり、一方、529ミクロスフェア（c）およびタンパク質-529共封入ミクロスフェア（e）に関する充填率はそれぞれ0.71％および0.80％であった。この一連のミクロスフェアはいずれも同程度のサイズであり、直径は約1μmであった。表2には、2時間時点で放出されたタンパク質の量がタンパク質ミクロスフェアについては3％であり、タンパク質-MPL共封入ミクロスフェアおよびタンパク質-529共封入ミクロスフェアについては17％および21％であったことも示されている。

（表２）Mtb8.4製剤、MPL製剤およびRC529製剤の特徴分析

ICCSの結果：
1回のみの免疫処置の後に採取した脾細胞に対して行ったICCSアッセイによるCD8+およびCD4+T細胞応答の結果を図15A〜図15Dに示している。図15Aおよび図15Bは、MPL群および対照群に関するMtb8.4特異的CD8およびCD4 T細胞応答を表しており、一方図15C〜図15Dは529群および対照群に関する結果を表している。4つの図はすべて、MPLまたは529のいずれかを用いたタンパク質-アジュバント共封入ミクロスフェアにより、最も強いCD8 T細胞応答および最も強いCD4 T細胞応答が生じたことを示している。CD8およびCD4 T細胞応答両方について、タンパク質-MPL共封入ミクロスフェアの方がタンパク質-529共封入ミクロスフェアよりも強い応答を誘発した。Mtb8.4タンパク質のみ、タンパク質＋MPL（登録商標）アジュバントおよび未処置のマウスのいずれによっても、CD8 T細胞応答もCD4 T細胞応答も本質的には生じなかった。図15A〜図15Dはまた、アジュバント-ミクロスフェアをタンパク質のみ（F群およびK群）またはタンパク質-ミクロスフェア（H群およびM群）と混合すると、CD8およびCD4 T細胞応答の両方が、-AF脂質製剤中に製剤化されたアジュバントによって生じたもの（E群、J群、G群およびL群）よりも増強されることも示している。すなわち、アジュバント-ミクロスフェアは、裸の（naked）タンパク質、ならびにMPLおよび529を用いたタンパク質-ミクロスフェアのいずれにも有効なアジュバント製剤である。

IFN-γの結果：
一次免疫処置から2週間後に採取した脾細胞からのIFN-γ放出を、図16A（MPL群および対照群）ならびに図16B（529群および対照群）に示している。図16A〜図16Bは、CD8およびCD4 T細胞応答と同じく、最も強いIFN-γ応答がタンパク質-MPL共封入ミクロスフェアおよびタンパク質-529共封入ミクロスフェアによって誘発され、2つの応答の中ではタンパク質-MPL共封入ミクロスフェア製剤の方が同じく強い応答を誘発することを示している。このアッセイにおいて、タンパク質ミクロスフェアを、アジュバントもしくはアジュバント-ミクロスフェアと混合して、または混合せずに投与された群（D、G、H、LおよびM群）はすべて同程度の応答を誘発し、これはタンパク質のみおよびタンパク質＋アジュバント（B、E、F、JおよびK群）によって誘発されたものよりも明らかに強かったが、共封入群（IおよびN群）によって誘発されたものよりはかなり弱かった。

IgG1およびIgG2b抗体応答：
二次免疫処置から2週間後に採取した血清に関して測定したIgG1およびIgG2b抗体応答を、対照群およびMPL群については図17A〜図17Bに示し、対照群および529群については図17C〜図17Dに示した。IgG1については16000：1希釈、IgG2bについては4000：1希釈で測定したODを、応答として示した。図17Aおよび図17Cは、ミクロスフェア中に封入されたタンパク質を投与された群（G、H、I、L、MおよびN群）で最も強いIgG1応答が得られたことを示している。DNAおよびタンパク質のみによる免疫処置はIgG1応答をほとんどまたは全く誘発せず、タンパク質をMPL-AFおよび529-AFのいずれかと混合した場合は非常に弱いIgG1応答が得られた。図17Bは、タンパク質-ミクロスフェアをアジュバントと混合した場合（G、HおよびI群）に最も強いIgG2b応答が得られたことを示している。これらの応答は、DNA、タンパク質のみ、タンパク質とMPL-AFとの混合、およびタンパク質とMPL-ミクロスフェアとの混合によって誘発されたものよりもはるかに強かった。興味深いことに、脂質中に製剤化したアジュバントとミクロスフェア中に製剤化したアジュバントを比較した図17A〜図17D中のいずれの比較においても（例えば、IgG1およびIgG2bに関するEとF、GとH、JとK、およびLとMとの比較）、アジュバント-ミクロスフェア群はより高レベルの抗体を誘発した。このことは、アジュバント-ミクロスフェアがアジュバントの有効な製剤の一つであり、おそらくは-AF脂質製剤よりも優れていることを示している。

これらのデータは、タンパク質-アジュバント共封入物が、CD8 T細胞応答、CTL、CD4 T細胞応答、IFN-γならびにIgG1およびIgG2b抗体応答を含む、広範囲にわたる免疫応答を誘発するための最も有効なワクチン製剤と考えられることを示している。これまでの実施例で示されたように、共封入はMPLに加えて、合成AGPであるRC529についても有効であった。これらの結果によれば、他の合成アジュバントもミクロスフェア共封入製剤において有効であると考えられる。これらのデータは、少なくともMtb8.4に関しては、MPLの方が529よりもミクロスフェア中に共封入するには幾分優れたアジュバントであることを示唆している。

また、これらのデータは、アジュバント-ミクロスフェアがアジュバントの有効な製剤であることも明らかに示している。これはMPLおよび529のいずれについても示された。-AFリポソームアジュバント製剤との比較では、アジュバント-ミクロスフェアは免疫応答の増強に関して優れてはいないものの同程度の成績であった。アジュバント-ミクロスフェア製剤の開発および最適化は、最も有効なワクチンアジュバント製剤を創出するために有望である。

