ES2201129T3

ES2201129T3 - Procedimiento para producir proteinas purificadas del papilomavirus.

Info

Publication number: ES2201129T3
Application number: ES95942431T
Authority: ES
Inventors: Ernest D. Lehman; James C. Cook, Iii; Hugh A. George; Kathryn J. Hofmann; Kathrin U. Jansen; Joseph G. Joyce; Henry Z. Markus; Loren D. Schultz
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1994-11-14
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2015-11-13
Also published as: KR987000420A; NZ298224A; BR9510520A; CN1173203A; HRP950557A2; EP0789767B1; JPH11500002A; WO1996015247A1; UA35639C2; SK281878B6; DE69531308D1; AR004464A1; CZ145297A3; PT789767E; RU2161651C2; MX9703570A; AU4365896A; HUT77559A; DE69531308T2; FI972030A0

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA A PROTEINAS RECOMBINANTES PURIFICADAS DE PAPILLOMAVIRUS (PV) Y A METODOS DE FABRICACION, MEDICION, UTILIZACION Y FORMULACION DE LAS MISMAS.

Description

Procedimiento para producir proteínas purificadas del papilomavirus.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a procedimientos para preparar proteínas recombinantes purificadas del papilomavirus (PV).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un vector de expresión en levaduras bidireccional usado para expresar las proteínas de la cápsida del papilomavirus L1 y/o L2.

La Figura 2 es una microfotografía electrónica de PLV VPH6a L1 expresados en levaduras.

La Figura 3 es una microfotografía electrónica de PLV VPH6a L1/L2 expresados en levaduras.

La Figura 4 es un esquema de la formación de la cepa de S.cerevisiae 1558.

La Figura 5 es un esquema de la formación de la cepa de S.cerevisiae 1569.

La Figura 6 esboza las principales etapas en un procedimiento de purificación.

La Figura 7 es una lista de cepas.

La Figura 8 muestra una serie de análisis en SDS-PAGE de VPH16 L1 + L2 purificados a partir de levaduras. Además de la VLP final purificada, se incluyen subproductos obtenidos en las etapas intermedias del proceso de purificación. La tabla proporciona la identificación de la muestra en cada calle. Se incluyen un gel marcado con Coomassie y técnicas de Western blot que han usado como sondas antisueros frente a las proteínas L1 y L2.

La Figura 9 es un esquema de los procesos de purificación alternativos para el papilomavirus del conejo cola de algodón.

Antecedentes de la invención

Las infecciones por papilomavirus (PV) se producen en una variedad de animales, incluyendo seres humanos, ovejas, perros, gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus infectan las células epiteliales, generalmente induciendo tumores espiteliales o fibroepiteliales benignos en el lugar de la infección. Los PV son especies de agentes infecciosos específicos; un papilomavirus humano no puede infectar a un animal no humano.

Los papilomavirus pueden clasificarse en grupos diferentes en función del hospedador que infectan. Además, los papilomavirus humanos (PVH) se clasifican en más de 70 tipos en función de la homología en la secuencia de ADN. Los tipos PV parecen ser inmunógenos específicos de tipo, de manera que la presencia de una inmunidad neutralizante de la infección por un tipo de papilomavirus no confiere inmunidad frente a otro tipo de papilomavirus.

En los seres humanos, diferentes tipos de PVH causan enfermedades distintas. Los tipos de PVH a, 2, 3, 4, 7, 10 y 26-29 producen verrugas benignas en individuos tanto sanos como inmunodeprimidos. Los tipos de PVH 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50 dan lugar a lesiones planas en individuos inmunodeprimidos. Los tipos de PVH 6, 1, 34, 39, 41-44 y 51-55 producen condilomas no malignos de la mucosa genital o respiratoria. Los tipos de PVH 16, 18, 31, 33, 35, 45 y 58 producen displasia epitelial de la mucosa genital y están asociados con la mayoría de los carcinomas in situ e invasivos del cuello del útero, la vagina, la vulva y el canal anal.

Los papilomavirus son pequeños (50-60nm) virus de ADN, icosaédricos y sin cubierta que codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Los marcos de lectura abierta (ORF) de los genomas víricos se designan de E1 a E7 y L1 y L2, donde "E" indica temprano y "L" indica tardío. L1 y L2 codifican las proteínas de la cápsida del virus. Los genes tempranos (E) están asociados con funciones tales como la replicación del virus y la transformación celular.

La proteína L1 es la principal proteína de la cápsida y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es una proteína de la cápsida secundaria que tiene un peso molecular predicho de 55-60 kDa y un peso molecular aparente de 75-100 kDs, determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteína L2 es interna a la proteína L1. El ORF de L1 está muy conservado entre los diferentes papilomavirus. Las proteínas L2 están menos conservadas entre los distintos papilomavirus.

Los genes L1 y L2 se han identificado como unas buenas dianas para los agentes inmunoprofilácticos. También se ha demostrado que algunos de los genes tempranos son posibles dianas para el desarrollo de vacunas. Mediante estudios en los sistemas del papilomavirus del conejo cola de algodón (PVCR) y del papilomavirus bovino (PVB), se ha demostrado que inmunizaciones con estas proteínas expresadas en bacterias o usando vectores vacunales se protegía a los animales de la infección vírica. La expresión de genes L1 de papilomavirus en sistemas de expresión de baculovirus o usando vectores vacunales resultó en el ensamblaje de partículas similares a virus (VLP) que se han usado para inducir respuestas con títulos elevados de anticuerpos neutralizantes del virus que correlacionan con la protección frente al desafío del virus. Es más, se han usado los genes L1 y L2 para generar vacunas para la prevención y el tratamiento de las infecciones por papilomavirus en animales. Los genes L1 y L2 del PVH tipo 16 se han clonado en un vector vírico vacunal; el vector resultante se usó para infectar células de mamífero CV-1 para producir partículas similares a virus (VLP).

El desarrollo y comercialización de vacunas profilácticas y terapéuticas para la infección y la enfermedad por PV, que contengan proteína L1, proteínas L1 + L2 o proteínas L1 o L1 + L2 modificadas, se ha visto impedido por la falta de cantidades grandes de virus purificado y de proteína purificada.

Dado que el PV no se cultiva con facilidad in vitro, es difícil producir las cantidades necesarias de proteínas L1 y L2 mediante la proliferación in vitro del PV.

Los problemas de suministro resultantes dificultan la caracterización del PV y de las proteínas del PV. Por tanto, sería útil desarrollar una fuente fácilmente renovable de proteínas brutas de PV, especialmente de las proteínas de PV L1 y L2 o de proteínas L1 y L2 modificadas. También sería útil desarrollar procedimientos para purificar cantidades grandes de proteínas brutas de papilomavirus hasta alcanzar unos niveles de pureza adecuados para estudios inmunológicos y desarrollo de vacunas. Asimismo, sería de utilidad producir grandes cantidades de proteínas de papilomavirus con las propiedades para conferir inmunidad de las proteínas nativas, tales como la configuración de la proteína nativa. Además, sería útil desarrollar procedimientos de análisis de las proteínas de PV y procedimientos para determinar la pureza relativa de las proteínas así como de las composiciones que contienen las proteínas. Dichas proteínas altamente purificadas también serían útiles para preparar una variedad de reactivos útiles en el estudio de la infección por PV; tales reactivos incluyen, pero no se limitan a ellos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y estándar analíticos. R.C. Rose y cols. en J. Virol. 67: 1936-1944 (1993), describen la purificación de proteínas L1 de PVH en dos etapas cromatográficas consecutivas.

La presente invención está dirigida a las proteínas de PV L1 y L2 altamente purificadas. La invención también comprende procedimientos mediante los cuales se producen y purifican proteínas de papilomavirus con las propiedades que confieren inmunidad de las proteínas nativas de papilomavirus. La presente invención está dirigida a la producción de vacunas profilácticas y terapéuticas para tratar la infección por papilomavirus. Las proteínas recombinantes de la presente invención son capaces de formar partículas similares a virus. Esta VLP son inmunogénicas e impiden la formación de verrugas en un modelo animal. La invención se ilustra con proteínas L1 y L1 + L2 recombinantes derivadas de levadura del papilomavirus de conejo de cola de algodón (PVCR) de PVH tipo 6 (subtipo 6a) y PVH tipo 16 como sistemas modelo. La purificación y los procedimientos analíticos de la presente solicitud pueden adaptarse para otros tipos de PVH, otras proteínas de PVH y otros sistemas de expresión recombinante.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a proteínas de papilomavirus (PV) recombinantes purificadas y a procedimientos para preparar, medir, usar y formularlas mismas.

Descripción detallada de la invención

Un procedimiento para producir una proteína purificada de la cápsida de papilomavirus, que comprende:

(a) transformar una levadura hospedador con una molécula de ADN recombinante, codificando la molécula de ADN recombinante una proteína seleccionada de entre la proteína L1 de papilomavirus y de las proteínas L1 + L2 de papilomavirus;

(b) cultivar el hospedador transformado en condiciones que permitan la expresión de la molécula de ADN recombinante para producir una proteína bruta recombinante de papilomavirus; y

(c) purificar la proteína de papilomavirus recombinante mediante una única etapa de cromatografía usando una cromatografía de intercambio iónico para producir la proteína purificada, teniendo dicha proteína una pureza de al menos 90%.

Se han generado L1 y L2 recombinantes derivadas de bacterias procedentes del papilomavirus bovino. A niveles bajos, se produjeron reacciones cruzadas de suero neutralizante de las proteínas recombinantes bacterianas con el virus nativo, presumiblemente a causa de las diferentes configuraciones de las proteínas nativas y de las proteínas derivadas de bacterias.

Se han usado baculovirus recombinantes que expresan ORF de PVH16L1 o PVH16L2 para infectar células de insecto SF9 y producir proteína L1 y L2. Las análisis transferencia Western mostraron que las proteínas L1 y L2 derivadas de los baculovirus reaccionaban con anticuerpos frente al PVH 16. La L1 derivada de baculovirus forma VLP.

Se ha informado acerca de la producción de proteínas brutas PVH16L1 y PVH16L2 mediante cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae. Las proteínas se produjeron como formas intracelulares y como productos de secreción. En el caso de expresión intracelular de las proteínas, se descubrió que la mayor parte de la proteína era insoluble al producirse la lisis de las células en ausencia e reactivos desnaturalizantes. No se comunicó la pureza de estas proteínas.

Se ha demostrado que las proteínas recombinantes secretadas por la levadura contienen hidratos de carbono derivados de la levadura. La presencia de estos oligosacáridos unidos por N puede enmascarar los epítopos nativos. Además, las proteínas recombinantes secretadas pueden contener otras modificaciones, como por ejemplo retener la secuencia líder de secreción. Asimismo, el proceso de secreción puede ser menos eficiente.

El desarrollo y comercialización de vacunas profilácticas y terapéuticas para la infección y la enfermedad por PV, que contengan proteína L1, proteínas L1 + L2 o proteínas L1 o L1 + L2 modificadas, se ha visto impedido por la falta de cantidades grandes de virus purificado y de proteína purificada. Dado que el PV no se cultiva con facilidad in vitro, es difícil producir las cantidades necesarias de proteínas L1 y L2 mediante la proliferación in vitro del PV. Las dificultades asociadas con el cultivo in vitro del PV también dan lugar a dificultades en la caracterización química, inmunológica y biológica del PV y de las proteínas de PV. Por tanto, sería útil fuente fácilmente renovable de proteínas brutas de PV, especialmente de las proteínas de PV L1 y L2 o de proteínas L1 y L2 modificadas. También sería útil desarrollar procedimientos para purificar cantidades grandes de proteínas brutas de papilomavirus hasta alcanzar unos niveles de pureza adecuados para estudios inmunológicos y desarrollo de vacunas. Asimismo, sería de utilidad producir grandes cantidades de proteínas de papilomavirus con las propiedades para conferir inmunidad de las proteínas nativas, tales como la configuración de la proteína nativa. Además, sería útil desarrollar procedimientos de análisis de las proteínas de PV y procedimientos para determinar la pureza relativa de las proteínas así como de las composiciones que contienen las proteínas. Dichas proteínas altamente purificadas también serían útiles para preparar una variedad de reactivos útiles en el estudio de la infección por PV; tales reactivos incluyen, pero no se limitan a ellos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y estándar analíticos.

Pueden formularse composiciones farmacéuticamente útiles que comprendan el ADN o las proteínas codificadas por el ADN según procedimientos conocidos, como por ejemplo mezclando un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el Remington's Pharmaceutical Sciences pueden encontrarse ejemplos de dichos vehículos y procedimientos de formulación. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para su administración eficaz, tales composiciones deben contener una cantidad eficaz de la proteína o de la VLP. Dichas composiciones pueden contener proteínas o VLP derivadas de más de un tipo de PVH.

Las composiciones terapéuticas o diagnósticas se administran a un individuo en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar las infecciones por PV. La cantidad eficaz puede variar en función de una serie de factores tales como el estado de salud del individuo, el peso, el sexo y la edad. Entre otros factores se incluye el modo de administración. Generalmente, las composiciones se administrarán en dosis variables desde aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 1 mg.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al individuo mediante una serie de vías, tales como subcutánea, tópica, oral, mucosa, intravenosa e intramuscular.

Las vacunas comprenden ADN, ARN o proteínas codificadas por el ADN, que contienen los determinantes antigénicos necesarios para inducir la formación en el individuo de anticuerpos neutralizantes. Asimismo, tales vacunas son lo bastante seguras como para administrarlas sin peligro de producir infección clínica; no provocan efectos secundarios tóxicos; pueden administrarse a través de una vía eficaz; son estables y son compatibles con los portadores de vacunas.

Las vacunas pueden administrarse mediante una serie de vías, tales como oral, parenteral, subcutánea, mucosal, intravenosa o intramuscular. La dosis administrada puede variar con el estado de salud, el peso, el sexo y la edad del individuo; la vía de administración y el tipo de PV de la vacuna. La vacuna puede usarse en formas de dosificación tales como cápsulas, suspensiones, elixires y soluciones líquidas. La vacuna puede formularse con un vehículo inmunológicamente aceptable.

Las vacunas se administran en cantidades terapéuticamente eficaces, es decir, en las cantidades suficientes para generar una respuesta inmunológica de protección. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar según el tipo de PV. La vacuna puede administrarse en una o varias dosis.

Las proteínas purificadas de la presente invención se pueden usar en la formulación de composiciones inmunogénicas. Tales composiciones, cuando se introducen en un hospedador adecuado, son capaces de inducir una respuesta inmunológica en el hospedador.

Por tanto, las proteínas purificadas de la invención pueden usarse para generar anticuerpos. El término "anticuerpo", como se usa en la presente invención, incluye anticuerpos tanto monoclonales como policlonales, así como fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab)2, que son capaces de unir antígenos o haptenos.

Las proteínas y derivados de proteínas de la presente invención pueden usarse para determinar el serotipo de la infección por PVH y para detectar de forma selectiva el PVH. Las proteínas purificadas, las VLP y los anticuerpos son útiles para la formulación de kits adecuados para detectar y determinar el serotipo de PVH. Tal kit debe comprender un contenedor dividido en compartimentos para mantener en confinamiento estricto al menos un vial. Además, el contenedor puede comprender reactivos tales como proteínas L1 o L2 de PVH6a o VPL o anticuerpos anti-PVH6a o proteínas recombinantes L1 o L2 de PVH16 o VLP o anticuerpos anti-PVH16, adecuados para detectar una variedad de tipos de PVH. El vehículo puede también contener medios para la detección, como por ejemplo antígeno marcado o sustratos enzimáticos o similares.

Las proteínas purificadas también son útiles como patrones inmunológicos, marcadores de peso molecular y marcadores de tamaño molecular.

Dado que el código genético es degenerativo, pueden usarse más de un codón para codificar un determinado aminoácido y, por tanto, la secuencia de aminoácidos puede estar codificada por cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos de ADN similar. Sólo un miembro del conjunto será idéntico a las secuencias de PVH6a o de PVH 16, aunque, en las condiciones adecuadas, será capaz de hibridar con ADN de PVH6a o PVH 16 incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con falta de apareamiento entre las bases. En condiciones alternativas, los oligonucleótidos de ADN con falta de apareamiento todavía pueden hibridar con ADN de PVH6a o de PVH16 para permitir la identificación y aislado del ADN codificante de PVH6a o de PVH16.

