CN1070685A - 能形成粒子的复合乙型肝炎病毒表面蛋白 - Google Patents

Abstract

为了生产颗粒状的混合乙型肝炎病毒(HBV)表 面蛋白，由一种单一重组酵母表达编码两种或两种以 上HBV蛋白的DNA，为了生长具有含量显著降低 的碳水化合物的粒子，将这种编码两种或两种以上 HBV蛋白的DNA表达在单一重组酵母寄主中。所 述寄主在糖基化蛋白的能力方面存在缺陷。这些 HBV蛋白具有由HBV病毒粒子包壳开放解读密码 中的S-区域(包括pres区域)，遗传编码的抗原位 点，并且当将其表达在糖基化能力存在缺陷的酵母中 时，其所含截留碳水化合物的含量降低。

Description

乙型肝炎病毒（HBV）是能引起数种人类肝脏疾病的传染物。受HBV传染的许多个体在遭受急性疾病之后均可复原。然而，仍有一部分受感染的个体不能消除它们的感染，因而变成慢性的传染带菌者。在世界许多地方HBV感染成了流行病，在接近出生时其传染率较高，受慢性传染的母亲传染给她们的新生儿，而新生儿本身经常保持慢性传染。经估计，全世界范围内的人数已超过3亿。在这群带菌者中，每年有几十万人因长期慢性乙型肝炎（肝硬变和/或肝细胞癌）而死亡。

在协同感染HBV时，乙型肝炎δ病毒能引起一种急性暴发性疾病，该疾病通常将会致命。δ病毒不编码（由其固有的遗传物质）能充当病毒粒子包壳的蛋白;而是通过由协同感染的HBV编码的包壳蛋白而使该病毒壳体化，由此与HBV蛋白共有密切结构和免疫关系，对于HBV蛋白下文将要描述。现在还不知道其它传染因子是否也与HBV具有类似的相互关系。然而，很清楚具有较宽的血清反应性的或免疫效能增强的蛋白在疾病（或传染）的论断或预防（或治疗）的系统中是有用的（通过一类与HBV具有轻微或部分抗原交叉-反应性的试剂）。

HB病毒粒子由两组结构蛋白组成，核心蛋白和包壳或表面蛋白。除了作为主要表面蛋白或病毒粒子，即Dane粒子，包壳蛋白还是澳大利亚抗原（Australia    antigen）或22nm粒子的主要组成部分。这些包壳蛋白是大型病毒开放解读密码（ORF）的翻译产物，所述ORF密码至少编码389个氨基酸（aa）。将所述ORF划分成三个区域，其中每一个都从ATG密码子开始，该密码子能在体内起到转译起始位点的作用。这些区域按照各自基因的5′-3′顺序分别称为preS1（108aa）、preS2（55aa）和S（226aa）。因此，这些区域结构限定了三种多肽，分别称为S或HBsAg（226aa）、PreS2+S（281aa）和preS1+preS2+S（389aa），还分别称为p24/gp27、p30/gp33/gp36和p39/gp42（以及主要、中间和大蛋白）。

HBV的包壳蛋白是具有碳水化合物侧链的糖蛋白（聚糖），该侧链通过N-糖苷键与所限定的肽识别位点相连[Heermann等人，J.virol.52，396（1984）和Stibbe等人，J.virol.46，626（1983）]。在自然感染过程中产生的HBV多肽包括种p24/gp27（S多肽及其糖基化衍生物）、gp33/gp36（仅在preS2区域中糖基化的preS2+S多肽和在S以及preS2区域中糖基化的相同多肽），和p39/gp42（preS1+preS2+S肽及其在preS1区域结构中糖基化的衍生物）。目前可获得的由血桨得到的疫苗由实际上只含S区域的蛋白组成（包含p24单体及其糖基化衍生物gp27），而成功地发展至今的由酵母产生的疫苗仅由S多肽组成（只包含非糖基化的种P24）。

22nm HBsAg粒子已被人们从慢性带菌者的血浆中提纯出来，当他们的血浆是颗粒-阳性时，将这些慢性带菌者称为HBs⁺。如果受感染的人已产生足够的免疫应答，那么他们就能消除感染而变成HBs^-。根据其HBS抗体的形成情况，将这些个体称为抗-HBs⁺。用这种方式，将抗HBs⁺与从病中复原和对免受疾病再感染的免疫性以及对再感染HBV的免疫性联系起来。因此人们希望通过利用HB疫苗刺激或形成抗-HBs而具有预防HBV感染的能力。

这个假说是可以通过实验而证实的。除了人之外黑猩猩是少数几种能充分受HBV感染的物种之一，正如由定量标志物如HBs⁺和升高的肝酶的血清量所反映的那样。对黑猩猩接种三种剂量的纯HBsAg粒子而后由静脉用传染性HBV进行攻击。当模拟接种的动物已表现出急性HBV感染征兆时，接种HBsAg的动物完全被保护起来，没有呈现感染征兆。因此，在实验系统中，由p24（或p24和gp27）组成的HBsAg粒子对诱发保护性免疫是足够的。受这些观察结果的激励，一些制造商生产出了由HBsAg粒子组成的HB疫苗。

近来，人们提出了一系列不同的证据表明preS顺序在赋于HBV免疫性方面是重要的。在病毒感染过程中，preS抗原的免疫消失显示出病毒清除和感染消除的予兆（Budkowska等人，Ann    Inst.Past./Immun.，136D：56-65，（1985）]。在急性乙型肝炎传染期间，对preS区域的抗体经常出现在S抗体之前[Petit等人，Mol.Immun.，23：511-523，（1986）]。在近亲繁殖的小鼠中，对S和preS的免疫应答似乎可以独立地进行调节，而且preS区域的存在能影响对S的免疫应答[Milich等人，proc    Nat.Acad.Sci.USA，82：8168-8172，（1985），J.Immunol.，137：315-322（1986）;Neurath等人，J.Med.Virol.，17：119-125，（1985）]。此外，对preS区域的抗体能在体外抵消病毒的感染性[Neurath等人，Vaccine，4：35-37，（1986）]，并且preS抗原能保护免疫过的黑猩猩免遭HBV的感染[Itoh等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，83：9174-9178，（1986）]。借助于这些观察结果且由于重组酵母在由重组啤酒酵母（Saccharomyces    cerevisiae）生产HB疫苗过程中的使用，我们由重组啤酒酵母（S.cerevisiae）配制出实验HB疫苗。

为了扩大HB疫苗的供应，制造商已转向用重组DNA技术作为引起病毒包壳蛋白表达的媒介。在微生物系统中，最普遍地是用大肠杆菌（Escherichia    coli）和啤酒酵母来表达多种重组源蛋白。

许多试图在大肠杆菌（E.coli）中表达免疫活性HBsAg粒子的努力都未成功。然而，啤酒酵母（S.cerevisiae）在表达免疫活性HBsAg粒子的能力上显示出巨大的通用性。已经证实这些粒子（只由p24组成）在配制成疫苗时能充分保护黑猩猩免遭各种血清型的活HBV的攻击。此外，由酵母产生的S粒子也具有免疫学活性而且在临床上预防疾病或感染方面其效果与由血浆产生的HBsAg一样[Stevens等人，JAMA，257：2612-2616（1987）]。因此，人们肯定地提出用啤酒酵母（S.cerevisiae）作为寄主物种来引导合成重组HBsAg。另外，人体治疗试剂和疫苗在酵母中的表达对于产品的开发是非常有用的，这是因为酵母不含内毒素，对人是非致病性的，能以工业化规模进行发酵，而且无需很多围绕使用连续哺乳动物细胞系而引起的安全措施，该细胞系中有许多是通过病毒转化的，它们可能在小鼠中导致肿瘤并且所有的细胞系都含有原致癌基因。

啤酒酵母（S.cerevisiae）（面包酵母）是一种能合成糖蛋白的真核生物，蛋白在酵母中的糖基化已成为近期无数评论文章的主题，突出的如：Kukuruzinska等人，Ann.Rev    Biochem，（1987）56，915-44;Tannen等人，BBA，（1987）906，81-99]。该糖基化过程或向位于多肽上的适当的受体氨基酸（aa）添加聚糖的过程，发生在特定的丝氨酸（ser）或苏氨酸（Thr）残基（O-连接的）上或在特定的天冬酰胺（Asn）残基（N-连接的）上。人们对于在Ser或Thr残基上的O-连接加成的特异性未能清楚地理解而是根据各种情况凭经验确定的。

N-连接型糖基化过程的信号顺序已被人们确定为氨基酸顺序Asn-X-Thr、或Asn-X-Ser（其中X当任意一种氨基酸）。除了合成许多自体的、天然的、糖基化的蛋白[它们中称为甘露蛋白（mannoprotein）或甘露肽（mannopeptide）的]之外，酵母还能使用重组技术表达的异源或外源蛋白糖基化（假若该异源蛋白含有适于进行N-连接适于进行O-连接型糖基化过程的适当的糖基化信号顺序）。

在自然感染过程中产生的preS2+S多肽含有不多于两种的“核心”[大约为3仟道尔顿（KD）]N-连接型聚糖，一种在S区而另一种在preS2区域中氨基酸残基4上的Asn上.S区域中的识别位点既没在Recombivax HB

中也没在酵母中合成的重组preS2+S中被糖基化。然而，preS2区域氨基酸残基4上的位点可以由酵母识别并被糖基化。

preS1区域在preS1区的氨基酸残基4上含有一个N-连接型糖基化位点并且在aa残基26上有适于血清型adw的潜在位点。很显然，对于本领域的普遍技术人员来说，preS2区内的不同顺序以及preS1和S区域内的不同顺序的糖基化过程，仍遵循对preS2糖基化过程所述的论点。

合成重组preS1+preS2+S或preS2+S的酵母增加了一种“核心”聚糖，该聚糖与在病毒感染期间加到天然多肽上的相类似，然而，如果寄主细胞对糖基化来说是“野生型”的（即含有天然糖基化过程所必须的酶完整补体，实际上对于所有常用的酵母菌株来说都是这种糖基化过程），就需用大量的附加甘露糖残基将数量相当大的这类聚糖进行扩增，其方式与酵母在制造其本身结构的甘露蛋白时所用的方式一样。聚糖的这种扩增加成，当它发生在外源基因产物（如preS2+S多肽）上时则被称为过糖基化。对于熟悉本领域的人员来说，很虽然对酵母所陈述的理论同样可延伸到其它寄主细胞（例如昆虫、真菌等），对于这些寄主细胞可以采用有所不同的糖基化方案。