実施例9：Mt8.4およびMPL共封入の代替的および最適な方法
本実施例には、タンパク質およびアジュバントの共封入の代替的方法によっても、強く広範囲にわたる免疫応答を誘発しうるミクロスフェアを作製しうることを示す。詳細には、ダブルエマルション法によってミクロスフェアを作製し、シングルエマルション法を用いて調製した共封入ミクロスフェアと比較した。さらに、本実施例には、有効なミクロスフェアの作製にHIPを利用する、代替的でしかもより製造しやすい手法も示す。この方法では、水性タンパク質溶液をダブルエマルション工程における内水相として、溶媒中のHIP剤とともに用いる。タンパク質はおそらく、一次エマルション段階の間に溶媒中に抽出されると考えられる。

タンパク質-アジュバント共封入ミクロスフェアを調製するための代替的な方法を検討した。これらの方法を、妥当な封入効率（すなわち、最終ミクロスフェア産物中の投入試薬の比率）を有するミクロスフェアを生成する能力、および動物において広範囲にわたる免疫応答を賦活する能力に関して評価した。検討するタンパク質は結核菌抗原の一つであるMtb8.4（「DPV」）とし、アジュバントはMPL（登録商標）アジュバントとした。

ミクロスフェアの調製：
Mtb8.4-MPL共封入ミクロスフェアを、いくつかの特徴について共通する3種類の異なる技法を用いて調製した。すなわち、用いた製剤にはすべて、3mgのMtb8.4タンパク質、3mgのMPL（登録商標）アジュバント、300mgのRG502Hポリマー、プロセス媒体としての400mlの5％PVAを用い、ミクロスフェアの調製にはSilverson混合機を混合速度9000rpmで用いた。ロット番号MJ102の第1のミクロスフェア製剤は、実施例1、実施例6および実施例7に記載された通りに調製した。簡潔に述べると、Mtb8.4タンパク質を水溶液からドキュセートナトリウム-ジクロロメタン（DCM）溶液中に疎水的イオン対形成を介して抽出した。続いて水溶液を廃棄した。ポリマーおよびMPL（登録商標）アジュバントをDCMに添加してミクロスフェアを調製した。ロット番号MJ107の第2の製剤には、HIPおよび/またはドキュセートナトリウムを用いずにタンパク質を有機相中に可溶化するために、改変した溶媒系を用いた。Mtb8.4は単独ではDCM中には不溶性である。このため、Mtb8.4を酸性pHの水溶液から凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶解して、それに同容積のDCMを添加した。続いてポリマーおよびMPL（登録商標）アジュバントを溶媒相に溶解し、ミクロスフェアを調製した。ロット番号MJ108の第3の製剤には、ダブルエマルション法の変法を用いた。内水相は、MJ102の抽出時と同じく、Mtb8.4タンパク質の酸性pHにある1.0ml水溶液とした。有機相はMJ102の抽出時と同じく約8mgのドキュセートナトリウムを含み、さらにポリマーおよびMPL（登録商標）アジュバントを含むDCMとした。一次エマルションは、溶媒相にあるタンパク質溶液をボルテックスを用いて激しく混合することによって形成させた。タンパク質はおそらく、MJ102の場合と同じく、疎水的イオン対形成を介して有機相に抽出されたと考えられる。しかし、この技法は、MJ102工程の面倒な面である水相の分離および廃棄の必要がない点で、より簡単である。続いて、ミクロスフェアを上記の一次エマルションを用いて調製する。

ミクロスフェアの特徴分析：
ミクロスフェアのタンパク質含量およびアジュバント含量を、HPLC分析またはアミノ酸分析およびバートレット無機リンアッセイを用いて決定した。サイズ分布の測定にはHoriba LA920を用いたほか、走査型電子顕微鏡による視覚的判定によっても行った。放出動態は、10mg〜20mgの製剤を100mM Tris緩衝液中に分散させ、上清から経時的に試料を採取した上で、逆相HPLCによってタンパク質濃度を定量することによって測定した。

免疫処置：
7匹ずつのC57Bl/6からなる群に対して、マウス1匹当たり5μgの封入Mtb8.4タンパク質により免疫処置を行った。MPL（登録商標）アジュバントに関する目標用量はマウス1匹当たり5μgとした。MJ102、MJ107およびMJ108に関する実際の用量はマウス1匹当たりそれぞれ4.1μg、4.3μgおよび6.4μgであった（表3）。対照群のマウスには、未処置、Mtb8.4タンパク質＋MPL-AF、タンパク質＋-AF媒体（脂質水溶液）およびMtb8.4-DNAを含めた。全タンパク質製剤は、尾の基部への皮内経路によって投与し、一方、DNAは筋肉内に投与した。各群のマウス3匹または4匹を一次免疫処置から2週間後に取り出して脾臓および血清を採取し、評価のためにプールした。残りの1群当たり3匹または4匹のマウスには一次免疫処置から3週間後に追加免疫処置を行い、その2週間後に取り出した。

免疫応答：
脾細胞を、CTLアッセイ、CD8+およびCD4+T細胞応答ならびにIFN-γに関するICCSアッセイに用いた。Mtb8.4特異抗体の測定には血清を用いた。これらの方法は上記の実施例1〜実施例7に用いたものと同じである。

結果
ミクロスフェアの特徴分析：
タンパク質含量およびMPL（登録商標）含量（「コア充填率」、CLと略記）ならびに封入効率を表3に挙げた。MJ102、MJ107およびMJ108に関してタンパク質の封入効率は同程度かつ妥当であり、64％〜76％の範囲であった。MPL（登録商標）アジュバントの封入効率も同程度かつ妥当な値であり、62％〜79％の範囲であった。アジュバントと抗原との比もいずれも均一に近く、0.81〜1.28の範囲であった。

