CN105039358A - 58型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及58型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法，具体技术要点是提供一种新的编码重组的HPV158？L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV158？L1溶合蛋白、五聚体和由该五聚体组成VLP，本发明还公开该五聚体、VLP蛋白及其组成的疫苗组合物在制备预防HPV158感染的药物中的应用。

Description

58型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及人乳头状瘤病毒的病毒样颗粒及其制备方法。更具体而言，本发明涉及一种重组的人乳头瘤病毒L1蛋白的五聚体及病毒样颗粒（Virus-likeParticle，VLP）及其制备方法，及含该病毒样颗粒的疫苗组合物在预防人乳头瘤病毒感染中的应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,简称HPV)主要通过人体密切接触，如性传播的病毒，可引起人类多种增殖性上皮病变，包括乳头状瘤（疣）和瘤样病变。具体来讲，HPV诱发的疾病主要包括3大类，第1类:宫颈、阴道、女性外阴、阴茎和肛门的癌症及某些类型的头颈部肿瘤等恶性病变。100%的宫颈癌患者都是HPV感染所导致的，90%的肛门癌，40%的外阴、阴道及阴茎，12%的口咽及3%的口腔癌症归因于HPV感染。第2类:良性病变如扁平疣、尖锐湿疣等生殖器疣，是一种性传播疾病，在性行为活跃的人群中很常见。虽然生殖器疣不会像癌症一样造成严重的后果，但是病变通常会引起病人较为痛苦的临床症状如灼痛、出血和疼痛，同时产生尴尬、焦虑和自卑等负而的心理反应，而且反复治疗的过程浪费了大量的医疗资源。在世界范围内估计由非致癌性HPV(主要是6和11型)引起的生殖器疣有3000万，其中20～50%的病变中还包含有高危型HPV的混合感染。第3类:HPV感染还能引起复发性呼吸道乳头瘤(RRP)，这是一种罕见的、具有潜在致命性的疾病，主要发生在青少年时期，有时，大量的乳头瘤可以引起呼吸困难并导致较小年龄儿童死亡。

HPV是无囊膜的双链DNA病毒，主要由病毒外壳和基因组DNA组成(Bernard,Burketal.2011)。HPV病毒外壳是由360个L1蛋白质（形成72个五聚体）和至多72个L2蛋白质构成的二十面体结构，直径55～60nm(HowleyandLowy2007)。病毒外壳蛋白质具有自组装特性，在体外L1蛋白质单独或与L2蛋白质共同自组装形成病毒样样颗粒（Virus-likeParticle，VLP）(Chen,Garceaetal.2000,Finnen,Ericksonetal.2003,Buck,Chengetal.2008,WangandRoden2013)。

由于HPV不能在体外细胞培养,要获得该病毒的特异性抗原,只能用重组DNA技术的方法制备基因工程疫苗。重组Ll或L1/L2组装形成的病毒样颗粒VLPs，无病毒DNA，安全性好，具有和天然病毒颗粒相似的抗原表位，刺激机体后可产生中和抗体IgG和IgA，因此HPVVLPs可作为预防性疫苗，从而大大降低因感染HPV导致产生相关肿瘤的可能性(HowleyandLowy2007)。

HPV疫苗研制的关键是能够大量制备高纯度、稳定的HPV抗原。在HPV疫苗抗原制备技术方面，目前较为常用的生产HPV抗原的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPVL1能自发的形成VLP，往往只需进行简单的纯化即可获得VLP。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1蛋白质已有报道。但是由于大肠杆菌所表达的HPVL1蛋白质可溶性低，目前已知的纯化方法大多通过无盐沉淀或变性复性等步骤从蛋白质种类繁杂的细胞液中最终纯化得到HPVVLP。例如：在专利CN02129070.9中公开通过原核细胞表达和制备HPVL1多聚体的方法，其中纯化工艺包括通过3.3M尿素处理和透析复性过程；在WO-0204007专利中对L1-GST融合蛋白质的纯化方法也是通过尿素变性处理并进行透析复性；在现有技术中也有公开L1蛋白质的纯化方法是包括磷酸缓冲液超滤透析和离心，使目的蛋白沉淀再复溶的步骤。但是在这些纯化过程中蛋白质损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。

在HPV疫苗抗原蛋白质VLP的均一性方面，现有技术中所组装的HPVL1VLP的粒径分散度有使用polyd值表示，polyd值<15%说明颗粒有很好的均一性，15%到30%之间说明颗粒有较大的不均一性，大于30%说明颗粒完全不够均一。现有技术中制备的HPVL1VLP多大于15%。另一个说明粒径均一的指标是PdI值，PdI值为粒径分布系数，小于0.05为高度均一的样品；0.05～0.1为准均一的样品，0.1～0.3为均一性较差的样品，大于0.3为不均一的样品。在US7205125B2专利中公开HPV58-HPV18L1VLP的混合蛋白液的PdI为0.07。

因此，本领域仍然需要成本低、纯度高、产量高、质量稳定的HPVL1蛋白质生产技术和大规模工业化生产重组HPVL1VLP的新方法。

发明内容

本发明的目的是公开一种优化的编码HPV58L1蛋白质的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该多核苷酸序列翻译表达的HPVL1蛋白质，Tag-HPV-L1重组蛋白，由该L1蛋白质形成的五聚体和VLP，以及由该五聚体和VLP作为抗原组成的预防HPV感染的疫苗。

本发明第一方面提供一种经密码子优化的HPV58L1的基因,其核苷酸序列为SEQNO：2。

本发明第二方面提供一种构建的表达载体，其包含本发明第一方面的经密码子优化的HPV58L1的基因。所述载体适合驱动异源DNA在细菌中翻译表达HPVL1蛋白质。在一个实施方案中，所述表达载体优选pGEX-6p-1、pGEX-4T-2、pMAL或pET28a。

本发明的第三方面提供一种构建的工程菌细胞，该细胞包含本发明第一方面的基因，或第二方面的表达载体。所述的工程菌宿主细胞是大肠杆菌，在一个实施方案中，所述宿主细胞优选BL21细胞株。

本发明第四方面提供一种Tag-HPV58L1融合蛋白，其中标签Tag为6*His.Tag，GST.Tag，SUMO.Tag，MBP.Tag，6*His-SUMO.Tag或GST-SUMO.Tag；L1为HPV58L1全长蛋白质和/或C端截短5个、10个、15个或不多于30个氨基酸和/或N端截短2个、4个、6个或不多于10个氨基酸的L1蛋白质。

