CN107188931A - 截短型人乳头瘤病毒58型l1蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白及其应用。具体地,本发明涉及截短型HPV58 L1蛋白,其编码核苷酸,包含所述核苷酸的载体、重组Bacmid、重组杆状病毒,包含所述重组杆状病毒的昆虫细胞,由所述HPV58L1蛋白组成的病毒样颗粒,含该病毒样颗粒和疫苗佐剂的疫苗,以及其在预防HPV感染和HPV感染相关疾病中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及新型截短型人乳头瘤病毒(HPV)58型L1蛋白、含有该蛋白的病毒样颗粒和疫苗,以及其在预防HPV感染及感染相关病变中的用途。
背景技术
目前已分离鉴定了200多型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV),分为嗜黏膜组和嗜皮肤组。黏膜组的HPV主要感染泌尿生殖道、肛门肛周及口咽部的黏膜及周围皮肤,诱发各种良恶性病变。根据诱发病变的性质不同,可分为诱发恶性肿瘤的高危型(包括HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等)、可疑高危型(HPV26,30,53,66,67,69,70,73,82,85等)、尚未确定型(HPV34,42,43,54,71,81,83,97,102,114等),及诱发疣状增生等良性病变的低危型(HPV6,7,11,13,32,40,42,44,61,62,72,74,81,83,84,86,87,89,90,91,106等)。嗜皮肤组主要感染上述部位之外的皮肤组织,诱发皮肤疣状增生,并与某些皮肤癌的发生密切相关。
高危型HPV感染相关的恶性肿瘤目前已确定的有:宫颈癌、阴道癌、阴唇癌、阴茎癌、肛门肛周癌、口咽癌、扁桃体癌、口腔癌,其中以宫颈癌的危害最大。宫颈癌是世界范围第三高发的妇女恶性肿瘤,年发病率约52.7万,其中亚洲地区28.5万;中国的年发病数7.5万。
研究发现病毒的主要外壳蛋白L1体外表达后可组装成L1病毒样颗粒(VLP),L1VLP的结构及形态与病毒颗粒的天然结构类似,具有很强的免疫原性。目前国外上市的三种HPV预防性疫苗均为HPV L1VLP疫苗,包括葛兰素史克的HPV16/18双价疫苗、默沙东的HPV16/18/6/11四价疫苗及HPV16/18/58/52/31/33/45/6/11九价疫苗,人群免疫后,免疫活性好、预防感染及感染相关疾病的保护效率高。在世界范围内,HPV58在宫颈癌中的检出率为3.3%,但不同地区的HPV型别分布存在差异。在中国,HPV58在宫颈癌标本中的检出率达7.1%,仅次于HPV16和18型;且在癌前病变标本中的检出率达13%以上,仅次于HPV 16型。因此深入研究HPV58 L1 VLP疫苗具有意义。
目前多种不同的表达体系,包括昆虫细胞表达体系、酵母表达体系、大肠杆菌表达体系等,均可用于HPV58 L1VLP的表达生产。研究发现HPV58 L1全长蛋白(专利CN101857870B)、N端截短的突变体(专利CN102336822B)、C端截短的突变体(专利CN104418942A)、及联合N端截短5个氨基酸及C端截短23个氨基酸的GST融合突变体蛋白(专利CN105039358A),采用特定的技术均可以组装成HPV58 L1VLP(全长HPV58L1蛋白序列为NCBI数据库CAX48979.1序列,N端截短从N端第一个氨基酸M开始)。但C端截短32或33个氨基酸的HPV58 L1蛋白组装的VLP结构松散(李文生等,华中科技大学学报,24(6):537-539,2004;刘景会等,中国生物制品学杂志,28(3):233-238)。在HPV16 L1的研究中发现,HPV16L1蛋白中即使出现1个或几个氨基酸的差异,均可影响其表达水平(Touze A,Mehdaoui SE,et al.J.Clin.Micr.1998;36(7):2046-2051),且N端或C端截短不同长度的L1突变体表达水平有差异(CN104418942A,CN101293918B)。此外,在HPV58 L1的研究中也发现,C端截短7个或19个氨基酸可提高L1蛋白的表达水平(CN104418942A);不同的N端截短突变体之间表达水平亦存在差异(CN102336822B),且截短蛋白的表达水平是难以预测的。目前有关N端截短2、3、4、7、8、10、11、12或13个氨基酸的突变体是否能形成VLP,以及N端截短2-13个氨基酸联合C端截短24-29个氨基酸的HPV58 L1突变体是否能形成VLP,尚未见有报道,上述方法获得的截短型突变体的表达量的分析也不明确。由于本发明采用的N端和/或C端截短策略与目前已报道的截短方式差异大,相应的截短型HPV58 L1突变体蛋白表达水平如何及是否能组装成VLP亦是无法预测的,需依靠具体的实验研究才能确定。因此,本发明涉及多种HPV58L1突变体在HPV58 L1VLP疫苗研究中具有探索价值。
发明内容
本发明的目的是获得一种新的截短型HPV58 L1蛋白、由其组成的病毒样颗粒及含该病毒样颗粒的疫苗,并研究该疫苗在预防HPV感染和感染相关疾病中的用途。
本发明人经研究出人意料地发现,适当地对HPV58 L1蛋白的N端和/或C端进行截短,可有效提高HPV58 L1蛋白在昆虫细胞表达系统中的表达量,该截短蛋白可组装成VLP,并可诱发针对HPV 58的保护性免疫反应。本发明基于以上发现,现已完成,在本文实施例中提供数据。
