DE2644493A1 - Impfstoff gegen virushepatitis a und b sowie verfahren zum nachweis von hepatitisvirus-b-core-antigen oder hepatitisvirus-a-antigen bzw. hepatitisvirus-b- core-antikoerpern oder hepatitisvirus-a- antikoerpern - Google Patents

Impfstoff gegen virushepatitis a und b sowie verfahren zum nachweis von hepatitisvirus-b-core-antigen oder hepatitisvirus-a-antigen bzw. hepatitisvirus-b- core-antikoerpern oder hepatitisvirus-a- antikoerpern

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DE2644493A1 DE19762644493 DE2644493A DE2644493A1 DE 2644493 A1 DE2644493 A1 DE 2644493A1 DE 19762644493 DE19762644493 DE 19762644493 DE 2644493 A DE2644493 A DE 2644493A DE 2644493 A1 DE2644493 A1 DE 2644493A1
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Description

ORTHO DIAGNOSTICS, INC.
Raritan, New Jersey, V.St.A.
" Impfstoff gegen Virushepatitis A und B sowie Verfahren zum Nachweis von Hepatitisvirus-3-Core-Antigen oder Hepatitisvirus-A-Antigen bzw. Hepatitisvirus-B-Core-Antikörpern oder Hepatitisvirus-A-Antikörpern "
Priorität: 1. 10. 1975, V.St.A., Nr. 618 644
Die Virushepatitis tritt in zwei Formen auf, nämlich als infektiöse Hepatitis und als Serumhepatitis. Die "beiden Krankheiten unterscheiden sich weniger klinisch oder histopathologisch, als durch die Art der Übertragung, die Inkubationszeit und durch gewisse immunologische Kriterien. Die infektiöse Hepatitis wird dem Hepatitisvirus A und die Serumhepatitis dem Hepatitisvirus B zugeordnet. Das mit der Virushepatitis B vergesellschaftete Virus wurde immunologisch als Australia-Antigen (HAA) bezeichnet. Das die Virushepatitis A verursachende Virus wird einfach als Hepatitis-A-Antigen bezeichnet. Das Hepatitis-Α-Antigen wird häufig als HAAg und das Hepatitis-B-Antigen als HBAg abgekürzt.
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Die durch die beiden Viren verursachte Erkrankung ist klinisch praktisch identisch. Die Inkubationszeit ist verschieden, doch nimmt die Krankheit im allgemeinen den gleichen klinischen Verlauf. Anfänglich treten grippeähnliche Symptome, Übelkeit, Muskelkrämpfe, Fieber und Schüttelfrost auf. Diese Symptome variieren mit der Schwere der Erkrankung. Gewöhnlich folgt eine ikterische Phase. Die ikterische Phase setzt je nach der Art des Virus im allgemeinen zwischen dem 29. und 100»Tag ein.
Das Antigen der Virushepatitis B (HBAg) in infizierten Patienten kann gewöhnlich im Serum und häufig im Samen, Speichel und Urin gefunden werdenff Andererseits findet sich bei Patienten, die an Virushepatitis A erkrankt sind, das Hepatitis-A-Antigen (HAAg) im Kot.
HBAg und HAAg sind unter dem Elektronenmikroskop unterscheidbar, insbesondere mittels Immun-Elektronenmikroskopie (IEIi). Hier zeigt sich das Hepatitis-A-Antigen in Form von Teilchen, die ungefähr die Gestalt von Ikosaedern einer Größe von etwa 25 bis 30 nm besitzen. Das Hepatitisvirus B besteht nach den derzeitigen Kenntnissen aus einem Gemisch von Partikeln, die Dane-Partikel genannt werden, sowie Fragmenten der Oberfläche der Dane-Partikel.
Die Dane-Partikel haben die Gestalt von Kugeln, die aus einem ikosaedrischen Kern (Core) bestehen, der von einer Proteinschale umgeben ist. Die Dane-Partikel haben im allge-
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meinen eine Größe von 40 bis 45 nm, während ihr Kern' eine Größe von etwa 27 bis 30 nm besitzt. Die Fragmente der Dane-Partikel bestehen gewöhnlich aus zerrissenen Teilen der Proteinschale. Sie haben im allgemeinen die Gestalt von Kugeln oder Röhrchen einer Größe von 20 bis 25 nm. Vermutlich ist das Hepatitisvirus B mit dem Dane-Partikel identisch.