（表３）Mtb8.4およびMPL（登録商標）アジュバントのコア充填率および封入効率

これらの3種類の製剤に関する粒径の中央値および初期タンパク質放出動態データを表4に示している。これらの製剤の粒径の中央値は1μg〜2.6μgの間であり、ミクロスフェアが最適な食作用を受けるために望ましい範囲（すなわち、約1μm〜10μm）に十分に含まれる。AOTを含む2つの製剤であるMJ102およびMJ108がMJ107よりも有意に低い初期放出動態を示すことも、表4により示される。すなわち、MJ107の場合は封入されたタンパク質の78％が2時間以内に放出されるが、MJ102およびMJ107はタンパク質の約20％しか放出されない。これは、（i）タンパク質とドキュセートナトリウムとの疎水的イオン対形成、（ii）製剤に対するAOTの影響、および/または（iii）MJ107に対する、より親水性の高い溶媒（DMSO：DCMが1：1）の使用に起因する可能性がある。タンパク質の過度の初期放出は、放出の前にミクロスフェアの食作用のための十分な時間が得られないことから、ミクロスフェアの有効性を減じさせるおそれがある。

（表４）ミクロスフェアのサイズおよび初期タンパク質放出動態

CTL応答：
単回免疫処置から2週間後に測定したCTL応答を図18に示している。Mtb8.4タンパク質＋MPL（登録商標）アジュバントを投与されたマウスは明らかな特異的CTL応答を示さなかった。同様に、未処置マウスおよびタンパク質＋-AF媒体（脂質）を投与されたマウスも特異的CTL応答を生じなかった。しかし、有効性が以前に判明しているMtb8.4タンパク質-MPL共封入製剤（実施例1、実施例6、実施例7および実施例8を参照）であるMJ102は、この場合もCTLを誘発することに成功した。同様に、ダブルエマルション法を用いて調製した共封入ミクロスフェアMJ108も同程度の強さのCTL応答を誘発した。2時間時点でほぼ80％が放出された共封入製剤であるMJ107は、この実験におけるこの時点では強いCTL応答を誘発しなかった。

IFN-γ応答：
一次免疫処置または一次および二次免疫処置のいずれかを受けたマウスについて測定した脾細胞培養物からのIFN-γ放出を図19に示している。図19は、タンパク質＋MPL（登録商標）アジュバント、タンパク質＋-AF媒体を投与されたマウスおよび未処置マウスではIFN-γが本質的に全く誘発されなかったことを示している。DNAを投与されたマウスは背景値を辛うじて上回る程度のIFN-γ応答を誘発した。これに対して、MJ102およびMJ108ミクロスフェアはいずれも、1回または2回の免疫処置を受けたマウスにおいて強く同程度のIFN-γ応答を誘発した。CTL応答についても、MJ107ミクロスフェアは初期放出動態の低い2つのミクロスフェア製剤よりもIFN-γ誘発が弱かったが、これは背景値を上回るレベルであり、DNA群のものと同程度であった。

IgG1およびIgG2b抗体応答：
図20および図21はそれぞれ、マウスにおいて誘発されたMtb8.4特異的IgG2bおよびIgG1抗体応答を示している。図20は、3種類のミクロスフェア製剤が最も強いIgG2b応答を誘発したことを示している。タンパク質＋MPL（登録商標）アジュバントおよびMtb 8.4-DNAはミクロスフェアよりもIgG2b誘発レベルが低かった。CTLおよびIFN-γ応答の場合と同じく、MJ102およびMJ108はMJ107よりも強い応答を誘発した。同様に、図21は3種類のミクロスフェア製剤が最も強いIgG1特異抗体応答を誘発したことを示している。タンパク質＋MPL（登録商標）アジュバントおよびMtb8.4-DNAはミクロスフェアよりもIgG1誘発レベルが低かった。他の免疫応答測定値とは異なり、3種類のミクロスフェア製剤に対するIgG1応答はすべて同程度であった。

これらのデータは、良好なミクロスフェア特性（サイズ、封入効率、放出動態など）を示し、マウスにおいてCD8 T細胞、CTL、CD4 T細胞、IFNγならびにIgG2bおよびIgG1抗体を含む強い免疫応答を誘発する、共封入ミクロスフェアの複数の表現があること（HIP抽出、溶媒中でのタンパク質とアジュバントの混合、ダブルエマルション）を示している。これらのデータはまた、良好なミクロスフェア特性（サイズ、封入効率、放出動態など）を同じく生じ、マウスにおいてCD8 T細胞、CTL、CD4 T細胞、IFNγならびにIgG2bおよびIgG1抗体を含む強い免疫応答を誘発する、疎水的イオン対形成の複数の表現があること（例えば、抽出、ダブルエマルション）も示している。さらに、MJ107の性能がMJ102および1008よりも低かったことは、製剤化過程の問題および生成される産物の特性を必ずしも常に先験的に予測しうるとは限らないことを示している。MJ107がそれでも、検討したすべてのアッセイでタンパク質＋アジュバントよりも優れた性能を示したことは重要な点である。

本実施例で検討した2つの代替的方法（MJ107：タンパク質およびアジュバントの、有機溶媒中での共可溶化、ならびにMJ108：MJ102に用いたものよりも製造しやすい偽抽出物としてのダブルエマルション）はいずれも、実験室でより簡単に用いることができ、おそらくは製造もしやすい技法である。

実施例10：72fタンパク質ミクロスフェアは強い免疫応答を誘発する
本実施例には、好ましい結核抗原である72fの送達の最適化に関係するいくつかの点を示す。72fは3つのポリペプチド：RA12、TbH9およびRA35の融合体である。本実施例は以下のことを示す：（1）ミクロスフェア中に封入された組換え72f（r72f）タンパク質は、強いCD4+およびCD8+T細胞応答、CTLおよび抗体応答を誘発しうる；（2）r72fとアジュバント（MPL）との共封入物はアジュバントを含まないr72f-ミクロスフェアよりも強い免疫応答を誘発する；（3）ダブルエマルションおよびシングルエマルション製剤はいずれも最も強い免疫応答を誘発する；および（4）最適なミクロスフェアによって誘発されるCD4+T細胞応答（Elispot）はタンパク質＋AS-2（MPLおよびサポニン）、タンパク質＋MPLおよびタンパク質のみによって誘発されるものよりも著しく強い。