编码Tag-HPVL1融合蛋白GST-HPV58L1的核苷酸序列为SEQNO：3、SEQNO：11，，GST-SUMO-HPV58L1的核苷酸序列为SEQNO：4、SEQNO：12，MBP的核苷酸序列SEQNO：5、SEQNO：13，6*His-HPV58L1的核苷酸序列为SEQNO：6，6*His-SUMO-HPV58L1的核苷酸序列为SEQNO：7。

编码Tag-HPVL1融合蛋白GST-HPV58L1的氨基酸序列为SEQNO：8，GST-SUMO-HPV58L1的氨基酸序列为SEQNO：9，MBP的氨基酸序列SEQNO：10。

本发明第五方面提供Tag-HPVL1融合蛋白质经过纯化后获得的HPVL1的五聚体，及由五聚体组装的VLP。在一个优选实施例中HPV58L1五聚体蛋白平均粒径10～15nmPdI<0.1。在一个优选实施例中HPV58L1VLP的平均粒径45～65nmPdI<0.1。

本发明第六方面提供了一种疫苗组合物，其包含本发明HPVL1的五聚体或HPVL1的VLP，所述组合物中进一步包含可药用的赋形剂和药用佐剂。

在一个实施方案中将含有HPV58L1五聚体或VLP蛋白原液（根据上述方法制备所得）分别与氢氧化铝佐剂生理盐水溶液按照蛋白与铝含量1:10比例进行吸附配制即可制得重组HPVL1蛋白质五聚体或VLP疫苗，在4℃保存待用。

另一方面，本发明还提供一种获得Tag-HPVL1融合蛋白的方法，包括如下步骤：

A.通过用大肠杆菌偏爱的密码子取代HPV58L1基因序列的翻译同种蛋白的密码子，得到大肠杆菌表达系统偏爱的密码子优化的HPV58L1的基因；

B.构建HPV58L1基因的大肠杆菌表达载体；

C.构建Tag-HPV58L1的大肠杆菌表达工程菌株；

D.诱导表达并纯化得融合蛋白Tag-HPV58L1。

上述制备融合蛋白Tag-HPV58L1方法中原核宿主细胞选自但不限于GI698，ER2566，BL21(DE3)，XA90，B834(DE3)，BLR(DE3)。

上述制备融合蛋白Tag-HPV58L1方法中表达条件是：20～37℃温度条件下，诱导表达3～20小时。在一个具体实施例中优选在28℃温度条件下,诱导表达16小时。

本发明还提供一种获得HPV58L1五聚体的方法，包括如下步骤：

a)用亲和层析方法吸附融合蛋白Tag-HPV58L1；

b)加入蛋白质水解酶切除Tag标签，得到HPV58L1五聚体蛋白质；

c)纯化HPVL1五聚体蛋白质、得到纯度>98%,平均粒径10～15nmPdI<0.1的L1五聚体蛋白质。

上述制备HPV58L1五聚体方法中所述用于蛋白酶为切除Tag标签的位点专一的蛋白质水解酶：重组3C蛋白酶，凝血酶，SUMO蛋白酶，SENP1或TEV蛋白酶。

上述制备HPV58L1五聚体方法中纯化方法选自但不限于离子交换色谱法，疏水性色谱法，分子筛（或称凝胶过滤或分子排阻）色谱法；优选地纯化包括离子交换色谱法和分子筛色谱法。

上述制备HPV58L1五聚体方法中纯化方法还包括使用还原剂，例如加入DTT。

上述制备HPV58L1五聚体方法中最终纯化后所得到HPV58L1五聚体蛋白平均粒径10～15nmPdI<0.1。

本发明还提供了一种HPV58L1五聚体组装成VLP的方法，包括如下步骤：

将平均粒径10～15nmPdI<0.1的L1五聚体蛋白质液与组装缓冲液混合,最终获得pH值为5.0～5.9，盐浓度为500～2000mM，平均粒径45～65nmPdI<0.1的HPV58L1VLP蛋白质液，优选获得pH值为5.7，盐浓度为1300mM的HPV58L1VLP蛋白质液。

组装缓冲液包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，醋酸缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液，枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液，硼酸缓冲液等。

上述HPV58L1五聚体组装成VLP的方法中HPV58L1-VLP蛋白质液中还可以加入保护剂，例如：0.01～0.1聚山梨酯80。

本发明还提供了另一种组装VLP的方法—低温冷冻处理组装法，包括如下步骤：

将HPVL1五聚体蛋白质液置于pH值为5.5～8.0盐浓度为150～1000mM条件下缓冲液，在-20～-80℃条件下完全冷冻，优选冷冻24小时后，再放置室温至蛋白质原液融解，获得平均粒径45～65nmPdI<0.1的HPV58L1VLP蛋白质液。

另一方面，本发明还提供了HPVL1的五聚体、VLP和包括五聚体或VLP的疫苗组合物在制备预防HPV感染的药物中的应用。

根据本发明，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于注射或鼻腔或口腔吸入或者阴道给药，优选注射剂和肌内注射。

本发明中相关术语的说明及解释

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌（菌株）与载体组成，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，XA90，DH(5a)、B834(DE3)，BLR(DE3)。

根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白质的多聚核苷酸插入其中并使蛋白质获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体“是指选自一种或多种，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于：聚山梨酯80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，磷酸铝、氟氏完全佐剂、氟氏不完全佐剂等。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“色谱”包括但不限于：离子交换色谱（例如阳离子交换色谱、阴离子交换色谱）、疏水相互作用色谱、吸附色谱层析法（例如羟基磷灰石色谱）、分子筛色谱层析（凝胶过滤或分子排阻层析）、亲和色谱层析法。

根据本发明，在本发明获得的重组HPVL1蛋白质的方法中，缓冲液是指一种能在加入少量酸或碱和水时大大降低pH变动幅度的溶液，包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，醋酸缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液，枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液，硼酸缓冲液等。

根据本发明，所述细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现；

根据本发明，在本发明获得的重组HPVL1蛋白质的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCI、KCl、CaCl2、NH4Cl、KCI、NH4CI、MgSO4、(NH4)2SO4中的一种或几种。优选NaCI。所用的还原剂包括但不限于DTT，2-巯基乙醇。所用量包括但不限于2mM～lO0mM，优选10～15mM。