Das Hüllmaterial des Dane-Partikels wird als HB8Ag, das Kernmaterial als HB_Ag bezeichnet. Das Oberflächenprotein HB Ag des Dane-Pärtikels und die Fragmente des Hepatitis-B-Antigens sind antigenetisch ähnlich, da das HBS-Antigen mit den aus den Fragmenten von Hepatitis-B-Antigen erzeugten Antikörpern eine Kreuzreaktion eingeht. Andererseits ist das Dane-Core-Partikel (HB.Ag) antigenetisch verschieden vom Dane-Oberflächenprotein (HB0Ag). HB.Ag ergibt keine Kreuzreaktion mit den durch HBgAg erzeugten Antikörpern. In gleicher Weise ergibt HB0Ag keine Kreuzreaktion mit HBgAb. Die Antikörper werden kurz beispielsweise als HBgAb bezeichnet. Die in der Literatur verwendeten. Ausdrücke HBAg und HBAb bedeuten gewöhnlich HB Ag oder HB Ab, sie beziehen sich also
S ο
auf das Oberflächen-Antigen des Dane-Partikels und/oder die Fragmente des Hepatitis-B-Antigens. Dies ist insbesondere bei der vor 1974 veröffentlichten Literatur der Fall, die keinen Unterschied zwischen Core-Antigen und Oberflächen- Antigen machte. Zur Zeit empfiehlt die U.S. National Academy of Sciences - Committee of Viral Hepatitis of the National Research Council, folgende Nomenklatur für die
. Antigene des Hepatitisvirus B: _
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Das cytoplasmatische Hepatitis-B-Antigen (CHBAg) entspricht dem Hepatitis-B-Oberflachen-Antigen (HB Ag); das Nuclear-Hepatitis-B-Antigen (NHBAg) entspricht dem Hepatitis-B-Core-Antigen (HB0Ag). Antikörper gegen CHBAg (CHBAb) entsprechen den Antikörpern gegen HB0Ag (Anti-HB_), während Antikörper gegen IiHBAg (NHBAb) den Antikörpern gegen HB.Ag ( nti-HB ) entsprechen.
Wie vorstehend bereits erwähnt, kommen als Erreger der Virushepatitis zwei Viren in Betracht, nämlich HB Ag von Hepatitisvirus B und HAAg von Hepatitisvirus A. Es gibt keinen Unterschied zwischen Kern oder Oberfläche beim Hepatitis-A-Antigen; die Gestalt dieses Partikels ist von der des Hepatitisvirus B völlig verschieden. Immunologisch ergeben Antikörper, die durch das Hepatitis-B-Antigen erzeugt werden, keine Krenz.reaktion mit dem Hepatitis-A-Antigen. In ähnlicher Weise ergeben Antikörper, die durch das Hepatitis-A-Antigen erzeugt vrerden, keine Kreuzreaktion mit dem Hepatitis-B-Antigen.
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Die Bedeutung dieser Tatsache liegt auf der Hand. Zur wirksamen Immunisierung gegen eine Virusinfektion muß in einem Wirtsorganismus eine antigene und immunogene Substanz erzeugt werden, die die Bildung von Antikörpern induziert, die mit dem Virus, d.h. der infektiösen antigenen Substanz, eine Kreuzreaktion eingeht. Zur Induktion der Bildung von Antikörpern gegen das Hepatitisvirus A muß daher im Wirtsorganismus die Bildung von Hepatitis-A-Antikörpern indu-
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ziert werden. Dies kann dadurch erreicht werden, daß man einem WirtsOrganismus eine antigene Substanz verabfolgt, die die Bildung dieser Antikörper induziert. In gleicher Weise geht man zur Unterdrückung einer Infektion durch das Hepatitisvirus B vor. Bis jetzt war es nicht möglich, Hepatitis-A-Antigen oder Hepatitis-B-Anti gen außerhalb eines Wirtsorganismus und für die Zwecke einer Immunisierung herzustellen. Dies machte die Herstellung von Impfstoffen unmöglich.
Das A-2-Plaque-Virus wurde von Dr. A.D. Felsenfeld 1963 in der virologischen Abteilung des U.S.Armed Forces Institute of Pathology (AFIP), Washington D.C. isoliert. Das Virus wurde aus dem Serum von Patienten in der ikterischen Phase isoliert, bei denen auf die nachstehend beschriebene Weise eine Virushepatitis-B-Infektion diagnostiziert wurde. Beim Studium des A-2-Plaque-Virus wurde festgestellt, daß das Virus die Produktion von Antikörpern induziert, die mit
HB_Ag reagieren; vgl. E.D Shaw u. Mitarb., Journal of s
Virology, Bd. 12, Nr. 6 (1973), Seiten 1598 bis 1607. Auf den Inhalt dieser Veröffentlichung wird hier vollinhaltlich Bezug genommen. Diese Veröffentlichung betrifft den Nachweis
des Oberflächen-Antigens des Hepatitisvirus B und erläutert die Herstellung des A-2-Plaque-Virus, dessen Vermehrung in Zellkultur und die Erzeugung von Antiseren gegen das Virus in Kaninchen. Ferner ist ein Verfahren zur Vermehrung des Virus in serumfreien Medien beschrieben.
