ES2165367T5 - Procedimiento para prevenir el herpes zoster o para aliviar la neuralgia post-herpetica relacionada con la varicela. - Google Patents
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Abstract
HERPES DE ZOSTER, O NEURALGIA POST-HERPETICA RELACIONADA CON VARICELA SON ALIVIADOS INMUNIZANDO A LA GENTE DEL RIESGO DE DESARROLLAR HERPE DE ZOSTER CON ANTIGENO DEL VIRUS DE ZOSTER DE LA VARICELA (VZV).
Description
Procedimiento para prevenir el herpes zoster o
para aliviar la neuralgia post-herpética relacionada
con la varicela.
La neuralgia post-herpética es
la morbididad predominante asociada con el desarrollo de
herpes-zoster, también conocido como herpes. La
neuralgia típicamente dura de uno a seis meses y a menudo es muy
dolorosa.
En los últimos años se han ido acumulando
indicios que demuestran que el herpes-zoster se
produce por una reactivación del virus de la varicela latente
[Straus y col., Ann. Int. Med. (1988); 108, 221-237;
Hyman y col., Lancet (1983) 2, 814-816; Gilden y
col., Nature (1983) 306, 478-80; Croen y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1988); 85, 9773-9777;
Mahalingham y col., New Eng. J. Med. (1990) 323,
627-631]. La infección inicial de varicela puede
haberse producido como resultado de la varicela infantil o como
resultado de la inmunización con una vacuna de virus de varicela
zoster vivos atenuados para prevenir la varicela. En cualquier caso,
parece ser que el virus permanece en el sistema del individuo
infectado durante mucho tiempo desde la varicela o la vacunación.
Parece ser que el sitio de la latencia del VZV son las células
neurales existentes dentro de los ganglios de raíz dorsales.
Años después de que el VZV haya pasado a un
estado de latencia, el virus se reactiva por un mecanismo que aún
se conoce poco. Sin embargo, la reactivación de VZV y su posterior
replicación produce el herpes zoster. En el transcurso y después de
esta reactivación de VZV es cuando se desarrolla la neuralgia
post-herpética grave.
Numerosas publicaciones bibliográficas han
sugerido que puede haber una correlación entre una competencia
inmune disminuida y la reactivación de herpes zoster desde su estado
latente. Las sugerencias del mecanismo por el cual se produce la
reactivación incluyen la disminución de la inmunidad basada en
células, tal como la reducción del número de linfocitos T
sanguíneos que llevan el receptor CD4^{+}, que son responsables
del reconocimiento de los antígenos que no son autoantígenos
presentados por las moléculas del MHC (complejo principal de
histocompatibilidad) de tipo II después de la fagocitosis de VZV.
Como alternativa, también se ha sugerido como mecanismo posible
permisivo para la reactivación de VZV la reducción de los niveles de
los linfocitos T CD8^{+}, responsables de la destrucción de las
células en las que las moléculas del MHC de tipo I reconocen y
presentan antígenos que no son autoantígenos. Neumeyer y
col., [N.E.J. Med. p. 1456, 29 de mayo, 1986) detectaron
una reducción en la relación de CD4^{+}/CD8^{+} antes de la
aparición del herpes zoster, y un posterior aumento de la relación
tras la terminación del síndrome clínico.
En un estudio, se administró una vacuna de
varicela a sujetos de edad avanzada con la intención de reforzar
sus respuestas CMI a VZV. Se realizó la inmunización contra VZV de
estos individuos seropositivos a causa de la reducción de la CMI
específica para VZV relacionada con la edad descrita previamente
[Miller AE., Neurology. (1980); 30, 582-587; Berger
R, Florent G. Just M., Infect. Immun. (1981); 32,
24-27; Burke BL, Steele, RW, Beard OW., Arch.
Intern. Med. (1982); 142, 291-293] y de la
posibilidad de que la reactivación de VZV relacionada con la edad
(como herpes zoster) sea una consecuencia de esta reducción. Esta
vacuna viva atenuada se toleraba bien; no apareció ninguna reacción
local o sistémica grave y las reacciones leves no fueron muy
comunes. Ocasionalmente se produjo una extensión sistémica del
virus de la vacuna, manifestada por un exantema cutáneo mínimo
(posiblemente en 6/245 inyecciones). Aunque teóricamente esto tiene
importancia en pacientes de edad avanzada con una reducción
documentada de la inmunidad específica mediada por células, las
lesiones resultantes y los síntomas no tuvieron significado
clínico. Este hecho es coherente con las observaciones anecdóticas
de que los abuelos seropositivos no se infectan después de la
exposición a los nietos con varicela.
Los déficits en la inmunidad específica para VZV
en las personas de edad avanzada se producen en el contexto de la
reducción de las respuestas CMI. Éstas se detectan en ensayos de
respuestas cutáneas de hipersensibilidad retrasada [Goodwin JS, y
col., Clin. Exp. Immunol. (1982); 48,
403-410] y en respuestas proliferativas in
vitro de linfocitos T estimulados por mitógenos [Hayward AR, y
col., J. Clin. Immunol. (1987); 7, 174-178; Tice
RR, y col., J. Exp. Med. (1979); 149, 1029-1041;
Murasko DM, y col., Am. J. Med. (1986); 81,
612-618]. La mayoría de los estudios documentan un
número normal de células T, pero hay una reducción en las células
CD4^{+} [Nagel Je, y col., J. Immunol. (1981); 127,
2086-2088; Thompson JS, y col., J. Am. Geriate Soc.
(1984); 32, 274-281]. En estos pacientes, los
números y las funciones de las células destructoras naturales son
normales [Hayward AR, Herberger M., J. Clin. Immunol. (1987); 7,
174-178; Nagel Je, y col., J. Immunol. (1981); 127,
2086-2088]. Un aumento del tiempo del ciclo celular,
como se sugiere en el estudio de Tice y col., sería una posible
explicación de la pérdida de CMI con el envejecimiento [Tice RR, y
col., J. Exp. Med. (1979); 149, 1029-1041]. Sin
embargo, los estudios posteriores no apoyan un cambio en el ciclo
celular ni ninguna reducción en el grado de expansión clonal
después de la estimulación de antígenos
[Staiano-Coico L, y col., J. Immunol. (1984); 132,
1788-1792; Sohnie PG, y col., Clin. Exp. Immunol.
(1982); 47, 138-146]. En su lugar, los análisis de
ADN muestran un aumento de la frecuencia de lesiones de ADN,
intercambios de cromátidas hermanas y pérdida celular en células de
personas de edad avanzada estimuladas con mitógenos [Dutkowski RT,
y col., Mutat. Res. (1985); 149, 505-512]. Las
respuestas proliferativas reducidas a los mitógenos no están
acompañadas necesariamente por una reducción de la síntesis de IL2 o
IL2R [Dutkowski RT, y col., Mutat. Res. (1985); 149,
505-512]. El defecto más consistente encontrado por
Chopra y col., fue el aumento de la producción de interferón gamma
y la reducción de la supervivencia de las células estimuladas, que
apoya el uso de un refuerzo [Chopra RK, y col., Clin. Immunol.