有益效果

本发明提供了一种合成基因，该基因序列是根据大肠杆菌的密码子偏好进行过密码子优化的核苷酸序列，该序列编码了HPVL1蛋白氨基酸序列。研究发现经过密码子优化的核酸序列相对于未经密码子优化的核酸序列的L1蛋白的表达量有显著提高。

本发明公开的大肠杆菌表达系统具有表达量高、易于培养和操作以及生产成本低等优点。但是，仅仅使用该表达系统仍难以直接获得大量可溶性的HPVL1蛋白，其原因在于L1蛋白极容易形成包涵体，即无生物学活性的不溶性聚合体。此外，即使获得大量的包涵体，为了得到有生物学活性的蛋白，还必须对包涵体进行变性、复性处理，这个过程往往损失大量的蛋白。为了解决这一难题，本发明采用融合技术，将L1基因与具有协助蛋白质正确折叠的蛋白如谷胱甘肽硫转移酶（GST）、SUMO、MBP、6*His-SUMO或GST-SUMO等进行融合表达，不仅蛋白的可溶性及收率有所提高，而且GST-SUMO-HPVL1，6*His-SUMO-HPVL1使得在HPVL1蛋白质N端没有外源氨基酸的残留，同时发现其中的GST-SUMO作为重组蛋白HPVL1表达的融合标签和分子伴侣，具有抗蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量以及促进靶蛋白正确折叠，提高可溶性等功能。因此本发明采用的技术路线是在构建HPVL1蛋白表达载体时采用了标签蛋白融合技术，一方面通过标签蛋白与L1蛋白形成的融合蛋白来提高目的蛋白的可溶性、提高产量，另一方面通过GST融合标签可以利用亲和层析和蛋白水解酶切除融合质标签方法进行目的蛋白的纯化特点，从而实现了从种类繁杂的细胞裂解液中一步纯化即可获得纯度达到70%以上的HPVL1蛋白，大大提高了纯化效率，从而提高了终产物HPVL1蛋白的产量。

本发明提供的先表达、分离纯化获得高纯度的HPVL1五聚体蛋白后再人工控制组装形成VLP的技术路线，可以解决当前公知技术存在的从杂蛋白种类繁多的细胞破碎液中直接纯化VLP纯度低、降解比例高，收率低的问题，得到高纯度五聚体体外组装VLP及VLP保存条件。

另外，本发明人出人意料地发现了一种新的组装条件和方法：即低温冷冻处理组装法。通过该方法得到的VLP可将冻融前组装的粒径不均一的蛋白质（PdI大于0.1）变成粒径大小符合理论预期而且均一的，PdI小于0.1的VLP，对比现有技术得到的VLP更加稳定，并且可保存于不同盐浓度、pH值范围更广泛的缓冲液中，更便于最终疫苗制剂的稀释和配制。

本发明经重组所得的HPVL1VLP蛋白质，具有良好的免疫原性，可以诱导高滴度的针对同型HPV的中和抗体，预防HPV对人体的感染，是一种良好的疫苗形式。

在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。

附图说明

图1：GST-HPV58L1蛋白质亲和与酶解后的SDS-PAGE凝胶电泳图。M泳道为蛋白质量标准泳道从上至下为：94kDa，66kDa,45kDa,33kDa,26kDa,20kdat，左泳道为亲和吸附GST-L1的树脂，右泳道为酶解后GST与L1的树脂。

图2：GST-SUMO-HPV58L1蛋白质经亲和与酶解后的SDS-PAGE凝胶电泳图。M泳道为为蛋白质量标准（从上至下为：94kDa，66kDa,45kDa,33kDa,26kDa,20kda），左泳道为亲和吸附GST-SUMO-L1的树脂，右泳道为酶解后GST-SUMO与L1的树脂。

图3：MBP-HPV58L1蛋白质经亲和与酶解后的SDS-PAGE凝胶电泳图。M泳道为为蛋白质量标准（从上至下为：94kDa，66kDa,45kDa,33kDa,26kDa,20kda），左泳道为亲和吸附MBP-L1的树脂，右泳道为酶解后MBP与L1的树脂。

图4：6*HIS-SUMO-HPV58L1蛋白质经亲和与酶解后的SDS-PAGE凝胶电泳图。M泳道为为蛋白质量标准（从上至下为：94kDa，66kDa,45kDa,33kDa,26kDa,20kda），左泳道为亲和吸附6*HIS-SUMO-L1的树脂，右泳道为酶解后6*HIS-SUMO与L1的树脂。通过凝胶电泳图显示蛋白酶未切开带有6*HIS-SUMO标签的溶合蛋白。

图5：本发明经过分子筛色谱纯化后的重组HPV58L1五聚体蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳图。M泳道为蛋白质量标准（从上至下为：94kDa，66kDa,45kDa,33kDa,26kDa,20kda），另一泳道为HPVL1蛋白。

图6：HPV58L1五聚体的动态光散射观测结果。结果显示五聚体的粒径直径为12.56nM，粒度分布PdI为0.043。

图7：HPV58L1VLP的动态光散射观测结果。结果显示VLP的粒径直径为52.19nM，粒度分布PdI为0.031。

图8：HPV58L1五聚体蛋白的透射电镜照片。

图9：HPV58L1VLP蛋白的透射电镜照片。

图10：HPV58L1五聚体蛋白质的高压液相分子筛色谱图，图中显示经高度纯化的L1五聚体蛋白质纯度大于98%。

图11：HPV58L1VLP蛋白质的高压液相分子筛色谱图，图中显示经高度纯化的VLP蛋白质纯度大于98%。

图12：HPV58L1五聚体各实验组疫苗接种小鼠后，在第二次加强免疫4周后，检测中和抗体的平均滴度水平。

图13：HPV58L1VLP各实验组疫苗接种小鼠后，在第二次加强免疫4周后，检测中和抗体的平均滴度水平。

下面结合实施例对本发明进一步举例描述。这些实施例是非限制性的。

实施例l：密码子优化的HPVL1基因的设计与合成

基因序列来源于PUBMED上已公开的各型HPV序列。参照大肠杆菌对基因转录密码子的偏好对选定的各型HPVDNA序列进行密码子优化后合成所有HPVDNA序列。根据合成DNA序列设计引物，利用合成基因为模板进行PCR扩增。所得的密码子优化序列通过DNA序列测定验证。

