MXPA97007208A - Acido desoxiribonucleico que codifica para virus de papiloma humano tipo 18 y uso del mismo - Google Patents
Acido desoxiribonucleico que codifica para virus de papiloma humano tipo 18 y uso del mismoInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a moléculas de ADN que codifican para virus de papiloma humano tipo 18, compuestos derivados de ella y el uso de las mismas.
Description
ACIDO DESOXIRIBONUCLEICO QUE CODIFICA PORA VIRUS DE PAPILOMA HUMANO TIPO 18 Y USO DEL MISTO
REFERENCIAS CRUZADAS CON OTRAS SOLICITUDES
La presen-te es una continuación de la solicitud de
E.U.A. No. de erie 08/400,669 prosentada «1 22 de marzo de
1995, ahora pendiente, y una cont nuación de la solicitud de
E.U.A. No. de Serie 08/409,122 presentada el 22 de marzo de 1995, ahora pen ient ..
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presen+e invención es+á dirigida a moléculas de flDN que codifican virus de papiloma humano -t po 18 y derivados de las mismas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura l muestra las secuencias de nucleotidos de
HPV18 Ll y las secuencias deducidas de aminoácidos. La figura 2 muestra las secuencias de nucleotidos de HPV1T L2 y las secuencias deducidas de aminoácidos. La figura 3 muestra ?n i unoblot de protei a Ll de HPV18 expresada en levadura. La figura 4 muestra un inmunoblot de prote ina L2 de HPV18 expresada en levadura. La figura 5 es una nucrografía electrónica de partículas semejantes a virus formadas por- pro+eina Ll de HPV18 expresada en levadura.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones por virus de papiloma (PV) ocurren en una variedad de animales, incluyendo humanos, ovejas, perros, galos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los virus de papiloma infectan células epiteliales, induciendo generalmente tumores epiteliales o fibroepitelial.es benignos en el sitio de la infección. Los PV son agentes infecciosos específicos de especie; un virus de papiloma humano no infecta a un animal no humano. Los vi us de papiloma pueden clasificarse en grupos distintos en base al hu sped que infectan. los virus de papiloma humano (HPV) se clasifican ademas en más de 70 tipos en base a la homología de secuencias de flDN. Los tipos de PV parecen ser inmunógenos específicos de cada tipo, ya que la inmunidad neutralizante contra la infección por un tipo de virus de papiloma no confiere inmunidad contra o+ ro tipo de virus de papiloma. En humanos, los diferentes tipos de HPV ocasionan diferentes enfermedades. Los tipos de HPV 1, 2, 3, 4, 7, 10 y 2(5-29 ocasionan verrugas beni nas en individuos normales e inrnunodepprni os. Los HPV ipos 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50 ocasionan lesiones a nivel de superficie en individuos mmunocomprornetidos. Los HPV pos 6, 11, 34, 39, 41-44 y 51-b5 ocasionan cond lornas ben nos de la mucosa genital o respi rator ía. Los HPV tipos 16 y 18 ocasionan displasia epitelial de la mucosa genital y están asociados con la mayoría de carcinomas i *u e invasivos de cérvix, vagina, vulva y canal anal . Los virus de papiloma son virus de ADN pequeños (50-60 nrn), no envueltos, i cosahedp eos que codifican para hasta ochos genes tempranos y dos tardíos. Los marcos de lectura abiertos (ORFs) de los geno as de los virus se designan El a E7 y Ll a L2, en donde "E" deno+a temprano y "L" tardío. Ll y L2 codifican lae proteínas de la cápside del virus. Los genes tempranos (E) se encuent an asociados con funciones tales corno la replicación viral y la transformación celular. La rote ina 1.1 es la prot-eina mas importante de la cápside y tiene un peso molecular de 55-60 i.-Da. La proteína L2 es una protema menor de la cápside la cual tiene un peso molecular predicho de 75-100 kDa corno e, determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos mrnunologicos sugieren que la mayoría de la proteína L2 es interna a la proteí a Ll. El ORF de Ll se encuentra altamente conservado entre los diferentes virus de papiloma. Las proteínas L2 se encuentran menos conservadas entre los diferentes virus de papiloma.
Los genes de Ll y 1.2 se han identificado corno buenos blancos para mmunopro filaxis . Los estudios en los sistemas de virus de papiloma de conejo cola de al od n (O PV) y virus de papiloma bovino (BPV) han mo trado que las inmunizaciones con las proteínas Ll y L2 expresadas en bacterias o utilizando vectores de vacuna, protegieron a los animales de infección viral. La expresión de los genes Ll de virus de papiloma en sistemas de expresión de baculovirus, o utilizando vectores de vacuna, origina el ensamble de partículas semejantes a virus (VLP) las cuales se han utilizado para inducir altos ítulos en respuestas de anticuerpos neutralizantes de virus que se correlacionan con la protección contra el ataque del virus. Después del HPV tipo 16, el HPV 18 es el segundo tipo mas prevalente de HPV encontrados en carcinomas cervicales. Se detectó HPV 18 en 5-20% de b opsias de cáncer cervical recogidas en diferentes partes del undo (Tkenberg, H, 1990. Human papil l?mav us DNA in invasive genital carcinomas, en "Genital Papillomaví rus Infec+ ons" G. Gross y otros, eds. pag. 85-112). Parece haber una dependencia geográfica de infección con HPV 18 ya que las biopsias de tumor de las mujeres de África y Sudarnépca hospedan HPV 18 con mayor frecuencia que biopsias similares de mujeres Europeas y de Norteamérica. No se conocen las razones fundamentales para estas diferencias geográficas. Se hace extremadamente relevante el desarrollo de una vacuna contra infección por HPV 18 puesto que el HPV 18 también está asociado con cánceres que crecen rnás agresivamente y se encuentra raramente en las lesiones precursoras más leves, CIN t-p. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención esta dirigida a mol culas de
ADN que codifican virus de papiloma humano tipo 18 (HPV tipo 18; HPV18) y usos de las mol culas de ADN.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invenci n esta dirigida a moléculas de ADN que codifican virus de papiloma humano t-ipo 18 (HPV tipo 18; HPV18) y derivados de las mismas.. Tales derivados incluyen pero no se limitan a péptidos y proteínas que están codificadas por- el ADN, an»- i cuerpos contra el ADN o anticuerpos contra Las proteínas codificadas por el ADN, vacunas que comprenden el ADN o vacunas que comprenden proteínas codificadas por el ADN, composiciones inrnunológicas que comprenden el ADN o las proteínas codificadas por el ADN, equipos que contienen el ADN o ARN derivado a partir del ADN o proteínas codificadas por el ADN. Pueden formularse composiciones farmacéu camente útiles que comprenden el ADN o proteínas que codifica el ADN de conformidad a métodos conocidos tales como mediante la mezcla de ?n vehículo farmacéuticamente aceptable. Pueden encontrarse ejemplos de tales vehículos y métodos en el libro Remington's Pharmacouti l Sciences. Para formar una composición f rmacéuticame te aceptable para la administración efectiva, tales composiciones rontendran una cantidad efectiva de la prote na o VLP. Tales composiciones pueden contener proteínas o VLP derivados a partir' de rnas de un tipo de HPV. Las composiciones terapéuticas o diagnosticas de la invención se administ an a un individuo en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar infecciones por PV. La cantidad efectiva puedo variar de acuerdo a una variedad de factores tales como la condición del indiv duo, peso, sexo y edad. Otros factores incluyen el modo de administración. Generalmente las composiciones se administraran en dosis que se encuentran dentro del intervalo de lug a aproximadamente Img. Las composiciones farmacéuticas pueden proveerse al individuo mediante una variedad de rutas tales como subcutánea, tópica, oral, mucosa, intravenosa e intramuscular. Las vacunas de la i vención comprenden ADN, RNA o proteínas codificadas por el ADN que contienen los detepni nantes ant i gen eos necesarios para inducir la formación de anticuerpos neu-t ralizantee en el huésped. Tales vacunas son también sufic entemente seguras para administrarse sin peligro de infección clínica; no tienen efectos secundarios tóxicos; pueden administrarse mediante una ruta efectiva; son estables y son compatibles con los vehículos de vacuna. Las vacunas pueden adm istrarse mediante una variedad de rutas, tales como oralmente, parenteralmente, subcutáneamente, a través de la mucosa, in ravenosamente o int rarnuecul rmente. La dosificación admin s rada puede variar con la condición, sexo, pe o y edad del individuo; la ruta de administración y el tipo de PV de la vacuna. La vacuna puede utilizarse en formas de dosis tales corno capsulas, suspensiones, elíxires o soluciones líquidas. La vacuna puede formularse con un vehiculo inrnunológicarnente aceptable. Las vacunas se administran en cantidades terapéuticamente efectivas, esto es, en cantidades suficientes para generar una respuesta inrnunolog carnente protectora. La cantidad terap uticamente efectiva puede variar de acuerdo al tipo de PV. La vacuna puede adminis rarse en una dosis única o en dosis múltiples. El ADN y los derivados de ADN de la presente invención pueden utilizarse en la formulación de composiciones inrnunogenicas. Tales composiciones, cuando se introducen en un huésped adecuado, son capaces de inducir una respueeta inmune en el mismo. Pueden utilizarse ADN o sus derivados para generar anticuerpos. El término "anticuerpo" como se utiliza aquí incluye ambos anticuerpos policlonal y rnonoclonal, así corno fragmentos de ellos, tales co o Fv, Fab y F(ab)2 los cuales son capaces de unirse a un antígeno o hapteno. El ADN y los derivados de ADN de la presente invención pueden utilizarse par-a tipificar en suero la infección por HPV y la verificación de HPV., Fl ADN, proteínas recornb mant s, VLP y anticuerpos se prestan a la formulación de equipos adecuados para la detección y tipificación en suero de HPV. Tal equipo podría comprender un portador- dividido en compar imientos adecuado para mantener confinado por lo menos un contenedor. El portador comprendería ademas reactivos tales corno ADN de HPV18, p rote ina recoinbi nante de HPV o VLP o anticuerpos ant i -HPV adecuados para detectar una variedad de tipos de HPV. El portador puede contener también medios para la detección tal corno ant i geno o sustratos de enzima marcados o similares.. El ADN y l s prote as deri adas a partir del mi mo son también útiles co o marcadores de peso molecular y tamaño de molécula. Corno el código genético esta degenerado, puede utilizarse rnás de un codon para codificar un aminoácido particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede codificarse por1 cualquiera de un conjunto de oligonucl eotidos similares de ADN. Solamente un miembro del conjunto sera idéntico a la secuencia de HPV18 pero será capaz de hibridarse a ADN de HPV13 aún en presencia de oligonucleótidos de ADN con desapareanientos ba o condiciones apropiadas. Bajo condiciones alternas, los oligonucleótidos desapareados pueden hibridarse aun al ADN de HPV18 para permitir la identificación y aislamiento del ADN que codifica para HPV18. Puede utilizarse ADN de HPV18 purificado de la invención o fragmentos del mismo par-a aislar y purificar- hom logos y fragmentos de HPV18 a partir de otras fuentes. Para lograr esto, el primer ADN de HPV 18 u e mezclarse con una muest a que contenga ADN que codifique homólogos de HPV18 bajo condiciones apropiadas de hibridaci n. El complejo h bpdado de ADH puede aislarse y el ADN que codifica los hom logos de ADN puede purificarse a partir de ello. Se sabe que existe una cantidad sustancial de redundancia en los diferentes codones que codifican para amino cidos específicos. Por- lo tanto, esta invención también está dirigida a aquellas secuencias de ADN las cuales contienen codones alternativos que codifican para la eventual traducción del amino cido idéntico. Para propósitos de esta especificación una secuencia que lleva uno o más codones reernplazados se definirá corno una variación degenerada. También incluidas dentro del alcance de la presente invención se encuentran mutaciones ya sea en la secuencia de ADN o en la proteina t-raducida las cuales no alteran de manera sustancial Jas propiedades físicas fundamentales de la proteina expresada. Por ejemplo, la sustitución de valí na por- leucma, arg mna por lisina o asparagina por glutamina, puede no ocasionar un cambio en la funcionalidad del polipéptido. Se sabe que las secuencias de ADN que codifican para un péptido pueden alterarse de manera que codifiquen para un péptido que tiene propiedades que son diferentes que aquellas del peptido que ocurre en la naturaleza. Los métodos para alterar las secuencias de ADN incluyen pero no se limitan a inutagenesis dirigida al sitio. Tal corno se utiliza aquí, un "derivado funcional" de HPV18 es un compuesto que posee una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialrnente similar a la actividad biológica de HPVJ8. El término "derivados funcionales" intenta incluir los "fragmentos", "variantes", "variantes degeneradas", "análogos" y "homólogos" o "derivados químicos" de HPV18. Fl término "fragmento" se refiere a cualquier subconjunto de polipep-t i dos de HPV18. El término "variante" se refiere a una molécula sustancial ente similar- en estructura y función a la molécula completa de HPV18 o a un fragmento de la misma. Una molécula es "sustancialrnente similar" a HPV18 si ambas moléculas tienen estructuras sustancialrnente similares o si ambas moléculas poseen actividad biológica similar. Por- lo tanto, si las dos moléculas poseen actividad sustancialrnente similar, se consideran co o variantes aun s la eetructur-a de una de las mol culas no se encuentra en la otra o aún si las dos secuencias de amino cidos no son idénticas. El término "análogo" se refiere a una molécula sustancialrnente similar en función a la molécula completa de HPV18 o a un fragmento de la isma. Puede utilizarse una variedad de procedimientos para clonar molecularmente ADN de HPV18. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, dirigir la expresión funcional de los genes de HPV18 después de la construcción de un ADNc que contenga HPV18 o una colección de ADN genómico en un sistema apropiado de vector de expresión. Otro método es verificar la presencia de ADNc que contiene HPV10 o la colección de ADN genornico const ruido en un bacteriófago o vector de plásrnido con una sonda de ol gonucleot-idos marcada diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos de HPV18. Este ADN parcial se obtiene mediante la amplificación específica mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de fragmentos de ADN de HPV18 través del diseño de iniciadores de olí on?cleot i dos degenerados a partir de la secuencia de aminoácidos de HPV18 purificado. Otro método es aislar ARN a partir de células productoras de HPV18 y traducir el ARN a proteínas mediante un sistema de traducción _?n vi tro o _?_n vivo. La traducción de ARN a un péptido o una proteína originara la producción de por lo menos una porción de proteína de HPV18 que puede identi ficarse mediante, por ejemplo, la actividad de la prote na de HPV18, o mediante la reactividad inrnunolog ca con un anticuerpo ant-i-HPV18. En este método, puede analizarse la presencia de ARN que codifica por lo menos una porción del HPV18 en grupos de ARN asilado a partir de células productoras de HPV18. Puede realizarse el fraccionamiento adicional del grupo de ARN para purificar el ARN de HPV18 a partir de ARN no perteneciente a HPV18. El peptido o proteina producidos mediante este método puede anal izarse para proveer secuencias de aminoácidos las cuales a su vez se utilizan para proveer iniciadores para la producción de ADNc de HPV18, o puede analizarse el ARN utilizado para traducción, proveer secuencias de nucleótidos que codifican para HPV18 y producir sondas para la verificaci n de una colección de ADNc de HPV18. Estos m todos se conocen en la técnica y pueden encontrarse en, por ejemplo, Sambrook , 3. , Fritsch, E.F», Mamatis, T en Molecular- Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1 89. Es evidente que otros i os de colecciones, así corno colecciones construidas a partir de otras células o tipos de células, pueden ser útiles para aislar el ADN que cod fica HPV18. Otros tipos de colecciones incluyen, pero no se limitan a, colecciones de ADNc derivadas de otras c lulas o lineas celulares que contienen colecciones de ADN genomico y de HPV tipo 18. La preparación de colecciones de ADNc puede realizarse mediante una variedad de técnicas. Las técnicas de const ucción de colecciones de ADNc pueden encontrarse por ejemplo, en Sanbrool--, 3. , y otros, citados antes. Es evidente que el ADN que codifica para HPV18 puede aislarse también a partir de una colección adecuada de ADN genómico. La construcción de colecciones de ADN genómico puede realizarse mediante una variedad de t cnicas. Las técnicas de const ruccion de una colección de ADN genómico pueden encontrase en Sambrook, 3. , y otros, citados antes. El ADN de HPV18 clonado o fragmentos del mis o obtenidos a través de métodos descritos en la presente invención pueden expresarse de manera recornb nante mediante la clonaci n molecular en un vector de expresi n que contiene un promotor- adecuado y otros elementos adecuados regulador-es de la ranscripción, y transferirse a células huésped procarióticas o eucap óticas para producir HPV18 recoinbi nante. Las técnicas para tales manipulaciones se describen completamente en Sarnbrool< , 3., y otros, citados antesa, y se conocen en la técni a . Los vectores de expresión se definen en la pr-esente invención corno secuencias de ADN que se requieren par-a la transcripción de copias clonadas de genes y la traducción de sus ARN s en un huésped apropiado. Tales vectores pueden utilizarse para expresar genes eucarióticos en una variedad de huéspedes tales corno bacterias, algas verdeazules, células vegetales, células de insecto, células de hongos y células animales. Los vectores designados específicamente permiten el lanzamiento de ADN en r-e huespedes tales como células de bacteria-levadura o células de bacteria-animal o células de bacteria-hongo o células de bacteria-invertebrado. Un vector de expresión construido de manera adecuada debe contener: un origen de replicación para la repl icación autónoma en células huésped, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios útiles de enzima de restricción, un potencial para un alto numero de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige una pol imerasa de ARN a unirse con el ADN e inicia la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es uno que causa que los ARNrns sean iniciados a alta frecuencia. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no limitarse a, vectores de clonaci n, vectores de clonación modificados, plasrnidos diseñados específicamente o virus. Puede utilizarse una variedad de vectores de expresión de mamíferos para expresar ADN de HPV18 o fragmentos de Jos mismos en células de mamíferos. Los vectores de expresión de mamífero disponibles conercialrnente que pueden ser adecuados para l a expresión de HPV18 recornbi ante, incluyen pero no se limitan a, pcJ)NA3 ( Tnvitrogen) , pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y lamhdaZD35 (ATCC 37565). Puede utilizarse una variedad de vectores de expresión para expresar- ADN de HPV13 o fragmentos del misino en células bacterianas. Los vectores bacterianos de expresión que pueden ser adecuados e incluyen, pero no se limitan a pETlla (Novagen) , lambda gtll (Invitrogen) , pcDNAII (Inv trogen) , PKK223-3 (Pharmacia). Puede utilizarse una variedad de vectores de expresión de células de hongos para expresar HPV18 o fragmentos del mismo en células de hongos. Los vectores de expresión disponibles comercialrnente que pueden ser adecuados incluyen pero no se limitan a ?YES2 ( Invitrogen) , vector de expresión Pichia (Invitrogen) y expresión Hansenula (Rhein Biotech., Dusseldorf, Alemania). Puede utilizarse una variedad de vectores de expresión de células de insectos para expresar ADN de HPV18 o fragmentos de ellos en células de insecto. Los vectores de expresión de células de insecto disponibles cornercialrnente que pueden ser adecuados incluyen pero no se limitan a pBlue Bac Til (Tnvitrogen) y pAcUUdl (PharMmgen, Inc.), Puede utilizarse un vec+or de expresión que contiene ADN que codifica par-a HPV18 o fragmentos del mismo para expresar- proteínas de HPV18 en una célula, tejidos, órganos o animales (incluyendo humanos). Las células huésped pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluyendo pero no limitándose a bacterias tales como E^ coli , células fúngicas tales como levadura, células de rnarní fero incluyendo pero no limitándose a líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono y roedor, y células de insecto incluyendo pero no limitándose a lineas celulares derivadas a partir de Drosophila y gusano de seda. Las lineas celulares derivadas a partir de especies de mamífero que pueden ser adecuadas y que son cornercialmente disponibles incluyen per no se limitan a, células L L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-KI (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171).