El ADN purificado de PVH6a o de PVH16 de la invención puede usarse par aislar y purificar homólogos y fragmentos de PVH6a procedente de otras fuentes. Para conseguir esto, el primer ADN de PVH6a puede mezclarse con una muestra que contenga el ADN codificante de homólogos de PVH6a, en condiciones adecuadas para la hibridación. El complejo de ADN hibridado puede ser aislado, a partir del cual se puede purificar el ADN que codifica el ADN homólogo.

Se sabe que en los diversos codones que codifican aminoácidos específicos hay una cantidad sustancial de redundancia. Por tanto, esta invención también está dirigida a aquellas secuencias de ADN que contienen codones alternativos que codifican la traducción final del aminoácido idéntico. Para los propósitos de esta descripción, como una variación degenerada se definirá una secuencia que lleve uno o más codones reemplazados. También se incluyen mutaciones en la secuencia de ADN o en la proteína traducida que no alteran demasiado las propiedades físicas finales de la proteína expresada. Por ejemplo, la sustitución de valina por leucina, de arginina por lisina o de asparagina por glutamina pueden no producir un cambio en la funcionalidad del polipéptido.

Se sabe que las secuencias de ADN que codifican un péptido pueden alterarse de forma que codifiquen un péptido con propiedades distintas de aquéllas que posee el péptido natural. Entre los procedimientos que alteran las secuencias de ADN se incluye, pero no se limitan a ella, la mutagénesis dirigida.

Para la clonación molecular de ADN de PVH6a se puede usar una variedad de procedimientos conocidos en la materia. Entre estos procedimientos se incluye, pero no se limita a, expresión funcional directa de los genes de PVH6a tras la creación de un ADNc que contenga el ADN de PVH6a o de una genoteca de ADN en un sistema de vector de expresión adecuado. Otro procedimiento consiste en detectar el ADNc que contiene ADN de PVH6a o la genoteca de ADN construidos en un bacteriófago o en un plásmido vector de transferencia, con una sonda oligonucleotídica marcada diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos del PVH6a. Otro procedimiento consiste en la detección del ADNc que contiene ADN de PVH6a o la genoteca de ADN construidos en un bacteriófago o en un plásmido vector de transferencia, con un ADN parcial codificante del PVH6a. Este ADN parcial se obtiene por amplificación específica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de fragmentos de ADN de PVH6a a través del diseño de oligonucleótidos degenerados como cebadores a partir de la secuencia de aminoácidos de PVH6a purificado. Otro procedimiento es aislar ARN a partir de células productoras de PVH6a y traducir el ARN en proteínas a través de un sistema de traducción in vitro o in vivo. La traducción del ARN en un péptido o una proteína dará lugar a la producción de al menos una porción proteica de PVH6a que puede identificarse mediante, por ejemplo, la actividad de la proteína de PVH6a o mediante reactividad inmunológica con un anticuerpo frente a PVH6a. En este procedimiento, se pueden analizar acúmulos de ARN aislado de células productoras de PVH6a para detectar la presencia de un ARN que codifica al menos una porción de PVH6a. Posteriormente, se pueden fraccionar los acúmulos de ARN para purificar el ARN de PVH6a del ARN no perteneciente al PVH6a. El péptido o la proteína producidos mediante este procedimiento pueden analizarse para crear secuencias de aminoácidos que a su vez se usan para proporcionar cebadores que produzcan ADNc de PVH6a, o el ARN usado para la traducción puede analizarse para proporcionar secuencias de nucleótidos que codifican PVH6a y producir sondas para la detección de una genoteca de ADNc de PVH6a. Estos procedimientos son conocidos en la materia y se pueden encontrar en, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Para aquellos expertos en la materia, es evidente que otros tipos de bibliotecas, así como bibliotecas construidas a partir de otras células o tipos celulares. pueden ser útiles para aislar ADN codificante de PVH6a. Otros tipos de bibliotecas incluyen, pero no se limitan a, genotecas de ADNc derivadas de otras células o líneas celulares que contienen PVH tipo 6a y genotecas de ADN.

La preparación de genotecas de ADN se puede realizar mediante técnicas estándar bien conocidas en la materia. Las técnicas de construcción de genotecas de ADNc se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook, J. y cols., supra. Para aquéllos expertos en la materia es evidente que el ADN que codifica PVH6a puede también aislarse a partir de una genoteca de ADN adecuada. La construcción de genotecas de ADN se puede realizar mediante técnicas estándar conocidas en la materia. Las técnicas de construcción de genotecas de ADN se pueden encontrar en Sambrook, J., y cols., supra.

El ADN clonado de PVH6a o fragmentos del mismo obtenidos mediante los procedimientos descritos en la presente invención pueden expresarse de forma recombinante mediante clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción adecuados, y transferirse a células hospedadoras eucarióticas para producir PVH6a recombinante. Las técnicas para tales manipulaciones se describen completamente en Sambrook, J., y cols., supra, y son conocidas en la materia.

Un vector de expresión adecuadamente construido debe contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en las células hospedadoras, marcadores seleccionables, un número limitado de útiles sitios de actuación para las enzimas de restricción, capacidad para realizar un elevado número de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige la unión de la ARN polimerasa al ADN e inicia la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es aquél que provoca la iniciación de los ARNm a frecuencia elevada. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no están limitados a ellos, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos específicamente diseñados o virus.

Como vectores de expresión se puede usar una serie de células fúngicas para expresar PVH6a o fragmentos del mismo en células fúngicas. Entre las células fúngicas vectores de expresión disponibles en el mercado que pueden ser adecuadas para la expresión de PVH6a recombinante se incluyen, pero no se limitan a ellas, pYES2 (Invitrogen), vector de expresión Pichia (Invitrogen).

El vector de expresión puede ser introducido en las células hospedadoras a través de una cualquiera de las técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, transformación, transfección, lipofección, fusión de protoplastos y electroporación. Las células que contienen el vector de expresión se propagan clonalmente y se analizan de forma individual para determinar si producen proteína de PVH6a. La identificación de clones de células hospedadoras que expresan PVH6a puede realizarse mediante diversos medios, incluyendo pero no limitándose, reactividad inmunológica con anticuerpos anti-PVH6a, y la presencia de actividad PVH6a asociada con la célula hospedadora, como por ejemplo unión de ligando específico de PVH6a o transducción de señal definida como una respuesta mediada por la interacción de ligandos específicos de PCH6a con el PVH6a.

La expresión de fragmentos de ADN de PVH también se puede llevar a cabo usando ARNm sintético producido in vitro o ARNm nativo. ARNm sintético o ARNm aislado de células productoras de PVH6a pueden traducirse de forma eficaz en diversos sistemas acelulares, incluyendo pero no limitados a, extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como también se pueden traducir eficazmente en sistemas basados en células, incluyendo pero no limitados a, microinyección en oocitos de rana, siendo la microinyección en oocitos de rana el sistema preferido.

Ras la expresión de proteínas de PVH6a en una célula hospedadora, la proteína de PVH6a se recupera para proporcionar el PVH6a en una forma purificada.

Para los expertos en la materia resultará evidente que los procedimientos para producir anticuerpos monoespecíficos pueden usarse para crear anticuerpos específicos de fragmentos polipeptídicos de PVH o polipéptidos nacientes de PVH de longitud completa. Específicamente, resultará evidente para los expertos en la materia que pueden generarse anticuerpos monoespecíficos, específicos de proteínas de PVH completamente funcionales o de fragmentos de las mismas.

Se describen procedimientos para la detección de compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN codificante de PVH, así como la función o funciones de una proteína o proteínas de PVH6a in vivo. Los compuestos que modulan estas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas o moléculas orgánicas no proteínicas. Los compuestos pueden modular a través del aumento o atenuación de la expresión de ADN o ARN codificante de PVH6a o de la función de proteína de PVH6a. Los compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN codificante de PVH6a o de la función de proteína de PVH6a pueden detectarse mediante una serie de ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo de "sí/no" para determinar si hay un cambio en la expresión o en la función. El ensayo puede ser cuantitativo, comparando la expresión o la función de una muestra de prueba con los niveles de expresión o de función en una muestra estándar.

Pueden prepararse kits que contienen ADN de PVH6a, fragmentos de ADN de PVH6a, anticuerpos frente al ADN de PVH6a o a proteínas de PVH6a, ARN de PVH6a o proteínas de PVH6a. Tales kits se usan para detectar en una muestra ADN que hibrida con ADN de PVH6a o para detectar la presencia de proteína o proteínas de PVH6a o de fragmentos peptídicos. Dicha caracterización es útil para una variedad de propósitos que incluyen, pero no se limitan a, análisis forenses y estudios epidemiológicos.

Las secuencias nucleotídicas complementarias a la secuencia de ADN codificante del PVH6a pueden sintetizarse para tratamiento antisentido. Estas moléculas antisentido pueden ser ADN, derivados estables de ADN tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, ARN, derivados estables de ARN tales como 2'-O-alquilARN, u otros imitadores de oligonucleótidos antisentido de PVH6a. Las moléculas antisentido de PVH6a pueden introducirse en células mediante microinyección, encapsulación en liposomas o mediante la expresión de vectores que contienen la secuencia antisentido. La terapia antisentido con PVH6a puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que la reducción de la actividad de PVH6a es beneficiosa.

El término "derivado químico" describe una molécula que contienen fracciones químicas adicionales que normalmente no forman parte de la molécula inicial. Tales fracciones pueden mejorar la solubilidad, la semivida, la absorción etc. de la molécula inicial. Ejemplos de dichas fracciones se describen en una variedad de textos, tales como el
Remington's Pharmaceutical Sciences.

Los compuestos identificados según los procedimientos descritos en la presente invención pueden usarse solos, a las dosis adecuadas definidas por las pruebas rutinarias para obtener la inhibición óptima del PVH6a o de su actividad al tiempo que se minimiza cualquier posible toxicidad. Además, puede ser deseable la administración simultánea o la administración secuencial de otros agentes.

De forma ventajosa, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en una única dosis diaria, o la dosis total diaria puede administrarse de varias dosis divididas. Es más, los compuestos de la presente invención pueden administrarse mediante una variedad de rutas, incluyendo pero no limitándose a, las vías intranasal, transdérmica, mediante supositorios, por vía oral y similares.

Respecto a la politerapia con más de un agente activo, donde los agentes activos se encuentran en formulaciones de dosificación distintas, los agentes activos pueden administrarse de forma simultánea o cada uno de ellos puede administrarse a distintos tiempos escalonados.

El régimen de dosificación que usa los compuestos de la presente invención se selecciona según una serie de factores, incluyendo el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y la enfermedad del paciente; la gravedad de la enfermedad a tratar; la vía de administración; la función hepática y renal del paciente; y el compuesto concreto empleado. Un médico de capacidad normal puede fácilmente determinar y prescribir la cantidad eficaz del fármaco requerido para impedir, frenar o detener el progreso de la enfermedad. La precisión óptima en la consecución de unas concentraciones del fármaco que se encuentren dentro del intervalo que produce eficacia sin toxicidad, requiere un régimen basado en la cinética de la disponibilidad del fármaco para dirigirse a los sitios. Esto implica considerar la distribución, el equilibrio y la eliminación de un fármaco.

En los procedimientos de ña presente invención, los compuestos aquí descritos con detalle pueden formar el principio activo y típicamente se administran mezclados con diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticos adecuados (denominados conjuntamente en la presente invención materiales "transportadores"), adecuadamente seleccionados respecto de la forma de administración deseada, es decir, comprimidos orales, cápsulas, elixires, jarabe, supositorios, geles y similares, y consistentes con la práctica farmacéutica convencional.

Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula, el componente activo del fármaco puede combinarse con un vehículo oral inerte, atóxico, farmacéuticamente aceptable, como por ejemplo, etanol, glicerol, agua y similares. Además, siempre que se desee o sea necesario, se pueden incorporar a la mezcla ligantes, lubricantes, agentes desintegrantes y colorantes adecuados. Entre los ligantes adecuados se incluyen, sin limitaciones, almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas como goma arábiga, goma tragacanto o alginato sódico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen, sin limitaciones, oleato sódico, estearato sódico, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato sódico, cloruro sódico y similares. Entre los desintegrantes se incluyen, sin limitaciones, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma de xantano y similares.

Para las formas líquidas, el componente activo del fármaco se puede combinar con agentes de dispersión o de suspensión adecuadamente saborizados, tales como gomas naturales y sintéticas, por ejemplo, tragacanto, goma arábiga, metilcelulosa y similares. Otros agentes de dispersión que se pueden usar incluyen glicerina y similares. Para la administración parenteral, son deseables las soluciones y las suspensiones estériles. Cuando se desea la administración intravenosa, se emplean preparaciones isotónicas que generalmente contienen conservantes adecuados.

Preparaciones tópicas que contienen el componente activo del fármaco se pueden mezclar con una variedad de materiales transportadores bien conocidos en la materia, tales como, por ejemplo, alcoholes, gel de aloe vera, alantoína, glicerina, vitaminas A y E, aceites, aceite mineral, propionato de miristilo PPG2 y similares, para formar, por ejemplo, soluciones alcohólicas, limpiadores tópicos, cremas de limpieza, geles cutáneos, lociones cutáneas y champúes en forma de crema o de gel.

Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse en forma de sistemas de liberación liposomal, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de una variedad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

Los compuestos de la presente invención también pueden ser liberados mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los que se acoplan las moléculas del compuesto. Los compuestos de la presente invención también pueden acoplarse a polímeros solubles como vehículos de fármacos capaces de ser dirigidos. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacril-amidafenol, polihidroxietilaspartamidafenol o polietil-eneoxidepolilisina sustituida con residuos de palmitoílo. Además, los compuestos de la presente invención pueden acoplarse a un tipo de polímeros biodegradables útiles en la consecución de la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo ácido poliláctico, poliepsilon caprolactona, ácido polohidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidro piranos, policianoacrilatos y copolímeros en bloque, anfipáticos o entrecruzados, de hidrogeles

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin, sin embargo, limitar la misma.

Ejemplo 1 Preparación de la cepa de levadura u9

La cepa de Saccharomyces cerevisiae 2150-2-3 (MATalpha, leu2-04, adel, cirº) se obtuvo del Dr. Leland Hartwell (Universidad de Washington, Seattle, WA). Las células de la cepa 2150-2-3 se incubaron durante toda la noche a 30ºC en 5 ml de medio YEHD (Carty y cols., J. Ind. Micro 2 (1987) 117-121). Las células se lavaron 3 veces con agua destilada estéril, se resuspendieron en 2 ml de agua destilada estéril y 0,1 ml de la suspensión celular se introdujeron en placas, en seis placas con ácido 5-fluoroorótico (FOA), para seleccionar los mutantes ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Las placas se incubaron a 30ºC. El medio contenía, por cada 250 ml de agua destilada: 3,5 g de Difco Yeast Nitrogen Base sin aminoácidos y sulfato amónico; 0,5 g de ácido 5-fluoroorótico; 25 mg de uracilo; y 10,0 g de dextrosa.

El medio se esterilizó mediante filtración a través de membranas de 0,2 \mum y a continuación se mezcló con 250 ml de Bacto-Agar al 4% (Difco) mantenido a 50ºC, 10 ml de una solución de adenina de 1,2 mg/ml y 5 ml de una solución de L-leucina (180 mg/50 ml). El medio resultante se dispensó en una cantidad de 210 ml por placa petri.

Después de 5 días de incubación, habían aparecido numerosas colonias. Se aislaron colonias únicas raspando colonias de las placas con FOA iniciales e introduciéndolas en las placas con FOA recién formadas, para a continuación incubarlas a 30ºC. En una serie de colonias procedentes del segundo conjunto de placas con FOA se realizaron pruebas para determinar la presencia de la mutación ura3 haciendo copias de las placas en placas con medio YEHD y placas carentes de uracilo. El resultado deseado era un buen crecimiento en las placas con YEHD y ausencia de crecimiento en las placas sin uracilo. Se obtuvo un aislado (U9) con estas propiedades. Se guardó como reserva de glicerol congelado (cepa nº325) a -70ºC para su uso posterior.

