JP7295536B2 - Ｂ型肝炎ワクチン - Google Patents
Ｂ型肝炎ワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JP7295536B2 JP7295536B2 JP2019529827A JP2019529827A JP7295536B2 JP 7295536 B2 JP7295536 B2 JP 7295536B2 JP 2019529827 A JP2019529827 A JP 2019529827A JP 2019529827 A JP2019529827 A JP 2019529827A JP 7295536 B2 JP7295536 B2 JP 7295536B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- protein
- hbs
- vaccine
- hepatitis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
- A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、ＨＢｓ－Ｌ抗原を用いたＢ型肝炎ワクチンに関する。
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の表面抗原は、Ｌ抗原（Ｐｒｅ－Ｓ１、Ｐｒｅ－Ｓ２及びＳ領域から形成）、Ｍ抗原（Ｐｒｅ－Ｓ２及びＳ領域から形成）及びＳ抗原（Ｓ領域のみから形成）の３種類が存在する（これらの抗原をそれぞれ、ＨＢｓ－Ｌ抗原、ＨＢｓ－Ｍ抗原、ＨＢｓ－Ｓ抗原ともいう。）。Ｂ型肝炎用のワクチンは、Ｓ抗原が主に使用され、一部、Ｍ抗原も使われてきた。
ＨＢＶの表面抗原として機能するタンパク質のうち、Ｐｒｅ－Ｓ１領域はＨＢＶウイルスがヒト肝細胞を認識し、結合するセンサーである。このため、Ｐｒｅ－Ｓ１領域の機能を中和する抗体はＢ型肝炎に対する予防ワクチンとして有望であるのみならず、体内でＨＢＶウイルスが広がることを阻止する意味で治療ワクチンとしても重要である。
ＨＢＶの表面抗原として機能するタンパク質のうち、Ｐｒｅ－Ｓ１領域はＨＢＶウイルスがヒト肝細胞を認識し、結合するセンサーである。このため、Ｐｒｅ－Ｓ１領域の機能を中和する抗体はＢ型肝炎に対する予防ワクチンとして有望であるのみならず、体内でＨＢＶウイルスが広がることを阻止する意味で治療ワクチンとしても重要である。
Ｌタンパク質をコードする遺伝子（Ｌ抗原遺伝子という）は、３つの翻訳開始サイトと共通の終止コドンを持っている。このためＬ抗原遺伝子をＣＨＯ細胞などの動物細胞で発現させると、Ｌ、Ｍ及びＳの３種のタンパク質が形成される。この３種のタンパク質は一つの脂質粒子に提示されることでＬ、Ｍ及びＳタンパク質が混合した抗原粒子が形成されることになる。
こうした状況下、３種の抗原であるＬ抗原、Ｍ抗原及びＳ抗原の混合物を利用したワクチンも知られている（例えば、市販の予防ワクチンであるＳｃｉ－Ｂ－ＶａｃＴＭ（ＶＢＩ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ． イスラエル）。また、３種の抗原の混合物をＢ型肝炎の治療ワクチンとして利用しようとする考えもある（ＨＢＶワクチンおよびその製造方法：特表２０１０－５１６８０７）。
しかしながら、これらの抗原はＬ抗原、Ｍ抗原及びＳ抗原の混合物であり、Ｌ抗原だけを利用したワクチン開発は知られていない。
こうした状況下、３種の抗原であるＬ抗原、Ｍ抗原及びＳ抗原の混合物を利用したワクチンも知られている（例えば、市販の予防ワクチンであるＳｃｉ－Ｂ－ＶａｃＴＭ（ＶＢＩ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ． イスラエル）。また、３種の抗原の混合物をＢ型肝炎の治療ワクチンとして利用しようとする考えもある（ＨＢＶワクチンおよびその製造方法：特表２０１０－５１６８０７）。
しかしながら、これらの抗原はＬ抗原、Ｍ抗原及びＳ抗原の混合物であり、Ｌ抗原だけを利用したワクチン開発は知られていない。
ところで、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）持続感染者は世界で約４億人存在すると推定されており、本邦におけるＨＢＶ感染率は１．５％に上る。本邦では、ＨＢＶ母児感染予防、輸血のスクリーニング、高リスク群へのワクチン投与（セレクティブワクチネーション）などの各種予防策が功を奏し、ＨＢＶ感染者数は減少傾向にある。一方で、これらの予防策の対象とならない多くの人は、ＨＢＶに対する免疫がなく、ＨＢＶに対して無防備な状態にあるため、現在でも一定数みられる水平初感染によるＢ型急性肝炎、劇症肝炎の患者となり得る。これらの水平感染の予防のため、本邦ではＨＢＶに対するユニバーサルワクチネーションが本年から開始された。
前述のとおり、ＨＢＶのウイルス粒子表面にはＨＢｓ－Ｌ抗原、ＨＢｓ－Ｍ抗原、ＨＢｓ－Ｓ抗原の３種類の蛋白質が存在する（図１）。本邦では２種類のＨＢＶ予防ワクチンが使用されるが、いずれもＨＢｓ－Ｓ抗原を使用しており、約１０％の人はいずれのワクチンでもＨＢｓ抗体の産生がみられず（ＨＢワクチン無反応者）、ＨＢＶワクチン接種の恩恵が得られない。そのため、ＨＢＶ水平感染の根絶には、ＨＢＶワクチン無反応者の少ない、より強力なワクチンが必要である。またＨＢｓ－Ｓ抗原を用いたＢ型肝炎に対する免疫治療も試みられているが、十分な治療効果は得られておらず、より強力な免疫治療法が求められる。
Ａｖｅｒｈｏｆｆ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｒｅｖ Ｍｅｄ．１９９８；１５：１－８．
Ｈｏｒｉｉｋｅ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ．２００２；２３：３８－４７．
現行のワクチンは製造上の簡便性からＨＢｓ－Ｓ抗原が用いられている。しかし肝細胞に吸着する時にはＬタンパク質のＮ末端が使われており、その領域に対する抗体又は細胞性免疫が誘導されていることが望ましい。
また、感染後にウィルスの活動性が持続すると慢性肝炎から肝硬変、肝細胞がん、肝不全に進展する。現在、Ｂ型肝炎治療にはＰＥＧ化ＩＦＮおよび核酸アナログであるエンテカビルが用いられている。ＰＥＧ化ＩＦＮは免疫賦活作用や高ウィルス作用を有し、セロコンバージョン例では高効率で効果が持続するものの、高頻度かつ多彩な副作用が大きな問題である。また、エンテカビルはウィルスの複製阻害によりＨＢＶ ＤＮＡ量を減少させるものの、その薬効は投与の中止によって速やかに消失し、肝炎が再燃してしまう。このような問題点から、従来とは異なるメカニズムの新規治療法の開発が強く望まれている。
そこで本発明は、Ｂ型肝炎に対する新規治療ワクチンを提供することを目的とする。
また、感染後にウィルスの活動性が持続すると慢性肝炎から肝硬変、肝細胞がん、肝不全に進展する。現在、Ｂ型肝炎治療にはＰＥＧ化ＩＦＮおよび核酸アナログであるエンテカビルが用いられている。ＰＥＧ化ＩＦＮは免疫賦活作用や高ウィルス作用を有し、セロコンバージョン例では高効率で効果が持続するものの、高頻度かつ多彩な副作用が大きな問題である。また、エンテカビルはウィルスの複製阻害によりＨＢＶ ＤＮＡ量を減少させるものの、その薬効は投与の中止によって速やかに消失し、肝炎が再燃してしまう。このような問題点から、従来とは異なるメカニズムの新規治療法の開発が強く望まれている。
そこで本発明は、Ｂ型肝炎に対する新規治療ワクチンを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ビークル社で開発製造されているＨＢｓ－Ｌ抗原（図２）を免疫することで、現状よりもより強力な感染発症予防効果を示すワクチンの開発を試み、ＨＢｓ－Ｌ抗原を用いることにより上記課題を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質又はその変異体のみが脂質膜上に集合し、形成された表面抗原粒子を含む、Ｂ型肝炎ワクチン。
（２）Ｌタンパク質又はその変異体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である（１）又は（２）に記載のワクチン。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であって且つ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（３）Ｌタンパク質又はその変異体が、酵母により発現されたものである（１）又は（２）に記載のワクチン。
（４）被検者への投与によりＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１及び／又はＰｒｅＳ２領域に対する抗体が産生される、（１）～（３）のいずれか１項に記載のワクチン。
（５）被検者への投与によりＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１及び／又はＰｒｅＳ２領域に対する細胞性免疫が誘導される、（１）～（４）のいずれか１項に記載のワクチン。
（６）さらにＢ型肝炎ウイルスのコアタンパク質を含む、（１）～（６）のいずれか１項に記載のワクチン。
（７）被検者への投与により、さらにコアタンパク質に対する抗体が誘導される、（６）に記載のワクチン。
（８）被検者への投与により、さらにコアタンパク質に対する細胞性免疫が誘導される、（６）又は（７）に記載のワクチン。
（９）Ｂ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価が、少なくとも２から１０００である（１）～（８）のいずれか１項に記載のワクチン。
（１０）Ｂ型肝炎ウイルスのヒト肝細胞への結合に対する阻害効果が、少なくとも５０～１００％である（１）～（９）のいずれか１項に記載のワクチン。
（１）Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質又はその変異体のみが脂質膜上に集合し、形成された表面抗原粒子を含む、Ｂ型肝炎ワクチン。
（２）Ｌタンパク質又はその変異体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である（１）又は（２）に記載のワクチン。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であって且つ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（３）Ｌタンパク質又はその変異体が、酵母により発現されたものである（１）又は（２）に記載のワクチン。
（４）被検者への投与によりＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１及び／又はＰｒｅＳ２領域に対する抗体が産生される、（１）～（３）のいずれか１項に記載のワクチン。