El vector de expresión puede introducirse en las células huésped mediante cualquiera de un número de técnicas incluyendo pero no limitándose a transformación, t ransmfección, lipofección, fusión de protoplastos y elect roporacion. Las células que contienen el vector' de expresión se propagan clonalrnente y se analizan de manera individual para determinar si producen la proteína HPV18, La identificación de los clones de las células huésped que expresan HPV18 puedo hacerse por varios medios, incluyendo peto no limitándose a reactividad inmuno1 gi ca con anticuerpos an i-HPV18, tales como una unión de ligando específico o transducción «Je señal de HPV18 definida como una respuesta mediada por la interacción de ligandos específicos de HPV18 con las proteínas expresadas de HPV18. Puede realizarse también la expresión de fragmentos de ADN de HPV utilizando ARNrn sintético o ARNm nativo producidos j_n v t ro. Fl ARNrn sintetizo o el ARNrn aislado a partir- de células productoras de HPV18 puede traducirse de manera eficiente en varios sistemas libres de células, incluyendo pero no limitándose a extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos así como también en varios sistemas a base de células, incluyendo pero no limitándose a, ovocitos de rana, siendo preferida la microi nyección en ovocitos de rana - Después de la expresión de proteína(s) de HPV18 en una célula huésped, la proteína de HPVJ8 puede recuperarse para proveei HPV18 en forma purificada. Varios procedimientos de purificaci n de HPV18 se encuentran disponibles y son adecuados par-a su uso. Tal como se describe aquí, la proteína recornbinante de HPV 18 puede purificarse a partir de lisados y extractos de células mediante varias combinaciones de, o aplicación individual de, fraccionamiento de sales, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía por adsorción de hidroxilapa i ta y cromatografía de interacción hl dro fobj ca. Ademas, el HPV 18 recornbi nante puede separarse de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoa f nidad hecha con anticuerpos rnonoclonales o pol clonales específicos para la proteína completa naciente de HPV18 o fragmentos de polipéptido de HPV18. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales y pol clonales de conformidad con una variedad de métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo monoclonal o rnonoespeci fi co tal corno se utiliza on la presente invención se define co o una única especie de anticuerpo o especies múltiples de anticuerpo con características homogéneas de unión para la HPV18. La unión homogénea tal como se utiliza aquí se refiere a la habilidad de la especie de anticuerpo para unirse a un antigeno o epítope espec fico. Fs evidente que los métodos para producir anticuerpos rnonoespecí fieos pueden utilizarse para producir anticuerpos específicos para fragmentos de polipéptido de HPV18, o el polipépt do completo naciente de HPV18. Específicamente, es evidente que pueden generarse los anticuerpos rnonoespecí fieos los cuales son específicos par-a HPV18 completamente funcional o fragmentos del mismo. La presente invención también se encuentra dirigida a métodos par-a seleccionar compuestos que modulan la expresión del ADN o ARN que codifican para HPVl?, así corno también a la función(es) de la proteina(s) de HPV18 _in vivo. Los compuestos que modulan estas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas, o moléculas orgánicas no- rote aceas. Los compuestos pueden modular aumentando o atenuando la expresión de ADN o ARN que codifican para HPV18, o la función de la prote?na de HPV18. Los compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifica para HPV18 o la función de la proteína de HPV18 pueden detectarse mediante una variedad de pruebas. La prueba puede ser- una sencilla prueba de "si/no" para determinar-si existe un cambio en la expresi n o la función. La prueba puede hacerse cuantitativa comparando Ja expresión o función de una muestra experimental con los niveles de expresión o función en una mezcla normal. Pueden prepararse equipos que contengan ADN de HPV18, fragmentos de ADN de HPV18, anticuerpos contra ADN de HPV18 o proteina de HPVl?, ARN de HPVl? o proteína de HPVl?. Tales equipos se utilizan para detectar ADN el cual se híbrida a ADN de HPV18 o para detectar la presencia de proteína(s) de HPVl? o fragmentos de péptido en una muestra. Tal caracterización es útil para una variedad de propósitos incluyendo pero no limitándose a análisis forenses y estudios epidemiológicos. Las secuencias de nucleot os que son complementarias a la secuencia de ADN que codi fica para HPV18 pueden sintetizarse para terapia de an isentido. Estas moléculas de antisentido pueden ser ADN, derivados estables de ADN tales corno fosforotioatos o rneti l fosfonatos, ARN, derivados estables de ARN tales corno 2'-0-al qui l-ARM u otros rnirnéticos de oligon?cleóti dos de antisentido de HPV18. Las moléculas ant i sentí do de HPV18 pueden int roducí ¡-se en las células mediante mi croinyeccion, encapeulación de liposomas o mediante ia expresi n a partir de vectores que acogen la secuencia anti sentido. La terapia de antisentido de HPV18 puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en donde sea benéfico reducir la actividad de HPV18. El término "derivado químico" describo una molécula que contiene porciones químicas adicionales las cuales noi-malmen e no forman parte de la molécula base. De manera alternativa, las porciones pueden atenuar efectos secundarios no deseables de la molécula base o disminuir su toxicidad. Ejemplos de tales porciones se describen en una variedad de textos, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences. Los compuestos identificados de conformidad con los métodos descritos en la presente invención pueden utilizarse solos en dosificaciones apropiadas definidas mediante pruebas de rutina con el fin de obtener la inhibición óptima de HPVl? o su actividad mientras que se lleva al mínimo cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser conveniente la coadrninist ración o la administración secuencial de otros agentes. De manera ventajosa, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en varias dosis divididas. Mas aún, los compuestos para la presente invención pueden administrarse mediante una variedad de rutas incluyendo pero no limitándose a íntranasal, oral, t ransdérrní ca, o mediante suposi t op os. Para el tratamiento de combinaci n con mas de un agente activo, en donde los agentes activos se encuentran en formulaciones separadas de dosis, los agentes activos pueden administrarse concurrentemente, o cada uno puede administrarse en tiempos escalonados. El régimen de dosificación utilizando los compuestos de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores incluyendo tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la severidad de la condición a tratarse; la ruta de administración; la función renal y hepática del paciente y el compuesto particular que se emplea . Un médico de experiencia ordinaria puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de fármaco requerido para prevenir, contraatacar o detener el progreso de la condición. La precisión óptima para lograr las concentraciones de fármaco dentro de la escala que producen eficacia sin toxicidad, requiere de un régimen diseñado en base a la cinética de la disponibilidad del fármaco hacia los sitios blanco. Fsto incluye una consideración de la dist ibución, equilibrio y eliminación de un fármaco. Eii los métodos de la presente invención, los compuestos que se describen aquí en detalle pueden foi mar- el ingrediente activo y se administran típicamente en una mezcla con diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables (referidos aquí colectivamente como materiales de "vehículo") seleccionados adecuadament con respec o a la forma indicada de administración, esto es, tabletas, capsulas, elixires, jarabes, supositorios, geles y similares, y consistentemente con la práctica farmacéutica convencional. Por' ejemplo, para la administración oral en forma de tableta o capsula, el componente activo del fármaco puede combinarse con un vehículo oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal corno etanol, glicerol, agua y similares. Más aún, cuando se de-ee o sea necesario, pueden incorporarse también aglutinantes, lubricantes, agentes <Jesintegrant.es y agentes colorantes a la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen sin limitación almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, beta-lac osa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sint ticas tales como acacia, tragacanto o algmato de sodio, carboxirnetilcelulosa, poliet lenglicol, ceras y similares. Los lubricantes utilizados en estas formas de dos ficación incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar-, bentonita, goma de xantano y similares.
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Para formas líquidas, puede combinarse el componente activo del fármaco en agentes de suspensión o dispersión con saborizante adecuado tales como las gomas sintéticas y naturales, por ejemplo, -tragacanto, acacia, netilcelulosa y similares. Otros agentes de dispersión que pueden utilizarse incluyen glicerina y similares. Para la administración parenteral, se desean suspensiones y soluciones estériles. Las preparaciones isotónicas que contienen generalmente conservadores adecuados se emplean cuando se desea la administración intravenosa. Las preparaci nes tópicas que contienen el componente activo del fármaco pueden mezclarse con una variedad de materiales de vehículo bien conocidos en la técnica tales como por ejemplo, alcoholes, gel de aloe vera, alantoína, glicerina, aceites de vitamina A y E, aceite mineral, rni ristilpiopionato de PPG2 y similares, para formar, por ejemplo, soluciones alcohólicas, limpiadores tópicos, cremas de limpieza, geles para la piel, lociones para la piel y champúes en crema o formulaciones de gel . Los compuestos de la presente invención pueden también administrarse en forma de sistemas de liberación de liposo as, tales corno vesículas ?mlarninaree, vesículas grandes uní laminares y vesículas rnult ila inares. Los liposomas pueden formarse a par-tir de una variedad de fosfolípidos tales como colesterol, esteaplarní na o fosfatidi Icol mas. Los compuestos de la presente invención pueden también 1 iberarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales corno vehículos individuales a los cuales las moléculas del compuesto se encuentran acopladas. Los compuestos de la presente invención pueden encontrarse también acoplados con polímeros solubles corno vehículos de fármaco que pueden utilizarse corno blancos. Tales polímeros pueden incluir pol vmil p? rrolidona, copolírnero de pirano, polihidroxipropí 1-rnetacp lamí dafenol , polihidroxietilaspartarnidafenol o pol et ilenoxi opol ll sina sustituidos con residuos de palmitoilo. Además, los compuestos de la presente invención pueden encontrarse acoplados a una clase de polímeros biodegradables útiles en lograr la liberación controlada del fármaco, por ejemplo, ácido poli láctico, poliepsilon-caprolactona, ácido polihidroxibutí rico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidro-piranos, policianoacplatos y copolimeros de bloque entrelazados o anfipaticos de hidrogeles. Los siguientes ejemplos ilustran la pr-esente invención sin limitar, sin embargo, a la misma.