Ejemplo 2 Preparación de un vector para romper el gen de la Levadura MNN9

Para preparar un vector para la ruptura del gen MNN9, en primer lugar era necesario clonar el gen MNN9 a partir del ADN genómico de S. cerevisiae. Esto se consiguió mediante la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa estándar (PCR). En base a la secuencia publicada del gen MNN9 de levadura (Zymogenetics: solicitud de patente EPO nº 88117834.7, publicación nº 0-314-096-A2) se diseñaron un cebador 5'en dirección de la lectura y un cebador 3' antisentido para la PCR de toda la longitud de la secuencia codificante del MNN9. Como cebadores se usaron los siguientes oligodesoxinucleótidos que contenían sitios de restricción flanqueantes HindIII (subrayados):

cebador en sentido: 5'CTT AAA GCT T AT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3'

cebador antisentido: 5'TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3'

El codón de metionina iniciador para el gen MNN9 se destaca en negrita. La PCR se realizó usando como cebador ADN genómico de la cepa de S.cerevisiae JRY188 (Rine y cols.), Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer) y 25 ciclos de amplificación (94ºC 1 min, 37ºC 2 min, 72ºC 3 min). El fragmento resultante de la PCR de 1,2 kpb se sometió a digestión con HindIII, se purificó en gel y se ligó con pUC13(Pharmacia) digerido con HindIII y tratado con fosfatasa alcalina. El plásmido resultante se designó p1183.

Para romper el gen MNN9 con el gen de levadura URA3, el plásmido pBR322-URA3 (que contiene el fragmento de 1,1 kpb resultante de la digestión con HindIII que codifica el gen URA3 de S. cerevisiae subclonado en el sitio HindIII de pBR322), se digirió con HindIII y el fragmento de 1,1 kpb de ADN que lleva el gen funcional URA3 se purificó en gel, se sometió a procedimientos para enromar sus extremos con la ADN polimerasa T4 y se ligó con el plásmido digerido con PmII p1183 (PmII corta dentro de la secuencia codificante de MNN)). El plásmido resultante, p1199, contiene una fragmentación en el gen MNN9 por el gen funcional URA3.

Ejemplo 3 Construcción de la cepa 1372 derivada de u9 con una fragmentación en el gen MNN9

Para la fragmentación del gen MNN9 en la cepa U9 (nº325), se digirieron 30 \mug del plásmido p1199 con HindIII para crear un módulo lineal de ruptura mnn9::URA3. Las células de la cepa 325 sufrieron un proceso de transformación con el ADN del plásmido p1199 digerido con HindIII mediante el método del esferoplasto (Hinnen y cols., 1978, Proc. Natl. acad. Sci. USA 75:1929-1933) y los transformantes se seleccionaron en un medio de agar sintético sin uracilo y con sorbitol 1,0 M. El medio sintético contenía, por litro de agua destilada: agar, 20 g; fuente de nitrógeno para levadura sin aminoácidos, 6,7 g; adenina, 0,04 g; L-tirosina, 0.05 g; sorbitol, 182 g; glucosa, 20 g; y "Leucine Minus Solution #2", 10 ml. La "Leucine Minus Solution #2"contiene por litro de agua destilada: L-arginina, 2g; L-histidina, 1 g; L-Leucina, 6g; L-isoleucina, 6 g; L-lisina, 4g; L-metionina, 1 g; L-fenilalanina, 6 g; L-treonina, 6 g; L-triptófano, 4 g.

Las placas fueron incubadas a 30ºC durante cinco días al final de los cuales habían aparecido numerosas colonias. Se hicieron preparaciones de ADN cromosómico de 10 colonias y se pusieron en digestión con EcoRI y HindIII. Los digeridos de ADN fueron evaluados con Southern blots (J. Sambrook y col. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) utilizando el fragmento de 1,2 kpb resultado de la digestión por la HindIII que contiene al gen MNN9 (aislado del plásmido p1199) como sonda. Se identificó un aislado (cepa número 1372) que mostraba las desviaciones de banda del ADN en el Southern blot, así como la aglutinación acentuada típica mostrada por los mutantes del mnn9.

Ejemplo 4 Construcción de un vector para romper el gen de levadura HIS3

Para construir un módulo de fragmentación en el que el gen URA3 rompe el gen HIS3 de S. cerevisiae, el plásmido YEp6 se sometió a digestión con BamHI (K. Struhl y cols., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76:1035) y el fragmento que contenía el gen HIS3 se purificó en gel, se enromaron sus extremos con la ADN polimerasa T4 y se ligó con pUC18 previamente digerido con BamHI y tratado con la ADN polimerasa T4. El plásmido resultante (denominado pp1501 o pUC18-HIS3) se digirió con NheI (que corta en la secuencia codificante HIS3) y el fragmento del vector se purificó en gel, se enromaron sus extremos con la ADN polimerasa T4 y, a continuación, se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. El gen URA3 se aisló del plásmido pBR322-URA3 mediante digestión con HindI y el fragmento de 1,1 kpb que contiene el gen URA3 se purificó, se enromaron sus extremos con la ADN polimerasa T4 y se ligó con el fragmento NheI mencionado pUC18-HIS3. El plásmido resultante (denominado pUC18-his3::URA3 o p1505)contiene un módulo de fragmentación en el que el gen URA3 funcional produce la fragmentación del gen HIS3 de levadura.

Ejemplo 5 Construcción de un vector para la fragmentación de un gen de levadura PRB1 por el gen HIS3

El plásmido FP8\DeltaH que contiene el gen de S.cerevisiae PRBI fue suministrado por el Dr. E. Jones de la Carnegie-Mellon Univ. (C. M. Moehle y cols., 1987, Genetics 115: 255-263). Este plásmido se digirió con HindI XhoI y el fragmento de ADN de 3,2 kpb que contenía el gen PRB1 se purificó en gel y se convirtieron sus extremos en romos mediante tratamiento con la ADN polimerasa T4. El plásmido pUC18 se digirió con BamHI, se sometió a purificación en gel y se enromaron sus extremos con la ADN polimerasa T4. El fragmento del vector resultante se ligó con el fragmento del gen PRB1 mencionado anteriormente para dar lugar al plásmido pUC18-PRB1. El plásmido Yep6, que contiene el gen HIS3, se digirió con BamHI. El fragmento BamHI de 1,7 kpb resultante que contiene el gen funcional HIS3 se sometió a purificación en gel y después se enromaron sus extremos mediante tratamiento con la ADN polimerasa T4. El plásmido pUC18-PRB1 se digirió con EcoRV y Ncol, que cortan dentro de la secuencia codificante de PRB1 y eliminan el sitio activo de la proteasa B y la secuencia adyacente. El fragmento de 5,7 kpb EcoRV-Ncol que contiene las porciones 5' y 3' residuales de la secuencia codificante de PRB1 en pUC18 se sometieron a purificación en gel, se enromaron sus extremos mediante tratamiento son la ADN polimerasa T4, se desfosforiló con fosfatasa alcalina de intestino de ternero y se ligó con el fragmento de extremos romos HIS3 descrito anteriormente. El plásmido resultante (denominado pUC18-prb1::HIS3, cepa nº 1245) contiene el gen HIS3 funcional en el lugar de la porción del gen PRB1 que se había delecionado antes.

Ejemplo 6 Construcción de una cepa de levadura relacionada con U9 que contiene fragmentaciones en los genes MNN9 y PRB1

La cepa 1372 relacionada con U9, que contiene una fragmentación en el gen MNN9 se describió en el Ejemplo 3. Se introdujeron aislados clonales de la cepa 1372 en placas FOA (como se describe en el Ejemplo 1) para seleccionar los mutantes ura3. Se obtuvieron numerosos aislados ura3 de la cepa 1372 y se seleccionó un aislado concreto (cepa 12930-190-S1-a) para la posterior fragmentación del gen HIS3. El vector de fragmentación del gen pUC18-his3::URA3 (p1505) se digirió con XbaI y EcoRI para generar un módulo de fragmentación lineal his3::URA3 y se usó para transformar la cepa 12930-190-S1-1 mediante el método de acetato de litio (Methods in Enzymology, 194:290(1991). Los transformantes Ura+ se seleccionaron en medio de agar sintético sin uracilo, se sembraron de nuevo en el mismo medio para detectar los aislados clonales y se volvieron a cultivar en otras placas en un medio sin uracilo o histidina para detectar los aislados que eran Ura+ y His-. Se seleccionó un aislado (cepa 12930-230-1) para la posterior fragmentación del gen PRB1. El vector de fragmentación del gen PRB1 (pUC18-prb1::HIS3, cepa nº 1245) se digirió con SacI y XbaI para generar un módulo de fragmentación lineal prbl::HIS3 y se usó para transformar la cepa 12930-230-1 mediante el método de acetato de litio. Los transformantes His+ se seleccionaron en medio agar sintético sin histidina y se volvieron a sembrar en el mismo medio para detectar los aislados clonales. El ADN genómico se preparó a partir de una serie de los aislados His+ resultantes, se digirió con EcoRI y se sometió a una electroforesis en geles de agarosa al 0,8%. A continuación se realizaron análisis Southern Blot usando una sonda de 617 pb marcada con radioisótopos para el gen PRB1 que había sido preparada mediante PCR usando como cebadores los siguientes oligodesoxinucleótidos:

5'TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3'

5'CAC CGT AGT GTT TGG AAG GCA 3'

Se obtuvieron once aislados que mostraban la esperada hibridación de la sonda con un fragmento de ADN de 2,44 kpb prbl::HIS3. Esto contrastaba con la hibridación de la sonda con el fragmento de 1,59 kpb del gen PRB1 salvaje. Uno de estos aislados que contienen la fragmentación prb1::HIS3 deseada se seleccionó ara su uso posterior y se denominó cepa número 1558.

Ejemplo 7 Construcción de un vector para la fragmentación del gen de levadura PEP4

El gen PEP4 de S.cerevisiae se clonó a partir de una genoteca de la siguiente forma. Las células E.coli que contienen la genoteca de levaduras pLS101 (Schultz y Friesen, 1983, J. Bacteriol. 155: 8-14)) se reprodujeron durante la noche en 5 ml de medio LB con 100 \mug/ml de ampicilina. De este cultivo se realizaron diluciones 10^{-4} y 10^{-5} que se sembraron en placas con medio LB más ampicilina. Las transferencias de las colonias de las placas se prepararon usando filtros de nitrocelulosa. Se preparó una sonda de 600 pb para el gen de levadura PEP4 mediante PCR usando la ADN polimerasa Taq, ADN plasmídico total procedente de la genoteca de levaduras pLS101 y los siguientes oligodesoxinucleótidos como cebadores, diseñados en función de la secuencia de ADN publicada para el gen PEP4 (C.A. Woolford y cols., Mol. Cell. Biol. 6:2500 (1986)).

Cebador en el sentido de la lectura: 5'GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3'

Cebador antisentido: 5'-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3'

La PCR se realizó con 25 ciclos de amplificación (94ºC durante 1 min, 37ºC durante 2 min, 72ºC durante 3 min). Se procedió a la purificación en gel de la sonda de PCR, su radiomarcaje e hibridación con los filtros con las colonias descritos anteriormente. Varias colonias fueron positivas para la hibridación con la sonda PEP4 y se volvieron a sembrar en placas con medio LB con ampicilina para detectar colonias aisladas. El ADN plasmídico se preparó mediante lisis alcalina con SDS (Sambrook y cols., supra) a partir de varios de los aislados y se digirió con BamHI. Se observaron las esperadas bandas correspondientes al vector de 14 kpb y al inserto PEP4 de 6,9 kpb. Tras digestión doble con EcoRI y XhoI, se observó la esperada banda de 1,5 kpb correspondiente al PEP4. Uno de los aislados (E.coli, cepa número 860)que mostraba los resultados esperados se seleccionó para su posterior uso. El ADN plasmídico de la cepa 860 se digirió con BamHI y el fragmento de ADN BamHI de 6,9 kpb que contiene el gen cromosómico PEP4 se subclonó en el sitio BamHI de pUC13 para dar lugar al plásmido p890. A continuación, el plásmido 890 se digirió con NcoI (que corta dentro de la secuencia codificante de PEP4), se sometió a purificación en gel, se trató con la ADN polimerasa T4 para enromar sus extremos y se ligó con el fragmento de extremos romos y de 1,1, kpb que contiene el gen funcional URA3 (preparado como en el Ejemplo 2). El plásmido resultante que contiene el gen PEP4 fragmentado por el gen URA3 se denominó pUC13-pep4::URA3 (cepa número 906).

Ejemplo 8 Construcción de las cepas de levadura números 1569, 1538 y 1592, que derivan de la cepa U9 que contiene las mutaciones prb1 y pep4

Para fragmentar el gen HIS3 en la cepa U9, el vector de fragmentación pUC18-his3::URA3 se digirió con EcoRI y XbaI, y después se usó para transformar la cepa U9 mediante el método de acetato de litio. Los transformantes Ura+ se seleccionaron en medio agar sin uracilo y se volvieron a sembrar en el mismo medio para detectar los aislados clonales. Un número de los aislados Ura+ resultantes de cultivaron de nuevo en placas con medio agar sin uracilo o sin histidina, y se procedió a la detección selectiva de aquéllos que eran Ura+ e His-. Un aislado (cepa número 1524) se seleccionó para la posterior fragmentación del gen PRB1. El vector de fragmentación del gen PRB1 pUC18-prb1::HIS3 se digirió con SacI y XbaI y a continuación se usó para la transformación de la cepa número 1524 mediante el método de acetato de litio. Los transformantes Hi+ se seleccionaron en medio agar sin histidina y se volvieron a sembrar para detectar los aislados clonales en el mismo medio. El ADN genómico se preparó a partir de un número de los aislados His+ y se evaluó mediante hibridación con técnicas de Southern Blot con una sonda PRB1 marcada con radioisótopos. Uno de los aislados (cepa número 1537) con la deseada fragmentación del gen PRB1 por HIS3 (es decir, prb1::HIS3) se seleccionó para la posterior fragmentación del gen PEP4. La cepa 1537 se introdujo en placas con FOA para obtener aislados ura3 y se seleccionó un aislado (cepa número 1541) para su posterior uso.

Para fragmentar el gen PEP4 en la cepa número 1541, el vector de fragmentación del gen PEP4 pUC13-pep4::URA3 se digirió con XhoI para generar un módulo lineal de fragmentación pep4::URA3 y se usó para transformar la cepa 1541 mediante el método de acetato de litio. Los transformantes Ura+ se seleccionaron en medio agar sin uracilo y se sembraron en el mismo medio para detectar los aislados clonales. El ADN genómico se preparó a partir de una serie de los transformantes Ura+ y se evaluó mediante Southern Blot usando una sonda marcada con radioisótopos para el gen PEP4. Un aislado (cepa número 1569) con la deseada fragmentación del gen PEP4 por el gen URA3 se seleccionó para su uso posterior. La cepa número 1538 se preparó en un experimento independiente realizado siguiendo virtualmente la misma secuencia de etapas. La cepa número 1538 deriva de la cepa U9. La cepa número 1538 contiene las mutaciones prb1 y pep4. Además, un derivado ura3 de la cepa 1569 se obtuvo mediante subcultivo en placas con FOA. El derivado ura3 resultante de la cepa1569 se denominó cepa número 1592.

Ejemplo 9 Extracción de ácido nucleico a partir de una biopsia

De una paciente en el periodo posparto de 25 años de edad se obtuvo una lesión procedente de un condiloma acuminado vulvar de tamaño grande. Un fragmento de la lesión se congeló en nitrógeno líquido y se procesó con un mikrodismembrator II Braun (B. Braun Instruments, Melsungen, Alemania). El material resultante se solubilizó con dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,6% (p/v), se trató con proteinasa K (50 \mug/ml) y se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. El ADN se precipitó con etanol y se cuantificó mediante espectrofotometría de UV. La presencia de ADN de peso molecular elevado se estableció mediante electroforesis en gel de agarosa seguida por marcaje con bromuro de etidio.

