HU210606A9

HU210606A9 - Aggregált formájú, celluláris, amfipatikus proteinek, valamint eljárás azok előállítására, továbbá tisztítására Az átmeneti oltalom az 1-9. és 12. igénypontra vonatkozik.

Info

Publication number: HU210606A9
Application number: HU9400060P
Authority: HU
Inventors: Friedrich Dorner; Johann Eibl
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1994-12-30
Publication date: 1995-05-29

Description

HU 210 606 A9

A találmány sejtekben előállított, oldható amfipatikus proteinekre, valamint ezen proteinek izolálási és tisztítási eljárására vonatkozik.

Valamennyi fiziológiailag aktív sejt termel proteineket, amelyekre mindenkori életfunkcióik fenntartásához szükségük van. A szintetizált proteinek feladatai különbözőek. Egyesek enzimként hatnak, azaz a sejtben végbemenő anyagcsere reakcióit katalizálják. Mások arra szolgálnak, hogy összehangolják azon szerv életfolyamatait, amelyhez a sejtek tartoznak, míg ismét mások ezen sejtek szerkezetét alkotják. Az ezekben a sejtekben előállított proteinek más szervezetekre viszont antigén hatásokat gyakorolhatnak, azaz ezekben a szervezetekben immunreakciókat váltanak ki. Vírusok is tartalmaznak burkukban olyan proteineket, amelyek antigénként hathatnak.

A proteinszintézisre vonatkozó utasítások a sejtek génjeiben vannak, amelyeket az öröklődést meghatározó anyag funkcionális egységeinek tekinthetünk. Mára jól kézben tartott eljárássá vált egy sejt, így egy baktérium genetikai készletének megváltoztatása oly módon, hogy egy gént, így egy állati vagy emberi sejtből származó gént egy másik sejtbe, gyakran baktériumsejtbe visznek be. A baktérium ezután azt a proteint is szintetizálja, amelyre vonatkozó információt a bevitt idegen gén tartalmazza. Az egyik legismertebb példa erre az ember hasnyálmirigyében termelt inzulin, amelynek genetikai információját az Escherichia coli baktériumba vitték be.

Mind a természetes módon, mind pedig sejtek géntechnológiai manipulációja útján előállított proteinek vagy kizáródnak a sejtből, vagy pedig a sejben halmozódnak fel, és a technika állásából ismert eljárásokkal a sejtek felnyitása után izolálhatok és adott esetben feloldhatók. Ezekhez az eljárásokhoz bizonyos frakcionálási és tisztítási előfokozatok után általában detergenseket alkalmaznak, amelyeknek nagyon sajátosan illeszkedniük kell az egyes izolálandó és tisztítandó proteinekhez. A technika állása szerint továbbra is nehézséget okoz a kívánt proteinek izolálásához és tisztításához a helyes detergensek megtalálása.

A találmány feladata HÍV 160-as glikoproteinjének biztosítása biológiailag aktív alakban, továbbá eljárás kidolgozása annak előállítására.

A találmány értelmében ezt a feladatot fellazított, elektronoptikai eszközökkel látható, aggregált, elektroforetikusan immobilis (II) alakú 160-as glikoprotein (GP 160) útján oldjuk meg, amelyet sejtekben előállított, közelítőleg gömb alakban aggregált, kompakt, elektronoptikai eszközökkel látható, elektroforetikusan immobilis (I) alakban lévő GP 160 roncsolásmentes hatású detergenssel végzett kezelése, továbbá a sejtekben előállított GP 160 izolálási és tisztítási eljárása útján kapunk, amelynek során egy első aggregált (I) alakban lévő GP 160-at a felületén lévő szennyeződésektől egy első tisztítási lépésben megtisztítunk, majd roncsolásmentes hatású detergens használata útján egy második aggregált (II) alakra hozzuk, és egy második tisztítási lépésben az aggregált (II) alakban hozzáférhető szennyeződéseket eltávolítjuk, és adott esetben egy második roncsolásmentes detergens hozzáadása útján a GP 160-at egy monomer (III) alakra hozzuk, és a roncsolásmentes hatású detergens eltávolításával reverzibilis módon ismét az aggregált (I) vagy (II) alakra hozzuk.

A következőkben egy protein „biológiai aktivitása” kifejezésen a proteinnek fiziológiás körülmények között mutatott tulajdonságait értjük, így receptorokhoz történő kötődési képességét vagy a természetes proteinéhez hasonló immunválasz kiváltását.