此外，现已证实在野生型酵母寄主细胞中表达的HBV表面蛋白的重组型22nm粒子可以在22nm粒子内截留相当数量的酵母细胞碳水合物（至少部分是从该酵母寄主细胞的结构甘露蛋白和甘露多肽得到的）。这种被捕集的碳水化合物会产生一些潜在问题，被捕集的碳水化合物可能会导致对糖基化蛋白上的酵母碳水化合物产生抗体，而且含有被捕集的碳水化合物的疫苗免疫原会与大多数哺乳动物种内存在的抗-酵母抗体反应，从而有可能削弱其作为免疫原和疫苗的效率。

完整甘露蛋白和甘露肽的过糖基化和辅集可以被消除，或通过下列任何一种方法使糖基化仅限于含多肽及其相应粒子的HBV    preS和S中。

首先，通过在生长培养基中存在的外源试剂（如衣霉素）可以将N-连接型过糖基化阻止或限制在重组寄主的生长期内。其次，从重组体或天然来源产生的多肽被脱糖基化，此时可用化学方法（例如无水三氟甲烷-磺酸或无水氟化氢）或用酶法（例如用N-聚糖酶、Endo-F或endo-H）或用物理方法（例如声处理）。另外，可以将糖基识别位点3改变或通过在DNA水平上引起突变而造成缺失，致使核心糖基化同样还有过糖基化受到阻止。将这种经过修饰的preS+S    ORF转化到酵母寄主细胞中，在该ORF中，其糖基化识别顺序已经被改变（通过在酵母中呈活性的识别顺序引导）。在所合成的preS+S多肽中没有发生糖基化。第四，可以识别那些缺少糖基化所必须的关键酶的寄生细胞，这种技术说明了本发明但本发明与其不一样。人们已经识别出一种这样的酵母菌株（mnn9-突变株[Ballou，L等人，（1980），J.Biol.Chem.，255，pp 5986-5991]，该菌株在糖基化通道中缺少N-连接型聚糖延伸（过糖基化）所必需的关键的酶;化学研究表明这种突变体使甘露蛋白不具有外链甘露糖残基而只含“核心”碳水化合物[Ballou，C.E，等人，（1986），proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，pp 3081-3085;Tsai，P.等人，（1984），J.Biol.Chem.，259，pp 3805-3811]。人们已经采用S或preS+S多肽的ORF（由在酵母中呈活性的适当的启动子引导的转录）来转化这种mnn⁹-突变体酵母。所得到的preS+S多肽）包括preS1+preS2+S、preS2+S、preS1、preS2或preS1+preS2）只含“核心”糖基化而没有过糖基化。

尽管S多肽在酵母中表达时既没有被糖基化也没有被过糖基化，然而由它们组成的粒子则含有相当数量的源自酵母甘露肽的被捕集的碳水化合物。因此将S多肽和含有preS的多肽表达在不能过糖基化的酵母细胞中会导致被表达的22nm粒子中的碳水化合物的含量下降。

啤酒酵母（S.cerevisiae）在表达免疫活性22nm粒子的能力上显示出巨大的通用性。已经证实这些粒子，当制成疫苗时能够充分地保护黑猩猩免遭活HBV的攻击。此外，由酵母产生的HBsAg在人体临床试验中在免疫学上与由血浆产生的HBsAg的效果一样。因此，人们肯定地提出利用啤酒酵母（S.cerevisiae）作为寄主物种去引导合成重组HBsAg。

在各种重组微生物表达体系中，已经有许多不同的多肽合成过程显示出对寄主细胞是有害的。因此，对这些多肽的表达存在着选择压力，致使只有那些聚集在递增的这种重组培养基上面的细胞，才是已中止表达多源多肽的细胞，或是那些所表达的多源多肽是如此地少以致于使该培养基成为多肽的一种不经济的来源的细胞。在某些情况下，有害作用是如此之强以致当表达受一种强组成启动子驱使时，新转化的细胞还是不能繁殖和在选择板上形成菌落。这些有害作用可通过使用一种诱导性启动子来引导合成这些多肽而得以克服。有许多诱导性基因存在于啤酒酵母（S.cerevisiae）中。被较好地特征化的四种诱导基因体系是半乳糖（GAL）利用基因、醇脱氢酶2（ADH2）基因、α-交配因子基因以及pho5基因。

啤酒酵母（S.cerevisiae）具有5个能编码酶的基因，该酶能使半乳糖作生长碳源而使用。GAL1、GAL2、GAL5、GAL7和GAL10基因分别编码半乳糖激酶、半乳糖透性酶、磷酸葡糖变位酶的主要同功酶、α-D-半乳糖-1-磷酸盐尿苷酰转移酶以及尿苷二（二氧磷基）-半乳糖-4-表异构酶。在缺少半乳糖的条件下，经检测这些酶表达得非常少。假若细胞是在葡萄糖基上生长的，然后再向该培养基中加入半乳糖，这三种酶以RNA转录量计至少被协调地诱发增长1000倍（除GAL5以外，它仅诱导出约5倍）。GAL1、GAL2、GAL5、GAL7和GAL10基因已被分子克隆并被顺序化。将各个编码区5′侧的调节和启动子顺序放在靠近LacZ基因的编码区的地方。由这些试验确定了这些启动子和调节顺序对半乳糖诱导是必须的也是充分的。

啤酒酵母（S.cerevisiae）还具有三种基因，其中的每一种均能编码ADH的同工酶。其中有一种酶，即ADHII，能使啤酒酵母（S.cerevisiae）在氧化生长期中采用乙醇作为碳源。ADH2基因的表达（它能编码ADHII同工酶）受到葡萄糖的降解物阻遏，因此在发酵生长期中在有0.1%（w/v）葡萄糖存在的情况下，实际上不发生ADH2基因的转录。在没有葡萄糖但存在非-抑制性碳源的情况下，ADH2基因的转录将成100-1000倍地发生，这种基因已经被分子克隆并被顺序化，解除对转录的抑制所必须的和充分的调节和启动子顺序已被确定。

α交配因子是啤酒酵母（S.cerevisiae）的性信息素，它是MATα和MATa细胞交配所必须的。这种十三肽被表达成一种早前信息素（prepropheromone），该早前信息素被导入粗糙内质网中，将其糖基化并用蛋白水解法将其处理成其最终成熟的形式，它是由细胞分泌出来的。人们已经将这种生化途径作为多源多肽的表达方法而加以使用。分子克隆α交配因子基因并将其带有前（pr-e）-原（pr-o）-引导顺序的启动子用于表达和分泌各种多肽。类似地，已证明pho5基因启动子通过低浓度磷酸盐是可诱导的并且也可以利用这一点将外源蛋白可生理调节地表达在酵母中。

正如由它们的粗糙内质网的横截面和Golgi仪器所揭示的，外源蛋白能进行N-和O-连接型糖基化过程。α交配因子启动子只在表型是α的细胞中才是活性的。在啤酒酵母（S.cerevisiae）中有4个遗传位置，称为SIR，它们能合成出抑制其它通常不活动的a和α信息拷贝所需要的蛋白。干扰该抑制过程的热敏（ts）缺陷存在于至少具有一个这种位置的基因产品中。在这种突变体中，在35℃下生长则可消除抑制，结果形成表型为a/α的细胞，其中α交配因子启动子是非活性的。当温度改变成23℃时，细胞的表型复原成α，因此启动子变成活性的。已证明使用具有ts    SIR缺陷的菌株可以使某些外源多肽得到受控表达。

本发明的目的是提供同时在酵母寄主中表达的复合HBV表面蛋白，它可以形成由两种或更多种HBV蛋白组成的混合颗粒。本发明另外一个目的是提供一种在酵母寄主中生产复合HBV表面蛋白的方法，该蛋白能形成粒子并含有含量显著降低的截留的碳水化合物。本发明另外的一个目的是提供一种HBV疫苗，它含有HBV蛋白粒子，该蛋白粒子含有复合的HBV表面蛋白其截留的碳水化合物含量被显著地降低，该疫苗适于对由HBV或血清学上与HBV有关的其它因子引起的疾病和/或感染进行主动的和被动的预防及治疗，本发明另一目的是提供用于开发对这类疾病和/或感染的诊断试剂的抗原和免疫原。本发明还有一个目的是提供大规模培养重组寄主细胞和纯化特定的颗粒状重组复合HBV表面蛋白的条件。根据下列描述本发明的种种目的将是明显的。

在重组酵母寄主中，将复合HBV蛋白同时高产地表达并形成粒子。复合HBV表面蛋白在酵母细胞中的同时表达导致了特征粒子的形成，该粒子含有预定比率的复合形式的表面蛋白。这些粒子在“野生型”酵母寄主细胞中的形成，有可能导致酵母细胞物质捕集或截留在该粒子中。当采用“野生型”酵母寄主细胞时，有相当数量的酵母细胞碳水化合物被截留在HBsAg粒子内。为了避免产生由含有大量的碳水化合物的粒子组成的疫苗，可以由在糖基化蛋白能力方面存在缺陷的重组酵母寄主同时制备并纯化得到该HBV表面蛋白。由这种寄主产生的复合HBV表面蛋白可以形成碳水化合物含量较在野生型酵母细胞中产生的粒子低得多的粒子。这些含有各种比率的复合表面蛋白的HBV表面蛋白粒子，如果是在截留的碳水化合物含量被明显降低的存在糖基化缺陷的酵母中制成的话，则它就可以作为一种疫苗而用于治疗和/或预防与HBV有关的传染，且用作为免疫诊断用抗原，该抗原与自然产生的抗-酵母抗体的反应性已被降低。

图1是质粒pKHBS-1a的示意图，该质粒含有HBsAg    ORF、pGAL10启动子、tADH1终止区和在pc1/1基质粒中的LEU2t选择性标志。

图2是质粒pKHBS-2a的示意图，该质粒含有preS1+preS2+S    ORF、pGAL10启动子、cADH1终止区和在pYEP24基质粒中的URA选择性标志。

