KR20080052667A

KR20080052667A - 절단된 ｈｂｃ 코어 단백질과 사포닌계 보조제를 포함하는백신

Info

Publication number: KR20080052667A
Application number: KR1020087009128A
Authority: KR
Inventors: 칼 멜베르; 파스칼 부치만; 쯔비그뉴 자노윅츠
Original assignee: 라인 비오테크 게셀새프트 퓌르 너이에 비오테크놀로지세 프로제세 운트 프로덕테 엠비에이치
Priority date: 2005-09-16
Filing date: 2006-09-15
Publication date: 2008-06-11
Also published as: WO2007031334A2; CN101309931B; EP1764369A1; CA2622587A1; KR101320702B1; EP1924597B1; CN101309931A; JP5102209B2; ATE556089T1; EP1924597A2; AR056512A1; WO2007031334A3; AU2006291430A1; ES2386369T3; US20110059132A1; AU2006291430B2; JP2009507877A; HK1126228A1

Abstract

본 발명은 i) HBcAg₁ _-x(여기에서, x는 100 내지 160 범위의 정수이다), 이 항원의 단편, 이 항원 또는 이 항원의 단편의 변이체 또는 적어도 상기 두 가지의 혼합물, ii) 사포닌 또는 사포닌 유도체 또는 적어도 상기 두 가지의 혼합물을 포함하는 보조제, 및 선택적으로는 iii) HBsAg, 이 항원의 단편, 이 항원 또는 이 항원의 단편의 변이체 또는 상기 두 가지의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조성물의 제조방법, 상기 방법에 의해 수득가능한 조성물, 약학적 제형물, 조성물 또는 약학적 제형물의 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 용도, 조성물 또는 약학적 제형물의 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 용도와, HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료용 및/또는 예방용 방법에 관한 것이다.

HBV 감염, 사포닌, 항원, 변이체, 백신

Description

절단된 ＨＢＣ 코어 단백질과 사포닌계 보조제를 포함하는 백신{VACCINES COMPRISING TRUNCATED HBC CORE PROTEIN PLUS SAPONIN-BASED ADJUVANTS}

본 발명은 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus (HBV)) 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료용 및/또는 예방용 조성물, 조성물의 제조방법, 상기 방법에 의해 수득가능한 조성물, 약학적 제형물, 조성물 또는 약학적 제형물의 용도, 및 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료용 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 조성물 또는 약학적 제형물의 용도와 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료용 및/또는 예방용 방법에 관한 것이다.

세계보건기구(WHO)에 따르면, 20억이 넘는 현존 인구가 B형 간염 바이러스에 걸린 적이 있거나, 걸려있는 것으로 추산하고 있다. 이에 따라 HBV는 인류 건강에 지대한 영향을 미치는 것 중 가장 중대한 인간 병원체 중 하나이다.

HBV는 피를 통해 감염되고, 구체적으로는 감염된 모체로부터 임신 중 또는 출산 후 직후에, 오염된 혈액이나 성교를 통해 감염된다. HBV는 간독성(hepatotropic) 바이러스에 속하고, 이는 급성 및 만성 감염 모두를 유발할 수 있다. 출산중 감염 또는 생후 1개월째에 감염되는 것은 그 중 90%가 만성 감염을 유발하지만, 성인시기에 감염되는 것 중에는 약 10%만이 만성으로 관찰된다. 감염 된 성인 중 약 2%에서, 전격성(fulminant) 감염(급성 간질환)이 발생할 수 있고, 이는 높은 사망율과 연관되어 있다.

초기에 만성 감염은 임상학적인 증상이 없지만, HBV가 지속되어 감염된 간 세포와 면역계의 병원성(pathological) 상호작용이 계속되면 10 내지 30년 후의 잠복기 후에는 급성 간질환(활성, 만성 B형 간염)으로 발전할 수 있다. 만성 B형 간염으로 발전되는 만성 HBV 보균자의 수는 약 25%이다. 만성 B형 간염은 종국에 간경변 및/또는 제1기 간세포 암종으로 발전될 수 있다. 상기 질병은 모두 높은 사망율과 관련이 있다. 현재 약 3억5천의 만성 HBV 간염 보균자가 전세계에 있는 것으로 추산된다. 매년 약 백만명이 만성 HBV 감염 때문에 사망한다.

다행히도, HBV 감염은 B형 간염 예방 백신에 의해 예방될 수 있다. 이러한 만성 보균자의 혈장으로부터 채취한 정제된 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 기초로 한 백신은 처음에 1980년대 초반에 판매되기 시작하였다. 그 후 재조합 방식으로 제조된 HBsAg가 이를 대체하였다. 하지만 백신접종이 모든 나라에 통상적으로 도입된 것은 아니기 때문에, HBV는 여전히 인간의 건강을 위협할 수 있는 것이다. 이를 감안하면 만성 HBV 보균자는 감염성인 것으로 간주되고 바이러스를 옮길 수 있다는 의미가 된다.

만성 B형 간염은 여러가지 외형을 지닌 역동적인 질병이다. 만성 감염의 초기에는 면역내성기(immunotolerant phase)라고 불리는데, 이는 혈청내에 바이러스 마커(HBV-DNA, HBsAg, HBeAg)가 출현하고, 간의 문제가 없다는 점이 특징이다. HBV 보균자의 약 25%가 면역활동기(immunoactive phase)로 전이되는데, 그 도중에는 제 1 간 증후가 나타나고 치료가 필요하게 된다. 이러한 면역활성화 단계 도중에, 혈청 중의 HBV-DNA는 일반적으로 감소되고 혈청-트랜스아미나아제(serum-transaminase)는 뱃치방식으로(batchwise) 증가한다. HBsAg는 혈청 중에 존재하지만, 환자 중 적은 비율(약 1%)만이 그러하고, 이는 자발적으로 HBeAg 포지티브에서 HBeAg 네거티브로 혈청 전환된다. 이러한 혈청 전환은 비활성 보균자 단계로 들어가게 되는 싸인(sign)이고, 이는 바이러스 활성이 낮은 것이 특징이다. 간혹, HBsAg 포지티브에서 항-HBsAg 포지티브로 혈청전환되는 것이 더 관찰되기도 하는데, 이것은 감염이 치료된 싸인으로 간주된다. 활성 만성 B형 간염은 조직 염증(necro-inflammation) 및 간조직의 섬유증(fibrosis of the liver tissues)이 특징인데, 이는 간경변으로 진행되고, 대상부전 간질환(decompensated liver disease)으로 진행된다. 추가의 합병증으로서, 간경변은 제1기 간세포 암종을 유발할 수 있는데, 이에 의해 일부 만성 HBV 보균자는 간경변의 징후 없이도 간암으로 발전될 수 있다.

활성 만성 B형 간염에 대한 치료 가능성은 매우 제한적이다. 현재 인터페론-α(예를 들면, Intron A^®또는 Roferon A^®) 또는 항바이러스 물질(Lamivudine, Adefovir, Entecavir)로 치료할 수 있다. 인터페론-α는 바람직하게는 HBeAg 포지티브 환자에 사용되는데, 이에 의해 약 30%가 HBeAg-혈청 전환과 반응하고, 이는 비활성 보균자 상태와 상응하는 것이다. 결과적으로, 소수의 환자(약 3%)가 또한 완전한 치료의 싸인으로서 HBsAg 혈청 전환을 보인다. 하지만 인터페론-α로의 치 료는 심각한 부작용과 관련되는데, 이는 치료를 초기에 중단해야 할 필요가 생긴다는 뜻이다. HBeAg 네거티브 환자에서, 인터페론-α는 HBeAg 포지티브 환자에 비해 더 낮은 반응율을 보인다. 대안적으로, 항바이러스 물질, 즉 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 역전사효소 억제제의 부류에 속하는 것이 여기에 사용될 수 있다. 이러한 항바이러스 물질은 바이러스의 복제를 억제하고 그 결과로서 간 질환의 발전을 예방한다. HBeAg 포지티브 환자에 대한 혈청 전환율은 인터페론-α에 비해 낮고, 자발적으로 발생하는 완화(remission)보다는 높지 않다. 그러므로 항바이러스 치료의 목표는 제한되지 않은 시간 동안에 바이러스 활성을 억제함으로써 질병을 지연시키는 것이다. 하지만 항바이러스 물질을 장기간 사용하면 바이러스 내성 돌연변이의 출현에 의해 위험에 처하게 된다. 가장 흔히 사용되는 물질인 Lamivudine의 경우, 4년이내 최대 68%까지의 내성 비율이 관찰된 바 있다. 가장 최근에 도입된 Adefovir는 가장 낮은 내성을 유발하는 것으로 보인다. 하지만 바이러스 내성의 기본적인 문제점은 항바이러스 물질이 복합적으로 사용되는 경우에도, 장기간 치료해야 된다는 점이다. 그러므로 만성 B형 간염을 치료하기 위한 추가의 치료 수단이 절실히 요구되고 있다. 특히 바람직한 것은 부작용이 적고 환자를 위해 단기간 치료할 수 있는 면역조절제이다.

이러한 대안 중 하나는 치료용 백신의 형태인 특이적인 면역치료이다. 치료용 백신의 개념은 바이러스에 대항하여 적절한 면역 반응이 개시되고, 이것이 종국적으로는 바이러스를 조절하도록 유도하여 간 질환의 발전을 미리 막도록 하는 방식으로, 만성 B형 간염 환자의 면역계를 특이적으로 자극하는 것이다. 치료용 백신이 보여야 하는 명백한 효과 중 하나는 다량의 바이러스 항원의 존재하에 면역내성을 보이는 것을 통해 일어나는 브레이킹(breaking)이다. 이 치료는 특히 바이러스-특이적 T-세포 반응, 특히 HBV의 다양한 항원에 대항하여 세포독성 T-림프구(CTL)를 발생시켜야 한다. 급성 감염 치료를 위한 상황과 비교하여, 만성 B형 간염에 걸린 환자에서 이러한 면역 반응은 매우 작은 정도로 보여질 뿐이고, 또는 아예 보여지지 않는다. 강한 바이러스 특이적 CTL 반응은 일반적으로는 바이러스 감염의 조절의 지표로 간주된다. 치료용 백신의 개발은 그러므로 1차 표적으로서 강한 항바이러스 CTL 반응을 유도한다.