結核菌融合タンパク質72fの一連の初期PLGミクロスフェア製剤を調製し、インビボで評価した。製剤化の方法および材料は、ミクロスフェア形成時および最終産物におけるタンパク質のそれ自体、ポリマー、溶媒との相互作用の程度が変化するように選択された。これらの差異は、インビトロ特徴分析、さらには広範囲にわたる抗原特異的免疫応答を生じる能力に関するインビボ評価に関して、異なるミクロスフェア特性が生じるように設計し、これらの製剤のうち2つは、タンパク質およびMPL（登録商標）アジュバントが共封入されたものであった。72f融合タンパク質の3つの構成要素のそれぞれに対する免疫応答を測定した（以下の免疫応答の項参照）。

ミクロスフェアの調製：
72fタンパク質ミクロスフェアをシングルエマルション法およびダブルエマルション法を用いて調製した（表5）。表1に記載したすべての製剤は、300mgのPLGポリマー、3mgの72fタンパク質、10mlの有機溶媒（表5）を有し、ミクロスフェアの作製にはSilverson混合機を9000rpmで用いた。製剤の違いには、シングルエマルション（SE）工程であるかダブルエマルション（DE）工程であるか、ポリマーの末端基がカルボン酸であるかエステル基であるか、ポリマー末端基の頻度（すなわち、分子量：約10kDaに対して約40kDa）、DCMであるかDCM：DMSO（35：65）であるか、MPL（登録商標）アジュバントの添加の有無、プロセス媒体の容積（280mlであるか400ml）および安定剤（CMC 1.4％であるかPVA 5％）が含まれる。MPL（登録商標）アジュバントをAM123では共封入した点を除き、AM123はAM117と同じ様式で調製されたことに注意されたい。同様に、AM124ではMPL（登録商標）アジュバントを共封入した点を除いて、AM124はAM120と同じ様式で調製された。

（表５）72fタンパク質ミクロスフェアの調製におけるパラメーターの違い

ミクロスフェアの特徴分析：
ミクロスフェアのタンパク質含量およびアジュバント含量を、アミノ酸分析およびBartlett無機リンアッセイによって決定した。サイズ分布の測定にはHoriba LA920を用いたほか、走査型電子顕微鏡による視覚的判定によっても行った。

免疫処置：
マウス1匹当たり10μgの封入72fタンパク質を3週間間隔で尾の基部に接種することで（すなわち、ID）、3匹ずつのC57BL/6マウスの群を2回免疫処置した。免疫応答の発生に関する評価のために、2回目の免疫処置から2週間後にマウスから脾臓および血清を採取した。MPL（登録商標）アジュバントの目標用量はマウス1匹当たり10μgとした。タンパク質およびMPL（登録商標）アジュバントを共封入した2種類のミクロスフェア製剤であるAM123およびAM124の実際の用量はそれぞれ5μgおよび12μgであった。対照群には、未処置マウス、タンパク質のみ（10μg）、水中油型エマルション中のタンパク質＋AS-2（MPL（登録商標）およびサポニン）、ならびにタンパク質＋MPL（登録商標）-SEアジュバントを含めた。

免疫応答：
脾細胞をElispotアッセイおよびCTLアッセイに用いた。Elispotアッセイに関しては、細胞をTbH9タンパク質、RA12タンパク質、RA35タンパク質、およびRA12に対するCD8 10アミノ酸Dbエピトープによって刺激した。CTLアッセイに関しては、Ra12タンパク質による形質導入を行ったEL4細胞で細胞を刺激した。血清中のTbH9タンパク質、RA12タンパク質およびRA35タンパク質に対する抗体の測定には抗原特異的ELISAを用いた。

結果
ミクロスフェアの特徴分析：
タンパク質含量およびMPL（登録商標）含量（「コア充填率」または「CL」）を表6に挙げている。タンパク質のコア充填率は同程度であり、0.63％〜1.35％の範囲であった。AM123およびAM124に関するMPL（登録商標）アジュバントのコア充填率は0.68％および0.93％であり、このため、ある一定のタンパク質用量（すなわち、10μg）では、AM124の方がAM123よりもほぼ2倍のアジュバントが投与される。表6は、直径約1μmにおいてミクロスフェアのサイズも同様であったことを示している。