图3是质粒子pKHBS-3a的示意图，该质粒是仅定向启动子载体，该载体含有由pGAL10启动子引发的preS1+preS2+S    ORF，和由pc1/1基质粒中的pGAL1启动子引发的HBsAg    ORF。

图4是质粒pKHBS-3b的示意图，该质粒含两种独立的表达盒（cassettes），一种具有由pADH2启动子引发的preS1+preS2+S    ORF，而另一种具有由pC1/1基质粒中的pGAL10启动子引发的HBsAg    ORF。

本发明有关一种制备两种或多种HBV蛋白的方法，该蛋白形成混合的在相同粒子中含有两种或多种蛋白的粒子，这种蛋白可用作抗HBV的疫苗。另外本发明涉及这种碳水化合物含量被明显降低的混合粒子获得适于保护对现有疫苗产生过低一或无反应的个体的HBV疫苗候选物（通过表达在HBsAg粒子上具有preS1（和preS2）抗原决定部位的混合-粒子抗原，而其中所述的HBsAg粒子上也具有保护性“a”抗原决定部位，人们研究出了三种相互有关的方法。表达是在含mnn9-突变的酵母寄主中完成的并且和截留的酵母碳水化合物的共同纯化，所述的突变能防止过糖基化。另外，由于酵母使AsN4上的preS1区域发生了N-糖基化，所以这个残基在preS1+preS2+S    ORF中被突变成GLN（Q4），从而在所表达多肽中完全消除了N-连接型糖基化。其它的可能N-连接型糖基化位点（一个在preS2区域中，两个在S区域中）都没有被酵母糖基化。对于熟悉本领域的人来说，很显然未突变的蛋白为本发明所有，并在下文对此予以描述。

一种方案是共同表达preS1（Q4）+preS2+S基因和S基因，从而产生由S抗原形成的粒子框架，在该框架中插入preS1（Q4）+preS2+S。完成共同表达有三种不同的方式。第一种，通过转化一种酵母细胞，该细胞具有两种独立自动复制，独立选择的质粒（双转化体），其中每一种质粒都带有一个HBV基因。根据大概估算的相对质粒拷贝数量，该转化体中所表达的多肽的比率约为10∶1（S：preS1（Q4）+preS2+S）。第二种，在位于双向载体中的两种独立的启动子的控制下将两种HBV基因放在一种质粒上，根据大概估算的相对启动子强度，在该转化体中所表达的多肽的比率约为1∶1（S：preS1（Q4）+preS2+S）。第三种，将在两种独立启动子控制下的两种HBV基因放在一双盒载体构建中。根据大概估算的相对启动子强度，在该转化体中所表达的多肽的比率约为3∶1（S：preS1+preS2+S）。这些方案全部获得了成功，而且被转化的酵母以明显不同的比率表达两种HBV多肽，这些多肽共同组合到具有preS区域以及保护性a抗原决定部位的粒子中。

Dane粒子（血清型adw或ayw）被用作分离病毒ORF₃的HBV核酸源。对于熟悉本领域的人员来说，很显然本发明扩大到采用由HBV菌株或具有其它血清反应性的类似病毒（包括但不限于ayr、ayw、adr、ddw和其它抗原决定部位变种）产生的核酸，上述的反应性是由于病毒遗传变异而产生的，利用内源聚合酶反应从而由天然残留于HB病毒粒子中的切口和缺口型核酸制备HBV基因组的共价键-封闭环形双链DNA。将该DNA分离、用EcoRI消化完全、并克隆到pBR322的EcoRI位点中，这样就产生了pHBV/ADW-1或pHBV/AYW-1。从中选择出在preS区的EcoRI位点上含有园形变位的HBV基因组重组质粒。编码preS2区的55个氨基酸和S区的226个氨基酸的完整ORF，其构建过程是首先将所得到的0.8千碱基对（Kbp）片段提纯，继而用EcoRI和AccI消化pHBV/ADW-1;这种片段编码preS2+S多肽，它仅缺少起始密码子、氨基-末端3氨基酸、羧基-末端3氨基酸以及转译终止密码子。

合成低聚核苷酸并将其与所述片段连接，使其转化成为HindⅢ片段，该片段含有10bp由酵母产生的未被转译5′侧面顺序，从中挑选出完整的preS2+S    ORF，以便将该终止密码子与ADH1转录终止区内固有的HindⅢ位点直接相连，由此产生一个天然的由酵母产生的接点，它没有任何附加的插入碱基。对于熟悉本领域的人员来说，很显然为了表达HBV表面和相关蛋白，任何合适的酵母-活性转录终止区都可用来代替ADH1。

用来构造 侧面顺序（SEQ ID NO∶1）被选择成与酵母基因GAP63（GAP）的未被转译的前导体（NTL）的顺序相对应[Holland，J.Biol.Chem.225，2596（1980）]并且与GAP基因族的相一致。构建过程采取这样一种方式使得NTL直接与preS2+S ORF的起始密码子连接而无任何附加碱基插入。因此，对于熟悉本领域的人员来说，很显然为了HBV表面蛋白的表达，应该将NTL顺序的选择延伸到其它能产生合适表达水平的顺序，这些对于熟悉本领域的人来说是显而易见的。

DNA顺序分析结果表明有2种碱基发生了取代，从而使其氨基酸不同于由pHBpreSGAP    347/19T的DNA所编码的preS2+S顺序[Volenzuela等人，Biotechnology，3（4），317-320（1985）]。为了对两种构建的相同多肽进行评价，将这些核苷酸取代物用定点突变方法加以改变，所述的这些取代物是在HBV    preS2+S的846bp    ORF碱基64上由T代替C（编码phe不是Leu）和在碱基352上由C代替A（编码H：s而不是Gln）Zoller等人，Nucleic    Acids    Research    10：6487-6500（1982）]。从而确定优选构建过程所用的编码氨基酸顺序。对于熟悉领域人员来说，很显然本发明并不限于这种顺序而是可以扩展到任何顺序上，只要其中的DNA能编码一种具有HBV-类似抗原性的多肽即可。

将3.3Kbp含有pC19和HBsAg编码区的大DNA片段，在用EcoRI和StyI消化后与编码preS2的DNA片段分离，再通过制备性琼脂糖凝胶电脉法提纯。然后将合成的DNA低聚核苷酸与pC19-HBsAg片段连接。该合成的DNA低聚核苷酸含有5′EcoRI和3′StyI粘性末端以及紧接着5′EcoRI位点有一个HindⅢ位点。另外，该合成的DNA低聚核苷酸含有HBsAg    ATG密码子外加9上游核苷酸和21下游核苷酸（包括StyI位点）。

这种低聚核苷酸重建HBsAg的完整编码区并且允许其在随后通过用HindⅢ进行消化而从pUC19基载体上原封不动地除去。

带有上述连接的合成DNA低聚核苷酸的pUC19-HBsAg    DNA片段用于转化E.Coli。选择出的重组质粒具有完整重建的HBsAg编码区。完整HBsAg开放解读密码（ORF）通过用HindⅢ消化随后分离、再用制备性琼脂糖凝胶电泳法提纯0.7Kbp    HBsAg    DNA从而将其克隆到GAL    10启动子表达载体中而由重组质粒中除去。

表达盒（pGAL10-tADH1）引发外源基因的表达，该基因在位于半乳糖-诱导型GAL10启动子下游的特有的HindⅢ位点上插入。将上述HBsAg    ORF（具有HindⅢ末端点）连接到载体的HindⅢ位点中。将所述表达盒插在大肠杆菌/啤酒酵母往返载体pcl/l的SphⅠ位点之间（Beggs，上文），将这种载体引入啤酒酵母（S.cerevisiae）菌株CF52或CF55中并从中选择出被转化的克隆。

在致突变之后，将上述编码S或preS+S的片段用于构建表达盒，如前所述[Kniskern等人，Gene    46：135-141，（1986）]，该表达盒包括：（a）大约1.1Kbp的GAP491启动子，（b）10bp由酵母产生的侧面顺序，（c）1230bp用于preS1+preS2+S的病毒ORF，或846碱基对用于preS2+S的病毒ORF或681碱基对用于S的病毒ORF，和（d）大约0.4Kbp的酵母ADH1终止区。

将三种不同的表达载体用于构建HBsAg表达盒。先前描述的GAP491启动子表达盒[Kniskern等人，（1986）Gene    46    pp    135-141]，包括约1.1Kbp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）启动子和大约350bp位于pBR322主链中的酵母醇脱氢酶1（ADH1）终止区，它在启动子和终止区之间具有特有的HindⅢ位点。将例2中的HBsAg    ORF连接在该特有的HindⅢ位点，并且它的存在和取向由限制性核酸内切酶分析和Southern印痕法证明。

另一方面，用（0.5Kbp）GAL10启动子（Schultz等人，1987，Gene，54，pp113-123）代替上述构建中的1.1Kbp    GAP启动子，或用（1.25Kbp）ADH2启动子（Kniskern等人，1988，Hepatology，8，82-87）代替GAP启动子（见图1）。

在任一种情况下，将含有特定启动子、HBsAg    ORF和ADH1终止区的表达盒克隆到往返载体pC1/1中（Beggs，上文;Rusenberg等人，上文）以产生一种酵母表达载体，然后按下文所述将该载体用来转化啤酒酵母。将这些转化体冻干储存以进行评价和随后的试验。

获取亲代菌株CF52或CF55的方式如下：通过在YEHD完整培养基培养板上将菌株混合，将α交配型菌株CZ5/LB347-1C（mnn9-、SUCZ^-）与一种菌株2150-2-3（leu2^-、adel）交配。为了选择二倍体，将交配过的菌株在含2%葡萄糖（作为唯一的碳源）的leu^-基本培养基上复制平板培养。在分离出单菌落后，使二倍体形成孢子，再通过标准方法对其子囊进行解剖。将KHY-107菌株作为单孢子分离并确定其中的cir⁺、adel⁺、leu2^-和mnn9^-（用Schiff染色技术），按照Broach在[Methods in Enzymology，lol，part C pp307-325（1983）]中所述的方法由菌株KHY107（cir⁺）得到KHY107（Cir0）。通过将分裂的ura3基因整合，使处理过的菌株成ura3^-。将所得到的菌株，KHY-707 ura3△，在富培养基中培养以使自发突变获得聚积并从中选择出具有刀豆氨酸抗性的突变体。该突变菌株，CF55，经互补试验确定是canl^-。将GAL10pGAL4表达盒整合到CF55的HIS3基因中（Method in Enzymology，1990，185 pp297-309）以产生最终寄主菌株CF52（Mata leu2-2，112 ura3△ can1 nis3△∷GAL10pGAL4-URA3，cir°），将菌株CF52和CF55冻干储存以供评价和随后的试验用。