Ejemplo 10 Tipificación del ADN de PVH

El tipo de ADN de PVH se determinó usando el ensayo de captura híbrida comercializado como ViraType Plus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD). Las sondas PVH usadas se dividieron en dos grupos cuya composición está basada en la asociación de cada tipo con neoplasias del tracto genital. El grupo A de sondas contenía los tipos de "bajo riesgo" PVH6, 11, 42, 43 y 44, mientras que el grupo B contenía sondas de los tipos de "alto riesgo" 16, 18, 31, 33, 35,.45, 51, 52 y 56. El ADN total se digirió con PstIm BamHI y HindIII y se realizaron análisis de Southern Blot en condiciones muy rigurosas (Tm- 15ºC) para determinar el subtipo de PVH.

Ejemplo 11 Clonación del genoma de PVH6a

El ADN total extraído de la muestra de biopsia positiva para PVH6a se digirió con la endonucleasa HindIII. Tras el fraccionamiento por tamaño a través de un gel de agarosa preparativo de temperatura de fusión baja al 0,8%, se escindió del gel una región correspondiente a ADN de \sim8 kpb y la agarosa se digirió con la enzima Gelasa^{TM}(Epicentre Technologies, Inc., Madison, WI). La muestra se ligó con pUC18 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) que se había digerido con HindIII y sometido a defosforilación. Tras la transformación de células competentes DH5 de E-coli (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD), se rastreó la genoteca plasmídica para detectar los clones positivos para PVH6a mediante hibridación de las colonias usando un oligodesoxinucleótido antisentido marcado con ^{32}P que era complementario al extremo 3'del gen L1 de PVH6a (5'-GAC AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3'-). Un plásmido PUC18 que contenía el genoma de PVH6a de 8,1 kpb se aisló y se caracterizó mediante enzimas de restricción y análisis de Southern blot. Este plásmido se denominó pUC18-PVH6a. El ADN plasmídico se preparó usando el kit Qiagen^{TM} Plasmid Maxi kit (Qiaten Inc. Chatsworth, CA).

Ejemplo 12 Análisis de la secuencia de pUC18-PVH6a

Para determinar la secuencia completa del HPV6a, se sintetizaron cebadores de secuenciación basados en la secuencia del PVH6b publicada. Se secuenciaron las dos hebras del genoma completo de PVH6a, compuesto por 8.1 kbp, del HPV6a por el método didesoxi de terminación de la cadena usando el kit PRISM^{TM} y un secuenciador automatizado (número 373A)de Applied Biosystems (ABI) siguiendo las instrucciones del fabricante (ABI, Inv., Foster City, CA). En los casos en los que la secuencia sentido y la antisentido no coincidían, se sintetizaron cebadores específicos de PVH6a adicionales para realizar una nueva secuenciación en ambas direcciones sobre el área en cuestión para obtener un consenso.

Las secuencias de ADN de PVH6a y de PVH6b mostraban una homología del 97%, con un total de cambios identificados en 229 pb de 8.010 pb. Las diferencias más significativas al comparar con la secuencia de PVH6b se encontraron en la región control larga (RCL; nt 7.205-nt 106). Aparte de los diversos cambios que afectaban a un único nucleótido (nt)en la RCL en el PVH6a, se encontraron una inserción de 94 pb en el nt 7.350 y otra inserción de 19 pb en el nt 7.804. En el nt 7.615 se encontró una deleción de seis pares de bases frente al genoma de PVH6a.

Ejemplo 13 Construcción de un vector de expresión de levaduras de PVH6aL1

El ADN de PVH tipo 6a se usó como cebador para la PCR. El gen de PVH6aL1 se amplificó mediante PCR usando la polimerasa Vent (New England Biolabs, -Inc.), con 35 ciclos de amplificación (94ºC durante 1 minuto, 48ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto y 45 segundos) y como cebadores los siguientes oligodesoxinucleótidos con sitios para Bg1II en las regiones adyacentes (subrayadas):

cebador en el sentido de la lectura:

5'CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3'

cebador antisentido:

5'GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3'

El cebador en el sentido de la lectura introduce, en la posición inmediatamente anterior cadena arriba al codón de metionina iniciador de PVH6aL1 (en negrita), una secuencia líder de levadura no traducida. El producto de la amplificación de L1 de 1,5 kpb se digirió con Bg1III y se purificó en gel. Se construyó el vector de expresión pGAL10 aislando un fragmento SphII de 1,4 kpb de un vector promotor bidireccional GAL pUC18-GAL1p-GAL10p, que contienen el promotor divergente GAL1/GAL10 del plásmido pBM272 (proporcionado por el Dr. Mark Johnston, Washington University, St. Louis), flanqueado por cada lado por una copia del terminador transcripcional de levadura ADH1 [Bennetzen, J.L. y Hall, B.D. (1982) J. Biol. Chem. 257: 3018-3025], clonando un sitio BamHI localizado entre el promotor GAL1 y la primera copia del terminador transcripcional ADH1, y un pequeño sitio de clonación SmaI situado entre el promotor divergente GAL10 y la segunda copia del terminador transcripcional ADH1. Un vector de transferencia de levadura compuesto por pBR322, el gen de levadura LEU2-d y la levadura de 2 \mum se trató con SphI y se ligó con el fragmento promotor GAL SphI de 1,4 kpb. El vector resultante, pGAL10, se linealizó con BamHI que corta entre el promotor GAL1 y el terminador transcripcional ADH1. El vector pGAL10 digerido con BamHI y el fragmento de PVH6aL1 producido mediante PCR digerido con BgIII se ligaron y se usaron para transformar las células de E.coli DH5 (BRL). Se aisló un plásmido pC1/1-GAL, que contiene el gen PVH6aL1 y se denominó p13173-357-6. El gen L1 en p13173-357-6 se secuenció (Secuenciador ABI 373A) y se mostró que era idéntico al gen L1 del clon pUC18-PVH6a).

Ejemplo 14 Construcción del vector de expresión de levadura del PVH6a L1 y L2

El plásmido p13173-357-6 (pGAL10 + PVH6aL1) se digirió con SmaI, que corta entre el promotor GAL10 y el terminador de la transcripción ADH1. El gen PVH6aL2 de 1,4 kpb se amplificó mediante PCR usando como cebador el ADN de pUC18-PVH6a, la polimerasa Vent (New EnglanD Biolabs, Inc.), con 10 ciclos de amplificación mediante PCR (94ºC durante 1 minuto; 48ºC durante 1 minuto; 72ºC durante 1 minuto y 45 segundos) y usando como cebadores los siguientes oligodesoxinucleótidos, que contienen sitios SmaI adyacentes (subrayados):

cebador en el sentido de la lectura:

5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC ATA GTA GGG CCC GAC GAC-3'

cebador antisentido:

5' TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA AAA AAA TAA GC-3'

El cebador en el sentido de la lectura introduce, en la posición inmediatamente anterior cadena arriba al codón de metionina iniciador de PVH6Al2 (en negrita), una secuencia líder de levadura no traducida. El fragmento de PCR se digirió con SmaI, se purificó en gel y se ligó con el plásmido digerido con SmaI p13173-357-6. Se aisló un plásmido pGAL10 que contenía los genes de PVH6aL1 y L2 y se denominó p14049-7-2. Se secuenció el gen L2 (secuenciador ABI 373A) y se encontró que era idéntico al gen L2 del clon pUC18-PVH6a.

Ejemplo 15 Expresión de PVH6aL1 y expresión simultánea de PVH6aL1 y L2 en levaduras

Para transformar las cepas de S.cerevisiae 1569 (MATa, leu2-04, prb1, ade1, pep4, cirº) y 1558 (MATa, leu2-04, prb1, mnn9, ade1, pep4, cirº) se usaron los plásmidos p13173-357-6 (pGAL10 + PVH6aL1) y p14049-7-2 (pGAL10 +
PVH6aL1 y L2). Las cepas recombinantes resultantes obtenidas usando la cepa hospedador número 1558 fueron las cepas 1644 (PVH6aL1) y 1670 (PVH6aL1 + L2), como recoge la tabla. Se indujo el crecimiento de los aislados clonales a 30ºC en medio YEHD con 2% de galactosa, durante 68-78 horas. Después de recoger las células, se procedió a la fragmentación de los precipitados celulares con perlas de cristal y los lisados celulares de analizaron para detectar la expresión de las proteínas PVH6aL1 o PVH6aL2 mediante análisis de inmunotransferencia. Las muestras que contenían 40 \mug de la proteína celular total se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 10% en condiciones reductoras y de desnaturalización y sometidas a análisis de electrotransferencia en filtros de nitrocelulosa. La proteína L1 se detectó mediante métodos inmunológicos usando antisuero de conejo frente a la proteína de fusión trpE-pVH11 (Brown, D.R. y cols., Virology 201:46-54) como anticuerpo primario y, como anticuerpo secundario, los anticuerpos IgG de mono anticonejo unidos a la peroxidasa de rábano (HRP) (Amersham, Inc.). Los filtros se procesaron usando el kit de detección quimioluminiscente ECL^{TM} (Amsersham, Inc.). En todas las muestras, excepto en el control negativo (vector control sin los genes L1 o L2), se detectó una banda de proteína L1 de 50-55 kDa.

Mediante análisis Western se detectó la proteína L2 en forma de una banda proteica de 70 kDa, usando una dilución 1:250 de suero de ratones que habína sido inmunizados 3 veces con una proteína de fusión trpE-PVH6aL2 preparada, esencialmente, según el método de Carter y cols., como el principal anticuerpo y, como anticuerpo secundario, la IgG antiratón de ovejas ligada a HRP (Amersham, Inc.) (dilución 1:1.000).

Para el análisis ME (Structure Probe, West Chester, PA), se introdujo una alícuota de cada muestra en mallas de cobre de 200 mesh recubiertas de carbono. Una gota de ácido fosfotúngstico (PTA) al 2% se vertió en la malla durante 20 segundos y a p 7,0. Las mallas se dejaron secar al aire antes del análisis TME. Las técnicas microscópicas se realizaron usando un microscopio de transmisión de electrones JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) y una tensión de aceleración de 100 kV. Las microfotografías generadas tienen un aumento final de 100.000.

En todas las muestras de levadura que hospedaban los plásmidos de coexpresión de PVH6aL1 o de PCH6aL1 y L2 se observaron VLP con un diámetro dentro del intervalo de 50-55 nm. En las muestras de levadura control no se observaron VLP.

Ejemplo 16 Fermentación de PVH6aL1 + L2 (cepa número 1670)

El crecimiento en la superficie de una placa de cultivo de la cepa 1670 se transfirió en condiciones de asepsia a un medio líquido sin leucina que contenía (por l): 8,5 g de fuente de nitrógeno para la levadura Difco sin aminoácidos y sulfato de amonio; 0,2 g de adenina; 0,2 g de uracilo; 10 g de ácido succínico; 5 g de sulfato de amonio; y 0,25 g de L-tirosina; antes de la esterilización, este medio se ajustó a un pH de 5,0-5,3 con NaOH. Después del crecimiento durante 25 horas a 28ºC, en un agitador giratorio a 250 rpm, se prepararon viales de cultivo congelados añadiendo glicerol estéril hasta una concentración final de 17% (p/v), antes de su almacenamiento a -70ºC (1 ml por criovial). En el mismo medio se desarrollaron los inóculos para la fermentación de la cepa 1670 (500 ml por probeta de 2 l) y se comenzó transfiriendo los contenidos descongelados de dos viales de cultivo congelados a las probetas de 2 l e incubando a 28ºC en un agitador giratorio a 250 rpm durante 25 horas.

La fermentación de la cepa 1670 se realizó con un fermentador New Brunswick SF-116 de 10 l de volumen de trabajo después de la inoculación. El medio de producción usado contenía (por litro): 20 g de extracto de levadura Difco; 10 g de peptona Sheffield HySoy; 20 g de glucosa; 20 g de galactosa; antes de la esterilización, se ajustó el pH del medio a 5,3. Todo el contenido de la probeta de inóculo de 2 l (500 ml) se transfirió al fermentador, que se incubó a 28ºC, 5 l de aire por minuto, a 400 rpm y a una presión de 24,13 pa. La agitación se aumentó en función de las necesidades, para mantener niveles de oxígeno disuelto superiores a una saturación de 40%. El progreso de la fermentación se controló realizando mediciones de los niveles de glucosa con muestras extraídas del proceso (Beckman Glucose 2 Analizer) y espectrometría de masas en línea con el proceso (Perkin-Elmer 1200). Después de una incubación de 69 horas, se consiguió una densidad celular de 9,9 g de peso celular seco por litro. Se procedió a la concentración del cultivo mediante filtración con fibras huecas (cartuchos Amicon H5MP01-43 en un sistema de filtración Amicon
DC-10) a una capacidad de 2 litros, diafiltración con 2l de suero salino tamponado con fosfato y la posterior concentración (a una capacidad de 1 litro) antes de su introducción en tubos de centrífuga de 500 ml. Los precipitados celulares se recogieron mediante centrifugación a 8.000 rpm (rotor Sorval GS3) durante 20 minutos a 4ºC. Después de decantar el sobrenadante, los precipitados(peso celular húmedo total de 225 g) se almacenaron a -70ºC para su posterior uso.

Ejemplo 17 (de referencia)

Purificación de las proteínas recombinantes de la cápsida PVH6aL1 + L2

Todas las etapas se realizan a 4ºC, a no ser que se indique otra cosa.

Las células de la cepa número 1670 se almacenaron congeladas a -70ºC. Las células congeladas (peso húmedo = 38,0 g) se descongelaron a 20ºC-23ºC y se resuspendieron en 50 ml de "tampón L1" (fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 100 mM, EDTA 1,7 mM). Se añadieron inhibidores de la proteasa PMSF y pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 2 mM y 1,7 \muM, respectivamente. La pasta celular se fragmentó a una presión de aproximadamente 55.158,4 kpa, pasándola tres veces en un microfluidificador M110 (Microfluidics Corp., Newton, MA). La pasta celular fragmentada se centrifugó a 5.000 g durante 10 minutos para eliminar restos celulares. El sobrenadante líquido que contenía el antígeno L1 + L2 se recuperó.

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El sobrenadante líquido se diluyó 1:5 añadiendo tampón A (MOPS 20 mM a pH 7,0) y se aplicó a una columna de captura de intercambio aniónico (ID 5,0 cm x 4,0 cm) de resina Fractogel®EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) equilibrado en Tampón A. Tras un lavado con el Tampón A, se produjo la elución del antígeno con un gradiente de 0-1,0 M de NaCl en Tampón A. La determinación de las fracciones de la columna que contenían la proteína L1 se realizó mediante inmunotransferencia.

Las fracciones que contenían la proteína L1 determinadas mediante inmunotransferencia se analizaron para determinar la cantidad de proteína total mediante el método de Bradford, seguido por SDS-PAGE usando tinciones de plata y técnicas de Western blot.

Las fracciones TMAE que mostraban pureza comparable y que estaban enriquecidas en la proteína L1 se acumularon. Se procedió a la concentración del antígeno mediante fraccionamiento con sulfato amónico. La solución se ajustó a una concentración de sulfato amónico saturada al 63% añadiendo reactivo sólido en agitación suave, durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 12.000 g. El precipitado se resuspendió en 20 ml de PBS (fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, NaCl 150 mM).

El precipitado resuspendido se sometió a una cromatografía en columna de exclusión por tamaño (2,6 cm ID x 89 cm) de resina Sephacryl 500 HR (Pharmacia Piscataway, NJ). Como tampón de carrera se usó PBS.

La cromatografía se realizó a 20ºC-23ºC. Las fracciones se analizaron con SDS-PAGE usando métodos de detección con tinción de plata y Western blot. Las fracciones más puras se guardaron. El acúmulo resultante se concentró.

El producto final se analizó con SDS-PAGE usando tinción con Coomassie coloidal. Se estimó que las proteínas L1 y L2 eran homogéneas al 85%. La identidad de las proteínas L1 y L2 se confirmó mediante técnicas de Western blot usando los antisueros adecuados. El producto final se alicuotó y se almacenó a -70ºC. Este procedimiento dio lugar a 3,0 mg de proteína.

Los análisis con microscopio electrónico se realizaron mediante Structrure Probe (West Chester, PA). Una alícuota de la muestra se colocó en una malla de cobre de 200 mesh recubierta de carbono. Durante 20 segundos se introdujo en la malla una gota de ácido fosfotúngstico al 2% y a pH 7,0. La malla se dejó secar al aire antes del análisis TME. Toda la microscopia se realizó usando un microscopio de transmisión de electrones JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) a una tensión de aceleración de 100 kv. Las microfotografías generadas tienen un aumento final de 100.000. Se confirmó la presencia de partículas similares a virus de un tamaño dentro del intervalo de 50-55 nm.