因此,本发明第一方面涉及一种与野生型HPV58 L1蛋白(例如起始ATG同NCBI数据库CAX48979.1序列)相比N端截短了2、3、4、7、8、10、11、12或13个氨基酸,C端保留完整读码框编码的氨基酸或截短了24-29个氨基酸的HPV58L1蛋白。
具体地,本发明涉及一种截短型HPV58 L1蛋白,其中所述截短型HPV58 L1蛋白与野生型HPV58 L1蛋白相比,N端截短了2、3、4、7、8、10、11、12或13个氨基酸和/或C端截短了24、25、26、27、28或29个氨基酸。
根据本发明所述的截短型HPV58 L1蛋白,其中所述截短型HPV58 L1蛋白选自HPV58 L1ΔN2、HPV58 L1ΔN3、HPV58 L1ΔN4、HPV58 L1ΔN7、HPV58 L1ΔN8、HPV58 L1ΔN10、HPV58 L1ΔN11、HPV58 L1ΔN12、HPV58 L1ΔN13、HPV58 L1ΔN2C25、HPV58 L1ΔN3C25、HPV58 L1ΔN4C25、HPV58 L1ΔN7C25、HPV58 L1ΔN8C25、HPV58 L1ΔN10C25、HPV58L1ΔN11C25、HPV58 L1ΔN12C25、HPV58 L1ΔN13C25、HPV58 L1ΔN2C26、HPV58 L1ΔN3C26、HPV58L1ΔN4C26、HPV58 L1ΔN7C26、HPV58 L1ΔN8C26、HPV58 L1ΔN10C26、HPV58L1ΔN11C26、HPV58 L1ΔN12C26和HPV58 L1ΔN13C26。
优选地,本发明所述截短型HPV58 L1蛋白在NCBI数据库CAX48979.1序列基础上进行截短;特别优选地,所述截短型HPV58 L1蛋白选自HPV58 L1ΔN4C25(SEQ ID No.1)及HPV58 L1ΔN8C26(SEQ ID No.2)。
野生型HPV58 L1蛋白也可选自但不 限于NCBI数据库ADK78678.1、ADK78686.1、AGQ21863.1、ADK78679.1、ADK78323.1、ADK78683.1等来自HPV58变异株的L1蛋白,相应变异株的截短型L1蛋白为在上述截短型HPV58 L1蛋白等同位置截短,如通过序列比较来评价。
本发明第二方面涉及编码本发明所述截短型HPV58 L1蛋白的多核苷酸。
本发明第三方面涉及含有上述第二方面所述多核苷酸的载体,所述载体选自重组Bacmid和重组杆状病毒。
本发明第四方面涉及包含上述载体的昆虫细胞。
本发明第五方面涉及一种HPV58 L1病毒样颗粒,该病毒样颗粒含有上述第一方面所述的HPV58 L1蛋白,或由上述第一方面所述的HPV58 L1蛋白组成。
本发明第六方面涉及一种预防HPV感染或HPV感染相关病变的疫苗,该疫苗含有第五方面所述的HPV58 L1病毒样颗粒,其中HPV58 L1病毒样颗粒的含量为能诱发保护性免疫反应的有效量。优选地,该疫苗还可包含至少1种选自其他嗜黏膜组和/或嗜皮肤组的HPV的病毒样颗粒,这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。上述疫苗通常还包含疫苗用赋形剂或载体。
优选地,所述疫苗含有第五方面所述的HPV58 L1病毒样颗粒以及至少1种选自HPV2、5、6、7、11、16、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、39、40、43、44、45、51、52、53、56、57、59、61、66、67、68、69、70、73、74、77、81、82、83、85、91的L1病毒样颗粒,这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
进一步优选地,所述疫苗含有第五方面所述的HPV58 L1病毒样颗粒以及HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、59、68及73的L1病毒样颗粒,这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
进一步优选地,所述疫苗含有第五方面所述的HPV58 L1病毒样颗粒以及HPV16、18、31、33、35、39、45及52的L1病毒样颗粒,这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
进一步优选地,所述疫苗含有第五方面所述的HPV58L1病毒样颗粒以及HPV16、18、及52的L1病毒样颗粒,这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
进一步优选地,所述疫苗含有第五方面所述的HPV58 L1病毒样颗粒以及HPV16及18的L1病毒样颗粒,这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
特别优选地,所述疫苗含有第五方面所述的HPV58 L1病毒样颗粒以及HPV16的L1病毒样颗粒,这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
