DE2810506A1 - Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen dane-kern-antigen und reagentien zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen dane-kern-antigen und reagentien zur durchfuehrung des verfahrens

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DE2810506A1 DE19782810506 DE2810506A DE2810506A1 DE 2810506 A1 DE2810506 A1 DE 2810506A1 DE 19782810506 DE19782810506 DE 19782810506 DE 2810506 A DE2810506 A DE 2810506A DE 2810506 A1 DE2810506 A1 DE 2810506A1
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Description

DR.-ING. WALTER ABIT2. DR. DIETER F. MORF DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER
Patentanwälte ..
Münzen. 10. Mär Z 1978
Postanschrift TPostal Address Postfach 88O1O9, 80O0 München 86
FienzenauerstraOe 28
Telefon 9ff 33 22
Telegramme: Chemindus München
Telex: (OJEf23992
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ABBOTT LABOEATOEIES Ho.rttL Chicago, Illinois 60064 ·
Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Dane-Kern-Antigen und Reagentien zur Durchführung des Verfahrens
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3387
Die Erfindung betrifft Iteagentien und Bestimmungsverfahren auf der Basis von gereinigten Dane-Kernen, mit denen Dane-Kern-Antikörper (anti-HB) in unbekannten Proben, beispielsweise Serum, nachgewiesen werden.
Hepatitis B-Oberflächenantigen (HB Ag) im Blutserum ist ein zuverlässiges Anzeichen für die Anwesenheit eines infektiösen Agens; vgl. Alter et al., Am. J. Med. Sei., Bd. 270 (1975), S.329 -■·- 334; oder Goldfield et al., Am. J. Med. Sei., Bd. 270 (1975), S. 335 "bis 342. HB0Ag gleicht morphologisch einem Virus, es gibt jedoch keinen zuverlässigen Hinweis dafür, dass mit diesem Teilchen direkt Infektivität oder Nucleinsäuren assoziiert sind; vgl. Gerin et al., J. Virol., Bd. 7 (1971), S. 569 bis 576.
KBAg ist immunogen, da anti-KB (Antikörper) normalerweise s s
in Patienten und Tieren während der Erholungs- und Genesunsphase gefunden werden. Die Anwesenheit von anti-HB geht mit einer schützenden Immunität einher, was darauf schliessen lässt., dass HB Ag eine strukturelle Komponente des infektiösen Virions ist. Somit hat die Assoziierung von HB Ag als Marker für Infektivität von Blut und Blutprodukten und anti-HB als Marker für Immunität als Anlass für zahlreiche diagnostische und epidemiologische Untersuchungen des Hepatitis-Typs B gedient. Hochempfindliche und spezifische immunologische Bestimmungsverfahren für Antigen und Antikörper haben sich bei diesen Untersuchungen als erforderlich und nützlich erwiesen. Ein derartiges Bestimmungsverfahren ist in der US-PS 3 867 517 angegeben.
Es wurde über verschiedene Übertragungswege und die Verwendung von hochempfindlichen immunologischen Testverfahren für HB Ag berichtet, um eine merkliche transfusionsbedingte Verringerung des Hepatitis-Typs B zu erzielen; vgl» Hollinger et alo, N. Eng. J. Med., Bd. 290 (1974), S.1104 bis 1109. Jedoch wurde bei
3587 6
sorgfältigen Nachuntersuchungen von Empfängern von in bezug auf HB Ag negativem Blut bei 7 von 465 Patienten eine Belastung (exposure) durch, das Antigen beobachtet; vgl. Goldfield et al., Am. J. Med. Sei., Bd. 270 (1975), S. 335 Ms 34-2. Dies deutet darauf hin, dass weitere Untersuchungen von anderen mit dem Hepatitis B-Virus in Verbindung stehenden immunologischen Systemen die Diagnose der Krankheit und den Nachweis des infektiösen Agens vervollständigen könnten. Das Dane-Teilchen (vgl. Dane et al., Lancet, Bd. 1 (1970), S. 695 "bis 698) mit seinem assoziierten Kern hat zur Identifizierung eines Kern-Antigens (HB Ag) und von dessen Antikörper (anti-Kern oder anti-HB ) als einem zweiten immunologischen System geführt. Der Befund, dass die Oberfläche des Dane-Teilchens HBAg enthält und das innere Kernteilchen DHA und DNA-Polymerase enthält, haben die Theorie bestärkt, dass dieses Teilchen möglicherweise den infektiösen Virus darstellt. Solange jedoch keine Gewebekulturen oder entsprechende Tiermodelle für das Laboratorium entwickelt sind, sind immunochemische, biochemische oder elektronenmikroskopische Verfahren notwendig, um die Anwesenheit und die mögliche Infektivität von Dane-Teilchen zu bestimmen.
