KR20080018176A

KR20080018176A - 다가 바이러스 유사 입자 생산 방법

Info

Publication number: KR20080018176A
Application number: KR1020077028015A
Authority: KR
Inventors: 라다 라소코바; 필립 푸옥 다오; 제임 펠프스
Original assignee: 다우 글로벌 테크놀로지스 인크.
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2008-02-27
Also published as: BRPI0611336A2; AU2006309286A1; EP1885394A2; CA2608515A1; WO2007053188A3; US20070041999A1; WO2007053188A2; EP1885394A4; JP2009501001A; CN101287489A

Abstract

본 발명은 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 생산하는 것, 및 바이러스 유사 입자 내로 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 시험관내 조립하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다가 바이러스 유사 입자를 생산하기 위하여 시험관 내에서 배합된 상이한 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 분리형의 캡시드 융합 펩티드 군집을 사용하는, 신속하고, 대량 생산이 가능하며, 비용면에서 효율적인, 다가 바이러스 유사 입자 생산 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 생산된 바이러스 유사 입자는 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하기 위하여 사용될 수 있다.

재조합 바이러스 캡시드 단백질, 바이러스 유사 입자, 항원성 펩티드 삽입체

Description

다가 바이러스 유사 입자 생산 방법{PRODUCTION OF MULTIVALENT VIRUS LIKE PARTICLES}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2005년 6월 1일 출원된 미국 가출원 제60/686,541호를 우선권으로 주장한다.

정부의 관심 상태

본 출원은 협력 협약 번호 제1-U01-AI054641-01호(Cooperative Agreement No. 1-U01-AI054641-01)로 미국 국립 알레르기 및 전염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Disease; NIAID)와 미국 정부의 계약하에 있다.

기술 분야

본 발명은 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 생산하는 것, 및 바이러스 유사 입자 내로 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 시험관내 조립하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다가 바이러스 유사 입자를 생산하기 위하여 시험관 내에서 배합 된 상이한 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 분리형의 캡시드 융합 펩티드 군집을 사용하는, 신속하고, 대량 생산이 가능하며, 비용면에서 효율적인, 다가 바이러스 유사 입자 생산 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 생산된 바이러스 유사 입자는 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하기 위하여 사용될 수 있다.

백신화는 병원체에 의한 감염으로부터 동물 및 인간을 보호하는 가장 효과적이고 효율적인 방법들중 하나이다. 최근, 1개 초과의 병원체에 대한 에피토프를 함유하는 백신 접종을 사용하는 것이 연구되었다. 그러한 전략법을 지지하는 이론적 해석으로는 면역을 유도하는데 필요한 접종 횟수의 감소를 포함하는데, 이는 의사의 왕진 횟수를 감소시킬 수 있고, 권고되는 백신 프로토콜과의 순응성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 미국에서의 디프테리아, 파상풍, 백일해, 소아마비, 및 B형 간염에 대한 제1 5가 백신은 페디아릭스(Pediarix)라는 상업명 하에 글락소 스미스클라인(GlaxoSmithKline)에 의해 개발되었다. 사용중이거나 개발중에 있는 다른 다가 백신으로는, B형 및 Hib형 간염 백신을 원 샷으로 배합시킨, 머크(Merck)에 의해 생산된 콤박스(Comvax); Hib 및 DTaP를 배합시킨, 아벤티스(Aventis)에 의해 생산된 TriHIBit; 및 A형 및 B형 간염 백신을 원 샷으로 배합시키고, 일련의 3회 투여량으로 제공되는, 글락소 스미스클라인에 의해 생산된 트윈릭스(Twinrix)를 포함한다. 개발중에 있는 다른 배합 백신으로는 MMR 및 배리박스(Varivax); DTaP 및 IPV; DTaP 및 B형 간염; DTaP, IPV, 및 Hib (펜타바크(Pentavac)); DTaP, B형 간염, 및 Hib; DTaP, IPV, Hib 및 B형 간염 (헥사바크(Hexavac)); 및 DTaP, Hib, IPV, A형 간염, 및 B형 간염을 배합시킨 단일 접종물을 포함한다.

바이러스 유사 입자

백신 제제로서 바이러스 유사 입자 (VLPs)가 연구되어 왔다. 일반적으로, 캡시드로 둘러싸인 바이러스는 바이러스 핵산을 함유하도록 조립된 단백질 코트 또는 "캡시드"를 포함한다. 많은 바이러스들은 개별적으로 발현된 캡시드 단백질로부터 "자가-조립"되어 VLPs를 형성할 수 있는 캡시드를 갖는데, 캡시드는 세포 내부에서 발현되어 VLP를 형성시키기도 하고 ("생체내 조립"), 세포 외부에서 발현되어 단리 및 정제되기도 한다 ("시험관내 조립").

바이러스 유사 입자는 감염성 물질을 함유할 필요없이 바이러스 입자의 전체 구조를 모사한다. VLPs에는 바이러스 DNA 또는 RNA 게놈이 존재하지 않지만, 진정한 바이러스의 3차원 구조를 보유한다. VLPs는 B-세포 매개 반응, CD4 증식성 반응 및 세포독성 T 림프구 반응을 자극시키는 능력을 갖고 있다. (문헌 [Schirmbeck et al (1996) Virus like particles induce MHC class I- restricted T- cell responses. Lessons learned from the hepatitis B small surface antigen. Intervirology 39, 111-119]; [Paliard et al (2000) Priming of strong, broad, and long lived HIV type I p55 gag-specific CD8+ cytotoxic T cells after administration of a virus like particle vaccine in rhesus macaques. AIDS Res. Hum. Retroviruses 16, 273-282]; [Murata et al. (2000) Immunization with hepatitis C virus like particles protects mice from recombinant hepatitis C virus-vaccinia infection. PNAS USA 100, 6753-6758])을 참조한다.

VLPs는 인간과, 노르워크, B형 및 C형 간염 바이러스, 유두종 바이러스, 파보바이러스, 및 인플루엔자 A를 비롯한 다른 동물들을 감염시키는 30개 초과의 상이한 바이러스들에 대하여 생산되었고, 현재는 인간에서 VLPs를 사용하는 임상적 시험이 다수 진행되고 있다. (문헌 [Koutsky et al. (2002) "A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine," NEJM 347:1645-1651]; [Pinto et al. (2003) "Cellular immune responses to human papillomavirus (HPV)-16 Ll in healthy volunteers immunized with recombinant HPV-16 L1 virus like particles," J. Infect. Dis 188:327-338]; [Tacket et al. (2003) "Humoral, mucosal, and cellular immune responses to oral Norwalk virus like particles in volunteers," Clin . Immunol. 108:241-247])을 참조한다.

바이러스 유사 입자는 또한 다른 병원체로부터의 에피토프를 전달하기 위한 운반체 분자로서의 역할을 하도록 조작될 수 있다. (문헌 [Noad et al. (2003) "Virus like particles as imniunogens," Trends in Microbiology 11(9), 438-444]; [Sadeyen et al. (2003) "Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of human papillomavirus type 16 virus like particles reduces their capacity to induce neutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope," Virology 309:32-40]; WO 2005/005614; 미국 특허 공개번호 제 2004/0033585호 및 제2005/0048082호; 미국 특허번호 제6,448,070호; 제6,110,466; 6,171,591호; [Brinkman et. al. (2004) "Recombinant murine polyoma virus-like-particles induce protective anti-tumour immunity," Lett. Drug Des . & Disc. 1:137-147])를 참조한다. 캡시드 단백질은 항원성 펩티드를 함유하도록 변형됨으로써 재조합 바이러스 캡시드 단백질-항원성 펩티드 융합체를 생성할 수 있다. 이어서, 이러한 융합 캡시드 단백질-항원성 펩티드 산물은 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 생체내 또는 시험관 내에서 조립되어 재조합 바이러스 또는 바이러스-양 입자를 형성할 수 있고, 면역 반응을 비정상화(illicit)시키기 위하여 숙주에 투여될 수 있다.

VLPs 생산

이상적인 다가 VLP 생산 방법을 통해, 상이한 병원체로부터의 다중 항원성 펩티드 삽입체는 함유하지만, 즉석의 감염성 바이러스 핵산은 함유하지 않는 균질의 VLPs 군집을 신속적이고 탄력적이며 조절 가능하게 조립할 수 있다. 다가 VLPs를 작제하는 현재의 방법들은 i) 생체 내에서 VLPs를 생성하는 것은 비탄력적이고 조절이 되지 않기 때문에 캡시드 단백질 삽입능에 있어서 본래 제한되는 바, 항원 삽입체의 잠재적인 배합의 수는 감소되거나, ii) 상이한 삽입체를 함유하는, 사전에 조립된 VLPs 군집의 단순한 시험관내 혼합에 기인하여 비균질의 VLP 군집이 생산된다는 난점을 갖고 있다.

발명의 요약

본 발명은 재조합 바이러스 캡시드 단백질을 사용하여 항원성 펩티드 삽입체는 함유하되, 전장의 감염성 바이러스 핵산 게놈은 함유하지 않는 바이러스 유사 입자 (VLP)를 시험관 내에서 대량으로 조립하는 방법을 제공한다. 본 발명은 항원성 삽입체를 함유하는 바이러스 캡시드 단백질을 전장의 감염성 바이러스 핵산 게놈이 존재하지 않는 VLPs 내로 조립하는 것을 포함한다. 구체적으로, 본 방법은 시험관 내에서 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 제1 바이러스 캡시드 단백질을 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 단백질과 혼합하되, 여기에서, 제2 캡시드 융합 펩티드의 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체는 제1 캡시드 융합 펩티드의 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체와는 상이한 항원성 펩티드 서열, 또는 상이한 병원체로부터 유래된 것이고, 시험관 내의 적절한 조건하에서 캡시드 단백질을 조립하여 바이러스 유사 입자를 형성하는 것을 포함한다. 조립된 바이러스 유사 입자는 적어도 2개의 상이한 항원성 서열을 포함함으로써, 다가 바이러스 유사 입자를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상이한 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 재조합 캡시드 융합 펩티드의 혼합물을 조절함으로써 조립된 바이러스 유사 입자에서 원하는 항원성 펩티드를 특정 비율로 수득할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 따라 조립된 VLP는 전장의 감염성 바이러스 핵산을 함유하지 않는다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 따라 조립된 VLP는 바이러스 핵산을 함유하지 않는다. 현 방법을 통해 다중 항원성 펩티드의 배합물을 함유하는 바이러스 유사 입자를 탄력적으로 생산할 수 있다. 이러한 다가 VLPs는 동물에서 면역 반응을 금제시키는 백신 전략법을 비롯하여 임의의 다수의 적용에 사용될 수 있다.

현 방법은 감염성 바이러스 핵산을 필요로 하지 않는 단일의 다가 VLPs 군집을 조립하기 위하여 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 재조합 캡시드 융합 펩티드 혼합물을 사용한다. VLP는 상이한 항원성 펩티드를 함유하는 캡시드 단백질을 사용하여 시험관 내에서 조립되기 때문에 VLP에 함유되어 있는 항원들을 원하는 비율로 조절할 수 있다. 이러한 기법을 사용하여 상이한 항원성 펩티드를 함유하는 캡시드 단백질을 다양한 배합 및 비율로 혼합할 수 있고, 신속하게 조립함으로써 다가 VLPs를 생산할 수 있다. 그러한 전략법을 통해 바람직한 항원 구성을 반영하도록 VLP 함량을 신속하게 적합화시킬 수 있다.

현 발명은 임의의 공급원으로부터 유래된 재조합 캡시드 융합 단백질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 삽입체를 함유하는 재조합 캡시드 단백질은 사전에 조립된 바이러스 유사 입자로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 그러한 바이러스 유사 입자는 생체 내에서, 또는 시험관 내에서 조립될 수 있다. 별법으로, VLPs 내로 사전에 조립된 바 없는 재조합 캡시드 단백질을 사용할 수 있다. 게다가, 사전에 조립된 VLPs로부터 유래된 재조합 캡시드 단백질을 VLPs 내로 사전에 조립된 바 없는 재조합 캡시드 단백질과 혼합하여 다가 VLPs를 생산할 수 있다.

본 발명에서 사용하기 위한 재조합 캡시드 단백질은 그러한 펩티드를 생산할 수 있는 임의의 숙주 세포 발현 시스템에서 생성될 수 있는데, 이는 그 중에서도 특히 세균, 효소, 곤충, 포유동물, 및 식물 숙주 세포 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 캡시드 단백질은 원핵생물 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 원핵생물 숙주 세포는 세균 숙주 세포이다. 몇몇 실시태양에서, 캡시드 융합 펩티드는 가용성 캡시드 단백질 또는 불용성 봉입체로서 생산될 수 있다. 특정 실시태양에서, 재조합 캡시드 단백질은 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 세포에서 가용성 캡시드 융합 단백질로서, 또는 불용성 봉입체로 발현될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 캡시드 단백질은 진핵생물 숙주 세포에서 생산된다. 특정 실시태양에서, 진핵생물 숙주 세포는 식물 세포이다. 또다른 실시태양에서, 캡시드 융합 펩티드는 전 식물에서 생산된다.

본 발명은 상이한 유형의 재조합 캡시드 융합 펩티드를 혼합하는 것을 제공하되, 여기에서, 혼합을 위해 선택되는 캡시드 융합 펩티드는 그가 혼합되는 다른 캡시드 융합 펩티드에는 존재하지 않는 항원성 펩티드를 적어도 하나 함유한다. 항원성 펩티드는 동일하거나 상이한 병원체로부터의 것일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 혼합을 위해 선택되는 캡시드 융합 펩티드는 상이한 병원체로부터의 항원성 펩티드를 함유한다. 특정 실시태양에서, 혼합물은 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집을 적어도 2개 함유할 수 있는데, 여기에서, 각각의 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집은 그와 혼합되는 임의의 다른 재조합 캡시드 융합 펩티드에는 존재하지 않는, 상이한 병원체로부터의 상이한 항원성 펩티드를 적어도 하나 함유한다. 또다른 실시태양에서, 혼합물은 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집을 2개 초과로 함유하는데, 여기에서, 각각의 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집은 적어도 하나의 상이한 병원체로부터의 상이한 항원성 펩티드를 적어도 하나 함유한다. 몇몇 실시태양에서, 캡시드 융합 펩티드는 다중 항원성 펩티드 삽입체를 함유한다. 몇몇 실시태양에서, 캡시드 융합 펩티드는 제한하는 것은 아니지만, T 세포, B 세포, 및 CTL 세포에 대한 에피토프를 비롯한, 특이적인 유형의 면역 효과기 세포를 표적하는 항원성 펩티드를 함유한다. 추가의 실시태양에서, 혼합물은 또한 야생형 캡시드 단백질을 함유한다.