优化前与优化后的HPV各型DNA序列：

SEQNO.1：优化前的HPV58型L1的DNA序列

SEQNO.2：优化后的HPV58型L1的DNA序列

实施例2：重组载体pGEX-6P-1-GST-HPV58L1的构建及鉴定：

扩增HPV58L1的DNA片段引物：（酶切位点分别是BamHI和XhoI）

Forward-HPV58L1-ApaI:5’ACTTCAGGATCCATGTCTGTTTGGCGTCCGTCTG

Reverse-HPV58L1-XhoI:5’ATCTCACTCGAGCTATTTTTTAACTTTTTTACGTTT

PCR扩增反应体系：10xPfubuffer20μL，Pfu酶4μL，10mMdNTP2.5μL，5’Primer(5μM)10μL，3’Primer(5μM)10μL，模板DNA50ng，加d2H2O至200μL。

基因PCR扩增条件：95℃　3min；95℃　30sec，58℃　30sec，72℃　4min；循环32次；72℃　10min。

将含有BamHI和XhoI酶切位点的L1基因片段以及载体pGEX-6P-1进行BamHI/XhoI双酶切处理，之后利用T4DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pGEX-6P-1进行连接反应，16℃10～15h。

连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后由上海生工生物公司进行测序，得到融合重组GST-HPV58-L1蛋白质的核苷酸序列为SEQNO.3，氨基酸序列为SEQNO.8。

参照该实施例方法制备带有GST标签的融合重组载体GST-HPV-L1，其基因序列SEQNO.11。

实施例3：重组载体pGEX-6P-1m-GST-SUMO-HPV58L1载体构建

pGEX-6p-1m载体构建：为使得多酶切位点附近的ApaI酶切位点（GGGCCC）为载体的唯一ApaI酶切位点，在不改变lacI基因蛋白质表达序列的前提下，通过点突变技术将市售的pGEX-6p-1载体的另一ApaI识别序列GGGCCC中的Gly密码子GGC改变为它的同义密码子GGT，即可消除ApaI（3890）。通过这样的改造使得ApaI成为可用来插入表达基因的位点。

扩增SUMO的DNA片段引物：（酶切位点分别是ApaI和BamHI）

Forward-SUMO-ApaI:ACTTCAGGGCCCTCTGACCAGGAAGCTAAACCGTC

Reverse-SUMO-BamHI:CGCGGATCCACCGGTCTGTTCCTGGTAAAC

扩增HPV58L1的DNA片段引物：（酶切位点分别是BamHI和XhoI）

Forward-HPV58L1-ApaI:5’ACTTCAGGATCCATGTCTGTTTGGCGTCCGTCTG

Reverse-HPV58L1-XhoI:5’ATCTCACTCGAGCTATTTTTTAACTTTTTTACGTTT

PCR扩增反应体系：10xPfubuffer20μL，Pfu酶4μL，10mMdNTP2.5μL，5’Primer(5μM)10μL，3’Primer(5μM)10μL，模板DNA50ng，加d2H2O至200μL。

基因PCR扩增条件：95℃　1.5min；95℃　30sec，58℃　30sec，72℃　1min；循环32次；72℃　10min。

基因PCR扩增条件同上述实施例。

酶切连接：将含有ApaI和BamHI酶切位点的SUMO基因片段以及载体pGEX-6P-1m进行ApaI/BamHI双酶切处理，之后利用T4DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pGEX-6P-1m进行连接反应，16℃10～15h。

转化鉴定：连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，得到融合重组载体pGSTSUMO-6p-1m。

再次酶切连接：将含有BamHI和Xho1酶切位点的L1基因片段以及重组载体pGSTSUMO-6p-1m进行BamHI/Xho1双酶切处理，之后利用T4DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pGSTSUMO-6p1m进行连接反应，16℃10～15h。

再次转化鉴定：连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，得到带有GST-SUMO标签的融合重组载体GST-SUMO-L1，其基因序列SEQNO.4，氨基酸序列为SEQNO.9。

参照该实施例方法制备带有GST-SUMO标签的融合重组载体GST-SUMO-L1，其基因序列SEQNO.12。

实施例4：重组载体pMAL—MBP-HPV58L1的构建

扩增HPV58L1的DNA片段引物：（酶切位点分别是EcoRI和HindIII）

Forward-HPV58L1-EcoRI:5’ACTTCAGAATTCATGTCTGTTTGGCGTCCGTCTG

Reverse-HPV58L1-HindIII:5’ATCTCAAAGCTTCTATTTTTTAACTTTTTTACGTTT

将含有EcoRI和HindIII酶切位点的L1基因片段以及载体pMAL进行EcoRI/HindIII双酶切处理，之后利用T4DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pMAL进行连接反应，16℃10～15h。

连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后由上海生工生物公司进行测序，得到融合重组MBP-HPV58-L1蛋白质的基因序列SEQNO.5，氨基酸序列为SEQNO.10。

参照该实施例方法制备带有MBP标签的融合重组载体MBP-HPV58-L1，其基因序列SEQNO.13。制备融合重组载体MBP-HPV16-L1，其基因序列SEQNO.14。制备融合重组载体MBP-HPV18-L1，其基因序列SEQNO.15。

实施例5：重组载体pET28a-6*His-HPV58L1的构建

扩增HPV58L1的DNA片段引物：（酶切位点分别是NdeI和XhoI,pET28a）

Forward-HPV58L1-NdeI:5’GACTTCACATATGATGTCTGTTTGGCGTCCGTCTG

Reverse-HPV58L1-XhoI:5’CATCTCACTCGAGCTATTTTTTAACTTTTTTACGTTT

将含有NdeI和XhoI酶切位点的L1基因片段以及载体pMAL进行NdeI/XhoI双酶切处理，之后利用T4DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pET28a进行连接反应，16℃10～15h。

连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后由上海生工生物公司进行测序，得到融合重组MBP-HPV58-L1蛋白质的基因序列SEQNO.6。

实施例6：重组载体6*His-SUMO-HPV58L1载体构建

扩增SUMO的DNA片段引物：（酶切位点分别是NdeI和BamHI）

Forward-SUMO-NdeI:GGAATTCCATATGTCTGACCAGGAAGCTAAACCGTC

Reverse-SUMO-BamHI:CGCGGATCCACCGGTCTGTTCCTGGTAAAC

扩增HPV58L1的DNA片段引物：（酶切位点分别是BamHI和XhoI）

Forward-HPV58L1-ApaI:5’ACTTCAGGATCCATGTCTGTTTGGCGTCCGTCTG

Reverse-HPV58L1-XhoI:5’ATCTCACTCGAGCTATTTTTTAACTTTTTTACGTTT

SUMO基因、L1基因PCR扩增条件、反应体系同上述实施例所述。

酶切连接：将含有NdeI和BamHI酶切位点的SUMO基因片段以及载体pET-28a进行NdeI/BamHI双酶切处理，之后利用T4DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pET28a进行连接反应，16℃10～15h。