Ejemplo 18 Construcción del vector de expresión de PVCRL1

El gen PVCRL1 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pLAII, que contiene el genoma vírico de PVCR completo (Dr. Peter Howley, NCI), usando la polimerasa Vent (New England Biolabs, Inc.); con 35 ciclos de amplificación (94ºC durante 1 minuto; 50ºC durante 1 minuto; 72ºC durante 2 minutos) y se usaron como cebadores los siguientes oligodesoxinucleótidos que contienen sitios BgIII adyacentes (subrayados):

cebador en el sentido de la lectura:

5'-GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGG CTG TCT AC-3'

cebador antisentido:

5' GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTAG-3'

El cebador en el sentido de la lectura introduce, en la posición inmediatamente anterior cadena arriba al codón de metionina iniciador de PVCRL1 (en negrita), una secuencia líder de levadura no traducida. El fragmento de L1 de 1,6 kb formado por PCR se digirió con Bg1II, se purificó en gel y se subclonó en el sitio Bg1II del vector pSP72 (Promega) para dar lugar al plásmido pSP72-PVCR-L1 (p12930-314-4-1).

Un subclon se secuenció completamente y se encontró que tenía 4 nucleótidos diferentes al comparar con la secuencia publicada de PVCRL1. Los cambios no produjeron cambios en los aminoácidos. El gen L1 se separó del plásmido pSP72-PVCR-L1 en forma de fragmento Bg1II y se subclonó dentro del único sitio BamHI, localizado entre el promotor GAL10 de la levadura y el terminador de la transcripción ADH1, en un vector de expresión de levaduras que contiene el promotor GAL10 de YEp52 (Broach y cols., Exp. Manipulation of Gene Expression, 1983, 83:
81-116) y el terminador de la transcripción ADH1 en la misma estructura del vector. El plásmido resultante se denominó p12930-323-6-1.

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Ejemplo 19 Construcción del vector de expresión PVCRL2

El gen PVCRL2 se amplificó mediante PCR usando la polimerasa Vent (New England Biolabs, Inc.)a partir del plásmido pLAII después de digerir el plásmido con Sa1I, purificar en gel el fragmento de 7,9 kb y ligarlo consigo mismo. Se realizaron treinta y cinco ciclos de amplificación (90ºC durante 1 minuto; 50ºC durante 1 minuto; 72ºC durante 2 minutos) y se usaron como cebadores los siguientes oligodesoxinucleótidos que contienen sitios EcoRI adyacentes (subrayados):

cebador en el sentido de la lectura:

5'-GGA ATT CAC AAA ACA AAA.TGG TTG CAC GGT CAC GAAAA- 3'

cebador antisentido:

5'-3'GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG-3'

El cebador en el sentido de la lectura introduce, en la posición inmediatamente anterior cadena arriba al codón de metionina iniciador de PVCRL2 (en negrita), una secuencia líder de levadura no traducida. El producto de la PCR de 1,5 kb se digirió con EcoRI, se purificó en gel y se subclonó en el sitio EcoRI del promotor bidireccional del vector pUC18-GAL1p-GAL10p, que contiene el promotor divergente de levadura GAL1/GAL10. Este vector contiene un único sitio BamHI entre el promotor GAL1 y una primera copia de terminador de la transcripción ADH1, únicos sitios EcoRI y SmaI situados entre el promotor GAL10 y una segunda copia del terminador de la transcripción ADH1. El módulo de expresión resultante está contenido en un fragmento SphI de 1,4 kb. Un clon (p12930-295-2-2) con el inserto L2 deseado adyacente al promotor GAL10 se secuenció por completo y se mostró que contenía cambios en 6 nucleótidos con respecto de la secuencia publicada, 4 de los cuales produjeron cambios en los aminoácidos. El análisis de la secuencia del ADN cebador original confirmó que los cambios también estaban presentes en pLAII y que no habían sido introducidos por la PCR. El vector pUC18-GAL1p-GAL10p con el gen L2 se cortó con SphI y el fragmento de 2,9 kb hospedador del módulo de expresión ADH1t-GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t se ligó al fragmento Sph1 grande del vector de transferencia de levadura. El plásmido resultante se denominó p12930-323-2-3.

Ejemplo 20 Construcción de las proteínas de la cápsida PVCRL1 y L2 en levaduras

Los plásmidos p12930-323-6-1 y p12930-323-2-3 se usaron para transformar las cepas de S. cerevisiae números 1569, 1538, BJ5462 [E. W. Jones, Methods in Enzimology 194 (1991) 428-453] y BJ1995 [Jones, ibid.]. Se indujo el crecimiento de los aislados clonales a 30ºC en medio YEHD con 2% de galactosa, durante 48-72 horas. Después de recoger las células, los precipitados celulares se fragmentaron con perlas de cristal, se añadió TritonX-100 a una concentración final de 0,5% y los lisados celulares resultantes se evaluaron para detectar la expresión de PVCRL1 y L2 mediante análisis de inmunotransferencia. Las muestras con 40 \mug de proteína celular total se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 12% (Novex), en condiciones reductoras y de desnaturalización y a electrotransferencia en membranas de PVDF (Novex). Las proteínas PVCRL1 y L2 se detectaron usando antisuero policlonal de conejo antiL1 o antiL2 (regalo del Dr. John Kreider, Hershey Medical Center) como anticuerpos principales y, como anticuerpo secundario, la proteína A acoplada a la peroxidasa de rábano (Amesham, Inc.). Las membranas se procesaron usando el kit de detección quimioluminiscente ECL^{TM} (Amersham, Inc.). En todas las muestras que contenían el plásmido de expresión L1 se detectó una banda de proteína L1 de 55-61 kDa y en todas las muestras procedentes de los clones de levaduras que contenían el plásmido de expresión L2 se detectó una banda de proteína L2 de \sim90 kDa.

En las muestras derivadas de los clones de levaduras con el plásmido de expresión L1 con antisuero antiL2 o viceversa no se detectó ninguna señal (figura 6).

En función de estos resultados de expresión, se seleccionaron las siguientes cepas de levadura recombinantes para posteriores estudios: cepa número 1582, que es una cepa hospedadora número 1569 con el plásmido p12930-323-6-1; y la cepa número 1583, que es una cepa hospedadora número 1538 con el plásmido p12930-323-2-3.

Ejemplo 21 (de referencia)

A. Purificación de la proteína recombinante de la cápsida PVCRL1

Las células de la cepa número 1582, almacenadas a -70ºC, se descongelaron y suspendieron en un volumen igual de tampón de rotura (fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 100 mM, EDTA 1,7 mM). A la pasta se añadieron los inhibidores de la proteasa PMSF y pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 2 mM y 1,7 \muM, respectivamente. Las células se lisaron con 10 ciclos en un microfluidificador. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se depositó en la superficie de un cojín de 5 cm de sacarosa al 45% (p/v) en tampón L1, y la L1 se precipitó mediante centrifugación a 1000.000 g durante 4 horas. El precipitado se resuspendió en un décimo del volumen del tampón L1. El precipitado resuspendido se aclaró mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos. Se añadió Tween-80 al sobrenadante hasta una concentración final de 0,01% y se procedió al fraccionamiento del sobrenadante a temperatura ambiente mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna de 1700 ml (5 cm ID) de resina Sephacryl-S-1000 (Pharmacia). Como tampón de carrera de esta columna se usó fosfato sódico 10 mM, a pH 7,2, NaCL 150 mM, Tween-80 al 0,01%. Las fracciones con el material inmunorreactivo por ensayo de inmunotransferencia se agruparon y concentraron a un sexto del volumen mediante ultrafiltración usando una célula agitada Amicon con una membrana YM-100 de lámina plana de 76 mm de diámetro (PMCO 100.000). El producto se filtró en condiciones estériles a través de una membrana Millex-GV de 0,22 \mum (Millipore).

B. Caracterización de la proteína recombinante de la cápsida PVCRL1

La identidad del producto final se confirmó mediante ténicas de Western blot y mediante análisis de la secuencia N terminal. La pureza se determinó mediante SDS-PAGE con tinciones de plata y con Coomassie y mediante electroforesis capilar en solución de filtrado (SSCE) con detección óptica a 215 nm. La SSCE determinó una pureza de L1 del 75%. La microscopia electrónica mostró la presencia de VLP de tamaño entre 50-55 nm de diámetro.

C. HPLC analítica por exclusión de tamaño

Para detectar la presencia de VLP, las muestras se fraccionaron según el tamaño mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La cromatografía se realizó con un HPLC Biopump serie 410 de Perkin Elmer con un autoinyector ISS 100 equipado con un lazo de inyección de 200 microlitros. La columna fue un gel TSK G5000PW de 7,5 x 600 mm (TOSOHAAS, Montgomeryville, PA). Para controlar la elución proteica de la columna se realizó la detección óptica a 280 nm con un detector de puente de diodos LC-235 de Perkin-Elmer. La fase móvil fue NaCl 0,5 M en tampón fosfato sódico 10 mM a pH 7,2. La velocidad de flujo fue de 0,5 ml/min y se recogieron fracciones de 1 mililitro. La columna de calibración se realizó con patrones proteicos de Sigma así como con antígeno de superficie recombinante de hepatitis B (Recombivax^{TM}, Merck & Co., West Point, PA). La detección del antígeno en las fracciones recogidas durante la elución se realiza mediante ensayos de inmunotransferencia.

D. Ensayos de inmunotransferencia

Una muestra de 10 microlitros de cada fracción se aplicó a una tira de membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA) previamente humedecida y colocada sobre un papel de transferencia húmedo. La muestra empapó la membrana y la membrana se introdujo en una solución bloqueante (5% p/v) de leche deshidratada y desnatada disuelta en NaCl 0,15 M, azida de sodio al 0,02% (p/v) y fosfato sódico 0,01M, a pH 7,2 y se incubó a temperatura ambiente en agitación suave durante un mínimo de tres horas. Se procedió a la decantación de la solución bloqueante y se sustituyó con una solución de anticuerpos primarios.

Los anticuerpos primarios usados varían en función del antígeno que se va a detectar:

PVCRL1 se detectó con una sonda de suero de conejo antiPVCR de "respuesta tardía" (Biodesign International, Kennebunk, ME). PVCRL2 se detectó con una sonda de suero de conejo antiPVCRL2. PVH6aL1 se detectó con una sonda formada por el anticuerpo monoclonal MAB837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). PVH6aL2 se detectó con una sonda formada por suero de fusión antiPVH6aL2-trpE.

La visualización de los complejos inmunológicos se realizó mediante procedimientos convencionales usando un segundo anticuerpo conjugado con una fosfatasa alcalina y con el sustrato cromogénico NBT/BCIP.

E. Preparación de una vacuna a partir de la proteína recombinante de la cápsida PVCRL1

La proteína de la cápsida PVCRL1 purificada se adsorbió con Al(OH)3 a una concentración de 100 \mug/ml.

Ejemplo 22 (de referencia)

Purificación de la proteína recombinante de la cápsida PVCRL1-Esquema 2

Todas las etapas se realizaron a 4ºC, a menos que se especifique otra cosa.

Las células de la cepa número 1582, almacenadas a -70ºC, se descongelaron y suspendieron en un volumen igual de tampón de rotura (fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 100 mM, EDTA 1,7 mM). A la pasta se añadieron los inhibidores de la proteasa PMSF y pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 2 mM y 1,7 \muM, respectivamente. Las células se lisaron usando un sistema de fragmentación BioNeb Cell (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos.

El sobrenadante se depositó en la superficie de un cojín de 5 cm de sacarosa al 45% (p/v) en tampón L1, y la L1 se precipitó mediante centrifugación a 1000.000 g durante 4 horas. El precipitado se resuspendió en un décimo del volumen del tampón L1. El precipitado resuspendido se aclaró mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos.

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El sobrenadante se diluyó a 1:5 con PBS, se aclaró otra vez mediante centrifugación en un rotor Sorvall SA-600 a 6.500 rpm durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de jeringuilla de 0,22 micrómetros y se fraccionó mediante cromatografía de intercambio aniónico.

La cromatografía de intercambio aniónico se realizó con una HLC Biopump de la serie 410 de Perkin-Elmer con un lazo de inyección de 5 mililitros. El medio de cromatografía fue una resina Fractogel EMF TMAE-650 (S) de
25-40 micrómetros (EM Separations, Gibbstown, NJ) en una columna de cristal de 150 mm x 10 mm ID. Para controlar la elución de la proteína de la columna, se realizó la detección óptica a 280 nm con un detector de puente de diodos
LC-235 de Perkin-Elmer. La columna se equilibró previamente con NaCl 0,15 M en tampón fosfato sódico 0,01 M a pH 7,2 (Tampón A). La velocidad de flujo de la columna fue de 0,75 ml/min. La muestra se cargó en la columna y la columna se lavó con Tampón A para eliminar el material sin unir. La elución del material unido se produjo con un gradiente lineal de concentración de cloruro sódico, 0,15 M a 0,65 M, durante 5 minutos y a continuación en un gradiente lineal de 0,65 M a 1,15 M durante 30 minutos. La detección del antígeno en las fracciones recogidas durante la elución se realizó mediante ensayos de inmunotransferencia. Las fracciones que contenían el material inmunoreactivo (es decir, las fracciones eluidas entre NaCl 0,81 M y 1,05 M) se recogieron.

Las fracciones agrupadas se concentraron en dispositivos de concentración centrífuga Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) a 1/5 de su volumen.

El concentrado se fraccionó mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando resina Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) en una columna ID de 87 cm x 27 mm. La velocidad de flujo de la columna fue de 2,5 ml/min. La elución de la proteína se controló por absorbancia a 280 nm. El antígeno se detectó mediante inmunotransferencia.

Las fracciones que contenían el material inmunorreactivo se acumularon y concentraron mediante ultrafiltración usando una célula agitada (Amicon, Inc., Beverly, MA) con una membrana de lámina plana YM-100 de 43 mm de diámetro (Amicon, Inc., Beverly, MA) en atmósfera de nitrógeno a una presión de 68,94 kpa.

El producto final se caracterizó mediante SDS/PAGE con tinción con Coomassie y mediante electroforesis capilar en solución de filtrado (SSCE). El producto final obtenido por SSCE en el esquema 2 tenía una pureza de 88%.

Ejemplo 23 (de referencia)

A. Purificación de la proteína recombinante de la cápsida PVCRL1- Esquema 3 (Figura 17)

Todas las etapas se realizaron a 4ºC, a menos que se especifique otra cosa.

La extracción del sobrenadante se realizó con ½ de volumen de cloroformo. La capa acuosa se eliminó y aclaró mediante centrifugación a 12.000 rpm en una Microfuge Beckman durante 5 minutos a temperatura ambiente.

La cromatografía de intercambio aniónico se realizó con una HLC Biopump de la serie 410 de Perkin-Elmer con un lazo de inyección de 5 mililitros. El medio de cromatografía fue una resina Fractogel EMF TMAE-650 (S) de
25-40 micrómetros (EM Separations, Gibbstown, NJ) en una columna de cristal de 150 mm x 10 mm ID. Para controlar la elución de la proteína de la columna, se realizó la detección óptica a 280 nm con un detector de puente de diodos
LC-235 de Perkin-Elmer. La columna se equilibró previamente con NaCl 0,15 M en tampón fosfato sódico 0,01 M a pH 7,2 (Tampón A). La velocidad de flujo de la columna fue de 0,75 ml/min. La muestra se cargó en la columna y la columna se lavó con Tampón A para eliminar el material sin unir. La elución del material unido se produjo con un gradiente lineal de concentración de cloruro sódico, 0,15 M a 0,65 M, durante 5 minutos y a continuación en un gradiente lineal de 0,65 M a 1,15 M durante 30 minutos. La detección del antígeno en las fracciones recogidas durante la elución se realizó mediante ensayos de inmunotransferencia. Las fracciones que contenían el material inmunorreactivo (es decir, las fracciones eluidas entre NaCl 0,81 M y 1,05 M) se recogieron.

El producto final se caracterizó mediante SDS/PAGE con tinción con Coomassie y mediante electroforesis capilar en solución de filtrado (SSCE). El producto final obtenido por SSCE en el esquema 3 tenía una pureza de 95%.