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Eine Probe des von E.D. Shaw und Mitarb, isolierten und vermehrten A-2-Plaque-Virus ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St A., unter der Hinterlegungsnummer ATCC VR 812 hinterlegt. Proben stehen Interessenten unter Beachtung der einschlägigen Rechtsvorschriften zur Verfügung. Das Virus wurde noch nicht klassifiziert. Taxonomisch hat es Eigenschaften, die vergleichbar sind mit den Picornaviren-Enteroviren. Beispielsweise hat das Virus einen kleinen Durchmesser in der Größenordnung von 27 bis 29 nm, einen RNS-Kern, es ist''wärmebeständig, d.h. es überlebt 30minütiges Erhitzen auf 560C, es ist beständig gegen zweiwertige Kationen, beispielsweise Calcium- und Magnesiumionen, beständig gegen Gallensalze, Äther, Actinomycin D und DNase, jedoch empfindlich gegen RNase.
In der vorstehend zitierten Veröffentlichung von E.D. Shaw ist auf S. 1598 das Verfahren beschrieben, wie das A-2-Plaque-Virus zuerst in humanem Serum der ikterischen Phase nachgewiesen wurde. Es ist ausgeführt, daß die Seren einen cytopatischen Effekt (CPE) in humanen fetalen Nierenzellen (HEK) während ihrer ersten Passage zeigten. Das Virus wurde drei weiteren Passagen in humanen' fetalen Nierenzellen, anschließend einer Plaque-Reinigung unter Überlagerung mit Agarmedium in zwei Passagen in Schweinenierenzellen und södann einer Reinigung durch verschiedene Passagen in primären Nierenzellkultüren von afrikanischen grünen Affen (AGMK) unterworfen. Fortgesetzte Passagen in AGMK ändern die Eigenschaften des Virus nicht, sondern dienen .lediglich zu seiner
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Massenvermehrung. Nach Selektion und Reinigung der plaquesbildenden Einheiten (PFU) unter Überlagerung mit Agarmedium wird das A-2-Plaque-Virus erhalten.
Unter dem Ausdruck "plaquesbildende Einheiten (PFU)" versteht man diejenige Menge an Virus, die aus der Zellkultur-Plaquebildung, nachstehend beschrieben in Beispiel 1, errech-
aus
net wurde, beispielsweiseYPlaques mit einem Durchmesser von
etwa 2 mm unter Überlagerung mit Agarmedium. Eine Menge von Gewebekulturflüssigkeit entsprechend 2 χ 10 PFU/ml ist
-5 7 / einer tissue culture infectious dose TCID1-Q von 10 ^' /0,1 ml im Röhrchentitrationstest äquivalent. In der beschriebenen Veröffentlichung wurde ein A-2-Plaque-Virus verwendet, das mindestens 45 mal durch AGMK passiert worden ist. Die Vermehrung von A-2-Plaque-Virus ist nachstehend im Beispiel 1 erläutert. ·■· -
Der Erfindung liegt unter anderem die Aufgabe zugrunde, einen Impfstoff gegen die Virushepatitis A und B zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß das A-2-Plaque-Virus die Fähigkeit hat, die Bildung von Antikörpern zu induzieren, die sowohl mit dem Hepatitis-B-Core-Antigen als auch mit dem Hepatitis-A-Antigen eine Kreuzreaktion eingehen und damit zugleich einen Schutz gegen die Serumhepatitis wie auch die infektiöse Hepatitis vermitteln. In gleicher Weise kann das A-2-Plaque-Virus-Antigen eine Kreuzreaktion mit Antikörpern eingehen, die sowohl durch das Hepatitis-A-Antigen als auch das Hepatitis-B-Antigen und
L _l
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zwar sowohl aus dem Kernmaterial als auch aus dem Hüllmaterial des HBAg induziert werden. Diese Entdeckung gestattet nun die Herstellung eines Hepatitisimpfstoffes für Menschen, der gegen die Virushepatitis A und B immunisiert. Es liegt auf der Hand, daß dies einen erheblichen Fortschritt bedeutet, da gewöhnlich das antigene Material spezifisch nur gegen Antikörper ist, die aus diesem Antigen gebildet werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis von Hepatitis-Antigenen oder -Antikörpern des Typs A oder B, insbesondere in Körperflüssigkeiten oder festen Stoffen. Dies ist von Bedeutung für die Medizin.