재조합 서브유닛 백신은 일반적으로 CTL 반응을 유발하지 못한다. 동물 모델(마우스)에서, DNA-백신, 특히 B형 간염 코어(core) 항원(HBcAg)-암호화 플라스미드 벡터를 기반으로 한 DNA-백신으로 상당한 CTL 반응을 달성할 수 있지만, 현재의 백신은 인간에서 매우 약한 면역 반응을 보일 뿐이고, 임의의 포텐트(potent) CTL 반응을 자극하지 못한다. 이러한 난관 때문에 소위 "Prime-Boost-Vaccine"이 현재 개발 중에 있는데, 이는 DNA-백신(예를 들면, HBsAg를 암호화하는) 및 재조합 바이러스 벡터(예를 들면, 변형된 Vaccinia Ankara Stem)로 대안적인 면역화가 발생하고, 이는 예를 들면 HBsAg를 발현시킨다(참조: McConkey S.J., Schneider J., Mendy M., Cavenaugh J.S., Bertoletti A., Whittle H., Hill A.V.S.: " Safety and Immunogenicity of a novel " Prime boost " therapeutic immunization strategy against hepatitis B virus ", Meeting abstract: "The molecular biology of hepatitis B viruses ", Bergamo, Italy, September 7-10, 2003).

WO-A01/98333은 HBc-항원의 사용을 기재하고 있는데, 여기에서는 C-말단에서의 4개 아르지닌(arginine) 반복 유닛 중 하나 이상이 제거되었지만, 그 중 HBV의 치료를 위한 C-말단의 시스테인 잔기는 남아있다. 제거된 아르지닌 반복 유닛은 암과 관련된 박테리아 또는 바이러스 병원체, 기생충, 알레르기 발생물질(allergen) 또는 항원으로부터의 에피토프를 나타내는 서열로 치환될 수 있는데, 이들은 T-헬퍼 셀, B-셀 또는 세포독성 T-림프구에 의해 인식되는 것들이다.

WO-A-2005/023297은 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료를 위한 조성물을 개시하고 있는데, 이 조성물은 적어도 두개의 B형 간염 표면 항원(HBsAg), 이의 단편 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 것으로, S-영역 및/또는 프리(pre)-S1-영역내의 HBV 유전자형(genotype)에서 HBsAg가 상이하여, 조성물이 HBcAg 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하지 않도록 한다.

WO-A-2005/056051는 그 중에서도 특히 B형 간염의 치료용 또는 예방용 재조합 폴리펩타이드 조성물을 개시하고 있으며, 이에 의해 조성물이 다수의 성분, 바람직하게는 a) HBV-코어-단백질의 면역발생 영역의 서열을 포함하는 코어-폴리펩타이드 성분, b) HBV-표면 항원-단백질(S, M, 또는 L)의 면역발생 영역의 서열을 포함하는, 표면 항원-폴리펩타이드 성분, c) HBV-X-단백질의 면역발생 영역의 서열을 포함하는, X-폴리펩타이드 성분, 및 d) HBV-폴리머라아제-단백질의 면역발생 영역의 서열을 포함하는, 폴리머라아제-폴리펩타이드 성분에서 선택된 적어도 3개 또는 4개의 성분을 포함하게 됨으로써, 적어도 하나의 성분이 각 HBV 단백질의 적어도 100 아미노산을 함유하게 된다.

EP-A-1 136 077은 HBsAg 및 선택적으로는 HBcAg를 포함하는 비강용 백신 조성물을 개시하고 있는데, 특히 치료용 백신으로서 사용될 수 있음을 개시하고 있다.

본 발명의 목적은 인간의 B형 간염의 치료 또는 예방용 백신을 위한 선행기술에서 공지된 단점을 극복하는 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 인간의 치료에 적합한 조성물을 제공하는 것인데, 선행기술로부터 공지된 조성물과 비교하여 강한 면역 반응, 특히 HBcAg, 구체적으로는 만성 HBV 감염에 대항하여 강한 CTL 반응을 유도할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다. 조성물은 이의 HLA 유형과는 관계없이, 만성 HBV 감염에 걸린 가능한 한 다수의 환자에서 면역 내성을 통해 브레이킹을 유발하여야 한다.

본 발명에 따른 조성물은 만성 환자의 HBV 유전자형과는 관계없이, 면역 내성을 통해 브레이킹을 허용하여야 하고, 이에 따라 바이러스가 조절되도록 하는 면역 반응을 발생시킬 수 있어야 한다.

본 발명의 또다른 목적은, 상기 기술된 장점을 가진 조성물이 가능한 한 간단한 방법으로 제조될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위해서, 하기를 포함하는 조성물을 제공한다:

i) HBcAg₁ _-x(HBcAg = HBV 코어-항원)(여기에서, x는 100 내지 160 범위의 정수이고, 바람직하게는 120 내지 150 범위의 정수, 특히 바람직하게는 140 내지 149의 정수이고, 더 바람직하게는 144 내지 146의 정수이며, 가장 바람직하게는 145이다), 이 항원의 단편, 이 항원 또는 항원의 단편의 변이체 또는 적어도 상기 두 가지의 혼합물,

ii) 사포닌 또는 사포닌 유도체 또는 적어도 상기 두 가지의 혼합물을 포함하는 보조제(adjuvant), 및 선택적으로는

iii) HBsAg, 이 항원의 단편, 이 항원 또는 항원의 단편의 변이체 또는 상기 두 가지의 혼합물.

매우 경이롭게도 이러한 장점과는 관계없이, 상기 기술된 조성물, 즉 기본적으로 인간에게 사용하기에 적합한 강한, 코어-특이적 CTL 반응을 동물 모델에서 수득할 수 있음을 발견하였는데, 이것은 동일한 동물 모델에서 HBcAg-암호화 플라스미드 벡터(DNA-면역화)를 사용하여 수득된 CTL 반응에 대략 필적하는 것이었다.

하기의 상세한 설명에 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 아미노산의 중합체를 말하는 것이고, 아미노산의 최소한의 수를 제한하는 것은 아니다. 그러므로, 동등하게 펩타이드, 올리고펩타이드, 다이머(dimer), 트라이머(trimer), 올리고머(oligomer), 파티클(particle) 등을 포함한다. 또한 용어 "폴리펩타이드"는 리보좀에서 해독(translation)된 직후 수득된 아미노산의 순수한 중합체 뿐 아니라, 당화, 아세틸화, 인산화 등에 의해 해독후 수득된 폴리펩타이드들도 포함하는 것이다.

"HBcAg₁ _-x"는 자연 상태의 HBcAg의 아미노산 1 내지 x를 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 자연 상태의 HBcAg의 아미노산 1 내지 x로 구성되는 폴리펩타이드로서, 용어 "HBcAg₁ _-x"는 현재 알려져 있는 표준 유전자형인 A, B, C, D, E, F, G 및 H의 HBcAg의 아미노산 1 내지 x를 가진 가상의 폴리펩타이드(이로써 폴리펩타이드의 N-말단이 제1 아미노산(=아미노산 1))인 것으로 이해되어야 한다. 이러한 8가지의 표준 유전자형은 뉴클레오타이드 서열의 대략 8%가 서로 상이한데(참조: Bartholomeusz, Rev. Med. Virol. 13 (2003), 1-14), 이로써 변이체는 HBsAg-유전자와 현저하게 관련이 있게 된다. 바람직하게는 HBV 유전자형 A는 참조 핵산 서열 Genbank X02763을 포함하며 HBV 유전자형 A_afr은 Genbank AF297621에 따른 참조 핵산 서열을 포함한다. HBV 유전자형 B_a에 대해 참조 핵산 서열은 Genbank D00330이고, 유전자형 B_j에 대해 참조 핵산 서열은 AB073858이다. HBV 유전자형 C에 대해, 참조 핵산 서열은 Genbank AY206389이고, 유전자형 C_aus에 대해, 참조 핵산 서열은 Genbank AB048704에 따른 핵산 서열이다. 유전자형 D에 대해, 참조 핵산 서열은 Genbank X02496이고, 유전자형 E에 대해서는 Genbank X75657, 유전자형 F에 대해 Genbank X69798, 유전자형 G에 대해서는 Genbank AF160501 및 유전자형 H에 대해서는 Genbank AY090454이다.

용어 HBcAg₁ _- _x 의 "단편"은, 바람직하게는 적어도 25, 바람직하게는 적어도 50 및 특히 바람직하게는 적어도 100개의 아미노산이 HBcAg₁ _-x의 해당하는 부분과 동일한 폴리펩타이드인 것으로 이해된다.

용어 HBcAg₁ _-x 또는 HBcAg₁ _-x의 단편의 "변이체" 는 바람직하게는 HBcAg₁ _-x 또는 HBcAg_1-x의 단편 중 최대 10개, 바람직하게는 최대 5개 아미노산, 특히 바람직하게는 최대 2개의 아미노산, 가장 바람직하게는 최대 1개 아미노산이 C- 말단 및/또는 N-말단에서 결실, 삽입, 치환 또는 부가된 것, 바람직하게는 치환된 폴리펩타이드인 것으로 이해된다. 용어 "변이체"는 또한 융합 폴리펩타이드, 구체적으로는 HBcAg₁ _-x를 포함하는 HBsAg와 융합된 것을 포함한다.

용어 "보조제(adjuvant)"는 본 발명에 따르면, 면역 반응의 유도를 허용하는 화합물, 바람직하게는 항원에 대한 CTL 반응을 유도하는 화합물이다.

본 발명에 따른 조성물 중에 포함되고, 자연 HBcAg와 비교하여 절단된 HBcAg_1-x, 즉 그 중 C-말단 핵산 결합 영역의 적어도 일부, 바람직하게는 전체 C-말단 핵산 결합 영역이 결실되어 있는 HBcAg₁ _-x는 당업자에게 공지된 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.