In der Literatur wurde davon berichtet, dass die Anwesenheit von Antikörpern gegen den Kern von Dane-Teilchen (anti-HB )
im menschlichen Blut möglicherweise ein Anzeichen für eine Hepatitis B-Virusinfektion oder einen Überträgerzustand für diesen Virus darstellt. Zum Nachweis von anti-KB wurden in der Literatur verschiedene Verfahren vorgeschlagen, darunter die Komplementfixierung, Immun-Haft-Hämagglutination und der Radioimmuntest; Hoofnagle et al., Ή. Eng. J. Med., Bd. 290 (1974-), S. 1336 bis 134-0; Tsuda et al., J. Immunol., Bd.o115 (1976), S. 834- bis 838; Greenman et al., Vox Sang., Bd. 29 (1975), S. 77 bis 80; Moritsugu et al., J. Lmmunol., Bd. 114-
— 2 —
809837/097*
•338? -f
(1975), S.. 1792 bis 1798; Purcell et al., Intervirol., Bd. (1973/1974-), S. 231 "bis 243ϊ und Vyas et al., transfusion, Bd. 16 (1976), S. 536 Ms 53?.
Es scheint klar zu sein, dass die Analyse von anti-HB eine epidemiologische und diagnostische Bedeutung haben kann. Nachstehend sind einige mögliche Interpretationen für die Anwesenheit von anti-EB und die Abwesenheit von HB Ag oder
C S
anti-HlL angegeben:
"ϊ'.'ϊί 1. !frühe Genesung von der Erkrankung mit nicht nachweisbaren Konzentrationen an replizierendem Virus;, vor dem Auftreten von nachweisbarem anti-KB .
2. Übertragerzustand von HB-Virus, bei dem die HB_Ag-Konzentration unter der nachweisbaren Konzentration liegt, während anti-EB kontinuierlich stimuliert wird,
3. Restimulation des Immunsystems bei vorher immunen Personen, wobei anti-HB_ auf ni< Konzentrationen abgenommen hat.
Personen, wobei anti-HB_ auf nicht nachweisbare
4·. In einigen Fällen Weiterbestehen von anti-HB für Zeiträume, wo das anti-HB auf nicht nachweisbare Konzentrationen abgenommen hat.
Erfindungsgemäss werden verbesserte Reagentien und Verfahren zum Nachweis von anti-HB {Antikörper) zur Verfugung gestellt. Der erfindungsgemässe Nachweis von anti-HBc (Antikörper) erlaubt eine deutliche Steigerung der Nachweisbarkeit von potentiell infizierend wirkendem Blut im Vergleich zum Nachweis von Oberflächenantigen (HB Ag) gemäss dem Verfahren der US-PS 3 867 517.
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Beispielsweise wurden Proben untersucht, bei denen sich mit dem Verfahren der US-PS 3 867 517 kein Oberflächenantigen (HBgAg) nachweisen liess. Dabei konnte mittels des erfindungsgemässen Verfahrens die Gegenwart von anti-HB festgestellt werden.