EJEMPLO 1 Clonación de genomas HPV18
Se preparo ADN genómico total a partir de linea celular derivada de carcinoma cervical humano, SU756 (Freedman, R.S., y otr-os, 1982, In Vitro, Vol 18, págs. 719-726) mediante t cnicas normales. El ADN fue digerido con EcoRl y sometido a elect roforesi s a través de un gel preparativo de agarosa de ba a temperatura de fusión al 0.8%. Se extirpó una rebanada del gel que corresponde a los fragmentos de ADN de aproximadamente 12 kpb en longitud. La agarosa fue digerida usando enzima flgarase TM (Boehpnger Mannheirn, Inc..) y el ADN fraccionado en tamaño se precipitó, se desfosfonló y se ligó con brazos larnbda-EMBL4 (Stratagene, Tnc.) digerido con FcoRl . La genoteca larnbda se empacó usando un extracto de empaque Gigapacl-- II Gold (Stratagene, Tnc.)„ Se i enti icaron clones HPV18-pos? ti vos usando una sonda de ADN HPV18L1 de 700 pb que fue generada mediante reacción de cadena de polirnerasa (PCR) usando ADN SU756 corno molde, e iniciadores de nucleótido que fueron designados en base a la secuencia publicada de ADN HPV18 Ll (Colé y Danos, 1987, 3. Mol. Biol,, Vol. 193:599-608: Accesión a Genban #X05015). Se aisló ?n clon lambda HPV18- posi ti vo que contenía un inserto de fragmento de EcoRl de 12 l-'pb, y fue designado corno #J0 -1.
EJEMPLO 2 Construcción de vectores de expresión de levadura
Se amplificó el marco de lectura abierta (ORF) HPV18
Ll mediante PCR usando clon #187-1 corno molde, Vent polyrneraseTM (New England Biolabs, Inc.), 10 ciclos de amplificación (94°C, 1 rnm; 50°C, 1 rnin; 72°C, 2 min) y los siguientes iniciadores de nucleótido que contienen sitios de . '•)
flanqueo Bgl T T ( subrayados ) :
i c ia do de se n t i do ,
' --GAAGmTCTCACAAAACAAAATTGCTTTGTGGCGGCCT AGTG-- 3 ' , ini ci ador de cont rasent i do , 5 ' -GAAGATCTTTACTTCCTGGCACGTACACGCACACGC- ' .
El iniciador de sentido introduce una secuencia guia no traducida de levadura (Kmskern, y otros, 1986, Gene, Vol. 46:135-141) inmediatamente hacia el extremo 5' hacia el codón de rnetiomna iniciador de HPV18 Ll (señalado en negritas). El producto de 1.5 kpb Ll PCR fue digerido con BglII y purificado en gei. El vector- de expresión de levadura PgAl 1-10 se construyó aislando un fragmento de 1.4 kpb Sph? de un plás ido pro otor- GAL bi d?recc onal/pUC18 , que contiene los promotores divergentes GAL1-GAL10 del plásmido ?BM272 (provisto por Mar Dohnston, Washington University, St. Louis, Missouri). Los promotores divergentes están flanqueados en cada lado mediante una copia del te minador de transcripción ADHl de levadur-a, un sitio de clonación BarnHI localizado entre el promotor GAL1 y la primera copia del terrninador transcppcional ADHl y un sitio de clonación Srnal localizado entre el promotor GALIO y la segunda copia del terrninador transcripcional ADH1. Un vector- de lanzadera le levadura que consiste de ?BR322, el gen LEU2d de levadura, y el plásmido 2u de levadura (donación de Benjamín Hall, U versity of Washington, Seattle, w shngton) fue digerido con SphT y ligado con el fragmento promotor GAL divergente de 1.4 kpb Shpl, or-igmando ?GALl-10. pGALl-10 fue lineal izado con BarnHF que corta entre el promotor GAL1 y el tepnmador de transcripción ADH1. El vector digerido con BamHl y el fragmento HPVl? Ll PCR digerido con BglTI se ligaron y usaron para transformar células DH5 de E. coli (Gibco BRL, Inc.). Se aisló un plasrnido ?GALl-10 que contiene el gen HPVl? Ll y se designo corno ?l91-fi. Se const uyo un vector de expresión de levadura que coexpresa los genes de HPV18 tanto Ll como L2. El plásmido pl91-6 (pGALl-10 + HPV18 Ll ) fue digerido con Smal que corta entre el promotor GALIO y el terminador de transcripción ADH1. El gen L2 de HPV18 de 1.4 pb se amplificó mediante PCR según se describió anteriormente utilizando los siguientes iniciado es de oligonucleot i do que contienen sitios de flanqueo Srnal (subrayados):
iniciador de sentido 5 ' -TCCCCCGGGCACAAAACAAAATGGTATCCCACCGTGCCGCACGAC-3 ' , iniciador de contrasen ido 5 ' -TCCCCCGGCTAGGCCGCCACAAAGCCATCTGC-3 ' .
El iniciador de sentido introduce una secuencia guía no traducida de levadura (KnisK-ern y otros, 1986, citados antes) inmediatamente hacia el extremo 5' del codón de iniciación de met ionina de HPV18 L2 (señalado en negritas). El fragmento de PCR fue digerido con Smal, purificado en gei y ligado con el plasmido ?l91-6 digerido con Srnal . Se aisló un plásrnido ?GALl~10 que contenía los genes de HPV18 tanto Ll corno L2 y se designó como pl95-ll.
EJEMPLO 3 Tipificación de muestras clínicas
Se recogieron muestras de biopsia cervical en el Veterans Ad imstration Medical Center Indianapolis, Indiana (cortesía del Dr. Darron Brown) y en el Albert Einste Medial Center m Phi iadelphia, Pennsylvama (cortesía del Dr. Joan Adler) y se congelaron a -?0°C„ Se aisló ADN según lo describieron Brown y otros, 1993 (Brown, D. y otros, 1993, J. Clin. M crobiol., Vol. 31:2667-2673). Brevemente , se trataron los especímenes clínicos con un microdesmembrador Braun II (B. Braun Instruments, Melsungen, Alemania) y se solubilizaron en regulador de pH que contenía 10 mM de EDTA y 0.6% (p/v) de dodecilsulfato de sodio (SDS). Las muestras se ajustaron a pH 7.4 con 20 mM de Tris y la proteina fue digerida con 50 rncg/rnl de proteinasa K en presencia de 0.1 mcg/ml de ARNasa seguido por extracción con fenol/cloroforrno/alcohol isoamílico. EL ADN fue precipitado en etanol y cuantificado por medio de espectofotometría.
Las inuest r-as de ADN se seleccionaron para detectar- la presencia de HPV18 mediante PCR y análisis Southern blot . e arnplí f ico un segmento de 256 pb del ORF de HPV18 Ll por medio de PCR utilirando los siguientes iniciadores de ol igonucl eot dos:
iniciador de sentido, 5 ' -CAATCCTTA7 TATTAAAGGCACAGGTATG-3 ' , inicia do r de co nt i -a se nt i do 5 ' -CATCATATTGCCCAGGTACACGAGACGGTG- ' .
Las condiciones de PCR fueron de conformidad con las recomendaciones del fabricante para el equipo ADN polimerasa Arn?l?Taq™/GenAmp™ (Perkín ELrner Corp,), excepto que se usaron 0.5 ul de ADN de muestra clínica corno molde y 10 pinoles de cada inic ador, 2 M dNTPs y 2 , 0 M de MgCl2 en la mezcla de reacción final . Un paso de desnaturalizaci n a 94°C, 2 minutos, fue seguido por 40 ciclos de amplificación (94°C, 1 min; 45°C, 1 rnin; 72°C, 1 rnin) Los productos de PCR fueron sometidos a elect roforésis a través de un gel de agarosa de 3.0%, aplicados corno manchas sobre membranas de nylon e hibpdados con una sonda de oligonucl óti os específica de HPVl? Ll marcada con
32p-„ EJEMPLO 4 Secuenciaci?n de ADN de los genes Ll y L2
Se secuenciaron los genes Ll y L2 de HPVl? en los clones #187-1, pl 1-6 y pl95-ll, utilizando el equipo de secuenciación PRIZM y el secuenciador automático de ADN ABI Sequ encer #373A (Applied Biosystems). Para obtener- una secuencia HPV18 de consenso, se amplificaron porciones del ADN del gen Ll mediante PCR a partir de ais Lados clínicos humanos, se secuenciaron y se compararon a las secuencias reivindicadas y publicadas. Se amplificó un fragmento de 256 pb (nucleótidos 817-1072) a partir de cada aislado de ADN clínico para este propósito utilizando los oligonucleótidos y ciclos de calentamiento descritos en el ejemplo 3. Se usaron los siguientes iniciadores,
' -GAAGnTCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG - ' y 5 ' -CCTAACGTCCTCAGAAACATTAGAC-3 '
para amplificar una porción de 432 pb aminoterrninal de ADN de Ll (nucleótidos 1-431) utilizando los ciclos de calentamiento descritos en el ejemplo 3. Ambos productos de PCR se ligaron separadamente con plásrnido pCRII (Invitrogen Corp.), utilizando los reactivos y procedimientos recomendados por el fabricante. Se aisló ADN plasmídico a partir de los transformantes, y los que contenían insertos de EcoRI, fueron secuenciados.