酵母活性启动子启动HBsAg和类似基因的转录过程。因此，对于熟悉本领域的人员来说，很显然可以用任何一种酵母-活性启动子顺序（例如包括但不限于GAL1、GAL10、ADH2、pho5等）GAP491启动子来取代。此外，应该采用合适的测试系统，例如免疫印痕法或RIA或酶一连接型免疫测定（EIA）法来分析测定HBsAg和类似的多肽在该系统中的表达，以便使以最大产率采集培养物的时间最佳化，这一点对于熟悉本领域的人来说也是显而易见的。

GAP491启动子对于在酵母中表达一些外源蛋白（包括HBsAg）是有效的[Bitter等人，Gene，32：263-274，（1984）;Wampler等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，82，pp    6830-6834（1985）]。根据我们以前将HBsAg表达成约40%的可溶性酵母蛋白的结果（Kniskern等人，上文），我们采用这种启动子来在合适的酵母寄主细胞内引发HBsAg和类似蛋白的表达。

为了表达HBV表面蛋白而选择的合适的酵母菌株包含各种各样的候选物。合适的酵母菌株包括但不限于那些具有遗传和表型特征如蛋白酶缺失，而且糖基化能力获得改变的菌株，这一点对于熟悉本领域的人来说是显而易见的。

为了控制和确定由重组酵母表达的HBV蛋白。按上述方法构建出啤酒酵母（S.cerevisiae）菌株CF52（Mata leu2-2、112 ura3△ canl his3△∷GAL10pGAL4-ura3，cir°，mnn9^-）或CF55（Meta leu2-2、112 ura3△ canl cir°）。

采用表达质粒pC1/1pGAL10HBsAgtADH-1来转化CF52（Mata Leu2-2、112 ura3△ canl his3△∷GAL10pGAL4-ura3，cir° mnn9^-）或CF55（mata leu2-2、112 ura3△ canl cir°）。将转化的克隆在含有1M山梨糖醇的基本培养基上（用于CF55的两种载体转化体的有leu-和ura^-）进行选择。对这些克隆过的转化体在17%甘油中冻干储存以供随后的评价和进一步试验使用。

为了获得糖基化过程野生型对照物，也将该表达质粒用于转化酵母菌侏CF54，该菌株是通过标准技术从菌株CF52中分离出来的而且它是MNN9⁺的一种自发的回复突变型（因此对于糖基化过程来说它是野生型的而在其它情况下则具有与菌株CF52一样的基因型）。对转化了的克隆分离物在17%甘油中冻干储存以用于随后的评价和进一步试验。

将含有该表达质粒的被转化了的酵母的克隆在leu^-选择性琼脂平板上进行培养（对于mnn9-转化体，板中含有1M山梨糖醇，而对于两种CF55的载体转化体，板中还缺少尿嘧啶）并于30℃下培养2-3天。将这些酵母接种到5-7ml复合YEHD（Carty等人，上文）培养基的培养物中（含0.1M-1M山梨糖醇）;将培养物于30℃下通气保温12-18小时。用上述培养物接种（原始A600＝0.1）盛有50ml含有1M山梨糖醇的复合YEHD培养基（以后称YEHDS）和对于GAL10启动子质粒的2%半乳糖的烧并，并于30℃下保温同时振荡（350rpm）48-72小时直到最终的A600为10-16。将10个A600单位的样品分散在试管中，并通过离心（在2000Xg下），使酵母细胞成球10分钟。样品既可直接测定也可于-70℃下冻干储存。在测定时，将小球再次悬浮于0.4ml含2mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的磷酸盐-缓冲盐水（PBS）中而后再将它转移至1.5ml Eppendorf管中。破碎酵母细胞的方法有：1）添加200-300mg洗涤过的玻璃珠（0.45mm）并在涡流混合器上搅拌15分钟，2）添加TRITON X-100至0.5%，3）在涡流混合器上搅拌2分钟，和4）在4℃下保温10分钟。在除去细胞碎片和玻璃珠后测定上清液中的蛋白[用Lowry等人在J.Biol.Chem.，193，265，（1951）中所述的方法]和对preS2+S特异的RIA[Hansson等人，Infeet.Immunol.26 125-130，（1979），Machida等人，Gastroenterology 86：910-918，（1984）]或S（AUSRIA）。

将含有该表达质粒的转化后的酵母mnn9-的克隆放在含1M山梨糖醇的选择性琼脂平板上培养并于30℃下保温2-3天。将这些酵母接种到5-7ml复合YEHDS培养基（外加2%用于GAL10启动子质粒的半乳糖）的培养物中，用上述培养物培养，该培养物原始A600＝0.1，并于30℃下将其培养同时振荡（350rpm）48-72小时，直至其最终A600为10-16。将10个A600单位的三倍体样品分散在管中，通过10分钟的离心（2000Xg）使酵母细胞成球。样品既可按上述方法直接测定也可在-70℃下冻干保存。

采用免疫印痕法分析由在具有mnn9-表型的寄主细胞中的上述全部重组体克隆产生的多肽，结果表明有两条表观分子尺寸约为24-KD（对S）和41KD（对preS1（Q4）+preS2+S）的谱带。

对于重组蛋白，定性和定量糖基化模式是函数且在很大程度上取决于寄主细胞物种，在一种物种内则取决于其细胞系。寄主菌株的选择对于熟悉本领域的人员来说很显然应扩展到除啤酒酵母以外的物种及细胞系。对于啤酒酵母，其在糖基化途径中的酶中的实变已得到证实。另外，啤酒酵母的寄主菌株选择也应扩展列所有菌株，其糖基化途径中的酶中的突变也被鉴定，这一点对于熟悉本领域的人员来说也是显而易见的。

对转化的克隆进行筛选，从中选出有HBsAg    DNA存在和p24和p41得到表达的克隆体。为了使GAL10启动子质粒能诱导表达随后使葡萄糖缺失，将这些细胞在同样含半乳糖的YEHDS培养基内培养。制备溶胞产物，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）解析并将其用Western印痕转移至硝基纤维素。结果发现p24和p41两种产物对包壳蛋白是特异的，这是因为它只在诱导转化体内存在且它与抗-p24血清具有反应性（p41与抗-preS抗血清也是能反应的）。为了进一步分析，从每一种方案中选出一种克隆。此外，通过放射免疫测定法，转化体的溶胞产物（但不是亲代的啤酒酵母）对于HBsAg和preS是阳性的。

这种结果加强了利用GAL10启动子的表达载体从而在啤酒酵母中引导表达HBsAg和类似的表面蛋白。作用方式尚不清楚的调节GAL10启动子、或GAL1、GAL2、GAL7或MELI启动子，能使重组啤酒酵母培养物的生长日益递增，从而在引发重组蛋白合成之前达到生产规模的体积，这样就使得对寄主细胞的负作用降至最低，这一点对于熟悉本领域的人员本说是显而易见的。另外含有另外一种调节启动子的表达载体，包括但不限于ADH2和α交配因子（其在生理上可通过其它方法而诱导或表达），能用来引导S和含有preS的多肽的表达，这一点对于熟悉本领域的人员来说是显而易见的。此外，效果较GAPDE差些的组成启动子，包括但不限于cyc1，可以引发含有S和pre-S的多肽的表达，但细胞蛋白的表达百分比较低，这样过表达对生理上的负作用就可以消除，这一点对于熟悉本领域的人员来说是显而易见的。还有应采用适当的测试系统，例如Western印痕或放射免疫测定法，来测定在该系统中的含S和preS的多肽的表达，从而使达到最大产率的采集培养时间最佳化。

已开发出含preS1的疫苗，它能形成产生免疫性的22nm粒子，即保留保护性“a”抗原决定部位和也具有preS1和preS2）区的抗原决定部位的混合HBsAg粒子。采用三种相互有联系的方案：（1）单个酵母寄主的双转化体，它具有两个可独立选择的自复制载体，它们各自表达一种不同的包壳多肽;（2）用一种载体进行单转化，该载体由一种表达盒表达一种包壳多肽和由同一质粒上的另一种表达盒表达另一种包壳多肽;和（3）酵母细胞的单转化，此时使用能由同一质粒主链表达两种被膜多肽的双向（双）表达载体。所用的含有preS1的表面蛋白的形式包括：（1）完整的preS1+preS2+S    ORF，它将在mnn9-寄主中在preS1区Asn4处进行核心糖基化;（2）完整的preS1+preS2+S    ORF的翻改（△2-15）译本，它缺少氨基酸2-15，所以既不能被糖基化也不能肉豆蔻化，但它仍保留preS1的主要抗原/中和抗原决定部位或（3）不能在任何寄主主链中被N-糖基化的Asn4到Gln4突变体。

将完整的preS1+preS2+S（以及△2-15变种）克隆到pGAL10表达盒中，将该盒设计到Ura-基酵母往返载体YEp24、一种中等拷贝（大约30拷贝/细胞）2μ-基载体中。该载体与高拷贝的（大约）200-400拷贝/细胞）Leu-基载体（pC1/1）一道用于双转化某些酵母菌株，表达S    ORF的pGAL10表达盒已被构建到上述pC1/1中。将转化体在缺少亮氨酸和uracil的双-选择性平板上克隆。因回收双转化体的次数较低而造成的困难则可以通过使该回收培养基的营养轻度富足而克服，并且在YEp24中具有完整preS1+preS2+S同时在pC1/1上具有S的转化体的克隆（15215-13），由于AUSRIA（S）和preS-RIA两者所以呈阳性，所述两者都需要有22nm粒子存在，而后者还需要在AUSRIA-阳性粒子上有preS抗原决定部位存在。此外印痕分析表明在约41KD处有一个谱带（大小与完整preS1+preS2+S    ORF的予定转录产品的一致），它可以与抗-preS和抗-S抗体反应，该分析结果还表明有一个只与抗-S抗体有反应性的p24谱带。根据免疫印痕结果估计p24∶p41的相对比约10∶1，将两种克隆以较大体积（600ml）在振荡烧瓶中生长，以便粒子能通过免疫亲合色谱而纯化。所获得结果与△12-15    ORF类似。