Erfindungsgemäss werden zwei Gruppen von Reagentien zur Verfugung gestellt, die sich in verschiedenen Immuntests, wie Radioimmuntests, zum Nachweis von anti-HB eignen. Die
C-
Gruppe A besteht aus einem Hyperiiamunserum, das in Meerschweinchen, Kaninchen oder anderen derartigen Tieren durch Immunisieren der Tiere mit hochgereinigten Dane-Teilchen-
125 Kernen erzeugt worden ist, einer ^J-markierten anti-Meer-
s chweinchen-lTnmungl obulinantikörp erlö* sung oder einer J-markierten Meerschweinchen-anti-HB -Lösung und einer festen, mit HB Ag überzogenen Phase. Die Gruppe B besteht aus einer festen, mit Dane-Teilchen-Kernen überzogenen Phase, einem
J-markierten. menschlichen anti-HB —Immunglobulin, einer
•^J-markierten Antikörperlösung gegen menschliche Immunglo--
125
buline oder einer ^J-markierten Dane-Teilchen-Kern-Lösung.
125
Das zum Markieren verwendete J kann durch andere markierende Substanzen, beispielsweise durch andere radioaktive Isotope, fluoreszierende Verbindungen oder Enzyme, ersetzt werden.
Reinigung von Dane-Teilchen
In bezug auf HB Ag positive Plasmen mit einem Gehalt an Dane-Teilchen werden vereinigt und als Quelle für Dane-Teilchen verwendet. Das Reinigungsverfahren der Dane-Teilchen besteht aus der isopyknischen Bandenbildung in Saccharosegradienten und einer einzigen isopyknischen Bandenbildung in Cäsiumchlorid. DHA.-Polymerase, ein mit HBcAg assoziiertes Enzym,
• _ 4 _ 809837/0974
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wird während des ganzen Reinigungsverfahrens als Indikator der Dane-Teilchen verwendet. Zwei Populationen von Dane-Teilchen mit unterschiedlichen Dichten sind im allgemeinen in HBAg-positiven Plasmen: Die erste "bildet in Saccharose eine Bande bei etwa 1,28 g/cm und die andere eine Bande bei etwa 1,25 g/cm . Die letztgenannte Bande stellt die Hauptbande dar, jedoch variieren die relativen Mengen der beiden Populationen, ausgedrückt als DHA-Polymeraseaktivitäten, von Ansatz zu Ansatz.. Die leichten und schweren Peaks werden ausgewählt und in Cäsiumchlorid einer erneuten Bandenbildung unterworfen. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen lassen sich keine morphologischen Unterschiede zwischen den beiden Populationen von Dane-Teilchen mit den unterschiedlichen Dichten feststellen.
Reinigung der Dane-Teilchen-Kerne
Hochgereinigte Dane-Teilchen von der schweren oder der leichten Fraktion werden zur Entfernung von Oberflächenbestandteilen mit einem nicht-ionogenen Detergens (Nonidet P-4-0) und mit 2-Mercaptoäthanol behandelt. Die Präparate werden sodann mit Genetron vermischt und zur Freisetzung der freien Kerne heftig geschüttelt. DHA-Polymerase verbleibt in der wässrigen Phase. Diese Behandlung mit Genetron ist nicht wesentlich und kann auch unterbleiben, jedoch trägt sie zur Gewinnung eines reineren Produkts bei. Die xveitere Reinigung der wässrigen DNA-Polymerase in linearen Saccharosegradienten ergibt eine homogene Bande mit einer Sedimentationsgeschwindigkeit von etwa 110 S. Im Elektronenmikroskop zeigt es sich, dass die 27 nm-Kern-Teilchen mit der Polymerase kosedimentieren. Nur Spurenmengen von HB5Ag lassen sich durch Radioimmuntests im Saccharosegradienten nachweisen.