본 발명에 사용되는 바이러스 캡시드 단백질은 바이러스 유사 입자로의 재조립이 가능한 임의 유형의 바이러스로부터 유래될 수 있다. 특정 실시태양에서, VLPs 내로 혼합되고, 재조립되는 재조합 바이러스 캡시드 단백질 모두는 동일한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 대체 실시태양에서, VLPs 내로 혼합되고, 재조립되는 재조합 바이러스 캡시드 단백질은 상이한 바이러스로부터 유래된다. 예를 들면, 형태학적 캡시드 구조 (즉, 정20면체, 나선형 등)는 유사하되, 상이한 바이러스로부터 유래된 재조합 바이러스 캡시드 단백질이 VLPs 내로 혼합되고, 재조립될 수 있다.

본 발명을 통해 다가 백신의 비율과 조성을 조절함으로써 다가 백신을 효율적이고 탄력적으로 생성할 수 있다. 본 발명은 분리형 숙주 세포에서의 독립적인 생산로부터 단리 및 정제된 후에 혼합되는 캡시드 융합 펩티드를 함유하는 바람직한 에피토프를 제공하기 때문에 원하는 배합을 엄격히 조정할 수 있다. 본 발명을 통해 혼합물에 첨가되는 재조합 캡시드 융합 펩티드 각 군집들의 양을 조정함으로써 재조합 캡시드 단백질을 임의의 바람직한 항원 성분 비율로 재조립할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 항원성 펩티드 이외의 미리 결정된 관능성 아미노산 서열을 바이러스 캡시드 단백질 내로 삽입하는 것을 포함한다. 이들 서열은 면역 반응을 유도하는 것 이외의 작용들을 가질 수 있다. 그러한 서열의 일례로는 수용체 결합 부위와 같은 표적화 아미노산 서열이 있고, 본 방법에서는 표적화 아미노산 서열을 함유하는 캡시드 단백질을 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 적어도 하나의 캡시드 단백질과 혼합하는 것을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 표적화 아미노산 삽입체는 조립된 입자를 특이적인 세포로 지정할 수 있거나 세포 내로 진입시킬 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 조립된 VLP 입자에 CpG 서열과 같은 면역자극성 핵산 서열을 포함시키는 것을 제공한다.

본 발명은 1개 초과의 병원체로부터의 항원 삽입체를 함유하는 바이러스 유사 입자를 사용하여 다가 백신의 생산율을 증가시키고 대량 생산을 증가시키는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 1개 초과의 병원체로부터의 항원 삽입체를 함유하되, VLP에 함유되어 있는 항원 제제의 비율이 용이하게 조절될 수 있는, 다가 VLPs를 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

추가로, 본 발명은 전장의 감염 바이러스 핵산 게놈이 존재하지 않는 다가 VLPs를 생산할 수 있다.

도 1 은 불용성 분획중 PA1, PA2, PA3, 및 PA4 펩티드 삽입체를 발현시키기 위해서 조작된 CCMV 캡시드 융합 펩티드를 포함하는 슈도모나스 플루오레센스 MB214 숙주 세포로부터 유래된 불용성 단백질 분획의 웨스턴 블롯이다. 세포를 0 시간째, 12시간째, 및 44시간째 용해시켰다. 키메라 캡시드 융합 펩티드는 화살표로 표시한다.

도 2 는 가용성 분획중 PA1, PA2, PA3, 및 PA4 펩티드 삽입체를 발현시키기 위해서 조작된 CCMV 캡시드 융합 펩티드를 포함하는 슈도모나스 플루오레센스 MB214 숙주 세포로부터 유래된 가용성 단백질 분획의 웨스턴 블롯이다. 세포를 0시간째, 12시간째, 및 44시간째 용해시켰다.

도 3 은 RNA를 포함하는 CCMV-PA3 VLPs 또는 RNA를 포함하지 않는 CCMV-PA3 VLPs의 분리를 나타내는 수크로스 밀도 구배의 사진이다.

도 4 는 수크로스 밀도 구배로부터 단리된 RNA를 포함하는 CCMV-PA1 및 CCMV-PA2 VLP 밴드 및 RNA를 포함하지 않는 CCMV-PA1 및 CCMV-PA2 VLP 밴드의 SDS-PAGE 겔이다.

도 5 는 RNA 부재하의 CCMV-PA4로부터 재조립된 VLPs의 전자 현미경 사진이다.

도 6 은 다중 보호성 항원 ("PA") 에피토프를 함유하는 다가 VLPs의 발현 및 재조립에 대한 도해이다.

도 7 은 조립 반응시 CpGs를 VLPs 내로 패킹하는 것을 설명하는 도해이다.

도 8 은 VLP 생산 단계의 HPLC 분석이다. 8A는 식물에서 생산된 CCMV 바이러스 입자의 SEC-HPLC 분석을 도시한다. 8B는 식물에서 생산된 CCMV 바이러스 입자가 이량체로 분해된 것을 설명한다. 8C는 단리된 CCMV 이량체가 VLPs로 재조립되는 것을 나타낸다.

도 9 는 정제되어진 분해된 CCMV 이량체, 및 캡슐화된 CpG 올리고뉴클레오티드를 함유하는 재조립된 CCMV VLP의 SEC-HPLC 분석이다.

도 10 은 캡슐화된 표준 CpG 올리고뉴클레오티드 또는 보호된 백본을 갖는 CpGs를 함유하는 CCMV VLPs의 1.2% 아가로스 겔의 사진으로서, 상단은 EtBr로 염색된 것이고, 하단은 단백질 염료로 염색된다.

발명의 상세한 설명

I. 재조합 바이러스 캡시드 단백질

바이러스 캡시드

본 발명의 실시태양은 적어도 하나의 항원성 펩티드를 함유하는 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집을 시험관 내에서 혼합하되, 여기에서, 재조합 캡시드 융합 펩티드 각 군집들은 그와 혼합되는 캡시드 융합 펩티드에는 함유되어 있지 않은 항원성 펩티드를 적어도 하나 함유하고 있고, 혼합된 재조합 캡시드 융합 펩티드를 미리 결정된 비율로 재조립하여 다가 바이러스 유사 입자를 형성하는 것으로 구성된, 다가 바이러스 유사 입자를 생산하는 것을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 생성된 VLPs에 함유되어 있는 항원성 펩티드는 상이한 병원체로부터 유래될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "다가"란 재조립된 바이러스 유사 입자에 상이한 항원성 펩티드 서열이 적어도 2개 존재한다는 것을 지시한다.

형태

현 발명은 캡시드 단백질을 유도하기 위하여 사용되는 바이러스 유형에 따라 달라지지 않는다. 항원성 펩티드 삽입 후, 바이러스 유사 입자, 또는 케이지 구조체 내로 재조립될 수 있는 임의의 바이러스 캡시드 단백질이 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명의 실시태양에서, 캡시드의 아미노산 서열은 정20면체 (고유의, 등방형, 유사-등방형 및 이중 또는 "쌍둥이형" 정20면체 포함), 다면체 (구형, 타원형 및 레몬형 포함), 막대형 (막대기형 또는 탄환형, 및 방추형 또는 시가형 포함), 및 나선형 (장대, 원통 및 필라멘트형 포함)을 비롯한 임의의 형태를 갖는 것으로 분류된 바이러스 캡시드로부터 선택될 수 있는데; 이중 임의의 것은 꼬리에 첨부될 수 있고/거나 스파이크 또는 노브와 같은 표면 돌기를 함유할 수 있다.

본 발명의 실시태양에서, 캡시드 아미노산 서열은 본래 나선형인 실체(entity)의 캡시드로부터 선택될 수 있다. 다른 실시태양에서, 캡시드 아미노산 서열은 정20면체인 실체의 캡시드로부터 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 캡시드 아미노산 서열은 고유 정20면체인 실체의 캡시드로부터 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 캡시드 아미노산 서열은 정20면체 바이러스의 캡시드로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 캡시드 아미노산 서열은 정20면체의 식물 바이러스의 캡시드로부터 선택될 수 있다. 그러나, 다른 실시태양에서, 바이러스 캡시드는 식물에 대해서는 비감염성인 정20면체 바이러스로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 바이러스는 포유동물에 대하여 감염성인 바이러스이다.

일반적으로, 정20면체 바이러스의 바이러스 캡시드는 정20면체 (입방체) 대칭형으로 배열된 다수의 단백질 하위 단위로 구성된다. 천연 정20면체 캡시드는 예를 들면, 캡시드의 각각의 삼각형 면을 형성하는 3개의 하위 단위으로 이루어질 수 있는데, 이로써, 완전한 캡시드를 형성하는 60개의 하위 단위가 형성된다. 이러한 작은 바이러스 구조중 대표적인 것은 예로서, 박테리오파지 ΦX174이다. 다수의 정20면체 바이러스 캡시드는 60개 초과의 하위 단위를 함유한다. 다수의 정20면체 바이러스의 캡시드는 평행하지 않은 8가닥의 베타-원통형 폴딩 모티프를 함유한다. 모티프는 한 측면에 4개의 베타 가닥 (BIDG로 표시됨) 및 다른 측면에 4개의 베타 가닥 (CHEF로 표시됨)을 갖는 쐐기형 블록을 갖는다. 또한, 2개의 보존된 알파-나선 (A 및 B로 표시됨)이 있으며, 하나는 베타 C와 베타 D의 사이에, 다른 하나는 베타 E와 베타 F의 사이에 있다.

바이러스

바이러스 분류학은 캡시드화된-입자 실체의 하기 분류군을 인지한다:

·제I군 바이러스, 즉 dsDNA 바이러스;

·제II군 바이러스, 즉 ssDNA 바이러스;

·제III군 바이러스, 즉 dsRNA 바이러스;

·제IV군 바이러스, 즉 DNA 단계가 없는 ssRNA (+)-가닥 바이러스;

·제V군 바이러스, 즉 ssRNA (-)-가닥 바이러스;

·제VI군 바이러스, 즉 ssRNA 역전사 바이러스인 RNA 레트로이드 바이러스;

·제VII군 바이러스, 즉 dsRNA 역전사 바이러스인 DNA 레트로이드 바이러스;

·델타바이러스;

·비로이드; 및

·위성형 핵산 및 프리온을 제외한 위성형 파지 및 위성형 바이러스.

상기 분류군의 구성원은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 문헌 [H. V. Van Regenmortel et al. (eds.), Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington Mass., USA)]; 영국 레이체스터 대학교(University of Leicester) 미생물 및 면역학과의 바이러스 분류학 웹 페이지인 http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgroups.html; 및 미국 워싱턴 D.C.에 소재하는 미국 보건 복지부(US Department of Health ＆ Human Services) 국립 보건원(National Institutes of Health) 국립 의학 도서관(National Library of Medicine) 국립 생명공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information (NCBI))의 온라인 "바이러스" 및 "비로이드" 섹션의 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html에 검토되어 있다.

캡시드의 아미노산 서열은 임의의 상기 분류군중 임의 구성원의 캡시드로부터 선택될 수 있다. 상기 분류군의 구성원의 캡시드에 대한 아미노산 서열은 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, NCBI에서 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi에 제공된 PubMed 검색 기관의 온라인 "뉴클레오티드" (Genbank), "단백질" 및 "구조" 섹션을 비롯한 공급처로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 실시태양은 캡시드 아미노산 서열이 하기 숙주들: 효모를 비롯한 진균, 식물, 조류를 비롯한 원생생물, 무척추 동물, 척추 동물 및 인간중 적어도 하나에 대하여 특이적인 분류군의 구성원으로부터 선택될 수 있는 것을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 캡시드 아미노산 서열은 하기 분류군: 제I군, 제II군, 제III군, 제IV군, 제VII군, 비로이드 및 위성형 바이러스중 어느 하나의 구성원들로 부터 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 캡시드 아미노산 서열은 상기-기재된 6개의 숙주 유형 중 적어도 하나에 대해 특이적인 이들 7개 분류군 중 어느 하나의 구성원들으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 캡시드 아미노산 서열은 제II군, 제III군, 제IV군, 제VII군 및 위성형 바이러스 중 어느 하나; 또는 제II군, 제IV군, 제VII군 및 위성형 바이러스 중 어느 하나의 구성원들로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 바이러스 캡시드는 제IV군 또는 제VII군으로부터 선택된다. 몇몇 실시태양에서, 바이러스 캡시드는 제IV군의 바이러스로부터 선택된다.

바이러스 캡시드 서열은 캡시드 융합 펩티드가 생산되는 세포에 대하여 천연 감염 인자가 아닌 바이러스로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 실시태양은 세포가 원하는 정20면체 캡시드 이외의 특정의 선택된 바이러스로부터의 바이러스 단백질은 포함하지 않는 것을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 바이러스 캡시드는 캡시드 융합 펩티드가 생산되는 세포와 과가 상이한 유기체에 대해 향성을 갖는 바이러스로부터 유래된다. 또다른 실시태양에서, 바이러스 캡시드는 캡시드 융합 펩티드가 생산되는 숙주 세포와 속이 상이한 유기체에 대해 향성을 갖는 바이러스로부터 유래된다. 또다른 실시태양에서, 바이러스 캡시드는 캡시드 융합 펩티드가 생산되는 숙주 세포와 종이 상이한 유기체에 대해 향성을 갖는 바이러스로부터 유래된다.