通过插入一种合适的合成低聚核苷酸，使Asn4到Gln4的突变在preS1+preS2+S中得以发生。所述ORF被插入pGAL10表达盒中并使定向的盒连接到上述两种酵母往返载体（pC1/1和YEp24）中。

构建一种表达盒，该盒允许由在单个载体主链上的两种经GAL调节的启动子表达两种多肽。该构建过程的优点在于酵母pGAL1pGAL10启动子区是呈双向分离的。在启动子和附加ADH1顺序之间设计出特有的克隆位点。在这些特有位点上插入S和preS1+preS2+S    ORF。

所述的双向载体被用于分别由pGAL1和pGAL10共表达S（ad）和preS1+preS2+S（ay）的ORF。对酵母进行转化由此获得经过克隆的种子。

用于由同一载体表达两种ORF的第二套方案是使用不同强度的启动子，以便使preS1+preS2+S的相对表达水平与双转化体（1∶10）或双向GAL启动子（1∶1）的不同。因此，将pADH2/preS1+preS2+S和pGAL1/S    ORF，在pC1/1中插入。

将一种免疫-亲合柱，用于从转化的啤酒酵母中提纯S和相关S蛋白，所述的免疫亲合柱用能识别HBsAg颗粒的山羊抗体粘接。经放射免疫测定对于HBsAg洗脱的产品是阳性的而且在电镜下是颗粒状的。这种含HBsAg和pre-S抗原或仅含HBsAg的颗粒作为HBV疫苗和诊断试剂是有效的。

将用编码乙型肝炎病毒表面蛋白或其变种的表达载体转化的酵母细胞培养而后采集。如果需要可以用缓冲溶液例如PBS洗涤细胞形成细胞膏后，一般于-70℃下将其冻干储存。

HBsAg和类似蛋白的纯化过程通常按下列方式开始，将一批新鲜的或冻干的细胞膏悬浮于缓冲溶液中，最好是TRIS，其pH值较高，范围在约8.5-约11.0之间，最好约10.5（缓冲液也可以含有合适的蛋白酶抑制剂）。最好用机械的方法使细胞破裂，发现温和型珠破碎法对大规模应用是不合适的。用高压均化器（约10，000-20，000psi，采用Gaulin或Stansted均化器）进行破裂是优选的，因为这种装置操作快速而有效。

酵母细胞的破裂产生了粗提取液。对该粗提取液进行pH调节。将pH调整至8.0-11.0，最好是10.5。

此时希望向该粗提取液加入一些洗涤剂。洗涤剂的加入有助于酵母细胞膜与无用的细胞碎片分离。已证实preS1+preS2+S蛋白以及其它形式的表面蛋白都可能与酵母细胞膜有关。各种中性或非离子型洗涤剂都可使用，它们包括但不限于TRITON-N系列、TRITON-X系列、BRIJ系列、TWEET系列或EMASOL系列、脱氧胆酸盐、辛基吡喃葡糖苷或NONIDET-Np-40。两性离子洗涤剂如CHAPS或CHAPSO也是有效和合适的洗涤剂。

假若使用洗涤剂，那么优选的洗涤剂是TRITON    X-100，其浓度约0.5%。必须强调的是本发明方法在该步骤并不是必须使用洗涤剂，洗涤剂的使用是优选的。

假若溶胞过程中未加入蛋白酶抑制剂，那么可以将该提取液加热处理。在一定的温度范围内和处理持续时间范围内热处理是有效的。通常使用的温度范围45℃-60℃，50℃为优选温度。热处理持续时间范围一般20-40分钟内，以30分钟为优选时间。将提取液在一合适容器内进行热处理并且将该容器浸没于加热浴中或使用热交换器，然后将物料冷却至约10℃;最好将其放入冰-水浴中或采用热交换器。

按照本发明方法，热处理和碎片去除步骤的顺序可以颠倒，这不会对本方法的结果产生重大影响，这一点对于熟悉本领域的人员来说是显而易见的。此外，可以在中性pH的缓冲液中加热所有的酵母细胞，并按上述方法将其破裂并向其中加入洗涤剂。

由热处理过的粗提取液中除去细胞碎片对于防止在随后的纯化步骤过程中发生物理吸留是必须的。碎片去除的办法有离心法，微量过滤法或过滤从而获得澄清的提取液。离心法和微量过滤法是最优选的方法。在不同的离心力下，进行离心的时间长短可变。发现在4℃、约3，000Xg下离心15分钟是适宜的。在离心前，为降低粗酵母细胞提取液的粘着性而稀释该提取液，也是有利的。稀释并不改变本方法随后的任何步骤。

微量过滤法的优点在于过滤和渗析可以同时进行。有一些型号的微量过滤单元对于本步骤是合适的，例如Microgon公司的KROSFLO，或Amicon或A/G技术制造的各种中空纤维滤筒。优选的微量过滤法是使提取液流过Prostak    Durapore（Millipore）膜式，板式和框架式微量过滤单元，其孔径约0.1μm-0.2μm，入口压力约2-7psi，使用的缓冲液由约0.1M    TRIS，其pH约10.4以及约0.1%TRITON    X-100组成。

在进行本工艺的下一步骤之前，可对离心产生的上清液或微量过滤产生的滤液进行浓缩。完成浓缩的方法包括但不限于渗析、过滤、冻干、超滤和渗析过滤法（diafiltration）。本发明优选的浓缩方法是使澄清的提取液流过10⁵分子量断流，中空纤维超滤系统。经过澄清的提取液的体积对于微量过滤产品一般降低约6.5倍而对稀释、离心的产品则降低约2倍，由此产生浓缩的滞留物。浓缩后，将滞留物渗析过滤以进一步除去低分子量的杂物。采用10⁵量断流、中空纤维系统进行渗析过滤。

如果加TRITON    X-100，则可采用一些常规方法将其除去，这些方法包括但不限于渗析法、添加某些有机溶剂、冷冻法、色谱分离法和采用能专门结合该洗涤剂的凝胶或树脂，例如Extractogel（pierce）和XAD树脂（Romicon）并使之接触的方法。本发明优选的去除TRITON    X-100的方法是将含TRITON-N    X-100的经过热处理的提取液循环流过XAD-2或XAD-4树脂（聚苯乙烯二乙烯基苯）筒。将热处理过的提取液在4℃下循环流过XAD筒约10小时，然后将它收集在一合适的容器内，例如可密封的玻璃瓶中。

如果该细胞是在高pH缓冲液中被破裂的，那么此后要将热处理过的提取液的pH调整到约7.0-约7.9之间，以约7.7的pH最好。按照本发明方法在高pH值下进行热处理之后再调整其pH至约7.7对在后来的步骤中使用大孔二氧化硅吸附包壳蛋白极为有利。可以在去除Triton    X-100步骤之前即对热处理过的提取液的pH进行调整，这对本工艺的结果没有影响。因此，对于熟悉本领域的人员来说，很明显按照本发明的方法，pH调整和Triton    X-100去除步骤的顺序可以颠倒，这对本方法的结果无重大影响。

HBsAg很容易与产生基本纯化的粒子的污染物分离。去除污染物的优选方法是使粒子吸附于孔径较宽的二氧化硅上。本发明最好的方法是吸附表面蛋白于孔径较宽的二氧化硅上，其孔径范围约1000-1500

而且二氧化硅的颗粒度范围约30-130微米（Amicon）。表面蛋白很容易进入二氧化硅的孔内而被滞留。酵母细胞蛋白污染物因此易于洗去。

粒子吸附于宽孔的二氧化硅上可用色谱法或用非色谱法分批式进行。通过将pH经过调整的提取液流过柱色谱装置中的宽孔二氧化硅床来进行色谱吸附。通常，一台5cm夹套柱装置[盛约300ml的（约100g干重）宽孔二氧化硅珠]适用于约1升的热处理提取液，其流速约200ml/小时。

通常在宽孔二氧化硅上进行非色谱吸附时，可通过将热处理提取液与二氧化硅在一合适容器内混合，例如在可密封的玻璃瓶混合而完成。优选的方法是向盛于玻璃瓶内的约1升热处理提取液中加入300ml的宽孔二氧化硅并采用恒定混合保温。吸附最好4-8℃下持续1.5小时左右，当然不同的时间及温度也是合适的。

还可通过洗涤吸附表面蛋白但无非吸附物质的二氧化硅而实现非色谱法。或将二氧化硅倒入如前所述的柱装置中，以进行色谱法吸附。进行批量洗涤时可通过抽吸宽孔二氧化硅上的热处理提取液并加入若干体积的缓冲液，但不要引起吸附在二氧化硅上的粒子释放出来，优选的缓冲液是PBS抽吸二氧化硅并将洗涤步骤重复3-5遍。

用色谱法洗涤表面已吸附HBsAg的二氧化硅时可以将PBS以约200ml/小时的流速流过二氧化硅直到280nm下的衰减恒定为至。

使用pH在8.5-9.0之间的缓冲溶液由洗过的宽孔二氧化硅上洗脱出粒子。表面蛋白的解吸最好采用pH为约8.7的由大约0.05M硼酸盐组成的缓冲溶液。将温度提高到-很宽的范围内有利于HBsAg蛋白的解吸，在大约55℃下进行解吸是最好优选的。

采用非色谱法解吸时可通过将pH8.7的1200ml0.05M的硼酸盐缓冲液与大约700ml的已吸附粒子并洗涤过的宽孔二氧化硅相混合而实现。解吸过程持续25分钟左右。收集洗脱液，重复解吸步骤两次后将洗脱液冷却。

采用色谱法解吸时，可以通过使洗涤过的二氧化硅夹套柱加热至55℃左右而实现。将pH8.7的0.05M硼酸盐缓冲液加热至55℃再以500ml/小时的流速用于所述柱。收集洗脱液并加以冷却。洗脱液的体积通常大致与施加到宽孔二氧化硅上的热处理提取液的体积相等。

通常要求浓缩洗脱下来的粒子。优选的浓缩方法是使洗脱液流过10⁵分子量断流中空纤维渗析过滤系统，此时采用0.05M硼酸盐缓冲液，其pH8.7。采用本系统洗脱过的表面蛋白的体积一般降低16倍之多。如果需要可将渗析过滤滞留物通过微量过滤而消毒。