（表６）72fおよびMPL（登録商標）アジュバントのコア充填率および封入効率

Elispotアッセイ：
Elispotアッセイの結果は、マウス3匹からのプール脾細胞に対する三重反復試験に基づく。表記した数はウェル当たりのIFN-γ Elispots数を表している。アッセイの陰性対照として、各群の各マウスからの細胞を培地のみによって刺激した。培地で刺激した各ウェルにはわずかな（＜15）陽性スポットしかなかった。これに対して、TbH9組換えタンパク質（10μg/ml）で刺激した細胞は陽性応答を示したが、その程度は群間に違いがあった。すなわち、未処置マウス（「培地」行）およびタンパク質のみを投与されたマウスでは、TbH9特異的陽性応答が誘発されなかった。AS-2とともに製剤化したタンパク質、ならびにタンパク質＋MPL（登録商標）-SEアジュバントはいずれも陽性のTbH9特異的応答を誘発し、ウェル当たりのスポット数はそれぞれ52個および154個であった。すべてのタンパク質ミクロスフェア群でも陽性のTbH9特異的応答が誘発され、AM116、AM117、AM118およびAM119に関するウェル当たりの平均スポット数はそれぞれ43個、41個、77個および69個であった。しかし、タンパク質ミクロスフェア製剤AM120（MPL非含有）ならびにAM123およびAM124（MPL共封入）は非常に強いTbH9応答を誘発したために、ウェル全体にスポットの集密化がみられた。AM117（MPL非含有）とAM123（MPL共封入）との比較により、MPL共封入によって生じた免疫応答の顕著な増強が明らかに示された。AM120（MPL非含有）応答はすでに最大限であるため、AM124（MPL共封入）との間に差は認められなかった。未処置マウスと比較してRa35特異的応答もRA12特異的応答も観察されなかった。Ra12 CD8+T細胞エピトープ（ペプチド番号86〜95）に対する最も強い応答も、ミクロスフェアを用いた場合に認められた。この読み取りに関しては、8種類のうち6種（AM116、AM117、AM119、AM120およびAM123）では応答がほぼ均一であったが、AM118およびAM124では応答が幾分弱かった。すなわち、タンパク質ミクロスフェアはTbH9に対する最も強いCD4+T細胞応答を生じるとともに、Ra12エピトープに対してもCD8+T細胞応答を生じさせた。これらの応答はタンパク質のみの場合よりもはるかに強く、MPLおよびAS-2アジュバント系によって誘発されたものよりも強かった。

CTL応答：
2回目の免疫処置から2週間後にRa12に対する二次CTL応答を測定した。72fタンパク質＋MPL（登録商標）アジュバントを投与されたマウスは明らかな特異的CTL応答を示さなかった。未処置マウスおよびタンパク質のみを投与されたマウスでは特異的溶解は観察されなかった。タンパク質＋AS-2はマウス3匹中3匹でCTL応答を生じさせ、これは背景値に対して中程度〜高いレベルであった。AM118を唯一の例外として、すべてのタンパク質-ミクロスフェア製剤がCTL応答を誘発した。最も強く最も定常的なCTL応答は、AM123、AM116、AM117およびAM119の場合であった。AM117（MPL非含有）とAM123（MPL共封入）との比較では、この場合もMPLの共封入によって免疫応答がかなり増強することが示された。すなわち、タンパク質ミクロスフェアは、タンパク質のみおよびタンパク質＋MPL（登録商標）アジュバントよりも明らかに強いCTL応答を生じさせた。

10μgの製剤化72fタンパク質の2回目の投与から2週間後に、個々のマウスにおけるRa12特異的抗体応答を測定した。IgG1応答はいずれも強く、タンパク質製剤を免疫処置したマウスのすべてでほぼ同程度であった。IgG2a応答は一部の群において観察されたが、IgG1よりも弱かった。タンパク質＋MPLはマウス3匹中3匹でIgG2a応答を誘発し、タンパク質＋AS-2はマウス3匹中3匹でかなり強いIgG2a応答を誘発した。MPLが共封入されていないミクロスフェア製剤の1つ、すなわちAM120はIgG2a応答を誘発し、応答したマウスは3匹中2匹であった。タンパク質およびMPL（登録商標）アジュバントが共封入された2種類のミクロスフェア製剤AM123およびAM124はミクロスフェア群の中でも最も強い応答を誘発し、それぞれ応答したマウスは3匹中3匹であった。TbH9およびRa35の両方に対するIgG1応答はミクロスフェア製剤およびタンパク質＋AS-2については同程度であったが、タンパク質のみおよびタンパク質＋MPL（Ra35に対して）に対する応答は弱かった。TbH9およびRa35に対しては非常に弱いIgG2a応答が誘発された。

これらのデータは、タンパク質-ミクロスフェア製剤に、結核菌融合タンパク質および製品候補72fに対する、CD8+T細胞、CD4+T細胞および抗体応答のいずれの免疫応答も増強する能力があり、それがタンパク質のみによって誘発されるものを上回ることを明らかに示している。これらの増強は劇的な可能性がある。これらのデータはまた、シングルエマルション工程およびダブルエマルション工程によって作製されたミクロスフェアを含む、種々のミクロスフェア製剤が、種々の免疫応答をインビボで誘発しうることも示している。ミクロスフェア中に共封入されたタンパク質およびMPL（登録商標）アジュバントは、広範囲にわたる免疫応答を得るために有効なワクチン送達システムとなりうる。

実施例11：腫瘍防御アッセイにおけるrICD（Her-2/neu）タンパク質ミクロスフェア
本実施例には、組換えher-2/neu細胞内ドメイン（rICD）タンパク質ミクロスフェアが、有効な腫瘍防御をもたらしうることを示す。複数種の（n＝4）ICDタンパク質ミクロスフェア製剤を調製した。これらはすべて同程度のサイズであり、同一ロットのタンパク質を用いて作製され、PLGポリマーの一種をミクロスフェアマトリックスとして含んでいた。しかし、ミクロスフェアの作製には異なるポリマー、添加物および技法が用いられ、その結果、インビトロまたはインビボでの測定によれば異なる特性を有するミクロスフェアが得られた。詳細には、これらのアプローチは、製造工程時および最終ミクロスフェア産物の双方において、タンパク質とそれ自体、ポリマー、溶媒との相互作用の程度が変化するように、さらには溶質、ポリマー、安定剤および水の相互同士の相互作用が変化するように設計した。これらの製剤にはいずれもアジュバントを含めなかった。これらの4種類の製剤を腫瘍防御モデルにおいて評価した。

ミクロスフェアの調製：
4種類の異なるICDタンパク質ミクロスフェア製剤を調製し、特徴分析して、腫瘍防御モデルにおける評価を行った。これらの製剤には共通した特徴がいくつかあった。すなわち、3種類の製剤はいずれも、2.5mgのICDタンパク質、300mgのPLGポリマー、プロセス媒体としての5％PVAを含み、ミクロスフェアの調製にはSilverson混合機を用いた。これらのミクロスフェアの製剤パラメーターの違いを表7にまとめている。これらには、シングルエマルション法であるかダブルエマルション法であるか、ポリマーの末端基の種類（カルボン酸「H」であるかエステル末端基であるか）、ポリマー末端基の頻度（すなわち、ポリマー分子量が約10kおよび約40K）、用いた溶媒系（DCMおよびDMC：DMSO（1：3.3））、プロセス媒体の容積、用いた混合速度（7000rpmおよび9000rpm）、および添加物（ステアリン酸エチル）の添加が含まれる。