EJEMPLO 5 Análisis de ADN y secuencias deducidas de aminoácidos
En la figura l se muestran las secuencias de nucleotidos y las secuencias deducidas de aminoácidos (aa) del HPVl? Ll reivindicado. La secuencia de ADN fue derivada de un consenso de los clones #187-1, pl9l-6 y ?l95-ll. Una comparación de la secuencia de nucleotidos de HPV18 Ll con la secuencia publicada de HPV18 Ll (Accesión de Genban #X05015) i ("identifico cambios de 20 pb por 1524 pbs. Cinco de los cambios de nucleotidos (C a G en la posición 89, C a A en 263, C a G en 848, G a A en 967 y C a G en 1013) originaron substi uciones de aminoácidos. Las cinco diferencias de residuo en comparación con las publicadas son P a R en las posiciones aa 30, 283 y 338, T a N en aa 88 y V a l en aa 323, ver el cuadro 1 a continuación.
CUADRO 1
Las posiciones 88 y 323 representan cambios conservativos mientras que los TRES cambios P a R pueden alterar .substancialmente las propiedades fisiológicas de la
proteína Ll expresada. En el cuadro 1 anterior se muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos derivados a partir de aislados clínicos (números 354, 556, 755, 697, 795 y 23) con la secuencia reivindicada y la secuencia publicada. Hay 4
localizaciones en donde los aislados clínicos y la secuencia reivindicada difieren de la secuencia publicada. Las posiciones 30, 283 y 338 codifican arginina (R) en todos los aislados encontrados a la fecha, incluyendo la secuencia reivindicada.
Esto es un agudo contraste con la secuencia publicada que tenía prolinas (P) en cada una de estas iocalizaciones. Ademas, la posición 88 es una aspa agina (N) en Jos aislados y la secuencia reivindicada, pero es una treonina (T) en la secuencia publicada. La ultima diferencia, posición 323, se encon ró que era una val ma (V) en muchos de los aislados clínicos y la cepa publicada, contra una isoleucma (I) en la secuencia reivindicada y uno de los aislados (#23). La conclusión es que la secuencia reivindicada refleja las secuencias vi rales predominantes que están asociadas con infecciones clínicas, y la ausencia de aislados que contienen cualquiera de las prolmas en la posición 30, 283 ó 338 de la secuencia publicada, sugiere que el clon publicado es bien un artefacto, o un subtipo inconsecuente. En la Figura 2 se muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia deducida de aa de HPVl? L2 y se derivaron de una secuencia de consenso de los clones #187-1 y ?l95-Jl. Una comparación de la secuencia de nucleótidos de L2 con la secuencia publicada de HPVl? (Accesión de Genban #X05015) identificó cambios de 40 pb por 1389 pbs. Las diferencias en pb originaron 14 cambios a nivel de aminoácido: P a S en aa 29 , P a N en aa 33, A a S en aa 177, D a E en aa 266, D a N en aa 270, D a G en aa 346, M a I en 355, V a M en aa 359, S a P en aa 365, F a S en aa 369, F a V en aa 371 , F a S en aa 372, K a T en aa 373 y S a P en aa 409.
EJEMPLO 6 Generación de Antisuero L2 de HPV18
Se prepararon anticuerpos específicos de HPV18 L2 en cabras utilizando una proteína de fusión t r?E-HPV18 L2 expresada en E, coli. Se amplificó el ORF L2 en toda su longitud mediante PCR utilizando iniciadores de oligonucleo o que proveen sitios HindTII y BarnHI que flanquean los extremos 5' y 3', respec ivamente. El fragmento de 1.2 fue insertado en el plasrnido de expresión ?ATH23 digerido con H ndlII-BarnHT (Koerner y otros, 1991, Meth. Enzymol. Vol. 194:477-490). La proteina de fusión se expresó en células RRl de E, coli (Gibco
BRL, Inc.) después de inducción con acido 3-b- mdolacrí l co. Se analizo la fracción insol?ble mediante SDS-PAGE, seguido por tinción con azul de Coo assie. La proteína de fusión tr?E-L2 representa la porción principal de Ja fracción insoluble de E „ coli , Se inmunizaron cabras con la prote Lna de fusión trpE-L2 de conformidad con el protocolo normal de Pocono Rabbit Farm and Laboratory, Inc, , para anti genos de proteína de fusión (Protein Rabbit Farm. Canadensis, Pennsylvama) .
EJEMPLO 7 Preparación de la Cepa U9 de Levadura
Se obtuvo Saccharornyces cerevisiae cepa 2150-2-3
(MATalpha, leu2-04, adel, c?r°) del Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, Washington), Se propagaron c lulas de las cepas 2150-2-3 durante la noche a 30°C en 5 rnl de medio YEHD (Carty y otros, 3. Tnd Micro 2 (1987) 117-121). Las células se lavaron tres veces en agua estéril destilada, se resuspendioron en 2 mi de agua destilada estéril, y 0.1 rnl je la suspensión celular se colocó sobre cada una de seis placas de ácido 5- fluoro-orotico (FOA) para seleccionar rnutantes ura3 (Oold Sppng Harbor L boratory Manual for Yeast Genetics). Las placas se incubaron a 30°C. El medio contenía, por 250 mi de agua destilada: 3,5 g de base de nitrógeno de levadura Di feo sin aminoácidos y sulfato de amonio; 0.5 g de ácido 5-fluoro-orótico; 25 rng de Uracilo; y 10.0 g de Dextrosa. El medio se esterilizó mediante filtración a través de membranas de 0.2 µrn y después se mezcló con 250 mi de Bacto-Agar (Di feo) al 4% mantenido a 50°C, 10 mi de una solución 1.2 rng/rnl de ademna, y 5 mi de solución de L-leucina (180 rng/50 rnl).. El medio resultante se dispensó a 20 mi por caja petp. Después de 5 días de incubación, aparecieron numerosas colonias. Las colonias individuales se aislaron volviendo a sembrar en estría las colonias de las placas iniciales de FOA sobre placas recientes de FOA que se incubaron después a 30°C. Se analizó un numero de colonias del segundo grupo de placas de FOA para detectar la presencia de la mutación ura3 duplicando en placa sobre ambas placas, YEHD y placas uracilo-rnenos. El resultado deseado era un buen crecimiento sobre YEHD y ningún crecimiento sobre medio uracilo- enos. Se obtuvo un aislado (U9) que mostró estas propiedades. Se guardó corno un banco en glicerol congelado (cepa #325) a -70°C para uso posterior.
EJEMPLO 8 Preparación de un Vector para interrupción del Gen MNN9 de Levadura
Para preparar un vector para interrupción del gen MNN9, fue necesario clonar primero el gen MNN9 a partir de ADN genómico de S. cerevisiae. Esto se logró mediante tecnología e reacción en cadena de polimerasa (PCR). Se diseñó un iniciador de sentido 5' y un iniciador de contrasentido 3' por PCR de la secuencia codificadora MNN9 de longitud completa en base a la secuencia publicada para el gen MNN9 de levadura (Zi ogenetics: EPO Solicitud de Patente No. 88117834.7, Publicación No. 0-314-096-A2). Se usaron los siguientes iniciadores de oligodesoxinucleótido que contienen sitios HindIII flanq?eadores (subrayados) :
iniciador- de sentido: 5' -CTT AAA GCT TAT TTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3' iniciador de contrasentido: 5 '-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' .
El codón de iniciación de metionina para el gen MNN9 16
se señala en negritas.. La PCR se efectuó usando ADN genomico de la cepa JRY 188 de S. cerevisiae corno molde, ADN Taq polirnerasa
(Perkín Elmer) y 25 ciclos de amplificación (94°C 1 min., 37°C 2 rn ., 72°C 3 rnin.). El fragmento resultante de PCR de 1.2 kpb fue digerido con HmdlTI, purificado en gel, y ligado con ?UC1 tratado con fosfatasa alcalina, digerido con HindIII (Pharmacia). El plásrnido resultante se designó corno [)1183. Par-a interrumpir el gen MNN9 con el gen URA3 de levadura, fue digerido el plásmido pBR322-URA3 (que contiene el fragmento de 1.1 Kpb HindTII que codifica el gen URA3 de S. cerevisiae subclonado en el sitio HindIII de pBR322) con HindIII y el fragmento de ADN de 1.1 kpb que lleva el gen URA3 funcional se purificó en gel, se rasuró en sus extremos con ADN polimerasa T4, y después se ligó con plásmido 1183 digerido con Prnll (Pmll corta dentro de la secuencia codificadora de MNN9). El plasrnido pll99 resultante contiene una interrupción del gen MNN9 mediante el gen URA3 funcional.
EJEMPLO 9 Construcción de la cepa 1372 derivada de U9 que contiene la interrupción del gen MNN9.