Immunopathol. (1989); 53, 297-308].
Otros estudios realizados en una población en
envejecimiento demostraron que la reducción de la inmunidad
específica para VZV que acompaña al aumento de la incidencia de HZ
en la población de edad avanzada, se explica al menos parcialmente
por la reducción de la frecuencia de células CD4^{+} específicas
para VZV en la sangre. Sin embargo, estos pacientes tienen números
normales de células T y conservan la actividad de sus células NK en
respuesta al antígeno de VZV, siempre que esté presente suficiente
IL2 [Hayward AR, y col., J. Clin. Immunol. (1987); 7,
174-178]. La frecuencia de células T que expresan el
fenotipo de células de memoria (CD45RO) aumenta con la edad desde
una media de 43+17% a los 28 años a 65+14% a los 70 años, de forma
que la reducción de la inmunidad específica para VZV con el
envejecimiento no se debe a una pérdida selectiva de esta subserie.
Las células CD45RO^{+} fabrican más interferón \gamma que las
células CD45RA^{-}, lo cual se correlaciona con los resultados de
Chopra y colaboradores.
Sea cual sea el mecanismo de represión o
reactivación del herpes zoster, ninguna evidencia médica ha
demostrado de forma eficaz la prevención de la reactivación del
herpes zoster (zoster) o la disminución de la neuralgia
post-herpética. Los agentes quimioterapéuticos como
clase han sido catastróficos en el tratamiento de esta afección
dolorosa [Watson, C. P. N., Neurol. Clin., 7,
231-248 (1989); Straus, y col., Ann. Int. Med. 108,
221-237 (1988)].
Starr y col., "Immunization of Healthy
seropositive middle aged and elderly adults with
varicella-zoster virus (VZV) vaccine"
("Inmunización de adultos sanos seropositivos de edad media y
avanzada con la vacuna del virus
varicela-zoster"), en Programs and Abstracts of
the Twenty-Seventh Interscience Conference on
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Nueva York, NY,
4-7 de octubre, 1987, página 313, midieron un
aumento en los niveles de anticuerpos contra VZV hasta cuatro meses
después de la vacunación. No hay descripción ni apreciación de que
esto pueda predecir una reducción de la incidencia o gravedad de la
neuralgia post-herpética.
Hayward y col., J. Infectious Diseases,
163, 1991, 873-875 describen la medición de
los niveles de anticuerpos y de las respuestas de células T después
de la vacunación. Afirman que estas mediciones no equivalen a una
reducción de la gravedad o incidencia de la neuralgia
post-herpética.
Esta invención es un procedimiento para reducir
la neuralgia post-herpética y para mejorar o anular
la reactivación del herpes zoster. La eficacia del procedimiento se
demuestra por resultados positivos obtenidos in vivo en los
que aumenta el nivel de linfocitos específicos para VZV. Este
aumento en la frecuencia de células respondedoras, RCF, inducido
por la inmunización de acuerdo con el procedimiento de esta
invención, produce un estado inmune in vivo que es
refractario al estado de enfermedad, incluyendo la reactivación de
VZV y la neuralgia post-herpética. La amplia
investigación clínica a largo plazo, multicéntrica, en la que los
individuos con riesgo reciben VZV vivo atenuado o inactivado
demuestra que la inmunización de acuerdo con esta invención produce
una protección significativa contra la reactivación de VZV, o, si
se produce la reactivación, una reducción significativa de la
duración o gravedad de la neuralgia
post-herpética.
Se describe un procedimiento para aliviar la
neuralgia post-herpética y para mejorar o anular la
reactivación del herpes zoster en personas con riesgo, que utiliza
la estimulación antigénica con VZV. El antígeno de VZV es un virus
VZV vivo atenuado o un virus VZV entero inactivado.
Los individuos con riesgo son los que han tenido
varicela (varicela infantil), aunque sea subclínica, o los que se
han vacunado con una vacuna de varicela viva. Tienen un riesgo
particular las personas de edad avanzada o los individuos
inmunocomprometidos. El estado de riesgo puede confirmarse por la
presencia de anticuerpos anti-VZV en suero o por
una respuesta positiva a un ensayo de antígeno VZV en la piel. Es
particularmente indicativa de un estado de riesgo una frecuencia de
células respondedoras a VZV inferior a aproximadamente 1 célula
respondedora de 68.000, mientras que se alcanza un estado protegido
cuando la RCF se aproxima a 1 célula respondedora de 40.000.
Los individuos con riesgo reciben el antígeno de
VZV en una cantidad inmunológicamente eficaz y se controlan con
respecto a la vuelta al estado de riesgo, momento en el que puede
realizarse otra inmunización.
La eficacia del procedimiento se demuestra por
los resultados positivos obtenidos en una amplia investigación
clínica a largo plazo, multicéntrica.
En el procedimiento de esta invención, un
individuo con riesgo de desarrollar herpes zoster se inmuniza con
un antígeno de VZV para inducir la elevación de las respuestas
inmunes anti-VZV. Esta inmunización reduce la
gravedad de la neuralgia post-herpética asociada con
la reactivación de VZV, y reduce o previene la propia
reactivación.
De esta forma, la presente invención proporciona
el uso de un virus de varicela zoster (VZV), el cual es un virus
VZV vivo atenuado o un virus VZV entero inactivado, para la
fabricación de una vacuna para inmunizar a una persona de más de
cincuenta años que haya tenido varicela o que se haya vacunado con
una vacuna de varicela viva, para reducir la duración o la gravedad
de la neuralgia post-herpética y para mejorar o
anular la reactivación del herpes zoster.
Preferiblemente, el VZV es una cepa Oka
atenuada.
Preferiblemente, la inmunización se realiza por
vía subcutánea. Preferiblemente, para la inmunización se usan al
menos 1.000 unidades formadoras de placas (PFU).
Preferiblemente, la cepa Oka del virus de
varicela zoster atenuado se almacena en estado liofilizado antes de
la inmunización. Más preferiblemente, se reconstituye desde el
estado liofilizado con agua destilada antes de la inmunización.
Un individuo con riesgo incluye cualquier
individuo de más de 50 años que haya experimentado varicela, aunque
sea de gravedad subclínica, y cualquiera que haya recibido una
vacuna del virus varicela zoster vivo. Dentro de esta clase, tienen
un riesgo particular las personas que, por una razón u otra, están
inmunocomprometidas. Esto puede deberse al desarrollo de una
enfermedad de deficiencia inmune adquirida (por ejemplo, SIDA, ARC),
a una quimioterapia o a otra terapia inmunosupresora (por ejemplo,
inmunosupresión de rechazo de injertos). Además, la incidencia de
zoster aumenta con la edad. Entre las personas con riesgo de más de
50 años, la incidencia es de 2,5-5,0 casos/1.000
personas/año. A los 80 años, la incidencia aumenta a
5-10 casos/1.000 personas/año. Este aumento del
riesgo se correlaciona con la reducción de la inmunidad mediada por
células a VZV.