Az „amfipatikus proteinek” kifejezésen a következőkben olyan proteineket értünk, amelyek mind hidrofil, mind pedig hidrofób részeket tartalmaznak. Jellemző képviselőik az integrális membránproteinek, amelyeknél a hidrofil részek a vizes közeggel érintkeznek, míg a hidrofób részeket a sejtmembrán veszi körül.

Proteinek izolálási eljárása során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy roncsolásmentes hatású detergensek alkalmazása esetén amfipatikus proteinek, így GP 160 nem monomer alakjukban, hanem aggregált alakban vannak jelen, amelyek meglepő módon előnyös tulajdonságokat mutatnak. Roncsolásmentes hatású detergens nélkül ezen aggregált formák kompakt szerkezetet mutatnak, amelyeket a leírásban aggregált (I) alakként jelölünk. Ebben az alakban a részecskék a leginkább alkalmasak olyan szennyeződések eltávolítására, amelyek ezen részecskék felületén vannak. A részecskék kompakt alakja ennek során bizonyos védelmet nyújt az aktív centrumok roncsolódása ellen, legyenek azok enzimatikusan aktív centrumok, vagy pedig az immunreakciókat kiváltó epitopok. A kompakt részecskék ennek ellenére az aggregált (I) alakban biológiailag aktívak, elektroforetikus szempontból azonban immobilisak.

Roncsolásmentes hatású detergens jelenlétében az aggregált proteinek kompakt, gömbszerü (I) alakja többé-kevésbé fellazított alakra hozható. Izolálási és tisztítási eljárás során ennek az az előnye, hogy könnyen eltávolíthatók olyan szennyeződések, amelyek az (I) alak (Π) alakká való felnyílása révén könnyebben hozzáférhetők. Az aggregált proteinek (II) alakjában a proteinek biológiai aktivitása meglepő módon erősödik, így tapasztalható, hogy az izolált proteinek immunizáló hatása növekszik, ha az izolált proteinek biológiai tulajdonsága a proteinek immunizáló hatású antigén jellegében rejlik. A biológiailag aktív proteinek vagy adott esetben azok biológiai aktivitást mutató részei is ezáltal különösen a felnyílt alakban aktívak, és a megnevezett okoknál fogva ebben a felhőszerü alakban különösen alkalmasak a proteinek megtisztítására olyan alkatrészektől, amelyek az aggregált alakban be vannak zárva.

Az aggregált (Π) alakban lévő proteinek elektroforetikus szempontból szintén immobilisak.

A találmány értelmében előállított, partikuláris, aggregált GP 160 tekintetében különösen meglepő az a körülmény, hogy az aggregált (I) és (Π) alakok - egy első roncsolásmentes hatású detergens hiányától vagy jelenlététől függően - egymásba reverzibilisen átalakíthatok. Az ismertetett partikuláris, aggregált protein2

HU 210 606 A9 nel így rendkívül célszerű komplex áll rendelkezésre, amely ezen aggregátumok különböző (I) és (II) alakjainak egymásba való reverzibilis átalakítása útján jelentős előnyöket mutat a tisztítási eljárás megkönnyítése, a tárolhatóság javítása, valamint az izolált protein biológiai aktivitásának megnövelt hatékonysága tekintetében.

Ha célirányosan egy második roncsolásmentes hatású detergenst alkalmazunk, az aggregált (II) alakban lévő proteineket a monomer (III) alakra hozhatjuk, ahol teljesen váratlan módon ez az állapot is reverzibilis, ha a második roncsolásmentes hatású detergenst eltávolítjuk. A roncsolásmentes hatású detergensek jelenlététől, illetve hiányától függően fiziológiailag aktív sejtekből izolálandó proteinek ezáltal célzatosan és manipulálhatóan reverzibilis módon bármely kívánt és az éppen következő eljárási lépés, illetve eljárási cél számára optimális alakra hozhatók.

Tárolt, illetve adagolt, adott esetben kívánt módon csökkentett biológiai aktivitású izolált proteinek számára előnyös egy gömbszerű szerkezetű aggregált (I) alak. A gömbszerű alak továbbá adott esetben tisztítási lépések során esetleges roncsoló kezelési lépésektől véd esetleges érzékeny aktív centrumokat (így a GP 160 CD4 receptorhoz kötődő helyeit, a V₃-hurkot, a PND-epitopját, konformációfüggő epitopját és hasonlókat).