하나의 가능한 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 바이러스 분리체로부터 코어 또는 프리-코어 리딩 프레임을 증폭시키는 것이다. 또한 해당하는 DNA-서열을 합성하여 제조한 다음에, PCR을 사용하여 증폭시키는 것도 생각해 볼 수 있다. 수득된 PCR 단편은 이어서 플라스미드 벡터로 클로닝한다. 추가의 PCR-플로닝을 사용하여, 해당하는 짧아진 형태를 발현 벡터에, 예를 들면, 발현 벡터 E. coli에 삽입할 수 있다. 이로써, 삽입은 바람직하게는 HBcAg₁ _-x 또는 각각의 단편 또는 변이체를 암호화하는 유전자가 활성 프로모터의 조절하에 있도록 하는 방식으로 발생한다. 발현 벡터는 발현 속도를 증가시키기 위한 유도 인자를 동시에 포함할 수도 있다. E. Coli에서 이 발현 벡터를 형질전환시킨 다음에, HBcAg₁ _-x 또는 각각의 단편 또는 변이체를 발현한 개개의 클론을 수득한다. 항원으로 작용하는 폴리펩타이드를 수득하기 위해, 개개의 클론을 배양 배지에 주사하고 밤새 37℃에서 교반 플라스크에서 배양한다. E. coli 배양물을 이어서 원심분리하여 수득한다. 박테리아 펠릿을 완충액에 재현탁시킨 다음에, 초음파 처리 또는 고압 균질화처리하여 파괴한다. 균질액 중에 가라앉은 HBcAg 또는 HBcAg-변이체를 암모늄 설페이트로 침전시킨 다음에, 겔 여과시켜 박테리아 숙주 성분을 분리한다. 파티클을 형성한 HBcAg-변이체를 스피드 존 원심분리(speed zone centrifugation)함으로써 추가로 정제할 수 있다. 파티클을 형성하지 않은 HBcAg₁ _-x는 이상적으로는 N-말단 His-Tag-친화(affinity) 마커로 엔지니어링한 다음에, Ni-NTA-친화 크로마토그래피하고, 겔 여과하여 정제한다. 그리하여 생성된 HBcAg₁ _-x는 멸균 여과시킨 후, 본 발명에 따른 조성물의 제형물의 경우와 같이 사용한다.

기본적으로 본 발명에 따른 조성물 중에 포함되어 있는 HBcAg₁ _-x 또는 이의 단편 또는 이의 변이체는 합성하여 수득할 수 있다.

또한 폴리펩타이드의 재조합 또는 합성 제조의 관련 기술에 대한 자세한 사항은 하기에서 찾아볼 수 있다:

-Sambrook,"Molecular Cloning : A Laboratory Manual " second edition (1989);

-"DNA Cloning" Volumes I and II (D. N. Glover, editor., 1985);

-"Oligonucleotide Synthesis "(M. J. Gait, editor, 1986);

-"Nucleic Acid Hybridization"(B. D. Hames & S. J. Higgins, editors, 1984);

-"Transcription and Translation "(B. D. Hames & S. J. Higgins, editors, 1984);

-"Animal Cell Culture "(R. I. Freshney, editors, 1986);

-"Immobilised Cells and Enzymes "(IRL Press, 1986);

-B. Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning "(1984);

-"The Methods in Enzymology series "(Academic Press, Inc.), 구체적으로 Volumes 154 and 155;

-"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells "(J. H. Miller and M. P. Calos, editors, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);

-Mayer und Walker, editors, (1987), "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology "(Academic Press, London);

-Scopes, (1987), "Protein Purification : Principles and Practice ", second edition (Springer-Verlag, N.Y.) 및

-"Handbook of Experimental Immunology " Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, editors, 1986).

기본적으로, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 HBcAg₁ _-x는 파티클을 형성할 수 있는 것이거나, 그렇지 않은 것일 수 있지만, 파티클을 형성할 수 있는 HBcAg₁ _-x가 바람직하다. 파티클 형성 HBcAg₁ _-x는 회합하여 대략 27 nm의 직경의 캡시드(capside)를 형성할 수 있다. 180 또는 240 다이머는 회합하여 거대분자 구조물을 형성한다. 본 발명에 따른 조성물의 특히 바람직한 구체예에 따르면, HBcAg₁ _-x는 그러므로, 상기 기술된 파티클 형태로 존재한다.

본 발명에 따른 바람직한 항원은 특히 HBcAg₁ _-124, HBcAg₁ _-127, HBcAg₁ _-144, HBcAg_1-145, HBcAg₁ _-146, HBcAg₁ _-147, HBcAg₁ _-148, HBcAg₁ _-149 (즉 자연 HBcAg의 처음 127, 144, 145, 146, 147, 148 또는 149 아미노산을 포함하고, 바람직하게는 이로 구성되는 폴리펩타이드)이고, 자연 발생한 HBcAg의 아미노산 81 내지 133을 포함하고, 바람직하게는 구성되는 HBcAg₈₁ _-133 (HBcAg의 단편)이다. 더욱 바람직한 항원은 HBcAg_1-144+AS인데, 자연 발생한 HBcAg의 처음 144개 아미노산을 포함하고, 145번째 아미노산으로서는, 자연 발생한 HBcAg에서의 145번째 아미노산으로 나타나는 글루탐산과는 상이한 아미노산 AS를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기에서 글루탐산과 상이한 아미노산 AS는 바람직하게는 이소루신이다. 본 발명에 따른 조성물에서 특히 바람직하게는 항원은 HBcAg₁ _-145 및 HBcAg₁ _-144+I을 포함한다.

본 발명에 따르면, HBcAg₁ _-x는 HBcAg에 대해 외래물질인 임의의 에피토프, 구체적으로는 HBsAg-에피토프를 포함하지 않는 것이 더욱 바람직하다. 가장 바람직하게는, HBcAg₁ _-x는 프리-S1 에피토프, 구체적으로는 프리-S1 항원의 아미노산 3 내지 55를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, HBcAg₁ _-x는, x가 48, 61 또는 107과 동일하지 않는 한, C-말단 위치 x에서 시스테인 잔기를 포함하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 구체예에 따르면, 이는 적어도 두개의 HBcAg₁ _-x또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하고, 이로써 HBcAg₁ _-x는 HBV-유전자형과 상이하다.

본 발명에 따른 조성물은 사포닌 또는 사포닌 유도체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물을 포함하는 보조제를 포함한다. 바람직하게는 상기 보조제는 사포닌 복합체, 사포닌 유도체 복합체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물이다. 특히 바람직하게는, 사포닌 복합체 또는 사포닌 유도체 복합체는 리포좀 사포닌 복합체 또는 리포좀 사포닌 유도체 복합체이다.

이와 관련하여, 사포닌 복합체, 사포닌 유도체 복합체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물은 물 또는 수용성 염 용액과는 상이한 성분으로서, 하기를 포함하는 것이 바람직하고:

(α1) 인지질(phospholipid) 0 내지 95 wt%, 특히 바람직하게는 10 내지 50 wt% 가장 바람직하게는 15 내지 25　wt%,

(α2) 스테로이드(steroid) 0 내지 95 wt%, 특히 바람직하게는 10 내지 50 wt% 가장 바람직하게는 15 내지 25　wt%,

(α3) 사포닌 또는 사포닌 유도체 5 내지 100 wt%, 특히 바람직하게는 15 내지 90 wt% 가장 바람직하게는 30 내지 80 wt%, 및

(α4) 부가적인 첨가제, 예를 들어 인지질 및 스테로이드 지질과는 상이한 지질 또는 물과 상이한 용매 0 내지 20 wt%, 특히 바람직하게는 1 내지 15 wt%, 가장 바람직하게는 5 내지 10 wt%,

여기서 중량은 물 및 수용성 염 용액 부분은 제외하고, 사포닌 복합체 또는 사포닌 유도체 복합체의 총 중량을 기준으로 한 것으로서, 성분 (α1) 내지 (α4)의 합은 100 wt%이다.

이러한 유형의 사포닌 복합체는 "ISCO-Matrix"로서 문헌에 언급되어 있다. 조성물이 성분 (α1) 내지 (α4)외에 항원으로서 단백질도 포함하는 경우에, 복합체는 "ISCOM^®"으로 언급된다.

인지질(α1)은 바람직하게는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 및 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine)으로 구성되는 군 중에서 선택되는 인지질이다.

스테로이드(α2)는 바람직하게는 콜레스테롤(cholesterol), 란노스테롤(lanosterol), 루미스테롤(lumisterol), 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 시토스테롤(sitosterol)로 구성되는 군 중에서 선택되는 식물 또는 동물 유래의 스테로이드이다.

사포닌은 본 발명에 따르면 바람직하게는 당 또는 스테로이드, 스테로이드 알칼로이드(steroid alkaloid) 또는 트리터펜(triterpene) 또는 상기 화합물의 혼합물 간의 화학적 화합물로 이해된다. 이들은 스테로이드-사포닌, 스테로이드 알칼로이드 사포닌 및 트리터펜 사포닌으로 언급될 수 있다. 이러한 사포닌은 표면 활성 글리코시드이고, 식물로부터 수득할 수 있는데, 여기에서 보조제로서 가장 효과적인 사포닌은 미국 남부에 서식하는 나무인 Quillaja saponaria에서 수득된 것으로서, 바람직하게는 이 나무의 껍질에서 수득된 것이다. Quillaja saponaria에서 사포닌을 분리하는 동안에, 부분적으로 정제된 형태로 수득된 추출물은 "Quil A" 로 알려져 있다(부분적으로 정제된 사포닌 추출물은 정해진 트리터펜 사포닌 함량을 가지고, 정제되지 않은 사포닌 추출물보다 더 독성이 낮다).

더욱 적당한 사포닌은 R. Tschesche and Wulf, "Chemie und Biologie der Saponine in Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe " published by H. Herz, H. Grisebach, G. W. Kirby, Vol. 30 (1973)에 개시되어 있으며, 극성 트리터펜 사포닌과 같은 강한 극성 사포닌, 구체적으로 극성 아세틱 비스데스모사이드(acetic bisdesmoside), 예를 들어, Quillajabark Aralosid A, Chikosetsusaponin IV, Calendula-Glycoside C, Chikosetsusaponin V, Achyrranthes-Saponin B, Calendula-Glycoside A, Aralosid B, Aralosid C, Putranji-Saponin III, Bersamasaponisid, Putrajia-Saponin IV, Trichosid A, Trichosid B, Saponasid A, Trichosid C, Gypsosid, Nutanosid, Dianthosid C, Saponasid D로부터의 사포닌 추출물, 바람직하게는 Aesculus hippocastanum 로부터의 Aescin이 그것이다(T. Patt and W. Winkler: "Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskastanie ( Aesculus hippocastanum )", Arzneimittelforschung 10(4), 273-275 (1960)).