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Immunog;enität und Antigenität der Dane-Teilchen-Kerne
Meerschweinchen und Kaninchen werden immunisiert, indem man ihnen das mit Hilfe des Saccharosegradienten gereinigte Kern-Präparat im Gemisch mit einem gleichen Volumen an Freund-Adjuvans injiziert. Die Seren der immunisierten Tiere reagieren mit gereinigten Dane-Kernen und werden routinemässig durch einen nachstehend "beschriebenen direkten Radioimmuntest auf ihren anti-HB -Titer untersucht. Die Hyperimmun-anti-HB Seren werden über iinmunoabsorbierende Säulen von gereinigtem HB3Ag und normalen menschlichen Serumproteinen geleitet,um mögliche, durch diese Komponenten induzierte Antikörper zu entfernen. Mit hochgereinigten Dane-Teilchen-Kernen immunisierte Tiere erzeugen einen hohen anti-HB -Titer, während der anti-HB -Titer vergleichsweise gering oder mit dem Pestphasen-Eadioimmuntest (gemäss der US-PS 3 867 517 5 gemessen mit dem unter der Handelsbezeichnung AUSAB vertriebenen Produkt nicht nachweisbar ist. Wenn das anti-HB -Tierserum mit hochgereinigten 22 Nanometer (nm)-HB Ag-Teilchen inkubiert wird, bilden die anti-HB'-Antikörper einen Komplex mit den HB Ag-Teilchen. Wenn die HBJLg-Teilchen aber zuerst mit Pepsin behandelt werden, verlieren die HB3Ag-Teilchen ihre Bindungsfähigkeit für anti-HB , behalten aber die volle HB Ag-Aktivitat, d.h. die Fähigkeit zur Bindung an anti-HB . Daraus wird geschlossen, dass sich an den 22 nm-HB Ag-Teilchen antigene Stellen befinden, die den Stellen an den Dane-Teilchen-Kernen ähnlich oder gleich sind. Dieser unerwarteten Eigenschaft von HBsAgTTeilchen kann man sich bei verschiedenen Formen von Immuntests zum Nachweis von anti-HB bedienen.
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Überziehen der festen Oberfläche mit Kernen von Dane-Teilchen
Präparate von Dane-Teilchen von "unterschiedlichen Reinheitsstufen werden 1 Stunde bei 37°C mit 2-Mercaptoäthanol (0,30 bis 0,75 Prozent) -und einem nicht-ionogenen Detergens, wie Triton X-100 oder Nonidet P-4-0, in einer Konzentration von etwa 1,0 bis 2,5 Prozent behandelt. Der Zweck dieser Behandlung besteht in der Entfernung des Lipoproteinüberzugs und in der Freisetzung des Kern-Antigens der Dane-Teilchen. Die vorgenannten Behandlungsbedingungen werden bevorzugt, können aber ohne nachteilige Wirkung variiert v/erden. Nach dieser Behandlung wird das Gemisch in entsprechender Weise mit einer Pufferlösung verdünnt, beispielsweise mit 0,01 m tris-HGl vom pH-Wert 7,1 in physiologischer Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,001 m EDTA. Die Lösung wird sofort zum Überziehen der festen Oberfläche von Gegenständen, wie Perlen, Rohren oder Behältern ("wells") aus Kunststoff oder Glas, verwendet. Auf diese Weise hergestellte Dane-Kerne sind sehr klebrig und haften leicht durch Absorption an festen Oberflächen. Wenn Präparate von Dane-Teilchen stark verunreinigt sind und hohe Konzentrationen an Fremdproteinen enthalten, ist es erforderlich, die festen Gegenstände vor der erwähnten Umsetzung mit den Dane-Kernen mit anti-EEL vorsubeschichten. Jedoch befinden sich auf-^ erfindurigsgemässen Präparaten, bei denen Polystyrolperlen 24 bis 72 Stunden mit der Dane-Kern-Lösung inkubiert worden sind,mehr Dane-Kerne auf den einfachen Perlen als auf mit anti-HBc vorbeschichteten Perlen, insbesondere wenn sehr geringe Konzentrationen an Dane-Kernen verwendet werden. Es wurde erfindungsgemäss festgestellt, dass in der Überzugs- - lösung die Detergenskonzentration sehr gering sein soll, vorzugsweise unter 0,005 Prozent, wenn die Dane-Kerne direkt als Überzug auf die feste Oberfläche aufgebracht werden. Ein weiterer Vorteil beim direkten Überziehen der Oberfläche von festen Gegenständen mit Dane-Kernen anstelle der Vorbe-
— 7 — 809837/0974
Schichtung mit anti-HB besteht in der Eignung des Reagenz zur Verwendung in einem direkten ßadioimmuntest (RIi) vom Sandwich-Typ für anti-HB .