Das erfindungsgemäß zur Impfstoff-Hersteilung verwendete A-2-Plaque-Virus wird in Zellkultur in an sich bekannter Weise gezüchtet und vermehrt. .Das nach diesen Verfahren erhaltene Virusmaterial, beispielsweise das auf die nachstehend in den Beispielen 1 und 2 und in der vorgenannten Veröffentlichung von E.D. Shaw beschriebene Virusmaterial, kann unmittelbar einem Empfänger in einer zur Immunisierung wirksamen Menge, gegebenenfalls zusammen mit einem Träger, verabfolgt werden. Vorzugsweise wird das Virusmaterial parenteral in einer Flüssigkeit und insbesondere durch intramuskuläre Injektion als Einzeldosis gegeben. Eine wirksame Menge des Vi-
rusmaterials enthält etwa 1 bis 3 x 10 PFU des A-2-Plaque-Virus in einem Flüssigkeitsvolumen von beispielsweise 1 bis 3 ml.
ORiSiNAL INSPECTED L -J
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^ Als Trägermedium kann beispielsweise zellfreie Kulturflüssig- keit,Freundsches Adjuvans, isotonische Kochsalzlösung oder ein serumfreies Medium verwendet werden, wie es von A. Leibovitz, Amer. J. Hyg., Bd. 78, Seiten 173 bis 180 be- , schrieben ist. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, nach einigen Wochen nochmals das Antigen als Booster zu geben, um den durch das A-2-Plaque-Virus erzeugten Antikörperspiegel durch eine immunologische Zweitreaktion noch veiter zu erhöhen. Dies kann mit einer ähnlichen Dosis des Virusmaterials erreicht werden.
Gegebenenfalls kann das Lebendvirus in an sich bekannter Weise attenuiert und als abgeschwächter oder inaktivierter Impfstoff gegeben werden. Vorzugsweise wird zur systemischen Verabfolgung ein mit Formalin behandeltes Virusmaterial einge-.setzt. -
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis von Hepatitis-B-Core-Antigen in Proben, vorzugsweise in Körperflüssigkeiten oder flüssigen Extrakten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das zu untersuchende Material mit Antikörper gegen A-2-Plaque-Virus zusammenbringt, wobei das Virus vorzugsweise dem A-2-Plaque-Virus ATCC Nr. VR 812 entspricht. Sofern Hepatitis-B-Core-Antigen in der Probe vorliegt, geht es eine Kreuzreaktion mit den Antikörpern ein und erzeugt dadurch eine nachweisbare immunologische Reaktion. Wenn die Reaktion negativ ist, fehlt das Hepatitis-B-Core-Antigen. Die Grenze zwischen einer positiven und einer negativen Reaktion
L kann durch Auswahl einer Mindestagglutinationsreaktion fest- J
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gelegt werden, unterhalb der negative Werte und oberhalb der positive Werte zuerkannt werden. Ein derartiges Selektionsverfahren ist bekannt.
Ein Kriterium zur Bestimmung des Auftretens der Agglutinationsaggregation ist von Feinstone u. Mitarb, in Science, Bd. 182 (1973)? Seiten 1026 bis 1028 beschrieben. Danach werden Aggregate von 3 Ms 5 Partikeln nach der Reaktion mit Seren als positiv angesehen. Vorzugsweise wird eine Reaktion jedoch als positiv angesehen, bei der mindestens zwei feste Aggregate von \rorzugsweise einem dreidimensionalen traubenähnlichen Haufen mit mindestens 14 Partikeln in jedem Antigen- Antikörper-Komplex vorliegen. Diese Reaktion ist bei eindeutig positiven Reaktionen häufig durch die Gegenwart von mindestens 200 Viruspartikeln gekennzeichnet. Außerdem sollen die Viruspartikel innerhalb jedes Aggregats eine größere Anzahl von hohlen Kernen enthalten. Das Verfahren ist geeignet, wenn die Immun-Elektronenmikroskopie (IEM) als Methode zur Beobachtung der Reaktion verwendet wird. Für die Methode der Immun-Gegenstromelektrophorese (CEP) genügt eine einfache Beobachtung der Präcipitinbande zur Feststellung positiver Reaktionen.