Para establecer si una persona es un individuo
con riesgo, sin basarse en los registros personales ni en la
recolección de muestras, puede realizarse un ensayo de piel sencillo
como se describe en la sección de Ejemplos mostrada más adelante.
Otro procedimiento para determinar el estado de riesgo incluye la
evaluación serológica, por ejemplo, por un ensayo ELISA de
anticuerpos anti-VZV. Otro procedimiento es medir la
frecuencia de células respondedoras específicas para VZV, RCF, y si
se descubre que es de aproximadamente 1 de 68.000, el individuo
supuestamente tiene riesgo. Sin embargo, para los fines de esta
invención, puede considerarse que cualquier individuo está en
riesgo, ya que no hay efectos secundarios conocidos asociados con la
inmunización general de acuerdo con esta invención, siempre que los
individuos inmunocomprometidos de forma grave, tales como los
infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o que
tienen el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) no se
inmunicen con un antígeno de VZV vivo.
El antígeno de VZV puede ser un VZV vivo
atenuado, preparado de acuerdo con el procedimiento descrito en la
patente de Estados Unidos 3.985.615 (Takahashi) o como se describe
en los siguientes ejemplos. La viabilidad de la varicela viva
atenuada puede mantenerse en cualquiera de varias formulaciones
estabilizadoras conocidas. El VZV Oka atenuado está depositado en
la ATCC (No. de adquisición VR-795) y también está
disponible en el mercado como VARIVAX®, comercializado por Merck
& Co., Inc. También pueden usarse otras cepas de VZV si están
suficientemente atenuadas, de forma que no provoquen la enfermedad
de tipo natural en individuos no expuestos previamente al antígeno
que pueden someterse a la vacunación por primera vez, o para la
producción de antígenos de VZV destruidos.
El antígeno de VZV puede ser un virus
inactivado. Este material puede prepararse simplemente por un
procedimiento tan sencillo como el calentamiento de una alícuota de
VZV vivo y el control del número de unidades formadoras de placas
(PFU) residuales por medio un ensayo apropiado, o puede inactivarse
por técnicas más sofisticadas tales como irradiación gamma, durante
periodos de tiempo y con intensidades conocidas. Un virus entero
inactivado es obviamente tan eficaz en la presente invención como
VZV vivo, y puede producirse por cualquier medio conveniente,
siempre que se mantenga la integridad antigénica de VZV. Cuando se
usa VZV inactivado térmicamente a una dosis de aproximadamente 10
\mug o mayor, las elevaciones en las frecuencias de células
respondedoras anti-VZV son las mismas que cuando se
administran aproximadamente 1000 PFU de virus vivos. Se prefiere el
uso de un VZV entero inactivado, particularmente cuando el receptor
está gravemente inmunocomprometido.
En el procedimiento de esta invención, sea cual
sea el antígeno elegido, el VZV vivo atenuado o el virus inactivado,
son útiles los siguientes indicios de dosis inmunológicamente
eficaces y de la eficacia del procedimiento:
- 1.
- Aumento de la frecuencia de células respondedoras específicas para VZV en aproximadamente un 30% (RCF, véase el siguiente ejemplo).
- 2.
- Elevación de las células T citotóxicas (CTL) anti-VZV, medida por una elevación de las células CD8^{+} específicas para VZV (células destructoras, véase el siguiente ejemplo).
- 3.
- Elevación de células T adyuvantes anti-VZV, medida por una elevación de las células CD4^{+} específicas para VZV (véase el siguiente ejemplo).
- 4.
- Aumento del nivel de anticuerpos específicos anti-VZV.
- 5.
- Aumento del nivel de linfocinas, tales como interferón, o interleucina.
- 6.
- Reducción de la duración o gravedad de la neuralgia post-herpética en un individuo a un periodo menor de un mes después del desarrollo de herpes zoster.
- 7.
- Reducción de la incidencia de herpes zoster, en un nivel estadístico, por debajo de la incidencia encontrada en la población general de individuos con riesgos similares.
\newpage
No hay ningún procedimiento in vitro
aceptado generalmente para cuantificar las respuestas inmunes
mediadas por células en el ser humano. Los presentes solicitantes
seleccionaron cultivos de dilución limitante con análisis de RCF
para este estudio porque preveían que este procedimiento sería más
preciso que la medición de SI. Los dos procedimientos de análisis
mostraron un refuerzo significativo en la inmunidad específica para
VZV después de la inmunización. La preferencia de los presentes
solicitantes por los resultados de RCF se basa en el descubrimiento
de desviaciones típicas menores de la media en estos resultados en
comparación con los resultados SI. Esto puede reflejar en parte el
hecho de que se analicen 196 pocillos de cultivo de tejidos para
conseguir una estimación de RCF, en comparación con los
6-8 pocillos de cultivo usados generalmente para
calcular SI. Sin embargo, los cultivos de dilución limitante que se
usaron sólo pueden proporcionar una estimación indirecta de la
frecuencia de respondedores. El denominador usado en este estudio es
el número de células recuperadas en un gradiente de Ficoll; de
éstas, sólo la cuarta parte pertenecen a la población de CD4^{+}
CD45RO^{+}, que es el fenotipo de memoria a partir del cual se
extraen células T respondedoras específicas para VZV [Beverly PCL.,
Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1990); 159, 111-112;
Hayward A, Giller R, Levin M., Viral Immunol. (1989); 2,
175]. Por lo tanto, es probable que la estimación de RCF de los
presentes solicitantes sea una infraestimación de la respuesta a la
vacunación. Sin embargo, la RCF media conseguida después de la
vacunación (1/40.000) es de la misma magnitud que la conseguida
después de HZ (Hayward A, Kevin M, Wolf W, Angelova G., J. Infect.
Dis. (1991); 163, 873-875], donde
probablemente la carga de antígeno VZV producido endógenamente es
grande. Este nivel de inmunidad conseguido después de la vacunación
también es comparable al de los individuos asintomáticos de 35 a 40
años. El refuerzo en la respuesta inmune en el estudio actual se
mantuvo durante 24 meses, con una vida media prevista de 56 meses, y
no era una función de la edad. Esta última propiedad es importante,
ya que los individuos de edad avanzada tienen más probabilidad de
desarrollar HZ y, por lo tanto, serían las dianas principales de
una estrategia de vacuna preventiva.
La respuesta de RCF después de la vacunación no
pudo correlacionarse con la dosis de vacuna administrada, que
variaba de 1.000 a 12.000 PFU. Además, la frecuencia de sujetos
respondedores no aumenta al aumentar las dosis de la vacuna. Esto
podría representar indicios de replicación del virus de la vacuna en
los receptores, de forma que incluso la menor dosis administrada
produzca suficiente antígeno de VZV como para conseguir un efecto
máximo en la RCF. Como alternativa, el contenido de antígeno de VZV
relativamente grande de las dosis menores (por ejemplo, 1.000 PFU
contienen aproximadamente 2 unidades de antígeno de VZV) puede ser
suficiente para conseguir una inmunización máxima. Sólo las
respuestas del interferón \gamma de las células cultivadas se
correlacionaron con una mayor dosis o una menor edad.