Az aggregált (Π) alak a kezelés időtartamától és egy roncsolásmentes hatású detergens koncentrációjától függően felhőszerű szerkezetet mutat. A felnyílás mértékétől függően a proteinek további tisztítási lépések számára hozzáférhetők olyan szennyeződések tekintetében, amelyek a proteinek termeléséhez használt gazdasejtektől, illetve vektorrendszerektől származnak. A proteinek megnövekedett biológiai aktivitást mutatnak.

Mind a gömbszerű, aggregált (I) alak, mind a felhőszerű aggregált (Π) alak elektronoptikai eszközökkel láthatóvá tehető, ha az előállított egyedi protein molekulatömege legalább 10 000 dalton. Ha azonban genetikai manipuláció révén csak meghatározott antigén determinánsok fejeződnek ki, az aggregált, több proteint tartalmazó (I) és (II) alakok is az elektronoptikai láthatóság határa alatt maradnak.

Az (I) és (Π) alakokban aggregált elektroforetikusan immobilis proteinek előnyösen 80%-os, még előnyösebben 98%-os tisztaságban vannak jelen, azaz az aggregált (I) és (II) alakok a kívánt proteineket viszonylag homogén anyagként tartalmazzák.

A proteinek aggregációja a sejteken belül különösen akkor következik be, ha a proteinek géntechnológiailag manipulált sejtek expressziós termékei, ilyen sejtek esetén viszont különösen akkor, ha ezekben a sejtekben ismert eljárásokkal a termékek túltermelését idézik elő. A túltermelés akkor következhet be, ha a kívánt proteint kifejező gént tartalmazó vektorból több van jelen, vagy pedig a megfelelő gének elé különösen erős promoterek vannak beiktatva. Amíg a kifejezett proteinek olyanok, amelyek a sejtben oldódnak, azok az ismertetett gömbszerű részecskékké aggregálódnak.

A genetikailag manipulált gazdasejtek által kifejezett proteinek előnyösen antigén tulajdonságot mutatnak. Ha élő oltóanyagot kell rendelkezésre bocsátani, vagy ha az antigének által megfelelő aktív immunizálást kell elérni, a génmanipulált protein expresszálása előnyösen ezekre a proteinekre irányul. Ezek különösen - akár emberekben, akár állatokban betegséget kiváltó - vírusok burkának proteinjei.

A találmány szerinti protein a HÍV GP 160 glikoproteinje. A mindenkori proteineket kifejező gének többek között kifejezhetök Vaccínia-vírusvektor által emlős sejtrendszerben. Specifikus gének Vaccinia-vírusvektorokba történő inszertálásának eljárása a szakirodalomból ismert [Mackett és munkatársai: J. Virol, 49, 857-846, (1984)]. Az idegen gént ismert eljárással előbb plazmidvektorba inszertáljuk a Vacciniatranszkripciós szabályozó elemtől (7,5 K-promotertől) lefelé. Ezt a rekombináns plazmidban lévő kiméra gént olyan Vbccin/ű-szekvenciák határolják, amelyek a genom nem-esszenciális tartományát [így a vírus timidinkináz génjét (TK) kódoló génszakaszt] képezik. A plazmidot ekkor előzetesen vadtípusú ( a WR törzshöz tartozó) Vacci'nía-vírussal fertőzött sejtekbe visszük be. A rekombináció abban a TK-tartományban megy végbe, ahol a vírus DNS-e és a plazmid egymással homológ, és lehetővé teszi a kiméra gén beinszertálását a Vaccinia-vírus genomjába. Az ily módon kapott rekombináns vírus TK fenotípusú, tehát nem képes timidinkináz termelésére, és 5-bróm-dezoxiuridint tartalmazó szelektív táptalajban növekszik. Ezzel a módszerrel előállíthatók olyan géneket tartalmazó rekombináns Vaccinia-vírusók, amelyek - adott esetben feleslegben - proteineket termelnek, amelyek aztán emlős állatok sejtjeiben az ismertetett, nagy számú egyedi fehérjemolekulát tartalmazó aggregált alakokká állnak össze. Hasonló expressziós rendszerek egyéb antigén proteinek vonatkozásában ismertek. így konstruáltak néhány rekombináns Vaccinia-vírust, amelyek a Hepatitisz-B vírus felületi antigénjeit kódolják. E célból a Vacciniavírus szabályozó mechanizmusa segítségével fejezték ki a Hepatitis-B vírus felületi antigénjeit, ennek során az idegen gének expressziós szintjének növelésére számos Vaccinia-vírusra jellemző promotert alkalmaztak (Gerald v. Quinnan (szerk.): Vaccinia Viruses as Vectors für Vaccine Antigens, Elsevier Science Publishing, 1985], előállítottak továbbá olyan rekombináns Vaccinra-vírusokat is, amelyek a Hepatitis-B vírus egynél több génjét fejezik ki.