转化鉴定：连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，得到融合重组载体pETSUMO-28a。

再次酶切连接：将含有BamHI和Xho1酶切位点的L1基因片段以及重组载体pETSUMO-28a进行BamHI/Xho1双酶切处理，之后利用T4DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pETSUMO-28a进行连接反应，16℃10～15h。

再次转化鉴定：连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后由上海生工生物公司进行测序，得到融合重组MBP-HPV58-L1蛋白质的基因序列SEQNO.7。

实施例7：重组HPVL1五聚体蛋白质的表达

将测序结果正确实施例2、3、4、5和6的重组载体转化大肠杆菌BL21宿主细胞，并作为表达重组蛋白质的工程菌进行HPVL1蛋白的表达。工程菌培养基为2YT培养基（10g/L胰化蛋白胨；5g/L酵母粉；10g/LNaCl）。挑取含重组质粒的菌体单斑于10ml2YT培养基（含100μg/ml氨苄青霉素）中，230转/分钟（rpm），37℃振荡培养过夜。转接5ml过夜菌于500ml（含100μg/ml氨苄青霉素）2YT液体培养基中，37℃震荡培养至重组工程菌生长至OD600nm≈0.4～1时，加入终浓度0.2mM的IPTG诱导，在28℃的条件下进行6h以上重组蛋白质的诱导表达。

细胞收集及破碎：对发酵培养物进行离心，弃上清，收获菌体沉淀，称重；使用bufferL（pH8.0，50mMTris，200mMNaCl，5mMDTT）洗涤沉淀，然后将其重悬于bufferL中进行超声波破碎，随后通过高速离心机对破菌液进行离心（16000rpm，30min，4℃），收集上清液。

实施例8：重组HPVL1五聚体蛋白在大肠杆菌中表达量的检测

采用ELISA夹心法检测亲和层析上样前Tag-HPVL1五聚体蛋白在大肠杆菌中表达量,样品及供试品:

包被抗体：自制抗HPV58L1小鼠单抗。

对照品：自制高纯度的HPV58L1蛋白。

供试品：用样品稀释液将供试品Tag-HPV58L1稀释至浓度在对照品梯度稀释浓度范围内。

酶标抗体：自制的辣根过氧化物酶标记的兔抗HPV58L1蛋白多抗。

结果计算:计算平行孔的平均值，以对照品系列浓度OD₄₅₀吸收值对其相应的L1蛋白抗原作直线方程，平行样品孔间变异系数不得大于10%，直线回归方程R²不得小于0.980，将供试品的OD₄₅₀吸收值代入方程计算出稀释后供试品L1蛋白抗原含量，再乘以相应的稀释倍数即为供试品中L1蛋白抗原含量，见表1。

表1检测表达后Tag-HPVL1蛋白抗原含量

实施例9：重组HPVL1五聚体蛋白质亲和层析

带GST标签重组蛋白的亲和层析：亲和柱中装入GST琼脂糖亲和层析介质5ml，以bufferL（pH8.0，50mMTris，200mMNaCl，5mMDTT）平衡层析柱，然后上样实施例8中带有GST或GST-SUMO标签的蛋白液，完毕后以BufferL洗至无蛋白质流出，亲和完毕。以5mLBufferL悬浮亲和介质，取样检测并计算介质中结合L1蛋白质的总量。

带MBP标签重组蛋白的亲和层析：亲和柱中装入Amylose-Resin亲和层析介质5ml，以bufferL（pH8.0，50mMTris，200mMNaCl，5mMDTT）平衡层析柱，然后上样实施例8中带有GST或GST-SUMO标签的蛋白液，完毕后以BufferL洗至无蛋白质流出，亲和完毕。以5mLBufferL悬浮亲和介质，取样检测并计算介质中结合L1蛋白质的总量。

带6*HIS标签重组蛋白的亲和层析：取5mlNi-NTA凝胶装柱，在柱上缓慢加入10倍柱体积的平衡液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNacl，20mmol/Limidazole，用NaOH调整PH值至8），以充分平衡Ni-NTA凝胶，流速为1ml/min。取实施例8中过滤后的带有6*His标签的上清液，完全进入凝胶后，用10倍柱体积的平衡液继续洗涤凝胶，保存流速为1ml/min。用平衡液洗脱至无蛋白质流出，亲和完毕。取样检测并计算介质中结合L1蛋白质的总量。

实施例10：重组Tag-HPVL1蛋白质的酶切纯化

按照目的蛋白质与蛋白酶质量比100：1加入酶量，其中带有GST-HPV-L1的蛋白质用3C蛋白酶切，带有GST-SUMO-HPV-L1和6*His-SUMO-HPV-L1的蛋白质用SENP1蛋白酶切,带有Mbp-HPV-L1的蛋白质用FactorXa蛋白酶切,带有6*His-HPV-L1的蛋白质用Thrombin蛋白酶切,分别混合酶切2h后，分别洗脱收集各个蛋白酶切后所得的HPV58L1五聚体蛋白质溶液。

将3C酶酶切GST标签后的L1蛋白质溶液用SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果见图1亲和层析电泳结果，实验表明，可将90%的目的蛋白切下。图2为SENP1蛋白酶切带有GST-SUMO-HPV-L1的蛋白质，用SDS-PAGE凝胶电泳检测。图3为FactorXa蛋白酶切带有Mbp-HPV-L1的蛋白质，用SDS-PAGE凝胶电泳检测。图1-图3说明说明得到了55kDa的HPV58L1蛋白。

Thrombin蛋白酶没有切开6*His-HPV-L1的蛋白质；用SENP1酶切6*His-SUMO-L1的蛋白质溶液用SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果见图4，显示SENP1蛋白酶未能切开带有6*His-SUMO标签的溶合蛋白。