Los efectos de la vacuna de VZV sobre los
anticuerpos contra VZV fueron de una menor magnitud y de una
duración más corta que los efectos sobre CMI. Probablemente, esto
no es crítico para el objetivo a largo plazo de prevenir HZ, ya que
se sabe que las titulaciones se reducen a los niveles iniciales en
los 1 a 2 años siguientes a un episodio de HZ [Hayward A, Kevin M,
Wolf W, Angelova G., J. Infect. Dis. (1991); 163,
873-875], y los niveles de anticuerpos contra VZV
no se reducen significativamente con el envejecimiento [Miller AE.,
Neurology. (1980); 30, 582-587; Gershon AA,
Steinberg SP., Am. J. Med. Sci. (1981); 282(1),
12-17]. Los niveles medios de anticuerpo contra VZV
antes de la vacuna en los sujetos de estudio, medidos por ELISA,
fueron comparables a los de adultos de control mucho más
jóvenes.
La evaluación de la respuesta inmune después de
la vacuna incluyó la medición de la liberación de interferón
\gamma por MNC expuestos a antígenos de VZV. Esto se evaluó como
una variable potencialmente independiente a causa de la evidencia
in vitro de que el interferón \gamma se sintetiza por
células destructoras naturales así como por células T específicas
de antígenos [Hayward AR, y col., Pediatr. Res. (1986); 20,
398-401]. Tanto las células destructoras naturales
como el interferón \gamma contribuyen a la limitación de la
replicación del virus del herpes in vitro [Leibson PJ, y
col., J. Virol. (1986); 57, 976-982]. Aunque se
observó un aumento estadísticamente significativo en el interferón
\gamma in vitro 3 meses después de la inmunización, los
errores típicos fueron muy grandes. Por lo tanto, la medición del
interferón \gamma no es una forma de predicción fiable de los
resultados de la inmunización con VZV.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar adicionalmente la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El virus de la varicela zoster vivo atenuado
puede prepararse de acuerdo con la descripción de la Patente de
Estados Unidos 3.985.615 o por cualquiera de los otros
procedimientos conocidos en la técnica.
Las concentraciones de infectividad de las
preparaciones del virus de la varicela zoster (VZV) se estimaron
usando el procedimiento de recubrimiento con agarosa o de
recubrimiento con líquido descrito por Krah y col. (J. Virol.
Methods, 1990, 27:319-326) o por Takahashi y col
[Postgrad Med. J.] 61 (supl. 4) 736-741, (1985)].
El ensayo se realiza como se indica a continuación:
Las células MRC-5 se siembran en
placas de cultivo de tejidos de 60 mm, a una concentración de 6 x
10^{5} células en volúmenes de 5 ml de BME (Medio Basal Eagle con
solución salina equilibrada de Hanks) con 100 mg/l de galactosa, 50
\mug/ml de neomicina y L-glutamina 2 mM, y se
incuban a 35ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}. Después de
la incubación durante 24-48 horas, las células
alcanzan una confluencia del 50-80%. El medio de
crecimiento se retira por aspiración y las células se infectan con
100 \mul de solución de VZV diluida en un diluyente de virus
apropiado, tal como tampón SPGA, o un medio de mantenimiento líquido
(LMM). El tampón SPGA contiene un 7,5% (p/v) de sacarosa, fosfato
potásico 11 mM, un 0,1% de glutamato sódico (p/v) y un 1% de
albúmina de suero humano. Se deja que el virus se una durante \geq
1 hora a 35ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}. Los cultivos
de células infectadas con VZV después se recubren con 5 ml de medio
de recubrimiento de agarosa (AOM) o medio de mantenimiento líquido
(LMM). El medio de recubrimiento de agarosa es una mezcla de dos
soluciones, medio de recubrimiento líquido (LOM) y solución de
agarosa. LOM contiene medio esencial mínimo (MEM) con sales de
Earle, un 2% de suero de ternero fetal inactivado térmicamente, 50
\mug/ml de sulfato de neomicina y L-glutamina 2
mM. La solución de agarosa se prepara calentando 4,5 g de agarosa a
baja temperatura de gelificación en 100 ml de MEM durante 15 minutos
a 121ºC y dejando que la solución se enfríe a 45ºC. AOM se prepara
mezclando un volumen de solución de agarosa con 4 volúmenes de un
concentrado 1,25 x de LOM a 45ºC. Las placas se enfrían a
23-25ºC para permitir que solidifique el AOM. Los
cultivos se incuban para facilitar el revelado de las placas.
Después de 6-7 días, las placas que recibieron LOM
se recubren con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS)
y se raspan con una pipeta Pasteur de vidrio para soltar y retirar
la agarosa. Se aspira el medio de las placas que recibieron LMM y
las placas se visualizan por tinción de las células con una
solución de Azul de Coomassie R-250 al 2% (p/v) en
etanol-ácido acético al 1%. Los recuentos de las placas son el
promedio de 4-5 placas replicadas y se expresan como
unidades formadoras de placas por ml (PFU/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El VZV vivo, preparado de acuerdo con el
procedimiento del Ejemplo 1 o por cualquier otro procedimiento,
puede inactivarse por incubación de una alícuota del virus a
aproximadamente 50ºC durante un periodo de aproximadamente
5-15 días. Como alternativa, el VZV vivo puede
inactivarse por exposición a irradiación gamma o a cualquier otro
medio de inactivación del virus, siempre que no se comprometa la
integridad antigénica del virus.
En un experimento, VARIVAX® CR453 atenuado vivo
se inactivó como se indica a continuación:
Procedimiento de Inactivación Térmica: Se
calentaron quinientos viales de vacuna del lote CR 453 como viales
intactos, sin reconstituir, durante 12 días en un incubador a 50ºC.
Después del tratamiento térmico, los 500 viales calentados se
marcaron con triángulos prominentes de tinta roja indeleble en el
centro de cada etiqueta de vial y se almacenaron a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Contenido de virus infeccioso de varicela
residual en la vacuna calentada: La determinación del número de
unidades formadoras de placas se realizó como se describe en
Takahashi y col. Postgrad Med. J. 61 (Supl. 4)
736-741 (1985). Se ensayó un total de 5 ml de
material reconstituido a partir de 10 viales de vacuna calentada.
Se obtuvo un valor de 2,4 unidades formadoras de placas por ml. Un
ensayo convencional de vacuna no calentada dio un valor de 3830
unidades formadoras de placas por ml.
Antígeno del virus de la varicela por ensayo
dot-blot: La determinación de la masa de antígeno
viral se realiza por análisis dot-blot o como se
describe en el Ejemplo 9 mostrado más adelante. Pos análisis dot
blot, se estimó que el producto calentado contenía 9,8 unidades de
antígeno por ml. Se estimó que la vacuna no calentada convencional,
ensayada simultáneamente, contenía 9,4 unidades de antígeno por
ml.