In ähnlicher Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren auch 2^ zum Nachweis des Hepatitis-A-Antigens unter Verwendung der Antikörper gegen das Ä-2-Plaque-Virus dienen. Umgekehrt kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis-B-Core-Antigen und Hepatitis-A-Antigen j_ unter Verwendung des A-2-Plaque-Virus verwendet werden. _j
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Erfindungsgemäß können die üblichen immunologischen Methoden zum Nachweis der Antigene bzrw. Antikörper verwendet werden. Eine sehr empfindliche Methode ist die Immun-Elektronenmikroskopie (IEM). Für die üblichen Zwecke genügt der Radioimmunassay und die Immun-Gegenstromelektrophorese (CEP). Ferner können Agglutinationstests mit beispielsweise Latexpartikeln oder Erythrocyten verwendet werden. In diesen Fällen ist es erforderlich, zur nachfolgenden Reaktion mit dem komplementären Partner das A-2-Plaque-Virus-Antigen oder dessen Antikörper an die Partikel zu koppeln. Diese Verfahren sind bekannt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Züchtung von A-2-Plaque-Virus in AGMK
Mit Trypsin behandelte Suspensionen von primären AGMK-Zellen werden stationär bei 35°C unter partieller CC^-Atmosphäre zu dichten Einschichtkulturen mit Typ 5 und 40 Simian-Virus-Antikörpern in Wachstumsmedium aus 10 % fetalem Kälberserum in Eagles-Minimum Essential Medium (MEM) (Earle's Salze) gezüchtet, das Penicillin und Streptomycin enthält. Innerhalb 5 bis 7 Tage eignen sich die Einschichtzellkulturen zur Beimpfung und Züchtung von A-2-Plaque-Virus.
Das Zellkultur-Wachstumsmedium wird von den AGMK-Einschichtzellkultüren dekantiert. Sodann werden die AGMK-Einschichtzellkultüren zweimal mit einem Erhaltungsmedium, entweder
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r -te-· -ι
einem serumfreien L-15 Medium (vgl. A. Leibovitz, Amer.
J. Hyg.,Bd. 78, S. 173 Ms 180) oder Eagle's MEM mit Earle's Salzen ohne Serum jedoch mit 50yug Gentamycin/ml, gewaschen.
1 ml einer Saatsuspension von A-2-Plaque-Virus (ATCC Nr.
VR 812) mit etwa 2 χ 10 PFU/ml genügt zur Infektion einer
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Fläche von 110 cm der AGMK-Einschichtzellkultüren, die mit 50 bis 60 inl Erhaltungsmedium in einem dicht verschlossenen
Zellkulturkolben überschichtet sind. Nach 24 bis 36-stündiger Bebrütung bei 36°C ist der charakteristische lytische cytopathische Effekt (CPE) der Zerstörung der AGMK-Einschichtzellkul türen vollständig.
Die Kolben der infizierten Zellkulturen sowie eine nichtinfizierte Kontrollkultur werden in situ bei -700C eingefroren. Nach 2- bis 3-maligem Auftauen und Einfrieren der infizierten Zellkulturen wird der Inhalt der beimpften Kolben vereinigt. Durch 20- bis 30-minütiges Zentrifugieren bei 800 bis 1000 g werden die Zellfragmente in der Kälte sedimentiert. Die überstehende geklärte Flüssigkeit mit den A-2-Plaque-Viren wird in Gefäße abgefüllt und bei -700C aufbewahrt. Dieses Material kann als Einsaatmaterial für andere Subkulturen verwendet werden. Das Material ist bei der ATCC unter der HinterIegungsnummer VR 812 hinterlegt und es enthält etwa 2 χ 10 plaquesbildende Einheiten/ml, entsprechend einem TCID^q Wert von 1O~^»Vo,1 ml im Röhrchentitrationstest.
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Beispiel 2 Konzentrierung des A-2-Plaque-Virus
Die gemäß Beispiel 1 erhaltene geklärte Flüssigkeit mit A-2-Plaque-Virus wird 18 Stunden in der Kälte bei 100 000 g zentrifugiert* Es wird ein Viruspellet (Sediment) erhalten, das in der überstehenden Flüssigkeit in einer Konzentration von 1 bis 3 x 10 PFU/ral resuspendiert wird. Dieses Material eignet sich als lebendes virales Immunogen zur Immunisierung beispielsweise von Menschen. Es kann nach üblichen Methoden, beispielsweise durch Behandlung mit wäßriger Formaldehydlösung inaktiviert werden. Das lebende Antigen kann auch zum Nachweis von Antikörpern verwendet werden.
Beispiel 3 Herstellung von Antikörpern gegen A-2-Plaque-Virus ■1 ml der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Suspension von A-2-
8
Plaque-Virus mit 2 χ 10 PFtJ wird am Tag 0 subcutan einem New Zealand Kaninchen injiziert, um die Antikörperproduktion zu stimulieren. Für jeden Versuch werden 10 Kaninchen verwendet.