实施例11：重组HPVL1五聚体蛋白质的纯化

分子筛色谱纯化：将上一个实施例收集的酶切纯化后的HPV58L1五聚体蛋白质分别进行纯化，可先经过离子交换色谱收集的HPV58L1五聚体蛋白质，或不经过离子交换步骤直接用Superdex200(GE公司生产)的凝胶过滤介质进行进一步分子筛层析，分子筛流动相为pH8.0，10mMTris，100mMNaCl，收集HPV58L1五聚体蛋白质紫外吸收峰的馏分。

纯化后测定样品纯度：将收集的蛋白质溶液取样用SDS-PAGE凝胶电泳检测，目的蛋白质HPV58L1五聚体经过分子筛层析纯化后最终纯度均大于98%，详见图5，经过分子筛色谱纯化后的重组HPV58L1五聚体蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳图。

测定样品蛋白浓度：用Bradford法进行蛋白浓度检测，使用标样2mg/mlBAS配制从100ug/ul稀释到500ug/ul，样品反应体系取10ul稀释的BSA+200ulBradford工作液：标准曲线为y=0.0013x-0.0294，R2=0.9986，测定样品的OD₅₉₅，代入标准曲线，计算样品的蛋白浓度，结果见表2。

表2Bradford法检测重组HPV58L1五聚体蛋白浓度

注：样品组1为GST-HPVL1经分子筛纯化后得HPVL1五聚体蛋白溶液；样品组2为GST-SUMO-HPVL1经分子筛纯化后得HPVL1五聚体蛋白溶液；样品组3为Mbp-HPVL1经分子筛纯化后得HPVL1五聚体蛋白溶液。

实施例12：重组HPV58L1五聚体蛋白质组装成VLP

在置于如下盐浓度（NaCl）和PH值条件下，HPVL1五聚体溶液样品组1、2和3，放置稳定后，使用马尔文ZetasizerNanoZS的动态光散射粒径仪，进行粒径及粒径分布测定（粒径分布系数PdI值为粒径分散度指标，小于0.05为高度均一的样品；0.05～0.1为准均一的样品，0.1～0.3为均一性较差的样品，大于0.3为不均一的样品），，HPV58L1五聚体蛋白组装得到粒径均一的VLP（PdI＜0.05）。

表3不同pH和盐浓度条件下组装HPV58L1VLP的粒径检测

注：样品组1为GST-HPVL1经分子筛纯化后得HPVL1VLP蛋白溶液；样品组2为GST-SUMO-HPVL1经分子筛纯化后得HPVL1VLP蛋白溶液；样品组3为Mbp-HPVL1经分子筛纯化后得HPVL1VLP蛋白溶液。

实施例13：动态光散射（DLS）对L1五聚体和VLP蛋白质粒径测定

仪器为马尔文ZetasizerNanoZS的动态光散射粒径仪，取各样品组最终制得的HPV58L1五聚体和HPV58L1VLP蛋白质进行检测，测平均粒径和分散性指数PdI（表明蛋白质的均一性），说明各组样品最终制备的L1五聚体和VLP蛋白均一。其中样品组2最终制得的五聚体蛋白质和其组装获得的HPV58L1VLP蛋白质粒径分布详见附图6和7。

实施例14：HPV58L1五聚体和VLP的制备

依据本发明上述实施例1-13所采用的技术，制备具有序列11，12，13的HPV58L1蛋白，以上蛋白均可纯化得到纯度达到98%以上的蛋白，得到平均粒径10～15nmPdI<0.1的HPV58L1五聚体蛋白。进一步组装得到平均粒径45～65nmPdI<0.1的HPV58L1VLP蛋白。

实施例15：低温冷冻处理对L1五聚体蛋白体外组装VLP的影响实验

在室温下将L1五聚体蛋白置于下表的盐浓度和PH值条件组装VLP，并测其粒径和PdI值。随后将其放置在-80℃条件下冷冻处理24小时，然后再放置室温至蛋白质溶液融解，再次检测其粒径和PdI值。经过冷冻处理可将在室温条件下（冻融前）组装的粒径不均一的蛋白质（PdI大于0.1）变成了粒径大小符合理论预期而且均一的，PdI小于0.1的VLP蛋白。

表4HPV58L五聚体蛋白在室温下组装VLP的粒径检测结果

表5HPV58L五聚体蛋白-80℃冷冻处理后组装VLP的粒径检测结果

实施例16：HPV58L1五聚体和VLP的形态学检测

透射电镜观察：将实施例中各个纯化获得的HPV58L1五聚体蛋白质、组装获得的HPV58L1-VLP蛋白质，通过中国科学院生物物理所利用透射电镜平台观察。冷冻样品制备及拍照流程：

1)将液氮盒装满液氮，待液面不沸腾时，将乙烷缓慢注入冷却的铜碗中，使之冷却为液态。

2)将铜网在PDC-32型等离子清洗器做亲水性处理。

3)在VitrobotTMMarkIV冷冻样品制备设备中，将3.5μL的五聚体及VLP样品吸附在300目的QUANTIFOIL铜网中，吸水4s后，通过液态乙烷冷冻样品。

4)迅速将样品转移到液氮中保存。

5)收集冷冻照片时，电子剂量为20e-/?2。数据通过300KV的300kVTitanKrios透射电子显微镜的GatanUltraScan4000CCD记录。加速电压为300kV。

结果显示，在HPV58L1五聚体蛋白质样品组中，视野中可见大量直径与理论大小相符的10nm左右的五聚体蛋白；在HPV58L1-VLP蛋白质样品组中，可见颗粒大小与理论相符的大量直径为50nm左右的病毒样颗粒（VLP），均匀一致。其中GST-SUMO标签组（样品组2）酶切纯化后HPV58L1五聚体所得样品的透射电镜照片见附图8，Mbp标签组（样品组3）酶切纯化后再组装的VLP蛋白的透射电镜照片见附图9。

实施例17：HPV58L1蛋白质原液纯度检测

分子排阻高效液相色谱测定：色谱柱AgilentBioSEC-5um，2000?，7.8×300mm，柱体积约15m1，分子量范围≥lO,OOOkDa；以pH6.8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（称取磷酸氢二钠25.8g，磷酸二氢钠4.37g，加超纯水使溶解，用磷酸调pH至6.8，超纯水定容成1000ml）为流动相；流速为1ml/min；检测波长280nm；柱温25℃，上样量不得小于20ug，样品主峰理论塔板数不低于1000，拖尾因子小于2.0，连续进样5针，峰面积的相对标准偏差不得大于3%。