Análisis de antígeno por inmunotransferencias:
se usó un procedimiento de transferencia de Western experimental
modelado después de los procedimientos usados para otros agentes
para comparar los antígenos presentes en las vacunas calentada y
normal. Los dos productos parecían muy similares entre sí, dentro de
los límites de observación visual de las manchas de
inmunotransferencia que reaccionaban con un antisuero policlonal
humano o con un anticuerpo monoclonal contra la glicoproteína viral
I.
Se usaron muestras de VZV inactivado entero como
se ha descrito anteriormente como inmunógeno para activar las
respuestas inmunes mediadas por células contra el herpes zoster. Se
administraron dosis iguales, equivalentes a aproximadamente
10.000PFU de VZV vivos o inactivados, a personas con riesgo de
desarrollar herpes zoster. A continuación se resumen la respuesta
de anticuerpos (Ab) y la frecuencia de células respondedoras a VZV
(RCF) antes y 3 meses después de la inmunización:
Estos datos indican que se consigue un aumento
sustancial de las respuestas inmunes anti-VZV, tanto
si la inmunización es con VZV vivos como si es con VZV
inactivados.
Ejemplo
3
El ensayo de varicela en la piel se realiza
mediante la introducción por vía subcutánea de un antígeno de VZV o
un antígeno de control, seguida de la medición de los cambios
eritematosos durante aproximadamente 48 horas desde la introducción
del antígeno. Por consiguiente, para realizar en ensayo en la piel
puede usarse el procedimiento de Kamiga y col., [J. Inf. Dis. 136,
784-788 (1977)] Babu y col., [J. Clin. Microbiol.
25, 2193-496, (1987)] o Lafussa y col., [J. Inf.
Dis. 152, 869-875 (1985)]. Como alternativa, para
proporcionar el antígeno de VZV podría usarse el antígeno
inactivado, preparado como se describe en el Ejemplo 2, o el
antígeno purificado del Ejemplo 3. En cualquier caso, Takahashi
[Adv. Virus. Res. 28, 285-356 (1987)] demostró que
el resultado negativo del ensayo de antígeno en la piel se
correlacionaba la susceptibilidad a la infección por varicela. Con
respecto a esto, se prefieren las glicoproteínas de VZV con pesos
moleculares de 15.000 y 45.000, que están muy asociadas con la
inmunidad mediada por células, como indicadores de la
susceptibilidad a reactivación de zoster.
Ejemplo
4
Las frecuencias de células que responden a VZV
pueden medirse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la
técnica, por ejemplo, M. Zauderer [Handbook of Experimental
Immunology, Volumen 2 - Cellular Immunology, Blackwell Scientific
Publications, D.M. Weir, y col., - editores, (1986) - Capítulo 65]
describe un análisis de dilución limitante. Véase también la
descripción del Ejemplo 7 mostrado más adelante, sección 5:
"Determination of the frequency of blood mononuclear cells (MN)
which proliferate in response to VZV antigen" ("Determinación
de la frecuencia de células mononucleares (MNc) sanguíneas que
proliferan en respuesta al antígeno de VZV").
De acuerdo con el procedimiento de esta
invención, se consiguen niveles de células respondedoras que se
aproximan a aproximadamente una célula respondedora de 40.000, que
es el mismo nivel de RCF encontrado en los individuos después de
sufrir un episodio de herpes zoster.
Ejemplo
5
Ensayo de citotoxicidad contra VZV: Se separan
monocitos de células periféricas (PBMN) y se cultivan con VZV vivo,
en micropocillos, a una densidad de 10^{4} células/pocillo.
Después de 7 días, se añade 1 unidad de IL2 a cada pocillo y el
cultivo se continúa durante 10 días, después de lo cual las placas
se examinan visualmente para detectar los pocillos con crecimiento.
Se recuperan las células inmaduras de esos pocillos, y se
re-estimulan con el antígeno homólogo y las células
EBV autólogas (irradiadas con 5000r) y 10 u/ml de IL2 durante una
semana de expansión clonal. El uso de VZV vivo para la estimulación
en este contexto procede de la evidencia de Braciale y
colaboradores [Immunol. Rev., 98, 95 (1987)] de que se requiere un
estímulo de virus vivos para inducir respuestas restringidas de
clase I, y de los datos [Arbeit y col., Intervirology 18, 56 (1982)]
de que los monocitos se pueden infectar por VZV, y de la necesidad
de células autólogas que llevan tanto la clase I como la clase II
para la presentación del antígeno.
En las células de los pocillos respondedores se
ensaya la restricción del MHC principalmente por inhibición de la
citotoxicidad [Gaston y col., Immunogenetics 19,
475-486 (1984)]. Las células T se suspenden a una
densidad de 10^{6}/ml y se añaden 10^{5} células a 5 x 10^{3}
dianas autólogas o no relacionadas preincubadas con VZV. La
restricción del MHC se determina (1) determinando el fenotipo de una
alícuota de las células efectoras para CD4 y CD8 y (2) añadiendo 1
\mug/ml de W6/32 (ATCC Hybridoma Bank HB 95,
anti-Clase I) o HB55 (ATCC,
anti-Clase II) a los ensayos de citotoxicidad. Estos
anticuerpos son adecuados porque reprimen el desarrollo de las
células citotóxicas restringidas a la clase I y a la clase II
respectivamente en cultivos de linfocitos mixtos. Después de 6
horas de incubación, se mide la liberación de ^{51}Cr de las
células diana.
Las células citotóxicas restringidas al MHC de
clase I se identifican como inhibibles por W6/32 y el fenotipo CD8.
Las células citotóxicas restringidas a la clase II se inhiben por
HB55 y los efectores son CD4. Se comparan los resultados de PBMN
obtenidos a diferentes intervalos después de un episodio de VZV
agudo en adultos jóvenes, y antes y después de la inmunización de
refuerzo con OKA.
Ejemplo
6
Se vacunaron individuos de 55 a 87 años de edad
que tenían una historia de varicela previa, pero que no habían
tenido HZ. Se excluyeron los que tenían una enfermedad debilitante o
inmunosupresora y los que habían recibido una terapia
inmunosupresora. También se excluyeron los que habían recibido otra
vacuna o los que se preveía que recibieran otra vacuna en el mes
previo a la vacunación con VZV, y los individuos que recibieron una
terapia con gammaglobulina en los tres meses anteriores a la
vacunación con VZV.
La vacuna viva atenuada viva (Cepa Oka/Merck) se
almacenó a -20ºC en estado liofilizado y se reconstituyó con agua
destilada a una titulación de infectividad de 1.140 pfu/0,5 ml (lote
CR 452) o 3.010 pfu/0,5 ml (lote CR 320). También pueden emplearse
otros virus de varicela zoster vivos atenuados. El virus Oka
preferido puede prepararse de acuerdo con la descripción de la
Patente e Estados Unidos 3.985.615.
Los individuos a vacunar se estratificaron por
edad (55-59; 60-64;
65-69; 70-79; \geq 80 años). Los
individuos de cada grupo de edad se asignaron aleatoriamente a
recibir una de cuatro dosis de vacuna por vía subcutánea: 3.010
pfu; 6.020 pfu; 12.040 pfu; o 3.010 pfu con una dosis de refuerzo de
3.010 pfu 3 meses después de la primera dosis. También se eligieron
aleatoriamente individuos de 55-59 años para recibir
1.140 pfu.