사포닌(α3)은 바람직하게는 "Quil A"로 언급되는 Quillaja saponaria의 껍질로부터 부분적으로 정제된 사포닌 추출물인데, 이는 적어도 22개의 상이한 사포닌 분획, 균질한 Quil A-분획의 서브-분획, 예컨대, 균질한 Quil A-분획으로부터 수득된 예를 들어, QS 7, QS 17, QS 18 또는 QS 21, 또는 서브-분획 중 적어도 두개의 혼합물, 바람직하게는 서브-분획 A 및 C의 혼합물로 구성되고, 이는 WO-A-96/11711에 개시되어 있다. 이 혼합물은 바람직하게는 50 내지 90 wt%의 분획 A 및 10 내지 50 wt%의 분획 C로 구성되고, 여기서 분획 A 및 C는 WO-A-96/11711의 실시예 1에 따라 수득된 것을 말한다. 이러한 종류의 혼합물은 시중에서 판매되고 있으며, 예를 들면 "ISCOPREP^®703"로서 판매되고 있다. 구체예에 따르면, 사포닌은 100 wt%의 분획 C로 구성될 수도 있다. Quil A로부터의 사포닌 외에도, US　6,262,029에 기술된 바와 같은 사포닌 유도체도 복합체내에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 사포닌 복합체는, 구체적으로 시중에서 판매되는 제품 AbISCO^®100, AbISCO^®200, AbISCO^®300 (ISCONOVA, Uppsala, Sweden) 또는 Stimulon^®QS-21 (ANTIGENICS, Woburn, USA)이다.

상기에 기술된 사포닌 복합체(ISCO-매트릭스)의 제조는 당업자에게 공지된 이러한 복합체의 제조방법 중 임의의 것을 통해 수행할 수 있다. 이러한 유형의 사포닌 복합체의 바람직한 제조방법은 예를 들면, EP-A-0　231　039(리포좀 사포닌 복합체) 또는 WO-A-90/03184 (비-리포좀 사포닌 복합체)에 기술되어 있으며, ISCO-매트릭스의 제조에 관해서 기술된 내용은 본원에 참조로써 인용되며, 본원의 개시의 일부를 구성한다.

본 발명에 따른 조성물내에 ISCO-매트릭스가 보조제로서 포함된 경우, 항원은 공지된 ISCOM의 경우와 같이, ISCO-매트릭스의 내부에 위치하지 않는 것이 본 발명에 따라 바람직하다.

본 발명에 따른 조성물의 구체예에 따르면, 조성물은 사포닌 복합체, 사포닌 유도체 복합체 또는 이들 복합체 중 적어도 두개의 혼합물, 사포닌 또는 사포닌 유도체를 포함하지 않는 추가의 보조제 외에도, 공동-보조제(co-adjuvant)를 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 공동-보조제는 이러한 복합체로부터 분리하여 존재할 수 있거나, 또는 합쳐져서 존재할 수도 있다. 공동-보조제로서, 당업자에게 공지되어 있는 임의의 보조제를 사용할 수 있는데, 이는 보통 백신내에 사용될 수 있는 것을 말한다. 바람직한 보조제는 과립형 보조제, 예컨대 서브-마이크로(sub-micro) 수중유 에멀젼(oil-in-water-emulsion), 여기에 속하는 것으로는 예를 들면, MF59 (5 % 스쿠알렌(Squalene), 0.5　% Tween^®80 및 0.5 % Span^®85), SAF (10 % Squalene, 0.4 % Tween^®80, 5　% Pluron-blocked polymer), 및 thr-muramyl 디펩티드 (thr-MDP), 미네랄 화합물, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드(aluminium hydroxide), 알루미늄 설페이트(aluminium sulphate) 또는 알루미늄 포스페이트(aluminium phosphate), 불완전한 Freund's 보조제, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-디펩티드(N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-dipeptide (GMDP)) 또는 뮤라밀디펩티드 (MDP), GAL-세라마이드(GAL-ceramide), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB)), 바람직하게는 인지질 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀(liposomes), 폴리-락타이드-코-글리콜라이드(poly-lactide-co-glycolide (PLGA))와 같은 생분해성 중합체의 미세입자, CpG-모티프를 갖거나 갖지 않는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드(oligodesoxyribonucleotides with or without CpG-motif), N,N-디-(b-스테아로일에틸)-N,N-디메틸암모늄 클로리드 (N,N-di-(b-stearoylethyl)-N,N-dimethylammonium chlorid (EQ1)), 글리코펩티드, 미코박테리아의 세포벽 성분, 4차 아민, 예컨대, 세틸피리디늄 클로라이드 및 벤잘코늄 클로라이드, 양성이온 아민, 예컨대, CHAPS (3-(3-콜아미도프로필)-디메틸-암모니오)-1-프로판설포네이트)((3-(3-cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio)-1-propanesulfonate)), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 글라뉼로시텐 마크로파지 콜로니 자극 인자(granulocyten macrophages colonies stimulating factor (GM-CSF)), 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF), 블록 공중합체, 예컨대 P1205 또는 Poloxamer 401, 디미리스토일포스파티딜콜린(dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC)), 3β-하이드록시-5-안드로스텐-17-온(3b-hydroxy-5-androsten-17-one (DHEA)), 디미리스토일포스파티딜-글리세롤(dimyristoylphosphatidyl-glycerol (DMPG)), 데스옥시콜린산 나트륨 염(desoxycholic acid sodium salt), Imiquimod, DTP-GDP, 7-알릴-8-옥소구아노신(7-allyl-8-oxoguanosine), Montanide ISA^®51, Montanide ISA^®720, 뮤라메타이드(murametide), 뮤라팔미틴(murapalmitin), 디세틸포스페이트(dicetylphosphate), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate (PMMA)), PEG-소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 polysorbate 20 또는 80 (TWEEN^®20, 80), 콜레라 톡신 또는 퍼투시스 톡신과 같은 박테리아 유래 ADP-리보실레이팅 톡신(bacterial ADP-ribosylating toxins)으로부터의 데톡시파이드 돌연변이체 또는 상기 보조제 중 적어도 두개의 혼합물을 포함하는 군 중에서 선택된다. 특히 공동-보조제로서 바람직한 것은 리포폴리사카라이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, GAL-세라마이드, CpG-모티프를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 및 PEG-소르비탄 지방산 에스테르이다.

공동-보조제로서 적합한 화합물은 Cox, J.C. and Coulter, A.R. "Adjuvants - a classification and review of their modes of action "in Vaccine 15:248-256 (Feb. 1997)에 개괄적으로 개시되어 있다. 이 문헌에 실린 백신 조성물 중의 보조제에 관한 것은 본원에 참조로써 인용되며, 본 발명의 개시의 일부를 구성한다.

본 발명에 따른 조성물의 바람직한 추가의 구체예에 따르면, 이는 항원 HBcAg_1-x 및 보조제 외에도, 추가로 적어도 하나의 HBsAg, 이 항원의 단편, 이 항원 또는 단편의 변이체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물을 포함한다. 이와 관련하여, HBcAg₁ _-x 뿐만 아니라, HBsAg도 본 발명에 따른 조성물에 과립 형태로 존재하는 것이 바람직하다.

HBsAg는 226개의 아미노산 단백질(p24/gp27 또는 S-단백질)이고, 이는 20-30　nm 리포단백질(lipoprotein) 입자로 자가 조립하고, 이의 약 100-150 서브유닛은 다양한 분자내부 및 분자 외부의 이황화 결합을 통해 교차결합으로 네트워크를 형성한다. 본 발명에 따라 조성물에 선택적으로 포함된 HBsAg는 모든 HBV-표준 유전자형 A, B, C, D, E, F, G 및 H에서 유래할 수 있으며, 이는 HBcAg₁ _-x와 동일한 방식일 수 있다. 용어 "HBsAg"는 226-아미노산 단백질 외에도, M- 및 L-단백질을 추가로 포함하는데, 이는 곧 HBsAg 외에도 55-아미노산 길이의 프리-S2-펩타이드(M-단백질) 또는 55-아미노산 길이의 프리-S2-펩타이드 및 120-아미노산 길이의 프리-S1-펩타이드(L-단백질)를 포함하는 것이다.

용어 HBsAg의 "단편"은 바람직하게는 적어도 50, 바람직하게는 적어도 150, 및 특히 바람직하게는 적어도 200개의 아미노산의 섹션이, 해당하는 HBsAg의 섹션과 동일한 폴리펩타이드인 것으로 이해된다.

용어 HBsAg 또는 HBsAg의 단편의 "변이체"는 바람직하게는, HBsAg의 아미노산 또는 HBsAg의 단편의 최대 5, 바람직하게는 최대 2, 특히 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 말단에서 결실, 삽입, 부가된 것, 또는 치환된 것으로서, 바람직하게는 치환된 폴리펩타이드로 이해된다.

본 발명에 따른 조성물의 바람직한 구체예에 따르면, 이는 적어도 하나의 HBsAg를 포함하고, 이는 HBsAg 뿐만 아니라, WO-A-2005/02397에서도 기술된 바와 같이, 적어도 두개의 HBsAg 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 것으로, 여기에서 HBsAg는 S-영역 및/또는 프리-S1-영역내의 HBV-유전자형과 상이한 것이다. 이러한 경우에 있어서는, WO-A-2005/02397에서 기술된 바와 같이, HBV-유전자형이 상이한 두개의 HBsAg가, 상동 파티클(homologous particles) 형태로 존재하는 것이 특히 바람직하다. 상동 HBsAg 파티클은 동일한 HBV-유전자형 중 HBsAg 단독으로 구성된 파티클로 이해된다.

HBsAg는 당업자에게 공지된 방법에 의해 수득될 수 있는데, 만성 B형 간염에 걸린 환자의 혈청으로부터, 또는 재조합 폴리펩타이드로서 합성하여 수득할 수 있다. 이러한 문맥에서, HBcAg₁ _-x를 수득하는 것과 관련된 상기 기술된 방법들을 참조할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 i), ii) 및 선택적인 iii) 성분 외에도, 특히 약학적 제형물로 존재하는 경우에 예컨대 약학적 담체 또는 첨가제와 같은 추가의 첨가제 iv)를 포함할 수 있다.