Herstellung; von radioaktiven' anti-HB„-Iinmunglobulinen für
- Il ii. .Hi..--■ ι iW .1.1 ι ι ι Il Q L - -.i-iii..
Radi ο immunt e s t s
Serum mit anti-HB -Aktivität wird an DEAE-Cellulose-Säulen
fraktioniert, um die Immunglobulinfraktionen zu erhalten.
125 Die Fraktionen werden sodann mit ^J oder anderen markierenden
Substanzen nach üblichen Verfahren markiert.
Radioimmuntest (RIA) zum Nachweis von anti-HB„ Verwendung der Reagentien der Gruppe A"
■Beispiel 1 ... - ..-.--■
Festphasen-Kompetitiv-RIA; Einfach-Antikörpersystem
Mit HB Ag überzogene Perlen werden mit einer Aliquotmenge einer Serumprobe so länge inkubiert, bis das in der Probe gegebenen-.
falls vorhandene anti-HB, mit den EB Äg-ähnlichen Stellen
c c j2
der Perlen reagiert. Sodann wird eine Aliquotmenge von anti-HB zu dem Reaktionsgemisch gegeben,-um eine Bindung an die zur Verfügung stehenden HB Ag-ähnlichen Stellen zu erreichen. Nach der Reaktionszeit werden die Perlen gewaschen. Die Menge an ^J-anti-HB , das an die Perlen gebunden ist, wird bestimmt. Ein bekanntes, in bezug auf anti-HBc negatives Normalserum wird parallel mit der zu untersuchenden Probe getestet. Die Anwesenheit von anti-HB in der zu untersuchenden
125 Probe wird durch eine Abnahme der ^J-anti-HB^-Aufnahme durch ■
die Perlen, im Vergleich zur Kontrolle, angezeigt.
Das vorstehende Verfahren kann für spezielle Zwecke modifiziert werden. Beispielsweise können bei diesem Bestimmungsverfahren die Probe und das -'j-anti-HB. vor der Umsetzung mit den Perlen vorgemischt werden oder es kann zwischen den beiden
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Inkubationsperioden der Perlen mit der Probe und dem anti-HB eine Waschstufe zwischenge schalt et werden.
Beispiel 2 IPestphäsen-Kompetitiv-RIA; Poppel-Antikörpersystem
Dieses Verfahren ist dem vorstehend erläuterten Einfach-Antikörpersystem ähnlich, mit der Ausnahme, dass anti-HB (beispielsweise von Meerschweinchen) und kein radioaktives oder auf andere Weise markiertes Produkt verwendet wird. Nach dem Waschen zur Entfernung von überschüssigem Reagenz wird eine weitere Inkubationsstufe mit markiertem Antikörper gegen anti-HB -Immunglobulin (beispielsweise Meerschweinchen), das in einer anderen Tierspezies (beispielsweise Kaninchen) erzeugt worden ist, durchgeführt, um das anti-HB auf den Perlen durch Radioaktivität oder eine andere markierende Substanz "sichtbar" zu machen.
Verwendung von Reagentien der Gruppe B Beispiel 3 ffestphasen-Komp etitiv-RIA
Eine Aliquotmenge an markiertem, menschlichem Immunglobulin mit einem Gehalt an anti-HB„ und die zu bestimmende Lösung werden mit Perlen, die mit Dane-Kernen überzogen sind, inkubiert. Nach gründlichem Waschen der Perlen wird die Menge des haftenden Markers gezählt. Als Kontrolle wird eine in bezug auf anti-HB negative Probe auf die gleiche Weise getestet. Eine Probe ist in bezug auf anti-HB positiv, wenn die Zählung oder ein anderes entsprechendes Mass bei der Probe deutlich niedriger ist als bei der negativen Kontrollprobe.