Se obtuvo sangre de los individuos vacunados
para la evaluación inmunológica justo antes de la inmunización y a
los 3, 12 y 24 meses después de la inmunización. También se obtuvo
sangre tres meses después de la dosis de refuerzo.
En los individuos vacunados también se siguieron
las reacciones a la vacuna durante 42 días por medio de llamadas
telefónicas cada dos semanas. Los individuos vacunados también
anotaron los signos y síntomas en una ficha de vacunación. Midieron
sus temperaturas corporales diariamente durante 5 días después de la
vacunación, y posteriormente sólo cuando sentían fiebre. Las
personas que mostraron reacciones inusuales se evaluaron
individualmente. Las lesiones cutáneas se cultivaron para comprobar
la presencia de VZV. Se pidió a los pacientes que llamaran si
consideraban que habían desarrollado HZ. Además, durante el primer
año se les llamó una vez al mes para preguntar acerca del HZ, y se
les preguntó lo mismo al final del segundo año. Las lesiones
cutáneas o los síndromes asociados que se considera que representan
HZ se investigaron por medio de exámenes físicos, cultivos de
lesiones para comprobar la presencia de VZV, y evaluación
inmunológica específica de VZV aguda y convaleciente
(4-6 semanas después de sospechar el desarrollo de
HZ).
Las filas A a D de 11 placas IMMULON® (Dynatech,
Alexandria, VA; No. Cat.
011-010-3450) se recubrieron con
0,1 ml de antígeno de VZV y las filas E a H se recubrieron con
antígeno de control (M.A. Bioproducts, Walkerville, MD; No. de Cat.
30-149J para el antígeno de VZV;
30-150J para el control) diluido 1:20 en solución
salina tamponada con fosfato (PBS; 0,15 M, pH 7) durante una noche
a 4ºC. Las placas se aclararon en PBS y se bloquearon con 1 mg/ml
de gelatina en PBS durante una noche. Se añadieron sueros de
pacientes y de control positivos a los pocillos de antígeno y de
control en diluciones 4 x (partiendo de 1:50) y se incubaron durante
una noche a 4ºC. Las posteriores incubaciones se realizaron con IgG
de cabra anti-humana purificada por afinidad y
conjugada con peroxidasa (Tago, Burlingame, CA; No. Cat 2390),
diluida a 1:2000 en PBS, y con sustrato ABTS (Sigma, St. Louis,
MO). Se desarrolló color durante 30-60 minutos, y la
DO se leyó en un lector de placas DYNATECH con un software
ELISACALC. Las densidades ópticas de los pocillos de control se
restaron de los pocillos de VZV. En todas las placas se procesó una
alícuota de un solo suero de referencia positivo y se calculó una
línea de regresión para el log (dilución) frente al log (DO). El
anticuerpo contra VZV en las muestras de los sujetos se expresó
como un porcentaje del suero de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se separaron MNC de sangre heparinizada por
centrifugación de Ficoll-Hypaque, se lavaron en
solución salina equilibrada de Hanks y se cultivaron en medio RPMI
1640 suplementado con anticuerpos y con un 10% de suero autólogo.
Los detalles de los cultivos de dilución limitante usados para
determinar la frecuencia de células respondedoras (RCF) están
publicados [Feldman S, y col., Am. J. Dis. Child. 126,
178-184 (1973)]. En resumen, se cultivaron 24
cultivos replicados que contenían 100.000, 50.000, 25.000 y 12.500
MNC por pocillo con una dilución 1:200 del antígeno de VZV sin
células durante 10 días, y después se sometieron a pulsos de 0,25
\muCi de [^{3}H]timidina (TRK 61, Radiochemical Centre,
Amersham; 5 Ci/mmol) por pocillo durante 8 horas. Los cultivos de
control paralelos fueron idénticos, con la excepción de que se
estimularon con un antígeno de control diluido preparado a partir
de células no infectadas. Las células respondedoras se definieron
como las que tenían más cpm de la media más 3 SD de los 24 cultivos
de control replicados paralelos. La RCF se interpoló en un gráfico
del log del porcentaje de pocillos no respondedores frente al número
de células por pocillo, como el punto al que el 37% de los pocillos
estimulados con antígeno de VZV fueron no respondedores [Henry C, y
col., En Mishell BB, Shiigi SM eds. Selected Methods in Cellular
Immunology. San Francisco: Freeman Press, (1980)]. La RCF se
expresa como el número medio de MNC requeridos para detectar una
célula proliferativa específica de VZV.
En el 2% de los sujetos, las cpm medias en los
pocillos no estimulados que contenían 10^{5} células aumentaron
artefactualmente el porcentaje de pocillos no respondedores. Por lo
tanto, en esta subserie de sujetos, los presentes solicitantes
calcularon la RCF a partir de los puntos de datos a 12.500; 25.000;
y 50.000 células por pocillo. La gran confianza puesta en los
puntos de datos a menores números de células en esos sujetos se
justifica por la mayor linealidad de los puntos de datos.
Para obtener un índice de estimulación a partir
de estos cultivos, se determinó la media aritmética para los
pocillos estimulados y no estimulados, y se expresó como (cpm de
estimulados/cpm de no estimulados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron cultivos de 5 x 10^{5} MNC en 0,5
ml con una dilución 1:20 de antígeno de control o antígeno de VZV.
Después de 5 días, los sobrenadantes se ensayaron con respecto a la
presencia de interferón \gamma por ELISA (Amgen, ABC 3.000;
Thousand Oaks, CA). Los resultados se expresan como unidades
internacionales (UI)/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se intentó aislar VZV a partir de lesiones
cutáneas mediante cultivo en fibroblastos de pulmón embriónico
humano (obtenidos internamente; pasada 10 a 20) después de raspar
las pápulas o vesículas y de frotar vigorosamente la base. El VZV
se identificó por inmunofluorescencia específica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron comparaciones sencillas con
ensayos t de Student a un nivel de significado de 0,05 con ajuste
de Bonferroni cuando fue apropiado. Los efectos del sexo, edad,
dosis de vacuna y número de meses después de la inmunización se
evaluaron por medio de análisis de medidas repetidas [Laird NM, Ware
JH., Diometrics (1982); 38, 963-974; Jennrich R,
Schluchter MD., Biometrics (1986); 42, 805-820].
Para investigar la duración de la inmunidad, se aplicaron modelos
polinomiales inversos usando un análogo no lineal del modelo de
Laird y Ware [Nelder JA., Biometrics (1966): 22,
128-141; Hirst K, y col., Commun. Stat. (1991):
B20].
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizó un total de 202 individuos. La edad
media de los 138 individuos vacunados del sexo femenino fue de 65,8
\pm 7,3; la edad media de los 64 individuos vacunados del sexo
masculino fue de 67,7 \pm 6,5 años. De ocho a 15 sujetos de todas
las categorías de dosificación tenían \geq 80 años de edad.