Para la interrupción del gen MNN9 en la cepa U9
(#325), fueron digeridos 30 µg de plásmido pll99 con HindIII para crear un cassette de interrupción lineal rnnn9: :URA3. Se transformaron células de la cepa 325 con el ADN ?ll99 digerido con HmdlII, por medio del método de esferoplasto (Hinnen y otros, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci, USA 75:1929-1933) y se seleccionaron transformantes sobro un medio de agar sintético sin uracilo y conteniendo 1.0 M de sorbitol . El medio sintético contenía, por Litro de agua destilada: agar 20 g; base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 6.7 g; adenina, 0.04 g; L-tirosma, 0.05 g; Sorbitol, 182 g; Glucosa, 20 g; y solución eucí na-menos #2, 10 rnl. La solución leucina- enos #2 contiene por- litro de agua destilada: L-argima, 2 g; L-histidma, 1 g; L~Leucma, 6 g; L-Isoleucma, 6 g; L-l sina, 4 g; L-rnetiom na, l g; L-fen lalina, 6 g; L-treomna, 6 g; L-tnptofano, 4 g. Las placas se incubaron a 30°C durante 5 días al cabo de los cuales aparecieron numerosas colonias. Se hicieron preparaciones de ADN crornosómico a partir de diez colonias y después fueron digeridas con EcoRI mas HindIII. Las partes digeridas de ADN se evaluaron después por medio de manchas de Southern blot (3. Sarnbroo y otros, Molecular Clon ing: A
Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) utilizando co o sonda el fragmento HindIII de 1.2 kpb que lleva el gen MNN9 (aislado a partir del plásrnido pl!99). Se identificó un aislado (cepa #1372) que mostró los cambios de banda de ADN esperados sobre el Southern blot, así como la aglutinación extrema mostrada típicamente permutantes rnnn9, EJEMPLO 10 Construcción de ?n vector para interrupción del gen HIS3 de levadura
Para construir un cassette de interrupción en el cual el gen HIS3 de S, cerevisiae está interrumpí do por el gen URA3, fue digerido el plásmido YEpd (K. Struhl y otros, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci . , USA 76:1035) con BarnHl y el fragmento de BarnHl de 1.7 kpb que lleva el gen HIS3 fue purificado en gel, rasurado en sus extremos con ADN polirnerasa T , y ligado con pUCl? que había sido digerido previamente con BamHl y tratado con ADN pol íme rasa T4. Fl plásmido resultante (designado como pl501 o ?UC18-HIS3) fue digerido con Nhel (que corta la secuencia codificadora HIS3) y el fragmento de vector fue purificado en gel, rasurado en sus extremos con ADN polirnerasa
T4, y tratado después con fosfatase alcalina de intestino de becerro. El gen de URA3 se aislo del plasmado ?BR322-URA3 mediante digestión con HindIII, y el fragmento de 1.1 kpb que lleva el gen de URA3 fue purificado en gel, rasurado en sus extremos con ADN polimerasa T4, y ligado con el fragmento anterior puO18-HTS3 Nhel. Fl plasmado resultante (designado corno pUC18-h?s3: :URA3 o ?l505) contiene un cassette de interrupción en el cual el gen HIS3 de levadura está interrumpido por el gen funcional URA3.
EJEMPLO 11 Construcción del vector para interrupción del gen PRB1 de levadura por medio del gen HIS3
Fue suministrado plásmido FP8H que lleva el gen PRB1 de 5. cerevisiae, por el Dr, E. Jones de Carnegie-Mellon Univ. (C. M. Moehle y otros, 1987, Genetics 115:255-263). Fue digerido con HindIII mas Xhol y el fragmento de ADN de 3.2 kpb que lleva el gen PRB.1 fue purificado en gel y rasurado en sus extremos mediante tratamiento con ADN polirnerasa T4. El plásmido pUC18 fue digerido con Ba Hl, purificado en gel y rasurado en sus extremos por tratamiento con ADN polimerasa T4. El fragmento del vector resultante fue ligado con el fragmento del gen PRB1 anterior para producir el plásrnido pUCl?-PRBl, El plásmido YEp6, que contiene el gen HIS3, fue digerido con BamHl. El fragmento resultante 1.7 kpb BarnHl que lleva el gen HIS3 funcional fue purificado en gel y después rasurado en sus extremos mediante tratamiento con ADN polimerasa T4. El plásrnido pUC18-PRBl fue digerido con EcoRV mas Ncol que cortó dentro de la secuencia codificadora de PRB1 y remueve el sitio activo de proteasa B y la secuencia flanqueadora. El fragmento EcoRV-NcoI de 5.7 kpb que lleva las porciones residuales 5' y 3' de la secuencia codificadora de PRB1 en pUCIS, fue purificado en gel, rasurado en sus extremos por tratamiento con ADN polirnerasa T4 , desfosforilada con fosfatasa alcalina de intestino de becerro, y ligado con el fragmento HIS3 rasurado en sus extremos descrito anteriormente,, El plás ido resultante (designado corno pUC18-brbl : :HIS3 , banco #1245) contiene el gen HIS3 funcional en lugar de la porción del gen PRB1 que ha sido sup r-irm o ant e p o pne t e .
EJEMPLO 12 Construcción de una cepa de levadura relacionada a U9 que contiene interrupciones de ambos genes MNN9 y PRB1
La cepa 1372 relacionada con U9 que contiene una interrupción del gen MNN9 se describió en el Ejemplo 9. Se pasaron aislados clónales de la cepa 1372 sobre placas FOA (corno se describió en el Ejemplo 7) para seleccionar «rutantes ura3. Se obtuvieron varios aislados de ura3 de la cepa 1372 y se seleccionó un aislado en particular (cepa 1293 -1 0-S1 -l) para interrupción subsecuente del gen HTS3. El vector de interrupción del gen ?UC18-h? 3 : :URA3 (pl505) fue digerido con Xbal más EcoRI para generar un cassette de interrupción lineal h?s3::URA3 y se uso para la tran formación de la cepa 12930-190-S1-1 mediante el método de acetato de litio [Methods ín
Enzyrnology, 194:290 (1991)1. Se seleccionaron ran formantes
Ura+ sobre medio de agar sintético sin uracilo, se estriaron nuevamente para aislados clónales sobre el mismo medio, y después se replicaron en placa sobro medio sin uracilo o sin histidina para seleccionar aquellos aislados que fueran Ura+ e
His- . Se seleccionó un aislado (cepa 12930-230-1) para interrupción subsecuente del gen PRB1, Fl vector de interrupción del gen PRB1 ( ?UC18-prbl : :HTS3, banco #1245) fue digerido con Sacl rnas Xbal par-a generar un cassette de interrupción lineal ?rbl::HI?3, y se usó para la ransformación de la cepa 12930-230-1 por medio del método de acetato de lita o. Se seleccionaron ansformantes H?s+ sobre medio de agar sin histidina y se estriaron nuevamente sobre el mismo medio para aislados clónales. Se preparó ADN genómico a partir de varios de los aislados resultantes de Ha s+ , se digirió con EcoRI y después se sometió a elect rofóresis sobre geles de agarosa a 0.8%. Después se efectuaron análisis Southern blot utilizando una sonda de 617 pb radionarcada para el gen PRB1 que había sido preparado mediante PCR utilizando los siguientes iniciadores de oligodesoxmucleot ido:
'TGG TCA TCC CAÁ ATC TTG AAA 3' 5' CAC CGT AGT GTT ÍGG AAG CGA 1'
Se obtuvieron once aislados que mostraron la hibridación esperada de la sonda con un fragmento de ADN prbl::HTS3 de 2.44 kpb. Fsto en contr'aste con la hibridación de la sonda con el fragmento de 1.59 kpb para el gen PRB1 de tipo silvestre. Uno de estos aislados que contiene la interrupción ?rbl::HIS3 deseada, se selecciono para uso posterior y fue designado como la cepa #1558.
EJEMPLO 13 Expresión de HPV18 Ll y L2 en levadura
Se usaron plás idos pl91-6 (pGALl-10 + HPV18 Ll) y pl95-ll (?GALJ-10 + HPVl? Ll *- L2) para tr-ansforinar la cepa
#1558 de S. cerevisiae (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel , c?r-°). Los aislados clónales se cultivaron a 30°C en medio YEHD que contenía 2% de galactosa durante 88 horas. Después de cultivar las células, se rompieron las pellas celulares con varillas de vidrio y los lisados celulares se analizaron para determinar la expresión de proteína HPV18 Ll y/o HPV18 L2 por medio de análisis de ímrnunoblot. Se sometieron a elect rofóresis muestras que contenían 25 µg de la proteína celular- total a través de geles de Tris al 10%-Glicina (Novex, Inc.) bajo condiciones desnatural izadoras y se sometieron a análisis de electroblott sobre filtros de ni t ocel ulosa. La proteina Ll fue mrnunodetectada utilizando an isue o de conejo desarrollado contra una proteína de fusión Ll de t rpE-HPVll corno anticuerpo primario (Brown y otros, 1994, Virology 201:46-54) e IgG de asno anta -conejo unida a peroxidasa de rábano
(HRP) (Arnersham, Inc.), como ¿Anticuerpo secundario. Los filtros se trataron utilizando el equipo quirnolumimscente ECL™ Detection (Anersharn, Inc.). Se detectó una banda de proteína Ll de 50-55 KDa en ambos clones de levadura coexpresores Ll + L2 (cepas 1725 y 1727, respectivamente) y no en el control negativo (pGALl-10 sin genes Ll ni L2) (Figura 3).
La protei na 1.2 de HPV18 fue detectada por medio de análisis Western utilizando un antisuero policlonal de cabra desarrollado contra una proteína de fusión 1.2 de tr?E-HIPV18 co o anticuerpo primario, seguido por IgG de conejo anti-cabra, conjugado con HRP (Kirkegaard and Perry Laboratories,
Gaithersburg, Maryland). Los filtos se trataron corno se describió anteriormente. Se detectó proteína L2 como una banda de proteína de 75 kDa en el clon de levadura coexpresor Ll + L2 (cepa 1727) pero n en el control negativo ni el clon expresor Ll (Fi ura 4) .