测定粒子中碳水化合物的含量是按Dubois    M.等人在Anal.Chem.，28，pp    350，1956中所述的方法进行的。该方法的一般原理是单糖、低聚糖、聚糖及其衍生物，包括具有游离的或可能游离的还原基的甲基醚当用苯酚和浓硫酸处理时会显出桔黄色。在苯酚浓度恒定时所产生的颜色浓度与存在的糖呈成正比。

为了测定HBV表面蛋白样品中的碳水化合物的含量，在试管中放入1ml含10-17μg蛋白的溶液。制备一系列的碳水化合物标准物和空白样品。往各个试管内加入1ml5%的苯酚溶液，混淆各个试管，加入5ml96%的硫酸溶液后再混合。将各试管在室温下保温10分钟，混合，再于20-30℃下保温20分钟。读出样品在分光光度计上的值（对于己糖和甲基化己糖为A490，对戊糖、糖醛酸及其甲基化衍生物则为A480），通过与碳水化合物标准对比确定HBsAg样品中的碳水化合物含量。

对于在“野生型”重组酵母细胞（CF54）中产生的粒子，和在CF52重组酵母细胞中产生的HBsAg，按上述方法分析两者中的碳水化合物含量。根据这些结果，用样品中蛋白的微克数去除碳水化合物的微克数就可计算出每份样品中所存在的碳水谷物对蛋白的比率。该比率计算结果证明在mnn9-重组酵母细胞中的生产HBsAg始终含有十分之一的在重组“野生型”酵母细胞中产生的HBsAg的碳水化合物量。这些结果表明在mnn9-突变株酵母细胞中产生的HBsAg与“野生型”酵母细胞中产生的HBsAg相比其含有的碳水化合物的量显著降低。

下列实例将用来说明本发明但不是对其进行限制。在下列实例所提到的各参考文献中公开的内容，作为参考而编入本文。

例1

HBV    DNA在pBR322中的克隆

从人血浆（载体）中分离并提纯出HBV    Dane粒子（表型adw和ayw），按Landers等人在[J.virology，23，368-376，（1977）]和Hruska等人在[J.virology，21，（1977）]中所述的方法，采用Dane粒子中的内源聚合酶合成双-链DNA。通过用SDS中所含的蛋白酶K消化随后用苯酚/氯仿提取再用乙醇沉淀从而分离出这种DNA。

用EcoRI消化HBV基因组DNA，产生单个的3.2Kbp片段，再将该片段克隆到pBR322的EcoRI上的位点中以形成pHBV/ADW-1或pHBV/AYW-1。通过EcoRI消化、Southern印痕转移至硝化纤维素和用[³²P]-标记的特异性低聚核苷酸探针杂交来证实HBV DNA的存在。

例2

将preS2+S基因克隆到克隆载体中

对质粒pHBV/ADW-1（实例1描述过）用EcoRI和AccI进行消化，再用制备性琼脂糖凝胶电泳法纯化0.8Kbp片段。还有，用EcoRI和BamⅢ消化pUc质粒，再用制备性琼脂糖凝胶电泳法纯化该线性载体。

为了重新构建preS2+S    ORF的5′部分，合成一对低聚核苷酸，由它们重建的ORF从ATG上游的EcoRI位点经过10bp    NTL顺序（通过Hind  Ⅲ位点）直到EcoRI末端，这些低聚核苷酸的顺序是：

AATTCAAGCT  TACAAAACAA  AATGCAGTGG  (SEQIDNO:2)

1    10    20    30

GTTCGAATGT  TTTGTTTTAC  GTCACCTTAA  (SEQIDNO:3)

1    10    20    30

为了重建preS2+S    ORF的3′部分，合成第二对低聚核苷酸，由它们重新构建的ORF从Acc    Ⅰ位点经过转译终止区（通过HindⅢ位点）直到BamⅢ末端。这些低聚核苷酸的顺序是：

ATACATTTAA  AGCTTG  (SEQIDNO:4)

1    10    16

TGTAAATTTC  GAACCTAG  (SEQIDNO:5)

1    10    18

将低聚核苷酸对退火后，与用pUC    EcoRI-BamHI消化过的载体连接。将得到的载体（2.8Kbp）用制备性琼脂糖凝胶电泳纯化。将由上述得到的0.8Kbp    EcoRI-AccI片段与所述载体连接。用限制性内切酶分析法和Southern印痕法证实preS2+S    ORF的存在和取向。DNA顺序分析[Sanger等人，1977]揭示有两个碱基发生取代，所产生的氨基酸不同于由质粒HBpreSGAP347/19T的DNT编码的顺序。为了评价两种构建过程的相同多肽，将这些取代即T代替碱基64上的C（编码phe而不是Leu）和C代替碱基352上的A（编码His而不是Gln），通过定点致突变加以改变[Zoller和Smith，1982，Nucleic    Acids    Research，10，pp6487-6500]

含有HBsAg编码区而没有preS2编码区的质粒的构建过程如下：用EcoRI和StyI限制性内切酶去消化pUCHBpreS2+S质粒（上文已描述）。将含pUC和HBsAg编码区的大DNA片段（3.3Kbp）与编码的preS2    DNA片段分离再用制备琼脂糖凝胶电泳法将其纯化。合成的DNA低聚核苷酸对为：

AATTCAAGCT  TACAAAACAA  AATGGAGAAC  ATCACATCAG

1    10    20    30    40

GATTC  (SEQIDNO:6)

45

GTTCGAATGT  TTTGTTTTAC  CTCTTGTAGT  GTAGTCCTAA

1    10    20    30    40

GGATC  (SEQIDNO:7)

45

将其与pUCHBsAg片段连接。该合成低聚核苷酸对含有5′EcoRI和3′StyI粘性末端以及紧接着5′EcoRI位点之后有一个HindⅢ位点。另外，合成的DNA低聚核苷酸对含有HBsAg    ATG密码子、上游10bp末被转译的前导顺序和含有Sty1位点的21下游核苷酸。

所述低聚核苷酸对重建HBsAg的完整编码区并允许其以后可通过用HindⅢ消化而从pUC基载体上原封不动地除去。

将带有上述经过连接的DNA低聚核苷酸对的pUC-HBsAg    DNA载体用于转化大肠杆菌E.coil。从重组质粒中选出具有完整重建的HBsAg编码区的质粒。通过用HindⅢ消化，随后分离再用制备性琼脂糖凝胶电泳法纯化，从而从重组质粒除去完整的HBsAg开放解读密码（ORF），由此将其克隆到表达载体中。

例3

将HBsAg    ORF克隆到3种不同的表达载体中

三种不同的表达载体被用于构建HBsAg表达盒。先前已描述过的GAP    491启动子表达盒[Kniskern等人，1986，Gene，46，pp135-141]，是由约1.1Kbp甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）启动子和位于pBR322主链中的大约350bp的酵母醇脱氢酶1（ADH1）终止密码子组成的，它在该启动子和终止密码子之间有一个特有的HindⅢ位点。将例2产生的HBsAg    ORF连接在该特有的HindⅢ位点中，且其存在和取向由限制性内切酶分析法和Southern印痕法证实。

另外，用（0.5Kbp）GAL10启动子（Schultz等人，1987，Gene，54，pp113-123）取代上述构建中的1.1Kbp    GAP启动子和用（1.25Kbp）ADH2启动子（Kniskern等人，1988，Hepatology，8，82-87）取代GAP启动子（见图1）。

在所有情况下，均将含有特异启动子、HBsAg    ORF和ADH1终止密码子的表达盒克隆到往返载体pC1/1中（Beggs，上文;Rosenberg等人，上文），以产生能用于按下述方式转化啤酒酵母（S.cerevisiae）的酵母表达载体。具有GAL10启动子的pC1/1质粒是pC1/1pGA10-HBsAg-tADH-1（见图1）。

例4

将preS1+preS2+S    ORF克隆到GAL10表达载体中

将Kniskern等人在1988，Hepatology，8，pp82-87中所述的preS1+preS2+S克隆载体用HindⅢ消化，随后分离再用琼脂糖凝胶电泳法将其1.17Kb    DNA片段纯化。将该DNA连接到例3所述的GAL10启动了表达载体上的HindⅢ位点中。将连接好的载体用于转化大肠杆菌，并从转化物中筛选出含有正确取向的preS1+preS2+S的适当质粒。表达盒（GAL10启动子、DNA    ORF和tDNH1终止密码子）用SphⅠ消化并从中分离出2.0Kb    DNA片段再用琼脂糖凝胶电泳将其纯化。将盒连接到往返载体pYEP24上的SphⅠ位点中（New    England    Biolabs）以产生酵母表达载体（图2），再将它按下文描述用于转化啤酒酵母。

例5

preS1+preS2+S    ORF中的糖基化突变体（Asn到Gln）

糖基化突变通过一对低聚核苷酸引入preS1+preS2+S    ORF（Gln4代替Asn4）。Asn4是唯一的在酵母寄主中被N-糖基化的氨基酸。Asn变成Gln（Q4）将会产生非N-糖基化的突变。preS1+preS2+S克隆载体已为Kniskern等人，（1988，Hepatology，8，pp82-87）所描述。两种中间克隆载体被用于preS1+preS2+S    ORF的组合中。EcoRI位点将完整的preS1+preS2+S编码区分成0.4Kb的5′区域和0.8Kb的3′区域。将这两种区域结构分别亚克隆以便整个基因完全重新组合。在pUC19/DSD中克隆的3′区域含有大多数的preS2和全部的S（EcoRⅠ至HindⅢ）。5′区域（pUC18/USD）含有全部的preS1和很少几个preS2的碱基（HindⅢ至EcoRI）。为了引起氨基酸的改变，preS1    ORF（包括Asn4）的5′末端被一对低聚核苷酸（72单体）所取代，该低聚核苷酸从ATG上游的BamHI位点经10bp    NTL顺序到HindⅢ终止区。该低聚核苷酸的顺序表示如下：

AGCTTACAAA  ACAAAATGGG  GCAGCAGCTT  TCCACCAGCA

10    20    30    40

ATCCTCTGGG  ATTTTTTCCC  GACCACCAGT  TG  (SEQIDNO:10)

50    60    70    72

ATGTTTTGTT  TTACCCCGTC  GTCGAAAGGT  GGTCGTTAGG

10    20    30    40

AGACCCTAAA  AAAGGGCTGG  TGGTCAACCT  AG  (SEQIDNO:11)

