CN101309931A - 包含截短的hbc核心蛋白和基于皂苷的佐剂的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组合物，其包含：i)HBcAg_1－x、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体、或者其至少两种，其中x是100到160的整数，ii)包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少两种的混合物的佐剂，以及任选地iii)HBsAg、来自该抗原的片段、该抗原或该抗原的片段的变体、或者其至少两种。本发明还涉及该组合物的生产方法、可以通过该方法获得的组合物、药物制剂、该组合物或该药物制剂在治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病中的用途、组合物或药物制剂在生产用于治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病的药物中的用途以及治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病的方法。

Description

包含截短的HBC核心蛋白和基于皂苷的佐剂的疫苗

技术领域

本发明涉及组合物、该组合物的生产方法、可以通过该方法获得的组合物、药物制剂、该组合物或该药物制剂在治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染和HBV介导的疾病中的用途、该组合物或该药物制剂在生产用于治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病的药物中的用途以及治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病的方法。

发明背景

据世界卫生组织(WHO)的估计，现今超过20亿人感染或已经感染乙型肝炎病毒(HBV)。因此，HBV属于对人类健康产生巨大影响的最为重要的人类病原体。

HBV感染可经由血液、受污染血液制品及通过性交而发生，其中所述经由血液的感染特别是由受感染母亲在分娩过程中或者在分娩以后不久传给新生儿。HBV是一种嗜肝性病毒，能够导致慢性和急性感染。尽管在出生时或者在出生后第1个月内的感染在90％的病例中导致慢性感染，但这仅在大约10％的成年感染病例中被观察到。在受感染成人中，有大约2％的人可发生与高死亡率相关联的暴发性肝炎(急性肝衰竭)。

慢性感染最初没有临床症状，但由于HBV的持续存在以及受感染肝细胞与免疫系统的病理相互作用，在10到30年的潜伏期后会发展为急性肝疾病(慢性活动性乙型肝炎)。大约25％的慢性HBV携带者将发展成为慢性乙型肝炎。慢性乙型肝炎最终将导致肝硬化和/或原发性肝细胞癌。两种疾病都具有高死亡率。据估计目前全世界大约35亿人为慢性感染的HBV携带者。每年大约1百万人死于慢性HBV感染所造成的不良后果。

幸运地是，HBV感染可通过预防性乙肝疫苗进行预防。20世纪80年代开始，首次可以获得基于从慢性携带者的血浆中纯化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的这种疫苗。之后，其被重组生产的HBsAg取代。然而，由于目前疫苗并未被常规地引入所有的国家中，HBV将仍然威胁着人类的健康。在本上下文中，有意义的是，慢性HBV携带者被认为具有传染性并能够传播该病毒。

慢性乙型肝炎是一种具有多种表现形式的十分动态的疾病。在慢性感染的早期阶段，可以提及免疫耐受期，其特征是血清中存在病毒标记(HBV-DNA，HBsAg，HBeAg)并且无肝脏问题。大约25％的HBV携带者转入免疫激活期，在其过程中出现最初的肝脏症状并且治疗成为必需的。在免疫激活期，血清中的HBV-DNA一般会减少，而血清转氨酶分批升高。尽管HBsAg在血清中持续存在，但有小百分比的患者(大约1％)会自发地经历由HBeAg阳性转为HBeAg阴性的血清转换。这种血清转换是进入非活动性携带期的征兆，其特征为病毒活性低。极少数情况下，也发现血清由HBsAg阳性转为抗HBsAg阳性，这被认为是感染痊愈的征兆。慢性活动性乙型肝炎的特征在于肝组织的坏死性炎症和纤维化，这最终将导致肝硬化和失代偿性肝脏疾病。作为其它的并发症，肝硬化可导致原发性肝细胞癌，由此一些慢性HBV携带者也可发展成为肝癌，但无肝硬化的征候。

用于活动性慢性乙型肝炎的治疗可能方案是非常有限的。目前，治疗可以通过采用α-干扰素(例如Intron A

或者Roferon A

)或抗病毒物质(Lamivudine，Adefovir，Entecavir)进行。α-干扰素优选用于HBeAg阳性患者，有约30％患者由此发生与非活动性携带状态有关的HBeAg血清转换反应。因此，少数患者(约3％)也显示出标志着全面痊愈的HBsAg血清转换。但采用α-干扰素进行治疗会产生严重的副作用，往往需要提早停止该治疗。与HBeAg阳性的患者相比，α-干扰素在HBeAg阴性患者中显示低反应率。作为替代品，属于核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂一类的抗病毒物质可以在此使用。这些抗病毒物质可抑制病毒的复制，并因此可阻止该肝病的发展。HBeAg阳性患者的该血清转换率相对α-干扰素而言是较低的，并且不比自发的康复高。因此，该抗病毒疗法的目标是通过降低病毒活性从而无限期地延迟该疾病。然而抗病毒物质的长期使用受到抗性病毒突变体出现的危及。就最常用的药物Lamivudine而言，已观察到在四年中高达68％的耐药率。最近推出的Adefovir似乎以较低的频率引起耐药性。即使抗病毒物质可联合使用，但病毒耐药性这个基本问题对于长期治疗仍是一个内在的隐患。因此，迫切需要另外的治疗手段来治疗慢性乙型肝炎，尤其期望的是几乎无副作用且有望对患者进行短期治疗的免疫调节剂。

此类可选方案是治疗性疫苗形式的特异性免疫治疗。治疗性疫苗的概念是特异地刺激慢性乙型肝炎患者的免疫系统以引发充足的抗病毒免疫应答，该应答最终导致对病毒的控制以及对该肝脏疾病发展的遏制。治疗性疫苗必须显示出的一个明显效果是打破在大量病毒抗原存在时出现的免疫耐受。该治疗尤其应当引起抗多种HBV抗原的病毒特异性T-细胞应答，尤其是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。与急性、痊愈中的感染相比，在慢性乙型肝炎患者中确切地仅能够显示出极小程度的这些免疫应答，或者根本不显示这些免疫应答。强病毒特异性CTL应答通常被认为代表着对病毒感染的控制。因此，治疗性疫苗的开发以诱导强抗病毒CTL应答作为首要目的。

通常重组型亚单位疫苗不能引发CTL应答。在动物模型(小鼠)中，DNA疫苗，尤其是基于编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的质粒载体的DNA疫苗能够实现显著的CTL应答，但目前的疫苗至今全部在人体中仅显示极微弱的免疫应答并且不刺激任何有效的CTL应答。由于这些困难，目前所谓的″致敏-加强疫苗″正在研制中，藉此交替地采用DNA疫苗(如编码HBsAg)及重组病毒载体(如，修饰后的痘苗病毒Ankara Stem)，如表达HBsAg的载体进行免疫(见McConkey S.J.，Schneider J.，MendyM.，Cavenaugh J.S.，Bertoletti A.，Whittle H.，Hill A.V.S.″一种新型的针对乙型肝炎病毒的″致敏-加强″治疗性免疫策略的安全性和免疫原性″，会议摘要：″乙型肝炎病毒的分子生物学″，贝加莫，意大利，9月7日至10日，2003年)。

WO-A-01/98333描述了一种HBc抗原特别是用于HBV治疗的用途，在该HBc抗原中C末端的一个或多个4精氨酸重复单位被去除，但C末端的半胱氨酸残基被保留。去除的精氨酸重复单位可由能够被辅助型T细胞、B-细胞或细胞毒性T淋巴细胞所识别的、来源于细菌或病毒病原体、寄生虫、过敏原或癌症相关抗原的表位序列替代。

WO-A-2005/023297描述了用于治疗HBV感染和HBV介导的疾病的一种组合物，其包含至少两种乙型肝炎表面抗原(HBsAg’s)，其片段和/或编码它们的核酸，其中所述HBsAg在S-区和/或前S1区具有不同的HBV基因型，并且所述组合物不包含HBcAg或编码它的核酸。

WO-A-2005/056051公开了尤其是用于治疗或预防乙型肝炎感染的重组多肽组合物，其中该组合物包含多个组分，优选地选自下列中的至少3个或全部4个：a)核心-多肽元件，其包含HBV核心蛋白的免疫原性区的序列；b)表面抗原-多肽元件，其包含HBV表面抗原蛋白(S，M或L)的免疫原性区的序列；c)X-多肽元件，其包含HBV-X蛋白质的免疫原性区的序列；和d)聚合酶-多肽元件，其包含HBV聚合酶蛋白的免疫原性区的序列，其中所述元件中至少有一个包含相应的HBV蛋白的至少100个氨基酸。

EP-A-I 136 077揭示了一种鼻用的疫苗组合物，包括HBsAg和任选地HBcAg，其也可以例如用作治疗性疫苗。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中已知的用于在人体中治疗或预防乙型肝炎感染的疫苗的缺陷。

具体地，本发明的目的是提供适用于治疗人的组合物，该组合物与现有技术已知的组合物相比可以在慢性HBV感染患者中导致强烈的免疫应答，特别是针对HBcAg的强烈的CTL应答。该组合物将在尽可能多的慢性HBV感染患者中打破免疫耐受，而不管患者的HLA类型。

根据本发明的组合物将能够打破免疫耐受，而不管慢性患者的HBV基因型，并因此导致可以控制病毒的免疫应答的产生。

本发明的再一目的是提供一种可以以尽可能小的制备复杂度获得具有上述优点的组合物的方法。

如下组合物有助于解决上述目的，该组合物包含：

i)HBcAg_1-x(HBcAg＝HBV核心抗原)、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体、或者其至少两种的混合物，其中x是100到160的整数，优选120到150的整数，尤其优选140到149的整数，更优选144到146的整数，最优选等于145，

ii)包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少两种的混合物的佐剂，和任选地，

iii)HBsAg、该抗原的片段、该抗原或该抗原的片段的变体、或者其至少两种的混合物。

尽管完全出乎意料，但是仍有利地发现，使用上述原则上适用于人的组合物，在动物模型中可获得强烈的核心特异性CTL应答，该应答与在同一动物模型中采用编码HBcAg的质粒载体(DNA免疫)获得的CTL应答大致相当。

在如下详述中使用的术语“多肽”是指氨基酸聚合物，并且无具体的最少氨基酸数目限制。因此其同样包括肽、寡肽、二聚体，三聚体，低聚体，颗粒等。再者，术语“多肽”不仅包括在核糖体中翻译后直接得到的纯氨基酸聚合物，还包括翻译后通过糖基化、乙酰化、磷酸化等获得的多肽。

根据本发明，“HBcAg_1-x”应理解为是一种多肽，其包括天然HBcAg的第1位至第X位氨基酸，优选由天然HBcAg的第1位至第X位氨基酸组成，由此术语″HBcAg_1-x″应理解为指所有可以想到的、具有目前已知8种标准基因型A，B，C，D，E，F，G和H的HBcAg的第1位至第X位氨基酸的多肽(第一位氨基酸(＝氨基酸1)是位于多肽的N末端的氨基酸)。这8种标准基因型在大约8％的核苷酸序列上互不相同(见Bartholomeusz，Rev.Med.Virol.13(2003)，1-14)，其中这些变异主要与HBsAg基因有关。HBV基因型A优选包含参考核酸序列Genbank X02763或者相应地HBV基因型A_afr包含根据Genbank AF297621的参考核酸序列。对于HBV基因型B_a，参考核酸序列是Genbank D00330；对于基因型B_j，参考核酸序列是AB073858。对于HBV基因型C，参考核酸序列是GenbankAY206389；对于基因型C_aus，参考核酸序列是Genbank AB048704。对于基因型D，参考核酸序列是Genbank X02496；对于基因型E，是Genbank X75657；对于基因型F，是Genbank X69798；对于基因型G，是Genbank AF 160501；对于基因型H，是Genbank AY090454。

术语HBcAg_1-x的“片段”优选理解为这样的多肽，在该多肽中至少25个，优选至少50个，尤其优选至少100个氨基酸的一段序列与HBcAg_1-x中的对应片段是一致的。

术语HBcAg_1-x或HBcAg_1-x的片段的“变体”优选理解为这样的多肽，在该多肽中相对于HBcAg_1-x或HBcAg_1-x的片段有至多10个，优选至多5个氨基酸，尤其优选至多2个氨基酸，最优选至多1个氨基酸已经发生缺失、插入、替换或附加在C-或N-末端，优选替换。术语“变体”也包括包含HBcAg_1-x的融合多肽，尤其是与HBsAg的融合。

根据本发明的术语“佐剂”应理解为指使得免疫应答，优选是针对抗原的CTL应答能够被诱导的化合物。

包含在根据本发明的组合物中的HBcAg_1-x、与天然的HBcAg相比截短的HBcAg_1-x、缺少C-末端核酸结合区的至少一个部分，优选整个C-末端核酸结合区的HBcAg_1-x，可由本领域技术人员通过已知的重组方法获得。

一种可能的方法是从病毒分离株中采用聚合酶链反应(PCR)扩增核心或前核心阅读框。也可以考虑合成制备相应的DNA序列，然后采用PCR扩增。然后将获得的PCR片段克隆到质粒载体上。然后，通过进一步的PCR-克隆，可以将相应缩短的形式插入到表达载体中，如插入到大肠杆菌表达载体中。在此，插入优选以使编码HBcAg_1-x或片段或变体的基因分别受控于活性启动子下的方式进行。表达载体可同时包括用于增加表达率的诱导元件。在将该表达载体转化至大肠杆菌中后，可获得分别表达HBcAg_1-x或片段或变体的单克隆。为了获得可作为抗原的多肽，将单克隆转入培养基中37℃摇瓶过夜培养。然后首先离心收集大肠杆菌培养物。缓冲液重悬细菌沉淀，之后超声处理破碎或高压匀浆破碎。将相应地处于匀浆液中的HBcAg或者HBcAg变体，经硫酸铵沉淀而浓缩，然后通过凝胶过滤除去细菌宿主成分进行纯化。形成颗粒的HBcAg变体可通过速率区带离心进一步纯化。颗粒缺陷型HBcAg_1-x理想地采用N端组氨酸标签亲和标记进行工程化，并通过Ni-NTA-亲和层析和随后的凝胶过滤进行纯化。对由此产生的HBcAg_1-x进行除菌级过滤，并就此用于配制根据本发明的组合物。

原则上根据本发明的组合物中的HBcAg_1-x或其片段或变体也可人工合成获得。

有关重组或合成制备多肽的技术的进一步细节可见于

-Sambrook，分子克隆：实验室手册，第二版(1989)；

-″DNA克隆″，卷I和II(D.N.Glover，编.，1985)；

-″寡核苷酸合成″(M.J.Gait，编，1986)；

-″核酸杂交″(B.D.Hames&S.J.Higgins，编，1984)；

-″转录和翻译″(B.D.Hames&S.J.Higgins，编，1984)；

-″动物细胞培养″(R.I.Freshney，编，1986)；

-″固定化的细胞和酶″(IRL Press，1986)；

-B.Perbal，″分子克隆实践指导″(1984)；

-″The Methods in Enzymology series″(Academic Press，Inc.)，尤其是卷154和155；

-″哺乳动物细胞的基因转移载体″(J.H.Miller和M.P.Calos，编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；

-Mayer und Walker，编，(1987)，″细胞和分子生物学中的免疫化学方法″(Academic Press，London)；

-Scopes，(1987)，″蛋白质纯化：原理和操作″，第二版(Springer-Verlag，N.Y.)和

-实验免疫学手册″，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编，1986)。

原则上，包含于根据本发明的组合物中的HBcAg_1-x可以是形成颗粒的或不形成颗粒的，其中优选形成颗粒的HBcAg_1-x。形成颗粒的HBcAg_1-x可缔合形成直径约27nm的衣壳。180或240个二聚体缔合形成大分子结构。因此，根据一个尤其优选的本发明的组合物的实施方案，HBcAg_1-x以上述颗粒的形式存在。

根据本发明的优选的抗原尤其是HBcAg_1-124，HBcAg_1-127，HBcAg_1-144，HBcAg_1-145，HBcAg_1-146，HBcAg_1-147，HBcAg_1-148，HBcAg_1-149(即，包含天然HBcAg的头127，144，145，146，147，148或149个氨基酸，优选地由天然HBcAg的头127，144，145，146，147，148或149个氨基酸组成的多肽)以及HBcAg_81-133(HBcAg的片段，它包含天然HBcAg的81位至133位氨基酸，且优选由天然HBcAg的81位至133位氨基酸组成)。再一优选的抗原是HBcAg_1-144+As，即，一种包含天然HBcAg的头144个氨基酸并且包含氨基酸AS作为第145个氨基酸的多肽，其中所述AS与天然HBcAg第145位的谷氨酸不同，该不同于谷氨酸的AS氨基酸优选为异亮氨酸。在根据本发明的组合物中，尤其优选的抗原包括HBcAg_1-145和HBcAg_1-144+I。

此外，根据本发明还优选，HBcAg_1-x不包含任何非HBcAg内的表位，尤其是无HBsAg的表位。最优选的是HBcAg_1-x不包含前Sl表位，尤其是不包含前Sl抗原的第3至55位的氨基酸。基于本发明也优选HBcAg_1-x在C-末端X位，只要X不等于48，61或107，就不含半胱氨酸残基。

根据本发明的组合物的一个特定实施方案，它包含至少两种HBcAg_1-x或其片段或变体，其中所述HBcAg_1-x具有不同的HBV基因型。

根据本发明的组合物包括佐剂，所述佐剂包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少两种的混合物。优选地，该佐剂是皂苷复合物、皂苷衍生物的复合物或者其至少两种的混合物。尤其优选地，皂苷复合物或皂苷衍生物的复合物是脂质体皂苷复合物或脂质体皂苷衍生物复合物。

本发明中尤其优选皂苷复合物、皂苷衍生物的复合物或者其至少两种的混合物包含不同于水或盐水溶液的组分：

(α1)0至95wt.％，尤其优选10至50wt.％，最优选15至25wt.％的磷脂，

(α2)0至95wt.％，尤其优选10至50wt.％，及最优选15至25wt.％的类固醇，

(α3)5至100wt.％，尤其优选15至90wt.％，及最优选30至80wt.％的皂苷或皂苷衍生物，以及

(α4)0至20wt.％，尤其优选1至15wt.％，及最优选5至10wt.％的其它添加剂，例如不同于磷脂和类固醇脂质的其它脂质或者不同于水的溶剂，

其中，所述以重量计的量分别基于皂苷复合物的总重量或皂苷衍生物的复合物的总重量，所述总重量不包括复合物的水部分或其盐水溶液部分，并且(α1)至(α4)组分的总和为100wt.％。

该类型的皂苷复合物在文献中也有提及，尤其是″ISCO-基质″。如果组合物除了包括(α1)到(α4)组分，还包括蛋白质作为抗原，则该复合物称为″ISCOM

″

磷脂(α1)优选是选自由磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺和二棕榈酰磷脂酰胆碱组成的组的磷脂。

类固醇(α2)优选是选自由胆固醇，羊毛甾醇，光固醇，豆甾醇及谷甾醇组成的组的、来源于动物或植物的类固醇。

根据本发明，皂苷优选理解为糖和类固醇、类固醇生物碱或三萜之间的化学化合物或这些化合物的混合物。这些化合物也可称为类固醇皂苷，类固醇生物碱皂苷和三萜皂苷。这些皂苷为表面活性糖苷并可从植物中获得，其中来源于南美皂皮树(Quillaja saponaria)的皂苷作为佐剂最有效，优选来源于该树的树皮。从皂皮树中分离皂苷时，可获得部分纯化形式的被称为″Quil A″的提取物(该部分纯化的皂苷提取物具有确定的三萜皂苷含量，它比粗皂苷提取物的毒性低)

其它合适的皂苷由R.Tschesche和WuIf在″Chemie und Biologie derSaponine in Fortschritte der Chemie Organischer Naturstqffe″(H.Herz，H.Grisebach，G.W.Kirby出版，Vol.30(1973))中进行了叙述。尤其是强极性皂苷如极性三萜皂苷，特别是极性乙酸双糖链皂苷(aceticbisdesmosides)，例如来自Quillaja树皮的皂苷提取物Aralosid A，Chikosetsusaponin IV，Calendula-Glycoside C，Chikosetsusaponin V，Achyrran-thes-Saponin B，Calendula-Glycoside A，Aralosid B，Aralosid C，Putranji-Saponin III，Bersamasaponisid，Putrajia-Saponin IV，Trichosid A，Trichosid B，Saponasid A，Trichosid C，Gypsosid，Nutanosid，Dianthosid C，Saponasid D，优选从Aesculus hippocastanum获得的Aescin(T.Patt andW.Winkler：″Das thera-peutisch wirksame Prinzip der Rosskastanie(Aesculus hippocastanum)″，Arzneimittelforschung 10(4)，273-275(I960)).

皂苷(α3)优选为称为″Quil A″的从皂皮树的树皮中部分纯化的皂苷提取物(其由至少22种不同的皂苷级分组成)、该匀质的Quil A级分的亚级分，如QS 7，QS 17，QS 18或QS 21，或者从匀质的Quil A获得的亚级分中的至少两种的混合物，优选WO-A-96/11711中所描述的亚级分A和C的混合物。该混合物优选由50至90wt.％的级分A和10至50wt.％的级分C组成，其中参照WO-A-96/11711的实施例1获得级分A和C。该类型混合物通过商业途径可获得，如可以提及″ISCOPREP

703″。根据一个特定的实施方案，该皂苷也可由100wt.％的级分C组成。除了由Quil A来源的皂苷外，例如US 6,262,029中所描述的皂苷衍生物也可包含于所述复合物中。根据本发明，适宜的皂苷复合物尤其是通过商业途径可获得的AbISCO

-100，AbISCO

-200，AbISCO-300(ISCONOVA，Uppsala，Sweden)或Stimulon

QS-21(ANTIGENICS，Woburn，USA)产品。

上述皂苷复合物(ISCO-基质)的生产可通过任何为技术人员已知的生产这些复合物的方法进行。这些类型的皂苷复合物的优选的生产方法，例如已在EP-A-0 231 039(脂质体皂苷复合物)中或在WO-A-90/03184(非脂质体皂苷复合物)中进行了描述，它们关于ISCO-基质生产的公开在此引入作为参考文献并且形成本发明公开的一部分。

根据本发明的组合物如果包含ISCO-基质作为佐剂，那么，根据本发明，进一步优选所述抗原(一种或多种)不位于ISCO-基质内部，这与已知的ISCOM的情况不同。

本发明组合物的一个特定实施方案，除了皂苷复合物或皂苷衍生物复合物或者其至少两种的混合物外，本发明组合物还可包含共佐剂(co-adjuvant)，不包含皂苷或皂苷衍生物的其它佐剂，其中这些共佐剂可以与复合物分开存在或整合到该复合物中。作为共佐剂，任何本领域技术人员所熟知的、在疫苗中常用的佐剂均可使用。优选的佐剂选自颗粒佐剂，如亚微水包油乳剂(属于其的有如MF59(5％角鲨烯，0.5％吐温

80和0.5％Span

85)，SAF(10％角鲨烯，0.4％吐温

80，5％Pluron嵌段聚合物))和thr-胞壁酰二肽(thr-MDP)，无机化合物(如，氢氧化铝，硫酸铝或磷酸铝)，不完全弗氏佐剂，脂多糖，N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-二肽(GMDP)或胞壁酰二肽(MDP)，GAL-神经酰胺，溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)，脂质体(优选包含磷脂和胆固醇)，可生物降解的聚合物微球如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，有或无CpG-基序的寡脱氧核糖核苷酸，N，N-二-(β-硬脂酰基乙基)-N，N-二甲基铵氯化物(EQ1)，糖肽，分枝杆菌的细胞壁组分，季胺类化合物如，氯化十六烷基吡啶鎓和苯扎氯铵，兼性离子胺类化合物如CHAPS(3-(3-胆酰氯基丙基)-二甲基-铵基)-1-丙磺酸盐)，硫酸葡聚糖，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，嵌段共聚物如P1205或Poloxamer 401，双十四碳酰磷脂酰胆碱(DMPC)，3β-羟基-5-雄甾烯-17-酮(DHEA)，双十四碳酰磷脂酰甘油(DMPG)，脱氧胆酸钠盐，咪喹莫特(zmiquimod)，DTP-GDP，7-烯丙基-8-氧代鸟苷，Montanide ISA

51，Montanide ISA

720，murametide，murapalmitin，二鲸蜡基磷酸酯，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯如聚山梨醇酯20或80(吐温

20，80)，来自细菌ADP核糖化毒素如霍乱毒素或百日咳毒素的去毒突变体，这些佐剂中的至少两种的混合物。尤其优选作为共佐剂的是脂多糖，氢氧化铝，磷酸铝，GAL-神经酰胺，具有CpG-基序的寡脱氧核糖核苷酸，以及聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯。

有关作为共佐剂的合适的化合物在Cox，J.C.and Coulter，A.R.“佐剂-分类和作用模式的综述”，Vaccine，15：248-256(Feb.1997)一文中进行了综述。该文中有关疫苗组合物中的可能佐剂的描述在此引入作为参考并且形成本发明公开的一部分。

依据本发明组合物的再一优选实施方案，除了包括抗原HBcAg_1-x和佐剂外，其还包含至少一种HBsAg、来自该抗原的片段、该抗原或该抗原的片段的变体或其至少两种的混合物。在本上下文中，尤其优选的是不仅HBcAg_1-x而且HBsAg在根据本发明的组合物中都以颗粒形式存在。

HBsAg是一个226个氨基酸组成的蛋白质(p24/gp27或S蛋白)，其可自组装成20-30nm的脂蛋白颗粒，其中约100-150个亚单位通过多个分子间和分子内二硫键交联形成网状结构。根据本发明的组合物任选包含的HBsAg可来源于现今已知的所有的8种HBV标准基因型A，B，C，D，E，F，G和H，HBcAg_1-x亦是如此。术语″HBsAg″除了226个氨基酸的蛋白质外，还包括M-和L-蛋白，其除了HBsAg外还包含长55个氨基酸的前S2肽(M蛋白)或长55个氨基酸的前S2肽和长120个氨基酸的前S1-肽(L蛋白)

术语HBsAg的″片段″优选理解为这样的多肽，在该多肽中具有至少50个氨基酸，优选至少150个和尤其优选至少200个氨基酸的一段序列与HBsAg的对应片段是一致的。

术语HBsAg或HBsAg片段的″变体″优选理解为这样的多肽，在该多肽中相对于HBsAg或HBsAg片段有至多5个，优选至多2个，尤其优选至多1个氨基酸已经发生缺失、插入、末端附加或替换，优选替换。

依据本发明组合物的其中包含至少一种HBsAg的优选实施方案，其不仅包含HBsAg，而且正如WO-A-2005/02397所描述的包含至少两种HBsAg或其片段或其变体，其中所述HBsAg在S区和/或前S1区具有不同的HBV基因型。本上下文中，尤其优选HBV基因型不同的这两种HBsAg以均质颗粒形式存在，正如WO-A-2005/02397所描述的一样。均质HBsAg颗粒理解为仅由相同HBV基因型的HBsAg组成的颗粒。

HBsAg可通过技术人员所熟知的方法，从慢性乙型肝炎患者的血清获得或是以重组多肽形式获得。在本上下文中，参考与获得HBcAg_1-x有关的上述方法。

除了组分i)，ii)及任选地iii)外，根据本发明的组合物也可以包含另外的添加剂iv)，如药物载体或添加剂，尤其是当它以药物制剂形式存在时。

优选的药物载体尤其是水，缓冲水溶液，优选等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲盐水)、葡萄糖、右旋葡萄糖，甘露醇，乳糖、淀粉，硬脂酸镁，纤维素，碳酸镁，0.3％甘油，透明质酸，乙醇，聚亚烷基二醇如聚丙二醇，甘油三酯等。所用药物载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服，鼻，皮内，皮下，肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含渗涨度调节剂，湿润剂，乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。

抗原成分i)或抗原成分i)和iii)与佐剂ii)之间的相对重量比优选是在1∶20至20∶1之间的范围，尤其优选在1∶10至10∶1之间，更优选在1∶5至5∶1之间及最优选在1∶2至2∶1之间。对相应的应用情况而言最佳的佐剂和抗原的重量比可由技术人员通过简单的试验确定，在所述试验中例如CTL应答的强度由该重量比决定。

如果根据本发明的组合物除HBcAg_1-x外也包含HBsAg，那么HBcAg_1-x和HBsAg之间的重量比优选在1∶20至20∶1之间的范围，尤其优选在1∶10至10∶1之间的范围，更优选在1∶5至5∶1之间的范围及最优选在1∶2至2∶1之间的范围。在此技术人员通过简单的试验同样也可决定最佳的重量比。

在根据本发明的组合物中组分i)，ii)及任选地iii)的总浓度(即，以本发明组合物的体积为基础的组分i)，ii)及iii)的总量)优选在0.1至2,000μg/ml之间，尤其优选在0.5至1,500μg/ml之间，更优选在1至1,000μg/ml之间及最优选在10至500μg/ml之间，前提是本发明的组合物不是冻干物形式。

本发明组合物的一个实施方案，其包含：i)HBcAg_1-145和ii)作为佐剂的皂苷复合物，优选脂质体皂苷复合物。

本发明组合物的另一个实施方案，其包括：i)HBcAg_1-144+I和ii)作为佐剂的皂苷复合物，优选脂质体皂苷复合物。

本发明组合物的再一个实施方案，其包括：i)HBcAg_1-145，ii)作为佐剂的皂苷复合物，优选脂质体皂苷复合物，和iii)HBsAg。

本发明组合物的又一个实施方案，其包括：i)HBcAg_1-144+I，ii)作为佐剂的皂苷复合物，优选脂质体皂苷复合物，和iii)HBsAg。

优选地，本发明的组合物的特征还在于，在如下小鼠的脾脏中造成HBcAg特异性CD8⁺T细胞频率为每10⁵个CD8⁺T-细胞中有至少30，尤其优选至少50，更优选至少75，甚至更优选至少100和最优选至少300个CD8⁺IFNγ⁺T-细胞，所述小鼠为依据本发明描述的免疫方法免疫并随后如本文所述接受MGLKFRQL(一种合成的HBcAg片段)再刺激的C57BL/6小鼠。

根据本发明的组合物的再一个优选特征在于，如果它包含了HBsAg，在通过在此描述的免疫方法进行免疫时，其将在C57BL/6小鼠中诱导强的抗HBsAg的抗体应答。抗HBs抗体的总量根据本文描述的AUSAB

-分析测定法为平均高达至少100mIU/mL，优选至少500mIU/mL，尤其优选至少1,000mIU/mL和最优选至少1,500mIU/mL。对抗HBs特异性IgG同种型的测定表明IgG1-和IgG2b两者的数值均增加，这表明Th1和Th2免疫应答均已形成。

对上述目的的另一解决方式是提供如下生产组合物的方法，该方法包括方法步骤I)，II)和IV)及任选地III)：

I)提供HBcAg_1-x，该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体、或者其至少两种的混合物，其中x是100到160的整数，优选在120至150之间，尤其优选在140至149之间，更优选在144至146之间和最优选为145。

II)提供包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少两种的混合物的佐剂，

III)提供HBsAg，该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体、或者其至少两种的混合物，及

IV)使HBcAg_1-x，佐剂和任选地HBsAg相接触。

至于HBcAg_1-x或其片段或其变体，至于包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少两种的混合物的佐剂，以及至于HBsAg或其片段或其变体，优选已经就本发明组合物而被提及为优选组分i)，ii)和iii)的那些化合物。

关于方法步骤I)和III)，优选HBcAg及HBsAg以抗原或抗原片段(通过从慢性乙型肝炎(仅仅就HBsAg而言)患者的血浆中、通过合成的方法或通过重组表达的方式获得的)存在于合适药物载体中的方式提供。此药剂载体优选为液体，尤其是水性液体，更优选水性盐溶液如PBS。在于方法步骤IV)中与其他组分接触前，通过该方式获得的水性抗原溶液可通过技术人员已熟知的方法进行除菌过滤。

根据本发明方法的一个优选的实施方案，在方法步骤I)和III)中HBcAg及任选地HBsAg以如下方式提供为优选，所述方式为这些抗原首先以至少两倍，尤其优选至少3倍，更优选至少4倍及最优选至少6倍于本发明最终目的组合物中的HBcAg或HBsAg浓度的浓度存在于药物载体中，优选水性盐溶液中(因此，例如，如果根据本发明的组合物中HBcAg的浓度为10μg/ml，则优选在组合物的生产中首先以浓度至少20μg/ml，尤其优选至少30μg/ml，更优选至少40μg/ml和最优选至少60μg/ml在水性盐溶液中提供HBcAg)。如果本发明的组合物包含HBcAg和HBsAg，那么优选将两者一起在一种相同盐溶液中以上述浓度(至少两倍，至少3倍，至少4倍或至少6倍超浓缩的)提供。根据本发明还优选这些超浓缩抗原溶液在于方法步骤IV)中与佐剂接触前，在30至60℃之间，尤其优选在35至55℃和更优选在37至50℃的温度孵育10分钟至4小时，尤其优选20分钟至2小时及更优选30分钟至1小时。在抗原与佐剂接触后，还优选由此获得的组合物在10至40℃，尤其优选在15至30℃，更优选在20至25℃及最优选是在室温孵育15分钟至5小时，尤其优选30分钟至3小时及更优选45分钟至2小时。

在方法步骤II)中提供佐剂。只要所用佐剂不是已可从商业途径获得的无菌形式，在此也优选在与组分I)或III)接触之前佐剂首先进行除菌，如通过除菌过滤。

尤其是如果将源于皂苷或皂苷衍生物、类固醇和/或磷脂的复合物作为佐剂(ISCO-基质)，则依据本发明优选这些复合物首先以无菌形式制备或从合适的供应商处商业获得，然后皂苷复合物或皂苷衍生物复合物与已除菌的、水性HBcAg溶液和任选地已除菌的HBsAg溶液或者这两种溶液的混合物接触。通过这种方式，不会形成其中抗原并入到ISCO-基质内部的经典ISCOM-复合物(即所谓的ISCOMs)。

取决于是否组合物将要用于口服，鼻内，皮内，皮下，肌内或是静脉内施用，由此获得的组合物然后可以与其它的添加剂，如另外的药物载体和添加剂混合。至于药物载体和添加剂，已就本发明组合物而被提及为优选的药物载体和优选的添加剂的那些化合物是优选的。

如果获得水性溶液，则可以以水性无菌状态进行包装或冷冻干燥，其中该冻干组合物在施用前与无菌溶液混合。

提供可以通过上述方法获得的组合物也有助于上述目的的解决，其中这些组合物优选具有与上述根据本发明的组合物一样的性质。

提供包含本发明组合物以及至少一种上述添加剂iv)的药物制剂，也有助于上述目的的解决。

上述目的的另一解决方案是提供本发明组合物或本发明药物制剂在治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病中的用途。本发明的组合物或本发明的药物制剂优选施用于哺乳动物，特别是用于人类。根据本发明组合物或本发明药物制剂的优选用途，其尤其用于治疗和/或预防，优选用于治疗，急性和/或慢性HBV感染，优选慢性HBV感染。

与人体中HBV感染相关的术语″预防″优选包括

-对与乙肝病毒HBV尚无任何接触的人的治疗，其目的是防止乙肝病毒HBV感染的发生；

-对于已接触乙肝病毒HBV并处于免疫耐受慢性期的人的治疗，其目的是防止这类人进入免疫激活慢性期；以及

-对于已接触乙肝病毒HBV并处于无活性携带期的人的治疗，其目的是防止这类人重新进入免疫激活期。

涉及人体HBV感染的术语″治疗″优选包括

-对已接触HBV并处于感染急性期的人的治疗，

-对已接触HBV并处于免疫激活慢性期的人的治疗。

根据本发明的组合物或依据本发明的药物制剂尤其优选对已经感染HBV的患者进行施用。

对于处于急性感染期、免疫耐受慢性期、免疫激活慢性期或无活性携带期的人，可使用本发明的组合物或者本发明药物制剂按需要单独或与其它疗法联合进行治疗。在治疗应用中，该组合物或药物制剂以如下量向患者施用，所述量将足以造成有效针对HBV抗原的CTL应答并能治愈或至少部分终止HBV相关症状和/或并发症。如果使用本发明的组合物或药物制剂(尤其优选)用于治疗慢性乙型肝炎，该疗法的目的是减少或是理想地消除受病毒感染的细胞。由于人们会由于在感染的急性期中CTL应答的不足或缺乏而发展成为慢性乙型肝炎，故在本发明的组合物或药物制剂中提供如下量的免疫相关病毒抗原(HBcAg_1-x和任选地HBsAg)是重要的，所述量足够有效地刺激CTL应答。能够达到这些目的的量被定义为″治疗有效剂量″。对于不同的应用情况为治疗有效的剂量依赖于，例如，本发明组合物或者本发明药物制剂的确切组成、施用方法、所治疗的疾病的阶段和严重性、患者的体重及一般健康状况以及主治医生的判断，但一般而言，对于一个体重70公斤的患者优选在大约0.1至2000μg之间(佐剂、HBcAg_1-x和任选地HBsAg的总量)，尤其优选在0.5至1500μg之间，更优选在1至1000μg之间和最优选在10至500μg之间，之后依赖于患者的CTL应答(其可通过检测患者外周血淋巴细胞(PBL)中HBV特异性CTL活性而确定)，数周到数个月再度使用介于0.1至2000μg之间的剂量。

在治疗慢性乙型肝炎时，用药应持续一段时间直到至少临床症状或实验室指标表明HBV感染已消除或至少处在免疫系统的控制下，任选地可作更长时间的治疗。

根据本发明的组合物或者依据本发明的药物制剂，原则上可口服，鼻内，皮内，皮下，肌内或静脉内施用。

上述目的的再一解决方案是提供本发明组合物在生产用于治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病的药物制剂中的用途。

在本上下文中，上述目的的一个特别的解决方案是提供本发明组合物的用途，所述组合物包括：

i)上述的HBcAg_1-x，

ii)上述的包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少两种的混合物的佐剂，以及

iii)上述的HBsAg，

所述用途为用于生产药物制剂以治疗HBV感染和HBV介导的疾病，优选治疗如下HBV感染和HBV介导的疾病，其中所述HBV感染或HBV介导的疾病由基因型或亚型(优选基因型)不同于包含在本发明组合物中的HBsAg的基因型或亚型(优选基因型)的HB病毒导致。例如，假设HBV感染或HBV介导的疾病是由A基因型乙型肝炎病毒导致，为治疗该种疾病或感染，优选使用如下本发明的组合物，该组合物除组分i)和ii)外还利用B，C，D，E，F或G基因型的HBsAg或这些基因型的HBsAg的混合物，其中也可以包括A基因型的HBsAg。

再者，有助于上述目的的解决的是用于治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病的方法，在该方法中还未接触到HBV或是已接触过HBV的人，优选患有慢性乙型肝炎的患者被给予根据本发明的组合物或者根据本发明的药物制剂的治疗有效剂量，优选通过上述的技术和方式。

在此也可能尤其有利的是，向那些已接触过HBV的个体，优选患有慢性乙型肝炎的患者施用如下组合物，这种组合物除了包括HBcAg_1-x和佐剂外，还包括来源于如下HBV基因型或HBV亚型的HBsAg，所述HBV基因型或亚型不同于在所需治疗的患者中导致HBV感染或HBV介导的疾病的乙型肝炎病毒的基因型或亚型，优选基因型。

本发明现通过非限定性实施例和附图进行更详细的举例说明。

图1显示当应用具有AbISCO

-100作为佐剂的本发明组合物时的CTL应答。

图2显示当应用具有AbISCO

-200作为佐剂的本发明组合物时的CTL应答。

图3显示当应用本发明的组合物(包含HBcAg和HBsAg及以AbISCO

-200作为佐剂)时的B细胞应答，以AUSAB抗HBsAg计数进行说明。

图4显示当应用本发明的组合物(包含HBcAg和HBsAg及以AbISCO

-200作为佐剂)时B细胞应答的免疫谱，以抗-HBsAg-IgG1及抗-HBsAg-IgG2b同种型的量进行说明。根据本发明的组合物诱导Th1和Th2型免疫应答。

方法

C57BL/6小鼠的免疫

用PBS，HBcAg，HBsAg和佐剂以表1，2所列的量分别在100μl PBS中对C57Bl/6小鼠进行免疫，其中各给出的量分别以21天的间隔进行皮下注射两次。对于DNA免疫，将质粒pCI/HBV_ayw核心以2x50μg的量分别于50μl PBS中注射于每侧的胫骨前肌。

脾脏中抗原特异性CD8⁺T细胞频率的测定

第二次免疫后两周，从动物中分离脾脏并从脾细胞制备细胞悬浮液。脾细胞悬液的制备见于Schirmbeck R.，

W.，Fissolo N.，Mel-ber K.，和Reimann J.：″乙型肝炎表面抗原天然变体中H-2 K^b限制性表位的不同免疫源性″，Europ.J.Immunol.2003，33：2429-38.一文的描述。脾细胞在含有0.25μM HBcAg特异性肽(MGLKFRQL；Jerini BioTools，Berlin，DE)和5μg/ml的Brefeldin A(BFA)(目录号.15870，Sigma)的RPMI-1640培养基中，37℃孵育(再刺激)4个小时。收集接受再刺激的细胞，并用抗-CD8 mAb(抗鼠CD8a-PE-缀合物；目录号：55303；BD Biosciences，Heidelberg，DE)进行表面染色，固定、透化处理和实施细胞质干扰素γ的显色(抗小鼠干扰素γ-FITC-缀合物；目录号：554411；BD-Biosciences，Heidelberg，DE)。核心特异性CD8⁺IFNγ⁺CTLs的频率测定采用FACS分析进行。显示CD8⁺IFNγ⁺T细胞/10⁵CD8⁺T细胞的平均值。

抗体同种型的确定

96孔微滴定板(Nunc，Wiesbaden，DE)以用于免疫的HBsAg(碳酸盐缓冲液中2μg/mL)4℃包被过夜(每孔100μL)。

在此ELISA方法的开始，用PBST(含有0.5％吐温20的磷酸盐缓冲盐溶液)洗包被的板3次。用0.2％凝胶37℃封闭孔1小时。以PBS分两步稀释待测的小鼠血浆/血清(1∶250到1∶32,000)并将稀释液各100μL分别加入适当孔中(一式两份)，并于37℃孵育1小时。未免疫小鼠的血清用作对照。然后用PBST洗微量滴定板5次并与同种型特异性二抗(过氧化酶缀合的)孵育。使用gamIg1(目录号GAM/IgGl/PO)检测IgGl，使用gamIg2b(目录号IgG2b/PO；北欧免疫学实验室，Tilburg，荷兰)检测IgG2b。显色反应以邻苯二胺(oPD)(Sigma；目录号P2903)作为底物(1μL/mL 30％H₂O₂和1mg/ml oPD)(每孔100μL)完成。反应10-15分钟后用1N H₂SO₄(每孔50μL)终止显色反应，于分光光度计(SpectraMax plus；Molecular Devices，Ismaning，DE)492 nm测定光密度值。

总抗HBs抗体数测定

经免疫的小鼠的血清中的抗HBs抗体数利用IMX AUSAB

检测试剂盒(索引号2226-21，Abbott，Wiesbaden，Germany)于IMX自动免疫分析仪(Abbott Diagnostics，Wiesbaden，Germany)中进行测定。试验依据制造商的描述进行。

抗原制备

a)HBcAg_1-144+I

利用BamHI-限制性，携带HBV全基因组的质粒pHB320(7,543碱基对)从载体pBR322(Bolivar F.，Rodriguez R.L.，Greene P.J.，Betlach M.C.，Heyneker H.L.，Boyer H.W.：″新克隆载体的构建和表征。II.多用途克隆系统，″Gene.1977；2(2)：95-113)和环化的乙型肝炎病毒基因组(HBV320，3,182碱基对；Bichko V，Pushko P，Dreilina D，Pumpens P，Gren E(1985)，″Subtype ayw variant of hepatitis B virus″，FEBS 185：208-212)构建。

经HhaI限制消化和核酸酶S1降解突出的单链序列后，长为1000碱基对的片段通过平末端连接克隆至载体pBR322 Ptrp(Ikehara M，OhtsukaE，Tokunaga T.et αl.(1984)：人生长激素基因的合成与在大肠杆菌中的表达.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5956-5960)中，所述片段携带前核心/核心基因(核心开放阅读框)的基因序列。该载体预先已用BamHI/SalI切割，并由DNA聚合酶补平突出端。所得质粒pGC74(6046个碱基对)以相反取向携带有色氨酸启动子和HBc-基因。该取向有利于以下为优化HBcAg-表达盒而重构单限制性内切酶位点的克隆步骤。

为改变HBc片段的取向，采用BamHI限制消化pGC74，DNA聚合酶补平突出端，SalI进行之后的限制消化。该片段与载体pBR322 Ptrp进行连接。该载体已预先采用AvaI进行线性化，DNA聚合酶补齐末端和之后使用SalI进行限制消化。由此构建的质粒pGC2(5,552个碱基对)携带有色氨酸启动子和同方向的HBc-基因。

该质粒用SalI进行消化，核酸酶Bal31除去突出末端，EcoRI进行之后的消化，由此而产生的突出末端用DNA聚合酶补平并再次连接。由此产生质粒pHBc10(4,825个碱基对)，在色氨酸启动子与HBc基因间具有缩短的序列以获得最佳的Ptrp-Shine-Dalgarno-HBc结构或距离。

为优化基因表达，用HhalI及S1-核酸酶消化后从pHBc10获得长为1,044碱基对的HhaI-HBc-片段，并克隆到已修饰的pBR322质粒即pBR322-trp-I载体中。该构建产生pHBc3(7,108个碱基对)，其具有位于色氨酸启动子控制下的HBc-基因的经优化的表达序列。

通过Kpn21消化质粒pHBc3，将合成的EcoRV-ClaI-PvuI

(5’TCCGGAGATATCGATCGTCCGGA-3’)多接头在HBc基因的第144位氨基酸位点并入该限制性位点。由此形成质粒pHBc1615(7,129个碱基对)。ClaI消化PHBc1615成为线性PHBc1615，并入合成的多接头以在第144位氨基酸位点后形成终止密码子以及在145位形成额外的异亮氨酸密码子。由此获得质粒pHBc2-7。

质粒pHBc2-7转化感受态大肠杆菌(E.coli)细胞(BL21菌株：基因型B F-dcm ompT hsdS(rB^-mB^-)gal)，阳性克隆于具有氨苄青霉素的LB琼脂板上37℃过夜培养获得。使用一个单克隆，接种300ml M9极限培养基(添加1％酪蛋白氨基酸，Difco目录号223050，Becton-Dickinson，Heidelberg)和0.2％葡萄糖。于37℃在1升-Erlenmeyer烧瓶中于圆形摇床中过夜培养。通常培养物的光密度(OD_540nm)达2到5之间。

细胞离心后沉淀用裂解缓冲液(50mM TRIS/HCl pH8.0；5mMEDTA，100μg/ml PMSF，0.08％Triton-X-100)重悬。条件化的细胞在冰上超声处理(3×15秒，22千赫)以裂解。细胞碎片离心后，以硫酸铵(33％饱和度)4℃，4-20小时沉淀上清，获得蛋白质沉淀。该沉淀用含有0.1％Triton X-100的PBS重悬，然后取所获溶液的5-10毫升上Sepharose CL4B层析柱(2.5x85cm)。以无Triton X-100的PBS进行洗脱。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳/考马斯染色分析各级分中HBcAg-多肽的存在。利用硫酸铵沉淀法(33％饱和度)于4℃，20个小时纯化和浓缩阳性级分。用PBS重悬蛋白质沉淀，浓度在3-20mg/ml间，然后于1000倍体积的相同缓冲液中透析过夜。HBcAg_1-144+I溶于PBS中除菌过滤，-20℃保存。

b)HBsAg

HBsAG的制备见Brocke P，Schaefer S.，Melber K.，Jenzelewski V.，Müller F.，Dahlems U.，Bartelsen O.，Park K.N.，Janowicz Z.A.，GellissenG.：重组乙型肝炎疫苗：疾病表征及疫苗生产″(2005)，Gellissen G(编)：重组蛋白的生产-新型微生物和真核表达系统，319-360页，Wiley-VCH，Weinheim的描述，并可从Rhein Biotech，Düsseldorf，Germany获得。

c)HBcAg_1-183

HBcAg_1-183从DiaSorin S.r.l.(Saluggia，Italy)获得。

实施例1

在第一系列实验中，将在产品描述AbISCO

-100(ISCONOVA，Uppsala，Sweden)下可商业获得的皂苷复合物用作佐剂。核心质粒DNA被用作阳性对照，纯PBS、于PBS中的纯佐剂、于PBS中的纯HBc_1-144+I以及于PBS中的HBc1-183作为阴性对照。本发明组合物包含PBS、HBc_1-144+I及AbISCO-100。各组分的量见表1。

质粒pCI/HBV_ayw核心依据

A.，Pudollek H.P.，Reifenberg K.，Chisari F.V.，Schlicht H.J.，Reimann J.，Schirmbeck R.(1996)：，H-2b小鼠中DNA免疫诱导对乙型肝炎核心抗原的抗体及细胞毒性T细胞反应″，J.Immunol.156：3687-95(本构建体在那称作pCMV-1/c)的描述进行制备，其分离采用QIAGEN-tip 500(目录号12162；Qiagen，Hilden，Germany)依据生产厂家说明进行。

对于本发明组合物的配制，HBc_1-144+I首先用PBS稀释至最终产品浓度的4倍并于37℃振荡下孵育30分钟。AbISCO

-100(由生产者以水性分散体形式提供)随后加入，表1中抗原终浓度以PBS进行调节，由此形成表中所列佐剂和抗原的浓度。由此制备的组合物于室温(20-25℃)孵育1小时后，于2-8℃过夜保存(12-18小时)并用于翌日的免疫。

表1

1)n.inv.表示非本发明；2)inv.表示本发明

从图1可见由上述组合物所获得的CTL应答。由该图可见，利用本发明的组合物(试验组E)，可产生核心特异性CTL应答，其甚至强过以核心质粒DNA可以产生的CTL应答(试验组A)。

实施例2

在之后的一系列实验中，在产品描述AbISCO

-200(ISCONOVA，Uppsala，Sweden)下可商业获得的皂苷复合物被用作佐剂。核心质粒DNA作为阳性对照；纯PBS、于PBS中的纯佐剂、于PBS中的纯HBC_1-144+I以及于PBS中的纯HBc_1-183作为阴性对照。本发明组合物包含PBS、HBc_1-144+I，AbISCO-200及任选地HBsAg。各单个组分的量见表2。

对于本发明组合物的配制，HBc_1-144+I及任选地HBsAg首先用PBS稀释至最终产品浓度的4倍，并于37℃振荡孵育30分钟。当使用HBsAg时，首先，HBsAg和HBcAg_1-144+I在无菌条件下混合，并同样地用PBS稀释至最终产品浓度的4倍。AbISCO

-200(由生产者提供的水性分散体形式)随后加入，表2中的抗原终浓度以PBS进行调节，由此形成表中所列佐剂和抗原的浓度。由此制备的组合物在室温(20-25℃)孵育1小时后，于2-8℃过夜保存(12-18小时)，并用于翌日的免疫。

表2

图2表明由上述组合物所产生的CTL应答。由该图可见，利用本发明的组合物(试验组L和M)，可产生核心特异性CTL应答，其与可由核心质粒DNA产生的CTL应答(试验组F)相当。

图3表明本发明组合物，当其还包含HBsAg时，也可导致针对HBsAg的强抗体反应。图4接着显示利用本发明的组合物后，IgG1及IgG2b的量均增加，这表明Th1和Th2型免疫应答的形成。

序列表

<110>莱因新生物技术工艺和产品有限公司(Rhein Biotech Gesellschaft für neuebiotechnologische Prozesse und Produkte mbH)

<120>包含截短的hbc核心蛋白和基于皂苷的佐剂的疫苗

<130>RB82336PC

<150>EP2005020208.4

<151>2005-09-16

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>HBcAg-特异性肽

<400>1

Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu

1                5

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的多接头

<400>2

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Claims (21)

1.一种组合物，其包含：

i)HBcAg_1-x、该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体、或者其至少两种，其中x是100到160的整数，

ii)包含皂苷或皂苷衍生物或者其至少两种的混合物的佐剂，以及任选地

iii)HBsAg、来自该抗原的片段、该抗原或该抗原的片段的变体、或者其至少两种。

2.根据权利要求1的组合物，其中x是140到149的整数。

3.根据权利要求1或权利要求2的组合物，其中x是144到146的整数。

4.根据前述的任何一项权利要求的组合物，其中佐剂是皂苷复合物或皂苷衍生物复合物或者其至少两种的混合物，并包含不同于水或水性盐溶液的组分：

(α1)0至95wt.％磷脂，

(α2)0至95wt.％类固醇，

(α3)5至100wt.％所述皂苷或皂苷衍生物，以及

(α4)0至20wt.％的其它添加剂，

其中，按重量计算的量分别基于皂苷复合物或者皂苷衍生物复合物的总重量，所述总重量不包括复合物的水部分或其水性盐溶液部分，而且组分(α1)到(α4)的总和为100wt.％。

5.根据前述的任何一项权利要求的组合物，其中，佐剂是ISCO基质。

6.根据前述的任何一项权利要求的组合物，其中，抗原组分i)或抗原组分i)和iii)与佐剂ii)之间的相对量的比在1∶20至20∶1的范围内。

7.根据前述的任何一项权利要求的组合物，其中，组分i)，ii)和任选地iii)在组合物中的总浓度为0.1至2,000μg/ml。

8.根据权利要求1的组合物，包含i)HBcAg_1-145及ii)皂苷复合物。

9.根据权利要求1的组合物，包含i)HBcAg_1-144+I及ii)皂苷复合物。

10.根据权利要求1的组合物，包含i)HBcAg_1-145、ii)皂苷复合物及iii)HBsAg。

11.根据权利要求1的组合物，包含i)HBcAg_1-144+I、ii)皂苷复合物及iii)HBsAg。

12.制备组合物的方法，包括如下方法步骤I)、II)和IV)及任选地III)：

I)提供HBcAg_1-x，该抗原的片段、该抗原或者该抗原的片段的变体、或者其至少两种的混合物，其中x是100到160的整数，

II)提供包括皂苷或皂苷衍生物或者其至少两种的混合物的佐剂，

III)提供HBsAg，该抗原的片段、该抗原或该抗原的片段的变体、或者其至少两种的混合物，以及

IV)使HBcAg_1-x、佐剂及任选地HBsAg相接触。

13.根据权利要求12所述的方法，其中x是140到149的整数。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中x是144到146的整数。

15.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其中，佐剂是皂苷复合物或皂苷衍生物复合物或者其至少两种的混合物，并包括不同于水或水性盐溶液的组分：

(α1)0至95wt.％磷脂，

(α2)0至95wt.％类固醇，

(α3)20至100wt.％所述皂苷或皂苷衍生物，以及

(α4)0至20wt.％的其它添加剂，

其中，所述以重量计算的量分别基于皂苷复合物或者皂苷衍生物复合物的总重量，所述总重量不包括复合物的水部分或其水性盐溶液部分，并且组分(α1)到(α4)的总和为100wt.％。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中，佐剂是ISCO基质。

17.可以通过根据权利要求12至16中任一项所述的方法获得的组合物。

18.药物制剂，其包含根据权利要求1至11或17中任一项所述的组合物以及适宜的添加剂。

19.根据权利要求1至11或17中任一项所述的组合物在制备用于治疗和/或预防HBV感染和HBV介导的疾病的药物制剂中的用途。

20.根据权利要求1至11或17中任一权利要求所述的组合物用于制备治疗慢性HBV感染的药物制剂的用途。

21.根据权利要求19或20的用途，其中，组合物包含HBsAg，并且其中HBV感染或HBV介导的疾病由如下HB病毒导致，该病毒的基因型或亚型不同于本发明组合物中包含的HBsAg的基因型或亚型。

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