EJEMPLO 14 Fermentación de HPV 18 Ll (cepa 1725) y IB L1+L2 (1725)
Se transfi rieron asépticamente el crecimiento de superficie de un cultivo en placa de la cepa L725 y 1727 a un medio liquido libre de leucina que contenía (por litro): 8.5 g de base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos y sulfato de amonio; 0.2 g de adenma: 0.2 g de uracilo; 10 g tie ácido succínico; 5 g de sulfato de amonio; 40 g de glucosa; 0.25 g de L-t ros?na; 0.1 g de L-argimna; 0.3 g de L-ísoleucma; 0.05 g de L-rnetionina; 0.2 g de L-triptofano; 0.5 g de L-h?st?dina; 0.2 g de L-lisina; 0.3 g de L-fenilalanina; este medio se ajustó a pH 5.0-5.3 con NaOH antes de su esterilización. Después de crecimiento a 2B°C, 250 rpm sobre ?n agitador rotativo, se prepararon frascos de cultivo congelados agregando gl cerol estéril hasta una concentración final de 17% (v/v) antes de almacenamiento a -70°C (l rnL por criovial). Se desarrollaron moculos en el mismo medio (500 mL por matraz de 2 1) y se iniciaron transfiriendo los contenidos derretidos de un frasco de cultivo congelado e mcubando a 28°C, 250 rpm sobre ?n agitador rotativo durante 29 horas. Las fermentaciones de cada cepa utilizaron un fermentador New Brunswick SF- 116 con un volumen de trabajo de 10 litros después de inoculación. El medio de producción contenía (por litro): 20 g de extracto de levadur-a Difco; 10 g de peptona de soya Sheffield HySoy; 20 g de glucosa; 20 g de galactosa; 0.3 rnl de ant íespumante Union Carbide UCON LB-625; el medio se ajustó a pH 5.3 antes de esterilización. Todo el contenido (500 mi) del matraz del inoculo de 2 mi fue transferido hacia el fermentador que fue incubado a 28°C, 5 litros de aire por minuto, 400 rp , 0.25 kg/crn2 de presión. Se aumentó la agitación según fue necesario para mantener los niveles de oxigeno disuelto de mas de 40% de saturación. El progreso de la fermentación fue rnonitoreado mediante mediciones de glucosa fuera de línea (Beckman Glucose 2 Analyzer) y espectrometría de masas en línea (Perkin-Elrner 1200). Después de incubación durante 66 horas, se alcanzaron densidades celulares de 9.5 a 9.7 gramos de peso seco de célula por litro. Los cultivos de concentraron por medio de filtración en fibra hueca (cartucho Arnicon H5MP01-43 en un sistema de filtración Arnicon DC-10) hasta aproximadamente 2 litros, se diafiltro 2 litros de solución salina regulada en su pH con fosfato, y se concentró ada cíonalmente (hasta aproximadamente 1 litro) antes de dispensar en botellas desmtrifuga de 500 rnL. Las pellas celulares se recogieron por medio de centrifugación a 8000 rpm (Sorval GS-3 rotor) durante 20 minutos a 4°C. Después de decantar el sobrenadante, Las pellas (total 191 a 208 gramos de células húmedas) se almacenaron a ~70°C hasta usa se.
EJEMPLO 15 Purificación de proteínas Ll de cápside de HPV tipo 18 recombinante
Todos los pasos se efectuaron a 4°C a menos que se haga notar,. Lae células se guardaron congeladas a -70°C„ Las células congeladas (peso seco igual a 126 g) se derritieron a 20-23°C y se resuspendioron on 70 mi de "regulador de pH de rompimiento" (20 M fosfato de sodio, pH 7.2, 100 mM NaCl), Se agregaron Los inhibidores de proteasa de PMSF y pepsatina A a hasta concentraciones finales de 2 mM y 1.7 µM, respectivamente. La suspensión de células se rompió a una presión de aproximadamente 1,120 kg/cm2 mediante 4 pases en un rnicrofluilizador M110-Y (Mi crofl?idcs Corp,, Newton, Massachusets) , La suspensión de células reventadas fue centrifugada a 12000 x g durante 40 minutos para retirar-desechos celulares. El líquido sobrenadante que contenía antigeno Ll fue recuperado. EJ liquido sobrenadante se diluyo 1:5 con la adici n de regulador de pH A (20 M MOPS, pH 7.0) y se aplico a una columna de captura de intercambio anionico (9.0 cm ID x 3.9 crn) de resina Fractogel * EMD TMAL-650 (M) (EM Separations, Gibbstoun, NJ) equilibrada en reguiador A. Después de un lavado con regulador- A, el antígeno fue eluido con un gradiente de 0-1.0 M de NaCl en regulador A. Se analizaron fracciones de la columna para determinar protei na total por el método de Bradford. Después se analizaron las fracciones a car-gas de proteína total iguales por medio de Western blotting y SDS-PAGE, con detecci n de tinción de plata., Las fracciones de TMAE que mostraron pureza comparable y contenido alto de roteina Ll fueron concentradas. El antígeno se concentro mediante fraccionamiento con sulfato de amonio. La solución se ajustó a 35% de sulfato de amonio saturado agregando reactivo solido agitando suavemente al misino tiempo durante 10 minutos. La muestra se colocó sobre hielo y se dejó proceder la precipitación durante 4 horas. La muestra se centrifugó a 16,000 x g por 45 rmn. La pella fue r-esuspendi a en 20.0 L PBS (6.25 mM fosfato Na, pH 7.2, 150 rnM NaCl ) . La pella resuspendida se sometió a cromatografía sobre una columna de exclusión de tamaño (DI 2.6 cm x 89 c ) de resina de Sephacryi 500 HR (Pharmacia, Piscataway, New Jersey), El regulador de pH de la corrida fue PBS. Las fracciones se analizaron mediante Western blotting y SDS-PAGE con detección de tinción de plata. Se concentraron las fracciones rnás puras. Estas se concentraron en una celda agitada de 50 mi usando membranas de ho a plana YM-100 (Arnicon, Beverly, Massachusetts) a una presión de N2 de 2.8-4.2 kg/crn2. El producto final se analizó mediante Western blotting y SDS-PAGE con detección de Coomasie coloidal. Se estimó que la proteína Ll es 50-60% homogénea. Se confirmó Ja identidad de la proteína Ll mediante Western blotting. Se tornaron alícuotas del producto final y se guardaron a ~70°C.
Este procedimiento produjo un total de 12.5 rng de proteina.
Prueba de Bradford para pro te ina total Se determinó la proteína total utilizando un equipo Coornas e PlusR disponible cornercialrnente (Pierce, Rockford,
Illinois). Se diluyeron muest as hasta niveles apropiados en M1U1-Q-H2O Los volúmenes requeridos fueron 0.1 mi y 1.0 inl para los protocolos patrón y de microensayo, respectivamente. Para ambos protocolos se usó BSA (pierce, Rockford, Illinois) para generar- la curva patrón. La prueba se efectuó de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. Las curvas patrón se graficaron utilizando software CncketGraphR en una computadora Macintosh IIci.
Pruebas de SDS-PAGE y Western Blot iodos los geles, regulador-es de pH y aparatos de elect. roforesis se obtuvieron de Novex (San Diego, California) y se operaron de acuerdo a Las recomendaciones del fabricante. Brevemente, Jas muestras se diluyeron a concen raciones iguales de protema en M1II1-Q-H2O y se mezclaron 1:1 con regulador- de pH de incubación de la muestra que contenía 200 rnM de DTT. Las muestras se incubaron 15 rnin a 100°C y se cargaron sobre geles precolados de 12% Tris-glicina. Se corrió eJect roforesi sobre las muestras a 125 V durante 1 hr 45 man. Los geles se desarrollaron usando tinción de plata con una variación d^l método de Huekeshoven y Dermck [Elect rophoresis, 6 (1985) 103-1121 o tinción de Coomasie coloidal utilizando un equipo obtenido co ercialrnente (Integrated Separation Systems, Natick, Massachusets) . Para Western blots, las proteínas se trans irieron a membranas PVDF a 25 v durante 40 rnin. Las membranas se lavaron con M?ll?~0-H2? y se secaron al a re. El anticuerpo primario fue antisuero policlonal de conejo desarrollado contra una proteína de fusión Trp-HPVllLl (donada por el Dr. D. Brown).
Experimentos anteriores habían mostrado que este antisuero tiene una reacción cruzada con Ll de HPV tipo 18 en Wester-n blots. La solución de anticuerpo se preparo por dilución de antisuero en regulador de pH de blotting (5% de leche sin grasa en 6.25 mM de fosfato de Na, pH 7.2, 150 mM de NaCl, 0.02% de
N N3 ) - La incubación fue durante por lo menos una hora a 20-23°C. La mancha se lavo durante 1 rnin cada vez en tres cambios de PBS (6.25 mM de fosfato de na, pH 7.2, 150 mM de NaCJ ) . La solución de anticuerpo secundario se preparo diluyendo antisuero conjugado de IgG de cabra anti-cone o unida a fosfatasa alcalina (Pierce, Rockford, Illinois) en regulador de pH de blotting. La incubación procedió bajo las mismas cond clones durante 1 hora por lo menos. Las manchas se lavaron corno antes y se detectaron usando un substrato NBT/BCIP del paso 1 (Pierce, Rockford, Illinois).
EJEMPLO 16 Estudios de Microscopía Electrónica
Para análisis de ME (S ructure Probé, West Chester, Pennsylvama) , se colocó una alícuota de cada mue tra sobre rejillas de cobre revestidas de car-bono de malla 200. Se colocó una gota de acido fos fot ungstico (PTA) al 2%, pH 7.0 sobro la rejilla durante 20 segundos. Se de o secar las rejillas al aire antes de examen de transmisión de ME, Toda la Microscopía se hizo usando un microscopio de transmisión electrónica JEOL
100CX (JEOL USA, Inc) a un voltaje de aceleración final de 100 kV, Las micrografías generadas tienen una amplificación final de I00,000x. Se observaron partículas semejantes a virus en Ja escala de tamaño de 50-55 n de diámetro en la muestra de levadur-a que hospeda el plás ido de expresión HPV18 Ll (figura
). No se observo VLPs en las muestras de levadur-a de control.