Beim vorstehenden Verfahren können folgende Varianten vorgenommen werden:
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(1) Die mit Dane-Kernen überzogenen Perlen werden vor der Zugabe von markiertem anti-HB mit der Probe inkubiert;
Ι. (2) wie (1), mit der Ausnahme, dass die Perlen vor
der Zugabe von markiertem anti-HB gewaschen werden.
Beispiel 4 Eestphasen-Direktbestimmuno;: Homologer Sandwich-Typ
Beim direkten EIA vom Sandwich-Typ können mit Dane-Kernen überzogene Perlen zusammen mit markiertem HB Ag verwendet werden. Eine Aliquotmenge einer Probe wird mit mit Dane-Kernen überzogenen Perlen, Schläuchen oder anderen Gegenständen inkubiert. Der Gegenstand wird sodann gewaschen und weiter mit einer Lösung von markiertem HB Ag inkubiert. Wenn
anti-HB in der Probe vorhanden ist, wird eine Sandwich-Struktur von HB Ag-anti-KB -markiertem HB Ag gebildet. Nach
CG C
dem Waschen ergeben die Perlen im Vergleich zu Kontrollperlen, die mit anti-HB -negativen Proben gemessen werden, eine signifikant höhere Zählung oder ein~_änderes entsprechendes .Mass.
Beispiel 5 Eestphasen-Direktbestimmunp;: Heterologer Sandwich-Typ
Mit Dane-Kernen überzogene Perlen werden zunächst in einer Aliquotmenge von in geeigneter Weise verdünntem Humanserum inkubiert. Wenn die Probe anti-HB enthält, wird dieses spezifisch an die Dane-Kerne der Perlen gebunden. Mach dem Waschen der Perlen mit Wasser oder einer Pufferlösung wird eine markierte anti-Humanimmunglobulin-Lösung zugegeben, um eine Reaktion mit dem vorher gebundenen anti-HB herbeizuführen. Wenn markiertes, spezifisches anti-Human IgG oder IgM verwendet wird, kann dieses Verfahren anti-HBc unterscheiden, je nachdem, ob es IgG oder IgM ist.
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338?
Befunde unter Verwendung der Testverfahren-Häufigkeitsyerteilung von anti-Kernen
Eine Sammlung von Seren von aufeinanderfolgenden Plasmapherese-Sp end em (bezahlte Spender) wird auf anti-HB gemäss dem er-
findungsgemässen Verfahren und auf HB Ag (unter Verwendung
125
von ^J-anti-HB ) und auf anti-HB (unter Verwendung von
12^J-HB Ag) gemäss dem Verfahren der US-PS 3 867 517 analysiert. In Tabelle I findet sich eine Gegenüberstellung der Befunde in bezug auf Hepatitis .B-Oberflächen- und Kern-Systeme unter Verwendung der Eeagentien der Gruppe A. Etwa 81 Prozent der HB Ag-positiven Proben enthält auch anti-HB . Etwa 15 Prozent der Proben mit einem Gehalt an anti-HB enthalten auch anti-
HB . Dies lässt darauf schliessen, dass in diesen Spendern
anti-HB. kürzere Zeit als anti-HB_ weiterbesteht. Eine dritte c s
Gruppe von 3105 Spendern zeigt keine Anzeichen auf eine frühere Belastung durch Hepatitis B-Virus, was aufgrund der negativen Ergebnisse in bezug auf Oberflächenantigen und Antikörper geschlossen wird. Jedoch fast 5 Prozent dieser Gruppe sind in bezug auf anti-Kern positiv. Ähnliche Ergebnisse v/erden mit einer Gruppe von 1049 freiwilligen Blutspendern erhalten. Die HBsAg-positiven Seren sind für eine Untersuchung nicht zugänglich. Etwa 21 Prozent der anti-HB -Proben sind auch in bezug auf anti-Kern positiv. Etwa 2 Prozent der in bezug auf Oberflächenantigen und Antikörper negativen Spender sind positiv in bezug auf anti-Kern. Bei einer Sammlung von HB Agpositiven Seren von Trägern erweisen sich 106 von 113 (94-Prozent) positiv in bezug auf anti-HB .