\newpage
La vacuna generalmente se toleró bien. Menos de
un 25% de los individuos vacunados tuvieron reacciones locales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estas reacciones constaban de eritema,
hinchazón, y/o sensibilidad anormal. La duración media de las
reacciones locales fue de 2,9 días para el eritema, de 2,9 días
para la hinchazón y de 3,6 días para la sensibilidad anormal. Estas
reacciones no fueron más frecuentes ni más severas en los individuos
vacunados que recibieron dosis de refuerzo. Aparecieron
temperaturas mayores de 37ºC en <1% de los individuos
vacunados.
\vskip1.000000\baselineskip
En \leq 4% de los individuos vacunados
aparecieron otros síntomas leves.
\newpage
Once pacientes se quejaron de un exantema en los
40 días posteriores a la vacunación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Dos de estos individuos demostraron tener sólo
reacciones eritematosas locales a la vacuna. Seis individuos
tuvieron exantemas macropapulares que comprendían de 1 a 10 lesiones
que aparecieron de 3 a 5 días después de la inmunización. El VZV se
aisló a partir de sólo uno de los cinco pacientes cuyas lesiones se
ensayaron. Este VZV resultó ser de tipo silvestre por análisis de
enzimas de restricción.
Los niveles de anticuerpos en sujetos de edad
avanzada fueron de un 85% de los del suero de referencia de control
antes de la inmunización. Después de administrar la vacuna de la
varicela, los niveles de anticuerpo fueron significativamente
mayores durante 12 meses (p < 0,001), pero no a los 24 meses
después de la vacunación (p = 0,100). La dosis, el sexo y la edad
no afectaron a esta respuesta. La producción in vitro de
interferón \gamma por células T estimuladas por VZV también fue
significativamente mayor (p < 0,001) a los 3 y 6 meses después
de la inmunización (Fig. 2), pero este efecto se perdió a los 12
meses. Las mayores dosis de vacunas (p = 0,037) y las menores
edades (p = 0,023) se asociaron con mayores respuestas de interferón
\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Para medir la inmunidad mediada por células
contra el antígeno de VZV después de la inmunización de refuerzo,
los MNC de los sujetos se cultivaron usando diferentes números de
células por pocillo. Estos cultivos se analizaron como cultivos de
dilución limitante para obtener una aproximación a la frecuencia de
células T específicas para VZV en la sangre (RCF). Se usó este
enfoque porque los presentes solicitantes preveían que sería más
fácil cuantificar y comparar los puntos de datos durante varios años
de estudio. Antes de recibir la vacuna, los sujetos tenían una RCF
media de 1:68.000 (es decir, una célula de proliferación específica
para VZV por 68.000 MNC de sangre periférica). Este valor aumentó a
1:40:000 a los seis meses después de la vacunación, y permaneció
significativamente por encima de los niveles anteriores a la
inmunización durante 24 meses (Fig. 3) (p \leq 0,001). La
magnitud de la mejora media en RCF probablemente es una
infraestimación, ya que el 33% de los individuos vacunados que
tuvieron menos de una célula respondedora en 100.000 MNC antes de la
vacunación se incluyen en el análisis de los presentes solicitantes
como individuos que tienen una célula respondedora. El valor
absoluto de RCF a los 12 ó 24 meses después de la vacunación no era
una función del sexo, de la dosis administrada o de la edad del
individuo vacunado. Sin embargo, la mejora incremental en RCF (es
decir, la RCF a los 12 ó 24 meses menos la RCF antes de la
vacunación) fue mayor en los individuos mayores (p < 0,05), lo
que refleja la CMI relativamente deficiente (es decir, menor RCF) en
los individuos de mayor edad antes de la inmunización y el hecho de
que todos los individuos vacunados respondedores - -
independientemente de la edad - - consiguieran niveles
similares después de la vacunación. El modelado polinomial inverso
de los datos predijo que se conseguiría una RCF máxima a los 6,34
meses, manteniéndose la mitad de este efecto durante 55,9 meses. La
inmunidad posterior a la vacuna se perdió a una velocidad de 309
\pm 364 células/célula respondedora/mes (límites de confianza del
95% = 0-1,047 células). La RCF se correlacionaba
deficientemente con las respuestas de anticuerpos o de interferón
\gamma.
Se observó que un grupo de individuos vacunados
no tuvo más de 1 RCF/10^{5} MNC en ningún momento después de la
vacunación. Este grupo no respondedor fue similar (del 8 al 20%) en
todos los grupos de edad, excepto para los individuos vacunados de
más de 80 años, entre los que 5 de 8 fueron no respondedores. No
hubo ninguna correlación estadísticamente significativa entre la
edad y la falta de respuesta, ni la falta de respuesta se
correlacionó con la dosis de vacuna administrada.
También se detectó el aumento de inmunidad
contra VZV cuando los datos se expresaron como un índice de
estimulación. Estos resultados se transformaron en logaritmos para
el análisis porque estaban distribuidos logarítmicamente.
Inicialmente, el índice de estimulación medio era de 3,44 (1 SD,
intervalo 1,2-9,9); a los 3 meses era de 4,57
(1,6-12,8); a 1 año era de 4,85
(1,81-13,5) y a los dos años era de 4,58
(1,7-17,1).
\vskip1.000000\baselineskip
En siete pacientes se evaluó la posibilidad de
aparición de herpes zoster (Tabla 4) durante dos años
(correspondiente a 400 pacientes-años de
observación). Los resultados de este análisis se muestran en la
Tabla 4 mostrada a continuación:
Uno produjo VZV en cultivos a partir de lesiones
cutáneas. Otros tres tuvieron presentaciones clínicas compatibles,
de los que dos mostraron mejoría en la RCF en estado convaleciente,
lo que sugería una infección por VZV reciente. Un paciente tuvo una
evaluación inmunológica completa y otros tres no tuvieron evaluación
inmunológica porque sus lesiones no se debían a VZV. Sólo dos casos
sospechosos tuvieron dolor agudo (de 4 días de duración en cada
caso) y ninguno tuvo dolor después de que se curaran las lesiones
(neuralgia post-herpética).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Como el ensayo de VZV en placa requiere mucho
tiempo, no es particularmente susceptible de control en proceso. Un
ELISA de antígeno de VZV rápido permite medir las cantidades de
antígeno de VZV para permitir el control del crecimiento del virus
durante la fabricación de la vacuna de la varicela viva. Además,
este ensayo puede usarse para estimar las cantidades de antígeno de
VZV en vacunas a granel sonicadas y clarificadas, y potencialmente
para medir el antígeno en viales rellenos de vacuna liofilizada. En
resumen, este ensayo se realiza por incubación del antígeno de VZV
procedente de muestras de ensayo con suero anti-VZV
en solución. Se deja que el anticuerpo libre restante se una al
antígeno de VZV inmovilizado en placas de microvaloración ELISA. La
cantidad de anticuerpo capaz de unirse a las placas es inversamente
proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra de
ensayo. La unión de anticuerpos a las placas se cuantifica por
reacción con un anticuerpo unido a enzima
anti-humano y un sustrato apropiado para
proporcionar un producto coloreado que se cuantifica
espectrofotométricamente.