本发明第七方面涉及一种包含第六方面所述疫苗及佐剂的可进一步提高免疫反应的新型疫苗。优选地,所使用的佐剂为包含铝佐剂、水包油乳剂或油包水乳剂及TLR刺激剂的佐剂组合物。
进一步优选地,所使用的佐剂为包含氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
进一步优选地,所使用的佐剂为包含MF59佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
特别地,本发明涉及的复合佐剂为实施方案中所述的聚肌苷酸-聚胞苷酸及稳定剂(PIKA)联合氢氧化铝佐剂组成的复合物,或聚肌苷酸-聚胞苷酸及稳定剂(PIKA)联合MF59佐剂组成的复合物,两种复合佐剂与HPV VLP疫苗联合使用均可有效提高疫苗的免疫活性。
本发明第八方面涉及第七方面所述的疫苗在预防HPV感染或HPV感染相关疾病中的用途。
相关术语的说明及解释
根据本发明,术语“昆虫细胞表达系统”包括昆虫细胞、重组杆状病毒、重组Bacmid及表达载体。其中昆虫细胞来源于市场上可得到的细胞,在此举例但不限于:Sf9,Sf21,High Five。
根据本发明,术语“野生型HPV58 L1蛋白”的例子包括但不限于NCBI数据库中编号为CAX48979.1的蛋白等长的全长L1蛋白。
“截短型HPV58 L1蛋白”或“截短型人乳头瘤病毒58 L1蛋白”的基因片段指的是其与野生型HPV58 L1蛋白基因相比,在其5’端和/或3’端缺失编码1个或多个氨基酸的核苷酸,其中“野生型HPV58 L1蛋白”的全长序列例如但不限于NCBI数据库中的如下序列:ADK78678.1、ADK78686.1、AGQ21863.1等。
根据本发明,表述“ΔNX”代表“N端截短X个氨基酸的蛋白质”,是指以起始甲硫氨酸为第1位氨基酸来计数,从N末端截去X个氨基酸之后,在剩余序列的N端再补加一个甲硫氨酸作为起始位点的蛋白质。例如“HPV58 L1ΔN4”代表N端截短了4个氨基酸的HPV58 L1蛋白,即删除从起始甲硫氨酸开始的4个氨基酸之后,在剩余序列的N端再补加一个甲硫氨酸所获得的蛋白质。
根据本发明,表述“ΔCY”代表“C端截短Y个氨基酸的蛋白质”,是指从HPV58 L1第498位氨基酸开始计数,截短Y个氨基酸的蛋白质。例如“HPV58 L1ΔC1”代表C端截短第498位1个氨基酸所获得的蛋白质。
根据本发明,表述“ΔNXCY”代表“N端截短X个氨基酸同时C端截短Y个氨基酸的蛋白质”,是指以起始甲硫氨酸为第1位氨基酸来计数,从N末端截去X个氨基酸之后,在剩余序列的N端再补加一个甲硫氨酸作为起始位点,同时从HPV58 L1第498位氨基酸开始计数,截短Y个氨基酸的蛋白质。例如“HPV58L1ΔN4C25”代表N端截短了4个氨基酸同时C端截短25个氨基酸的HPV58 L1蛋白,即删除从起始甲硫氨酸开始的4个氨基酸之后,在剩余序列的N端再补加一个甲硫氨酸,并且同时删除C端第474-498位共计25个氨基酸的蛋白质。
根据本发明,术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自一种或多种,包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,离子强度增强剂。例如,pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液,表面活性剂包括阳离子、阴离子或非离子型表面活性剂,举例但不限于:Tween 80,离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
根据本发明,术语“人用佐剂”是指在临床上可应用于人体的佐剂,包括当前已获得批准的和将来可能获得批准的各种佐剂,例如但不限于铝佐剂、MF59及各种形式的佐剂组合物。
根据本发明,术语“乳剂”是指由水相成分、油相成分及乳化剂按适当比例混合,经乳化后形成的非均相液体分散体系。其中水相成分包括但不限于磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等缓冲系统;油相成分为可代谢脂类,包括但不限于植物油、鱼油、动物油、合成油及其他脂类成分(例如但不限于角鲨烯、生育酚);乳化剂为适宜的表面活性剂,例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(Span-85)、聚山梨酯80(Tween-80)。
根据本发明,术语“稳定剂”是指可与佐剂中的聚肌苷酸-聚胞苷酸结合并起到稳定作用的成分,包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、庆大霉素)、无机盐(例如但不限于氯化钙、氯化镁、磷酸钙)、阳离子的有机复合物(例如但不限于硬脂酸钙、葡萄糖酸钙)。
根据本发明,本发明的疫苗可采用患者可接受的形式,包括但不限于口服或者注射,优选注射。
根据本发明,本发明疫苗优选单位剂型使用,其中单位剂型中截短型HPV58L1蛋白病毒样颗粒的剂量为5μg-80μg,优选20μ-40μg。
附图说明
图1A-1C显示了本发明实施例4中截短型HPV58 L1在昆虫细胞中的表达鉴定结果。结果显示,27种截短型HPV58 L1均可在昆虫细胞中高水平表达。
图1A:1至9分别代表HPV58 L1ΔN2、HPV58 L1ΔN3、HPV58 L1ΔN4、HPV58 L1ΔN7、HPV58 L1ΔN8、HPV58 L1ΔN10、HPV58 L1ΔN11、HPV58 L1ΔN12和HPV58 L1ΔN13重组蛋白;