50    60    70    72

pUC18/USD载体用HindⅢ和BamHI酶加以限制，将合成的载体（2.9Kb）分离并用琼脂糖凝胶电泳法纯化。将低聚核苷酸对退火后与消化过的载体连接。所产生的载体用HindⅢ和EcoRI消化。preS1    DNA（0.4Kb）用琼脂糖凝胶电泳纯化。

ORF的3′区域通过用EcoRI和HindⅢ消化而与pUC19/DSD分离（0.8Kb）。将5′和3′片段连接并用HindⅢ消化，并用琼脂糖凝胶电泳分离出完整的ORF（作为HindⅢ片段）（1.2Kb）。对ORF进行顺序分析以验证突变按例3所述将HindⅢ片段连接到两个表达载体（GAL10和ADH2）中。在所有情况下，均将含特异启动子、preS1+preS2+S（Q4）ORF和ADH-1终止密码子的表达盒克隆到往返载体pC1/1或YEP24中。

例6

表达preS1+preS2+S    ORF和HBsAg    ORF的双向载体的构建

质粒pBM272用限制性内切酶HindⅢ和SphⅠ消化并与（）Kb    DNA片段连接，该片段上带有含tADH1终止区的HindⅢ-SphⅠ末端。将该连接好的质粒用于转化大肠杆菌;从转化体中筛选出含tADH1终止区的质粒。将该质粒用EcoRI和SalⅠ消化，并分离含有GAL1/GAL10启动子区域的（）Kb    DNA片段，该启动子区域在GAL1启动子的下游具有tADH1终止区，再通过制备琼脂凝胶电泳将上述DNA片段纯化。

质粒pUC18GAL10tADH1用HindⅢ和EcoRI消化，以除去GAL10启动子区并且大载体片段用琼脂糖凝胶进行纯化。合成两种合成DNA低聚核苷酸，它具有如下顺序：

AATTGTCGAC  AGCTAGCTGA  ATTCCCGGG  (SEQIDNO:8)

1    10    20    30

AGCTCCCGGG  AATTCAGCTA  GCTGTCGAC  (SEQIDNO:9)

1    10    20    30

将这两种低聚核苷酸退火并与经过HindⅢ-EcoRI消化的pUC18GAL10-tADH1载体相连。上述合成低聚核苷酸，当按如上所述连接到pUC18GAL10tADH1载体上时，破坏了该载体上的EcoRI和HindⅢ位点，并将SalI、EcoRI和SmaI识别位点添加到该载体上。

含有连接好的合成低聚核苷酸的载体用SalI和EcoRI进行消化，并且用琼脂糖凝胶电泳法纯化该质粒。将SalI-EcoRI    DNA片段连接到该载体中，所述的DNA片段在GAL1启动子以及GAL10启动子的下游具有tADH1终止密码子。将此连接好的载体用于转化人肠捍菌，并从转化体中筛选出具有合适质粒结构的质粒。所得到的质粒含有GAL1/GAL10启动子区，它在各启动子下游具有tADH1终止密码子（见图3）。位于GAL10启动子和tADH1终止密码子间的克隆位点是EcoRI和SmaI，而位于GAL1启动子和tADH1终止密码子间的克隆位点是BamHI和HindⅢ。

preS1+preS2+S    ORF或preS1（Q4）+preS2+S    ORF（例5）是通过用HindⅢ消化，并且用琼脂糖凝胶纯化1.17Kb    DNA片段而克隆载体获得的。将该片段纯化，并将其钝端连接到位于GAL10启动子下游的双向载体中的SmaI位点中。将连接好的载体用于转化大肠杆菌并从转化株中筛选出合适的质粒，该质粒中含有正确定向的preS1+preS2+S    ORF。

HBsAg    ORF是通过用HindⅢ消化且用琼脂糖凝胶纯化0.7Kb    DNA片段而由质粒获得的。将这种片段连接到位于Gal1启动子下游的双向载体（含preS1+preS2+S    ORF）上的HindⅢ位点中。

将连接好的载体用于转化大肠杆菌且从转化体中筛选出合适的质粒，该质粒含有正确定向的preS1+preS2+S    ORF和HBsAg    ORF。将含有HBsAg、preS1+preS2+S    ORF和pGAL1/pGAL10启动子区以及tADH1终止密码子的表达盒用Sph1消化、分离出3.3Kb    DNA并用琼脂糖凝胶电泳法将其纯化。将该DNA连接在pC1/1往返载体上的SphI位点之间。最终质粒的结构示于图3。

例7

构建两种表达preS1+preS2+S    ORF和HBsAg    ORF的盒载体

将ADH2启动子表达盒中的preS1+preS2+S（Kniskern等人，1988，Hepatology，8，pp82-87）或preS1（Q4）+preS2+S（例5）用SalI消化继之分离并用琼脂糖凝胶电泳法纯化2.8Kb    DNA。逐个将这些DNA连接到pC1/1pGAL10-HBsAg-tADH-1载体上的SalI位点中，以产生具有两种表达盒的酵母载体，每一种盒都具有一种不同的DNA    ORF（HBsAg或preS1+preS2+S）和一种不同的启动子（GAL10或ADH2）;两种盒含有同样的tADH1终止密码子（图4）。将载体按下文所述用于转化啤酒酵母。

例8

构建酵母啤酒酵母CF52和CF55（mnn9-）突变酵母菌株

酵母啤酒酵母菌株KHY 107（cir^-、adel⁺、leu2^-和mnn9-）的构建过程如下：将α交配菌株CZS/LB347-1C（mnn9-、SUCZ^-）通过在YEHD完整培养平板上混合菌株与α型菌株2150-2-3（leu2^-、adel^-）交配接合。为了选出二倍体，将已接合的菌株在含2%葡萄糖作为唯一碳源的leu^-基本培养基上平板复制培养。分离出单菌落后，使二倍体形成孢子并用标准技术将子囊解剖，将KHY-107菌株作为单孢子分离出来并确定其中的cir^-、adel⁺、leu2^-和mnn9-（通过Schiff菌株技术）。

按Broach所述[Methods in Enzymology，101，Part C，pp307-325，（1983）]KHY107（cir0）由菌株KHY107（cir⁺）得到。通过整合破碎的ura3基本使处理过菌株成为ura3^-。将所得到的菌株，KHY-107ura3△，在富培养基中培养以使自发突变聚积并从中选择出抗刀豆氨酸的突变体。突变菌株CF55（Mata leu2-2、112 ura3△ canl cir°），经互补试验证明是canl^-。将GAL10pGAL4表达盒整合到CF55上的HIS3基因中（Methods in Enzymology，1990，185，pp297-309），以产生最终的寄主菌株CF52（Meta leu2-2，112 ura3△ canl his3△∷GAL10pGAL4-URA3，cir°）。

例9

对CF55    mnn9-突变酵母中的混合的HBsAg和preS1+preS2+S粒子进行酵母转化和成种

同时采用例3中的pC1/1pGAL10-HBsAg-tADH-1质粒和例4和5的YEP24pGAL10-preS1+preS2+S-tADH-1质粒来双转化啤酒酵母菌株CF55（例7）。在基本培养基（leu-ura-，含1M山梨糖醇）上选择克隆，并将其制成冻块贮存（在17%甘油中）并按下文所述对其进行评价。

例10

对CF52    mnn9-突变酵母中的HBsAg进行酵母转化和成种

将例5所述的双向载体和例6所述的两种盒式载体用于转化啤酒酵母菌株CF52。在基本培养基（含1M山梨糖醇的leu-）上选择克隆，将其制成冻块贮存（在17%甘油中）并按下文所述进行评价。

例11

混合粒子在酵母CF55和CF52（mnn9-）中的生长和表达

将含有例5中所述的表达质粒的酵母的克隆放在含有1M山梨糖醇的leu^-选择性琼脂平板养皿上并于30℃下保温2-3天。对这些酵母接种5-7ml的复合YEHDS（YEHD+1M山梨糖醇），并于30℃下通气保温12-18小时。向盛有50ml YEHDS+2%半乳糖培养基的烧瓶中接种上述培养物（原始A600＝0.1）并于30℃下振荡（350rpm）保温72小时至最终A600为10-16、将10个A600单位的样品分散在试管中，在2000Xg下使酵母细胞成球10分钟，小球既可用于直接测定又可于-70℃下储存以便进一步分析测定。在测定时，将小球再次悬浮于0.4ml含2mM PMST的缓冲磷酸盐盐水中。通过下列方式使醇酵母细胞破裂：

1）添加200-300mg洗涤过的玻璃珠（0.45mm），2）在涡流混合器上搅拌15分钟，3）添加Triton    X-100至0.5%（v/v），4）在涡流混合器上搅拌2分钟和5）于4℃下保温10-15分钟。通过13，000Xg下离心10分钟除去细胞破片和玻璃珠，移出澄清好的上清液液体并测定蛋白[采用Lowry等人的方法（J.Biol.Chem.，193，265（1951）]并用（AUSRIA^R）测定法（Abbott）测定HBsAg，典型的测定结果表示如下：

例12

在发酵桶内大规模培养生产HBV混合粒子的啤酒酵母

将冷冻的重组酵母培养物接种到含1M山梨糖醇的leu^-平板培养皿上。将平板培养皿于28℃下向下培养2-3天。将平板培养皿上的生长物再次悬浮于YEHDS中，将再悬浮的生长物转移至2L Erlenmeyer烧瓶中，烧瓶中盛有500ml的YEHDS和2%的半乳糖。在28℃下转速为在350rpm的环境可控的振荡恒温箱中将烧瓶保温18-22小时。将这些种子培养物用于接种生产阶段容器。

将取自一个或多个烧瓶的接种物（1-5%v/v）分别转移至盛有10L或200L    YEHDS的16L或250L的发酵桶内。16L发酵桶在500rmp、5L/min空气和28℃下操作。250L发酵桶在160rpm、60L/min空气和28℃下操作。在用种子培养物接种4.0-46小时后对发酵桶进行采集。通常可得到15.0    A660单位的光密度值。采集过程包括用中空纤维过滤装置浓缩细胞继之在缓冲盐溶液中洗涤细胞。按下文所述方法测定细胞浆或将它于-70℃下冷冻储存以用于进一步处理和分析。