바람직한 약학적 담체는 특히 물, 완충수, 바람직하게는 등장성 염 용액, 예컨대 PBS (Phosphate Buffered Saline), 포도당, 덱스트로스(dextroses), 만니톨(mannitol), 락토스(lactoses), 녹말(starches), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트(magnesium carbonate), 0.3　% 글리세롤, 히알루론산(hyaluronic acid), 에탄올, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 트리글리세라이드(triglyceride) 등이 있다. 사용되는 약학적 담체의 유형은 특히 본 발명에 따른 조성물이 경구용(oral), 비강용(nausal), 피내용(intradermal), 피하용(subcutaneous), 근육용 또는 정맥내 투여를 위해 제형되었는지 여부에 따라 달라진다. 첨가제로서, 삼투압 조절제(tonicity regulators), 습윤제(wetting agents), 유화제(emulsifies) 또는 완충 성분이 본 발명에 따른 조성물내에 포함될 수 있다.

항원 성분 i) 또는 항원 성분 i) 및 iii) 대 보조제 ii) 사이의 상대적인 중량 비율은 1:20 내지 20:1 범위에 있고, 특히 바람직하게는 1:10 내지 10:1 범위에 있으며, 더 바람직하게는 1:5 내지 5:1 범위에 있고, 가장 바람직하게는 1:2 내지 2:1 범위에 있다. 보조제 및 항원의 각각의 용도에 맞는 최적의 중량 비율은 당업자라면 통상의 시험에 의해 결정할 수 있는데, 예를 들면, CTL-반응의 강도는 이러한 중량 비율에 따라 결정된다.

본 발명에 따른 조성물이 HBcAg₁ _-x 외에도 HBsAg를 포함하는 경우, HBcAg₁ _-x 대 HBsAg의 중량 비율은 바람직하게는 1:20 내지 20:1 범위, 특히 바람직하게는 1:10 내지 10:1 범위, 더욱 바람직하게는 1:5 내지 5:1 범위, 가장 바람직하게는 1:2 내지 2:1 범위이다. 당업자라면 통상의 실험에 의하여 최적의 중량비를 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 중의 성분 i), ii) 및 임의로는 iii)의 총 농도(즉, 본 발명에 따른 조성물의 부피를 기준으로 하여 성분 i), ii), 및 iii)의 총량)은, 본 발명에 따른 조성물이 동결물(lyophilisate)로서 존재하는 것이 아닌 한, 바람직하게는 0.1 내지 2,000 ㎍/ml 범위, 특히 바람직하게는 0.5 내지 1,500 ㎍/ml 범위, 더욱 바람직하게는 1 내지 1,000 ㎍/ml 범위, 가장 바람직하게는 10 내지 500 ㎍/ml 범위이다.

본 발명에 따른 조성물의 구체예에 따르면, 상기 조성물은

i) HBcAg₁ _-145, 및

ii) 보조제로서 사포닌 복합체, 바람직하게는 리포좀 사포닌 복합체를 포함한다.

본 발명에 따른 조성물의 구체예에 따르면, 상기 조성물은

i) HBcAg₁ _-144+I, 및

본 발명에 따른 조성물의 추가적인 구체예에 따르면, 상기 조성물은

i)HBcAg₁ _-145,

ii) 보조제로서 사포닌 복합체, 바람직하게는 리포좀 사포닌 복합체, 및

iii) HBsAg를 포함한다.

i) HBcAg₁ _-144+I,

iii) HBsAg를 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은, 본원에 기술된 면역화 방법에 따라 면역화하고, 본원에 기술된 MGLKFRQL (HBcAg의 합성 단편)로의 추후의 재자극(re-stimulation)처리한 C57BL/6-마우스에서 10⁵CD8⁺ T-세포당 바람직하게는, 적어도 30, 특히 바람직하게는 적어도 50, 더욱 바람직하게는 적어도 75, 더욱 더 바람직하게는 적어도 100, 가장 바람직하게는 적어도 300의 CD8⁺ IFNg⁺T-세포의, 췌장내 HBcAg-특이적 CD8⁺ T-세포 빈도를 갖는 것을 바람직하게는 특징으로 한다.

본 발명에 따른 조성물은, HBsAg를 포함하는 경우, 본원에 기술된 면역화 방법에 따라 면역화된 HBsAg에 대한 C57BL/6-마우스 포텐트(potent) 항체 반응을 유발시키는 것을, 바람직하게는 특징으로 한다. 본원에 기술된 AUSAB^® 어세이에 따라 측정된 총 항-HBs 항체는 평균, 적어도 100　mIU/mL, 바람직하게는 적어도 500　mIU/mL, 특히 바람직하게는 적어도 1,000　mIU/mL, 가장 바람직하게는 적어도 1,500　mIU/mL까지 계수된다. 항-HBs-특이적 IgG-아이소타입-클래스의 측정은, IgG1- 및 IgG2b-수가 증가되었음을 보여주고, 이는 Th1 및 Th2 면역 반응의 형성의 지표가 된다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 하기의 단계 I), II), 및 IV), 그리고 선택적으로 III)를 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다:

I) HBcAg₁ _-x, 이러한 항원의 단편, 이러한 항원 또는 단편의 변이체, 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기에서 x는 100 내지 160 범위, 바람직하게는 120 내지 150 범위, 특히 바람직하게는 140 내지 149, 더욱 바람직하게는 144 내지 146 범위의 정수, 가장 바람직하게는 145의 정수인 단계,

II) 사포닌, 사포닌 유도체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물을 포함하는 보조제를 제공하는 단계,

III) HBsAg, 이 항원의 단편, 또는 이러한 항원 또는 단편의 변이체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물을 제공하는 단계, 및

IV) HBcAg₁ _-x를 보조제 및 선택적으로는 HBsAg와 접촉시키는 단계.

HBcAg₁ _-x로서, 이의 단편 또는 변이체로서, 사포닌, 사포닌 유도체를 포함하는 보조제로서, 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물로서 뿐만 아니라, HBsAg 또는 이의 단편 또는 변이체로서, 본 발명에 따른 조성물과 관련하여 바람직한 성분 i), ii), 및 iii)으로서 이미 언급된 화합물들이 바람직하다.

상기의 단계 I) 및 III)과 관련하여, HBcAg 및 HBsAg를 제공하는 단계는 합성법에 의해, 또는 재조합 발현에 의해 만성 B형 간염(HBsAg의 경우에만)에 걸린 환자의 혈청으로부터 수득된 항원 또는 항원 단편이 적당한 약학적 담체 중에 제공되도록 하는 방식으로 하는 것이 바람직하다. 이 약학적 담체는 바람직하게는 액체, 특히 바람직하게는 수용성 액체이고, 더욱 바람직하게는 수용성 염 용액, 예컨대 PBS이다. 단계 IV)에서 다른 성분과 접촉시키기 전에, 이러한 방식으로 수득된 수용성 항원 용액은 당업자에게 공지된 방법에 의해 멸균 여과될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에 따르면, 단계 I) 및 III)에서 HBcAg 및 선택적으로는 HBsAg를 제공하는 단계는 항원이 약학적 담체에 먼저 제공되고, 바람직하게는 수용성 염 용액에, 본 발명에 따른 최종 목표 조성물 중의 HBcAg 또는 HBsAg의 농도보다 적어도 2배, 특히 바람직하게는 적어도 3배, 더욱 바람직하게는 적어도 4배, 가장 바람직하게는 적어도 6배 더 높은 농도로 제공되는 것이 바람직하다(그러므로, 예를 들면, 본 발명에 따른 조성물 중의 HBcAg의 농도는 10㎍/ml가 되는 경우, HBcAg는 적어도 20 ㎍/ml, 특히 바람직하게는 적어도 30 ㎍/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 40 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 적어도 60 ㎍/ml의 농도로 수용성 염 용액중에 처음 제공되는 것이 조성물의 제조시 바람직한 것이다). HBcAg 및 HBsAg 모두가 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 경우, 전술한 농도(적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배 또는 적어도 6배 더 농축된 농도)로 동일한 염 용액에 하나로 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 단계 IV)에서 보조제와 접촉하기 전의 이러한 더 농축된 농도의 항원 용액을 10분 내지 4시간 동안, 특히 바람직하게는 20분 내지 2시간 동안, 더욱 바람직하게는 30분 내지 1시간 동안 30 내지 60℃, 특히 바람직하게는 35 내지 55℃, 더욱 더 바람직하게는 37 내지 50℃ 범위의 온도에서 인큐베이팅하는 것이 바람직하다. 보조제와 항원이 접촉된 후에는, 수득된 조성물을 15분 내지 5시간 동안, 특히 바람직하게는 30분 내지 3시간 동안, 더욱 바람직하게는 45분 내지 2시간 동안 10 내지 40℃, 특히 바람직하게는 15 내지 30℃, 더욱 바람직하게는 20 내지 25℃, 가장 바람직하게는 실온에서 인큐베이팅하는 것이 더욱 더 바람직하다.

단계 II)에서 보조제가 제공된다. 성분 I) 또는 III)과 접촉되기 전에 보조제는, 사용된 보조제가 멸균 형태로 시판되는 것이 아닌 한, 예를 들어, 멸균 여과하는 것에 의해 먼저 멸균처리하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 사포닌 또는 사포닌 유도체로부터의 복합체, 스테로이드 및/또는 인지질이 보조제로서 사용된 경우(ISCO-매트릭스), 본 발명에 따르면, 먼저 복합체를 멸균된 형태로 제조하거나 적당한 공급업체로부터 구입한 다음에, 사포닌 복합체 또는 사포닌 유도체 복합체를 멸균된 수용성 HBcAg 용액 및 선택적으로는 멸균된 HBsAg 용액, 또는 상기 두 용액의 혼합물과 접촉시키는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 기존의 ISCOM-복합체의 형성, 즉 항원이 ISCO-매트릭스(소위 ISCOM) 내부에 혼입되는 것이 발생하지 않게 된다.

상기와 같이 수득된 조성물은, 조성물이 추가의 첨가제, 예컨대 경구로, 비강으로, 피내로, 피하로, 근육으로, 정맥내로 투여되는지 여부에 따라 추가의 약학적 담체 및 첨가제와 추가로 배합될 수 있다. 약학적 담체 및 첨가제로서, 이러한 화합물은 본 발명의 조성물에 관해 전술한 바람직한 약학적 담체 및 바람직한 첨가제가 바람직하다.