图1B:1至9分别代表HPV58 L1ΔN2C25、HPV58 L1ΔN3C25、HPV58 L1ΔN4C25、HPV58 L1ΔN7C25、HPV58 L1ΔN8C25、HPV58 L1ΔN10C25、HPV58L1ΔN11C25、HPV58 L1ΔN12C25和HPV58 L1ΔN13C25重组蛋白;
图1C:1至9分别代表HPV58 L1ΔN2C26、HPV58 L1ΔN3C26、HPV58 L1ΔN4C26、HPV58 L1ΔN7C26、HPV58 L1ΔN8C26、HPV58 L1ΔN10C26、HPV58L1ΔN11C26、HPV58 L1ΔN12C26和HPV58 L1ΔN13C26重组蛋白。
图2A至2C显示了本发明实施例6中纯化后获得的HPV58 L1ΔN4、HPV58 L1ΔN4C25及HPV58 L1ΔN4C26突变体蛋白的动态光散射分析结果。结果显示HPV58 L1ΔN4、HPV58 L1ΔN4C25及HPV58 L1ΔN4C26重组蛋白形成的病毒样颗粒水化动力学直径分别为94.74nm,95.44nm和98.76nm,颗粒组装的百分比均为100%。
图2A代表HPV58 L1ΔN4;图2B代表HPV58 L1ΔN4C25;图2C代表HPV58L1ΔN4C26。
图3A至3I显示了本发明实施例7中纯化后获得的截短型HPV58 L1VLP的透射电镜观察结果。视野中可见大量的直径为55nm左右的病毒样颗粒,颗粒的大小与理论值相符,均一度好。Bar=200nm。
图3A至3I分别表示HPV58 L1ΔN4 VLP、HPV58 L1ΔN8 VLP、HPV58 L1ΔN10 VLP、HPV58 L1ΔN4C25 VLP、HPV58 L1ΔN8C25 VLP、HPV58 L1ΔN10C25 VLP、HPV58 L1ΔN4C26VLP、HPV58 L1ΔN8C26 VLP和HPV58 L1ΔN10C26 VLP。
图4显示了本发明实施例8中的HPV58 L1ΔN4 VLP、HPV58 L1ΔN4C25 VLP及HPV58L1ΔN4C26 VLP接种小鼠后免疫血清HPV58中和抗体滴度的分析。
图5显示了本发明实施例9中的HPV58 L1ΔN4C25 VLP蛋白联合含PIKA的复合佐剂接种小鼠后免疫血清中和抗体滴度的分析,**:与无佐剂组相比,P<0.01;***:与无佐剂组相比,P<0.001;#:与单纯PIKA组相比,P<0.05;##:与单纯PIKA组相比,P<0.01;###:与单纯PIKA组相比,P<0.001;&&:与单纯Alum组相比,P<0.01;&&&:与单纯Alum组相比,P<0.001。
具体实施方式
下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明做出许多修改,这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围,因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案,而非作为限制,本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
除非特别说明,本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述,但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明,均为常规方法或产品说明书所描述的方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于此作为参考,以揭示并说明所述公开文献中的方法和/或材料。
实施例1:截短型HPV58 L1基因的扩增及表达载体构建
用做模版的全长HPV58 L1基因由上海生工生物工程技术服务有限公司全基因合成(SEQ ID NO:3),其对应的氨基酸序列为NCBI数据库中编号为CAX48979.1的序列。
用于构建截短型HPV58 L1基因的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,具体如下:
58N2F:5’-GAATTCGCCGCCACCATGGTCTGGAGACCCTCCGAAGC-3’;
58N3F:5’-GAATTCGCCGCCACCATGTGGAGACCCTCCGAAGCAACC-3’;
58N4F:5’-GAATTCGCCGCCACCATGAGACCC TCCGAAGCAACC G-3’;
58N7F:5’-GAATTCGCCGCCACCATGGAAGCAACCGTCTATCTCC-3’;
58N8F:5’-GAATTCGCCGCCACCATGGCAACCGTCTATCTCCCACC-3’;
58N10F:5’-GAATTCGCCGCCACCATGGTCTATCTCCCACCCGTCC-3’;
58N11F:5’-GAATTCGCCGCCACCATG TATCTCCCACCCGTCCCCG-3’;
58N12F:5’-GAATTCGCCGCCACCATG CTCCCACCCGTCCCCGTCAGC-3’;
58N13F:5’-GAATTCGCCGCCACCATGCCACCCGTCCCCGTCAGCAAA G-3’;