取纯化后的样品2组最终制得的HPV58L1五聚体和组装后的VLP的蛋白质原液，分别稀释浓度为1mg/ml，上样量20ul注入高压液相色谱仪，按照上述方法检测，按面积归一法计算纯度，所有处理蛋白质纯度均大于98%，结果见附图10和表6、附图11和表7。

表6HPV58L1五聚体的HPLC蛋白质纯度检测

表7HPV58L1组装后VLP的HPLC蛋白质纯度检测

峰	保留时间	面积	面积 %
				1	13.767	2537207	100
总计		2537207	100

实施例18：HPVVLP稳定性实验

将各个样品组最终制得的HPV58VLP蛋白质在下表的缓冲液条件下，在25℃放置14天至28天，进行粒径检测，结果见下表，证明HPV58VLP在pH5.0至5.9，盐浓度500～2000mM下存放稳定。样品组3所得HPV58VLP在pH5.0至5.9，盐浓度500～2000mM下放置14-28天后检测结果详见如下表。

表8HPV58L1VLP在25℃下放置14-28天粒径检测结果

实施例19：制备含有HPVL1五聚体或VLP的单价疫苗

将含有各个样品组的HPV58L1五聚体或VLP蛋白原液分别与氢氧化铝佐剂生理盐水溶液按照蛋白与铝含量1:10比例进行吸附配制即可制得重组HPVL1蛋白质五聚体或VLP疫苗，在4℃保存待用。

实施例20：HPV58L1五聚体和VLP的免疫原性测定

分别取上述HPV58L1五聚体或VLP疫苗，加入灭菌过的生理盐水分别稀释成20μg/ml浓度的五聚体或VLP蛋白疫苗，以每只0.1ml肌肉注射BALB/c小鼠，每组10只。小鼠每4周加强免疫一次，共免疫2次。加强免疫4周后，采用假病毒细胞中和实验法分别测定每次免疫后的小鼠血清中针对同型HPV的中和抗体滴度，结果如附图12、13所示。

结果表明，HPVL1五聚体和VLP蛋白疫苗接种小鼠，二次免疫后4周中和抗体即可达到很高的水平。实验结果证明，HPVL1五聚体和组装的VLP疫苗均可以在动物体内产生中和抗体，说明HPVL1五聚体和VLP蛋白质疫苗在人体临床试验中都具有免疫原性，即能预防HPV同型病毒引起的疾病。

实施例21：HPVL1VLP的三价疫苗的免疫原性测定

将序列为SEQNO.13、SEQNO.14和SEQNO.15的核苷酸序列的MBP-HPVL1分别经上述实施例的步骤进行表达、纯化、再组装成HPVL1VLP蛋白原液按1：1：1（重量比）混合后，用pH7.2的硼酸缓冲盐稀释成150μg/ml的蛋白液，取稀释后的蛋白液加入50μg/ml氢氧化铝佐剂，充分混合吸附2小时，获得120μg/ml的16/18/58三价HPVL1VLP蛋白疫苗，于4℃避光保存。

参照实施例20方法稀释成每ml的VLP蛋白疫苗中含有20μgHPV16/20μgHPV18/20μgHPV58，以每只0.1ml肌肉注射BALB/c小鼠进行免疫原性测定，一次免疫后中和抗体几何平均滴度针对16型、18型和58型假病毒分别达到780，480和630，二次免疫后中和抗体几何平均滴度分别达到25450，21250和18130。说明HPV五聚体或VLP蛋白质三价疫苗在试验中具有免疫原性，即能预防HPV同型病毒引起的疾病。

SEQUENCELISTING

<110>北京康乐卫士生物技术股份有限公司

<120>58型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法

<130>2014

<160>15

<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

<213>人工序列

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370375380

GluGlyArgIleSerGluPheMetAlaLeuTrpArgProSerAspAsn

385390395400

ThrValTyrLeuProProProSerValAlaArgValValAsnThrAsp

405410415

AspTyrValThrArgThrSerIlePheTyrHisAlaGlySerSerArg

420425430

LeuLeuThrValGlyAsnProTyrPheArgValProAlaGlyGlyGly

435440445

AsnLysGlnAspIleProLysValSerAlaTyrGlnTyrArgValPhe

450455460

ArgValGlnLeuProAspProAsnLysPheGlyLeuProAspAsnSer

465470475480

IleTyrAsnProGluThrGlnArgLeuValTrpAlaCysAlaGlyVal

485490495

GluIleGlyArgGlyGlnProLeuGlyValGlyLeuSerGlyHisPro

500505510

PheTyrAsnLysLeuAspAspThrGluSerSerHisAlaAlaThrSer

515520525

AsnValSerGluAspValArgAspAsnValSerValAspTyrLysGln

530535540

ThrGlnLeuCysIleLeuGlyCysAlaProAlaIleGlyGluHisTrp

545550555560

AlaLysGlyThrAlaCysLysSerArgProLeuSerGlnGlyAspCys

565570575

ProProLeuGluLeuLysAsnThrValLeuGluAspGlyAspMetVal

580585590

AspThrGlyTyrGlyAlaMetAspPheSerThrLeuGlnAspThrLys

595600605

CysGluValProLeuAspIleCysGlnSerIleCysLysTyrProAsp

610615620

TyrLeuGlnMetSerAlaAspProTyrGlyAspSerMetPhePheCys

625630635640

LeuArgArgGluGlnLeuPheAlaArgHisPheTrpAsnArgAlaGly

645650655

ThrMetGlyAspThrValProGlnSerLeuTyrIleLysGlyThrGly

660665670

MetArgAlaSerProGlySerCysValTyrSerProSerProSerGly

675680685

SerIleValThrSerAspSerGlnLeuPheAsnLysProTyrTrpLeu

690695700

HisLysAlaGlnGlyHisAsnAsnGlyValCysTrpHisAsnGlnLeu

705710715720

PheValThrValValAspThrThrArgSerThrAsnLeuThrIleCys

725730735

AlaSerThrGlnSerProValProGlyGlnTyrAspAlaThrLysPhe

740745750

LysGlnTyrSerArgHisValGluGluTyrAspLeuGlnPheIlePhe

755760765

GlnLeuCysThrIleThrLeuThrAlaAspValMetSerTyrIleHis

770775780

SerMetAsnSerSerIleLeuGluAspTrpAsnPheGlyValProPro

785790795800

ProProThrThrSerLeuValAspThrTyrArgPheValGlnSerVal

805810815

AlaIleThrCysGlnLysAspAlaAlaProAlaGluAsnLysAspPro

820825830

TyrAspLysLeuLysPheTrpAsnValAspLeuLysGluLysPheSer

835840845

LeuAspLeuAspGlnTyrProLeuGlyArgLysPheLeuValGlnAla

850855860

GlyLeuArgArgLysProThrIleGlyProArgLysArgSerAlaPro

865870875880

SerAlaThrThrSerSerLysProAlaLysArgValArgValArgAla

885890895

ArgLys

<210>11

<211>2094

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttctt60

ttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaa120

tggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgat180

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gattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaa420