Bei den vorstehenden Untersuchungen wird anti-HB in 290 (7,3 Prozent) von 3929 Plasmapherese-Spendern und in 34- (3,2 Prozent) von 104-9 freiwilligen Blutspendern gefunden« Bei 14-5 bzw. 19 Spendern ist anti-HBc der einzige nachweisbare Marker für eine Belastung durch Hepatitis B-Virus»
— 11 —
3387
Bei einer anderen Populationsuntersuchung wird anti-HB unter Verwendung der Reagentien von Gruppe B "bestimmt. Es werden vergleichbare Ergebnisse erhalten (vgl. Tabelle II) mit der Ausnahme eines höheren prozentualen Anteils an anti-HB -positiven Proben, die sich auch als anti-HB -positiv erweisen.
Diese Ergebnisse stimmen qualitativ mit zwei anderen Untersuchungen über das Auftreten von anti-HB bei gesunder Bevölkerung überein. Hoofnagle et al., Lancet, Bd. 2 (1973)» S. 869 bis 873 und Ή. Eng. J. Med., Bd. 290 (1974-), S. 1336 bis 134-0, untersuchten Seren von bezahlten Spendern, freiwilligen Spendern und HB Ag-Trägern durch Komplementfixierung mit HB Ag von infizierten Schimpansenleber-Hepatozyten. Bei 8 von 100 Seren von bezahlten Spendern und bei 2 von 200 Seren von freiwilligen Spendern wird anti-HB gefunden. Bei 5 bzw. 1 Spender stellt anti-HB das einzige Anzeichen für eine Belastung durch den Hepatitis B-Virus dar. Tsuda et al., J. Immunol., Bd. 115 (1975), S. 834- bis 838 verwendeten zur Analyse von Seren von 215 gesunden Blutspendern die Immun-Haftung-Hämagglutination mit gereinigten Plasma-Dane-Teilchen-Kernen. Davon erwiesen sich 36 in bezug auf anti-HB positiv. Diese setzen sich zusammen aus 2 von 2 HB3Ag-P ο si ti ven, 28 von 31 anti-HB -positiven und 6 von 192 der Oberflächennegativen Gruppe.
- 12 -
Tabelle I
Zusammenhang von anti-HB mit Hepatitis B-Oberflächenantigen und Antikörpern
Spenderpopulationen* ·
25
120
145
80,6 5
15,1 72
4,6 974
NA**
15
19
20
1
,8
,9
HB_A£-Träger
Proben- anti-HB
zahl Anzahl
106 in
Plasmaphorese-Spender freiwillige Spender
Proben- anti-HB + Proben- anti-HB +
zahl Anzahl G % zahl Anzahl c %
290 7,3 1049 34 3 ,2 115 106 +
O HB3Ag +'
anti-HBs +
HB_ neg.■
31
793
3105
115 93,8
S' Gesamt 3929 93,8
* anti-KB bestimmt unter Verwendung der Reagentien der Gruppe A gemäss Beispiel 2
** standen für die Untersuchung nicht zur Verfügung
VM VM 00
ρ, 4
Tabelle II
Zusammenliang von anti-HBn mit Hepatitis B-Oberflächenantigen. und Antikörper in Spenderpopulationen
Plasmaphorese-Spender bezahlte Blutspender freiwillige Blutspender HB Ag-Trä^or
Proben- anti-
σ HB Ag + Proben
zahl
anti-HB
(%)
c + Proben
zahl
anti-HB
(%)
c + Proben
zahl
anti-HB +
(%) C
ω ι anti-HB + 30 26 (86, 7) 5 4 (80, 0)
HB neg. 573 414 (72, 2) 144 131 (91, 0) 15 7 (46,6)
1043 112 (07, 9) 776 14 (01, 8) 775 6 (00,7)
zahl
830 798 (%,1;
Gesamt
2006
552 (27,5) 925
(16,8) 790
13 (01,6)
830 798 (96,1.)