58CR:5’-TCTAGAATTATTTTTTAACCTTTTTGCGTTTG-3’;
58C25R:5’-TCTAGAATTACAAGCCGCTCTGCAGCAGG-3’;
58C26R:5’-TCTAGAATTAGCCGCTCTGCAGCAGGAACTTC-3’。
上述引物的序列表示为序列表中的SEQ ID NO:6-17。
以序列28为模版,使用58N2F/58CR为引物,PCR扩增HPV58L1ΔN2基因;使用58N3F/58CR为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN3基因;使用58N4F/58CR为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN4基因;使用58N7F/58CR为引物,PCR扩增HPV58L1ΔN7基因;使用58N8F/58CR为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN8基因;使用58N10F/58CR为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN10基因;使用58N11F/58CR为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN11基因;使用58N12F/58CR为引物,PCR扩增HPV58L1ΔN12基因;使用58N13F/58CR为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN13基因;使用58N2F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN2C25基因;使用58N3F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN3C25基因;使用58N4F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN4C25基因(SEQ ID NO:4);使用58N7F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN7C25基因;使用58N8F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58L1ΔN8C25基因;使用58N10F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN10C25基因;使用58N11F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN11C25基因;使用58N12F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58L1ΔN12C25基因;使用58N13F/58C25R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN13C25基因;使用58N2F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN2C26基因;使用58N3F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58L1ΔN3C26基因;使用58N4F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN4C26基因;使用58N7F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN7C26基因;使用58N8F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58L1ΔN8C26基因(SEQ ID NO:5);使用58N10F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN10C26基因;使用58N11F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN11C26基因;使用58N12F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN12C26基因;使用58N13F/58C26R为引物,PCR扩增HPV58 L1ΔN13C26基因。PCR扩增的方法都是公知的,例如专利CN 101293918 B。