EJEMPLO 17 Subclonacaon del ADNc de HPVl? en vectores de expr-esion
EL ADNc que codifica para HPV18 se subclona en varios vectores par-a La expresión de la protei na de HPVl? en células huésped transinfectadas y para la transcripción/traducción ín v tro. Estos vectores incluyen pBluescppt II SK+ (en donde la expresi n se maneja mediante los promotores T7 o T3) pADNc T/Arnp (en donde la expresión se maneja mediante el promotor de citornegaloví rus (CMV)), ?5Z9Q16-l (en donde la expresión se impulsa mediante el promotor de repetición de término largo (LTR) de HIV) y el vector de trasferencia de baculovirus PVL1393 (PharMingen, Inc.) (en donde la expresión se impulsa mediante el promotor de polihedpna (PH)) para producir baculovirus recornbinantes que contengan la S€icuencia de ADN que codifica para HPVl?. a) pBluescript II SK+:HPV18. El clon de long L tud completa de ADNc de HPV18 se recupera a partir del bacteriófago lambda mediante digestión limitada con EcoRI y ligada en pBluescript II SK+ tratado con CIP de EcoRI- corte. Los s?bclones separados se recuperan en los cuales la orientación de sentido de HPV18 sigue a cualquiera de los promotores T7 o T3. b) pADNc I/Amp:HPV18. Para facilitar la clonación direccional se extrae HPV18 a partir de una preparación purificada de plásmidos de pBluescript II SK+:HPV18 en donde la secuencia de ADN de HPVl? se encuentra hacia 3' del promotor T7 utilizando EcoRV y Xbal. El fragmento de HPVl?, EcoRV y Xbal resultante se purifica y se liga en EcoRV-corte, Xbal -corte, pADNc/Arnp tratado con CIP tales que el ADN que codifica para HPV18 se encuentra corriente abajo del promotor de OMV. c) pSZ9016-l:HPVl?, El HPVl? se extrae a partir de pBluescript II SK+:HPV18 mediante digestión limitada de EcoRT y purificación subsecuente del fragmento de 1.3 Kb a partir de geles de agarosa. El fragmento resultante de EcoRI HPV18 se l ga en EcoRI -corte, pSZ90l6~l tratado con CIP, Se seleccionan los subclones en los cuales la orientación de sentido de HPVl? se encuentre hacia 3' del promotor LTR de HTV. d) pAcUW51: HPVl? Ll , Toda la longitud del ORF de
HPV18 Ll se amplificó mediante PCR a partir del clon #187-1 utilizando iniciadores de oli gonucleo idos que proveen sitios de flanqueo Bglll. El gen Ll se insertó en el sitio BamHl del vector- de t ransferencia de baculovirus, pAcUW51 (PharMmgen, Inc.) bajo control del promotor de polihedrina. Se generaron baculovirus recornbinant.es que contenían el cassette de expresión de HPV18 Ll de acuerdo con los procedimientos descritos en el Pharmingen Manual. Los clones recombinantes se purificaron por dilución limitadora e hibridación de dot blot.
EJEMPLO 18 Expresión del Polipepta o de HPVl? mediante transcripción/t aducción vatro y mediante t ransinfeccion en células huésped
Se utilizan vectores que contienen secuencias de ADN de HPV para conducir la traducción del polipeptido de HPVl? en Jasados de ret iculocitos de conejo, células huésped de mam fero y en células de insecto infectadas con baculovirus. Los procedimientos experiment les son esencialmente aquellos delineados en las instrucciones del fabricante. a) Transcripción/traducción m vitro. Un complejo pBluescppt IIT SK+:ADN de plá«anudo de HPVl? (con HPVl? en orientación hacia T7) se hace lineal mediante la digestión con BarnHl hacia 3' en el i serto de HPVI8. El plasrnido Lineal izado se purifica y se utiliza corno un molde para traducci n rápida utilizando ARN poii erasa de T7 en presencia de rn7G(5' )?pp(5' )G. las copias bloqueadas de HPV18 resultantes se purifican precipitando con LiCl y se utilizan para conducir- la traducción de HPV18 en lisado de retieulocitos de conejo tratado previamente con nucleasas en presencia de L-[355]met?on?na. b) Expresión en células de mamífero. La roteína de HPVl? se expr-esa en células huésped de mamífero después de la transinfección con pADNc T/Arnp:HPV18 (ba o el control del promotor de CMV) o pSZ9016-I.-HPV18 (ba o el control del promotor LTR de HIV). En el último caso ( ?SZ9016-I :HPV13 ) , las células se cotrans fectan con el plasmado pE¡Z90161 :TAT que expr-esa TAT. Para ambos plasmados de expresión de HPV, se transinfectan células COS-7 utilizando DEAE-dext rano o lipofeccion con l.ipofec amina (BRL).. c) Expi-esión en células de insecto. El vector de transferencia de baculovirus ?VL1393:T7 HPV18 Ha que contiene HPVl? se utiliza para producir baculovirus recornb antes (Autographa cal i fornica) mediante recombinacion homologa mi vivo. El HPV18 etiquetado con epitope se expresa entonces en células de insecto Sf9 (Spodoptera frugí perda) desarrolladas en cultivo de suspensión siguiendo a la infección con el baculovirus recombinante que contiene HPVl?.
EJEMPLO 19
Los compuestos que afectan la actividad de HPVl? pueden detectarse mediante una variedad de métodos. Un método para identificar compuestos que afectan a HPV18 comprende: (a) mezclar un compuesto de prueba con una solución que contiene HPV18 para formar una mezcla; (b) medir l . actividad de HPVl? en la mezcla; y (c) comparar el HPVl? en la mezcla con un cont rol . Los compuestos que afectan la actividad de HPVl? pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser útiles para tratar enfermedades o condiciones que se caracterizan por la infección por HPV18.
EJEMPLO 20
El AUN que está relacionado estructuralmente al ADN que codifica para HPVl? se detectó con una sonda. Una sonda adecuada puede derivarse a partir de ADN que tiene toda o una porción de la secuencia de nucleótidos de la Figura 1 o Figura 2, ARN codificado mediante ADN que tiene toda o una porción de la secuencia de nucleótidos de la Figura 1 o Figura 2 u oligonucleótidos degenerados derivados a partir de una porción de la secuencia de la Figura 1 o Figura 2.
Claims (19)
- NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una molécula de ADN aislada y purificada que codifica par-a ei virus de papiloma humano tipo l? o un derivado funcional de la misma. 2.- La molécula de ADN aislada y purificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene la secuencia de nucleotidos que se muestra en la FLgura 1, la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 2, un derivado funcional de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 1, y un derivado funcional de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 2. 3.- Un vector de expresión para la expresión de la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, en un hué ed. 4.- Una protema purificada esencialmente codificada por la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1. 5.~ Un anticuerpo inmunológicamente reactivo con el compuesto seleccionado de la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación i, ARN complement rio a la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 o una proteína codificada por la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1. 6.- Un procedimiento para la expresión de una proteina de virus de papiloma humano tipo l? en un huésped, caracterizado porque comprende: f ) transferir- el vector de expresi n de conformidad con la reivindicación 4 en un huésped adecuado; y (b) cultivar el huésped del paso (a) bajo condiciones que permiten la expresión de la protema dei virus de papiloma humano ipo 18 a par-tir del vector de expresión. 7.- El procedimiento de conformidad con la reivi ndicación 6, caracterizado además porque la proteína se selecciona de protema Ll de HPV18, protema 1.2 de HPVl? y combinaciones de las mismas. 8.- Una composición capaz de inducir una respuesta inmune en un sujeto tratado con la composición, la composición caracterizada porque contiene un compuesto seleccionado de la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, peptidos codificados por- la molécula de ADN de conformidad con la reivindicaci n 1, ARN complementario a la molécula de ADN de conformidad con la reivindicaci n l o combinaciones de los mi mos 9.- Una vacuna para La prevención o el tratamiento de la infección por virus de papiloma humano, la vacuna contiene un compuesto seleccionado del grupo que consiste de la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, péptidos codificados por la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, ARN complementario a la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación l o combinaciones de los mismos. 10.- El uso de la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, ARN complementa io a la mol cula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, protei na codificada por Ja molécula de ADN de conformidad con la reivindicación l, o combinaciones de los mismos en la preparación de una composición para inducir respuestas inmunes contra la infección o enfermedad ocasionada por el virus de papiloma humano en un animal . 11.- Partículas semejantes a virus comprendidas de proteína Ll recornbinante o proteínas Ll *• L2 recomba nantes de virus de papiloma humano tipo 18, las partículas semejantes a virus son por lo menos 60% puras. 12.- Las partículas semejantes a virus de conformidad con la reivindicación 11, caracterizadas porque la proteína Ll recombinante o las proteínas Ll + L2 reco bmantes son producidas en levadura. 13.- Un método de producción de partículas semejantes a virus de conformidad con la reivindicación 11, que comprende: a) transformar levadur-a con una molécula de ADN recornbanant e que codifica proteina Ll de virus de papiloma o proteína L2 de virus de papiloma o proteínas Ll + L2 de virus de papilona; b) cultivar la levadura transformada bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de ADN recombmante para producirla proteína recornbinante de virus de papiloma, y c) aislar la proteína recornbinante de virus de papilona para producir partículas semejantes a virus de conformidad con la 53 reivi dicación 1. 14, - Protema recornbmante de virus de papiloma producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 13. 15.- Una vacuna que comprende las partículas semejantes a virus de conformidad con la reivindicación 12. 16.- Composiciones farmacéuticas que comprenden las partículas semejantes a v rus de conformidad con la reivindicaci n LL. 17.- El uso de partículas semejantes a virus comprendidas de proteína 1.1 recombinante o proteínas Ll + L2 recombin nte de virus de papiloma humano tipo 18, las partículas semejantes a vi rus son por lo menos 60% puras, en la preparación de una vacuna para prevenir infección por virus de papiloma en un huésped. 18.- Un método para producir una proteína de cápside de virus de papiloma recomba ríante derivado de levadura ensamblada en una partícula semejante a virus que comprende, a) clonar un gen de virus de papiloma que coda faca por lo menos para una prote a de cápside de virus de papiloma en un vector; b) transferir el vector hacia una célula huésped para producir-una célula huésped recombinante; c) cultivar la célula huésped recornbmante bajo condiciones que permiten la producción de proteína de capside de virus de papiloma; y d) purificar la proteina de capside de virus de papiloma bajo condiciones que permiten Ja formación de una partícula semejante a virus. 19.- Partículas semejantes a virus producidas mediante el método de conformidad con la reivindicación 18.
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