Electroforesis capilar en solución de filtrado (SSCE)

Las muestras de VLP de PVCR (\sim0,2 miligramos/mililitro) se calentaron durante 15 minutos a 100ºC en 2-mercaptoetanol al 1% y SDS al 1% (p/v). La muestra se aplicó electrocinéticamente junto con un marcador de referencia, ácido melítico, a un capilar fusionado de sílice de ID 42 cm (22 cm al detector) x 0,05 mm, previamente equilibrado con 10 volúmenes de lumen de NaOH 0,1 N, agua y reactivo de cribado ProSort (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se aplicó un voltaje de separación de 300 voltios/cm usando un instrumento de Applied Biosystems, modelo 270A-HT CE. La elución de la muestra se controló mediante la absorbancia a 215 nm y los datos se recogieron usando un software Nelson Turbochrom 3.

Ejemplo 24 Protección frente al desarrollo del papiloma causado por PVCR mediante vacunación con VLP de PVCRL1 derivadas de levaduras

5 conejos blancos New Zealand se inmunizaron por vía intramuscular con 135 \mug de VLP L1 (pureza de 75%) adsorbidas en alumbre o con 100 \mug de antígeno de superficie recombinante de hepatitis B (pureza de 99%) adsorbido en hidróxido de aluminio, como control negativo. Los animales recibieron dos inyecciones más en 8 semanas antes de exponerles al PVCR 10 días después de la última inyección. Los sueros extraídos antes de la inmunización, durante cada inyección y antes de la exposición al virus se analizaron mediante ELISA específico de L1. Placas de 96 pocillos se revistieron con 5 \mug de lisado bruto de PVCRL1 o PVCRL2 derivados de levaduras. Se eliminó la proteína y las placas se bloquearon en leche deshidratada al 10% (Carnation) + TTBS (TRIS 20 mM, a pH 7,4, NaCl 500 mM, Tween al 0,1%) durante dos horas a 4ºC. Después del lavado de las placas con TTBS, se añadieron sueros de conejo diluidos a leche al 1% + TTBS y se incubaron durante dos horas a 4ºC. Las placas se lavaron con TTBS y se incubaron con una dilución 1:1.000 de fosfatasa alcalina-IgG anticonejo (Kirkegaard y Perry Labs., Inc.) en leche al 1% + TTBS durante dos horas a 4ºC. Las placas se lavaron con TTBS y se revelaron añadiendo p- nitrofenilfosfato (Kirkegaard y Perry Labs., Inc.). La reacción se interrumpió añadiendo EDTA al 5%. La absorbancia se midió a 405 nm. El título se consideró positivo cuando la relación de la absorbancia L1/L2 era de 2:1.

Los títulos de anticuerpos antiL1 permanecían 4 semanas después de la primera inyección y aumentaban con cada inyección adicional. Los animales que actuaban como control eran negativos. Seis semanas después de la exposición al PVCR, los animales vacunados no presentaban verrugas en 15 sitios de 15 (virus diluido al 1:2 o al 1:12), mientras que en los animales control se formaron verrugas en 12 de los 15 sitios (virus diluido al 1:2) o en 9 de los 15 sitios (virus diluido al 1:12). Tras 15 semanas, los animales vacunados todavía no presentaban verrugas.

Los ensayos de neutralización de virus se realizaron (esencialmente según el método de Christensen y cols., 1991, Virology 181: 572-579), mezclando suero de conejo con PVCR y exponiendo posteriormente a los animales al PVCR tratado. El parámetro para determinar los anticuerpos neutralizantes fue la neutralización completa del virus (3 de 3 sitios sin formación de verrugas). Se analizaron los sueros de 5 animales vacunados y de 5 animales control. Los sueros recogidos tras 1 dosis de VLP de PVCRL1 contenían anticuerpos que neutralizaron completamente el virus sin diluir en el 80% de los conejos (4/5). Después de 2 ó 3 dosis de VLP de PVCRL1, el 100% de los conejos (5/5) tenían anticuerpos neutralizantes del virus. Los sueros control no mostraron ninguna actividad neutralizante del virus. En función de los títulos finales, el suero de los animales vacunados seleccionados se podía diluir entre 10 y 1.000 veces y todavía seguía siendo neutralizante al 100%.

Ejemplo 25 Construcción de un vector para la expresión simultánea de PVCRL1/L2 a partir de un único plásmido

El plásmido pSP72-PVCR-L1 (p12930-314-4-1) se digirió con Bg1II y el fragmento Bg1II de 1,5 kpb que contenía el ORF de PVCRL1 con una secuencia de levadura líder sin traducir en 5' se sometió a purificación en gel. El plásmido p12930-323-2-3 se digirió con BamHI, que corta entre el promotor GAL1 y el terminador de la transcripción ADH1. El fragmento del vector lineal se purificó en gel y a continuación se ligó con el fragmento Bg1II de PVCRL1 mencionado anteriormente, para dar lugar al plásmido p12930-366-1-2. Este plásmido resultante contiene el ORF de PVCRL1 bajo el control del promotor GAL1 y el ORF de PVCRL2 bajo el control del promotor GAL10.

Ejemplo 26 Construcción del vector para la expresión simultánea de PVCR L1/L2 a partir de dos plásmidos

El vector pUC18-GAL1p-GAL10p que contenía el gen L2 se digirió con SphI y el fragmento de 2,9 kb que hospedaba el módulo de expresión ADH1t-GAL1p- GAL10p-L2-ADH1t se purificó en gel y se enromó mediante tratamiento con la ADN polimerasa T4. El vector de transferencia de levaduras Yep24 [Botstein y cols., Gene 8:17 (1979) se digirió con BamHI, se enromó con la ADN polimerasa T4, se defosforiló con fosfatasa alcalina de intestino de ternero y, a continuación, se ligó con el módulo de expresión romo de L2 mencionado anteriormente para dar lugar al plásmido p1594.

Ejemplo 27 Expresión simultánea de PVCRL1 y L2 en levaduras

El plásmido p12930-366-1-2 (pC1/1-GAL1/10p-PVCR/L1 + L2) se usó para transformar las cepas de S.cerevisiae números 1569 y BJ5462 (sistema de un plásmido) y los transformantes resultantes se seleccionaron en medio agar sintético sin leucina. En un experimento paralelo, la cepa número 1592 se transformó de forma simultánea con el vector de expresión de PVCR-L1 p12930-323-6-1 y el vector de expresión de Yep24-GAL10p-L2 p1594 (sistema de dos plásmidos) y los transformantes resultantes que contenían ambos vectores se seleccionaron en medio agar sintético sin leucina ni uracilo. El crecimiento de los aislados clonales de ambos sistemas, de un plásmido y de dos plásmidos, se indujo a 30ºC en medio complejo YEHD con galactosa al 2%, durante 48-72 horas. Después de recoger las células, los precipitados celulares se fragmentaron con perlas de cristal. Se añadió TritonX-100 hasta una concentración final de 0,5% y los lisados celulares se analizaron para determinar la expresión de PVCRL1 y L2 mediante inmunotransferencia. Las muestras que contenían 50 \mug de proteína celular total se sometieron a electroforesis en gradiente de geles Tris-glicina 8%-16% (Novex) en condiciones reductoras y de desnaturalización y a electrotransferencia en membranas de PCDF (Novex). Las proteínas PVCRL1 y L2 se detectaron usando antisueros policlonales de conejo antiL1 o antiL2 (regalo del Dr. John Kreider, Hershey Medical Center) como anticuerpos primarios y, como anticuerpo secundario, proteína A acoplada a la peroxidasa de rábano (Amersham, Inc.). En todas las muestras procedentes de clones de levaduras que contenían el plásmido de expresión L1 + L2, se detectó una banda de proteína L1 de 55-61 kDa y una banda de proteína L2 de 90 kDa. En las muestras derivadas de clones de levadura que contenían el plásmido de expresión de L1 no se detectó ninguna señal de L2 (figura 6). En las muestras procedentes de células que contenían sólo el plásmido de expresión de L2 no se detectó ninguna señal de L1.

Ejemplo 28 Purificación de las VLP de PVCRL1 y PVCRL1+L2 para estudios ME

Las proteínas expresada en levaduras PVCRL1 y PVCRL1 y L2 se purificaron parcialmente y se concentraron para realizar estudios de microscopia electrónica (ME). De uno a 1,5 litros de medio YEHD con 2% de galactosa se inocularon con las cepas de S.cerevisiae números 1569 o BJ5462, se transformaron con el vector de expresión simultánea de L1 + L2 p12930-366-1-2 y se indujo el crecimiento a 30ºC durante 48-72 horas. En un experimento paralelo, se indujo el crecimiento de forma similar en células de la cepa 1569 cotransformadas con el vector de expresión dePVCR-L! P12930-323-6-1 y el plásmido de Yep24-GAL10p-L2, p1594. Las células se recogieron y los precipitados celulares se congelaron a -70ºC. Las siguientes etapas se realizaron a 4ºC. Los precipitados celulares se descongelaron y se suspendieron en un volumen igual de "tampón L1" (fosfato sódico 20 mM a pH 7,2, NaCl 100 mM, EDTA 1,7 mM). A la pasta se añadieron los inhibidores proteicos PMSF y Pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 2 \muM y 1,7 \muM, respectivamente. Las células se lisaron con 3-5 ciclos en un microfluidificador. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se depositó en la superficie de un cojín de 5 cm de sacarosa al 45% v/v) en tampón L1, y las proteínas L1, L2 o L1 Y L2 se precipitaron mediante centrifugación a 1000.000 g durante 4 horas. El precipitado se resuspendió en un décimo del volumen del tampón L1. El precipitado resuspendido se aclaró mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos.

Para los análisis de ME (Structure Probe, West Chester, PA), se colocó una alícuota de cada muestra en mallas de cobre de 200 mesh recubiertas con carbono. Una gota de ácido fosfotúngstico (PTA) al 2% se introdujo en la malla durante 20 segundos y a p 7,0. Las mallas se dejaron secar al aire antes del análisis de TME. Las técnicas microscópicas se realizaron usando un microscopio de transmisión de electrones JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) y una tensión de aceleración de 100 kv. Las microfotografías generadas tienen un aumento final de 100.000.

En todas las muestras de levadura que hospedaban bien el plásmido de expresión de PVCRL1 o los plásmidos de coexpresión de PVCRL1 y L, se observaron VLP con un diámetro menor de 25 nm. No se observaron VLP en las muestras control de levadura ni en las muestras de levaduras que hospedaban el plásmido de expresión de L2 solo.

Ejemplo 29 Expresión de PVCRL1 (cepa 1582) y de L1 de PVH tipo 6a (cepa 1644) en medio complejo enriquecido y químicamente definido

Los inóculos de estas cepas se desarrollaron en medio sintético sin leucina, como se ha descrito anteriormente para transferir a frascos de cultivo en agitación. Los frascos de agitación usados se prepararon para una capacidad de aireación alta (70 ml de líquido por cada frasco de 300 ml, Tunair Labware) y los medios se suplementaron con ca. 0,5 ml/l de un antiespumante (UNCON LB-625, Union Carbide). El medio complejo enriquecido contenía (por litro):
40 g de extracto de levadura Difco; 20 g de peptona Sheffield HySoy; 30 g de glucosa; 50 g de galactosa; el pH del medio se ajustó a un valor de 5,3, antes de la esterilización. El medio químicamente definido usado fue similar al descrito por Oura (Biotechnol. Bioengineer. 16: 1197-1212. 1974) pero complementado con (por litro): 0,1 g de colina Cl; 0,4 g de adenina; 30 g de glutamato monosódico como fuente de nitrógeno; 0,2 g de uracilo; 20 g de glucosa;
40 g de galactosa. En los frascos se inocularon 3 ml del inóculo y se incubaron durante 66 horas a 28ºC, a 250 rpm en un agitador de rotación. A intervalos, se extrajeron muestras de los frascos para verificar la expresión mediante imunotransferencia usando antisuero antiPVCRL1 u antiPVH6aL1.

Ejemplo 30 Clonación de los genes PVH16L1 y L2

Mediante técnicas estándar (Sambrook y cols., supra) se extrajo el ADN genómico total de células Caski (ATCC número CRL 1550). El ADN se digirió con las endonucleasas Bst1 1071 y SphI y se realizó una electroforesis a través de un gel preparativo de agarosa al 0,8% de baja temperatura de fusión. Una región correspondiente a ADN de \sim3,5 kpb se escindió del gel y la agarosa se digirió con la enzima Gelasa^{TM} (Epicentre Technologies, Inc.). El ADN purificado en gel se enromó con la ADN polimerasa T4 y se ligó con ligantes de oligodesoxinucleótidos romos y fosforilados que contienen un sitio HindIII oculto. La mezcla de ligación se digirió por completo con HindIII y el ADN de \sim3,5 kpb se fraccionó por tamaño a través de un gel de agarosa, como se ha descrito anteriormente. El ADN purificado en gel se ligó con el ADN del plásmido pUC18 que había sido digerido con HindIII y defosforilado. Tras la transformación de células de E.coli DH5 competentes (BRL), la genoteca de plásmidos se rastreó para buscar los clones positivos para PVh16 mediante hibridación usando un oligodesoxinucleótido antisentido marcado con ^{32}P complementario al extremo 3'del gen de PVH16L1 (5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). Mediante enzimas de restricción y análisis Southern blot se aisló y caracterizó un plásmido pUC18 que contenía un fragmento genómico de PVH16 de \sim3,3 kpb. Este 16L1/L2 y contiene todas las secuencias de ADN que codifican L1 y L2. El ADN plasmídico se preparó usando el kit Qiagen^{TM} Plasmid Maxi )Qiagen, Inc.).

Ejemplo 31 Construcción del vector de expresión de levaduras de PVH16L1

Como cebador de la PCR se usó el clon pUC18-PVH16L1/L2. El gen de PVH16L1 se amplificó mediante PCR usando la polimerasa Vent (New England Biolabs, Inc.), con 10 ciclos de amplificación (94ºC durante 1 minuto, 48ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto y 45 segundos) y como cebadores los siguientes oligodesoxinucleótidos con sitios para Bg1II en las regiones adyacentes (subrayadas):

cebador en el sentido de la lectura:

5'- CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG GC -3'

cebador antisentido:

5'- GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'

El cebador en el sentido de la lectura introduce, en la posición inmediatamente anterior cadena arriba al codón iniciador de metionina de PVH6aL1 (en negrita), una secuencia líder de levadura no traducida. El producto de la PCR de 1,5 kpb se digirió con Bg1II, se purificó en gel y se ligó con el vector pGAL10 digerido con BamHI. Se aisló un plásmido pGAL10 que contenía el gen de PVH16L1 y se denominó p14049-37-1. El gen L1 de p14049-37-1 se secuenció usando el kit PRISM^{TM} (ABI, Inc.) y un secuenciador ABI, mode 373ª, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se mostró que el gen L1 de este aislado contenía 3 cambios nucleotídicos respecto de la secuencia prototipo corregida publicada (Kirnbauer, R. y cols. (1993) J. Virol. 67: 6929-6936), que dan lugar a dos cambios en aminoácidos: His-202 a Asp; Thr-266 a Ala. El análisis de la secuencia del ADN cebador original confirmó que estos cambios también se encontraban en el clon genómico pUC18-PVH16L1/L2 y no fueron introducidos por la PCR.