E helyen ldvánt proteinek géntechnológiai termelésére szolgáló expressziós rendszerek előállítása vonatkozásában általánosságban a szakirodalomra utalunk (Winnacker, E. L.: Gene und Klone, eine Einführung in die Gentechnologie, VCH-Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1984).

A részecske alakban összegyűlt proteineket előnyösen egy további anyaghoz, különösen konjugáció útján nagy molekulatömegű proteinhez kapcsolhatjuk, ezáltal a proteinek stabilitása, aktivitása, in vivő visszanyerése és biológiai felezési ideje tekintetében javulás érhető el. Proteinek további nagy molekulatömegű anya3

HU 210 606 A9 gokkal történő ilyen konjugációjára példa a VIII véralvadási faktorból és a Willebrands-faktorból álló konjugátum.

A részecske alakban aggregált proteinek elsősorban eukarióta sejtekben, különösen állati vagy emberi sejtekben vannak jelen.

A kívánt proteineket különösen előnyösen primér sejtkultúrákban vagy sejtvonalakból nyert verosejtekben, CHO-sejtekben vagy primér csirkeembrió-kötőszöveti sejtekben fejezik ki. Expressziós rendszerként előnyösek a megnevezett gazdasejtek, minthogy ezekben az esetekben a ponttranszlációs módosítások olyanok, amilyen az alkalmazandó végtermék esetében elvárható, ezekhez sorolható többek között az expreszszált proteinek glikozilezése. Ezek a glikozilezett proteinek állnak aztán össze részecske alakban, amelyek egy első roncsolásmentes hatású detergenssel végzett kezelés után az ismertetett gömbszerű (I) alakot, illetve felhőszerű (Π) alakot vehetik fel, és egy második roncsolásmentes hatású detergenssel végzett kezelés után egy harmadik, (III) alakra hozhatók.

Az előzőekben ismertetettek szerint verosejtek különösen előnyösek a HIP GP 160 előállítására. Ezt a sejtrendszert választottuk ki, minthogy növekedési sebessége viszonylag nagy, és emberi oltóanyagok előállítására már kellően adaptálták. Verosejtek fertőzése a kívánt, a jelen találmány szerinti eljárással izolálandó proteint kifejező gént tartalmazó rekombináns Vacciηια-vírussal a kívánt protein szokásos szintézisét, megfelelő glikozilezését és feldolgozását eredményezi. Két rekombinánssal történő kettős fertőzési rendszer alkalmazása által a kívánt protein mennyiségét jelentősen növelhetjük. Ez a rendszer tartalmaz egy rekombinánst, amely a T7 fág polimerázát a Vaccinia P7,5-promoter vezérlése alatt fejezi ki. Ezt a rekombinánst egy olyan rekombinánssal együtt használjuk fertőzés céljára, amely a T7 promotert és a HÍV GP 160 génjét tartalmazza. AT7 promoter nagyon erős promoterés az expresszálás magas fokát biztosítja.

Az ismertetett rendszerek előnyös rendszerekként tekintendők. A szakirodalom általános áttekintést ad azokról a sokrétű lehetőségekről, amelyek értelmében bizonyos vektorokat kívánt gének rekombinálására alkalmazunk, és ezeket a vektorokat kívánt sejtekben szaporítjuk, és az idegen gének által expresszált proteineket előállítjuk [Róbert Williamson (szerk.): Genetic Engeneering, 3. kötet, Academic Press, Spektrum dér Wissenschaft, Industrielle Mikrobiologie 1985].