（５）被検者への投与によりＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１及び／又はＰｒｅＳ２領域に対する細胞性免疫が誘導される、（１）～（４）のいずれか１項に記載のワクチン。
（６）さらにＢ型肝炎ウイルスのコアタンパク質を含む、（１）～（６）のいずれか１項に記載のワクチン。
（７）被検者への投与により、さらにコアタンパク質に対する抗体が誘導される、（６）に記載のワクチン。
（８）被検者への投与により、さらにコアタンパク質に対する細胞性免疫が誘導される、（６）又は（７）に記載のワクチン。
（９）Ｂ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価が、少なくとも２から１０００である（１）～（８）のいずれか１項に記載のワクチン。
（１０）Ｂ型肝炎ウイルスのヒト肝細胞への結合に対する阻害効果が、少なくとも５０～１００％である（１）～（９）のいずれか１項に記載のワクチン。
本発明により、Ｂ型肝炎ワクチンが提供される。本発明により、初めてＢ型肝炎ウイルスの中和抗体価を定量的に解析・提示し、その抗Ｂ型肝炎ウイルス効果を明確に示すことが可能となった。
本明細書において、Ｌタンパク質とは、Ｌ抗原を構成するタンパク質を意味し、Ｍタンパク質とは、Ｍ抗原を構成するタンパク質を意味し、Ｓタンパク質とは、Ｓ抗原を構成するタンパク質を意味する。
本発明は、ＨＢｓ－Ｌ抗原を用いたＢ型肝炎ワクチンに関する。
Ｂ型肝炎に対する予防ワクチンとしてＨＢｓ－Ｓ抗原が用いられているが、約１０％の人は同ワクチンを投与してもＨＢｓ抗体の産生がみられず（ＨＢワクチン無反応者）、感染防御ができない。またＢ型肝炎の抗ウイルス療法として、核酸アナログ製剤の内服治療とインターフェロン治療が提案されているが、核酸アナログ治療については内服を始めると中断できず、一生継続する必要があり、インターフェロン治療は多くの副作用を伴う。また共に治療してもＨＢＶ抗原・抗体のセロコンバージョンは得られにくい。過去にＢ型肝炎のＨＢｓ－Ｓ抗原を用いた免疫治療も試みられているが、十分な治療効果は得られていない。そこで、Ｂ型肝炎ウイルス感染予防のために、現行ワクチンと異なる、より強力な免疫作用を持つＨＢｓ－Ｌ抗原による予防ワクチンの開発と、同抗原を治療ワクチンとして用いた免疫治療の開発を目的とした。
本発明者は、Ｌ抗原だけを提示する粒子を利用してＢ型肝炎ワクチン可能性を検討したところ、従来のものより優れた効果が期待できることを発見し、本発明を成すことに成功した。
本発明は、ＨＢｓ－Ｌ抗原を用いたＢ型肝炎ワクチンに関する。
Ｂ型肝炎に対する予防ワクチンとしてＨＢｓ－Ｓ抗原が用いられているが、約１０％の人は同ワクチンを投与してもＨＢｓ抗体の産生がみられず（ＨＢワクチン無反応者）、感染防御ができない。またＢ型肝炎の抗ウイルス療法として、核酸アナログ製剤の内服治療とインターフェロン治療が提案されているが、核酸アナログ治療については内服を始めると中断できず、一生継続する必要があり、インターフェロン治療は多くの副作用を伴う。また共に治療してもＨＢＶ抗原・抗体のセロコンバージョンは得られにくい。過去にＢ型肝炎のＨＢｓ－Ｓ抗原を用いた免疫治療も試みられているが、十分な治療効果は得られていない。そこで、Ｂ型肝炎ウイルス感染予防のために、現行ワクチンと異なる、より強力な免疫作用を持つＨＢｓ－Ｌ抗原による予防ワクチンの開発と、同抗原を治療ワクチンとして用いた免疫治療の開発を目的とした。
本発明者は、Ｌ抗原だけを提示する粒子を利用してＢ型肝炎ワクチン可能性を検討したところ、従来のものより優れた効果が期待できることを発見し、本発明を成すことに成功した。
ＨＢＶのウイルス粒子表面にはＨＢｓ－Ｌ抗原、ＨＢｓ－Ｍ抗原、ＨＢｓ－Ｓ抗原の３種類の蛋白質が存在する（図１、図２）。ＨＢｓ－Ｌ抗原は、表面に提示されるタンパク質のＮ末からＰｒｅ－Ｓ１領域、Ｐｒｅ－Ｓ２領域、Ｓ領域の３つの領域からなる。Ｐｒｅ－Ｓ１領域はＨＢＶが感染する肝細胞を認識し結合するセンサー領域であり、ＨＢＶ感染機構の最初のステップで重要な役割を持っている。Ｐｒｅ－Ｓ２領域は発癌との関与が推定されている他、ＨＢＶが感染細胞へ侵入する際に役割を果たすと言われている。また、Ｓ領域はＨＢＶがウイルス粒子としての構造を保持するために重要な膜貫通ドメインを有している。ＨＢｓ－Ｌ抗原は３つの領域から成っているが、ＨＢｓ－Ｍ抗原はＰｒｅ－Ｓ１領域を欠き、ＨＢｓ－Ｓ抗原はＰｒｅ－Ｓ１とＰｒｅ－Ｓ２領域を持たず、Ｓ領域のみから成っている。ＨＢｓ－Ｌ抗原を形成するＬタンパク質は通常４００個のアミノ酸からなっているが、欠失が多いタイプでは、例えば３８２個のアミノ酸からなるものもある。４００個のアミノ酸からなる場合、Ｐｒｅ－Ｓ１領域はＮ末側からの１番から１１９番目まで、Ｐｒｅ－Ｓ２領域は１２０番から１７４番目まで、Ｓ領域は１７５～４００番目までのアミノ酸で構成されている。種々の変異体を通じて、各領域の重要なアミノ酸配列は良く保存されており、欠失が多いものでも３つの領域を区別することは容易である。現行のワクチンは製造上の簡便性からＨＢｓ－Ｓ抗原が用いられている。しかしＨＢＶが肝細胞に吸着する時にはＬ抗原のＰｒｅ－Ｓ１領域が重要でありため、本領域に対する抗体又は細胞性免疫が誘導されていることが望ましい。
そこで本発明においては、ビークル社で開発製造されているＨＢｓ－Ｌ抗原（配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む）を免疫することで、現状よりもより強力な感染発症予防効果を示すワクチンの開発を試みた。ビークル社では、Ｐｒｅ－Ｓ１領域のＮ末の１１アミノ酸を５個のシグナルペプチドと置き換え、且つ、１６３番目から１６８番目（Ｐｒｅ－Ｓ２領域の４４から４９番目）のアミノ酸を欠失させることで、Ｌタンパク質のみから成るＨＢｓ－Ｌ抗原の安定な大量製造に成功しているものである。
ＨＢＶが感染可能な小動物であるツパイ（図４）又はウサギ（図５）にＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫し、その血清についてＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原に対する抗体価をＥＬＩＳＡ法及び中和抗体価により定量化し比較した。
そこで本発明においては、ビークル社で開発製造されているＨＢｓ－Ｌ抗原（配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む）を免疫することで、現状よりもより強力な感染発症予防効果を示すワクチンの開発を試みた。ビークル社では、Ｐｒｅ－Ｓ１領域のＮ末の１１アミノ酸を５個のシグナルペプチドと置き換え、且つ、１６３番目から１６８番目（Ｐｒｅ－Ｓ２領域の４４から４９番目）のアミノ酸を欠失させることで、Ｌタンパク質のみから成るＨＢｓ－Ｌ抗原の安定な大量製造に成功しているものである。
ＨＢＶが感染可能な小動物であるツパイ（図４）又はウサギ（図５）にＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫し、その血清についてＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原に対する抗体価をＥＬＩＳＡ法及び中和抗体価により定量化し比較した。
ＨＢｓ－Ｌ抗原を免疫した動物の血清中にはＨＢｓ－Ｌ抗原と特異的に結合する抗体が、ＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した動物の血清中にはＨＢｓ－Ｓ抗原と特異的に結合する抗体が多く産生されていた（図６，図７，図８）。
ＨＢｓ－Ｌ抗原、あるいはＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した血清の中和抗体価について比較検討したところ、ＨＢｓ－Ｌ抗原を免役したツパイ血清の方が高い中和抗体価を示した（図９）。また、この中和活性を示す抗体の結合強度を評価するために、それぞれを希釈して中和試験を行ったところ、ＨＢｓ－Ｌ抗原を免役したツパイ血清の方がＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した方よりもより強い結合活性を示した（図１０）。以上のことから、現行のＨＢｓ－Ｓ抗原によるワクチンよりもＨＢｓ－Ｌ抗原による予防ワクチンの方が優れていることが示された。
さらに、Ｌ抗原にアラムアジュバントを結合させたものを作製し、これをマウスに投与して血清を調製した。血清中の抗体価の測定を行った結果、Ｐｒｅ－Ｓ１抗体が、Ｐｒｅ－Ｓ２抗体及びＳ抗体に比べ、約１０倍程度の高い抗体価を有するＰｒｅ－Ｓ１抗体を作製することが分かった。
ＨＢｓ－Ｌ抗原、あるいはＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した血清の中和抗体価について比較検討したところ、ＨＢｓ－Ｌ抗原を免役したツパイ血清の方が高い中和抗体価を示した（図９）。また、この中和活性を示す抗体の結合強度を評価するために、それぞれを希釈して中和試験を行ったところ、ＨＢｓ－Ｌ抗原を免役したツパイ血清の方がＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した方よりもより強い結合活性を示した（図１０）。以上のことから、現行のＨＢｓ－Ｓ抗原によるワクチンよりもＨＢｓ－Ｌ抗原による予防ワクチンの方が優れていることが示された。
さらに、Ｌ抗原にアラムアジュバントを結合させたものを作製し、これをマウスに投与して血清を調製した。血清中の抗体価の測定を行った結果、Ｐｒｅ－Ｓ１抗体が、Ｐｒｅ－Ｓ２抗体及びＳ抗体に比べ、約１０倍程度の高い抗体価を有するＰｒｅ－Ｓ１抗体を作製することが分かった。
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質、Ｍタンパク質及びＳタンパク質のうち、Ｌタンパク質又はその変異体のみが脂質膜上に集合し、形成された表面抗原粒子を含む、Ｂ型肝炎ワクチンを提供する。
本発明のワクチンには、Ｌタンパク質のほか、その変異体を使用することもできる。例えば、本発明のＬタンパク質又はその変異体として以下のタンパク質を例示することができる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域において１３個以下であって且つ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
本発明のワクチンには、Ｌタンパク質のほか、その変異体を使用することもできる。例えば、本発明のＬタンパク質又はその変異体として以下のタンパク質を例示することができる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域において１３個以下であって且つ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
上記（ｂ）のタンパク質は、Ｌ抗原として機能するタンパク質である。「Ｌ抗原として機能するタンパク質」とは、動物にＬ抗原を接種したときに抗体を産生させ、当該抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスして中和活性を有するようにワクチンとして機能するタンパク質であることを意味する。