\newpage

Ejemplo 32 Construcción del vector de expresión de levaduras de PVH16L1 Y L2

El plásmido p14049-37-1 se digirió con SmaI, que corta entre el promotor GAL10 y el terminador de la transcripción ADH1. El gen PVH16L2 de 1,4 kpb se amplificó mediante PCR usando como cebador el ADN de pUC18-PVH16L1/L2 y con la polimerasa Vent (New Englan Biolabs, Inc.), con 10 ciclos de amplificación mediante PCR (94ºC durante 1 minuto; 48ºC durante 1 minuto; 72ºC durante 1 minuto y 45 segundos) y usando como cebadores los siguientes oligodesoxinucleótidos, que contienen sitios SmaI adyacentes (subrayados):

cebador en el sentido de la lectura:

5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC ACA AAC GTT CTG CAA AAC-3'

cebador antisentido:

5' TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC-3'

El cebador en el sentido de la lectura introduce, en la posición inmediatamente anterior cadena arriba al codón de metionina iniciador de PVH16L2 (en negrita), una secuencia líder de levadura no traducida. El producto de la PCR de 1,4 kpb se digirió con SmaI, se purificó en gel y se ligó con el vector p14049-37-1 digerido con SmaI. Se aisló un plásmido que contenía los genes de PVH16L1 y L2 y se denominó p14049-42-2. El gen L2 de p14049-42-2 se secuenció usando el kit PRISM^{TM} (ABI, Inc.) y un secuenciador ABI, mode 373A, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se mostró que el gen L2 de este aislado contenía 5 cambios nucleotídicos respecto de la secuencia prototipo corregida publicada (Kirnbauer, R. y cols. (1993) supra), resultando en un cambio de aminoácido: Ser-269 a Pro. El análisis de la secuencia del clon genómico pUC18-PVH16L1/L2 confirmó que este cambio también se encontraban en el ADN cebador y no fue introducido por la PCR.

Ejemplo 33 (de referencia)

A. Expresión de PVH16L1 y expresión simultánea de PVH16L1 y L2 en levaduras

Los plásmidos p14049-37-1 y P14049-42-2 se usaron para transformar la cepa de S. cerevisiae número 1558. Las cepas recombinantes resultantes fueron las número 1678 (PVH16-L1) y 1679)PVH16L1+L2), como se muestra en la tabla. Se indujo el crecimiento de los aislados clonales a 30ºC en medio YEHD con 2% de galactosa, durante 68-78 horas. Después de recoger las células, los precipitados celulares se fragmentaron con perlas de cristal y los lisados celulares se analizaron para detectar la expresión de las proteínas PVH16L1 o PVH16L2 mediante análisis de inmunotransferencia. Las muestras con 40 \mug de proteína celular total se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 10% en condiciones reductoras y de desnaturalización, y a electrotransferencia en filtros de nitrocelulosa. La proteína PVH16L1 se detectó usando antisuero policlonal de conejo frente a la proteína de fusión trpE-PVH11L1)D. Brown y cols., Virology 201:46-54) como anticuerpo primario y, como anticuerpo secundario, el anticuerpo IgG de mono ligada a HRP (Amersham, Inc.). Los filtros se procesaron usando el kit de detección quimioluminiscente ECL^{TM} (Amersham, Inc.). En todas las muestras, excepto en la usada como control negativo (vector control sin el gen L1 o L2), se detectó una banda de proteína L1 de 50-55 kDa. La proteína L2 se detectó en forma de banda proteica de 70 kDa mediante inmunotransferencia usando suero de ratón antiPVH16L2 frente a las proteínas de fusión trpE-L2 expresadas en E.coli como anticuerpos primarios. Como anticuerpo secundario se usó IgG de cabra antiratón ligada a HRP (Amersham, Inc.) y los filtros se procesaron como se ha descrito anteriormente.

B. Purificación de las proteínas recombinantes de la cápsida PVH tipo 16 L1 + L2

Todas las etapas se realizaron a 4ºC, a menos que se especifique otra cosa.

Las células estaban almacenadas congeladas a -70ºC. Las células congeladas (peso húmedo=27,6 g) se descongelaron a 20ºC-23ºC y se resuspendieron en 40 ml de "tampón L1" (fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 100 mM, EDTA 1,7 mM). Se añadieron inhibidores de la proteasa PMSF y pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 2 mM y 1,7 \muM, respectivamente. La pasta celular se fragmentó a una presión de aproximadamente 55.158,4 kpa pasándola tres veces en un microfluidificador M110 (Microfluidics Corp., Newton, MA). La pasta celular fragmentada se centrifugó a 5.000 g durante 10 minutos para eliminar restos celulares. El sobrenadante líquido que contenía el antígeno L1 + L2 se recuperó.

El sobrenadante líquido se diluyó a 1:5 añadiendo tampón A (MOPS 20 mM a pH 7,0) y se aplicó a una columna de captura de intercambio aniónico (ID 5,0 cm x 4,8 cm) de resina Fractogel®EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) equilibrado en Tampón A. Tras un lavado con el Tampón A, se produjo la elución del antígeno con un gradiente de 0-1,0 M de NaCl en Tampón A. La determinación de las fracciones de la columna que contenían la proteína L1 se realizó mediante inmunotransferencia.

\newpage

Las fracciones TMAE que mostraban pureza comparable y que estaban enriquecidas en la proteína L1 se acumularon. Se procedió a la concentración del antígeno mediante fraccionamiento con sulfato amónico. Las muestras se ajustaron a una concentración de sulfato amónico saturada al 48% añadiendo reactivo sólido en agitación suave, durante 30 minutos. Las muestras se introdujeron en hielo y se dejó que se produjera la precipitación durante la noche. Las muestras se centrifugaron a 12.000 g. El precipitado se resuspendió en 20 ml de PBS (fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, NaCl 150 mM).

Los precipitados resuspendidos se sometieron, de forma independiente, a una cromatografía en columna de exclusión por tamaño (2,6 cm ID x 89 cm) de resina Sephacryl 500 HR (Pharmacia Piscataway, NJ). Como tampón de carrera se usó PBS. Las fracciones se analizaron con SDS-PAGE usando métodos de detección con tinción de plata y Western blot. Las fracciones más puras se guardaron. Los acúmulos resultantes se concentraron en una célula agitada YM-100 de 50 ml usando membranas de lámina plana de 43 mm (Amicon, Beverly, MA) a una presión de N_{2} de 27,58-41,37 kpa.

El producto final se analizó con SDS-PAGE usando tinción con Coomassie coloidal. Se estimó que las proteínas L1 y L2 eran homogéneas al 70%. La identidad de las proteínas L1 y L2 se confirmó mediante técnicas de Western blot usando los antisueros adecuados. El producto final se alicuotó y se almacenó a -70ºC. Este procedimiento dio lugar a un total de 0,53 mg de proteína.

Los análisis con microscopio electrónico se realizaron mediante Structrure Probe (West Chester, PA). Una alícuota de la muestra se colocó en una malla de cobre de 200 mesh recubierta de carbono. Durante 20 segundos se introdujo en la malla una gota de ácido fosfotúngstico al 2% y a pH 7,0. La malla se dejó secar al aire antes del análisis TME. Toda la microscopia se realizó usando un microscopio de transmisión de electrones JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) a una tensión de aceleración de 100 kv. Las microfotografías generadas tienen un aumento final de 100.000. Se confirmó la presencia de partículas similares a virus de un tamaño dentro del intervalo \leq25 nm.

C. Purificación de las proteínas recombinantes de la cápsida L1 + L2 de PVH tipo 16

Todas las etapas se realizaron a 4ºC, a menos que se especifique otra cosa.

Las células estaban almacenadas congeladas a -70ºC. Las células congeladas (peso húmedo=92,8 g) se descongelaron a 20ºC-23ºC y se resuspendieron en 105 ml de "tampón L1" (fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 100 mM, EDTA 1,7 mM). Se añadieron inhibidores de la proteasa PMSF y pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 2 mM y 1,7 \muM, respectivamente. La pasta celular se fragmentó a una presión de aproximadamente 110.316 kpa pasándola tres veces en un microfluidificador M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). La pasta celular fragmentada se centrifugó a 6.100 g durante 15 minutos para eliminar restos celulares. El sobrenadante líquido que contenía el antígeno L1 + L2 se recuperó.

El sobrenadante líquido se diluyó a 1:5 añadiendo tampón A (MOPS 20 mM a pH 7,0) y se aplicó a una columna de captura de intercambio aniónico (ID 5,0 cm x 4,2 cm) de resina Fractogel®EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) equilibrado en Tampón A. Tras un lavado con el Tampón A, se produjo la elución del antígeno con un gradiente de 0-1,0 M de NaCl en Tampón A. La determinación de las fracciones de la columna que contenían la proteína L1 se realizó mediante inmunotransferencia.

Las fracciones que contenían la proteína L1 determinadas mediante inmunotransferencia se analizaron para determinar la cantidad de proteína total mediante el método de Bradford, seguido por SDS-PAGE usando tinciones de plata y técnicas de Western blot

Las fracciones TMAE que mostraban pureza comparable y que estaban enriquecidas en la proteína L1 se acumularon. Se procedió a la concentración del antígeno mediante fraccionamiento con sulfato amónico. Las muestras se ajustaron a una concentración de sulfato amónico saturada al 35% añadiendo reactivo sólido en agitación suave, durante 10 minutos. Las muestras se introdujeron en hielo y se dejó que se produjera la precipitación durante 4 horas. Las muestras se centrifugaron a 12.000 g. El precipitado se resuspendió en 20,0 ml de PBS (fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, NaCl 150 mM) que contenía EDTA 1 mM.

Los precipitados resuspendidos se sometieron, de forma independiente, a una cromatografía en columna de exclusión por tamaño (2,6 cm ID x 89 cm) de resina Sephacryl 500 HR (Pharmacia Piscataway, NJ). Como tampón de carrera se usó PBS + EDTA 1 mM. Las fracciones se analizaron con SDS-PAGE usando métodos de detección con tinción de plata y Western blot. Las fracciones más puras se guardaron. Los acúmulos resultantes se concentraron en una célula agitada YM-100 de 50 ml usando membranas de lámina plana de 43 mm (Amicon, Beverly, MA) a una presión de N_{2} de 27,58-41,37 kpa.

El producto final se analizó con SDS-PAGE usando tinción con Coomassie coloidal. Se estimó que las proteínas L1 y L2 eran homogéneas al 70%. La identidad de las proteínas L1 y L2 se confirmó mediante técnicas de Western blot usando los antisueros adecuados. El producto final se alicuotó y se almacenó a -70ºC. Este procedimiento dio lugar a un total de 3,8 mg de proteína.

Ejemplo 34 (de referencia)

A. Fermentación de la cepa 1679 (L1 + L2 de PVH tipo 16)

Los procedimientos usados para la preparación de cultivos de cepas congeladas, desarrollo de inóculos, fermentación y recuperación celular de la cepa 1679 fueron esencialmente como se ha descrito anteriormente. Después de 67 horas de incubación, se alcanzó una densidad celular de 4,2 g de peso celular seco por litro y produjo un total de 93 g de precipitado celular húmedo después de la recuperación.

B. Fermentación de la cepa 1678 (L1 de PVH tipo 16)

Los procedimientos usados para la preparación de cultivos de cepas congeladas, desarrollo de inóculos, fermentación y recuperación celular de la cepa 1678 fueron esencialmente como se ha descrito anteriormente. Después de 70,5 horas de incubación, los contenidos de dos fermentaciones de 10 l de acumularon (una densidad celular de 8,7 g de peso celular seco por litro), que produjeron un total de 258 g de precipitado celular húmedo después de la recuperación.

C. Purificación de las proteínas recombinantes de la cápsida L1 de PVH tipo 16

Todas las etapas se realizaron a 4ºC, a menos que se especifique otra cosa.

Las células de la cepa 1678 estaban almacenadas congeladas a -70ºC. Las células congeladas (peso húmedo=
128 g) se descongelaron a 20ºC-23ºC y se resuspendieron en 140 ml de "tampón L1 modificado" (fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 100 mM). Se añadieron inhibidores de la proteasa PMSF y pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 2 mM y 1,7 \muM, respectivamente. La pasta celular se fragmentó a una presión de aproximadamente 110.316 kpa pasándola tres veces en un microfluidificador M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). La pasta celular fragmentada se centrifugó a 11.000 g durante 40 minutos para eliminar restos celulares. El sobrenadante líquido que contenía el antígeno L1 se recuperó.

El sobrenadante líquido se diluyó a 1:5 añadiendo tampón A (MOPS 20 mM a pH 7,0) y se aplicó a una columna de captura de intercambio aniónico (ID 5,0 cm x 6,4 cm) de resina Fractogel®EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) equilibrado en Tampón A. Tras un lavado con el Tampón A, se produjo la elución del antígeno con un gradiente de 0-1,0 M de NaCl en Tampón A. La determinación de las fracciones de la columna que contenían la proteína L1 se realizó mediante inmunotransferencia.

Las fracciones TMAE que mostraban pureza comparable y que estaban enriquecidas en la proteína L1 se acumularon. Se procedió a la concentración del antígeno mediante fraccionamiento con sulfato amónico. Las muestras se ajustaron a una concentración de sulfato amónico saturada al 35% añadiendo reactivo sólido en agitación suave, durante 10 minutos. Las muestras se introdujeron en hielo y se dejó que se produjera la precipitación durante 5 horas. Las muestras se centrifugaron a 12.000 g. El precipitado se resuspendió en 20,0 ml de PBS (fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, NaCl 150 mM).

El producto final se analizó con SDS-PAGE usando tinción con Coomassie coloidal. Se estimó que la proteína L1 era homogénea al 70%. La identidad de la proteína L1 se confirmó mediante técnicas de Western blot usando los antisueros adecuados. El producto final se alicuotó y se almacenó a -70ºC. Este procedimiento dio lugar a un total de 7,4 mg de proteína.

D. Procedimientos analíticos Inmunotransferencia

Las muestras de diluyeron (cuando fue necesario) al 1:10 en Milli-Q-H_{2}O y 10 \mul de la muestra se dispersaron sobre membranas PCDF de PolyScreen^{TM} (NEN Research Products, Boston, MA). Después de que las manchas se secaron, las membranas se lavaron con agua y se dejaron secar. Se preparó una solución de anticuerpo primario mediante dilución del antisuero adecuado en tampón de transferencia (5% de leche desnatada en fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, ClNa 150 mM, 0,02% de NaN_{3}). La incubación se realizó durante al menos una hora a 20ºC-23ºC. Cada mancha se lavó durante 1 minuto, cambiando tres veces el PBS (fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, ClNa 150 mM). La solución de anticuerpos secundarios se preparó diluyendo el adecuado antisuero conjugado ligado a la fosfatasa alcalina en tampón de transferencia. La incubación se realizó, en las mismas condiciones, durante al menos 1 hora. Las manchas se lavaron como antes y se detectaron usando un sustrato NBT/BCIP de 1 etapa (Pierce, Rockford, IL).

Los anticuerpos usados para la detección fueron los siguientes:

PVH6aL1 se detectó mediante MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). PVH6aL2 se detectó mediante los grupos de suero de fusión de ratón antiPVH6aL2-trpE números 641 y 647 (de producción casera por M. Rosolowski). PVH16L1 se detectó mediante MAB 885 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). PVH16L2 se detectó mediante el suero de fusión de ratón antiPVH16L2-trpE número 611 (de producción casera por K .Jansen).

Método Bradford para la determinación de proteína total

La proteína total se determinó usando el kit comercializado Coomassie Plus® kit (Pierce, Rockford, IL). Las muestras se diluyeron a los niveles adecuados en Milli-Q-H_{2}O. Los volúmenes requeridos fueron de 0,1 ml y de 1,0 ml para los protocolos estándar y de microensayos, respectivamente. Para ambos protocolos, se usó BSA (Pierce, Rockford, IL) para generar la curva estándar. El ensayo se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las curvas estándar se representaron usando software CricketGraph® en un ordenador Mcintosh Iici.

Ensayos con SDS-PAGE y de transferencia Western

Todos los geles, tampones y aparatos electroforéticos se obtuvieron de Novex (San Diego, CA) y se utilizaron según las recomendaciones del fabricante). Brevemente, las muestras se diluyeron a concentraciones proteicas iguales en Milli-Q-H_{2}O y se mezclaron en una relación 1:1 con tampón de incubación de la muestra que contenía DTT 200 mM. Las muestras se incubaron durante 15 minutos a 100 ºC y se cargaron en geles de Tris- glicina al 12% previamente fundidos. Se procedió a la electroforesis de las muestras a 125 V durante 1 hora y 45 minutos. Los geles se revelaron usando tinción de plata mediante una variación del método de Heukeshoven y Dernick [ Electrophoresis, 6 (1985) 103-112] o tinción con Coomassie coloidal usando un kit comercializado (Integrated Separation systems, Natick, MA). En el caso del Western blot, las proteínas se transfirieron a membranas PVDF a 25 V durante 40 minutos. Las membranas se secaron e incubaron con soluciones de anticuerpos, como para las técnicas de inmunotransferencia.