Azok a roncsolásmentes hatású detergensek, amelyeknek jelenléte vagy hiánya lényegesen befolyásolja a fiziológiailag aktív sejtekből izolált proteinek egymástól különböző módon aggregált alakjait vagy a proteinek monomer alakját, lehetnek ionos, nem-ionos vagy belső só típusú detergensek. A proteinkémiában, illetve a proteinek tisztítási eljárásai kapcsán ismert nehézség, hogy a kívánt protein egyrészt nagy tisztaságú alakban, másrészt pedig biológiailag aktív állapotban történő kinyeréséhez a detergens megválasztása mindenkor kritikus szempont. Meglepő módon azt állapítottuk meg, hogy bizonyos ionos, nem-ionos vagy belső só jellegű, roncsolásmentes hatású detergensek alkalmazása útján a proteinek tisztítási eljárásaival szemben támasztott, felsorolt követelmények teljes mértékben kielégíthetők, amellett a gömb alakúvá ahogy az ezeket a proteineket termelő sejtekben jelen vannak - összeállt proteinek váratlan konformációváltozása a felsorolt követelményeket meglepő módon optimálisan teljesíti. Az előzőekben említettek szerint különösen a fellazított vagy felhőszerű konformáció aggregált (II) alakjában erősödik az egyes proteinek enzimatikus vagy antigén természetű - biológiai aktivitása.

Az egyik előnyös nem-ionos detergens az oktil-glikozid vagy valamely származéka, előnyösen 0,25-5 tömeg%, még előnyösebben 1 tömeg% koncentrációban.

Ugyancsak előnyös az epesav, valamint származéka sójának alkalmazása, előnyös a dezoxi-kolát (DOC) detergens, amely különösen alkalmas a HÍV GP 160 gömbszerű konformációjának izolálásával és tisztításával kapcsolatban. Az izoláláshoz DOC előnyösen 0,25-5 tömeg%, előnyösen 1 tömeg% koncentrációban alkalmas, akárcsak a GP 160 felhasználása során, ami történhet alumínium-hidroxiddal együtt.

Az aggregált (II) alak monomer (III) alakra hozásához előnyösen alkalmazandó roncsolásmentes hatású detergens a belső sók által alkotott sorozathoz tartozó detergens, amelyet előnyösen szintén 0,25-5 tömeg%, még előnyösebben 1 tömeg% koncentrációban alkalmazunk.

GP 160 az aggregált (I) alakban az említettek szerint különösen alkalmas a stabil állapotú tároláshoz. Alkalmazható azonban kívánt biokémiai átalakításokhoz vagy reakciókhoz is, minthogy az aggregált (I) alakba összeállt protein is mutat biológiai aktivitást.

GP 160 az aggregált (Π) alakban előnyösen a protein biológiai funkciójának fokozása céljából alkalmazható.

A protein (Π) alakja - hasonlóan a korábban már ismertetett, további nagy molekulatömegű proteinekkel konjugált alakokhoz - terápiás, megelőző vagy diagnosztikai felhasználásra alkalmas.

A (Π) alakban aggregált protein további alkalmazása a helyettesítő kezelésben, oltóanyagok vagy monoklonális antitestek előállításában, valamint ilyen anyagok testnedvekben való kvalitatív kimutatására és kvantitatív meghatározására szolgáló anyagok előállításában rejlik.

A nagyszámú proteinekből álló - egy roncsolásmentes hatású detergens jelenlététől vagy hiányától függően morfológiailag különböző, egymásba reverzibilisen átalakítható konformációban jelen lévő - részecskék mellett a találmány sejtekben, előnyösen géntechnológiailag manipulált sejtekben az előzőekben ismertetett módon előállított GP 160 izolálására és tisztítására szolgáló eljárásra is vonatkozik.

A találmány szerinti eljárás lényeges előnyei az előzőekben tárgyalt módon a protein különböző aggregált alakjainak egymásba való reverzibilis átalakíthatóságában rejlenek.

HU 210 606 A9

A nagyjából gömb alakú (I) alak a proteinek kompakt elrendezése folytán többek között lehetővé tesz egy könnyebb elsó tisztítási műveletet, amelynek során a nagyjából gömb alakban összeállt protein alakzat felületéről eltávolíthatjuk a közeg maradványait. Mihelyt eltávolítottuk a második tisztítási lépésben azokat a szennyeződéseket, amelyek az aggregált (II) alakban a felnyílás folytán különösen könnyen hozzáférhetők, a roncsolásmentes hatású detergens elvonása útján reverzibilisen ismét helyreállíthatjuk az aggregált (I) alakot, amelyben a protein aktív centrumai a gömb alakban elrendezett protein belsejében különösen jól védettek, így a protein különösen jól tárolható az aggregált (I) alakban. Az aggregált (II) alak az említettek szerint előnyös abból a szempontból, hogy a protein expreszszálásához használt gazdasejtek sejtalkotóitól könynyebben megtisztítható, ezenkívül további előnye, hogy a protein biológiai aktivitása jelentősen növelhető azáltal, hogy a sajátos aggregált állapot révén sok aktív centrum van térbelileg egymáshoz közel.