본 발명의 실시태양은 바이러스 캡시드가 정20면체 바이러스로부터 선택되는 것을 포함한다. 정20면체 바이러스는 파필로마비리대(Papillomaviridea), 토티비리대(Totiviridae), 디시스트로비리대(Dicistroviridae), 헤파드나비리대(Hepadnaviridae), 토가비리디애(Togaviridiae), 폴리오마비리디애(Polyomaviridiae), 노다비리대(Nodaviridae), 테크티비리대(Tectiviridae), 레비비리대(Leviviridae), 마이크로비리대(Microviridae), 시포비리대(Sipoviridae), 노다비리대(Nodaviridae), 피코르노비리대(Picornoviridae), 파보비리대(Parvoviridae), 칼시비리대(Calciviridae), 테트라비리대(Tetraviridae), 및 위성형 바이러스중 임의의 구성원으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 서열은 적어도 하나의 식물 숙주에 대해 특이적인 분류군 중 어느 하나의 구성원으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 정20면체 식물 바이러스 종은 부니아비리대(Bunyaviridae), 레오비리대(Reoviridae), 라브도비리대(Rhabdoviridae), 루테오비리대(Luteoviridae), 나노비리대(Nanoviridae), 파르티티비리대(Partitiviridae), 세퀴비리대(Sequiviridae), 티모비리대(Tymoviridae), 오우르미아바이러스(Ourmiavirus), 담배 괴사 바이러스 위성, 카울리모비리대(Caulimoviridae), 게미니비리대(Geminiviridae), 코모비리대(Comoviridae), 소베모바이러스(Sobemovirus), 톰부스비리대(Tombusviridae) 또는 브로모비리대(Bromoviridae) 분류군 중 어느 하나인 또는 그의 구성원인 식물-감염성 바이러스 종일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 정20면체 식물 바이러스 종은 루테오비리대, 나노비리대, 파르티티비리대, 세퀴비리대, 티모비리대, 오우르미아바이러스, 타바코 네크로시스 바이러스 세틀라이트, 카 울리모비리대, 게미니비리대, 코모비리대, 소베모바이러스, 톰부스비리대, 또는 브로모비리대 분류군 중 어느 하나인 또는 그의 구성원인 식물-감염성 바이러스 종이다. 몇몇 실시태양에서, 정20면체 식물 바이러스 종은 카울리모비리대, 게미니비리대, 코모비리대, 소베모바이러스, 톰부스비리대, 또는 브로모비리대 중 어느 하나인 또는 그의 구성원인 식물 감염성 바이러스 종이다. 다른 실시태양에서, 정20면체 식물 바이러스 종은 코모비리대, 소베모바이러스, 톰부스비리대, 또는 브로모비리대 중 어느 하나인 또는 그의 구성원인 식물-감염성 바이러스 종일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 정20면체 식물 바이러스 종은 코모비리대 또는 브로모비리대 과의 구성원인 식물-감염성 바이러스 종일 수 있다. 특정 실시태양에서, 바이러스 캡시드는 브로모비리대 분류군의 종으로부터 유래된다. 특정의 다른 실시태양에서, 캡시드는 일라르바이러스(Ilarvirus) 또는 알파모마이러스(Alfamovirus)로부터 유래된다. 특정 실시태양에서, 바이러스 캡시드는 동부 모자이크 바이러스 또는 동부 퇴록얼룩무늬 바이러스로부터 유래된다. 다른 실시태양에서, 캡시드는 담배 줄무늬병 바이러스, 브롬 모자이크 바이러스, 또는 알팔파 모자이크 바이러스 (AMV)로부터 유래된다.

II. 항원성 펩티드 삽입체

크기

본 발명의 실시태양은 바이러스 캡시드 서열에 작동가능하게 연결된 항원성 펩티드 또는 단백질이 적어도 2개의 아미노산을 함유하는 것을 포함한다. 항원성 펩티드는 유효량으로 동물에게 투여되었을 때 면역 반응을 일으키기에 충분한 크기 일 수 있다. 펩티드의 길이는 적어도 아미노산 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 45, 50, 60, 65, 75, 85, 95, 96, 99개 이상일 수 있다.

본 발명의 실시태양은 재조합 캡시드 융합 펩티드가 적어도 하나의 항원성 펩티드를 함유하는 것을 포함한다. 대체 실시태양에서, 재조합 캡시드 융합 펩티드는 1개 초과의 항원성 펩티드를 함유한다. 몇몇 실시태양에서, 항원성 펩티드는 적어도 2개의, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개 또는 적어도 20개의 분리형 항원성 펩티드로 구성된다. 추가의 또다른 실시태양에서, 항원성 펩티드는 캡시드 단백질이 재조립되어 바이러스-양 입자를 형성할 때 적어도 하나의 표면 루프상에 노출되도록 바이러스 캡시드 단백질 내로 삽입된다.

항원성 펩티드

본 발명에 사용하기 위한 항원성 펩티드는 면역 반응을 일으킬 수 있는 임의의 펩티드 서열일 수 있다. 예를 들면, 항원성 펩티드는 펩티드 에피토프, 합텐 또는 관련 펩티드 (예로서, 항원성 바이러스 펩티드; 바이러스 관련 펩티드, 예로서, HIV-관련 펩티드, 간염 바이러스-관련 펩티드; 항체 이디오타입 도메인, 세포 표면 펩티드; 항원성 인간, 동물, 원생생물, 식물, 진균, 세균 및/또는 원시 펩티드; 알레르기성 펩티드 및 알레르기 탈감작 펩티드)일 수도 있다. 항원성 펩티드는 감염 인자, 기생충, 암 세포, 및 다른 병원체를 비롯한 인간 또는 동물 병원체의 항원성 펩티드인 것으로부터 선택될 수 있다. 그러한 병원체로서는 또한 상기 인자들중 발병 인자 및 발병기전 인자, 예로서, 외독소 및 내독소 등을 포함한다. 병원체는 임의 수준의 발병을 나타낼 수 있고, 즉, 발병성, 무발병성, 위-발병성, 반-발병성 등일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항원성 펩티드는 병원체(들)로부터의 에피토프 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 에피토프 아미노산 서열은 상기 인자들중 적어도 하나의 표면 펩티드의 적어도 일부의 것을 포함할 수 있다.

1개 초과의 항원성 펩티드는 단일 캡시드 단백질내 삽입을 위해 선택될 수 있고, 이러한 경우, 생성된 바이러스-양 입자는 다중의 상이한 캡시드 융합 펩티드로부터 다중의 상이한 항원성 펩티드를 제시할 수 있다. 다중 항원성 펩티드 포맷중 몇몇 실시태양에서, 다양한 항원성 펩티드는 동일한 병원체로부터의 복수개의 에피토프로부터 선택될 수 있다. 다중 항원성 펩티드 포맷중 다른 실시태양에서, 선택되는 다양한 항원성 펩티드는 모두 복수개의 밀접하게 관련되어 있는 병원체, 예를 들면, 동일한 속에 속하는 동일한 종 또는 상이한 종의 상이한 균주, 아종, 생체변이형(biovar), 병원형(pathovar), 혈청형(serovar) 또는 유전형(genovar)으로부터 선택될 수 있다. 대체 실시태양에서, 캡시드 융합 펩티드내 삽입을 위한 항원성 펩티드는 관련이 없는 병원체로부터의 것일 수 있다.

본 발명의 실시태양은 병원체(들)가 하기 군 중 적어도 하나에 속할 수 있는 것을 포함한다: 세균 및 미코플라즈마 인자, 예를 들면, 병원성인 바실루스(Bacillus) 종, 예를 들면, 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis); 바르토넬라(Bartonella) 종, 예를 들면, B. 퀸타나(B. quintana); 브루셀라(Brucella) 종; 부르크홀데리아(Burkholderia) 종, 예를 들면, B. 슈도말레이(B. pseudomallei); 캄필로박터(Campylobacter) 종; 클로스트리듐(Clostridium) 종, 예를 들면, C. 테타니(C. tetani), C. 보툴리눔(C. botulinum); 코시엘라(Coxiella) 종, 예를 들면, C. 부르네티이(C. burnetii); 에드와르드시엘라(Edwardsiella) 종, 예를 들면, E. 타르다(E. tarda); 엔테로박터(Enterobacter) 종, 예를 들면, E. 클로아새(E. cloacae); 엔테로코쿠스 종, 예를 들면, E. 패칼리스(E. faecalis), E. 패슘(E. faecium); 에쉐리히아(Escherichia) 종, 예를 들면, E. 콜라이(E. coli); 프란시셀라(Francisella) 종, 예를 들면, F. 툴라렌시스(F. tularensis); 해모필루스(Haemophilus) 종, 예를 들면, H. 인플루엔재(H. influenzae); 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 예를 들면, K. 뉴모니애(K. pneumoniae); 레지오넬라(Legionella) 종; 리스테리아(Listeria) 종, 예를 들면, L. 모노시토제네스(L. monocytogenes); 메닌고코시(Meningococci) 및 고노코시(Gonococci), 예를 들면, 네이세리아(Neisseria) 종; 모락셀라(Moraxella) 종; 미코박테륨(Mycobacterium) 종, 예를 들면, M. 랩래(M. leprae), M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis); 뉴모코시(Pneumococci), 예를 들면, 디플로코쿠스 뉴모니애(Diplococcus pneumoniae); 슈도모나스 종, 예를 들면, P. 애루기노사(P. aeruginosa); 릭케트시아(Rickettsia) 종, 예를 들면, R. 프로와제키이(R. prowazekii), R. 릭케트시이(R. rickettsii), R. 티피(R. typhi); 살모넬라(Salmonella) 종, 예를 들면, S. 티피(S. typhi); 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 예를 들면, S. 아우레우스(S. aureus); A군 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 용혈성 스트렙토코쿠스, 예를 들면, S. 뉴모니애(S. pneumoniae), S. 피오제네스(S. pyogenes)를 비롯한 스트렙토코쿠스 종; 스 트렙토마이세스(Streptomyces) 종; 쉬겔라(Shigella) 종; 비브리오(Vibrio) 종, 예를 들면, V. 콜레래(V. cholerae); 및 예르시니아(Yersinia) 종, 예를 들면, Y. 페스티스(Y. pestis), Y. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 진균 및 효모 제제로는 병원성인 알테르나리아(Alternaria) 종; 아스페르길루스(Aspergillus) 종; 블라스토마이세스(Blastomyces) 종, 예를 들면, B. 더마티디티스(B. dermatiditis); 칸디다(Candida) 종, 예를 들면, C. 비칸스(C. albicans); 클라도스포륨(Cladosporium) 종; 코시디오데스(Coccidiodes) 종, 예를 들면, C. 임미티스(C. immitis); 크립토코쿠스(Cryptococcus) 종, 예를 들면, C. 네오포르만스(C. neoformans); 히스토플라즈마(Histoplasma) 종, 예를 들면, H. 카프술라툼(H. capsulatum); 및 스포로트릭스(Sporothrix) 종, 예를 들면, S.쉔키이(S. schenckii) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시태양은 상기 병원체(들)가 병원성인 아메배(Amoebae), 예를 들면, 아칸타메바(Acanthamoeba) 종, 아메바(Amoeba) 종, 내글레리아(Naegleria) 종, 엔타메바(Entamoeba) 종, 예를 들면, E. 히스톨리티카(E. histolytica); 크립토스포리듐(Cryptosporidium) 종, 예를 들면, C. 파붐(C. parvum); 시클로스포라(Cyclospora) 종; 엔세팔리토준(Encephalitozoon) 종, 예를 들면, E. 인테스티날리스(E. intestinalis); 엔테로시토준(Enterocytozoon) 종; 기아르디아(Giardia) 종, 예를 들면, G. 람블리아(G. lamblia); 이소스포라(Isospora) 종; 마이크로스포리듐(Microsporidium) 종; 플라스모듐(Plasmodium) 종, 예를 들면, P. 팔시파룸(P. falciparum), P. 말라리애(P. malariae), P. 오발레(P. ovale), P. 비박스(P. vivax); 톡소플라즈마(Toxoplasma) 종, 예를 들면, T.곤디이(T. gondii); 및 트리파노소마(Trypanosoma) 종, 예를 들면, T.브루세이(T. brucei) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 원생생물 제제로부터 유래된 것일 수 있는 것을 포함한다.

본 발명의 실시태양은 상기 병원체(들)가 병원성인 아스카리스(Ascaris) 종, 예를 들면, A. 룸브리코이데스(A. lumbricoides); 드라쿤쿨루스(Dracunculus) 종, 예를 들면, D. 메디넨시스(D. medinensis); 온코세르카(Onchocerca) 종, 예를 들면, O. 볼불루스(O. volvulus); 쉬스토소마(Schistosoma) 종; 트리키넬라(Trichinella) 종, 예를 들면, T. 스피랄리스(T. spiralis); 및 트리쿠리스(Trichuris) 종, 예를 들면, T. 트리키우라(T. trichiura) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 기생충 제제 (예를 들면, 연충 기생충)로부터 유래된 것일 수 있는 것을 포함한다.

또다른 실시태양에서, 상기 병원체(들)가 병원성인 아데노바이러스; 아레나바이러스, 예를 들면, 라사 열 바이러스; 아스트로바이러스; 분야바이러스, 예를 들면, 한타바이러스, 리프트 계곡 열 바이러스; 코로나바이러스, 델타바이러스; 사이토메갈로바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 허피스 바이러스, 수두 바이러스; 필로바이러스, 예를 들면, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스; 플라바이러스, 예를 들면, 뎅기열 바이러스, 서부 나일강 열 바이러스, 황열병 바이러스; 간염 바이러스; 인플루엔자바이러스; 렌티바이러스, T-세포 림프친화성 바이러스, 다른 백혈병 바이러스; 노르워크 바이러스; 파필로마바이러스, 다른 종양 바이러스; 파라믹소바이러스, 예를 들면, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자바이러 스, 뉴모바이러스, 센다이 바이러스; 파보바이러스; 피코르나바이러스, 예를 들면, 카르디오바이러스, 콕삭키 바이러스, 에코바이러스, 회백수염 바이러스, 리노바이러스, 다른 엔테로바이러스; 폭스바이러스, 예를 들면, 바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 파라폭스바이러스; 레오바이러스, 예를 들면, 콜티바이러스, 오르비바이러스, 로타바이러스; 랍도바이러스, 예를 들면, 광견병바이러스, 수포성 구내염 바이러스; 및 토가바이러스, 예를 들면, 풍진 바이러스, 신드비스 바이러스, 웨스턴 엔세팔리티스 바이러스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 바이러스 제제로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 실시태양은 항원성 펩티드가 개 파보바이러스 펩티드, 바실루스 안트라시스 보호성 항원 (PA) 항원성 펩티드 및 동부 말 뇌염 바이러스 항원성 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항원성 펩티드는 개 파보바이러스-유래된 펩티드이다. 추가의 실시태양에서, 항원성 펩티드는 서열 번호: 4, 6, 8, 또는 10의 아미노산 서열중 어느 하나를 갖는 바실루스 안트라시스 보호성 항원 (PA) 항원성 펩티드이다. 추가의 다른 실시태양에서, 항원성 펩티드는 서열 번호: 11 또는 13의 아미노산 서열중 하나를 갖는 동부 말 뇌염 바이러스 항원성 펩티드이다.

항원성 펩티드 또는 관심의 대상이 되는 펩티드에 대한 코딩 서열이 미리 결정된 부위중 바이러스 캡시드 또는 코트 단백질에 대한 코딩 서열 내로 삽입될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 펩티드는 VLP가 형성되는 동안 루프로서 발현되기 위해서 캡시드 코딩 서열 내로 삽입된다.

펩티드는 캡시드내 1개 초과의 삽입 부위에 삽입될 수 있다. 따라서, 펩티드는 캡시드의 1개 초과의 표면 루프 모티프에 삽입될 수 있고; 펩티드는 또한 주어진 루프 모티프내 다중 부위에 삽입될 수 있다. 삽입체(들)의 개별적인 관능성 및/또는 구조상 펩티드(들), 및/또는 전체 펩티드 삽입체(들)는 절단 부위, 즉, 단백질을 절단 또는 가수분해하는 제제가 캡시드 구조체 또는 조립체의 나머지 부분으로부터 펩티드를 분리하도록 작용할 수 있는 부위에 의해 분리될 수 있다.