* anti-HB wird unter Verwendung der Reagentien von Gruppe B, Beispiel 3, bestimmt

Claims (1)

  1. Pat.en tau S prüclie
    1. Reagenz zur immunologischen Bestimmung von anti-HB in unbekannten. Proben als Anzeichen für eine Belastung durch Hepatitis B-Yirus, enthaltend
    (A) eine mit 22 nm-KB Ag-Teilchen überzogene feste Phase oder
    (B) Dane-Teilchen-JKerne.
    2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase aus einem mit 22
    festen -Gegenstand besteht.
    ste Phase aus einem mit 22 nm-HB Ag-Teilchen beschichteten
    5* Eeagenz nach Anspruch Ί, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase aus einem festen . Gegenstand besteht, der direkt mit Dane-Teilchen-Kernen ohne eine Vorbeschichtung mit Antikörpern überzogen ist.
    4. Kunststoffperlen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit 22 nm-
    HB Ag-Teilchen als Reagenz zur Analyse von anti-HB überzogen s . c
    sind.
    5. Kunststoffperlen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Dane-Teilchen-Ke:
    zogen sind.
    Teilchen-Kernen als Reagenz zur Analyse von anti-HB über-
    6. Tierisches Antiserum, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Immunisierung eines Tieres mit HB Ag hergestellt worden ist«
    7. Radioaktiv markierte anti-HB -Immunglobulineo
    8. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Dane-Kern-Antigen in unbekannten Proben als Anzeichen für eine
    809837/0974
    3387 Ä
    Belastung durch Hepatitis B-Virus, dadurch, gekennzeichnet, ■dass man
    (a) die unbekannte Probe in Zontakt mit immobilisiertem Dane-Kern-Antigen bringt, wobei in der Probe vorhandene Dane-Kern-Antikörper an das Dane-Kern-Antigen gebunden werden,
    (b) das immobilisierte Dane-Kern-Antigen zur Entfernung von ungebundenen, unbekannten Probenbestandteilen wäscht,
    (c) das gewaschene, immobilisierte Dane-Kern-Antigen mit einer Lösung von markiertem Dane-Kern-Antigen versetzt, wobei das markierte Dane-Kern-Antigen an Dane-Kern-Antikörper, die an das immobilisierte Dane-Kern-Antigen gebunden sind, gebunden wird, xvodurch ein markierter Komplex entsteht,
    (d) den markierten Komplex zur Entfernung von ungebundenem, markiertem Dane-Kern-Antigen wäscht und
    (e) den Komplex auf die Anwesenheit von markiertem Dane-Kern-Antigen untersucht.
    9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Dane-Kern-Antigen als Überzug auf einen festen Gegenstand aufgebracht ist.
    10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Dane-Kern-Antigen mit einem radioaktiven Isotop markiert ist.
    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als radioaktives Isotop Jod 125 vorliegt.
    12. Verfahren zum Nachweis von Dane-Kern-Antigen in unbekannten Proben als Anzeichen für eine Belastung durch Hepatitis B-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man
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    5387 2
    (a) die unbekannte Probe in Eontakt mit immobilisiertem
    Bane-Kern-Antigen und markiertem menschlichem Immunglobulin, das Antikörper gegen Dane-Kern-Antigen enthält, bringt y
    (Jo) das erhaltene Gemisch inkubiert, wobei das markierte Material eine Bindung mit dem immobilisierten Dane-Kern-Antigen eingehen kann,
    (c) das immobilisierte Dane-Kern-Antigen wäscht und
    (d) das immobilisierte Dane-Kern-Antigen auf die Anwesenheit von daran gebundenem markiertem Material untersucht.
    13. Verfahren-nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass - das Dane-Kern-Antigen als Überzug auf einen festen Gegenstand aufgebracht ist..
    Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Dane-Kern-Antigen mit einem radioaktiven
    Isotop markiert ist.
    Verfahren nach Anspruch 14-, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktive Isotop Jod 125 ist.
    - 3 -809837/0974
DE19782810506 1977-03-11 1978-03-10 Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen dane-kern-antigen und reagentien zur durchfuehrung des verfahrens Ceased DE2810506A1 (de)

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