采用EcoRI/Xba I酶切位点,分别对上述PCR扩增得到的基因进行酶切,并分别插入商业化表达载体pFastBac1(Invitrogen公司生产)中,得到包含截短型HPV58L1基因的重组表达载体:pFastBac1-58L1ΔN2、pFastBac1-58L1ΔN3、pFastBac1-58L1ΔN4、pFastBac1-58L1ΔN7、pFastBac1-58L1ΔN8、pFastBac1-58L1ΔN10、pFastBac1-58L1ΔN11、pFastBac1-58L1ΔN12、pFastBac1-58L1ΔN13、pFastBac1-58L1ΔN2C25、pFastBac1-58L1ΔN3C25、pFastBac1-58L1ΔN4C25、pFastBac1-58L1ΔN7C25、pFastBac1-58L1ΔN8C25、pFastBac1-58L1ΔN10C25、pFastBac1-58L1ΔN11C25、pFastBac1-58L1ΔN12C25、pFastBac1-58L1ΔN13C25、pFastBac1-58L1ΔN2C26、pFastBac1-58L1ΔN3C26、pFastBac1-58L1ΔN4C26、pFastBac1-58L1ΔN7C26、pFastBac1-58L1ΔN8C26、pFastBac1-58L1ΔN10C26、pFastBac1-58L1ΔN11C26、pFastBac1-58L1ΔN12C26、pFastBac1-58L1ΔN13C26。上述酶切、连接及克隆构建的方法都是公知的,例如专利CN101293918B。
实施例2:截短型HPV58 L1基因的重组Bacmid及重组杆状病毒的构建
分别使用包含截短型HPV58 L1基因的重组表达载体pFastBac1-58L1ΔN2、pFastBac1-58L1ΔN3、pFastBac1-58L1ΔN4、pFastBac1-58L1ΔN7、pFastBac1-58L1ΔN8、pFastBac1-58L1ΔN10、pFastBac1-58L1ΔN11、pFastBac1-58L1ΔN12、pFastBac1-58L1ΔN13、pFastBac1-58L1ΔN2C25、pFastBac1-58L1ΔN3C25、pFastBac1-58L1ΔN4C25、pFastBac1-58L1ΔN7C25、pFastBac1-58L1ΔN8C25、pFastBac1-58L1ΔN10C25、pFastBac1-58L1ΔN11C25、pFastBac1-58L1ΔN12C25、pFastBac1-58L1ΔN13C25、pFastBac1-58L1ΔN2C26、pFastBac1-58L1ΔN3C26、pFastBac1-58L1ΔN4C26、pFastBac1-58L1ΔN7C26、pFastBac1-58L1ΔN8C26、pFastBac1-58L1ΔN10C26、pFastBac1-58L1ΔN11C26、pFastBac1-58L1ΔN12C26、pFastBac1-58L1ΔN13C26转化大肠杆菌DH10Bac感受态,筛选获得重组Bacmid,然后用重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9,在Sf9内扩增重组杆状病毒。重组Bacmid的筛选及重组杆状病毒的扩增方法都是公知的,例如专利CN 101148661 B。
实施例3:截短型HPV58 L1基因在Sf9细胞中的表达
Sf9细胞分别接种上述27种截短型HPV58 L1基因的重组杆状病毒,进行截短型HPV58 L1蛋白的表达,27℃培养约88h后收发酵液,3000rpm离心15min,弃上清,用PBS洗涤细胞后,用于表达鉴定及纯化。感染表达的方法是公开的,例如专利CN 101148661 B。
实施例4:截短型HPV58 L1蛋白的表达鉴定
取实施例3中所述表达不同截短型HPV58L1的细胞各1×106个,重悬于200μl PBS溶液中,加入6×Loading buffer 50μl,75℃变性8min,分别取10μl进行SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。结果如图1所示,27种截短型HPV58 L1蛋白均可在昆虫细胞中高水平表达,截短型HPV58 L1蛋白大小在50-55kDa。SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定的方法是公开的,例如专利CN 101148661 B。
实施例5:截短型HPV58 L1蛋白与野生型HPV58 L1蛋白的表达量比较
取实施例3中所述表达截短型HPV58 L1蛋白及野生型HPV58L1的细胞各1×106个,重悬于200μl PBS溶液中,采用超声破碎法(宁波新芝超声破碎仪,2#探头,100W,超声5s,间隔7s,总时间3min)破碎细胞,12 000rpm高速离心10分钟。收取裂解上清,采用夹心ELISA法检测上清中的L1含量,该方法是公知的,例如专利CN104513826A。
使用本发明人制备的HPV58 L1单克隆抗体包被酶标板,80ng/孔,4℃孵育过夜;使用5%BSA-PBST室温封闭2h,再用PBST洗板3次。用PBS将裂解上清进行连续2倍稀释,并且将HPV58 L1VLP标准品也进行梯度稀释,浓度从2μg/ml-0.0625μg/ml,分别加入酶标板,每孔100μl,37℃孵育1h。用PBST洗板3次,加入1:3000稀释的HPV58 L1兔多抗,每孔100μl,37℃孵育1h。用PBST洗板3次,加入1:3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:3000稀释,中杉金桥公司),37℃孵育45分钟。用PBST洗板5次,每孔加入100μl OPD底物(Sigma公司),37℃显色5分钟,用50μl 2M硫酸终止反应,在490nm处测定吸光值。依据标准曲线计算裂解上清中截短型HPV58 L1蛋白及野生型HPV58 L1蛋白的浓度。