El ELISA de antígeno de VZV y los ensayos de VZV
en placa generalmente deben proporcionar datos correlativos, pero
debe tenerse presente que el ensayo del antígeno de VZV detecta
tanto VZV viables como VZV no viables. El ensayo de antígeno
también es valioso porque proporciona una medición de la carga de
antígeno total que se administra a un receptor de la vacuna de
VZV.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se recubren placas ELISA con glicoproteínas (gps) procedentes de células MRC-5 infectadas por VZV o no infectadas (Ejemplo 3), y éstas se recubren con albúmina de suero bovino al 1% [fracción V, No. A-9647, Sigma], NaN_{3} al 0,1%) para reducir la adsorción no específica de anticuerpos en las placas. Se recubren filas alternas con VZV o con antígeno de control (es decir, las filas A, C, E y G reciben gp de VZV y las filas B, D, F y H reciben antígeno gp de MRC-5 no infectadas).
- 2.
- El antígeno de ensayo clarificado (3250 g-min) se diluye en estabilizante en tubos o microtubos de 12 x 75 mm. Una preparación de antígeno de virus convencional (26 unidades/ml de antígeno de VZV por ensayo dot blot) se diluye a 1:10 y después se diluye en serie 1:1,25 veces para proporcionar concentraciones de antígeno de 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1 y 0,9 unidades/ml. Pueden incluirse diluciones adicionales para proporcionar 0,7 y 0,5 unidades/ml de antígeno. Esta serie de dilución se usa para generar una curva patrón para la medición de las cantidades de antígeno presentes en las muestras de ensayo.
- 3.
- Se diluye suero humano anti-VZV en estabilizante hasta 2 veces la dilución final deseada.
- 4.
- Se distribuyen volúmenes de trescientos \mul de antígeno diluido en microtubos, se mezclan con 300 \mul de suero anti-VZV diluido y se incuban a 35ºC durante 15-22 minutos. El control incluye anti-VZV humano y diluyente (sin antígeno).
- 5.
- Se añaden alícuotas de 100 \mul de cada mezcla de suero-antígeno a 2 pocillos recubiertos con glicoproteína de VZV (gp de VZV) por replicado y 2 pocillos recubiertos con gp de MRC-5 (4 pocillos por muestra) (por ejemplo: la muestra 1 en la columna 1, filas A, B, C y D; muestra 2 en columna 2, filas A, B, C y D; etc.).
- 6.
- Las placas se incuban durante 15 \pm 1 minuto a 35ºC para permitir que el anticuerpo libre (no complejado con el antígeno en solución) se una al antígeno del virus inmovilizado en las placas.
- 7.
- El anticuerpo no unido se retira por lavado y los pocillos reciben una IgG anti-humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina para detectar el anticuerpo humano unido.
- 8.
- Después de la incubación durante 15 \pm 1 minuto a 35ºC, se retira el conjugado no unido por lavado. El conjugado unido se detecta por incubación durante 15 minutos a 35ºC con sustrato de p-nitrofenil fosfato disuelto en tampón de dietanolamina.
- 9.
- Después de terminar la reacción del sustrato por adición de 50 \mul/pocillo de NaOH 3 M, se cuantifica el desarrollo de color (DO a 405 nm) usando un espectrofotómetro de microplacas.
- 1.
- Se calcula el promedio de los valores de DO respectivos replicados para los pocillos recubiertos con MRC-5 y con VZV por replicado. La experiencia ha demostrado que la DO de MRC-5 es constante entre diferentes muestras y diluciones. Por lo tanto, se promedian los valores de MRC-5 para la placa entera y se usan para corregir la unión no específica del anticuerpo primario o el conjugado a extractos de células no infectadas. La DO de MRC-5 promediada se resta de las DO de VZV promediadas respectivas para proporcionar los valores de DO específicos de VZV (\DeltaDO).
- 2.
- Generación de una curva patrón para medir las cantidades de antígeno:
- Los valores de \DeltaDO de la curva patrón se representan contra las concentraciones de antígeno conocidas (unidades de VZV/l). Los datos se introducen en un programa de gráficos apropiado (por ejemplo: Cricket Graph versión 1.3, Cricket Software, Malvern, PA), se identifica la porción lineal de la curva (deberá incluir al menos 4 puntos) y se obtiene la "fórmula de ajuste a una línea" (y = a + bx).
- 3.
- Cálculo de las cantidades de antígeno de las muestras de ensayo: Los valores para a y b se proporcionan por la fórmula de ajuste a una línea, e y (\DeltaDO) es conocido. Entonces, puede calcularse el valor desconocido restante, x, que representa las unidades/ml de antígeno, y corregirse por la dilución de la muestra para obtener la concentración de antígeno de la muestra no diluida. A continuación se proporciona un cálculo general de la muestra:
La concentración de antígeno notificada es la
obtenida con la muestra menos diluida que proporciona un valor de
\DeltaDO dentro de la porción lineal de la curva patrón.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
El procedimiento para ensayar la eficacia de una
vacuna anti-zoster es el siguiente:
- a.
- Se obtiene un valor de pre-vacunación de la frecuencia de células respondedoras a VZV, de anticuerpos anti-VZV y de niveles de células T citotóxicas específicas para VZV a partir de una población de adultos susceptibles a zoster;
- b.
- Una primera población suficientemente grande de adultos susceptibles a VZV se vacuna con una vacuna de VZV viva o inactivada y una segunda población suficientemente grande (control) de adultos similares se vacuna con el diluyente de la vacuna de VZV sin el VZV vivo o inactivado;
- c.
- Se obtiene un valor de post-vacunación para la frecuencia de células respondedoras, anticuerpo anti-VZV y células T citotóxicas específicas para VZV;
- d.
- Los valores obtenidos en (c) se comparan con los valores obtenidos en (a), de tal forma que un aumento de aproximadamente un 30% en la frecuencia de células respondedoras a VZV, un aumento en los anticuerpos específicos para VZV y un aumento en las células T específicas de VZV en los 3 meses siguientes a la vacunación es indicativo de la eficacia de la vacuna anti-VZV.
Claims (6)
1. El uso del virus de la varicela zoster (VZV),
el cual es un virus VZV vivo atenuado o un virus VZV entero
inactivado, para la fabricación de una vacuna para inmunizar a una
persona mayor de cincuenta años que haya tenido varicela o que se
haya vacunado con una vacuna viva contra la varicela, para reducir
la duración o la gravedad de la neuralgia
post-herpética y para mejorar o anular la
reactivación del herpes zoster.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicho VZV es la cepa Oka atenuada.
3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que
dicha inmunización se realiza por vía subcutánea.
4. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que se usan al menos 1.000 unidades
formadoras de placas (PFU) para tal inmunización.
5. El uso de la reivindicación 2, en el que la
cepa Oka del virus de la varicela zoster atenuado se almacena en
estado liofilizado antes de dicha inmunización.
6. El uso de la reivindicación 5, en el que el
virus Oka de la varicela zoster atenuado se reconstituye en estado
liofilizado con agua destilada antes de la inmunización.
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