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ttcaaagaatacgttcgtcacgttgaagaatacgacctgcagttcgttttccagctgtgc1800

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gaagactggcagttcggtctgaccccgccgccgtctgcttctctgcaggacacctaccgt1920

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gaccagttcccgctgggtcgtaaattcctgctgcagtctggtctgaaagcttag2094

<210>12

<211>2451

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttctt60

ttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaa120

tggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgat180

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atgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttg300

gatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagtt360

gattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaa420

acatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgat480

gttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaa540

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aaccacaccccgaaagaactgggtatggaagaagaagacgttatcgaagtttaccaggaa960

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aaccgtgctggtaaactgggtgaagctgttccggacgacctgtacatcaaaggttctggt1800

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<210>13

<211>2622

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

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aacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcgctgatttataacaaa360

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<210>14

<211>2643

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

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ccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacatt180

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<210>15

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

atgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggt60

ctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcat120

ccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacatt180

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tcttacatccactctatgaactcttctatcctggaagactggaacttcggtgttccgccg2400

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cagaaagacgctgctccggctgaaaacaaagacccgtacgacaaactgaaattctggaac2520

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ctggttcaggctggtctgcgtcgtaaaccgaccatcggtccgcgtaaacgttctgctccg2640

tctgctacc2649

Claims (22)

1.一种经大肠杆菌偏好密码子优化的编码人乳头瘤病毒HPV58L1的基因，该基因为SEQNO.2所示的核苷酸序列。

2.一种大肠杆菌表达载体，其特征在于该载体包括具有权利要求1所述基因的序列。

3.如权利要求2所述的大肠杆菌表达载体，其特征在于该载体为pGEX-6p-1、pGEX-4T-2、pMAL或pET28a。

4.一种工程菌细胞，该细胞包含权利要求1所述的基因，或权利要求2、3所述的表达载体。

5.一种Tag-HPV58L1的融合蛋白，其特征在于该蛋白包括编码人乳头瘤病毒HPV58L1的基因，优选经大肠杆菌偏好密码子优化的编码人乳头瘤病毒HPV58L1的基因，更优选如权利要求1所述的基因编码；标签Tag为GST.Tag，MBP.Tag或GST-SUMO.Tag。

6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于L1蛋白质为全长蛋白质或C端截短不多于30个氨基酸和/或N端截短不多于10个氨基酸的L1蛋白质。

7.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于其核苷酸序列为SEQNO.3，SEQNO.4，SEQNO.5，SEQNO.11，SEQNO.12或SEQNO.13。

8.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列为SEQNO.8，SEQNO.9或SEQNO.10。

9.一种HPV58L1五聚体蛋白质，其特征在于该五聚体蛋白质由如权利要求5、6、7或8所述的融合蛋白质经过纯化后获得，五聚体蛋白平均粒径10～15nmPdI<0.1。

10.一种HPV58L1的VLP，其特征在于该VLP由权利要求9所述的五聚体蛋白质组装而成，平均粒径45～65nmPdI<0.1。

11.一种HPVL1蛋白质疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物包括权利要求9所述的HPVL1五聚体蛋白质和药用佐剂。

12.一种HPVL1蛋白质疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物包括权利要求10所述的HPVL1VLP和药用佐剂。

13.如权利要求5、6、7或8所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

通过用大肠杆菌偏好的密码子取代HPV58L1基因序列的密码子，得到密码子优化的HPV58L1的基因；

构建HPV58L1基因的大肠杆菌表达载体；

构建Tag-HPV58L1的大肠杆菌表达工程菌株；

诱导表达并纯化得融合蛋白Tag-HPV58L1。

14.如权利要求13所述的方法,其中所述原核宿主细胞为GI698，ER2566，BL21(DE3)，XA90，B834(DE3)或BLR(DE3)，优选BL21(DE3)。

15.如权利要求9所述的HPV58L1五聚体蛋白质的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤：

用亲和层析方法吸附融合蛋白Tag-HPV58L1；

加入蛋白质水解酶切除Tag标签，得HPV58L1五聚体蛋白质；

纯化HPVL1五聚体蛋白质、得纯度>98%,平均粒径10～15nmPdI<0.1的L1五聚体蛋白质。

16.如权利要求15所述的HPV58L1五聚体蛋白质的制备方法,其特征在于所述蛋白质水解酶为切除Tag标签的位点专一的蛋白酶：重组3C蛋白酶，凝血酶，SUMO蛋白酶，SENP1或TEV蛋白酶。

17.如权利要求10所述的HPV58L1VLP的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

将平均粒径10～15nmPdI<0.1的L1五聚体蛋白质液与组装缓冲液混合,最终获得pH值为5.0～5.9，盐浓度为500～2000mM，平均粒径45～65nmPdI<0.1的HPV58L1VLP蛋白质液。

18.一种低温冷冻处理组装如权利要求10所述的HPV58L1-VLP的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

将平均粒径10～15nmPdI<0.1的L1五聚体蛋白质液置于pH值为5.5～8.0盐浓度为150～1000mM条件下缓冲液,在-20～-80℃条件下完全冷冻，再放置室温至蛋白质原液融解，获得平均粒径45～65nmPdI<0.1的HPV58L1VLP蛋白质液。

19.如权利要求9所述的HPV58L1五聚体蛋白质在制备预防HPV58感染的药物中的应用。

20.如权利要求10所述的HPV58L1VLP蛋白质在制备预防HPV58感染的药物中的应用。

21.如权利要求11或12所述的疫苗组合物在制备预防HPV58感染的药物中的应用。

22.一种按重量比1：1：1的HPV16、HPV18和HPV58三价的五聚体或VLP蛋白制成的疫苗组合物在制备预防HPV16/18/58感染的药物中的应用。