Am 3· und 5· Tag wird den Kaninchen eine 2. und 3. Injektion von jeweils 1 ml intravenös gegeben. Am 12. bis 14. Tag wird Blut entnommen, um festzustellen, ob die Antikörpertiter ausreichend hoch sind. Die Kaninchen mit ausreichend hohem Antikörpertiter werden sodann am 21. Tag entblutet. Das Serum wird- gesammelt und vereinigt und die Globulinfraktion mit Natriumsulfat in an sich bekannter Weise fraktioniert. Die erhaltene Globulinfraktion wird sodann in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gelöst und in der Kälte gegen den Puffer
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etwa 48 Stunden dialysiert. Sodann wird das Retentat gesammelt und mittels Immun-Gegenstron:elektrophorese getestet. Es hat einen Titer von 1 : 64 gegen A-2-Plaque-Virus. Nach der Methode der Immun-Elektronenmikroskopie hat es einen Titer von mindestens 1 : 4375 gegen das gemäß Beispiel 2 hergestellte A-2-Plaque-Virus.
Beispiel 4 Nachweis von CD HB^Ag und (2) HB^Ab
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(1) Hepatitis-B-Core-Antigen wird nach der Methode von L.F. Barker u. Mitarb., J. of Virology, Bd. 14, Nr. 6 (1974), Seiten 1552 bis 1558 aus der Leber eines Schimpansen hergestellt, dessen Serum HB Ag-positiv ist. Das Core-Antigen liegt in der im Radioimmunoassay HB Ag-negativen Cäsiumchloridfraktion vor. Das Core-Antigen wurde als HB Ag durch eine unabhängig davon vorgenommene Immun-Elektronenmikroskopie identifiziert, nämlich unter Benutzung eines hyperimmunen Resusaffen-Hepatitis-B-Core-Antikörpers als Referenzreagens, das von der "Reference Reagent Branch of the National Institutes of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), einer Abteilung der National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, V.St.A., erhältlich ist. Eine weitere'unabhängige Bestätigung wurde . erhalten durch Benutzung eines Schimpansenserums, von dem bekannt war, daß es Komplement-bindende Antikörper gegen Hepatitis-B-Core-Antigen mit einem Titer von 1 : 64 enthält.
0,2 ml des nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren isolierten Core-Antigens werden mit 0,05 ml des gemäß Beispiel 3
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aus Kaninchen erhaltenen Anti-A-2-Plaque-Virus-Serums vermischt. Mittels der Imraun-Elektronenmikroskopie und Gegenstrom-Elektrophorese werden die Reaktionen auf die Bildung von Immunaggregaten ausgewertet. Diese Methoden bestätigen, daß sich Aggregate gebildet haben. Durch das A-2-Plaque-Virus haben sich Antikörper gebildet, die mit dem Hepatitis-B-Core-Antigen (HB_Ag) eine Kreuzreaktion eingehen.
(2-a) Der vorstehend in (1) beschriebene NIAID-Resus-Referenz-Core-Antikörper und der Schimpansen-Core-Antikörper werden in gesonderten Versuchen mit dem gemäß Beispiel 2 hergestellten A-2-Plaque-Virus vermischt und auf Kreuzreaktionen untersucht. Es v/erden Immunaggregate durch Immun-Elektronenmikroskopie beobachtet. Dies zeigt, daß das A-2-Plaque-Virus ein Antigen ist, das die Gegenwart von Hepatitis-B-Core-Antikörpern nachweisen kann
(2-b) Serumproben eines Patienten mit klinischen Symptomen einer Hepatitis, die als Schimpansen-assoziierte Hepatitis diagnostiziert wurde, werden zur Auswertung ausgewählt. Die Serumproben werden zu vier verschiedenen Zeitpunkten gesammelt:
Eine Probe zu Beginn der Symptome der Krankheit, die zweite Probe etwa 6 Wochen danach, die dritte Probe etwa 3 Monate danach und die vierte Probe 4 Monate danach. Die ersten zwei
Seren waren HB^Ab-negativ bei Verwendung des vorstehend bec
schriebenen Nachweis-Verfahrens. Die dritte Serümprobe war mittels des vorstehend beschriebenen Nachweisverfahrens posi-
L -J
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tiv. Eine spätere Serumprobe war negativ für Core-Antikörper. Gegenstrom-Elektrophoresetests mit im Handel erhältlichen HB Ab als Antikörper bestätigen, daß der Patient HB Ab-negativ ist. Das Leberhomogenat von Beispiel 4 (1), d.h. das durch unabhängigen Test nachgewiesene Hepatitis-B-Core-Antigen, wurde in einem direktem und einem indirekten Hemmungs-Gegenstrom-Elektrophoresetest verwendet, um die Gegenwart oder das Fehlen von Core-Antikörpern zu bestätigen. Der Test v/ar HB.Ab-positiv. Bei Verwendung des gemäß Beispiel 2 hergestellten A-2-Plaque-Virus-Antigens als antigenem Material im direkten und indirekten Hemmungs-Gegenstromelektrophoresetest wurde das Vorliegen von HB,_ Ab' beobachtet. Dies zeigt, daß das antigene Material aus dem A-2-Plaque-Virus die Gegenwart von HB-Core-Antikörpern nachweisen kann.