また、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってＬ抗原として機能するタンパク質も本発明において使用することができる。このようなタンパク質のアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から５番目のＫＶＲＱＧ（配列番号５）に代わってＭＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧ（配列番号６）が挿入されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１５６番と１５７番との間へＳＩＦＳＲＴ（配列番号７）の６個のアミノ酸が挿入された配列
（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６３番目から３８５番目のＳ領域において１３個以下のアミノ酸が置換された配列
（ｉｖ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であって且つ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失又は置換された配列（１５６番と１５７番の間への６個のアミノ酸の挿入を除く）
などが挙げられる。
また、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってＬ抗原として機能するタンパク質も本発明において使用することができる。このようなタンパク質のアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から５番目のＫＶＲＱＧ（配列番号５）に代わってＭＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧ（配列番号６）が挿入されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１５６番と１５７番との間へＳＩＦＳＲＴ（配列番号７）の６個のアミノ酸が挿入された配列
（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６３番目から３８５番目のＳ領域において１３個以下のアミノ酸が置換された配列
（ｉｖ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であって且つ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失又は置換された配列（１５６番と１５７番の間への６個のアミノ酸の挿入を除く）
などが挙げられる。
本発明において、Ｌタンパク質及びその変異体の作製方法は特に限定されず、酵母などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
Ｌタンパク質を遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該Ｌタンパク質をコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、Ｌタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
上記の変異体タンパク質を調製するために、該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）に変異を導入する。変異導入には、変異を持った遺伝子情報を元に発現ベクターを構築するほか、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ、Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
Ｌタンパク質を遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該Ｌタンパク質をコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、Ｌタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
上記の変異体タンパク質を調製するために、該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）に変異を導入する。変異導入には、変異を持った遺伝子情報を元に発現ベクターを構築するほか、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ、Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるＬタンパク質を採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的のＬタンパク質が宿主内に生産される場合には、宿主を破砕することによりＬタンパク質を抽出する。また、Ｌタンパク質が宿主外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により宿主を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることにより、Ｌタンパク質を単離精製することができる。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるＬタンパク質を採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的のＬタンパク質が宿主内に生産される場合には、宿主を破砕することによりＬタンパク質を抽出する。また、Ｌタンパク質が宿主外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により宿主を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることにより、Ｌタンパク質を単離精製することができる。
本発明においては、無細胞合成系を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によりＬタンパク質を得ることもできる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（インビトロジェン社）等を用いることができる。
さらに、本発明において使用されるＬタンパク質は、自己組織化能を有し、脂質膜上に集合して粒子を形成することにより抗原提示させることができる。すなわち、Ｓクンパク質、Ｍタンパク質及びＬタンパク質は、何れも脂質親和性の高いＳ領域を持っており、いずれのタンパク質も、生物細胞を利用して製造すると脂質膜に突き刺さって存在する状態となる。これにより、当該タンパク質は安定な抗原粒子構造を取り、この粒子構造のため高い免疫原性を持つことになる。このように抗原提示させる方法として、第４０８５２３１号又は第４９３６２７２号特許に記載されている方法が挙げられる。
さらに、本発明において使用されるＬタンパク質は、自己組織化能を有し、脂質膜上に集合して粒子を形成することにより抗原提示させることができる。すなわち、Ｓクンパク質、Ｍタンパク質及びＬタンパク質は、何れも脂質親和性の高いＳ領域を持っており、いずれのタンパク質も、生物細胞を利用して製造すると脂質膜に突き刺さって存在する状態となる。これにより、当該タンパク質は安定な抗原粒子構造を取り、この粒子構造のため高い免疫原性を持つことになる。このように抗原提示させる方法として、第４０８５２３１号又は第４９３６２７２号特許に記載されている方法が挙げられる。
さらに、本発明においては、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質を前記粒子と混合する他に、Ｌタンパク質粒子の表面又は内部に含めることもできる。コアタンパク質の作製法は、既に報告されている非特許文献（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ．２００１ ２５；７５３（１）：５１－６５）などの方法を利用することが出来る。
本発明において得られるワクチンは、被検者への投与によりＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１及び／又はＰｒｅＳ２領域に対する抗体が産生される。また、被検者への投与によりＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１及び／又はＰｒｅＳ２領域に対する細胞性免疫が誘導される。さらに、コアタンパク質を含めたワクチンは、被検者への投与によりコアタンパク質に対する抗体が誘導され、あるいは、コアタンパク質に対する細胞性免疫が誘導される。
抗体が誘導されたことの確認は、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。また、本明細書において、「細胞性免疫」とは、食細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞等が体内の異物排除を担当する免疫系である。
このときのＢ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価は、少なくとも２から１０００であり、Ｂ型肝炎ウイルスのヒト肝細胞への結合に対する阻害効果は、少なくとも５０～１００％である。
抗体が誘導されたことの確認は、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。また、本明細書において、「細胞性免疫」とは、食細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞等が体内の異物排除を担当する免疫系である。
このときのＢ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価は、少なくとも２から１０００であり、Ｂ型肝炎ウイルスのヒト肝細胞への結合に対する阻害効果は、少なくとも５０～１００％である。
本発明のワクチンは、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に導入することができる。さらに、本発明のワクチンに含まれるＨＢｓ－Ｌ抗原と、既存の抗ウイルス薬（例えばインターフェロン）を併用することも可能である。併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明のワクチンと既存のワクチン又は抗ウイルス薬とを同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
また、本発明のワクチンは、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合し、ワクチン組成物として使用することができる。