将20%洗涤过的细胞浆小量样品（0.6ml）在1.5ml Eppendoff管中用玻璃珠（0.45-0.52mm）打碎。将PMSF（6.5μl的200mM储备液）作为蛋白酶抑制剂加入其中。破碎后由各试管移出等份试样并于-70℃下冷冻以进行免疫印疫分析。在管中的剩余样品中加入TRITON X-100至终浓度为0.5%，将样品筒短地混合再于4℃下保温20-40分钟。通过离心除去细胞碎片然后测定澄清好的细胞提取液中的S抗原[按（Ausria）^R]、pres（按RIA）和蛋白（Lowry）。

例13

采用免疫亲合色谱法纯化颗粒状的混合粒子

将按例8和9所述构建得到的重组啤酒酵母或在烧瓶内或在发酵桶内培养。用微量过滤在Amicon DC-10单元内采用酵母细胞，并悬浮于30ml缓冲液A中[0.1M Na₂HPO₄、pH7.2、0.5M NaCl]，并且在标准压力细胞中在每平方吋75-85磅压力下使细胞破碎七次。破碎的细胞悬浮液（31克湿重细胞）用120ml缓冲液A稀释，加入Triton X-100至终浓度为0.5%（v/v），并且将悬浮液于4℃下通过离心（10，000Xg）澄清20分钟。倾析澄清的液体培养基并在4℃下采用同HBsAg的抗体偶合的琼脂糖AB（Sepharose 4B）[Mcaleer等人，Nature 307∶178（1984）]保温19小时，使抗原吸附于树脂上。在保温期后，为了所有后来的步骤而将细胞浆加热至室温，并于真空下脱气15分钟。将脱气后的浆液倒入2.5×40cm的柱中。当柱装满时，用缓冲液A洗去未结合的蛋白。抗原用3M KSCN（在缓冲液A中）洗脱。将含有抗原的部份在4℃下对0.007M Na₂HPO₄、pH7.2、0.15M NaCl进行渗析并将其收集在一起以形成在20ml中含有1.08mg蛋白的渗析亲合库（Dialyzed Affinity Pool）。将16ml渗析亲合库用5.6ml的0.006M Na₂HPO₄、ph7.2、0.15MNaCl稀释至40mcg/ml。产品通过Millex-Ov0.22μ膜而过滤消毒。渗析亲合库中的产品鉴定是通过检测HBsAg（按Ausria^R反应性）和检测preS（按RIA）而证实的。

例14

大规模纯化重组HBV混合粒子

将大约250g的冷冻细胞膏（产生由两种载体转化体表达的重组混合粒子抗原）再次悬浮于磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中直至浓度为17%湿重/体积（大约1500ml）。通过侵入水浴使细胞加热至45℃。在45℃下将细胞保持15分钟然后在冰上冷却至大约10℃。然后通过两次流过Gaulin均质器使细胞破碎。

均化后，加入10%Titon    X-100至终浓度为0.3%并混合约15分钟。然后使细胞提取液在4℃下离心（3600Xg）20分钟，并收集上清液。

使上清液流过装有约200g XAD-2树脂的柱，以除去Triton X-100。然后使流出物直接从装填约150g宽孔二氧化硅的柱的上面流过，二氧化硅孔径约1500

且其粒径约50微米。所用柱直径为5cm（pharmacia）并且在约200ml/小时流速下操作。

二氧化硅柱用PBS洗涤至A280退回基线。

将混合粒子抗原由二氧化硅柱洗脱出来，开始时采用冷硼酸盐缓冲液（50mM，pH8.7，4℃）流速为每小时约500ml，至到能观察到A280上升。一旦A280开始上升，将柱立即加热至55℃并使55℃硼酸盐缓冲液以每小时约500ml的流速流过该柱。在冰上收集含有混合粒子抗原（大约1L）的洗脱液。然后通过渗滤法（对pH8.7的50mM硼酸盐缓冲液，使洗脱液浓缩至约200ml，此时采用具有10⁵分子量断流的中空纤维渗滤单元。然后使S蛋白过滤通过0.2μm的滤器并储存。经Western印痕分析或银着色凝胶法分析未观察到显著的降解，所以证实产品呈稳定的。银着色或免疫印痕凝胶的定量光密度分析结果表明p41∶p24的相对比为14∶86，电镜检查结果表明为标准22nm粒子。

顺序一览表

(1)普通情报:

(i)申请人:Kniskern,P.J.

Hagopian,A.

Burke,P.

Short,K.R.

(ii)发明名称:能形成寄主碳水化合物含量较低的粒子的复合乙

型肝炎病毒表面蛋白

(iii)顺序数:9

(iv)通讯地址:

(A)收信人:Merck&co.,InC.

(B)街道:P.O.130X  2000

(C)城市:Rahway

(D)州:新泽西(New  Jersey)

(E)国家:美国(US)

(F)邮区:07065-0900

(V)计算机阅读形式:

(A)媒介类型:Floppy  盘

(B)计算机:IBM  PC  [兼容]

(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS

(D)软件:在释放(Release)^#1.0,版本(Version)^#

1.25方面是专利。

(vi)现申请数据

(A)申请数:未获得

(B)申请日:未获得

(C)分类:未获得

(viii)代理人/代理机构情报

(A)姓名Pfeiffer,Hesna  J.

(B)登记号:22,640

(C)参考/附加提要号:18350

(ix)电讯情报:

(A)电话:(908)594-4251

(B)传真:(908)594-4720

(2)对SEQ  ID  NO:1的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:10碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:1

ACAAAACAAA

(2)对SEQ  ID  NO:2的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:30碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:2

AATTCAAGCT  TACAAAACAA  AATGCAGTGG

(2)对SEQ  ID  NO:3的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:30碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:3

GTTCGAATGT  TTTGTTTTAC  GTCACCTTAA

(2)对SEQ  ID  NO:4的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:15碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:4

ATACATTTAA  AGCTTG

(2)对SEQ  ID  NO:5的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:18碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:5

TGTAAATTTC  GAACCTAG

(2)对SEQ  ID  NO:6的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:45碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:6

AATTCAAGCT  TACAAAACAA  AATGGAGAAC  ATCACATCAG  GATTC

(2)对SEQ  ID  NO:7的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:45碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:7

GTTCGAATGT  TTTGTTTTAC  CTCTTGTAGT  GTAGTCCTAA  GGATC

(2)对SEQ  ID  NO:8的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:29碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:8

AATTGTCGAC  AGCTAGCTGA  ATTCCCGGG

(2)对SEQ  ID  NO:9的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:29碱基对

(B)类型:DNA

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:9

AGCTCCCGGG  AATTCAGCT  GCTGTCGAC

(2)对SEQ  ID  NO:10的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:72碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:10

AGCTTACAAA  ACAAAATGGG  GCAGCAGCTT  TCCACCAGCA

ATCCTCTGGG  ATTTTTTCCC  GACCACCAGT  TG

(2)对SEQ  ID  NO:11的情报:

(i)顺序特性:

(A)长度:72碱基对

(B)类型:核酸

(C)股链:单

(D)拓扑结构:线性

(ii)分子类型:DNA(基因组)

(Xi)顺序说明:SEQ  ID  NO:11

ATGTTTTGTT  TTACCCCGTC  GTCGAAAGGT  GGTCGTTAGG

AGACCCTAAA  AAAGGGCTGG  TGGTCAACCT  AG

Claims (23)

1、复合乙型肝炎病毒蛋白，能形成混合粒子并且对每种蛋白至少显示一种抗原的抗原决定部位。

2、权利要求1所述混合粒子，它含有HBV蛋白，该蛋白选自：adr、ayw、adw或ayr表型的复合S蛋白表型;也可选自：preS1+preS2+S蛋白和S蛋白;或preS1（Q4）+preS2+S蛋白和S蛋白。

3、权利要求2所述混合粒子，其中粒子对S蛋白显示出保护性“a”抗原决定部位。

4、权利要求2所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中S蛋白对preS1+preS2+S蛋白的比率分别接近1∶20和20∶1。

5、权利要求4所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中S蛋白对preS1+preS2+S蛋白的比率是1∶1、3∶1、10∶1或20∶1。

6、权利要求2所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中蛋白是在重组寄主细胞中同时产生的。

7、权利要求6所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中重组寄主是酵母。

8、权利要求7所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中酵母寄主在蛋白糖基化方面存在遗传缺陷。

9、权利要求8所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中酵母寄主的遗传缺陷是在mnn9基因中。

10、权利要求5所述复合乙型肝炎病毒蛋白，其中在已纯化的粒子中碳水化合物对蛋白之比低于0.5。

11、权利要求2所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中preS1+preS2+S蛋白是非-糖基化的。

12、权利要求11所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中preS1+preS2+S的氨基酸顺序被改变以防止糖基化。

13、权利要求12所述复合乙型肝炎病毒蛋白，其中preS1+preS2+S蛋白的氨基酸改变是preS1氨基酸顺序的位置4上谷氨酰胺代替天冬酰胺。

14、权利要求2所述复合乙型肝炎病毒蛋白，其中preS1+preS2+S蛋白包含在preS1氨基酸顺序的位置4上由谷氨酰胺代替天冬酰胺，并且其中S蛋白与preS1+preS2+S蛋白之比分别接近1∶20和20∶1之间。

15、权利要求14所述复合乙型肝炎病毒蛋白，其中S蛋白对preS1+preS2+S蛋白之比各为1∶1、3∶1、10∶1或20∶1。

16、权利要求14所述复合乙型肝炎病毒蛋白，其中蛋白是在重组寄主细胞中同时产生的。

17、权利要求16所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中重组寄主是酵母。

18、权利要求17所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中酵母寄主在蛋白糖基化方面存在遗传缺陷。

19、权利要求18所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中酵母细胞的遗传缺陷在mnn9基因中。

20、权利要求14所述复合乙型肝炎病毒表面蛋白，其中在纯化过的粒子中碳水化合物对蛋白的比率低于0.5。

21、一种疫苗，它由权利要求2所述的含有复合乙型肝炎病毒表面蛋白的粒子组成。

22、一种疫苗，它由权利要求20所述的包含复合乙型肝炎病毒表面蛋白的粒子组成。

23、一种权利要求6或9或19所述的抗原或免疫原，它用于制备诊断试剂。

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