（表７）ICDタンパク質ミクロスフェアの調製におけるパラメーターの違い

ミクロスフェアの特徴分析：
ミクロスフェアのタンパク質含量をアミノ酸分析によって決定した。サイズ分布の測定にはHoriba LA920を用いたほか、走査型電子顕微鏡による視覚的判定によっても行った。

免疫処置：
マウス1匹当たり25μgの封入ICDタンパク質を3週間間隔で接種することで、8匹ずつのC57Bl/6マウスの群を2回免疫処置した。対照群には、（この系に適していることが以前に判明しているアジュバントである）モンタニド中に製剤化された25μgのICD、ICD-DNAを投与するか未処置マウスとした。タンパク質製剤は皮内経路によって投与し、DNAは筋肉内に投与した。

腫瘍移植：
2回目の免疫処置から2週間後にマウスにEL4-Her-2/neu腫瘍細胞を免疫処置した。腫瘍サイズを6週間にわたって定期的に測定した。

結果
ミクロスフェアの特徴分析：
AM049、AM050、AM051およびAM051 ICDミクロスフェアに関するタンパク質含量（「コア充填率」、CLと略記）およびミクロスフェアの直径を表8に挙げた。表8は、これらのミクロスフェア製剤のコア充填率が同程度で0.96％〜1.24％の範囲であり、サイズも同程度であることを示している。

（表８）ICD製剤の特徴分析

腫瘍防御：
図23〜図29は腫瘍防御実験の結果を示している。図22は未処置マウスにおける腫瘍の進行を示している。マウス8匹中6匹では腫瘍の移植から間もなく腫瘍増殖がみられ、マウス8匹中7匹は実験終了時には顕著な腫瘍増殖を示した。図23および図24は、モンタニド中にあるICDタンパク質およびICD-DNAのそれぞれを投与された陽性対照群における腫瘍増殖を示している。図23は、この腫瘍モデルで有効なことが以前に判明しているアジュバントであるモンタニドアジュバント中に製剤化されたICDが、未処置マウスと比較して防御の増強を示したことを示している。第6週までには、モンタニド群のマウス8匹中3匹には顕著な腫瘍増殖がみられた。以前の実験で最も一貫性がみられた陽性対照であるICD-DNAは顕著な腫瘍防御をもたらした（図24）。DNA免疫処置を受けたマウスでは実験がほぼ終了するまで測定可能な腫瘍増殖はみられず、終了時になってマウス1匹の腫瘍が増殖していることが明らかになった。

図25〜図28は、25μgのICDタンパク質封入製剤番号AM049、AM050、AM051またはAM052のそれぞれによる2回の免疫処置を受けたマウス群（n＝8）の結果を示している。これらのデータを対照群と比較したところ、ICDタンパク質ミクロスフェアのロットAM049（図25）は未処置群に比してほとんど防御を示さないように思われたが（図22）、AM051（図27）は腫瘍増殖の発生を幾分遅延させたように思われた。これに対して、ICDタンパク質ミクロスフェアのロットAM050は顕著な防御を示した（図26）。第6週までに明らかな腫瘍増殖を認めたのはマウス8匹中2匹のみであり、この結果はモンタニドアジュバント群よりも優れるとは言えないまでも同程度であった。さらに、ICDタンパク質ミクロスフェアのロットAM052（図28）は、いずれのタンパク質製剤についても最も強くかつ最も一貫した防御をもたらしたように思われた。第6週までに明らかな腫瘍増殖を認めたのはマウス8匹中1匹のみであり、2匹目のマウスが腫瘍増殖を示し始めたばかりであった。さらに、最初の4週間に測定した腫瘍サイズの背景値は極めて小さく、DNA免疫処置によって得られたものと同程度であった（図25）。

これらのデータは、タンパク質ミクロスフェアがワクチン送達システムとしての有効性を有し、タンパク質製剤に関して最も優れた腫瘍防御データがミクロスフェアによって得られることを明らかに示している。これらのデータはまた、異なるミクロスフェア製剤によって種々の免疫応答がいかにして生じうるかも例示している。

当業者は、以上の説明において開示された概念および個々の態様を、本発明の同じ目的を実施するために他の態様を改変および設計するための基盤として容易に利用しうることを理解すると考えられる。また、当業者は、このような等価な態様が、添付の特許請求の範囲に示された発明の精神および範囲を逸脱しないことも理解すると考えられる。