また、本発明のワクチンは、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合し、ワクチン組成物として使用することができる。
本発明のワクチン組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、噴霧剤、外用剤、坐剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔等への局部注射あるいは経鼻噴霧等が例示される。
ワクチン又はワクチン組成物の投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、ＨＢｓ－Ｌ抗原の一日投与量としては、皮下注射の場合は５～４００マイクログラム程度、好ましくは１０～１００マイクログラム程度であり、経鼻噴霧の場合は５～４００マイクログラム程度、好ましくは１０～１００マイクログラム程度である。本発明のワクチン又はワクチン組成物は、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
ワクチン又はワクチン組成物の投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、ＨＢｓ－Ｌ抗原の一日投与量としては、皮下注射の場合は５～４００マイクログラム程度、好ましくは１０～１００マイクログラム程度であり、経鼻噴霧の場合は５～４００マイクログラム程度、好ましくは１０～１００マイクログラム程度である。本発明のワクチン又はワクチン組成物は、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
［実施例１］
Ｌ抗原の製造
本実施例においては、Ｌ抗原として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するＬタンパク質が脂質膜上に集合して出来たウイルス様粒子を用い、特許第４０８５２３１号明細書に記載されている方法で調製した。具体的には、特許第４０８５２３１号明細書に記載の方法により、Ｌ抗原を発現する酵母を調製した。この酵母を培養し、培養後、特許第４９３６２７２号明細書に記載の方法により、ガラスビーズを利用して培養菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を７０℃にて２０分間の熱処理に供した。熱処理後に遠心工程に供し、得られた上清を回収した、その後、回収された上清を硫酸セルロファインカラム及びゲル濾過カラムを用いて精製し、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮して、Ｌ抗原を得た。
［実施例２］
本実施例においては、Ｌ抗原として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するＬタンパク質が脂質膜上に集合して出来たウイルス様粒子を用い、特許第４０８５２３１号明細書に記載されている方法で調製した。具体的には、特許第４０８５２３１号明細書に記載の方法により、Ｌ抗原を発現する酵母を調製した。この酵母を培養し、培養後、特許第４９３６２７２号明細書に記載の方法により、ガラスビーズを利用して培養菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を７０℃にて２０分間の熱処理に供した。熱処理後に遠心工程に供し、得られた上清を回収した、その後、回収された上清を硫酸セルロファインカラム及びゲル濾過カラムを用いて精製し、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮して、Ｌ抗原を得た。
［実施例２］
Ｌ抗原の生化学的・物理化学的性質
製造したＬ抗原を電気泳動し銀染色すると、図３左パネルに示すように４５ｋＤａ付近の位置にＬ抗原のモノマーのバンドが見え、その２倍の分子量位置にＬ抗原のダイマーのバンドが見える。一方、Ｌ抗原をウェスタンブロットで検出すると図３右パネルに示すように、Ｓ抗体、Ｐｒｅ－Ｓ１抗体、及びＰｒｅ－Ｓ２抗体の何れの抗体を利用しても、４５ｋＤａ付近の位置とその約２倍の分子量の位置にバンドが見られた。
Ｌ抗原の粒子径はゼータサイザー（マルバーン社）を用いて動的光散乱法によって行った。その結果、粒子径は５９．７ｎｍであり、本抗原が粒子を形成していることが分かる。なお、乾燥状態で測定する電子顕微鏡では粒子径は凡そ２０ｎｍ程度になるが、本方式では粒子サイズは水溶液中で測定するため、粒子径より大きくなる。
以上の結果は、このＬ抗原が、Ｓタンパク質及びＭタンパク質を含まず、Ｌタンパク質のみからなる抗原であり、しかも粒子を形成していることを示している。
［実施例３］
製造したＬ抗原を電気泳動し銀染色すると、図３左パネルに示すように４５ｋＤａ付近の位置にＬ抗原のモノマーのバンドが見え、その２倍の分子量位置にＬ抗原のダイマーのバンドが見える。一方、Ｌ抗原をウェスタンブロットで検出すると図３右パネルに示すように、Ｓ抗体、Ｐｒｅ－Ｓ１抗体、及びＰｒｅ－Ｓ２抗体の何れの抗体を利用しても、４５ｋＤａ付近の位置とその約２倍の分子量の位置にバンドが見られた。
Ｌ抗原の粒子径はゼータサイザー（マルバーン社）を用いて動的光散乱法によって行った。その結果、粒子径は５９．７ｎｍであり、本抗原が粒子を形成していることが分かる。なお、乾燥状態で測定する電子顕微鏡では粒子径は凡そ２０ｎｍ程度になるが、本方式では粒子サイズは水溶液中で測定するため、粒子径より大きくなる。
以上の結果は、このＬ抗原が、Ｓタンパク質及びＭタンパク質を含まず、Ｌタンパク質のみからなる抗原であり、しかも粒子を形成していることを示している。
［実施例３］
チオレドキシン融合Ｐｒｅ－Ｓ１とＰｒｅ－Ｓ２の作製
Ｐｒｅ－Ｓ１領域又はＰｒｅ－Ｓ２領域のＤＮＡ断片は、ＨＢｓＡｇ Ｌ－Ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を含むｐＧＬＤ－ＬＩＩＰ３９－ＲｃＴ（Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９２，２６７：１９５３－１９６１）から調製した。得られたＤＮＡ断片をｐＥＴ－３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩサイトに挿入し、発現ベクターｐＥＴ－３２ａ－Ｐｒｅ－Ｓ１及びｐＥＴ－３２ａ－Ｐｒｅ－Ｓ２とした。これらの発現ベクターを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、発現株を得た。発現菌体は、培養液にＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し、発現誘導かけることで得た。
発現菌体を超音波破砕することでタンパク質を抽出し、Ｎｉカラム（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）かけ、イミダゾール濃度を上げることでＰｒｅ－Ｓ１－ＴＲＸタンパク質及びＰｒｅ－Ｓ２－ＴＲＸタンパク質を溶出させた。
精製物はＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で透析後、冷凍保存した。なお、タンパク質濃度を測定は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて行った。
［実施例４］
Ｐｒｅ－Ｓ１領域又はＰｒｅ－Ｓ２領域のＤＮＡ断片は、ＨＢｓＡｇ Ｌ－Ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を含むｐＧＬＤ－ＬＩＩＰ３９－ＲｃＴ（Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９２，２６７：１９５３－１９６１）から調製した。得られたＤＮＡ断片をｐＥＴ－３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩサイトに挿入し、発現ベクターｐＥＴ－３２ａ－Ｐｒｅ－Ｓ１及びｐＥＴ－３２ａ－Ｐｒｅ－Ｓ２とした。これらの発現ベクターを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、発現株を得た。発現菌体は、培養液にＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し、発現誘導かけることで得た。
発現菌体を超音波破砕することでタンパク質を抽出し、Ｎｉカラム（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）かけ、イミダゾール濃度を上げることでＰｒｅ－Ｓ１－ＴＲＸタンパク質及びＰｒｅ－Ｓ２－ＴＲＸタンパク質を溶出させた。
精製物はＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で透析後、冷凍保存した。なお、タンパク質濃度を測定は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて行った。
［実施例４］
Ｌ抗原投与時の抗体産生
Ｌ抗原にアラムアジュバントを結合させたものを調製した。これをマウス（ＩＣＲ 日本チャールズリバー、ｎ＝３）に、１匹当りＬ抗原として５μｇを２週間間隔で３回投与し、最終投与４週間後に採血し、血清を調製した。
血清中のＰｒｅ－Ｓ１，Ｐｒｅ－Ｓ２，Ｓ抗体の測定は次の通り行った。
抗Ｓ抗体については、Ｓ抗原（ａｄｒ型のＳ抗原粒子、ビークル社製）を固相化したＥＬＩＳＡプレートに血清サンプルをアプライし、抗原に結合したＳ抗体を、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧを２次抗体として利用して測定した。なお、Ｓ抗体を定量するために、市販のマウスの抗Ｓ抗原モノクローナル抗体（ＨＢ５ ＥＸＢＩＯ社）を検量線用の標準抗体として利用した。
Ｐｒｅ－Ｓ１抗体については次の通り行った。即ち、実施例３で調整したＰｒｅ－Ｓ１－ＴＲＸタンパク質をＥＬＴＳＡプレートに固相化し、その後はＳ抗体の測定と同様に行った。
Ｌ抗原にアラムアジュバントを結合させたものを調製した。これをマウス（ＩＣＲ 日本チャールズリバー、ｎ＝３）に、１匹当りＬ抗原として５μｇを２週間間隔で３回投与し、最終投与４週間後に採血し、血清を調製した。
血清中のＰｒｅ－Ｓ１，Ｐｒｅ－Ｓ２，Ｓ抗体の測定は次の通り行った。
抗Ｓ抗体については、Ｓ抗原（ａｄｒ型のＳ抗原粒子、ビークル社製）を固相化したＥＬＩＳＡプレートに血清サンプルをアプライし、抗原に結合したＳ抗体を、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧを２次抗体として利用して測定した。なお、Ｓ抗体を定量するために、市販のマウスの抗Ｓ抗原モノクローナル抗体（ＨＢ５ ＥＸＢＩＯ社）を検量線用の標準抗体として利用した。
Ｐｒｅ－Ｓ１抗体については次の通り行った。即ち、実施例３で調整したＰｒｅ－Ｓ１－ＴＲＸタンパク質をＥＬＴＳＡプレートに固相化し、その後はＳ抗体の測定と同様に行った。