Der direkte Gegenstrom-Elektrophoresetest wird in üblicher Weise durchgeführt; vgl. .A.P. McKee u. Mitarb., Vox Sang., Bd. 24 (1973), Seiten 80 bis 83; hier ist eine Niederspannungs-Gegenstrom-Elektrophoresemethode zur Bestimmung von Australia-Antigen beschrieben. In der Veröffentlichung von E.D. Shaw u. Mitarb., Journal of Virology, Bd. 12, Nr. β (1973), Seiten 1598 bis 1607,- sind indirekte Tests beschrieben.
Beispiel 5 Nachweis von (1) Hepatitis-A-Antikörpern und (2) Hepatitis-A-
Antigen
(1) Für die Versuche werden experimentell mit Hepatitisvirus A
L j
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-ig
infizierte freiwillige Versuchspersonen ausgewählt. Von diesen Patienten werden vor und nach der Infektion Proben von Serum und Kot gesammelt. Die Diagnose der Virushepatitis A wird durch den Nachweis von Hepatitisvirus-A Partikeln im Kot bestätigt. Die Gegenwart von Typ Α-Antikörpern im Serum der rekonvaleszenten Phase wird unabhängig dadurch bestätigt, daß man das aus dem Kot erhaltene Typ Α-Antigen mit dem Rekonvaleszenten-Serum, mittels des Imnuin-Elektronenmikroskopie-Tests eine Kreuzreaktion eingehen läßt. 10
Zur Feststellung, daß das A-»2~Plaque-Virus-Antigen mit dem Typ Α-Antikörper eine Kreuzreaktion eingeht, werden Proben des Serums von drei der Freiwilligen gesammelt. Mittels der Methode der Gegenstrom-Elektrophorese gegen das gemäß Beispiel 2 hergestellte A-2-Plaque-Virus-Antigen zeigte sich, daß das Serum der rekonvaleszierenden und der ikterischen Phase HAAb-positiv war. Die Identität von HAAb mit Hepatitis-A-Antikörpern wurde vorher" bestätigt. Diese Tests an den vor der Infektion gesammelten Proben waren HAAb-negativ sowie HAAg-negativ in den Faeces. Nachstehend sind in Tabelle I die Ergebnisse zusammengefaßt
Tabelle I Serum Direkte CEP indirekte CEP
1. a) Nullserum - r
b) ikterische Phase + (1:4)
2. a) Nullserum - -
b) ikterische Phase + (1:4) + (1:4)
3· a) rekonvaleszierende Phase + (1:8) + (1:8)
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(2) Nachweis von Hepatitis-A-Antigen
Proben der Faeces der Freiwilligen wurden gesammelt. Zwei der Proben wurden positiv und sechs der Proben negativ befunden. Sie wurden untersucht und durch Gegenstrom-Elektrophorese mit dem gemäß Beispiel 3 hergestellten Kaninchenglobulin-Antikörper getestet.
Direkte Reaktionen wurden in den zwei positiven Faecesproben beobachtet, jedoch nicht, in den sechs negativen Faecesproben.
In diesem Beispiel wurde Fibrin aus dem Plasma der Patienten mit einem Volumenverhältnis von 1 Volumteil einer 1 molaren Calciumchloridlösung zu 40 Volumenteilen Plasma ausgefällt. Nach 15-minütigem Zentrifugieren in der Kälte bei 2000 g
wurden die Seren als Überstand abgenommen. 15
Faecessuspensionen werden in -normaler Kochsalzlösung von einem Anfangswert von 1 : 5 auf eine Endkonzentration von 1 : 25 verdünnt und 1o Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Nach weiterem Verdünnen mit normaler Kochsalzlösung wird jede Faeces-
suspension durch 3 stündiges Zentrifugieren in der Kälte bei 93 000 g zu einem Pellet sedimentiert. Das sediment!erte Pellet wird in einer möglichst geringen Menge normaler Kochsalzlösung resuspendiert. Auf diese Weise konnten die faekalen Antigene auf die erforderlichen Mengen verdünnt, werden zur
Reaktion bei 370C während 30 Minuten entweder mit den vor der Infektion ausgewählten Seren oder den Seren der rekonväleszierenden Phase. Die faekalen Antigen-Antikörper-Reaktionsgemische werden mit steril filtriertem destilliertem Wasser auf
L 1:2 verdünnt. j
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Beispiel 6 Nachweis von Hepatitis-A-Äntikörper Drei Weißlippen-Krallenäffchen werden mit Hepatitisvirus A infiziert. Zum Zeitpunkt der vorliegenden Untersuchung war das Krallenäffchen das einzige Testmodell außer dem Menschen, das mit Hepatitisvirus A infiziert werden konnte.