수용액이 수득되면, 이들은 포장되거나, 수용액 형태, 멸균 상태로 동결될 수 있고, 이로써 동결된 조성물은 투여 전에 멸균 용액과 섞어진다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 전술한 방법에 의해 수득가능한 조성물이 제공되는데, 이로써 이러한 조성물은 바람직하게는 본 발명에 따른 전술한 조성물과 동일한 성질을 갖게 된다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 조성물 및 전술한 첨가제 iv) 중 적어도 하나를 포함하는 약학적 제형물을 제공한다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약학적 제형물의 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 용도를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약학적 제형물은 포유류, 특히 인간에 투여하기 위해 사용된다. 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약학적 제형물의 바람직한 용도에 따르면, 이는 바람직하게는 급성 및/또는 만성의, 바람직하게는 만성 HBV 감염의 치료 및/또는 예방, 특히 치료에 기여한다.

인간의 HBV 감염과 관련하여 용어 "예방"이란 바람직하게는 하기를 포함하는 것이다:

-HBV 감염의 발생을 예방하기 위한 목적의, HBV와 접촉되지 않은 인간의 치료,

-면역활성 만성기에 들어가는 것을 예방하기 위한 목적의, 이미 HBV와 접촉한 자 및 면역내성 만성기에 있는 인간의 치료, 및

-면역활성기에 새로 진입하는 것을 막기 위한 목적의, HBV와 이미 접촉한 인간 및 비활성 보균자 단계에 있는 인간의 치료.

인간에서 HBV 감염과 관련하여 용어 "치료"는 바람직하게는 하기를 포함한다:

-HBV와 이미 접촉한 인간 및 급성 감염기에 있는 인간의 치료

-HBV와 이미 접촉한 인간 및 면역활성 만성기에 있는 인간의 치료.

특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약학적 제형물은 HBV에 이미 감염된 환자에게 투여된다.

급성 감염기에 있는 환자, 면역내성 만성기에 있는 환자, 면역활성 만성기에 있는 환자, 또는 비활성 보균기에 있는 환자는 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약학적 제형물 단독으로 또는 다른 치료 등 필요한 것과 병행하여 치료될 수 있다. 치료적 용도에서, 조성물 또는 약학적 제형물 각각은 HBV 항원에 대한 효과적인 CTL-반응을 유발하고, HBV와 관련된 증후 및/또는 합병증을 치료하기 위하여 또는 적어도 부분적으로 중단시키기 위하여 충분한 양으로 환자에게 투여된다. 본 발명에 따른 조성물 또는 약학적 제형물 각각이 바람직한 형태로 만성 B형 간염의 치료의 목적으로 사용된 경우, 이 치료의 목적은 바이러스에 감염된 세포를 감소시키거나, 이상적인 경우에는 제거하는 것이다. 감염 중 급성기 중에 부적절하거나 결핍된 CTL-반응 때문에 만성 B형 간염이 발전되기 때문에, 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약학적 제형물 각각에, CTL-반응을 효과적으로 자극하기 위하여 충분한 양의 면역을 위해 적절한 바이러스 항원(HBcAg₁ _-x 및 선택적으로는 HBsAg)을 제공하는 것이 중요하다. 이러한 목적이 달성될 수 있는 양은 "치료 유효량"이라고 정의한다. 각각의 용도에 맞는 치료 유효량은 예를 들면, 본 발명에 따른 조성물의 정확한 조성, 또는 투여 방법, 치료되는 질병의 단계 및 심각도, 체중, 건강 상태 및 주치의의 판단에 따라 달라지지만, 일반적으로는 70 kg 환자에 대해 약 0.1 내지 2,000 ㎍(보조제, HBcAg₁ _-x 및 선택적으로는 HBsAg의 총량) 범위, 특히 바람직하게는 0.5 내지 1,500 ㎍ 범위, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 1,000 ㎍ 범위, 가장 바람직하게는 10 내지 500 ㎍ 범위이고, 재조정된 투여량은 환자의 CTL-반응 정도에 따라 1주 내지 1개월 동안에 0.1 내지 2,000 ㎍ 범위인데, 상기 CTL-반응은 환자의 모세혈관 림프구(peripheral blood lymphocytes (PBL))의 HBV-특이적 CTL-활성에 의해 결정된다.

만성 B형 간염의 치료시, 투여는 적어도 임상학적인 증후나 실험실적인 지시자가 HBV 감염이 제거되었거나, 임의선택적으로는 그 이후로는 적어도 면역계의 조절하에 있다는 것을 암시하기 전까지의 기간 동안에 계속된다.

본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약학적 제형물은, 기본적으로 경구로, 비강으로, 피내로, 피하로, 근육으로 또는 정맥내로 투여될 수 있다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 추가로 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약학적 제형물의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.

이러한 관점에서, 전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료를 위한 약학적 제형물의 제조를 위해서, 바람직하게는 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료를 위해서, 하기를 포함하는 본 발명의 조성물의 용도를 제공하고:

i) 전술한 HBcAg₁ _-x,

ii) 사포닌 또는 사포닌 유도체 또는 적어도 상기 두 가지의 혼합물을 포함하는 전술한 보조제, 및

iii) 전술한 HBsAg,

이로써, HBV 감염 및 HBV 매개성 질병이, 이의 유전자형 또는 서브타입, 바람직하게는 유전자형이 본 발명에 따른 조성물에 포함된 HBsAg의 유전자형 또는 서브타입, 바람직하게는 유전자형과 상이한 HB-바이러스에 의해 유발된다. 예를 들어, HBV 감염 및 HBV 매개성 질병이 유전자형 A의 HB-바이러스에 의해 유발된 경우, 이러한 질병의 감염을 치료하기 위해서는, 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 성분 i) 및 ii)외에도, 유전자형 B, C, D, E, F, G의 HBsAg 또는 이러한 유전자형의 HBsAg의 혼합물과 함께 사용되며, 이로써, 유전자형 A의 HBsAg가 포함될 수 있게 된다.

또한, 전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 방법이 제공되는데, 이는 아직 HBV와 접촉하지 않은 인간 또는 이미 HBV와 접촉한 인간, 바람직하게는 만성 B형 간염을 앓고 있는 환자에게 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약학적 제형물의 치료 유효량을, 바람직하게는 전술한 기술 및 방식으로 투여하는 것이다.

이미 HBV와 접촉한 인간, 바람직하게는 만성 B형 간염을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것이 특히 유리할 수 있는데, 이러한 조성물은 HBcAg₁ _-x 및 보조제 외에도, HBV-유전자형 또는 HBV-서브타입 유래의 HBsAg로서, 치료되어야 할 환자의 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병에 대해 일상적인(casual) HB-바이러스의 유전자형 또는 서브타입, 바람직하게는 유전자형과 상이한 HBsAg를 포함한다.

지금부터 본 발명을 하기의 비제한적인 도면 및 실시예를 사용하여 보다 자세히 설명하고자 한다.

도 1은 보조제로서 AbISCO^® 100을 사용하여 본 발명에 따른 조성물을 사용하였을 때 CTL-반응을 보이는 도면이다.

도 2는 보조제로서 AbISCO^®200을 사용하여 본 발명에 따른 조성물을 사용하였을 때 CTL-반응을 보이는 도면이다.

도 3은 AUSAB-항-HBsAg 수에 의해 나타내어지는, 보조제로서 AbISCO^® 200을 사용하여 HBcAG 및 HBsAg를 포함하는 본 발명에 따른 조성물을 사용하였을 때 B-세포-반응을 보이는 도면이다.

도 4는 항-HBsAg-IgG1 수 및 항-HBsAg-IgG2b 아이소타입(isotype) 수에 의해 나타내어지는, 보조제로서 AbISCO^® 200을 사용하여 HBcAG 및 HBsAg를 포함하는 본 발명에 따른 조성물을 사용하였을 때 B-세포-반응의 면역 프로파일을 보이는 도면이다. 본 발명에 따른 조성물은 Th1 및 Th2 면역 반응 모두를 유도한다.

방법

C57BL /6 마우스의 면역화

C57B1/6-마우스를 각각 100㎕ PBS 중의 표 1 및 2에 제시된 양의 PBS, HBcAg, HBsAg 및 보조제로 면역화시키는데, 각각의 소정의 양을 21일간 따로 피하로 2회 주사하였다. DNA 면역화를 위해서, 플라스미드 pCI/HBV_ayw 코어를 각각 50 ㎕ PBS 중의 2x50㎍의 양으로 Tibialis anterior 근육에 주사하였다.

췌장내 항원 특이적 CD8 ⁺ T-세포-빈도의 측정

2차 면역화한 후 2주 후에, 췌장을 동물에서 제거하고 세포 현탁액을 췌장 세포로부터 만들었다. 췌장 세포 현탁액의 제조는 하기에 기재되어 있다: Schirmbeck R., Bohm W., Fissolo N., Melber K., and Reimann J.: "Different imunogenicity of H-2 K ^b - restricted epitopes in natural variants of the hepatitis B surface antigen ", Europ. J. Immunol. 2003, 33: 2429-38. 췌장 세포를 4시간 동안 0.25　μM HBcAg-특이적 펩타이드(MGLKFRQL; Jerini BioTools, Berlin, DE) 및 5　㎍/ml Brefeldin A (BFA) (catalogue no. 15870, Sigma)를 함유하는 RPMI-1640 배지에서, 37　℃에서 인큐베이팅하였다(재-자극(re-stimulation)하였다). 재자극된 세포를 수득하고, 표면을 항-CK8 mAb(항-마우스 CD8a-PE-컨쥬게이트(conjugate); catalogue no. 55303; BD Biosciences, Heidelberg, DE)로 염색하고, 고정하며, 투과시킨 뒤(permeabilised), 세포질(cytoplasmatic) IFN_γ (항-마우스 IFN_γ-FITC-컨쥬게이트; catalogue no. 554411; BD-Biosciences, Heidelberg, DE) 상에서 염색하였다. 코어-특이적 CD8⁺IFN_γ ⁺CTL은 FACS 분석방법에 의해 측정하 였다. CD8⁺IFN_γ ⁺T-세포/10⁵CD8⁺T-세포에 대한 평균값이 제시된다.

항체- 아이소타입의 측정

96-웰-마이크로적정 플레이트(Nunc, Wiesbaden, DE)를 HBsAg (카보네이트 완충액 중의 2 ㎍/mL)로 코팅하고, 4　℃에서 밤새 면역화하기 위해 사용하였다(웰당 100㎕).