（図１）5種類のミクロスフェア製剤に関して、DPVの放出を時間（日）の関数としてプロットしたグラフを示している。製剤には、JA-024、40％ミリスチン酸エチル（C14）（菱形印）；AS-011（四角印）；AS-012、15％コレステロール（三角印）；AS-014、20％カプリン酸エチル（C10）（×印）；AS-013、20％ステアリン酸エチル（C18）（星印）；およびJA-002、RG-502（＋印）が含まれる。
（図２）図2A〜図2Cは、5匹ずつの群からなるマウスに対してタンパク質5μgの皮下に免疫処置を3週間間隔で2回行った実験による、CTLアッセイの結果を示したグラフである。1つの群には、本発明のHIP法を用いて調製したMtb8.4タンパク質-ミクロスフェアを投与した（図2A）；別の群には、Mtb8.4タンパク質＋MPL/サポニンアジュバント混合物を投与した（図2B）；第3の群には、Mtb8.4タンパク質のみを投与した（図2C）。●印はMtb8.4 DNAによる形質導入を受けた標的の溶解を表している。○印は対照EL4標的の溶解を表している。
（図３）図3A〜図3Cは、本発明のHIP法を用いて調製したMtb8.4タンパク質ミクロスフェアが抗体応答を誘発し（IgG1；図3A）、これがMPL/サポニンアジュバント混合物によって誘発された応答と同程度に強く（図3B）かつタンパク質のみによって誘発された応答よりも有意に強かった（図3C）ことを示したグラフである。個々のマウスによる結果を個別の線として示している。
（図４）脾臓がプールされたマウス群に関して（n＝7）、マウス脾細胞の単回インビトロ刺激後のクロム放出アッセイを用いて測定したCTL応答を示している。塗りつぶした記号はMtb8.4 DNAによる形質導入を受けた標的の溶解を表している。白抜き記号は対照EL4標的の溶解を表している。タンパク質-ミクロスフェアを投与した群では強いCTL応答が測定された（丸印）。この反応はタンパク質＋MPL/サポニン群で測定された応答（三角印）よりも有意に強く、かつ驚いたことに、DNAを投与した群での応答と同程度であった（四角印）。
（図５）細胞内サイトカイン（ICC）アッセイによって評価した、rMtb8.4により活性化された脾細胞培養物からのIFNγ放出を示している。個々のマウスの脾臓におけるCD8+IFNγ+細胞の比率を単回のSCまたはID免疫処置から14日後に測定した。MJ-071bは、MPLを含まないrMtb8.4が封入されたミクロスフェアを示している。
（図６）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって評価した、脾細胞培養物からのIFNγ放出を示している。脾細胞培養物（マウス3匹からプールした脾臓）を組換えMtb8.4によって72時間活性化した。MJ-071bは、MPLを含まないrMtb8.4が封入されたミクロスフェアを示している。
（図７）放射線照射Mtb8.4-EL4細胞による5日間の活性化後のCD8+T細胞による、Mtb8.4-EL4標的のCTL応答による特異的溶解率を示している。MJ-071bは、MPLを含まないrMtb8.4が封入されたミクロスフェアを示している。
（図８）IFNγに関するICCによる、一次免疫処置から14日後のCD8+細胞反応性のMtb8.4細胞の比率を示している。MJ-073はMPLを含まないMtb8.4が封入されたミクロスフェアを示している；MJ-082は、タンパク質抽出後かつプロセス媒体への添加前にMPLを有機相に添加した、Mtb8.4およびアジュバント（MPL）の両方を含むミクロスフェアを示している；MJ-083は、MPLが内水相を介して組み入れられた、Mtb8.4およびアジュバント（MPL）の両方を含むミクロスフェアを示している；MJ-084は、MPLをポリビニルアルコール（PVA）の代わりにプロセス媒体に添加した、Mtb8.4およびアジュバント（MPL）の両方を含むミクロスフェアを示している。
（図９）IFNγに関するICCによる、一次免疫処置から14日後のCD4+細胞反応性のMtb8.4細胞の比率を示している。
（図１０）Mtb8.4-ミクロスフェアによる二次免疫処置から14日後のC57BL/6マウスの血清中のIgG1抗体レベルを示している。
（図１１）Mtb8.4ミクロスフェアによる二次免疫処置から14日後のC57BL/6マウスの血清中のIgG2b抗体レベルを示している。
（図１２）放射線照射Mtb8.4-EL4細胞による5日間の活性化後のCD8+T細胞による、Mtb8.4-EL4標的のCTL応答によるMtb8.4用量依存性特異的溶解率を示している。
（図１３）IFNγに関するICCによる、一次免疫処置から14日後のCD4+細胞反応性のMtb8.4細胞のMtb8.4用量依存性の比率を示している。
（図１４）IFNγに関するICCによる、一次免疫処置から14日後のCD8+細胞反応性のMtb8.4細胞のMtb8.4用量依存性の比率を示している。
（図１５）図15A〜図15Dは、単回免疫処置から2週間後に採取したT細胞を用いた、CD8（図15Aおよび図15C）およびCD4（図15Bおよび図15D）ICCSによって測定したT細胞応答を示した棒グラフである。
（図１６）図16Aおよび図16Bは、一次免疫処置から2週間後に採取した脾細胞からのIFN-γ放出を示した棒グラフである。脾臓は、このアッセイのためにプールされた。
（図１７）図17A〜図17Dは、2回目の免疫処置から2週間後に採取した血清におけるMtb8.4に対して特異的なIgG1およびIgG2b血清抗体応答を示した棒グラフである。
（図１８）単回免疫処置から2週間後に測定したCTL応答を示した棒グラフである。
（図１９）一次免疫処置または一次および二次免疫処置のいずれかを受けたマウスで測定した脾細胞培養物からのIFN-γ放出を示した棒グラフである。
（図２０）マウスに2回目の免疫処置を行って2週間後に測定した、Mtb8.4に対して特異的なIgG2b血清抗体を示したグラフである。
（図２１）マウスに2回目の免疫処置を行って2週間後に測定した、Mtb8.4に対して特異的なIgG1血清抗体を示したグラフである。
（図２２）未処置マウス（n＝8）における腫瘍増殖の経時的推移を示したグラフである。
（図２３および図２４）陽性対照群のマウス（n＝8）における腫瘍増殖の経時的推移を示したグラフである。モンタニドアジュバント中に製剤化した25μgのICDタンパク質により2回、またはICD-DNAにより2回、マウスを免疫処置した。
（図２５〜図２８）ICDタンパク質のミクロスフェアを投与されたマウス群（n＝8）における腫瘍増殖の経時的推移を示したグラフである。マウスを、25μgのICDタンパク質が封入されたミクロスフェア、ロット番号AM049、AM050、AM051またはAM052でそれぞれ2回免疫処置した。

Claims (54)