A kísérleti elrendezéstől függően centrifugálással sejteket vagy sejtmembránokat távolítunk el, majd roncsolásmentes hatású detergenst és proteázt gátló rendszert tartalmazó pufferoldattal extrahálást végzünk, vagy - ha a kívánt, nagy molekulatömegű anyagot a sejtek a sejtközi állományba leadták - a roncsolásmentes hatású detergenst és a proteáz gátló rendszert a sejtközi állományhoz adjuk, ennek során a roncsolásmentes hatású detergens, így DOC előnyösen a 0,25-5 tömeg% koncentrációtartományban van, még előnyösebben 1 tömeg%.

Az így kapott oldatokat - ha az izolálandó és tisztítandó anyag glikoprotein - szilárd mátrixhoz kötött lektinek útján koncentráljuk és a nem szénhidráttartalmú szennyeződésektől elválasztjuk. Az alkalmazott, roncsolásmentes hatású detergens - azon tulajdonságán túl, hogy az anyagot a (II) alakra hozza - meggátolja a nem specifikus adszorpciót. Az eluálást glikozidokkal folytatjuk le.

További, jelentős tisztítási lépést érhetünk el immunadszorpciós oszlopban kötött, előtisztított, nagy molekulatömegű anyag sajátos kötődése révén. Pufferoldattal végzett kellő mosás után kaotróp ágenssel, így (2-8 mol/1, előnyösen 3 mol/1 koncentrációjú) karbamiddal vagy KSCN-dal folytatunk eluálást. Ezt követően pufferoldattal szemben végzett dialízis útján az anyagot a részecskeszerű (I) alakra hozzuk. Szükség esetén a nagy molekulatömegű anyagot meghatározott, belső só típusú detergenssel a monomer (ΙΠ) alakra hozzuk és ioncserés kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Detergensmentes pufferral szemben végzett dialízis útján a monomer (III) alakból ismét az aggregált (Π) vagy (I) alakot állítjuk elő.

Az ismertetett sejtekben előállított proteinek különböző aggregált alakjait elektronoptikai eszközökkel láthatóvá tehetjük.

A találmányt a következőkben ábrák és példák útján szemléltetjük.

Az 1. ábra GP 160 elektromikroszkópos felvételét mutatja Tris-pufferban 278 640-szeres nagyításban.

A proteinek a kompakt, gömbszerű aggregált (I) alakban vannak.

A 2. ábrán a HÍV GP 160 elektromikroszkópos felvétele látható 1 tömeg% DOC-ot tartalmazó pufferban.

A proteinek a laza, felhőszerű, aggregált (II) alakban vannak.

1. példa

A HÍV GP 160 izolálása és tisztítása

A HÍV GP 160 izolálását és tisztítását a következő séma szerint folytatjuk le:

1. A HÍV GP 160-at termelő, gén technológiailag manipulált verosejteket a kívánt sűrűségérték esetén centrifugáljuk.

2. A centrifugálás útján nyert pelletet 1 mmol/1 CuSO₄-ot és 0,5 mmol/1 ZnCl₂-ot tartalmazó 7,4 pH-jú TBS-ben újra szuszpendáltatjuk.

3. Az újra szuszpendáltatott pelletet 1 tömeg% DOC-ot, 1 mmol/1 CuSO₄-ot és 0,5 mmol/1 ZnCl₂-ot tartalmazó, 8,3 H u, 50 mmoll koncentrációjú tris-HCIoldattal extraháljuk. A szuszpenziót 25 °C hőmérsékleten 30 percen át folytatott centrifugálással derítjük.

4. A maradványt Lentil-Lectin-típusú töltetes oszlopon lefolytatott kromatográfiás eljárással kezeljük, ennek során a kívánt proteineket adszorbeáltatjuk az oszlopon, majd DOC-pufferral mossuk. A proteineket 5 tömeg% metil-glikozidot tartalmazó mosópufferral eluáljuk.

5. A Lectin-típusú töltetes oszlopról származó eluátumot Tween-pufferben hígítjuk. Ezután adszorbeáltatás következik immunaffinitási kromatográfiás oszlopon, amelyet TBS-Twin, majd pedig TBS-közeggel mosunk. Ezt DNáz- és RNáz-kezelés követi. 3 mol/1 koncentrációjú KSCN-dal folytatjuk le az eluálást, majd detergensmentes pufferral szemben dializálunk.

6. A dializált eluátumot 1 tömeg% belső só típusú detergenssel és 5 tömeg% bétámnál állítjuk be, majd mono-Q-típusú anioncserélő mátrixon adszorbeáltatjuk, KSCN-gradienssel eluáljuk és pufferral szemben dializáljuk.

7. Egy második Lentil-Lectil-típusú töltetes oszlopon lefolytatott adszorbeáltatás és detergensmentes pufferral végzett mosás következik. Az eluálást 5 tömeg% metil-glikozidot tartalmazó közeggel folytatjuk le, majd TBS-sel szemben dialízist végzünk. Ezzel az eljárási lépéssel a proteineket koncentráljuk.

2. példa

Az 1. példában ismertetett eljárással tisztított HÍV GP 160 hatékonyságának vizsgálata igazolja a GP 160 immunizáló hatásosságát a kompakt, gömbszerű (I) alakban, valamint a laza, felhőszerű (II) alakban.

Vakcinánként 5 hígítást állítunk elő 10 gg, 2,5 gg, 0,625 gg, 0,158 gg, valamint 0,04 gg GP 160/ml tartalommal. Mindegyik hígítással 10 BALBc-típusú egeret szubkután immunizálunk; eszerint vakcinatípusonként 50 állat szükséges. A jelen vizsgálatnál 4 különböző adszorpciós eljárást vizsgálunk.

l.GP160 + 0,2% A1(OH)₃

HU 210 606 A9

2. [GP 160 + 0,25% DOC] + 0,2% A1(OH)₃

3. [GP 160 + 0,25% DOC] + [0,2% A1(OH)₃ + 0,25% DOC]

4. [GP 160 + 0,25% DOC] + [mosott 0,2% A1(OH)₃]

Valamennyi állatot 1 ml vakcinával szubkután immunizáltuk, és hat hét eltelte után egyenként kivéreztettiik. Minden egyes állat szérumát az Anti-HIV ELISA (SORIN) eljárással GP 160 antitestek jelenlétére megvizsgáltuk, ennek során mindegyik vakcinatípusra meghatároztuk GP 160 effektív 50-es dózisát az ismert Spearman-Kaerber-módszer segítségével a reagáló állatok alapján.

A kapott eredmények a következők:

1.1-V 10 pg GP 160/ml + 0,2% A1(OH)₃ s. c.

		reagáló állat	max. titer
I	tömény	1	100
II	1:4	1	10
¹¹¹	1:16	0	/
IV	1:64	1	10
V	1:256	1	10
ED₅₀: 10 pg/ml GP 160

2. VI-X [10 pg GP 160/ml + DOC] + 0,2% A1(OH)₃s. c.

		reagáló állat	max. titer
VI	tömény	7	1000
VII	1:4	5	200
VIII	1:16	1	10
IX	1:64	0	/
X	1:256	0	/
ED₅₀: 3,3 pg/ml GP 160

3. XI-XV [10 pg GP 160/ml + DOC] + [A1(OH)₃ + DOC] s. c.

		reagáló állat	max. titer
XI	tömény	7	800
XII	1:4	5	1000
XIII	1:16	6	100
XIV	1:64	2	100
XV	1:256	1	100
ED#: 1,09 pg/ml GP 160

4. XVI-XX [10 pg GP 160/ml + DOC] + mosott A1(OH)₃ s. c.

		reagáló állat	max
XVI	tömény	0	/
XVII	1:4	1	10
XVIII	1:16	0	/
XIX	1:64	0	/
XX	1:256	0	/
ED₅₀: 10 pg/ml GP 160

A HÍV GP 160 hatékonyságvizsgálatának eredménye a GP 160 immunizáló képességének különbözőségét mutatja az aggregált alaktól függően. ED# értéke— ami az alkalmazott anyagnak azt a mennyiségét jelöli, amelynél a beoltott állatok 50%-ának szérumában kellő hatás tapasztalható - jelentősen csökken, ha DOC detergens van jelen. A DOC detergens jelenlétében a GP 160 az aggregált (Π) alakban van, amelyben az antigén epitópok egyrészt szabadon vannak, másrészt azonban térbelileg összefüggenek, így fokozott immunválaszt váltanak ki.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. GP 160 fellazított, elektronoptikai eszközökkel látható, aggregált, elektroforetikusan immobilis (Π) alakban, amelyet sejtekben előállított, közelítőleg gömb alakban aggregált, kompakt, elektronoptikai eszközökkel látható, elektroforetikusan immobilis (I) alakban lévő GP 160 roncsolásmentes hatású detergenssel végzett kezelése útján kaphatunk.
2. Az 1. igénypont szerinti GP 160, azzal jellemezve, hogy legalább 80%-os, előnyösen 98%-os tisztaságú.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti GP 160, azzal jellemezve, hogy géntechnológiailag manipulált sejtek, különösen proteineket túltermelő sejtek expresszált terméke.
4. A 3. igénypont szerinti GP 160, azzal jellemezve, hogy antigén funkciót mutat.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti GP 160, azzal jellemezve, hogy a sejtek eukarióta, előnyösen állati vagy emberi sejtek.
6. Az 5. igénypont szerinti GP 160, azzal jellemezve, hogy a sejtek primér sejtkultúrákból vagy sejtvonalakból vannak kinyerve, különösen verosejtek, CHO-sejtek vagy primér csirkeembrió-kötőszöveti sejtek.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti GP 160, azzal jellemezve, hogy a detergensek meghatározott ionos, nem-ionos vagy belső só jellegű detergensek.
8. A 7. igénypont szerinti GP 160, azzal jellemezve, hogy az (I) alakból a (II) alakra hozáshoz első, nem-ionos detergensként oktil-glikozid vagy annak származéka, előnyösen 0,25-5 tömeg%, még előnyösebben 1 tömeg% koncentrációban, a (II) alakból a monomer (ΙΠ) alakba hozáshoz második, belső só típusú detergensként belső detergenssor egyike előnyösen 0,25-5 tömeg%, még előnyösebben 1 tömeg% koncentrációban nyer alkalmazást.
9. A 7. igénypont szerinti GP 160, azzal jellemezve, hogy a detergens az epesav vagy származékának sója, előnyösen dezoxi-kolát, előnyösen 0,25-5 tömeg%, még előnyösebben 1 tömeg% koncentrációban.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti GP 160 alkalmazása stabil tároláshoz aggregált (I) alakjában.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti GP 160 alkalmazása a biológiai funkció erősítésére aggregált (II) alakjában.

HU 210 606 A9
12. GP 160 terápiás, megelőző vagy diagnosztikai használatra szolgáló (II) alakban.
13. GP 160 alkalmazása (Π) alakban oltóanyagok kinyerésére.
14. GP 160 alkalmazása (II) alakban a megnevezett anyagok testfolyadékokban történő kvalitatív kimutatására vagy kvantitatív meghatározására szolgáló anyagok kinyerésére.
15. Eljárás sejtekben előállított GP 160 izolálására és tisztítására, azzal jellemezve, hogy egy első aggregált (I) alakban lévő GP 160 felületén lévő szennyeződésektől egy első tisztítási lépésben megtisztítjuk, majd roncsolásmentes hatású detergens használata útján egy másik aggregált (Π) alakra hozzuk, és egy második tisztítási lépésben az aggregált (Π) alakban hozzáférhető szennyeződéseket eltávolítjuk, és adott esetben egy második roncsolásmentes hatású detergens hozzáadása útján GP 160-at egy monomer (ΠΙ) alakra hozzuk és a roncsolásmentes hatású detergens eltávolításával reverzibilis módon ismét az aggregált (I) vagy (Π) alakra hozzuk.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aggregált (I), (II) és (ΠΙ) alakok reverzibilis átalakítását tisztítás céljából többször lefolytatjuk.
17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a GP 160 géntechnológiailag manipulált sejtek, különösen proteint túltermelő sejtek expresszálási terméke.
18. A 15. vagy 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek eukarióta, előnyösen állati vagy emberi sejtek.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek primér sejtkultúrákból vagy sejtvonalakból nyert sejtek, különösen verosejtek, CHO-sejtek vagy primér csirkeembrió-kötőszöveti sejtek.
20. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a detergensek meghatározott ionos, nem-ionos vagy belső só típusú detergensek.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első, nem-ionos detergensként oktil-glikozidot vagy annak származékát, előnyösen 0,25-5 tömeg%, még előnyösebben 1 tömeg% koncentrációban, és második, belső só típusú detergensként belső só detergenssor egyikét 0,25-5 tömeg%, még előnyösebben 1 tömeg% koncentrációban alkalmazzuk.
22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a detergens az epesav vagy származékának sója, előnyösen dezoxi-kolát, előnyösen 0,25-5 tömeg%, még előnyösebben 1 tömeg% koncentrációban.

HU 210 606 A9 Int. Cl.⁶: C 07 K 1/00