なお、検量線用の標準抗体としてはＰｒｅ－Ｓ１モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＨＢｓ Ｐｒｅ－Ｓ１，ｍｏｎｏ １、ビークル社製）を利用した。Ｐｒｅ－Ｓ２抗体の測定は、Ｐｒｅ－Ｓ１の場合と同じく、調製したＰｒｅ－Ｓ２－ＴＲＸタンパク質をＥＬＩＳＡプレートに固相化したものを利用して測定した。検量線用の標準抗体としてはＰｒｅ－Ｓ２モノクローナル抗体（２ＡＰＳ４２、（株）特殊免疫研究所）を利用した。得たれた結果を表１に示す。
表１に示される通り、Ｌ抗原を投与すると、Ｐｒｅ－Ｓ１抗体はＰｒｅ－Ｓ２やＳ抗体に比べ約１０倍程度の高いＰｒｅ－Ｓ１抗体を作ることが分かった。このことは、Ｌタンパク質だけで出来たＬ抗原は非常に大量のＰｒｅ－Ｓ１抗体を作るのに適した抗原であることを示す。
［実施例５］
［実施例５］
ＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原を、ウサギ、又はＨＢＶが感染可能な小動物であるツパイに免疫後、経日的に採血を行った（図４、図５）。この血清についてＨＢｓ－Ｌ抗原、ＨＢｓ－Ｓ抗原に対する抗体価をＥＬＩＳＡ法により定量化し比較した。また、ＨＢＶ感染感受性培養細胞を用いて中和抗体誘導効果の定量化を行った。また、ＨＢＶが感染可能な小動物であるツパイからは経日的に末梢血を採取し、凍結保存した。この細胞を用いて細胞性免疫の誘導効果の定量化比較を行った。
１）．ウイルス
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ジェノタイプＣ（Ｃ＿ＪＰＮＡＴ）を使用した。本ウイルスをヒト初代培養肝細胞（ＰＸＢ細胞；フェニックスバイオ社）に感染させ、ウイルスを増殖させた細胞の培養上清をウイルス液として使用した。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ジェノタイプＣ（Ｃ＿ＪＰＮＡＴ）を使用した。本ウイルスをヒト初代培養肝細胞（ＰＸＢ細胞；フェニックスバイオ社）に感染させ、ウイルスを増殖させた細胞の培養上清をウイルス液として使用した。
２）．ウイルスと細胞
ウイルスの感染実験には、ＨｅｐＧ２細胞にヒトのＮＴＣＰ遺伝子を導入し発現させたＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞を用いた。ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞の培養にはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ１２－Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＨＥＰＥＳを１０ｍＭ、加熱非働化牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）を１０％、Ｉｎｓｕｌｉｎを５μｇ／ｍｌ、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを１μｇ／ｍｌ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎが１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが１００μｇ／ｍｌとなるように加えたものを増殖用培地として用いた。
ウイルスの感染実験には、ＨｅｐＧ２細胞にヒトのＮＴＣＰ遺伝子を導入し発現させたＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞を用いた。ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞の培養にはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ１２－Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＨＥＰＥＳを１０ｍＭ、加熱非働化牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）を１０％、Ｉｎｓｕｌｉｎを５μｇ／ｍｌ、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを１μｇ／ｍｌ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎが１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが１００μｇ／ｍｌとなるように加えたものを増殖用培地として用いた。
３）．動物
ツパイ（Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉ）は中国科学院昆明動物研究所より購入し、自家繁殖した個体を使用した。ウサギはＳｌｃ：ＮＺＷ（日本エスエルシー株式会社）６週齢を用いた。
４）．免疫抗原
各動物への免疫には、ＨＢｓ Ｓ－抗原，ＨＢｓ Ｌ－抗原，ＨＢｃ抗原（ビークル社）を使用した。
ツパイ（Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉ）は中国科学院昆明動物研究所より購入し、自家繁殖した個体を使用した。ウサギはＳｌｃ：ＮＺＷ（日本エスエルシー株式会社）６週齢を用いた。
４）．免疫抗原
各動物への免疫には、ＨＢｓ Ｓ－抗原，ＨＢｓ Ｌ－抗原，ＨＢｃ抗原（ビークル社）を使用した。
５）．動物への免疫
ツパイにおいては、ＨＢｓ Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ又はＨＢｓ Ｌ－ｐｒｏｔｅｉｎとＨＢｃ ｐｒｏｔｅｉｎとが、それぞれ１００μｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した抗原液を１００μｌ、３頭ずつツパイの背部に皮下接種した。免疫は２週間おきに５回行った後、４週間後に再度免疫を行った。採血は、免疫時および最終免疫の１週間後に実施し、ＥＤＴＡ採血管を用いた。血液は２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血漿を分離した。血漿は使用時まで－８０℃にて保存した。
ウサギへの初回免疫には、ＨＢｓ Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）又はＨＢｓ Ｌ－ｐｒｏｔｅｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）とフロイントコンプリートアジュバント（和光社）とを等量混合した抗原液を１００μｌ、３頭ずつウサギの背部に皮下接種した。１か月後に２回目の免疫を行い、その際には、フロイントコンプリートアジュバントの代わりにインコンプリートアジュバント（和光社）を蛋白液と混合して抗原液を作製し、背部に皮下接種した。免疫１か月後に採血を行った。血液は１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血清を分離した。血清は使用時まで－８０℃にて保存した。
ツパイにおいては、ＨＢｓ Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ又はＨＢｓ Ｌ－ｐｒｏｔｅｉｎとＨＢｃ ｐｒｏｔｅｉｎとが、それぞれ１００μｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した抗原液を１００μｌ、３頭ずつツパイの背部に皮下接種した。免疫は２週間おきに５回行った後、４週間後に再度免疫を行った。採血は、免疫時および最終免疫の１週間後に実施し、ＥＤＴＡ採血管を用いた。血液は２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血漿を分離した。血漿は使用時まで－８０℃にて保存した。
ウサギへの初回免疫には、ＨＢｓ Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）又はＨＢｓ Ｌ－ｐｒｏｔｅｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）とフロイントコンプリートアジュバント（和光社）とを等量混合した抗原液を１００μｌ、３頭ずつウサギの背部に皮下接種した。１か月後に２回目の免疫を行い、その際には、フロイントコンプリートアジュバントの代わりにインコンプリートアジュバント（和光社）を蛋白液と混合して抗原液を作製し、背部に皮下接種した。免疫１か月後に採血を行った。血液は１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血清を分離した。血清は使用時まで－８０℃にて保存した。
６）．ツパイ検体からの抗体検出ＥＬＩＳＡによる抗ＨＢｓ抗体の検出
捕捉抗原として、ＨＢｓ Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ又はＨＢｓ Ｌ－ｐｒｏｔｅｉｎが２μｇ／ｍｌとなるように０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３カーボネートバッファー（ｐＨ９．６）で希釈した抗原液を９６穴プレートに各穴５０μｌずつ分注して、４℃で一晩インキュベーションした。その後、これにブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ）を各穴１００μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベートしてブロッキングした。これを２００μｌの０．５％ Ｔｗｅｅｎ添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファーで１，０００倍に希釈した血漿を各穴５０μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベーションした。
捕捉抗原として、ＨＢｓ Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ又はＨＢｓ Ｌ－ｐｒｏｔｅｉｎが２μｇ／ｍｌとなるように０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３カーボネートバッファー（ｐＨ９．６）で希釈した抗原液を９６穴プレートに各穴５０μｌずつ分注して、４℃で一晩インキュベーションした。その後、これにブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ）を各穴１００μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベートしてブロッキングした。これを２００μｌの０．５％ Ｔｗｅｅｎ添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファーで１，０００倍に希釈した血漿を各穴５０μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベーションした。