1. 生分解性高分子ミクロスフェア中に封入されたアジュバントおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
2. アジュバントとともにミクロスフェア中に共封入されたタンパク質をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
3. アジュバントが、MPL、AS-2、サポニン、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、アミノアルキルグルコサミニドリン酸、RC-529、RC-557、R544、イソツセラソール（isotucerasol）、細胞壁骨格、および/またはCpG含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の薬学的組成物。
4. タンパク質が、癌、自己免疫疾患または感染症と関連のある抗原を含む、請求項2記載の薬学的組成物。
5. 感染症が結核である、請求項4記載の薬学的組成物。
6. 抗原がMtb8.4またはMtb72fを含む、請求項5記載の薬学的組成物。
7. 抗原がTbH9（Mtb 39A）、38-1、Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9.9A、Mtb9.8、Mtb16、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46fまたはMtb31fを含む、請求項5記載の薬学的組成物。
8. 癌が乳癌である、請求項4記載の薬学的組成物。
9. 抗原がher-2/neuのICD、ECDまたはECD-PDを含む、請求項8記載の薬学的組成物。
10. ミクロスフェア中に封入されていないアジュバントをさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
11. タンパク質をミクロスフェア中に封入するための方法であって、以下の段階を含む方法：
    （a）タンパク質を含む有機相を生じさせるために、疎水的イオン対形成（HIP）剤および有機溶媒の存在下でタンパク質を可溶化する段階；
    （b）ポリマーを有機溶媒中または有機相中に溶解する段階；ならびに
    （c）有機相、タンパク質およびポリマーを含むポリマー溶液からミクロスフェアを調製する段階。
12. タンパク質を水溶液から有機相中に抽出する段階を含む、請求項11記載の方法。
13. タンパク質の分子量が少なくとも約3kDaである、請求項11記載の方法。
14. タンパク質の分子量が少なくとも約8kDaである、請求項11記載の方法。
15. タンパク質の分子量が少なくとも約20kDaである、請求項11記載の方法。
16. タンパク質の分子量が少なくとも約50kDaである、請求項11記載の方法。
17. タンパク質が少なくとも約20アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する、請求項11記載の方法。
18. タンパク質が少なくとも約60アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する、請求項11記載の方法。
19. タンパク質が少なくとも約80アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する、請求項11記載の方法。
20. タンパク質が少なくとも約100アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する、請求項11記載の方法。
21. 可溶化段階が有機溶媒を乾燥HIP剤-タンパク質複合体と混合する段階を含む、請求項11記載の方法。
22. HIP剤-タンパク質複合体を凍結乾燥または蒸発によって乾燥させる、請求項21記載の方法。
23. HIP剤が陰イオン性HIP剤である、請求項11記載の方法。
24. 陰イオン性HIP剤がドキュセートナトリウムである、請求項23記載の方法。
25. HIP剤が、タンパク質の正味の正電荷の数と等しいかそれよりも大きい化学量論量として存在する、請求項23記載の方法。
26. HIP剤が陽イオン性HIP剤である、請求項11記載の方法。
27. 陽イオン性HIP剤が、ジメチルジオクタデシル-臭化アンモニウム（DDAB18）、1,2-ジオレオイルオキシ-3(トリメチルアンモニウム)プロパン（DOTAP）、または臭化セトリモニウム（CTAB）である、請求項26記載の方法。
28. HIP剤が、タンパク質の正味の負電荷の数と等しいかそれよりも大きい化学量論量として存在する、請求項26記載の方法。
29. 有機媒体におけるHIP剤とタンパク質との比が最大で約70：1である、請求項11記載の方法。
30. タンパク質のpIが少なくとも約7.0である、請求項11記載の方法。
31. タンパク質のpIが少なくとも約7.5である、請求項11記載の方法。
32. タンパク質のpIが少なくとも約8.0である、請求項11記載の方法。
33. タンパク質のpIが最大で約6.0である、請求項11記載の方法。
34. タンパク質のpIが最大で約6.5である、請求項11記載の方法。
35. タンパク質のpIが最大で約7.0である、請求項11記載の方法。
36. 有機溶媒が塩化メチレン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルまたはジメチルスルホキシドを含む、請求項11記載の方法。
37. 水溶液の総塩濃度が約30mM未満である、請求項11記載の方法。
38. ミクロスフェアが水中油型シングルエマルションによって調製される、請求項11記載の方法。
39. ミクロスフェアが水中油型ダブルエマルションによって調製される、請求項11記載の方法。
40. ミクロスフェアがポリマー溶液の噴霧乾燥またはコアセルベーションによって調製される、請求項11記載の方法。
41. ミクロスフェアの少なくとも約90％が直径約1μm〜約10μmである、請求項11記載の方法。
42. ポリマーが乳酸グリコール酸共重合体（PLG）を含む、請求項11記載の方法。
43. ポリマーが、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸および/またはそれらの共重合体を含む、請求項11記載の方法。
44. ポリマー溶液がアジュバントをさらに含む、請求項11記載の方法。
45. ポリマー溶液がコレステロールおよび/または脂肪酸エステルをさらに含む、請求項11記載の方法。
46. 脂肪酸エステルがミリスチン酸エチル、カプリン酸エチルおよび/またはステアリン酸エチルを含む、請求項45記載の方法。
47. 有機相にアジュバントを添加する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
48. アジュバントを内水相（inner aqueous phase）を介して添加する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
49. 請求項11記載の方法によって作製されたミクロスフェア中に封入されたタンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
50. 請求項2記載の組成物を対象に投与する段階を含む、抗原を対象に送達するための方法。
51. 請求項2記載の組成物を対象に投与する段階を含む、対象において抗原に対する免疫応答を誘発するための方法。
52. 免疫応答が細胞性免疫応答および体液性免疫応答を含む、請求項51記載の方法。
53. 請求項4記載の組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における癌を治療または予防するための方法。
54. 請求項4記載の組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における結核を治療または予防するための方法。

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