Ejemplo 35 Preparación de composiciones inmunogénicas

Las VLP purificadas se formulan según procedimientos conocidos, tales como la mezcla de vehículos, estabilizantes o un adyuvante vacunal farmacéuticamente aceptables. Las VLP inmunogénicas de la presente invención pueden prepararse para su uso como vacunas combinándolas con una composición fisiológicamente aceptable, tales como, por ejemplo, PBS, suero salino o agua destilada. Las VLP inmunogénicas se administras en un intervalo de dosificación de 0,1 \mug a 100\mug, preferiblemente de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 20 \mug, para obtener el efecto inmunogénico deseado. La cantidad de VLP por formulación puede variar según una serie de factores incluyendo pero no limitándose a la enfermedad, el peso, la edad y el sexo del individuo. La administración de la formulación de VLP se puede realizar de varias formas, incluyendo pero no limitándose a, por vía oral, subcutánea, tópica, mucosal e intramuscular. Dichas formulaciones de VLP pueden estar comprendidas por un único tipo de VLP (es decir, VLP de PVH6a) o por una mezcla de VLP (es decir, VLP de PVH6a, PVH11, PVH16 y PVH18).

Opcionalmente, puede estar presente un conservante antimicrobiano, por ejemplo, tiomersal. Los antígenos inmunogénicos de la presente invención puede emplearse, si se desea, en combinación con estabilizantes de vacunas y adyuvantes de vacunas. Los estabilizantes tópicos son compuestos específicos, por ejemplo polianiones tales como, heparina, hexasulfato de inositol, betaciclodextrina sulfatada, excipientes menos específicos, por ejemplo, aminoácidos, sorbitol, manitol, xilitol, glicerol, sacarosa, dextrosa, trihalosa, y variaciones en las condiciones d la solución, por ejemplo, pH neutro, elevada fuerza iónica (ca.sales 0,5 M-2M), cationes divalentes (Ca^{2+}, Mg^{2+}). Entre los ejemplos de adyuvantes se encuentran Al(OH)_{3} y Al(PO_{4}). Las vacunas de la presente invención pueden almacenarse en refrigeración o en forma liofilizada.

Ejemplo 36 Preparación de anticuerpos frente a VLP

Las VLP purificadas se usan para generar anticuerpos. El término "anticuerpo", como se usa en la presente invención, incluye anticuerpos tanto monoclonales como policlonales así como fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab)2 capaces de unir antígenos o haptenos. Los anticuerpos se usan de varias maneras, incluyendo pero no limitándose a, la purificación de VLP recombinantes, la purificación de proteínas L1 o L2 nativas y kits. Los kits comprenderían un vehículo dividido en compartimentos adecuado para mantener en su interior al menos un vial. Además, el vehículo comprendería reactivos tales como el anticuerpo antiVLP o la VLP adecuada para detectar PVH o fragmentos de PVH o anticuerpos frente a PVH. El vehículo puede también contener medios para la detección, como por ejemplo antígenos marcados o sustratos enzimáticos o similares. Los anticuerpos o las VLP o los kits son útiles para varios propósitos, incluyendo pero no limitándose a, análisis forenses y estudios epidemiológicos.

Ejemplo 37 Purificación de proteínas recombinantes de la cápsida L1 de PVH tipo 11

Todas las etapas se realizaron a 4ºC, a menos que se especifique otra cosa.

Las células estaban almacenadas a -70ºC. Las células congeladas (peso húmedo=180 g) se descongelaron a 20ºC-23ºC y se resuspendieron en 900 ml de "tampón de rotura" (MOPS 50 mM, a pH 7,2, NaCl 500 mM, CaCl_{2} 1 mM). Se añadieron inhibidores de la proteasa AEBSF y pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 1 mM y 1,7 \muM, respectivamente. La pasta celular se fragmentó a una presión de aproximadamente 110316,8 kpa pasándola 4 veces en un microfluidificador M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). A la pasta celular fragmentada se añadió un volumen suficiente de detergente Triton X100® al 10% (Pierce, Rockford, IL) para llevar la concentración de TX100 a un valor de 0,5%. La pasta se agitó durante 20 horas. El lisado tratado con Triton X100 se centrifugó a 12.000 g durante 40 minutos para eliminar restos celulares. El sobrenadante líquido que contenía el antígeno L1 se recuperó.

El sobrenadante líquido se sometió a diafiltración frente a cinco volúmenes de fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 1,5 M usando un módulo de membrana de flujo tangencial de 300K (Filtron, Northborough, MA). Mediante técnicas de radioinmunoensayo y de Western blot se mostró que el material retenido en ña membrana contenía la proteína L1.

El material retenido se introdujo en una columna de afinidad de alta resolución (ID 11,0 cm x 5,3 cm) de resina SP Spherodex (M)® (IBF, Villeneuve-la-Garenne, France) equilibrada en fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,5 M. Tras un lavado con el tampón de equilibrado y una etapa de lavado con fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 1,0 M, se produjo la elución de la proteína L1 con una etapa de lavado con fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 2,5 M. Las fracciones se recogieron durante los lavados y la elución. Las fracciones de la columna se analizaron para determinar la proteína total mediante el método de Bradford. A continuación, las fracciones se analizaron mediante Western blot y SDS-PAGE con detección con Coomassie coloidal. Las fracciones también se analizaron mediante radioinmunoensayo.

Las fracciones SP Spherodex que mostraron pureza comparable y enriquecidas con proteína L1 se guardaron.

El producto final se analizó con Western blot y SDS-PAGE con detección con Coomassie coloidal. Se estimó que la proteína L1 tenía una homogeneidad \geq90. La identidad de la proteína L1 se confirmó mediante técnicas de Western blot. El producto final se filtró en condiciones de asepsia a través de una membrana de 0,22 \mum y se almacenó a 4ºC. Este procedimiento dio lugar a un total de 100 mg de proteína.

Los análisis de microscopia electrónica se realizaron mediante Structure Probe (West Chester, PA). Una alícuota de cada muestra se colocó en una malla de cobre de 200 mesh recubierta con carbono. Una gota de ácido fosfotúngstico (PTA) al 2% se introdujo en la malla durante 20 segundos y a p 7,0. La malla se dejó secar al aire antes del análisis de TME. Todas las técnicas microscópicas se realizaron usando un microscopio de transmisión de electrones JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) y una tensión de aceleración de 100 kv. Las microfotografías generadas tienen un aumento final de 100.000.

Método de Bradford para determinar la proteína total

Ensayos SDS-PAGE y transferencia Western

Todos los geles, tampones y aparatos electroforéticos se obtuvieron de Novex (San Diego, CA) y se utilizaron según las recomendaciones del fabricante). Brevemente, las muestras se diluyeron a concentraciones proteicas iguales en Milli-Q-H_{2}O y se mezclaron en una relación 1:1 con tampón de incubación de la muestra que contenía DTT 200 mM. Las muestras se incubaron durante 15 minutos a 100 ºC y se cargaron en geles de Tris-glicina al 12% previamente fundidos. Se procedió a la electroforesis de las muestras a 125 V durante 1 hora y 45 minutos. Los geles se revelaron usando tinción de Coomassie coloidal usando un kit comercializado (Integrated Separations Systems, Natick, MA).

En el caso del Western blot, las proteínas se transfirieron a membranas PVDF a 25 V durante 40 minutos. Las membranas se lavaron con Milli-Q-H_{2}O y se dejaron secar al aire. El anticuerpo primario fue antisuero policlonal de conejo frente a la proteína de fusión trpE-PVH11L1 (regalo del Dr. D. Brown). La solución de anticuerpos se preparó mediante dilución del antisuero en tampón de transferencia (5% de leche desnatada en fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, ClNa 150 mM, 0,02% de NaN_{3}). La incubación se realizó durante al menos 1 hora a 20ºC-23ºC. Cada mancha se lavó durante 1 minuto, cambiando el PBS tres veces (fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, NaCl 150 mM). La solución del anticuerpo secundario se preparó diluyendo antisuero conjugado ligado a la fosfatasa alcalina-IgG anticonejo de cabra (Pierce, Rockford, IL) en tampón de transferencia. La incubación avanzó durante al menos 1 hora en las mismas condiciones. Las manchas se lavaron como antes y la detección se realizó usando un sustrato NBT/BCIP de 1 etapa (Pierce, Rockford, IL).

Ejemplo 38 Purificación de las proteínas recombinantes de L1 de la cápsida de PVH tipo 6a

Todas las etapas se realizaron a 4ºC, a menos que se especifique otra cosa.

Las células estaban almacenadas a -70ºC. Las células congeladas (peso húmedo=60 g) se descongelaron en un baño de agua a 45ºC y se resuspendieron en 300 ml de "tampón de rotura" (MOPS 50 mM, a pH 7,2, NaCl 500 mM, CaCl_{2} 1 mM). Se añadieron inhibidores AEBSF de la proteasa y pepstatina A hasta unas concentraciones finales de 1 mM y 1,7 \muM, respectivamente. La pasta celular se fragmentó a una presión de aproximadamente 110316,8 kpa pasándola 5 veces en un microfluidificador M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). A la pasta celular fragmentada se añadió un volumen suficiente de detergente Triton X100® al 10% (Pierce, Rockford, IL) para llevar la concentración de TX100 a un valor de 0,5%. La pasta se agitó durante 18 horas. El lisado tratado con Triton X100 se centrifugó a 12.000 g durante 40 minutos para eliminar restos celulares. El sobrenadante líquido que contenía el antígeno L1 se recuperó.

El sobrenadante líquido se sometió a diafiltración frente a cinco volúmenes de fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,5 M usando un módulo de membrana de flujo tangencial de 300K (Filtron, Northborough, MA). Mediante técnicas de radioinmunoensayo y de Western blot se mostró que el material retenido en la membrana contenía \geq90% de la cantidad original de la proteína L1.

El material retenido se introdujo en una columna de afinidad de alta resolución (ID 5,0 cm x 10,0 cm) de resina POROS® 50HS (perseptive Biosystems, Cambridge, MA) equilibrada en fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,5 M. Tras un lavado con el tampón de equilibrado se produjo la elución de la proteína L1 en un gradiente lineal de concentraciones de NaCl de 0,5 M- 1,5 en fosfato sódico 20 mM a pH 7,2, NaCl. Las fracciones se recogieron durante los lavados y la elución. Las fracciones de la columna se analizaron para determinar la proteína total mediante el método de Bradford. A continuación, las fracciones se analizaron mediante Western blot y SDS-PAGE con detección con Coomassie coloidal. Las fracciones también se analizaron mediante radioinmunoensayo.

Las fracciones de la columna que mostraron pureza comparable y enriquecidas con proteína L1 se guardaron. Las fracciones agrupadas se filtraron en condiciones de asepsia a través de una membrana de 0,22 \mum. El producto se concentró en una célula agitada de 50 ml usando membranas YM-100 de lámina plana de 43 mm (Amicon, Beverly, MA) a una presión de N_{2} de 27,58-41,37 kpa. El producto se almacenó a 4ºC. Este procedimiento dio lugar a un total de 2,7 mg de proteína.

Posteriormente, una muestra del producto final se concentró mediante precipitación con TCA y se analizó con las técnicas de transferencia Western y SDS-PAGE con detección con Coomassie coloidal. Mediante densitometría de geles teñidos con Coomassie coloidal se mostró que la proteína L1 tenía una homogeneidad \geq90%. La identidad de la proteína L1 se confirmó mediante transferencia Western.

Método de Bradford para determinar la proteína total

Ensayos SDS-PAGE y transferencia Western

Todos los geles, tampones y aparatos electroforéticos se obtuvieron de Novex (San Diego, CA) y se utilizaron según las recomendaciones del fabricante). Brevemente, las muestras se diluyeron a concentraciones proteicas iguales en Milli-Q-H_{2}O y se mezclaron en una relación 1:1 con tampón de incubación de la muestra que contenía DTT 200 mM. Las muestras se incubaron durante 15 minutos a 100 ºC y se cargaron en geles de Tris- glicina al 12% previamente fundidos. Se procedió a la electroforesis de las muestras a 125 V durante 1 hora y 45 minutos. Los geles se revelaron usando tinción con Coomassie coloidal usando un kit comercializado (Integrated Separations Systems, Natick, MA).

En el caso del Western blot, las proteínas se transfirieron a membranas PVDF a 25 V durante 40 minutos. Las membranas se lavaron con Milli-Q-H2O y se dejaron secar al aire. El anticuerpo primario fue MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA), que había sido unido covalentemente a la enzima fosfatasa alcalina (j. Cook, MRL). La solución del anticuerpo se preparó mediante la dilución del antisuero en tampón de transferencia (5% de leche desnatada en fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, ClNa 150 mM, 0,02% de NaN_{3}). La incubación se realizó durante al menos 1 hora a 20ºC-23ºC. Cada mancha se lavó durante 1 minuto, cambiando el PBS tres veces (fosfato sódico 6,25 mM, a pH 7,2, NaCl 150 mM). Las manchas se detectaron usando un sustrato NBT/BCIP de 1 (Pierce, Rockford, IL).

(1)INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Lehman, Ernest D.

\hskip3,4cm

Cook, James C III.

\hskip3,4cm

George, Hugh A.

\hskip3,4cm

Hofmann, Kathryn J.

\hskip3,4cm

Jansen, Kathrin U.

\hskip3,4cm

Joyce, Joseph G.

\hskip3,4cm

Markus, Henry Z.

\hskip3,4cm

Schultz, Loren D.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEINAS PURIFICADAS DEL PAPILOMAVIRUS

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 20

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Carty, Christine E.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 126 E. Lincoln Avenue, PO Box 2000

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: Rahway

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: New Jersey

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 07065-0907

\vskip0.666000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC IBM COMPATIBLE

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, versión 1.25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/339.368

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 de noviembre de 1994

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Carty, Christine E.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36.099

\vskip0.333000\baselineskip

(C): REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19341Y

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (908)594-6734

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TELEFAX: (908) 594-4720

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTTAAAGCTT ATGTCACTTT CTCTTGTATC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGATAAGCTT GCTCAATGGT TCTCTTCCTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGGTCATCCC AAATCTTGAA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CACCGTAGTG TTTGGAAGCG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.666000\baselineskip

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.666000\baselineskip

(B) TIPO: ácido nucleico

\vskip0.666000\baselineskip

(C) CADENA: sencilla

\vskip0.666000\baselineskip

(D) TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGGCTACCA GCGAGCCGGG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGCCAGTGGG CCAACAGGTT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCCCCCGGGC ACAAAACAAA ATGGCACATA GTAGGGCCCG ACGAC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCCCCCGGGC TAGGCCGCCA CATCTGAAAA AAATAAGC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAAGATCTTC AAAACAAAAT GGCAGTGTGG CTGTCTAC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAAGATCTTT ATTAAGTACG TCTCTTGCGT TTAG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGAATTCACA AAACAAAATG GTTGCACGGT CACGAAAAC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGAATTCTTA TTCTGCGTAG ACAGCCACAC TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGAGATCTT ACAGCTTACG TTTTTTGCGT TTAGC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTCTCTTT GGCTGCCTAT GTAGGCC

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGAGATCTT ACAGCTTACG TTTTTTGCGT TTAGC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCCCCCGGGC ACAAAACAAA ATGCGACACA AACGTTCTGC AAAAC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCCCCCGGGC TAGGCAGCCA AAGAGACATC TGA

\hfill

33

Claims

1. Un procedimiento para producir una proteína purificada de la cápsida de papilomavirus, que comprende:

(a): transformar una levadura hospedadora con una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína seleccionada de entre la proteína L1 de papilomavirus y las proteínas L1 + L2 de papilomavirus;

(b): cultivar el hospedador transformado en condiciones que permitan la expresión de la molécula de ADN recombinante para producir una proteína bruta recombinante de papilomavirus; y

(c): purificar la proteína bruta recombinante de papilomavirus con una única etapa de cromatografía usando cromatografía de intercambio iónico para producir la proteína purificada, siendo la proteína al menos un 90% pura.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre una resina POROS®.

4. Un procedimiento según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en el que el papilomavirus se selecciona de entre papilomavirus humano y papilomavirus de conejo de cola de algodón.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el papilomavirus humano se selecciona de entre PVH6a, PVH6b, PVH11, PVH16, PVH18, PVH31, PVH33, PVH35, PVH41, PVH45 y PVH58.