结果如表1所示,本发明的截短型HPV58 L1蛋白的表达量均高于野生型HPV58 L1蛋白,且高于专利CN104418942A中的C端截短突变体HPV58 L1-491(HPV58 L1ΔC7)及HPV58L1-479(HPV58 L1ΔC19)。
表1 HPV58L1蛋白表达量分析
实施例6:截短型HPV58 L1蛋白的纯化及动态光散射粒径分析
取截短型HPV58 L1的细胞发酵液50ml,使用10ml PBS重悬细胞,加PMSF至终浓度1mg/ml,超声破碎(宁波新芝超声破碎仪,6#探头,100W,超声5s,间隔7s,总时间5min),取破碎上清进行纯化,纯化步骤在室温进行。在裂解液中加入4%β-巯基乙醇(w/w)对VLP进行解聚,然后使用0.22μm滤器过滤样品,依次使用DMAE阴离子交换层析(20mM Tris,180mMNaCl,4%β-ME,pH 7.9洗脱)、TMAE阴离子交换层析(20mM Tris,180mM NaCl,4%β-ME,pH7.9洗脱)及羟基磷灰石层析(100mM NaH2PO4,30mM NaCl,4%β-ME,pH 6.0洗脱)纯化。纯化产物采用Planova超滤系统进行浓缩,并更换缓冲液(20mM NaH2PO4,500mM NaCl,pH 6.0)促使VLP组装。以上纯化方法均是公开的,例如专利CN101293918B、CN1976718A等。
取纯化后的截短型HPV58 L1蛋白溶液进行DLS粒径分析(Zetasizer Nano ZS90动态光散射仪,Malvern公司),结果如表2所示,其中HPV58 L1ΔN4、HPV58L1ΔN4C25及HPV58L1ΔN4C26的DLS分析图如图2所示。
表2截短型HPV58 L1蛋白DLS分析
蛋白名称 | 水力学直径(nm) | PDI |
HPV58 L1ΔN2 | 95.02 | 0.233 |
HPV58 L1ΔN3 | 94.98 | 0.265 |
HPV58 L1ΔN4 | 94.74 | 0.251 |
HPV58 L1ΔN7 | 94.68 | 0.212 |
HPV58 L1ΔN8 | 94.88 | 0.207 |
HPV58 L1ΔN10 | 95.08 | 0.263 |
HPV58 L1ΔN11 | 95.12 | 0.276 |
HPV58 L1ΔN12 | 94.76 | 0.238 |
HPV58 L1ΔN13 | 94.58 | 0.255 |
HPV58 L1ΔN2C25 | 96.06 | 0.222 |
HPV58 L1ΔN3C25 | 95.38 | 0.252 |
HPV58 L1ΔN4C25 | 95.44 | 0.277 |
HPV58 L1ΔN7C25 | 95.88 | 0.226 |
HPV58 L1ΔN8C25 | 95.34 | 0.270 |
HPV58 L1ΔN10C25 | 95.80 | 0.278 |
HPV58 L1ΔN11C25 | 95.22 | 0.224 |
HPV58 L1ΔN12C25 | 96.48 | 0.216 |
HPV58 L1ΔN13C25 | 97.26 | 0.236 |
HPV58 L1ΔN2C26 | 97.44 | 0.208 |
HPV58 L1ΔN3C26 | 97.92 | 0.202 |
HPV58 L1ΔN4C26 | 98.76 | 0.188 |
HPV58 L1ΔN7C26 | 98.33 | 0.198 |
HPV58 L1ΔN8C26 | 97.28 | 0.225 |
HPV58 L1ΔN10C26 | 96.36 | 0.261 |
HPV58 L1ΔN11C26 | 98.02 | 0.218 |
HPV58 L1ΔN12C26 | 97.18 | 0.258 |
HPV58 L1ΔN13C26 | 96.56 | 0.196 |
实施例7:截短型HPV58 L1VLP的透射电镜观察
按实施例6所述的层析纯化方法,对截短型HPV58 L1VLP分别进行纯化,使用透析后的VLP制备铜网,并用1%醋酸铀进行染色,充分干燥后使用JEM-1400电镜(奥林巴斯)进行观察。不同截短型HPV58 L1 VLP的平均直径如表3所示,其中HPV58 L1ΔN4 VLP、HPV58L1ΔN8 VLP、HPV58 L1ΔN10 VLP、HPV58 L1ΔN4C25 VLP、HPV58 L1ΔN8C25 VLP、HPV58 L1ΔN10C25 VLP、HPV58 L1ΔN4C26 VLP、HPV58 L1ΔN8C26 VLP、及HPV58 L1ΔN10C26 VLP的电镜图如图3所示,其余截短型HPV58 L1 VLP电镜图也与图3类似,所有截短型HPV58L1VLP均与野生型无差异,且大小均匀,形状规则。铜网制备及电镜观察的方法均是公开的,例如专利CN 101148661 B。
实施例8:HPV58 L1ΔN4 VLP、HPV58 L1ΔN4C25 VLP及HPV58 L1ΔN4C26 VLP的小鼠免疫及中和抗体滴度测定
取4-6周龄的BALB/c小鼠,随机分组,每组4只,分别用PBS、截短型HPV58L1 VLP及HPV58 L1wt VLP免疫小鼠。肌肉注射,L1VLP的免疫剂量为0.1μg,于第0,2周免疫,共2次。第2次免疫后2周尾静脉采血,分离血清。