その後、再度２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した後、２次抗体としてブロッキングバッファーで１μｇ／ｍｌに希釈した抗ツパイＩｇＧウサギ抗体を各穴５０μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベーションした。その後、２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した後、３次抗体としてブロッキングバッファーで１０，０００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧロバ抗体を各穴５０μｌずつ加え、３７℃で１時間インキュベーションした。２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．１５Ｍクエン酸バッファー１０ｍｌあたりオルトフェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）を４０ｍｇ溶解し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を４μｌ加えたものを各穴１００μｌずつ加えた。室温で１０分間発色させた後、反応停止液として２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各穴５０μｌずつ加え、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
７）．中和試験
（１）細胞の調製
中和試験には、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞を使用した。コラーゲンコートした４８穴プレートに２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで各穴２５０μｌずつ播種した。３７℃で２４時間培養後、培地を３％ＤＭＳＯ添加増殖用培地に置き換えた。さらに３７℃で２４時間培養した細胞を中和試験に用いた。
（１）細胞の調製
中和試験には、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞を使用した。コラーゲンコートした４８穴プレートに２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで各穴２５０μｌずつ播種した。３７℃で２４時間培養後、培地を３％ＤＭＳＯ添加増殖用培地に置き換えた。さらに３７℃で２４時間培養した細胞を中和試験に用いた。
（２）中和試験の術式
検体の血清・血漿サンプルを増殖用培地で１０倍希釈し、さらに２倍階段希釈を行った。これら血清・血漿サンプルおよびコントロールとして増殖用培地と６．０×１０６ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌに調製したウイルス液を等量ずつ混合し、３７℃で１時間静置し、反応させた。反応後、４８穴プレートに播種されたＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞に混合液を各穴１２５μｌ接種し、３７℃で３時間静置し、反応させた。反応後、接種した混合液を除去し、１２５μｌの増殖用培地を各穴注ぎ、５回洗浄を行った。洗浄後、細胞を先太チップで回収し、使用時まで－８０℃に凍結保存した。
検体の血清・血漿サンプルを増殖用培地で１０倍希釈し、さらに２倍階段希釈を行った。これら血清・血漿サンプルおよびコントロールとして増殖用培地と６．０×１０６ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌに調製したウイルス液を等量ずつ混合し、３７℃で１時間静置し、反応させた。反応後、４８穴プレートに播種されたＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞に混合液を各穴１２５μｌ接種し、３７℃で３時間静置し、反応させた。反応後、接種した混合液を除去し、１２５μｌの増殖用培地を各穴注ぎ、５回洗浄を行った。洗浄後、細胞を先太チップで回収し、使用時まで－８０℃に凍結保存した。
（３）ウイルス遺伝子の定量
凍結保存した細胞からの遺伝子抽出はスマイテストＥＸ－Ｒ＆Ｄ（日本ジェネティクス）を使用した。ウイルス遺伝子の定量はリアルタイムＰＣＲ法により決定した。ＰＣＲ反応液３０μｌには、遺伝子が２５０ｎｇ、フォワードプライマーＨＢ－１６６－Ｓ２１（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ［ｎｔｓ］１６６－１８６；５’－ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣ－３’（配列番号２））が６ｐｍｏｌ，リバースプライマーＨＢ－３４４－Ｒ２０（ｎｔｓ ３４４－３２５；５’－ＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧ－３’（配列番号３））が６ｐｍｏｌ，ＴａｑＭａｎプローブＨＢ－２４２－Ｓ２６ＦＴ（ｎｔｓ ２４２－２６７；５’－ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号４））が９ｐｍｏｌ，Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）が１５μｌ含まれる。ＰＣＲサイクルは５０℃ ２分、９５℃ １０分の反応後、９５℃ ２０秒と６０℃ １分の反応を５３回繰り返した。
凍結保存した細胞からの遺伝子抽出はスマイテストＥＸ－Ｒ＆Ｄ（日本ジェネティクス）を使用した。ウイルス遺伝子の定量はリアルタイムＰＣＲ法により決定した。ＰＣＲ反応液３０μｌには、遺伝子が２５０ｎｇ、フォワードプライマーＨＢ－１６６－Ｓ２１（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ［ｎｔｓ］１６６－１８６；５’－ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣ－３’（配列番号２））が６ｐｍｏｌ，リバースプライマーＨＢ－３４４－Ｒ２０（ｎｔｓ ３４４－３２５；５’－ＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧ－３’（配列番号３））が６ｐｍｏｌ，ＴａｑＭａｎプローブＨＢ－２４２－Ｓ２６ＦＴ（ｎｔｓ ２４２－２６７；５’－ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号４））が９ｐｍｏｌ，Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）が１５μｌ含まれる。ＰＣＲサイクルは５０℃ ２分、９５℃ １０分の反応後、９５℃ ２０秒と６０℃ １分の反応を５３回繰り返した。
（４）中和抗体価の決定
それぞれの細胞サンプルよりウイルス遺伝子量を定量し、コントロールサンプルとのウイルス遺伝子量と比較した。コントロールサンプルの遺伝子サンプルと比較して、ウイルス遺伝子量が１０％以下となっているサンプルは抗体による中和反応陽性とみなし、中和抗体陽性とした。中和抗体価は、中和反応の見られた血漿・血清の最高希釈倍率の逆数で表した。
それぞれの細胞サンプルよりウイルス遺伝子量を定量し、コントロールサンプルとのウイルス遺伝子量と比較した。コントロールサンプルの遺伝子サンプルと比較して、ウイルス遺伝子量が１０％以下となっているサンプルは抗体による中和反応陽性とみなし、中和抗体陽性とした。中和抗体価は、中和反応の見られた血漿・血清の最高希釈倍率の逆数で表した。
結果
ＨＢＶのウイルス粒子表面にはＨＢｓ－Ｌ抗原、ＨＢｓ－Ｍ抗原、ＨＢｓ－Ｓ抗原の３種類の蛋白質が存在する（図１、図２）。現行のワクチンは製造上の簡便性からＨＢｓ－Ｓ抗原が用いられている。しかしＨＢＶが肝細胞に吸着する時にはＬ抗原のＮ末端が使われており、その領域に対する抗体又は細胞性免疫が誘導されていることが望ましい。そこでビークル社で開発製造されているＨＢｓ－Ｌ抗原（Ｒｅｆ．２）を免疫することで、現状よりもより強力な感染発症予防効果を示すワクチンの開発を試みた。ＨＢＶが感染可能な小動物であるツパイ（図４）又はウサギ（図５）にＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫し、その血清についてＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原に対する抗体価をＥＬＩＳＡ法及び中和抗体価により定量化し比較した。
ＨＢＶのウイルス粒子表面にはＨＢｓ－Ｌ抗原、ＨＢｓ－Ｍ抗原、ＨＢｓ－Ｓ抗原の３種類の蛋白質が存在する（図１、図２）。現行のワクチンは製造上の簡便性からＨＢｓ－Ｓ抗原が用いられている。しかしＨＢＶが肝細胞に吸着する時にはＬ抗原のＮ末端が使われており、その領域に対する抗体又は細胞性免疫が誘導されていることが望ましい。そこでビークル社で開発製造されているＨＢｓ－Ｌ抗原（Ｒｅｆ．２）を免疫することで、現状よりもより強力な感染発症予防効果を示すワクチンの開発を試みた。ＨＢＶが感染可能な小動物であるツパイ（図４）又はウサギ（図５）にＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫し、その血清についてＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原に対する抗体価をＥＬＩＳＡ法及び中和抗体価により定量化し比較した。
ＨＢｓ－Ｌ抗原を免疫した動物の血清中にはＨＢｓ－Ｌ抗原と特異的に結合する抗体が、ＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した動物の血清中にはＨＢｓ－Ｓ抗原と特異的に結合する抗体が多く産生されていた（図６，図７，図８）。ＨＢｓ－Ｌ抗原又はＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した血清の中和抗体価について比較検討したところ、ＨＢｓ－Ｌ抗原を免役したツパイ血清の方が高い中和抗体価を示した（図９）。また、この中和活性を示す抗体の結合強度を評価するために、それぞれを希釈して中和試験を行ったところ、ＨＢｓ－Ｌ抗原を免役したツパイ血清の方がＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した方よりもより強い結合活性を示した（図１０）。
以上のことから、現行のＨＢｓ－Ｓ抗原によるワクチンよりもＨＢｓ－Ｌ抗原による予防ワクチンの方が優れていることが示された。
以上のことから、現行のＨＢｓ－Ｓ抗原によるワクチンよりもＨＢｓ－Ｌ抗原による予防ワクチンの方が優れていることが示された。
考察