ELISA-방법의 초기에, 코팅된 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다(0.5% Tween 20을 함유한 포스페이트 염 완충 용액). 웰을 0.2% 젤라틴으로 1시간 동안 37℃에서 블록킹하였다. 마우스 플라즈마/혈청을 PBS 중에 2단계로 희석시키고(1:250 내지 1:32,000 범위), 100㎕의 희석액을 적당한 웰에 첨가하고(2배로), 1시간 동안 37　℃에서 인큐베이팅하였다. 면역화하지 않은 마우스로부터의 혈청을 대조군으로서 사용하였다. 마이크로적정 플레이트를 PBST로 5회 세척한 다음에 아이소타입-특이적인 2차 항체(퍼옥시다아제 컨쥬게이팅된 것)와 인큐베이팅하였다. IgG1에 대해 시험하기 위하여, gamIg1 (catalogue no. GAM/IgG1/PO) 를 사용하였고, IgG2b에 대해 시험하기 위하여, gamIg2b (catalogue no. IgG2b/PO; Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Netherlands)를 사용하였다. 기질로서 o-페닐렌디아민(oPD)으로( 1　mg/mL 30　% H₂O₂와 함께 1　mg/ml oPD) (웰당 100 ㎕) 변색 반응을 수행하였다. 1　N　H₂SO₄ (웰당 50㎕)를 사용하여 10-15분 후에 변색 반응을 중단시키고, 스펙트로포토미터(SpectraMax plus; Molecular Devices, Ismaning, DE)에서 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

항- HBs 항체 총수의 측정

면역화된 마우스의 혈청내 항-HBs 항체 수를 IMX AUSAB^®test kit (reference no. 2226-21, Abbott, Wiesbaden, Germany)를 사용하여 IMX Automated Immunoassay Analyzer (Abbott Diagnostics, Wiesbaden, Germany)에서 측정하였다. 어세이는 공급업자가 지시한 대로 수행하였다.

항원의 제조

a) HBcAg₁ _-144+I

벡터 pBR322(Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W.: "Construction and Characterization of new cloning vehicles . II . A multipurpose Cloning System ," Gene. 1977; 2(2):95-113) 및 환형화된 B형 간염 바이러스 게놈(HBV320, 3,182 베이스 페어; Bichko V, Pushko P, Dreilina D, Pumpens P, Gren E (1985), "Subtype ayw variant of hepatitis B virus", FEBS 185: 208-212)으로부터, BamHI-제한효소를 사용하여, 완전한 HBV 게놈을 보유한 플라스미드 pHB320 (7,543 베이스 페어)을 구조체화하였다.

돌출한(overhanging) 개별 스트랜스 서열에 대해 HhaI-절단하고 S1-뉴클리아제 처리한 후, 프리-코어/코어-유전자(코어 오픈 리딩 프레임)에 대한 유전자 서열을 보유하는 1,000 베이스 페어 길이의 단편을, 벡터 pBR322 Ptrp에 블런트-엔드 연결법(Blunt - end-ligation)을 사용하여 클로닝하였다(Ikehara M, Ohtsuka E, Tokunaga T. et al . (1984): Synthesis of a gene for human growth hormone and its expression in E. coli .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5956-5960). 이 벡터는 BamHI/SalI 로 미리 절단하고, 튀어나온 말단을 DNA 폴리머라제로 채워넣었다. 생성된 플라스미드 pGC74(6,046 베이스 페어)는 트립토판 프로모터를 보유하고, 반대되는 방향으로 HBc-유전자를 보유한다. 이 방향은, HBcAg-발현 카셋트의 최적화를 위한 단일 제한 자리의 재조합에 의해, 하기의 클로닝 단계를 더욱 용이하게 한다.

HBc-단편의 방향을 변화시키기 위해, pGC74를 BamHI으로 절단하고, 튀어나온 말단을 DNA-폴리머라아제로 채운 후에 SalI으로 후-절단했다(post-restricted). 이 단편을 벡터 pBR322 Ptrp으로 연결했다. 이 벡터를 AvaI으로 미리 연결하고, 말단을 DNA-폴리머라아제로 채운 후에 SalI으로 후-절단했다. 상기와 같이 구조체화된 플라스미드 pGC2 (5,552 베이스 페어)는 트립토판 프로모터 및 HBc-유전자를 동일한 방향으로 보유한다.

이 플라스미드를 SalI으로 절단하고, 튀어나온 말단을 뉴클레아제(nuclease) Bal31으로 제거하며, EcoRI으로 후절단했고, 상기와 같이 생성된 돌출된 말단을 DNA-폴리머라아제로 채우고 다시 연결하였다. 최적의 Ptrp-Shine-Dalgarno-HBc 구조 또는 거리를 수득하기 위해서, 트립토판-프로모터 및 HBc-유전자 사이에 짧아진 서열을 갖는 플라스미드 pHBc10 (4,825 베이스 페어)가 생성되었다.

유전자 발현을 최적화하기 위해서, HhalI 및 S1-뉴클레아제로 절단한 후 1,044 베이스 페어-HhaI-HBc-단편을 pHBc10로부터 절단하고, 변형된 pBR322-플라스미드인 벡터 pBR322-trp-I로 클로닝하였다. 이 구조체(construction)는 트립토판 프로모터의 조절하에 HBc-유전자의 최적화된 발현 서열을 가진, pHBc3(7,108 베이스 페어)를 생성하였다.

플라스미드 pHBc3을 Kpn21로 절단하고, 합성 폴리링커(polylinker) EcoRV-ClaI-PvuI (5'TCCGGAGATATCGATCGTCCGGA-3')를 HBc 유전자의 아미노산 위치 144에 있는 절단 부위에 도입하였다. 플라스미드 pHBc1615 (7,129 베이스 페어)가 이로부터 생성되었다. PHBc1615를 ClaI로 선형화하고(linearised), 아미노산 위치 144 뒤에 종결 코돈 및 위치 145에서의 부가적인 이소루신 코드를 가지는 합성 폴리링커를 도입하였다. 플라스미드 pHBc2-7가 수득되었다.

컴피턴트(Competent) E. coli 세포(Stem BL21: Genotype B F^-dcm ompT hsdS (r_B ^-m_B ^-)gal)를 플라스미드 pHBc2-7로 형질전환하고 37℃에서 밤새 앰피실린을 함유한 LB 아가 배지에 플레이팅한 후에 수득하였다. 각 하나의 콜로니에 대해, 300 ml M9 최소 배지(1% Casamino acid를 첨가한 것, Difco catalogue no. 223050, Becton-Dickinson, Heidelberg) 및 0.2% 글루코스를 주사하였다. 37℃에서 밤새 1 l-Erlenmeyer 플라스크인 둥근 플라스크에서 배양하였다. 배양액은 일반적으로는 2 내지 5 사이의 광학 밀도(OD_540nm)에 도달하였다.

세포를 원심분리하고 용균 완충액(50　mM TRIS/HCl pH 8.0; 5　mM EDTA, 100　㎍/ml PMSF, 0.08　% Triton-X-100) 중에 펠렛을 재현탁시켰다. 컨디셔닝된 세포를 얼음 위에서 초음파처리(22 kHz에서 3　x　15초)하여 용균시켰다. 세포 데브 리(debris)를 원심분리한 후에는, 4℃에서 4 내지 20시간 동안 암모늄 설페이트(33% 포화도)로 상층액으로부터 단백질을 침전시켰다. 펠렛을 0.1　% Triton-X-100으로 PBS 중에 재현탁시켰고, Sepharose CL4B-크로마토그래피 컬럼(2.5 X 85cm) 상에 수득된 용액의 5 내지 10 ml 각각을 충전시켰다. Triton-X-100을 첨가하지 않고도 PBS로 용리가 되었다. 각 분획내에 HBcAg-폴리펩타이드가 존재한다는 것은 폴리아크릴아미드-겔-전기영동/코마시-염색으로 확인하였다. 포지티브 분획을 정제하고, 4℃에서 20시간 동안 암모늄 설페이트 침전(33% 포화도)시켜 농축시켰다. 단백질 펠렛을 3-20 mg/ml 사이의 농도를 갖는 PBS에 재현탁시켰고, 동일한 완충액 1,000 용적에 대해 밤새 투석시켰다. HBcAg₁ _-144+I를 PBS 중에 멸균 여과시켰고, -20℃에서 보관하였다.

b) HBsAg

HBsAg를 하기에 기술된 바와 같이 제조하였고: Brocke　P, Schaefer　S., Melber　K., Jenzelewski V., Muller F., Dahlems U., Bartelsen O., Park K.N., Janowicz Z.A., Gellissen G.: "Recombinant hepatitis B vaccines : disease characterization and vaccine production (2005) in Gellissen G (Editor): "Production of recombinant proteins - novel microbial and eucaryontic expression systems " pages 319-360, Wiley-VCH, Weinheim), Rhein Biotech, Dusseldorf, Germany로부터 입수할 수 있다.

c)HBcAg₁ _-183

HBcAG₁ _-183를 DiaSorin S.r.l. (Saluggia, Italy)로부터 입수하였다.

실시예 1

첫번째 실험에서, 상품명 AbISCO^®100 (ISCONOVA, Uppsala, Sweden)로 시판되는 제품인 사포닌 복합체를 보조제로서 사용하였다. 코어-플라스미드-DNA를 양성 대조군으로 사용하였고, 순수한 PBS, PBS 중의 순수한 보조제, PBS 중의 순수한 HBc_1-144+I 및 PBS 중의 HBc₁ _-183를 음성 대조군으로 사용하였다. 본 발명에 따른 조성물은 PBS, HBc₁ _-144+I 및 AbISCO^®100를 포함하였다. 각 성분의 양은 표 1에 주어진다.

플라스미드 pCI/HBV_ayw 코어를 하기에 기술된 바와 같이 제조하였고: Kuhrober A., Pudollek H.P., Reifenberg K., Chisari F.V., Schlicht H.J., Reimann J., Schirmbeck R. (1996): "DNA Immunization induces antibody and cytotoxic T cell responses to hepatitis B core antigen in H-2b mice ", J. Immunol. 156: 3687-95(구조체는 pCMV-1c로 언급된다), 공급업자가 설명하는 바와 같이 QIAGEN-tip 500 (catalogue no. 12162; Qiagen, Hilden, Germany)으로 분리하였다.

본 발명에 따른 조성물의 제형을 위해서, HBc₁ _-144+I 를 먼저 PBS로 최종 생성물의 4배 농도까지 희석하고, 30분 동안 37℃에서 교반하며 인큐베이팅하였다. 수성 분산액으로서 제조업자에 의해 공급된 AbISCO^®100을 첨가한 다음에, 표 1에 제 시된 항원의 최종 농도로 PBS를 사용하여 조정하여, 보조제 및 항원에 대한 표에 제공된 농도가 만들어지게 하였다. 상기와 같이 제조된 조성물을 실온(20-25℃)에서 1시간 동안 인큐베이팅한 다음에, 밤새(12-18시간) 2 내지 8℃에서 보관한 다음에 면역화를 위해 이튿날에 사용하였다.

시험군	면역화용 조성물
A (n. inv.¹⁾)	50　㎕ PBS 중의 2 X 50　㎍ 코어-플라스미드-DNA (양성대조군)
B (n. inv.)	100　㎕ PBS (음성대조군)
C (n. inv.)	100 ㎕　PBS 중의 12　㎍ AbISCO^®100 (음성대조군)
D (n. inv.)	100 ㎕　PBS 중의 10　㎍ HBcAg₁ _-144+I (음성대조군)
E (inv.²⁾)	100 ㎕　PBS 중의 12　㎍ AbISCO^®100 및 10　㎍ HBcAg_1-144+I
¹⁾ n. inv. = 본 발명의 것이 아님(non inventive) ²⁾ inv. = 본 발명의 것(inventive)

상기 기술된 조성물에 의해 달성된 CTL-반응은 도 1에서 발견할 수 있다. 도 1로부터, 본 발명에 따른 조성물(시험군 E)을 사용하여, 코어-특이적 CTL-반응이 달성되었음을 볼 수 있으며, 이는 코어-플라스미드-DNA(시험군 A)로 달성할 수 있는 CTL-반응보다 더 강한 것이다.

실시예 2

두번째 실험에서, 상품명 AbISCO^®200 (ISCONOVA, Uppsala, Sweden)로 시판되는 제품인 사포닌 복합체를 보조제로서 사용하였다. 코어-플라스미드-DNA를 양성 대조군으로 사용하였고, 순수한 PBS, PBS 중의 순수한 보조제, PBS 중의 순수한 HBc₁ _-144+I 및 PBS 중의 HBc₁ _-183를 음성 대조군으로 사용하였다. 본 발명에 따른 조성물은 PBS, HBc₁ _-144+I 및 AbISCO^®200 및 선택적으로는 HBsAg를 포함하였다. 각 성분의 양은 표 2에 주어진다.

본 발명에 따른 조성물의 제형을 위해서, HBc₁ _-144+I 및 선택적으로는 HBsAg를 먼저 PBS로 최종 생성물의 4배 농도까지 희석하고, 30분 동안 37℃에서 교반하며 인큐베이팅하였다. HBsAg를 사용할 때는 먼저 HBsAg 및 HBcAg₁ _-144+1을 무균 조건 하에 배합한 다음에, 마찬가지로 최종 생성물의 농도의 4배까지 PBS로 희석한다. 수성 분산액 형태로서 제조업자에 의해 공급된 AbISCO^®200을 첨가한 다음에, 표 2에 제시된 항원의 최종 농도로 PBS를 사용하여 조정하여, 보조제 및 항원에 대한 표에 제공된 농도가 만들어지게 하였다. 상기와 같이 제조된 조성물을 실온(20-25℃)에서 1시간 동안 인큐베이팅한 다음에, 밤새(12 내지 18시간) 2 내지 8℃에서 보관한 다음에 면역화를 위해 이튿날에 사용하였다.

시험군	면역화용 조성물
F (n. inv.)	50 ㎕　PBS 중의 2 X 50　㎍ 코어-플라스미드-DNA (양성대조군)
G (n. inv.)	100　㎕ PBS (음성대조군)
H (n. inv.)	100 ㎕　PBS 중의 5　㎍ AbISCO^®200 (음성대조군)
I (n. inv.)	100 ㎕　PBS 중의 10　㎍ HBcAg₁ _-144+I(음성대조군)
J (n. inv.)	100 ㎕　PBS 중의 10　㎍ HBcAg₁ _-144+I및 5 ㎍ HBsAg(음성대조군)
K (n. inv.)	100 ㎕　PBS 중의 10　㎍ HBcAg₁ _-183 (음성대조군)
L (inv.)	100 ㎕　PBS 중의 5　㎍ AbISCO^®200 및 10　㎍ HBcAg₁ _-144+I
M (inv.)	100 ㎕　PBS 중의 5　㎍ AbISCO^®200, 10　㎍ HBcAg_1-144+I 및 5　㎍ HBsAg

상기 기술된 조성물에 의해 달성된 CTL-반응은 도 2에서 발견할 수 있다. 도 2로부터, 본 발명에 따른 조성물(시험군 L 및 M)을 사용하여, 코어-특이적 CTL-반응이 달성되었음을 볼 수 있으며, 이는 코어-플라스미드-DNA(시험군 F)로 달성할 수 있는 CTL-반응보다 더 강한 것이다.

도 3은 본 발명의 조성물은, HBsAg를 포함하는 한, HBsAg에 대한 포텐트(potent) 항체를 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 도 4는 본 발명에 따른 이러한 조성물을 사용하면, IgG1- 뿐만 아니라, IgG2b 수도 증가하고, 이는 Th1 및 Th2 면역 반응이 형성되었음을 보여주는 지표이다.

<110> RHEIN BIOTECH GESELLSCHAFT FUR NEUE BIOTECHNOLOGISCHE PROZESSE UND PRODUKTE MBH <120> A Composition for therapy and/or prophylaxis of HBV-infections and HBV-mediated Diseases <150> EP 05020208.4 <151> 2005-09-16 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu 1 5 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 2 tccggagata tcgatcgtcc gga 23

Claims

i) HBcAg₁ _-x(여기에서, x는 100 내지 160 범위의 정수이다), 이 항원의 단편, 이 항원 또는 항원의 단편의 변이체 또는 이들 중 적어도 두 가지,

ii) 사포닌 또는 사포닌 유도체 또는 이들 중 적어도 두 가지에 대한 혼합물을 포함하는 보조제, 및 선택적으로는

iii) HBsAg, 이 항원의 단편, 이 항원 또는 항원의 단편의 변이체 또는 이들 중 적어도 두 가지를 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 x는 140 내지 149 범위의 정수인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 x는 144 내지 146 범위의 정수인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제는 사포닌 복합체, 사포닌 유도체 복합체, 또는 적어도 상기 두 가지의 혼합물이고, 물 또는 수용성 염 용액과 상이한 성분으로서 하기를 포함하는 것으로서:

(α1) 0 내지 95 wt%의 인지질,

(α2) 0 내지 95 wt%의 스테로이드,

(α3) 5 내지 100 wt%의 사포닌 또는 사포닌 유도체, 및

(α4) 0 내지 20 wt%의 추가의 첨가제,

상기 중량은 물 또는 이의 수용성 염 용액 부분은 제외하고 사포닌 복합체 또는 사포닌 유도체 복합체 각각의 총 중량을 기준으로 한 것으로, 성분 (α1) 내지 (α4)의 합은 100 wt%인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제는 ISCO 매트릭스인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 성분 i) 또는 항원 성분 i) 및 iii) 대 보조제 ii)의 상대적인 양 비율은 1:20 내지 20:1 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분 i), ii), 및 선택적으로는 iii)의 조성물 내 총 농도는 0.1 내지 2,000 ㎍/ml 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은

i) HBcAg₁ _-145, 및

ii) 사포닌 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은

i) HBcAg₁ _-144+I, 및

ii) 사포닌 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은

i) HBcAg₁ _-145,

ii) 사포닌 복합체, 및

iii) HBsAg를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은

i) HBcAg₁ _-144+I,

ii) 사포닌 복합체, 및

iii) HBsAg를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
하기의 I), II), 및 IV) 단계를 포함하고, 선택적으로는 III) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물의 제조방법:

I) HBcAg₁ _-x(여기에서, x는 100 내지 160 범위의 정수이다), 이 항원의 단편, 이 항원 또는 이 항원의 단편의 변이체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물을 제공하는 단계,

II) 사포닌 또는 사포닌 유도체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물을 포함하는 보조제를 제공하는 단계,

III) HBsAg, 이 항원의 단편, 이 항원 또는 이 항원의 단편의 변이체 또는 이들 중 적어도 두 가지의 혼합물을 제공하는 단계, 및

IV) 상기 보조제를 상기 HBcAg₁ _-x, 선택적으로는 상기 HBsAg와 접촉시키는 단계.
제12항에 있어서, 상기 x는 140 내지 149 범위의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 x는 144 내지 146 범위의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제는 사포닌 복합체, 사포닌 유도체 복합체, 또는 이들 중 적어도 두 가지에 대한 혼합물이고, 물 또는 수용성 염 용액과 상이한 성분으로서 하기를 포함하는 것으로서:

(α1) 0 내지 95 wt% 의 인지질,

(α2) 0 내지 95 wt%의 스테로이드,

(α3) 5 내지 100 wt%의 사포닌 또는 사포닌 유도체, 및

(α4) 0 내지 20 wt%의 추가의 첨가제,

상기 중량은 물 또는 이의 수용성 염 용액 부분은 제외하고 사포닌 복합체 또는 사포닌 유도체 복합체 각각의 총 중량을 기준으로 한 것으로, 성분 (α1) 내지 (α4)의 합은 100 wt%인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제는 ISCO 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제17항에 따른 조성물 및 적당한 첨가제를 포함하는 약학적 제형물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제17항에 따른 조성물의, HBV 감염 및 HBV 매개성 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약학적 제형물의 제조를 위한 용도.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항 또는 제17항에 따른 조성물의, 만성 HBV 감염의 치료를 위한 약학적 제형물의 제조를 위한 용도.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 조성물은 상기 HBsAg를 포함하고, 상기 HBV 감염 및 HBV 매개성 질병은 본 발명에 따른 조성물 중에 포함된 상기 HBsAg의 유전자형 또는 서브타입과는 상이한 유전자형 또는 서브타입의 HB 바이러스에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 용도.