使用HPV58假病毒对免疫血清的HPV58中和抗体滴度进行检测,结果如图4所示,HPV58 L1ΔN4 VLP(58L1ΔN4)、HPV58 L1ΔN4C25 VLP(58L1ΔN4C25)、HPV58 L1ΔN4C26VLP(58L1ΔN4C26)及HPV58 L1wt VLP(58L1wt)免疫小鼠后均可有效诱发中和抗体,且中和抗体滴度无统计学差异。本发明所述其他截短型HPV58 L1VLP诱发的中和抗体滴度也与HPV58 L1wt VLP无差异。假病毒制备及假病毒中和实验的方法均是公开的,例如专利CN104418942A。
实施例9:HPV58L1ΔN4C25 VLP联合佐剂免疫小鼠及中和抗体滴度测定
取4-6周龄的BALB/c小鼠,随机分组,每组4只,分别用HPV58L1ΔN4C25VLP联合聚肌苷酸-聚胞苷酸注射液(PIKA,南国药业)及氢氧化铝佐剂或MF59佐剂(4.3%角鲨烯,0.5%Tween-80,0.5%Span-85)免疫小鼠,具体分组及免疫剂量如表3所示。皮下注射,于第0,2周免疫,共2次。第2次免疫后2周尾静脉采血,分离血清。
表3佐剂实验小鼠分组及剂量
使用HPV58假病毒对免疫血清的HPV58中和抗体滴度进行检测,结果如图5所示,单独使用氢氧化铝佐剂或聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂(PIKA佐剂)对HPV58L1VLP诱发的中和抗体水平无明显增强效果,但使用氢氧化铝或MF59联合PIKA佐剂可显著提高VLP诱发的中和抗体水平,且与单独使用氢氧化铝或PIKA佐剂相比,中和抗体水平亦有明显提高。表明Alum/PIKA复合佐剂或MF59/PIKA复合佐剂可显著提高疫苗的免疫活性,具有应用前景(使用SPSS软件,One-way ANOVA分析)。
Claims (10)
1.一种截短型HPV58L1蛋白,其中所述截短型HPV58L1蛋白与野生型HPV58L1蛋白相比,N端截短了2、3、4、7、8、10、11、12或13个氨基酸和/或C端截短了24、25、26、27、28或29个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的截短型HPV58L1蛋白,其中所述截短型HPV58L1蛋白在NCBI数据库CAX48979.1序列基础上进行截短;优选地,所述截短型HPV58L1蛋白选自HPV58L1ΔN2、HPV58L1ΔN3、HPV58L1ΔN4、HPV58L1ΔN7、HPV58L1ΔN8、HPV58L1ΔN10、HPV58L1ΔN11、HPV58L1ΔN12、HPV58L1ΔN13、HPV58L1ΔN2C25、HPV58L1ΔN3C25、HPV58L1ΔN4C25、HPV58L1ΔN7C25、HPV58L1ΔN8C25、HPV58L1ΔN10C25、HPV58L1ΔN11C25、HPV58L1ΔN12C25、HPV58L1ΔN13C25、HPV58L1ΔN2C26、HPV58L1ΔN3C26、HPV58L1ΔN4C26、HPV58L1ΔN7C26、HPV58L1ΔN8C26、HPV58L1ΔN10C26、HPV58L1ΔN11C26、HPV58L1ΔN12C26和HPV58L1ΔN13C26。
3.一种多核苷酸,其编码如权利要求1或2所述的截短型HPV58L1蛋白。
4.一种载体,其包含如权利要求3所述的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的载体,其中所述载体选自重组Bacmid和重组杆状病毒。
6.一种昆虫细胞,其包含如权利要求4或5所述的载体。
7.一种HPV58L1病毒样颗粒,其中所述HPV58L1病毒样颗粒含有如权利要求1或2所述的蛋白,或由如权利要求1或2所述的蛋白组成。
8.一种疫苗,其用于预防HPV感染或HPV感染相关疾病,其中所述疫苗包含如权利要求7所述的HPV58L1病毒样颗粒和疫苗用赋形剂、佐剂或载体;优选地,所述疫苗还包含至少一种选自其他嗜黏膜组及嗜皮肤组的HPV的病毒样颗粒;更优选地,所述疫苗还包含选自HPV2、5、6、7、11、16、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、39、40、43、44、45、51、52、53、56、57、59、61、66、67、68、69、70、73、74、77、81、82、83、85、91的L1病毒样颗粒。
9.根据权利要求8所述的疫苗,其中所述佐剂为铝佐剂、水包油乳剂或油包水乳剂和TLR刺激剂的佐剂组合物;优选地,所述佐剂为氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂和聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物;更优选地,所述佐剂为MF59佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
10.根据权利要求1或2所述的截短型HPV58L1蛋白、根据权利要求7所述的HPV58L1病毒样颗粒、或根据权利要求8或9所述的疫苗在制备预防HPV感染及HPV感染相关疾病的药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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