펩티드는 외향 루프(들) 내에서 및/또는 내향 루프(들) 내에서, 즉, 각각 캡시드의 중앙으로부터 바깥족 또는 중앙을 향하여 대향하는 캡시드의 루프 내에서 삽입될 수 있다. 캡시드의 표면 루프에서 임의의 아미노산 또는 펩티드 결합은 펩티드에 대한 삽입부로서의 역할을 할 수 있다. 전형적으로, 삽입 부위는 루프의 중앙 부근에서, 즉, 폴딩된 캡시드 펩티드의 3차원 구조의 중앙으로부터 가장 먼 위치 부근에서 선택될 것이다. 펩티드 코딩 서열은 선택된 루프(들)의 대략 중앙에 상응하는 캡시드 코딩 서열의 위치 내에 작동가능하게 삽입될 수 있다. 이는 펩티드 삽입 부위로부터 하류에서 합성된 캡시드의 펩티드 서열의 일부분에 대한 리딩 프레임을 보유한다.

다른 실시태양에서, 펩티드는 캡시드의 아미노 말단에서 삽입될 수 있다. 펩티드는 하나 이상의 링커 서열을 통해 캡시드에 연결될 수 있다. 몇몇 다른 실시태양에서, 펩티드는 캡시드의 카르복시 말단에서 삽입될 수 있다. 펩티드는 또한 화학적 또는 효소적 가수분해에 의해 절단될 수 있는 하나 이상의 링커를 통해 카르복시 말단에 연결될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노 말단 및 카르복시 말단, 양자 모두에서, 또는 한 말단 및 적어도 하나의 내부 위치, 예로서, 그의 3차원 형상의 캡시드 표면상에서 발현되는 위치에서 연결된다. 다른 본 발명의 실시태양의 경우, 적어도 하나의 항원성 펩티드는 VLP의 적어도 하나의 내부 루프 내에서, 또는 적어도 하나의 외부 루프에서 발현된다.

바이러스 캡시드의 1개 초과의 루프는 변형될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항원성 펩티드는 바이러스-양 입자의 적어도 2개의 표면 루프상에서 노출된다. 다른 실시태양에서, 적어도 2개의 항원성 펩티드는 캡시드 단백질 내로 삽입되고, 바이러스 캡시드, 케이지 또는 바이러스-양 입자의 적어도 2개의 표면 루프상에서 노출된다. 또다른 실시태양에서, 적어도 3개의 항원성 펩티드는 캡시드 단백질 내로 삽입되고, 바이러스-양 입자의 적어도 3개의 표면 루프상에서 노출된다. 표면 루프내 재조합 펩티드는 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 추가의 실시태양에서, 표면 루프내 재조합 펩티드의 아미노산 서열은 상이하다.

바이러스 캡시드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 또한 VLP의 형성을 변경하도록 추가로 변형될 수 있다 (예로서, 문헌 [Brumfield, et al. (2004) J. Gen. Virol. 85: 1049-1053] 참조한다). 예를 들면, VLP 발현 및 조립체를 변형하기 위해 3가지 일반적인 부류의 변형이 가장 전형적으로 일어난다. 이러한 변형은 조립된 단백질 케이지 내의 인접한 하위 단위의 내부, 외부 또는 그 사이의 계면을 변경하도록 설계된다. 이를 달성하기 위해, 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 (i) N 말단의 염기성 잔기 (예로서, K, R)를 산성 글루탐산으로 대체함으로서 바이러스 핵산 결합 영역의 내부 표면 전하를 변경하고 (문헌 [Douglas et al., 2002b]); (ii) N 말단으로부터의 내부 잔기 (CCMV, 통상적으로 잔기 4 내지 37)를 결실시키고; (iii) 11개 아미노산 펩티드 세포-표적화 서열 (문헌 [Graf et al., 1987])을 코딩하는 cDNA를 표면 노출된 루프 내로 삽입하고; (iv) 금속 결합 부위 (CCMV 내, 잔기 81/148 돌연변이체)를 변경함으로써 바이러스 하위 단위 사이의 상호작용을 변형시킬 수 있다.

본 발명의 실시태양은 항원성 펩티드가 동부 퇴록얼룩무늬 모자이크 바이러스 (CCMV)로부터 유래된 캡시드 내로 삽입될 수 있는 것을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 펩티드는 CCMV 바이러스의 129번 아미노산에 삽입될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 CCMV 바이러스의 60, 61, 62 또는 63번 아미노산에 삽입될 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, 펩티드는 CCMV 바이러스의 129번 아미노산 및 60-63번 아미노산 모두에 삽입될 수 있다.

본 발명의 실시태양은 관심의 대상이 되는 항원 펩티드에 인접해 있거나, 바이러스 캡시드 단백질중 일부에 연결되어 있는 태그 서열 또한 포함할 수 있는 것을 포함한다. 본 발명의 실시태양에서, 태그 서열은 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드의 정제를 가능하게 할 수 있다. 태그 서열은 친화성 태그, 예를 들면, 헥사-히스티딘 친화성 태그일 수 있다. 또다른 실시태양에서, 친화성 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 분자일 수 있다. 또한, 상기 태그는 YFP 또는 GFP와 같은 형광 분자, 또는 이러한 형광 단백질의 유사체일 수 있다. 또한, 상기 태그는 항체 분자의 일부, 또는 정제에 유용한 공지된 결합 파트너에 대한 공지된 항원 또는 리간드일 수 있다.

III. 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드 생산

본 발명은 차후 다가 VLPs 조립에 사용하기 위한 재조합 캡시드 융합 펩티드를 생산하는 합성 또는 임의 유형의 생물학적 발현 시스템의 용도에 주시한다. 캡시드 단백질을 발현시키는 현 방법은 곤충 세포 발현 시스템, 세균 세포 발현 시스템, 예로서, E. 콜라이, B. 섭틸러스(B. subtilus), 및 P. 플루오레센스, 식물 및 식물 세포 배양 발현 시스템, 효모 발현 시스템 예로서, S. 세비시애(S. cervisiae) 및 P. 파스토리스(P. Pastoris), 및 포유동물 발현 시스템을 포함한다.

본 발명의 실시태양은 재조합 캡시드 융합 펩티드가 식물 세포 또는 전체 식물에서 생산되는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 캡시드 융합 펩티드는 가용성 단백질로서 생산될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 캡시드 융합 펩티드는 감염성 바이러스 입자 내로 조립된다. 대체 실시태양에서, 캡시드 융합 펩티드는 VLPs로서 조립된다.

본 발명의 실시태양은 재조합 캡시드 융합 펩티드가 세균 세포 배양물에서 생산되는 것을 포함한다. 실시태양에서, 재조합 캡시드 융합 펩티드는 숙주 세포 내에서 불용성 봉입체로서 응집될 수 있다. 대체 실시태양에서, 캡시드 단백질 융합 펩티드는 숙주 세포 내에서 가용성 분자로서 생산된다. 다른 실시태양에서, 재조합 캡시드 융합 펩티드는 슈도모나스 플루오레센스 세포를 비롯한 슈도모나드 숙주 세포에서 생산된다.

본 발명에서 사용하기 위한 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드는 당업계에 잘 공지되어 있는 기법을 사용하여 생물학적 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 예 를 들면, 적어도 하나의 항원성 펩티드에 작동가능하게 연결되어 있는 바이러스 캡시드 단백질의 융합 펩티드를 코딩하는 핵산 작제물은 숙주 세포 내로 도입되고 발현될 수 있다. His-태그, Flag-태그, T7-태그, S-태그, HSV-태그, B-태그, Strep-태그, 폴리아르기닌, 폴리시스테인, 폴리페닐알라닌, 폴리아스파르트산, (Ala-Trp-Trp-Pro)n, 티오레독신, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 시클로말토 덱스트린 글루코노트랜스퍼라제, CTP:CMP-3-데옥시-D-마노-옥툴로소네이트 시티딜트랜스퍼라제, trpE 또는 trpLE, 아비딘, 스트렙타비딘, T7 유전자 10, T4 gp55, 포도상구균 단백질 A, 연쇄상구균 단백질 G, GST, DHFR, CBP, MBP, 갈락토스 결합 도메인, 칼모둘린 결합 도메인, GFP, KSI, c-myc, ompT, ompA, pelB, NusA, 유비퀴틴 및 헤모실린 A를 비롯한, 발현된 펩티드의 식별, 분리, 정제 또는 단리를 돕는 전사 및 번역 조절 요소, 예로서, 전사 인핸서 서열, 번역 인핸서 서열, 프로모터, 내부 리보솜 결합 부위를 비롯한 리보솜 결합 부위, 활성화 인자, 번역 개시 및 종결 신호, 전사 종결자, 시스트론성 조절자, 폴리시스트론성 조절자, 뉴클레오티드 서열 "태그" 및 "태그" 펩티드 코딩 서열과 같은 태그 서열, 또는 정제에 유용한 공지 항원 또는 공지 결합 파트너에 대한 리간드를 기술된 서열에 공유 결합시킴으로써 숙주 세포의 작용에 의해 조절 요소가 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드의 발현을 지시할 수 있도록 할 수 있다.

발효 공정에서, 일단 재조합 캡시드 융합 펩티드의 발현이 유도되면, 캡시드 융합 펩티드의 생산율을 최대화하기 위하여 높은 수준의 생산성을 갖는 것이 이상적이다.

IV. 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드의 정제

일단 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드, 바이러스-양 입자 또는 케이지-양 구조체가 생산되면, 이어서, 당업계에 잘 공지되어 있는 표준 기법에 의해 이를 단리시키고, 실질적인 순도로 정제시킬 수 있다.

단리 및 정제 기법은 캡시드 단백질 융합 펩티드를 생산하는데 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 그러한 기법은 PEG, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 니켈 크로마토그래피, 하이드록실애퍼타이트 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 분취용 전기영동, 세제 가용화, 이러한 물질을 칼럼 크로마토그래피로서 사용하는 선택적 침전, 면역정제 방법, 크기 배제 크로마토그래프, 면역정제 방법, 원심분리, 초원심분리, 밀도 구배 원심분리 (예를 들면, 수크로스 또는 염화세슘(CsCl) 구배 상에서), 크기 배제 필터를 통한 한외여과, 및 당업계에 공지된 임의의 다른 단백질 단리 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 확립된 분자 부착성을 갖는 단백질은 리간드와 가역적으로 융합될 수 있다. 적절한 리간드와 함께, 캡시드 단백질 융합 펩티드는 정제 칼럼에 선택적으로 흡착된 후, 상대적으로 순수한 형태로 칼럼으로부터 유리화될 수 있다. 이어서, 캡시드 단백질은 효소적 활성에 의해 제거된다. 또한, 단백질은 면역친화성 칼럼 또는 Ni-NTA 칼럼을 사용하여 정제될 수 있다.

일반 기법은 예를 들면, (문헌 [R. Scopes, Peptide Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N.Y. (1982)]; [Deutscher, Guide to 펩티드 Purification, Academic Press (1990)]; 미국 특허번호 제4,511,503호; [S. Roe, Protein Purification Technique: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001)]; [D. Bollag, et al., Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996)]; [AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000)]; 및 [R. Mukhrja, et al., Gene 165(2): p. 303-6 (1995)])에 추가로 기재되어 있다. 또한, 예를 들면, (문헌 [Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements)]; [Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification, "Methods in Enzymology vol.182, and other volumes in this series]; [Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY]; 및 단백질 정제 생성물의 사용에 대한 제조자 문헌, 예컨대, [Pharmacia, Piscataway, N. J., or Bio-Rad, Richmond, Calif])도 참조한다. 재조합 기법과의 조합은 적절한 절편, 예컨대, FLAG 서열 또는 프로테아제-제거가능한 서열을 통해 융합될 수 있는 등가물에 융합을 가능하게 한다. 또한, 예를 들면, (문헌 [Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70]; [Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, NY]; 및 [Crowe, et al. (1992) QIAexpres: The High Level Expression ＆ Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.])을 참조한다.

몇몇 실시태양에서, 숙주 세포, 특히, 세균 숙주 세포에서 발현되는 캡시드 단백질 융합 펩티드는 불용성 응집체 ("봉입체")를 형성할 수 있다. 봉입체로부터 펩티드를 정제하는데 수개의 프로토콜이 적합하다. 예를 들면, 봉입체 정제는 전형적으로 예로서, 50mM TRIS/HCl pH 7.5, 50mM NaCl, 5mM MgCl₂, 1mM DTT, 0.1mM ATP, 및 1mM PMSF의 완충액에서의 인큐베이션으로 숙주 세포를 파괴시키는 것에 의한 봉입체의 추출, 분리 및(또는) 정제를 포함한다. 세포 현탁액은 프렌츠 프레스(French Press)를 통해 2 내지 3회 통과시켜 전형적으로 용해시킨다. 세포 현탁액은 또한 폴리트론(Polytron) (브린크르난 인스트루먼츠(Brinkrnan Instruments))을 사용하여 균질화시키거나 빙상에서 초음파처리할 수 있다. 세균 용해의 별법은 당업자에게 자명한 것이다 (예로서, (문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Ausubel et al., 상기 문헌]) 참조한다).

필요에 따라, 봉입체는 가용화할 수 있고, 용해된 세포 현탁액은 전형적으로 원심분리하여 원치않는 불용성 물질을 제거할 수 있다. 봉입체를 형성한 캡시드 단백질 융합 펩티드는 상용성인 완충액으로 희석 또는 투석에 의해 재생될 수 있다. 적합한 용매에는 우레아 (약 4M 내지 약 8M), 포름아미드 (적어도 약 80％, 부피/부피 기준), 및 구아니딘 하이드로클로라이드 (약 4M 내지 약 8M)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구아니딘 하이드로클로라이드 및 유사한 제제는 변성제이지만, 이 변성은 가역적이고, 변성제의 (예를 들면, 투석에 의한) 제거 또는 희석시에 재생될 수 있다. 다른 적합한 완충액은 당업자에게 공지되어 있다.

별법으로, 숙주 주변세포질로부터 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드, 바이 러스 유사 입자, 또는 케이지 구조체를 정제할 수 있다. 재조합 펩티드가 숙주 세포의 주변세포질로 이출되는 경우에 숙주 세포의 용해 후에, 세균의 주변세포질 분획은 당업자에게 공지된 다른 방법 이외의 냉각 삼투압 충격에 의해 단리될 수 있다. 주변세포질로부터 재조합 펩티드를 단리시키기 위해, 예를 들면, 세균 세포를 원심분리하여 펠릿을 형성할 수 있다. 펠릿은 20％ 수크로스를 함유한 완충액에 재현탁될 수 있다. 세포를 용해시키기 위해, 세균을 원심분리하고, 펠릿을 빙냉 5mM MgSO₄에 재현탁시키고, 대략 10분 동안 빙조에서 유지시킬 수 있다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 경사분리하여 모았다. 상등액에 존재하는 재조합 펩티드를 당업자에게 공지된 표준 분리 기법에 의해 숙주 펩티드로부터 분리할 수 있다.

초기 염 분획화는 관심의 대상이 되는 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드로부터 다수의 원치않는 숙주 세포 펩티드 (또는 세포 배양 배지로부터 유래된 펩티드)를 분리할 수 있다. 이러한 하나의 일례로는 황산암모늄일 수 있다. 황산암모늄은 펩티드 혼합물중 물의 양을 유효하게 감소시킴으로써 펩티드를 침전시킨다. 이어서, 펩티드는 그의 용해도를 기준으로 하여 침전된다. 소수성이 더욱 낮은 펩티드일수록 더욱 저농도의 황산암모늄 농도에서 침전될 가능성은 더욱 높다. 전형적인 프로토콜은 생성되는 황산암모늄 농도가 20 내지 30％가 되도록 펩티드 용액에 포화 황산암모늄을 첨가하는 것을 포함한다. 이 농도는 가장 소수성인 펩티드를 침전시킬 것이다. 이어서, (관심의 대상이 되는 펩티드가 소수성이 아닌 경우 에) 침전물을 버리고, 관심의 대상이 되는 캡시드 단백질 융합 펩티드를 침전시키는 것으로 공지된 농도로 황산암모늄을 상등액에 첨가한다. 이어서, 침전물을 완충액에서 가용화하고, 과량의 염을 필요에 따라 투석 또는 투석여과를 통해 제거한다. 펩티드의 용해도를 기반으로 하는 다른 방법, 예컨대, 냉각 에탄올 침전은 당업자에게 공지되어 있고, 이를 사용하여 복합 캡시드 단백질 융합 펩티드 혼합물을 분획할 수 있다.

재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드의 분자량은 세공 크기가 상이한 막 (예를 들면, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Millipore) 막)을 통한 한외여과를 사용하여 크기가 더 크거나 작은 펩티드들로부터 그를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 제1 단계로서, 캡시드 단백질 융합 펩티드 혼합물은 관심의 대상이 되는 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드의 분자량보다 낮은 분자량을 차단하는 세공 크기의 막을 통해 한외여과할 수 있다. 이어서, 한외여과의 보유액은 관심의 대상이 되는 캡시드 단백질 융합 펩티드의 분자량보다 큰 분자를 차단하는 막에 대해 한외여과할 수 있다. 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드는 막을 통해 여액으로 통과할 것이다. 이어서, 여액을 하기에 기재되는 바와 같이 크로마토그래피할 수 있다.

재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드는 또한 그의 크기, 표면의 순하전량, 소수성 및 리간드 친화성을 기준으로 다른 펩티드로부터 분리될 수도 있다. 또한, 캡시드 단백질에 대해 생성된 항체를 칼럼 매트릭스에 접합시키고, 캡시드 단백질을 면역정제할 수 있다. 이들 방법 모두는 당업계에 공지되어 있다. 크로마토그래피 기법을 임의의 규모로 다수의 상이한 제조자 (예컨대, 파마시아 바이오텍 (Pharmacia Biotech))로부터의 장비를 사용하여 수행할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

V. 조립된 바이러스 유사 입자의 분해

본 발명의 하나의 측면에서, 바이러스 유사 입자 내로 사전에 조립된 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드는 본 발명에 사용될 수 있는데, 여기에서, 바이러스 유사 입자는 분해되고, 바이러스 유사 입자의 재조합 캡시드 단백질 융합 펩티드는 단리되고 정제된 후, 다가 바이러스 유사 입자 형성에 사용될 수 있다.

분해 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, Tris, EGTA, DTT, 및 NaCl을 함유하는 해리 완충액을 사용하여 사전에 조립된 바이러스 유사 입자를 분해시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Brady et al. (1977) "Dissociation of polyoma virus by the chelation of calcium ions found associated with purified virions," J. Virology 23(3):717-724]을 참조한다. 또한, 고수준의 설프하이드릴 환원제, 예로서, β-머캅토에탄올, 글루타티온, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 시스테인, 황화수소, 및 그의 혼합물을 장기간 노출시키는 것을 사용하여 사전에 조립된 바이러스 유사 입자를 분해시킬 수 있다. 예를 들면, 미국 특허번호 제6,146,945호를 참조한다. 예를 들면, 실시예에 기술된 것과 같은 분해 방법 또한 본 발명에 사용될 수 있다.

VI. VLPs의 재조립

항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 상이한 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집을 시험관 내에서 혼합하고, 재조립하여 재조합 캡시드 융합 펩티드를 형성할 수 있 다. 본 발명의 하나의 측면에서, 항원 삽입체를 함유하는 바이러스 캡시드 단백질은 전장의 감염성 바이러스 핵산 게놈이 존재하지 않는 VLPs 내로 재조립된다. 전장의 감염성 바이러스 핵산은 세포에서 바이러스 복제에 필요한 모든 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 바이러스의 게놈 핵산이다. 이러한 요소들은 (i) 코딩 부위, (ii) 비-코딩 부위, 및 (iii) 조절 부위를 포함한다. 바이러스 게놈 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 비-코딩 부위는 바이러스 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치할 수 있거나, 코딩 부위 사이에 위치할 수 있다. 코딩 부위는 중복형이거나 비중복형일 수 있으며, 다중관능성일 수 있다. 비-코딩 및 코딩 부위, 양자 모두는 조절 작용을 가질 수 있고, 조절 요소, 예로서, 바이러스 복제, 번역, 또는 캡시드로 둘러싸는 것, 및 입자 형성에 필요한 서열을 함유할 수 있다.

추가의 실시태양에서, VLP는 바이러스 RNA의 존재하에 재조립될 수 있다. 또다른 실시태양에서, VLP는 바이러스 핵산의 부재하에 재조립될 수 있다. 또다른 실시태양에서, VLP는 비-바이러스 핵산의 존재하에 재조립될 수 있다. 또다른 실시태양에서, VLP는 면역자극성 핵산 서열, 예로서, CpG 서열의 존재하에 재조립될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에서, 상이한 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집들의 분리형 군집들을 시험관 내에서 혼합하고, 다가 바이러스 유사 입자 내로 조립할 수 있다. 각각의 분리형 군집들은 그와 혼합되는 임의의 다른 재조합 캡시드 융합 펩티드에는 존재하지 않는 항원성 펩티드 삽입체를 적어도 하나 함유한다.

하나의 실시태양에서, 재조합 캡시드 융합체를 동일한 비율, 예를 들면, 1:1, 1:1:1의 비율로 혼합한다. 또다른 실시태양에서, 재조합 캡시드 융합체를 상이한 비율, 예를 들면 1:2, 1:3, 1:2:1, 2:1:3:1의 비율로 혼합한다. 혼합물내 포함되어 있는, 항원 삽입체를 함유하는 상이한 유형의 캡시드 융합 펩티드의 갯수에 의해 비율을 결정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 재조합 캡시드 융합 펩티드의 혼합물은 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 단백질, 및 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 제2 바이러스 캡시드 단백질을 함유하되, 제2 캡시드 융합 펩티드의 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체는 제1 캡시드 융합 펩티드의 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체와 상이한 항원성 펩티드 서열, 또는 상이한 병원체로부터 유래된 것이다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 항원성 펩티드로부터의 삽입체를 함유하는, 적어도 2개의 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집을 혼합하되, 여기에서, 각각의 군집은 그와 혼합되는 캡시드 융합 펩티드에 존재하지 않는 항원성 펩티드 삽입체를 적어도 하나 함유한다. 항원성 펩티드 삽입체는 동일하거나 상이한 병원체로부터의 것일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 20개 이상의 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집을 혼합하되, 여기에서, 각각의 군집은 그와 혼합되는 임의의 다른 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집에는 존재하지 않는 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 함유한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 비-항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 캡시드 단백질 또한 혼합물에 포함될 수 있다. 그러한 비-항원성 펩티드 삽입체로는 표적화 펩티드, 면역 시스템 조절자로서의 역할을 하는 펩티 드, 예로서, 사이토카인 및 케모카인, 및 합성 수단으로부터 유도된 애주번트로서의 역할을 하는 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, VLPs에 함유되어 있는 항원성 펩티드 삽입체에 대한 면역 반응을 증진시키는데 유용할 수 있는, 예로서, 면역자극성 서열과 같은 비-바이러스 핵산 서열이 혼합물에 첨가될 수 있다. 면역자극성 핵산, 예로서, CpG 서열은 미생물 DNA에 대한 선천 면역 반응을 모사하는 단쇄 올리고뉴클레오티드이다. CpGs는 메틸화되지 않는 하나 이상의 시토신-포스페이트-구아닌 (CpG) 디뉴클레오티드-함유 모티프를 함유한다. 세균 DNA에서는 보편적이지만, 포유동물의 DNA에서는 보편적이지 않은, 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 DNA가 시험관내 또는 생체내, 양자 모두에서 강항 TH1-극성을 나타내는 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 하나의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, TH1 반응을 유도한다는 것은 CpG를 함유하는 면역자극성 서열 (CpG 올리고데옥시뉴클레오티드)이 대식세포 및 가지세포에 의한 IL-12 및 IL-18의 활성화 및 분비를 유도화시키는 능력의 결과인 것으로 간주된다. 이어서, 이러한 사이토카인은 자연살세포 및 T 세포에 의한 IFN-감마 생산을 유도하는 것을 상승시킨다. 또한, CpGs는 미성숙 가지 세포를 항원-반응성의 천연 T 세포를 활성화시킬 수 있는 전문적인 항원-제시 세포로 성숙하게 한다. CpGs는 또한 직접 B 림프구를 작동시켜 면역글루불린 생산을 증식시키고 일으킬 수 있다.

하나의 실시태양에서, 재조립된 VLP는 식 5'-R¹R²CGY¹Y²-3' (서열 번호: 19) (여기에서, R¹은 푸린 (바람직하게는, G)이고, R²는 푸린 또는 T이고, Y¹ 및 Y²는 피리미딘이다)을 따르는 회문식 헥사머내에 메틸화되지 않은 CpG 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, VLP는 5'-GACGTC-3' (서열 번호: 20), 5'-AGCGCT-3' (서열 번호: 21), 및 5'-AACGTT-3' (서열 번호: 22), 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 CpG 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, VLP는 5' TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT 3' (서열 번호: 23)을 포함하는 CpG 서열을 포함한다. 또다른 실시태양에서, CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 AACGTTCG (서열 번호: 24)이다.

상기 기술한 바와 같이, 혼합된 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집을 재조립함에 따라 형성된 생성 바이러스 유사 입자, 또는 케이지 구조체는 적어도 혼합된 군집과 동일한 갯수의 상이한 항원성 펩티드를 함유한다. 예를 들면, 2개의 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집이 혼합되되, 각각의 군집은 다른 군집에는 존재하지 않는 항원성 펩티드를 적어도 하나 함유할 경우, 이때 생성된 바이러스 유사 입자는 적어도 2개의 상이한 항원성 펩티드 삽입체를 함유할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면에서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 분리형의 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집은 시험관 내에서 혼합되어 VLPs를 형성하는데, 여기에서, 혼합되는 각각의 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집은 그와 함께 혼합되는 임의의 다른 재조합 캡시드 융합 펩티드와는 상이한 바이러스로부터 유래된 적어도 하나의 캡시드 단백질을 함유한다. 다른 실시태양에서, 재조합 캡시드 융합 펩티드의 혼합물은 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 적 어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 단백질, 및 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 제2 바이러스 캡시드 단백질을 함유할 수 있는데, 여기에서, 제1 바이러스 캡시드 단백질의 캡시드 단백질은 제2 바이러스 캡시드 단백질의 캡시드 단백질과는 상이한 바이러스로부터 유래된 것이다. 다른 실시태양에서, 항원성 펩티드 삽입체는 동일하거나 상이한 펩티드 서열일 수 있다. 또다른 추가의 실시태양에서, 항원성 펩티드 삽입체는 동일하거나 상이한 병원체일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 20개 이상의 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집이 혼합되되, 여기에서, 각각의 군집들은 그와 함께 혼합되는 임의의 다른 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집에는 존재하지 않는, 유래되어진 바이러스 캡시드 단백질을 함유한다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 상기 기술한 바와 같이, 비-항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 캡시드 단백질이 혼합물에 포함될 수 있다. 또한, VLPs에 함유되어 있는 항원성 펩티드 삽입체에 대한 면역 반응을 증진시키는데 유용할 수 있는, 비-바이러스 핵산 서열, 예로서, CpG 서열이 혼합물에 첨가될 수 있다.

본 발명의 실시태양은 펩티드 삽입체를 함유하지 않는 캡시드 융합 단백질 (야생형 캡시드 단백질) 또한 상기 기술한 혼합물에 첨가될 수 있는 것을 포함한다. 야생형 바이러스 캡시드 단백질은 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 캡시드 융합 펩티드를 유래시키기 위하여 사용되는 것과 동일하거나 상이한 바이러스를 비롯한, 임의의 바이러스로부터 유래될 수 있다.

캡시드 융합 펩티드의 재조립을 통해 바이러스 유사 입자 또는 케이지 구조 체를 생산할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, VLP 또는 케이지 구조체는 3개 내지 약 1000개 이상의 캡시드를 비롯한, 혼합된 캡시드의 다량체성 조립체를 포함한다. 다른 실시태양에서, VLP 또는 케이지 구조체는 적어도 30개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 90개, 적어도 120개의 캡시드, 또는 적어도 200개의 캡시드를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 각각의 VLP 또는 케이지 구조체는 적어도 150개의 캡시드, 적어도 160개, 적어도 170개, 또는 적어도 180개의 캡시드를 포함한다.

본 발명의 실시태양은 VLP가 정20면체 구조체로서 재조립될 수 있는 것을 포함한다. 또다른 실시태양에서, VLP는 캡시드 서열이 유래된 천연 바이러스와 동일한 구조로 재조립된다. 그러나, 별도의 실시태양에서, VLP는 천연 바이러스와 일치하는 구조를 갖지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 예를 들면, 상기 구조체는 다중의 캡시드로 형성된 입자로 생산되지만, 천연-유형의 VLP 구조체를 형성하지는 않는다. 예를 들면, 단지 3개의 바이러스 캡시드만으로도 케이지 구조체가 형성될 수 있다. 별도의 실시태양에서, 약 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 또는 60개의 캡시드의 케이지 구조체가 형성될 수 있다.

몇몇 측면에서, 본 발명은 혼합 단계에서 재조립된 VLP에 함유되는 항원성 펩티드 삽입체의 비율을 조절하고 지시하는 능력을 제공한다. 조립에 앞서 혼합물에 첨가되는 양을 통해 VLP에 함유되는 항원성 펩티드 삽입체의 비율이 조절될 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명을 통해 재조립된 VLP에 함유되는 몇몇 항원성 펩티드의 양을 VLP를 생체 내에서 조립하였을 때 수득될 수 있는 것보다 더욱 엄격하 게 조정하고 조절할 수 있다. 예를 들면, 그러한 조절은, 동물에서 1차 접종물로서 사용되는 하나의 항원 펩티드, 및 사전에 항원성 펩티드가 동물에서 접종물로 사용되었기 때문에 "부스터(booster)"로서 사용되는 제2 항원성 펩티드를 함유하는 VLP를 사용하는 백신 전략법에 유용할 수 있다. 이러한 경우, 예를 들면, "부스터" 항원성 펩티드는 다른 항원성 펩티드보다 소량으로 존재할 수 있고, "부스터" 항원성 펩티드를 함유하는 재조합 캡시드 융합 펩티드 군집은 현 방법을 사용하여 다른 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 군집보다 소량으로 혼합물에 첨가될 수 있다. 다른 실시태양에서, 적어도 하나의 재조립된 VLP 구조체는 혼합물에 첨가되는 각 군집으로부터의 적어도 하나의 캡시드 융합 펩티드를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 재조립된 VLP 구조체는 혼합물에 첨가되는 각 군집으로부터의 각각의 캡시드 융합 펩티드를 대략 동일한 비율로 포함한다. 별법으로, 상기 비율은 원하는 바와 같이 조절될 수 있되, 여기에서, 혼합물과는 반비례한다.

바이러스 유사 입자 조립체는 정확하게 폴딩된 캡시드 단백질을 필요로 한다. 그러나, VLP 제형화 및 안정성에 유의적인 추가의 인자가 존재할 수 있고, 특히, pH, 이온강도, 이황화 결합, 2가 양이온 결합을 포함한다. 예를 들면, (문헌 [Brady et al, (1977) "Dissociation of polyoma virus by the chelation of calcium ions found associated with purified virions," J. Virol. 23(3):717-724]; [Gajardo et al, (1997) "Two proline residues are essential in the calcium binding activity of rotavirus VP7 outer capsid protein," J. Virol., 71:2211-2216]; [Walter et al, (1975) "Intermolecular disulfide bonds: an important structural feature of the polyoma virus capsid," Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39:255-257 (1975)]; [Christansen et al, (1977) "Characterization of components released by alkali disruption of simian virus 40," J Virol., 21:1079-1084]; [Salunke et al, (1986) "Self-assembly of purified polyomavirus capsid protein VP1," Cell 46:895-904]; [Salunke et al, (1989) "Polymorphism in the assembly of polyomavirus capsid protein VP," Biophys. J., 56:887- 900]; [Garcea et al, (1983) "Host range transforming gene of polyoma virus plays a role in virus assembly," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3613-3617]; [Xi et al, (1991) "Baculovirus expression of the human papillomavirus type 16 capsid proteins: detection of L1-L2 protein complexes," J. Gen. Virol., 72:2981-2988])을 참조한다. 재조립을 위해 사용될 수 있는 기법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 실시예에 기술되어 있는 기법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

캡시드 융합 펩티드의 재조립을 통해 바이러스 유사 입자 또는 케이지 구조체를 생산한다. 다른 실시태양에서, VLP 또는 케이지 구조체는 3개 내지 약 1000개 이상의 캡시드를 포함하는, 혼합된 캡시드 융합 펩티드의 다량체성 조립체이다. 추가의 실시태양에서, VLP 또는 케이지 구조체는 적어도 30개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 90개, 적어도 120개 캡시드, 또는 적어도 200개 캡시드를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 각각의 VLP 또는 케이지 구조체는 적어도 150개 캡시드, 적어도 160개, 적어도 170개, 또는 적어도 180개의 캡시드를 포함한다.

본 발명의 실시태양은 VLP가 정20면체 구조체로서 재조립된 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, VLP는 캡시드 서열이 유래된 천연 바이러스와 동일한 구조로 재조립될 수 있다. 추가의 실시태양에서, VLP는 천연 바이러스와 일치하는 구조를 갖지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 예를 들면, 상기 구조체는 다중의 캡시드로 형성된 입자로 생산되지만, 천연-유형의 VLP 구조체를 형성하지는 않는다. 예를 들면, 단지 3개의 바이러스 캡시드만으로도 케이지 구조체가 형성될 수 있다. 별도의 실시태양에서, 약 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 또는 60개의 캡시드의 케이지 구조체가 형성될 수 있다.

VII. 백신화

본 발명의 몇몇 측면에서, 재조립된 다가 VLPs는 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하기 위한 전략법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 실시태양은 캡시드 융합 펩티드에 사용되는 바이러스 캡시드 단백질이 CCMV 바이러스인 것을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, VLPs에 함유된 항원 삽입체는 바실루스 안트라시스로부터의 "보호성 항원", 또는 별법으로, 동부 말 뇌염 바이러스의 E2 당단백질을 포함한다.

일반적으로, 면역 반응을 유도하는데 충분한 유효량의 VLP를 동물 또는 인간에게 투여한다. 상기 반응을 유도하기 위하여 투여되는 양은 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 기법을 통해 결정될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 투여되는 VLP의 양은 개별적으로 동물 1마리당 또는 인간 1명당 10 내지 500㎍인 것이 유리하다. 투여되는 VLP의 양은 투여 경로 및 개체의 체중에 대한 함수로서 달라질 수 있다.

VLP를 함유하는 백신은 약제학적으로 허용가능한 담체를 통해 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 약제를 제형화하는데 유용한, 당업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있는 임의의 생리학적 담체일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 약제학적 담체는 액상일 수 있고, VLP를 함유하는 백신은 용액의 형태일 것이다. 추가의 실시태양에서, 약제학적 담체는 겔이고, VLP를 함유하는 백신은 좌제 또는 크림제 형태이다. 또다른 추가의 실시태양에서, VLP를 함유하는 백신은 약제학적으로 허용가능한 경피용 패치제의 일부로서 제형화될 수 있다.

액상 담체는 액제, 현탁제, 유제, 시럽제, 엘릭시르제 및 가압식 조성물 제조시 사용된다. VLP는 약제학적으로 허용가능한 액상 담체, 예로서, 물, 유기 용매, 상기 양자 모두의 혼합물 또는 약제학적으로 허용가능한 오일 또는 지방에 현탁될 수 있다. 액상 담체는 다른 적합한약제학적 첨가제, 예로서, 가용화제, 유화제, 완충액, 보존제, 감미제, 향미제, 현탁제, 증점제, 착색제, 점성 조절제, 안정화제 또는 삼투압-조절제를 함유할 수 있다. 경구용 및 비경구용 투여를 위한 액상 담체로서 적합한 일례로는 물 (부분적으로는 상기와 같은 첨가제, 셀룰로오스 유도체, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 용액 함유), 알코올 (1가 알코올 및 다가 알코올, 예로서, 글리콜 포함) 및 그의 유도체, 및 오일 (예로서, 분별 코코넛유 및 낙화생유)를 포함한다. 비경구 투여를 위한 담체로는 또한 오일성 에스테르, 예로서, 에틸 올레이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액상 담체가 경구 투여용의 멸균 액상형 조성물에 유용하다. 가압식 조성물을 위한 액상 담체는 할로겐화된 탄화수소 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 추진제일 수 있다. 일반적으로 액상 담체는 재조립된 VLP의 폴딩을 방해하지 않는다.

VLP를 함유하는 백신은 당업계에서 현재 사용되고 있는 임의의 기법을 사용하여 투여될 수 있는데, 이는 예를 들면, 경구, 점막, 정맥내, 근육내, 수막강내, 경막외, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, VLP는 코 또는 임을 통해 점막으로 전달된다. 다른 실시태양에서, 재조립된 VLP는 CCMV로부터 유래된 캡시드 단백질로 구성되고, 점막으로 전달된다.

본 실시예에서 동부 퇴록얼룩무늬 바이러스 (CCMV)를 펩티드 운반체로서 사용하였고, 슈도모나스 플루오레센스는 발현 숙주로서 사용하였다. CCMV는 브로모비리대의 브로모바이러스 군의 구성원이다. 브로모바이러스는 4개의 성분의 (+) 센스 단일-가닥 RNA 게놈을 갖는 25 내지 28nm 직경의 정20면체 바이러스이다. RNA1 및 RNA2는 리플리카제 효소를 코딩한다. RNA3은 식물 숙주 내의 바이러스 이동에 관여하는 펩티드를 코딩한다. RNA4 (RNA3으로부터 유래된 서브게놈 RNA), 즉, sgRNA4는 20kDa의 캡시드 단백질 (CP) (서열번호: 1)을 코딩한다.

각각의 CCMV 입자는 CCMV CP의 카피를 약 180개까지 함유한다. CCMV CP를 코딩하는 예시적인 DNA 서열을 서열번호: 2에 나타내었다.

CCMV의 결정 구조가 밝혀졌다. 이 구조는 입자 안정성 및 역학 관계에 중요한 것으로 보이는 코트 단백질 상호작용을 보다 명확하게 묘사하며, 삽입 부위의 이론적인 설계를 결정하는데 도움이 되어왔다. 이전의 연구들이 CCMV 코트 단백질이 유전자적으로 변형되어 입자를 형성하는 이들의 능력은 방해받지 않으면서 이종 펩티드를 운반할 수 있다는 것을 입증하였다.

CCMV CP에서의 단일 삽입 부위를 사용하는 경우, 이종 펩티드 단위 (개별 펩티드 또는 직렬연쇄체 중 어느 것이든 상관 없다)의 카피를 총 약 180개까지 CCMV 입자 내로 삽입할 수 있다고 판단되었다. 현재까지, CCMV CP 내에 확인된 삽입 부위는 길이가 다양한 펩티드를 수용할 수 있다. 또한, 상기 펩티드의 다량체 형태를 삽입 부위 내로 삽입할 수 있다. 게다가, 다중 삽입 부위를 동시에 사용하여 동일하거나 상이한 펩티드를 동일한 입자 내/상에 발현시킬 수 있다. 펩티드 삽입체의 길이는 아미노산 잔기 약 200개 이하, 더욱 전형적으로는 약 180개 이하, 보다 더욱 전형적으로는 약 150개 이하, 또한 보다 더욱 전형적으로는 약 120개 이하, 더욱 보다 더 전형적으로는 약 100개 이하일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 펩티드 삽입체의 길이는 아미노산 잔기 약 5개 이상일 것이다. 다른 실시태양에서, 펩티드 삽입체의 길이는 아미노산 잔기 약 5 내지 약 200개, 약 5 내지 약 150개, 약 5 내지 약 120개, 더욱 전형적으로는 약 5 내지 약 100개일 것이다.

재료 및 방법

달리 언급하지 않는 한, 분자 생물학 분야에서 공지된 표준 기법, 벡터, 조절 서열 요소, 및 그 밖의 발현 시스템 요소를 핵산 조작, 형질전환 및 발현을 위해 사용하였다. 이러한 표준 기법, 벡터 및 요소는 예를 들면, (문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley ＆ Sons)]; [Sambrook, Fritsch, ＆ Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)]; [Berger ＆ Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press)]; 및 [Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements , Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)])에서 찾을 수 있다.

플라스미드 맵 제작

모든 플라스미드 맵을 VECTORNTI (미국 메릴랜드주 프레더릭에 소재하는 이포르맥스 인코포레이티드(InforMax Inc.))를 사용하여 제작하였다.

DNA 추출

E. 콜라이로부터의 모든 플라스미드 DNA 추출은 퀴아젠(Qiagen)(독일 소재)으로부터의 미니, 미디 및 맥시 키트를 제조사 지침에 따라 사용하여 수행하였다.

실험 전략

하기의 절차를 수행하였다. P. 플루오레센스 숙주 세포를 키메라 바이러스 코트 단백질-표적 펩티드 삽입체 융합체를 코딩하는 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 원하는 농도로 증식시키고, 키메라 바이러스 코트 단백질-펩티드 융합체 발현을 유도하였다. 이어서, 세포를 용해시키고, 이들의 함유물을 분석하였다.

실시예 1 - 펩티드 합성 및 CCMV CP 내로의 클로닝

1. A. 보호성 항원 클로닝

4개의 상이한 바실루스 안트라시스 보호성 항원 ("PA") 펩티드 (PA1-PA4)를 CCMV VLP 중에서 독립적으로 발현시켰다. PA1-PA4를 코딩하는 핵산은 합성 올리고뉴클레오티드의 SOE (중첩 연장에 의한 스플라이싱: splicing-by- overlapextension)에 의해 합성하였다. 하기 상술하는 열순환 프로그램을 사용하여 중첩 DNA 올리고에 의해 각각의 삽입체를 합성하였다:

PCR 프로토콜
반응 믹스 (총 부피 100㎕)		열순환 단계
10㎕	1OX PT HFI 완충액^*	단계 1	1회	2분	94℃
4㎕	5OmM MgSO₄ ^*	단계 2	35회	30초	94℃
2㎕	1OmM dNTPs^*			30초	55℃
0.25ng	각각의 프라이머			1분	68℃
1-5ng	주형 DNA	단계 3	1회	10분	70℃
1㎕	PT HIFI Taq DNA 폴리머라제^*	단계 4	1회	유지	4℃
잔량	증류된 탈이온 H₂O(ddH₂O)
(*미국 캘리포니아주 칼즈배드에 소재하는 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.), 이하 "인비트로겐"으로부터 입수함)

생성된 핵산은 BamHI 인식 말단부를 함유하였다. 이들 PA 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 이의 아미노산 서열은 각각 하기와 같다: 1) PA1은 서열 번호: 3 및 4; 2) PA2는 서열 번호: 5 및 6; 3) PA3은 서열 번호: 7 및 8; 및 4) PA4는 서열 번호: 9 및 10. 생성된 핵산을 BamHI로 분해하여 셔틀 벡터로 클로닝하기 위한 부착 말단을 제작하였다. 각각의 생성된 PA 삽입체를 CCMV129 CDS의 BamHI 부위에서 pESC-CCMV129 BamHI 셔틀 플라스미드 내에 클로닝하였다. 각각의 생성된 셔틀 플라스미드를 SpeI 및 XhoI 제한효소로 분해하였다. 각각의 원하는 키메라 CCMV129-PA-코딩 단편을 겔 정제에 의해 단리시켰다.

이어서, 생성된 키메라 CCMV129-PA 폴리뉴클레오티드를 각각 tac 프로모터에 작동가능하도록 부착하여 부이부이 코딩 서열 대신에 pMYC1803 발현 플라스미드 내로 삽입하였다. 삽입체의 존재를 확인하기 위해, 생성된 발현 플라스미드를 SpeI 및 XhoI을 사용하는 제한효소 분해로 스크리닝하였다.

1. B. 동부 말 뇌염의 E2 당단백질

2개의 상이한 EEE 펩티드 (EEE-1-25 및 EEE-238-262)를 CCMV VLPs에서 독립적으로 발현시켰는데, 이는 동부 말 뇌염 바이러스의 E2 당단백질의 25 AA 펩티드를 나타내었다.

EEE -1-25 펩티드 서열:

EEE -1-25 핵산 서열:

EEE -238-262 펩티드 서열:

EEE -238-262 핵산 서열:

EEE-1-25 및 EEE-238-262를 코딩하는 핵산을 합성 올리고뉴클레오티드의 SOE에 의해 합성하였다. 생성된 핵산은 BamHI 인식 말단부를 함유하였다. 삽입체 합성을 위한 센스 및 안티-센스 올리고뉴클레오티드 프라이머는 BamHI 제한효소 부위를 포함하였고, 이는 하기와 같았다:

생성된 핵산을 BamHI로 분해하여 pESC-CCMV129BamHI 셔틀 플라스미드 내로 클로닝하기 위한 부착 말단을 제작하였다.

각각의 생성된 EEE 삽입체를 CCMV129 CDS의 BamHI 부위에서 pESC-CCMV129 BamHI 셔틀 플라스미드 내에 클로닝하였다. 각각의 생성된 셔틀 플라스미드를 SpeI 및 XhoI 제한효소로 분해하였다. 각각의 원하는 키메라 CCMV129-EEE-코딩 단편을 겔 정제에 의해 단리하였다.

이어서, 생성된 키메라 CCMV129-EEE 폴리뉴클레오티드 단편을 각각 tac 프로모터에 작동가능하도록 부착하여 부이부이 코딩 서열 대신에 SpeI 및 XhoI로 제한된 pMYC1803 발현 플라스미드 내로 삽입하였다. 삽입체의 존재를 확인하기 위해, 생성된 발현 플라스미드를 SpeI 및 XhoI을 사용하는 제한효소 분해로 스크리닝하였다.

실시예 2 - 재조합 CCMV 캡시드 융합 펩티드의 발현

CCMV129 융합 펩티드 발현 플라스미드를 하기 프로토콜에 따라 슈도모나스 플루오레센스 MB214 숙주 세포 내로 형질전환시켰다. 숙주 세포를 얼음 상에서 유지된 바이알에서 점차적으로 해동시켰다. 각각의 형질전환을 위해, 정제된 발현 플라스미드 DNA 1㎕를 숙주 세포에 첨가하고, 생성된 혼합물을 피펫 팁으로 서서히 저어 혼합한 후, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물을 전기영동 일회용 큐벳 (바이오라드 진 펄서 큐벳(BioRad Gene Pulser Cuvette), 0.2cm 전극 갭, 카탈로그 번호 165-2086)으로 옮겼다. 큐벳을 바이오라드 진 펄서 프리-셋 중으로 200옴, 25μ파라드, 2.25kV로 놓았다. 세포는 간단하게 전류를 흐르게 하였다 (약 1 내지 2초). 냉 LB 배지를 즉시 첨가하고, 생성된 현탁액을 2시간 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 LB tet15 (테트라사이클린-보충된 LB 배지) 아가 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새도록 증식시켰다.

각각의 플레이트로부터 1개의 콜로니를 채취하고, 채취한 샘플을 배플된 진탕 플라스크 중의 50mL LB 시드 배양액으로 접종하였다. 액상 현탁 배양물을 250rpm으로 진탕하면서 30℃에서 밤새도록 증식시켰다. 이어서, 각각의 생성된 시드 배양물 10mL를 사용하여 1리터의 배플된 진탕 플라스크 중의 진탕-플라스크 배지 (즉, 미량 원소, 시트르산 나트륨 및 글리세롤을 함유한 효모 추출액 및 염 (pH 6.8)) 200mL에 접종하였다. 테트라사이클린을 선택을 위해 첨가하였다. 접종된 배양물을 250rpm으로 진탕하면서 30℃에서 밤새도록 증식시키고, CCMV129-PD1 키메라 코트 단백질의 발현을 IPTG로 유도하였다. 이어서, 각각의 진탕-플라스크 배양물로부터의 1mL 분취액을 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 2mM EDTA를 함유하는 냉 50mM Tris-HCl (pH 8.2) 0.75mL 중에 재현탁시켰다. 이어서, 10％ TritonX-100 세제 0.1％ 부피를 첨가한 후, 최종 농도가 0.2mg/mL가 되도록 리소자임을 첨가하였다. 이어서, 세포를 얼음 상에서 2시간 동안 인큐베이션시켰는데, 이 시점에서 투명하고 점성인 세포 용해액이 나타나야 했다.

용해물에 1M MgCl₂ 1/200 부피를 첨가한 후, 2mg/mL DNAseI 1/200 부피를 첨가한 다음, 1시간 동안 얼음상에서 인큐베이션시키자, 용해물은 점성이 매우 덜한 액체가 되었다. 처리된 용해물을 테이블탑 원심분리기에서 최대 속도로 4℃에서 30분 동안 회전시키고, 상등액을 깨끗한 튜브로 경사분리하였다. 경사분리한 상등 액은 "가용성" 펩티드 분획이었다. 이어서, 나머지 펠릿을 0.75mL TE 완충액 (10mM Tris-Cl, pH 7.5, 1mM EDTA) 중에 재현탁시켰다. 재현탁된 펠릿은 "불용성" 분획이었다.

이어서, 이들 "가용성" 및 "불용성" 분획을 1.0mm x 15 웰을 갖는 NuPAGE 4 내지 12％ Bis-Tris 겔 (인비트로겐으로부터 입수, 카탈로그 번호 NP0323) 상에서 제조사의 설명에 따라 전기영동하였다. 5ul의 각 분획을 5ul의 2X 환원 SDS-PAGE 로딩 완충액과 배합하고, 겔 상에서 전개시키기 전에 5분 동안 끓였다. 겔을 심플리블루 세이프 스테인(SimplyBlue Safe Stain) (인비트로겐으로부터 입수, 카탈로그 번호 LC6060)으로 염색하고, 물로 밤새도록 탈염하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 CCMV IgG (독일에 소재하는 DSMZ로부터 등록 번호 AS0011) 및 웨스턴 브리즈(WESTERN BREEZE) 키트 (인비트로겐으로부터 입수, 카탈로그 번호 WB7105)를 사용하여 웨스텐 블롯 검출을 수행하였다.

도 1은 불용성 분획중 PA1, PA2, PA3, 및 PA4 펩티드 삽입체를 발현시키기 위해서 조작된 재조합 CCMV 캡시드 단백질의 발현을 나타낸다. 재조합 캡시드 융합 펩티드는 화살표로 표시한다. 도 2는 가용성 분획중 PA1, PA2, PA3, 및 PA4 펩티드 삽입체를 발현시키기 위해서 조작된 재조합 CCMV 융합 펩티드의 발현을 나타낸다.

실시예 3 - VLP 재조립

3.A. RNA 를 포함하지 않는 VLP 재조립:

바이러스-양 입자를 조립하기 위하여 재조합 캡시드 융합 펩티드를 발현시키 는 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포 배양물 50ml를 프렌츠 프레스하고, 가용성 및 불용성 분획을 원심분리에 의해 분리하였다. 불용성 봉입체를 2회에 걸쳐 세척하였다. 가용성 및 불용성 분획으로부터 샘플을 취하고, -80℃에서 저장하였다. 불용성 분획을 4℃에서 밤새도록 8M 우레아를 함유하는 완충액 B (5OmM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 1mM DTT)에 재현탁시켰다. 이어서, 완충액 B를 사용하여 0.25M의 증분값으로 8M 우레아 용액을 희석시켜 우레아의 최종 농도가 2.0M이 되도록 하였다. 폴리에틸렌이민 (PEI)을 0.033%의 최종 농도로 첨가하고, 상기 용액을 10분동안 빙상에서 인큐베이션시켰다. 상등액은 완충액 B (완충액 3회 교환)에 대하여 투석시켜 밤새 우레아를 완전히 제거하였다. 상등액을 27,000xg에서 30분 동안 원심분리하였다.

재조합 CCMV 캡시드 융합 펩티드의 최종 수율을 측정하기 위하여 유리 캡시드 단백질에 대한 흡광 계수 1.20을 사용하여 280nm에서의 흡광도에 의해 상등액을 분석하여 용액중 캡시드 융합 단백질의 양을 정량하였다.

10uM의 캡시드 융합 펩티드 용액을 완충액 B (4ml당 1mg의 캡시드 융합 펩티드 사용)중에서 2시간 동안 4℃에서 앰티 어셈블리(Empty Assembly) 완충액 (5OmM 아세트산 나트륨 pH 5.2, 1M NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT)에 대하여 투석시켰다. 조립된 입자를 센트리콘(Centricon)-100 미세농축기를 사용하여 앰티 어셈블리 완충액으로 세척하였다. 조립된 VLP를 함유하는 샘플 보유액은 280nm에서의 흡광도에 의해 측정하여 VLP 수율을 측정하였다. 샘플 일부를 수크로스 구배상에 로딩하여 VLP 조립체를 측정하고, 남아있는 분량은 바이러스 완충액 (0.1M 아세트산 나트륨, pH.5.2)에서 농축시키고 SDS-PAGE 상에서 전개시켰다.

3.B RNA 를 포함하는 VLP 조립:

바이러스-양 입자를 조립하기 위하여 재조합 캡시드 융합 펩티드를 발현시키는 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포 배양물 50ml를 프렌츠 프레스하고, 가용성 및 불용성 분획을 원심분리에 의해 분리하였다. 불용성 봉입체를 2회에 걸쳐 세척하였다. 가용성 및 불용성 분획으로부터 샘플을 취하고, -80℃에서 저장하였다. 불용성 분획을 4℃에서 밤새도록 8M 우레아를 함유하는 완충액 B (5OmM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 1mM DTT)에 재현탁시켰다. 이어서, 완충액 B를 사용하여 0.25M의 증분값으로 8M 우레아 용액을 희석시켜 우레아의 최종 농도가 2.0M이 되도록 하였다. 폴리에틸렌이민 (PEI)을 0.033%의 최종 농도로 첨가하고, 상기 용액을 10분동안 빙상에서 인큐베이션시켰다. 상등액을 27,000xg에서 30분 동안 원심분리하였다. 상등액은 완충액 B (완충액 3회 교환)에 대하여 투석시켜 밤새 우레아를 완전히 제거하였다.

재조합 CCMV 캡시드 융합 펩티드의 최종 수율을 측정하기 위하여 유리 캡시드 단백질에 대한 흡광 계수 1.20을 사용하여 280nm에서의 흡광도에 의해 상등액을 분석하여 용액중 캡시드 융합 단백질의 양을 정량하였다. 조립을 위해 사용된 캡시드 융합 펩티드 대 CCMV RNA의 중량 대 중량 비율은 5:1이었다. RNA 공급원은 시험관 내에서 전사된 CCMV RNA1, RNA2, RNA3, 또는 서브게놈 RNA4 또는 그의 임의 부분이었다. 별법으로, CCMV로 감염된 식물로부터 단리된 CCMV 바이러스 RNA 또는 시험관내 또는 생체 내에서 보로모 모자이크 바이러스RNA가 사용될 수 있다. 별법 으로, 유기체, 식물 또는 슈도모나스 플루오레센스로부터 단리된 랜덤 mRNA를 사용할 수 있다. 캡시드 융합 펩티드의 농도는 10uM (4ml중 1mg)이었다. 10uM의 캡시드 융합 펩티드 및 RNA 용액을 2 내지 12시간 동안 4℃에서 조립 완충액 (5OmM Tris-HCl pH 7.2, 5OmM NaCl, 1OmM KCl, 5mM MgCl₂, 1mM DTT)에 대하여 투석시켰다. 생성된 조립된 입자를 센트리콘-100 미세농축기를 사용하여 앰티 어셈블리 완충액으로 세척하였다. 샘플 보유액중 일부를 취하고, 280nm에서의 흡광도에 의해 측정하여 VLP 수율을 측정하였다. 샘플 일부를 수크로스 구배상에 로딩하여 VLP 조립체를 측정하고, 남아있는 분량은 바이러스 완충액 (0.1M 아세트산 나트륨, pH.5.2)에서 농축시키고 SDS-PAGE상에서 전개시켰다.

도 3은 수크로스 밀도 구배에서의 RNA를 포함하는 CCMV-PA3 VLPs 또는 RNA를 포함하지 않는 CCMV-PA3 VLPs의 분리를 나타낸다. 도 4는 수크로스 밀도 구배로부터 단리된 RNA를 포함하는 CCMV-PA1 및 CCMV-PA2 VLP 밴드 및 RNA를 포함하지 않는 CCMV-PA1 및 CCMV-PA2 VLP 밴드의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 도 5는 RNA 부재하의 CCMV-PA4로부터 재조립된 VLPs의 전자 현미경 분석을 나타낸다.

실시예 4 - 다중 재조합 CCMV - 캡시드 융합 펩티드를 함유하는 VLPs의 재조립

동일하거나 상이한 병원체로부터의 항원성 펩티드를 함유하는 재조합 CCMV 캡시드 융합 펩티드 (실시예 1에 기술된 바와 같음)를 봉입체로서 슈도모나스 플루오레센스에서 생산할 수 있다. 봉입체를 단리시키고, 다양한 재조합 CCMV-캡시드 융합 펩티드를 가용화시키고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 리폴딩시켰다. 조립하 기 이전에 동일하거나 상이한 병원체로부터의 항원 삽입체를 함유하는 다양한 CCMV-캡시드 융합 펩티드 배합물을 다양한 비율로 혼합할 수 있다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 RNA의 존재하에 또는 부재하에 재조립 반응을 실시할 수 있다. 생성된 다가 VLPs는 상이한 항원 삽입체를 함유하는, 다중의 재조합 CCMV-캡시드 융합 펩티드 군집을 함유한다. 조립 반응에 앞서 혼합물에 첨가되는 상이한 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 재조합 CCMV-캡시드 융합 펩티드 군집 각각의 양을 조정함으로써 항원성 펩티드의 비율은 조정될 수 있다. 도 6은 보호성 항원-3 ("PA-3") 및 PA-4 항원성 펩티드를 함유하는 분리형 재조합 CCMV-캡시드 융합 펩티드로 구성된 다가 VLPs의 발현 및 재조립에 대한 도해이다.

실시예 5 - 식물에서의 CCMV 바이러스 입자 생산, 식물에서 생산된 CCMV 바이러스 입자의 분해, 및 식물 CCMV 캡시드 단백질의 VLPs 내로의 재조립

식물에서의 CCMV 바이러스 입자 생산: CCMV RNA1, RNA2, 및 RNA3의 칵테일 믹스를 사용하여 동부 식물을 감염시켰다. 동부 종자 동부 캘리포니아 블랙아이 #5 종자 (켄터기주에 소재하는 페리-모스 시드 코포레이션(Ferry-Morse Seed Co.))를 발아시키고, 미라클-그로 포팅 믹스 (오하이오주에 소재하는 미라클-그로 론 프로덕츠(Miracle-Gro Lawn Products))를 포함하는 6인치의 포트에 옮겨 심었다. 2번째 잎 단계 (발아 후 대략 7일)에서 동부 식물을 감염시켰다. 각 식물 잎사귀 하나에 카보런덤 분말 400그릿 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) 카탈로그 409-21-2)을 살포하였다. RNA 칵테일 믹스를 카보런덤층 상에 적용시켰다. 장갑을 끼고 손가락으로 부드럽게 문질러 잎들을 벗겨 냈다. 접종 후 7-14일째 감염은 확립되었다. 잎 조직을 수거하고, 추가의 공정시까지 -8O℃로 냉동시켰다. 잎 조직은 바이러스 완충액 (0.2M 아세트산 나트륨 pH 5.2; 1OmM EDTA.O)에서 혼화시켜 파쇄시켰다. 생성된 균질액을 3층의 치즈 보(cheese cloth)를 통해 압착시킨 후, 15분동안 15,00OxG 4℃에서 원심분리하였다. 생성된 상등액을 제거하였다. 각각의 상등액에 PEG8000을 최종 농도 10%로 첨가하고, 용액을 빙상에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 용액을 15,00OxG에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 이어서, 침전된 펠릿을 1/10의 초기 상등액 부피의 바이러스 완충액에 재현탁시키고, 재현탁된 샘플을 10분 동안 15,00OxG 4℃에서 원심분리하였다. 상등액을 회수하고, 2회에 걸쳐 PEG 침전시켰다. PEG8000를 최종 농도 15%에 가하고 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 15,00OxG에서 10분 동안 원심분리하고, 펠릿을 소량의 바이러스 완충액에 재현탁시켰다. 재현탁된 VLP 용액은 300K 분자량을 차단하는 센트리콘 플러스-20으로 로딩하고, 4,00OxG에서 5분 동안 회전시켰다.

이어서, 농축된 VLP 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 다클론성 항-CCMV 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅하였다. 별법으로, 바이러스 입자를 수크로스 구배 농도상에서 정제하였다. 정제된 바이러스 입자를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)-HPLC 에 의해 분석하였다 (도 8).

식물에서 생산된 CCMV 바이러스 입자의 분해: 정제된 CCMV를 16-29시간 동안 4℃에서 완충액 A (5OmM Tris HCl pH 7.5, 50OmM CaCl₂, 1mM DTT, 0.2mM PMSF)에 대 하여 투석에 의해 분해하였다. 분해된 바이러스를 14,000rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 바이러스 RNA를 펠릿화하였다. 남아있는 상등액은 2시간 동안 4℃에서 완충액 B (20OmM Tris HCl pH7.5, 1M NaCl, ImM DTT, 0.2mM PMSF)에 대하여 투석하였다. 추가로 FPLC 수퍼로스(Superose) 12 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된 캡시드 단백질 이량체로 CCMV가 분해되었다. 분해된 CCMV를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다 (도 8).

CCMV VLP의 조립: 4℃에서 밤새도록 정제된 이량체를 저염 조립 완충액 (10OmM 아세트산 나트륨 pH4.8, 10OmM NaCl, 0.2mM PMSF)에 대하여 투석시켜 CCMV VLPs를 조립시켰다. 재조립된 CCMV VLPs를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다 (도 8).

실시예 6 - 다양한 유기체에서 생산된 VLPs 의 분해 및 재조립.

동일하거나 상이한 병원체로부터의 다양한 항원 삽입체를 함유하는, 사전에 시험관내 또는 생체 내에서 조립된 CCMV 입자를 식물 및/또는 슈도모나스 플루오레센스에서 개별적으로 생산할 수 있다. 조립된 VLP 입자를 시험관 내에서 단리시키고 분해할 수 있다. 동일하거나 상이한 병원체로부터의 항원 삽입체를 함유하는, 생성된 CCMV-캡시드 융합 펩티드를 미리 결정된 비율로 혼합한 후, 실시예 3에 기술된 바와 같이 RNA의 존재 또는 부재하에서 재조립할 수 있다. 생성된 다가 VLPs는 분리형 재조합 CCMV-캡시드 융합 펩티드로 구성되고, 다가의 삽입체를 함유한다. 조립 반응에 앞서 혼합물에 첨가되는 상이한 항원성 펩티드 삽입체를 함유하는 각각의 재조합 CCMV-캡시드 융합 펩티드 군집의 양을 조정함으로써 항원성 펩티드의 비율은 조정될 수 있다. 야생형 캡시드 단백질 또한 조립에 앞서 재조립 혼 합물에 첨가할 수 있다.

실시예 7 - CpG 존재하에서의 VLP 재조립

조립 반응은 도 7에 나타낸 바와 같이 CpG의 존재하에서 실시할 수 있다. 생성된 다가 VLPs는 분리형 재조합 CCMV-캡시드 융합 펩티드로 구성되었고, 이는 다중 삽입체를 함유하고, 추가로 입자 내부의 CpG를 캡슐화한다. CpGs는 점막 애주번트로서의 역할을 하고, 공-투여된 항원에 대하여 Th1 면역 반응을 유도할 수 있다. VLPs로 CpG 서열을 캡슐화하는 것이 갖는 잇점으로는 보다 낮은 투여 요건, CpG 공-투여와 관련된 부작용의 감소, 및 CpG 및 VLP의 안정성 증가를 포함할 수 있다. 도 7은 조립 반응시 CpGs를 VLPs 내로 패킹하는 것을 나타낸다. 식물에서 생산된 CCMV는 실시예 5에 기술한 바와 같이 분해되었다. 완충액 B (0.5mg/ml)에서 분해된 CCMV 이량체를 CpG 올리고뉴클레오티드 (120nmol/ml)와 혼합하였다. 표준 올리고뉴클레오티드 및 DNase-보호된 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드, 양자 모두를 사용하였다 (아이오와주 코랄빌에 소재하는 인터그레이티드 DNA 테크놀러지스(Integrated DNA Technologies)). CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 5' TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT 3' (서열 번호: 23)이었다. 용액을 실시예 3B에 기술한 바와 같이 2 내지 12시간 동안 4℃에서 조립 완충액 (5OmM Tris-HCl pH 7.2, 5OmM NaCl, 1OmM KCl, 5mM MgCl₂, 1mM DTT)에 대하여 투석시켰다. 생성된 조립된 입자를 센트리콘-100 미세농축기를 사용하여 조립 완충액으로 세척하고, 완충액을 바이러스 완충액 (0.1M 아세트산 나트륨, pH.5.2)으로 교환하였다. 샘플을 SEC-HPLC상에서 전 개시켰다 (도 9). 표준 올리고뉴클레오티드의 존재하 및 DNase-보호된 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드의 존재하, 양자 모두에서 이량체는 VLPs 내로 조립되었다는 결과를 나타내었다. 샘플을 추가로 0.8-1.2% 아가로스 겔상에서 분석하였다. 아가로스 겔을 EtBr로 염색하여 CpG 올리고뉴클레오티드의 존재를 검출한 후, 단백질 염색에 의해 CCMV C의 존재를 검출하였다 (도 10). 그 결과 재조립된 VLPs가 입자 내 CpGs를 캡슐화하였음을 확인하였다. 래인 1은 분자량 마커이고, 래인 2는 캡슐화된 표준 CpGs를 갖는 CCMV VLP 샘플을 나타내고, 래인 3은 DNase-보호된 백본을 함유하는 캡슐화된 CpGs를 갖는 CCMV VLP 샘플을 나타낸다.

Claims

a) 시험관 내에서,

i) 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드; 및

ii) 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드 (여기에서, 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드는 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드에는 존재하지 않는 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함함)

를 혼합하고;

b) 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드 및 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드를 조립하여 적어도 하나의 다가 바이러스 유사 입자를 형성하는 것 (여기에서, 다가 바이러스 유사 입자는 전장의 감염성 바이러스 핵산을 결실함)

을 포함하는, 다가 바이러스 유사 입자를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드 및 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드를 조립하는 것은 정제 단계 후에 일어나는 방법.
제1항에 있어서, 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드 및 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드의 바이러스 캡시드가 동일한 바이러스 분류군의 구성원 또는 상이한 바이러스 분류군의 구성원으로부터 유래되는 방법.
제1항에 있어서, 제1 및/또는 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드의 바이러스 캡시드가 정20면체 바이러스의 아미노산 서열로부터 유래되는 방법.
제4항에 있어서, 정20면체 바이러스가 동부 퇴록얼룩무늬 바이러스(cowpea chlorotic mottle virus)인 방법.
제1항에 있어서, 제1 및 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드의 항원성 펩티드 삽입체가 병원체로부터 유래된 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 제1 캡시드 융합 펩티드 및 제2 캡시드 융합 펩티드의 항원성 펩티드 삽입체가 동일하거나 상이한 병원체로부터 유래되는 방법.
제1항에 있어서, 바이러스 유사 입자가 바이러스 핵산을 결실한 것인 방법.
제1항에 있어서, 제1 및/또는 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드가 생체 내에서 사전에 생산된 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로부터 유래되는 방법.
a) 시험관 내에서,

i) 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드;

ii) 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드 (여기에서, 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드는 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드에는 존재하지 않는 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함함); 및

iii) 적어도 하나의 면역자극성 핵산 (여기에서, 면역자극성 핵산 서열은 CpG 올리고뉴클레오티드 서열임)

을 혼합하고;

b) 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드, 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드, 및 면역자극성 핵산을 조립하여 적어도 하나의 다가 바이러스 유사 입자를 형성하는 것 (여기에서, 다가 바이러스 유사 입자는 전장의 감염성 바이러스 핵산을 결실함)

을 포함하는, 다가 바이러스 유사 입자를 생산하는 방법.
제10항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드 서열이 AACGTTCG (서열 번호: 24)인 방법.
제10항에 있어서, 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드 및 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드의 바이러스 캡시드가 동일한 바이러스 분류군의 구성원으로부터 또는 상이한 분류군의 구성원으로부터 유래되는 방법.
제10항에 있어서, 제1 및/또는 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드의 바이러스 캡시드가 정20면체 바이러스의 아미노산 서열로부터 유래되는 방법.
제13항에 있어서, 정20면체 바이러스가 동부 퇴록얼룩무늬 바이러스인 방법.
제10항에 있어서, 제1 및 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드의 항원성 펩티드 삽입체가 병원체로부터 유래된 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 제1 캡시드 융합 펩티드 및 제2 캡시드 융합 펩티드가 동일하거나 상이한 병원체로부터 유래된 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 방법.
a) i) 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제1 캡시드 융합 펩티드를 포함하는 적어도 하나의 제1 바이러스 유사 입자; 및,

ii) 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제2 캡시드 융합 펩티드를 포함하는 적어도 하나의 제2 바이러스 유사 입자

를 제공하고;

b) i) 분해되어 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 단리된 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드를 제공하는 제1 바이러스 유사 입자; 및

ii) 분해되어 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 단리된 제2 캡시드 융합 펩티드를 제공하는 제2 바이러스 유사 입자 (여기에서, 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드는 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드에는 존재하지 않는 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함함)

를 분해하고 하고;

c) 시험관 내에서,

i) 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드; 및

ii) 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드

를 혼합하고;

d) 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드 및 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드를 조립하여 적어도 하나의 다가 바이러스 유사 입자를 형성하는 것 (여기에서, 다가 바이러스 유사 입자는 전장의 감염성 바이러스 핵산을 결실함)

을 포함하는, 다가 바이러스 유사 입자를 생산하는 방법.
제17항에 있어서, 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드 및 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드의 바이러스 캡시드가 동일하거나 상이한 바이러스 분류군의 구성원으 로부터 유래되는 방법.
제17항에 있어서, 제1 바이러스 및/또는 제2 캡시드 융합 펩티드의 바이러스 캡시드가 정20면체 바이러스의 아미노산 서열로부터 유래되는 방법.
제19항에 있어서, 정20면체 바이러스가 동부 퇴록얼룩무늬 바이러스인 방법.
제17항에 있어서, 제1 및 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드의 항원성 펩티드 삽입체가 병원체로부터 유래된 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 제1 캡시드 융합 펩티드 및 제2 캡시드 융합 펩티드가 동일하거나 상이한 병원체로부터 유래된 상이한 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 제1 및/또는 제2 캡시드 융합 펩티드가 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서의 발현으로부터 유래되는 방법.
제17항에 있어서, 시험관 내에서, iii) CpG 올리고뉴클레오티드 서열인 적어도 하나의 면역자극성 핵산 서열을 혼합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제24항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드 서열이 AACGTTCG (서열 번호: 24)인 방법.
i) 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제1 동부 퇴록얼룩무늬 바이러스 캡시드 융합 펩티드; 및

ii) 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제2 동부 퇴록얼룩무늬 바이러스 캡시드 융합 펩티드 (여기에서, 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드는 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드에는 존재하지 않는 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함함)

를 포함하며, 여기서 다가 바이러스 유사 입자는 전장의 감염성 바이러스 핵산을 결실한 것인, 다가 바이러스 유사 입자.
제26항에 있어서, 제1 캡시드 융합 펩티드 및 제2 캡시드 융합 펩티드가 동일하거나 상이한 병원체로부터 유래된 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는, 다가 바이러스 유사 입자.
제26항에 있어서, 생성된 다가 바이러스 유사 입자는 바이러스 핵산을 결실한 것인, 다가 바이러스 유사 입자.
제26항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 다가 바이러스 유사 입자.
제26항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드 서열이 AACGTTCG (서열 번호: 24)를 포함하는, 다가 바이러스 유사 입자.
시험관 내에서, 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드, 및 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함하는 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드를 혼합하고 (여기에서, 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드는 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드에는 존재하지 않는 적어도 하나의 항원성 펩티드 삽입체를 포함함), 적어도 하나의 제1 바이러스 캡시드 융합 펩티드 및 적어도 하나의 제2 바이러스 캡시드 융합 펩티드를 조립하여 적어도 하나의 다가 바이러스 유사 입자를 형성하는 것 (여기에서, 생성된 다가 바이러스 유사 입자는 전장의 감염성 바이러스 핵산을 결실함)을 포함하는, 다가 바이러스 유사 입자의 가용성을 증가시키는 방법.
제1항의 다가 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신.