Bekannte, vor der Infektion gewonnene Seren und/bekannte Seren aus dem Rekonvaleszenzstadium wurden jeweils mittels Gegenstrom-Elektrophorese auf A-Typ-Antikörper mit dem gemäß Beispiel 2 hergestellten A-2-Plaque-Virus getestet. In Tabelle II sind die Ergebnisse zusammengefaßt.
Tabelle II Serum direkt indirekt IEM
Tier 1 a) Nullserum - -
b) rekonvaleszierende Phase + +
Tier 2 a) Nullserum . -
b) rekonvaleszierende Phase + - +
Tier 3 a) Nullserum - -
b) rekonvaleszierende Phase " 20
Tier 4 Normales Krallenäffchen zur - Kontrolle
Es ist ersichtlich, daß der direkte Gegenstrom-Elektrophoresetest alle negativen Seren und alle positiven Seren bis auf eines (3b) richtig indentifizierte, während der indirekte Gegenstrom-Elektrophoresetest die hemmenden A-2-Plaque-Antikörper nicht nachzuweisen vermochte. Die Immun-Elektronenmikroskopie ergab die gleiche Reaktion wie 3b). Bei späterer
L- Δ
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nochmaliger Überprüfung wurde sie als positiv bewertet unter Verwendung der bevorzugten Auswertungskriterien mittels der Reaktionsaggregate.
Beispiel 7
Zwei Schimpansen v/erden jeweils 1 ml einer 1:5 Verdünnung von nicht erhitztem HB -Antigen (Titer 1 : 180) injiziert. Die Nullseren waren negativ für HB -Antigen sowie HB -Antikörper und ebenso negativ für A-2-Plaque-Virus-Antikörper.
Eine am 21. Tag nach der Infektion isolierte Serumprobe vom ersten Schimpansen (Nr. 81) reagierte gegen A-2-Plaque-Virus. Dies zeigt, daß der Schimpanse einen HBgAb erzeugte, der mit A-2-Plaque-Antigen eine Kreuzreaktion einging. Rekonvaleszente Seren reagierten nach 5 1/2 Monaten positiv für HB -Antikörper sowie Antikörper für A-2-Plaque-Virus im direkten und indirekten Gegenstrom-Elektrophoresetest und Immun-Elektronenmikroskopietest für A-2-Plaque-Virus. Der Schimpanse Nr. 83 reagierte serologisch gleichartig, doch trat die Serokonversion später ein. In beiden Fällen waren die Tiere negativ für klinische Symptome von Hepatitis und reagierten niemals HBg-Antigen-positiv.
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Claims (8)

  1. Patentansprüche
    '1"i Impfstoff gegen Virushepatitis A und B, enthaltend gegebenenfalls attenuiertes oder inaktiviertes A-2-Plaque-Virus. 5
  2. 2. Impfstoff nach Anspruch 1, enthaltend A-2-Plaque-Virus ATCC Nr. VR 812.
  3. 3· Verfahren zum Nachweis von Hepatitisvirus-B-Core-Antigen oder Hepatitisvirus-A-Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit Antikörpern gegen A-2-Plaque-Virus zusammenbringt und, sofern das Antigen vorliegt, eine Kreuzreaktion mit den Antikörpern herbeiführt und diese
    in an sich bekannter Weise nachweist. 15
  4. 4. Verfahren nach Anspruch-3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antikörper die Antikörper gegen A-2-Plaque-Virus ATCC Nr. VR 812 verwendet.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis durch Immun-Gegenstromelektrophorese, Radioimmunoassay oder Immun-Elektronenmikroskopie führt.
  6. 6. Verfahren zum Nachweis von Hepatitisvirus-B-Core-Antikörpern oder Hepatitisvirus-A-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit A-2-Plaque-Virus-Antigen zusammenbringt und, sofern Antikörper vorliegen, mit dem Antigen eine Kreuzreaktion herbeiführt und diese L in an sich bekannter Weise nachweist. _l
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  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antigen A-2-Plaque-Virus ATCC Nr. VR 812 verv/endet.
  8. 8. Verf8.hren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis durch Immun-Gegenstromelektrophorese, Radioimmunassay oder Iminun-Elektronenmikroskopie führt.
    709816/ 1 1 SS
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