ＨＢｓ－Ｌ抗原でツパイ又はウサギに免役したところ、ＨＢｓ－Ｓ抗体ができるとともに、ＨＢｓ－Ｓ抗原と交叉性の少ないＨＢｓ－Ｌ抗原と特異的に反応するＰｒｅ－Ｓ１又はＰｒｅ－Ｓ２領域に対する抗体が主に産生されることが示された。また、ＨＢｓ－Ｌ抗原を免役したツパイ血清の方が高い中和抗体価を示し、且つＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した方よりもより強い結合活性を示した。Ｂ型肝炎ウイルスは肝細胞に吸着・侵入する際にＰｒｅ－Ｓ１又はＰｒｅ－Ｓ２領域が使われており、その領域に対する抗体又は細胞性免疫が誘導されることで、現状のワクチンよりも強力な感染予防効果が期待される。
ＨＢｓ－Ｌ抗原でツパイ又はウサギに免役したところ、ＨＢｓ－Ｓ抗体ができるとともに、ＨＢｓ－Ｓ抗原と交叉性の少ないＨＢｓ－Ｌ抗原と特異的に反応するＰｒｅ－Ｓ１又はＰｒｅ－Ｓ２領域に対する抗体が主に産生されることが示された。また、ＨＢｓ－Ｌ抗原を免役したツパイ血清の方が高い中和抗体価を示し、且つＨＢｓ－Ｓ抗原を免疫した方よりもより強い結合活性を示した。Ｂ型肝炎ウイルスは肝細胞に吸着・侵入する際にＰｒｅ－Ｓ１又はＰｒｅ－Ｓ２領域が使われており、その領域に対する抗体又は細胞性免疫が誘導されることで、現状のワクチンよりも強力な感染予防効果が期待される。
また、Ｂ型肝炎に対する治療ワクチンとしても（Ｒｅｆ．３，Ｒｅｆ．４）、ＨＢｓ－Ｌ抗原を用いることで、ＨＢｓ－Ｓ抗原に対する抗体と共に、Ｐｒｅ－Ｓ１又はＰｒｅ－Ｓ２領域に対する抗体又は細胞性免疫によりウイルスの肝細胞への吸着・侵入を阻害できると考えられ、Ｂ型肝炎ウイルス抗原・抗体のセロコンバージョンを誘導しうる抗ウイルス治療薬として用いられる。
ＨＢｓ－Ｌ抗原をユニバーサルワクチンとして用いることで、ＨＢワクチン無反応者を減少させ、Ｂ型肝炎ウイルスのより強い感染予防、さらにＢ型肝炎の根絶につながる可能性がある。また、ＨＢｓ－Ｌ抗原を治療ワクチンとして用いることで、核酸アナログ製剤やインターフェロンなど、現行の治療法の問題点を解消し、Ｂ型肝炎ウイルス抗原・抗体のセロコンバージョンを誘導しうる新しい抗ウイルス治療法として、Ｂ型肝炎患者に福音をもたらす可能性がある。
［実施例６］
Ｃ抗原の製造
［実施例６］
Ｃ抗原の製造
ＨＢｃＡｇの全長ＤＮＡ（ＡＣＣ＃ Ｘ０１５８７）をＨｉｓ－ｔａｇ等の配列を取り除いたｐＥＴ－１９ｂベクターに挿入し、ＨＢｃＡｇの発現ベクターを調製した。得られた発現ベクターを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）に導入し、発現株を得た。大腸菌株を培養し、菌体を得た。得られた菌体を破砕し、その上澄を硫安沈殿を行った。沈殿物を溶解しショ糖による密度勾配遠心によりＨＢｃＡｇ画分を得た。この画分をゲルろ過カラムを通して、ＨＢｃＡｇを精製した。精製したＨＢｃＡｇは電気泳動後の銀染色により２１ｋＤａのシングルバンドを示した（図１１）。なお、ＨＢｃＡｇは各コアタンパク質同士が相互に結合し、粒子を形成することが知られているが、粒子径はゼータサイザー（マルバーン社）を用いて動的光散乱法で測定した結果、４５ｎｍであり、粒子を形成していることが示された。
［実施例７］
マウス抗体検出ＥＬＩＳＡ（ＨＢｓ－Ｓ，－Ｍ，－Ｌ抗原投与）
［実施例７］
マウス抗体検出ＥＬＩＳＡ（ＨＢｓ－Ｓ，－Ｍ，－Ｌ抗原投与）
マウスにＨＢｓ－Ｓ、－Ｍ、－Ｌ抗原を投与して、Ｐｒｅ－Ｓ１ペプチド、Ｐｒｅ－Ｓ２ペプチド及びＨＢｓ－Ｓ抗原に対する結合を見ることで、Ｐｒｅ－Ｓ１、Ｐｒｅ－Ｓ２及びＳ抗原に対する各抗体量を測定した結果、Ｌ抗原を投与した場合のみＰｒｅ－Ｓ１抗体が産生された（図１２）。また、全体の約８割がＰｒｅ－Ｓ１に対する抗体であった。
Ｐｒｅ－Ｓ１はＨＢＶがヒト肝細胞に感染する時に肝細胞を認識する領域であるため、これに対する抗体が本当にＨＢＶの感染防御効果があれば、Ｌ抗原はより強いＨＢＶ感染防御作用を持つことになる。
［実施例８］
ＨＢｓ－Ｌ及びＨＢｃ抗原投与による細胞性免疫の活性化試験
Ｐｒｅ－Ｓ１はＨＢＶがヒト肝細胞に感染する時に肝細胞を認識する領域であるため、これに対する抗体が本当にＨＢＶの感染防御効果があれば、Ｌ抗原はより強いＨＢＶ感染防御作用を持つことになる。
［実施例８］
ＨＢｓ－Ｌ及びＨＢｃ抗原投与による細胞性免疫の活性化試験
ＨＢｓ－Ｌ抗原、ＨＢｃ抗原、及びＨＢｓ－Ｌ＋ＨＢｃ抗原を免疫したマウスから取り出した脾臓細胞を抗原で刺激し、細胞性免疫活性化（ＩＮＦ－γ上昇）を観察した（表２、図１３）。
ＨＢｓ－Ｌ抗原で免疫したマウスではＬ抗原で刺激しても細胞性免疫は殆ど活性化されなかった。ＨＢｃ抗原で免疫したマウスではＨＢｃ抗原及びＨＢｓ－Ｌ＋ＨＢｃ抗原で免疫すると細胞性免疫が活性化される。ＨＢｓ－Ｌ＋ＨＢｃ抗原で免疫したマウスでは全体に細胞性免疫が活性化され、特に、ＨＢｓ－Ｌ＋ＨＢｃ抗原刺激に対する活性化は大きかった。以上の結果は、ＨＢｓ－Ｌ抗原とＨＢｃ抗原を混合して免疫すると細胞性免疫が強く活性化されることを示す。
［実施例９］
Ｌ抗原の安全性試験
［実施例９］
Ｌ抗原の安全性試験
Ｌ抗原について、ラット（各群５例）を用いた単回静脈内投与毒性試験を非ＧＬＰ下で行った。対照群として、溶媒であるリン酸緩衝生理食塩水、及びＬ抗原として０．２、１、及び５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した結果、いずれの群でも一般状態に異常は認められず、死亡例もなかった。体重推移や剖検でも異常は認められなかった。以上のことから、最大耐用量は５ｍｇ／ｋｇを超えると推察された。
Ｌ抗原について、ラット（各群６例）を用いた２８日間反復静脈内投与毒性試験を非ＧＬＰ下で行った。対照群として溶媒であるリン酸緩衝生理食塩水、及びＬ抗原として０．０５、０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回２８日間投与した結果、いずれの群でも一般状態に異常は認められず、死亡例もなかった。また、体重推移でも異常は認められなかった。但し、脾臓重量の増加、及び白血球の増加が見られた。これらの異常は、Ｌ抗原を反復投与したことによる免疫反応と考えられた。以上のことから、毒性学的な最大無影響量は０．２５ｍｇ／ｋｇを超えると推察された。
Ｌ抗原について、ラット（各群６例）を用いた２８日間反復静脈内投与毒性試験を非ＧＬＰ下で行った。対照群として溶媒であるリン酸緩衝生理食塩水、及びＬ抗原として０．０５、０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回２８日間投与した結果、いずれの群でも一般状態に異常は認められず、死亡例もなかった。また、体重推移でも異常は認められなかった。但し、脾臓重量の増加、及び白血球の増加が見られた。これらの異常は、Ｌ抗原を反復投与したことによる免疫反応と考えられた。以上のことから、毒性学的な最大無影響量は０．２５ｍｇ／ｋｇを超えると推察された。
関連情報・論文
１）特許第４０８５２３１号
２）Ｓａｎａｄａ Ｔ，Ｔｓｕｋｉｙａｍａ－Ｋｏｈａｒａ Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｎ，Ｅｚｚｉｋｏｕｒｉ Ｓ，Ｂｅｎｊｅｌｌｏｕｎ Ｓ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｓ，Ｔａｎａｋａ Ｙ，Ｔａｔｅｎｏ Ｃ，Ｋｏｈａｒａ Ｍ．Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ｊａｎ ８；４６９（２）：２２９－３５．ｄｏｉ：１０，１０１６／ｊ．ｂ ｂｒｃ．２０１５．１１．１２１．
３）Ａｋｂａｒ ＳＭ，Ａｌ－Ｍａｈｔａｂ Ｍ，Ｊａｈａｎ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｏ，Ｈｉａｓａ Ｙ．Ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．１０（２）：２６７－７６，２０１６．
４）Ｆａｚｌｅ Ａｋｂａｒ ＳＭ，Ａｌ－Ｍａｈｔａｂ Ｍ，Ｈｉａｓａ Ｙ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｈｅｐａｔｏｌ．４（３）：２４１－６，２０１４．
１）特許第４０８５２３１号
２）Ｓａｎａｄａ Ｔ，Ｔｓｕｋｉｙａｍａ－Ｋｏｈａｒａ Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｎ，Ｅｚｚｉｋｏｕｒｉ Ｓ，Ｂｅｎｊｅｌｌｏｕｎ Ｓ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｓ，Ｔａｎａｋａ Ｙ，Ｔａｔｅｎｏ Ｃ，Ｋｏｈａｒａ Ｍ．Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ｊａｎ ８；４６９（２）：２２９－３５．ｄｏｉ：１０，１０１６／ｊ．ｂ ｂｒｃ．２０１５．１１．１２１．
３）Ａｋｂａｒ ＳＭ，Ａｌ－Ｍａｈｔａｂ Ｍ，Ｊａｈａｎ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｏ，Ｈｉａｓａ Ｙ．Ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．１０（２）：２６７－７６，２０１６．
４）Ｆａｚｌｅ Ａｋｂａｒ ＳＭ，Ａｌ－Ｍａｈｔａｂ Ｍ，Ｈｉａｓａ Ｙ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｈｅｐａｔｏｌ．４（３）：２４１－６，２０１４．
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
［配列表］
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
［配列表］
Claims (9)
- B型肝炎ウイルスのLタンパク質又はその変異体のみが脂質膜上に集合し、形成された表面抗原粒子を含む、B型肝炎ワクチンであって、Lタンパク質又はその変異体が、以下の(a)又は(b) のタンパク質である前記ワクチン。
(a) 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号１で表されるアミノ酸配列において、6番目から113番目のPre-S1領域内で6個以下、114番目から162番目のPre-S2領域内で6個以下、163番目から388番目のS領域内で13個以下であって且つ合計で16個以下のアミノ酸が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつB型肝炎ウイルスに対して中和活性を有する抗体を産生させる機能を有するタンパク質 - Lタンパク質又はその変異体が、酵母により発現されたものである請求項１に記載のワクチン。
- 被検者への投与によりLタンパク質のPre-S1及び/又はPreS2領域に対する抗体が産生される、請求項１又は２に記載のワクチン。
- 被検者への投与によりLタンパク質のPre-S1及び/又はPreS2領域に対する細胞性免疫が誘導される、請求項１～３のいずれか１項に記載のワクチン。
- さらにB型肝炎ウイルスのコアタンパク質を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のワクチン。
- 被検者への投与により、さらにコアタンパク質に対する抗体が誘導される、請求項５に記載のワクチン。
- 被検者への投与により、さらにコアタンパク質に対する細胞性免疫が誘導される、請求項５又は６に記載のワクチン。
- B型肝炎ウイルスに対する中和抗体価が、少なくとも2から1000である請求項１～７のいずれか１項に記載のワクチン。
- B型肝炎ウイルスのヒト肝細胞への結合に対する阻害効果が、少なくとも50～100%である請求項１～８のいずれか１項に記載のワクチン。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017138047 | 2017-07-14 | ||
| JP2017138047 | 2017-07-14 | ||
| PCT/JP2018/027412 WO2019013361A1 (ja) | 2017-07-14 | 2018-07-13 | Ｂ型肝炎ワクチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2019013361A1 JPWO2019013361A1 (ja) | 2020-07-16 |
| JP7295536B2 true JP7295536B2 (ja) | 2023-06-21 |
Family
ID=65001450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019529827A Active JP7295536B2 (ja) | 2017-07-14 | 2018-07-13 | Ｂ型肝炎ワクチン |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210228712A1 (ja) |
| JP (1) | JP7295536B2 (ja) |
| CN (1) | CN111163802A (ja) |
| WO (1) | WO2019013361A1 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004175665A (ja) | 2002-11-22 | 2004-06-24 | Japan Science & Technology Agency | タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤 |
| WO2007148924A1 (en) | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Dobeel Co., Ltd. | Use of colloidal gold as an adjuvant |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02449A (ja) * | 1987-04-20 | 1990-01-05 | Takeda Chem Ind Ltd | ペプチドの製造法 |
| WO2017210181A1 (en) * | 2016-05-30 | 2017-12-07 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to hepatitis b virus |
-
2018
- 2018-07-13 CN CN201880046625.8A patent/CN111163802A/zh active Pending
- 2018-07-13 JP JP2019529827A patent/JP7295536B2/ja active Active
- 2018-07-13 US US16/630,811 patent/US20210228712A1/en not_active Abandoned
- 2018-07-13 WO PCT/JP2018/027412 patent/WO2019013361A1/ja active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004175665A (ja) | 2002-11-22 | 2004-06-24 | Japan Science & Technology Agency | タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤 |
| WO2007148924A1 (en) | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Dobeel Co., Ltd. | Use of colloidal gold as an adjuvant |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAMADA, T. et al.，Physicochemical and immunological characterization of hepatitis B virus envelope particles exclusively consisting of the entire L (pre-S1 + pre-S2 + S) protein，Vaccine, 2001, Vol.19, p.3154-3163 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019013361A8 (ja) | 2019-12-26 |
| WO2019013361A1 (ja) | 2019-01-17 |
| CN111163802A (zh) | 2020-05-15 |
| JPWO2019013361A1 (ja) | 2020-07-16 |
| US20210228712A1 (en) | 2021-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI575070B (zh) | Ｈｂｖ聚合酶突變體 | |
| TWI775868B (zh) | 用於對ｈｂｖ產生免疫反應之類病毒粒子 | |
| EP3148566B1 (en) | Synthetic long peptides (slp) for therapeutic vaccination against hepatitis b virus infection | |
| EP2858674B1 (en) | An antibody composition for prevention or treatment of mutant hepatitis b virus infection | |
| EP2726499B1 (en) | Epitope of hepatitis b virus surface antigen and its use | |
| US10548973B2 (en) | Polypeptide carrier for presenting target polypeptide and uses thereof | |
| CN108503696B (zh) | 一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗 | |
| JP7295536B2 (ja) | Ｂ型肝炎ワクチン | |
| CN112262153A (zh) | 高效的肝炎病毒的抗体诱导方法、抗体以及检测系统 | |
| JP2018531911A (ja) | 融合タンパク質 | |
| KR20080052667A (ko) | 절단된 ｈｂｃ 코어 단백질과 사포닌계 보조제를 포함하는백신 | |
| KR100587944B1 (ko) | 보강제 및 ＨＢＶ 백신 성분인 Ｂ형 간염 바이러스의ｐｒｅ Ｓ단백질 | |
| KR101366702B1 (ko) | 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물 및 그의 제조방법 | |
| WO2011140984A1 (zh) | 抗hbv的多肽、其药物组合物及应用 | |
| KR102084912B1 (ko) | B형 간염 바이러스 표면 항원의 입체 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 | |
| JP2023102327A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスワクチン | |
| KR20220117627A (ko) | 백신 조성물과의 병용을 위한 hbv 특이적 항체를 포함하는 b형 간염 치료용 조성물 | |
| CN115335075A (zh) | 治疗和预防乙型肝炎和丁型肝炎的组合物和方法 | |
| Shamseldin | Development of Research Tools for Studying Hepatitis B Virus | |
| GB2440528A (en) | Antigen-antibody complexes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200115 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200214 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200401 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210615 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220621 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220816 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221019 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230117 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230310 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230509 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230601 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7295536 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |