KR100587944B1 - 보강제 및 ＨＢＶ 백신 성분인 Ｂ형 간염 바이러스의ｐｒｅ Ｓ단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 B형 간염 바이러스의 pre-S를 포함하는 보강제 및 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 통상의 백신 항원의 면역원성을 증강시킬 수 있는 변형된 pre-S에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개선된 B형 간염 바이러스 예방 백신 및 B형 간염 바이러스 만성 보균자에 대한 치료용 백신에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 효모로부터의 pre-S 생산, pre-S 의 보강제 활성 및 pre-S의 B형 간염 바이러스에 대한 백신 조성물로의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 B형 간염 바이러스 S 항원의 면역원성을 증강시키는 pre-S 기능, 및 B형 간염 바이러스 예방 백신 및 B형 간염 바이러스 만성 보균자에 대한 치료용 백신으로서의 용도에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(이하 "HBV"라 한다)는 일차적으로 혈액 또는 혈액 유래 채액과의 접촉을 통하여 전이되고, 혈액을 통하여 간세포에 전파된다.
HBV 감염자 대부분은 신체의 면역반응에 의하여 거의 회복되지만, 이중 약 5 %는 만성 감염으로 진행된다. 이는 임신중에 만성 감염자인 모계나 또는 그외 다른 원인을 통하여 감염된 유아의 경우(90 % 이상)에 더욱 심각하다. 또한 기관 이식을 통한 감염은 거의 100 % 보균상태를 유발한다. 대부분의 환자들은 증상이 없는 보균상태로 유지되지만, 이중 10 내지 30 %는 만성 간염으로 발전하여 간경화증으로 서서히 진행되어 결국 간암으로 발병된다.
일단 HBV에 감염되면 급성간염으로 진행되지만, 강력한 다클론성 면역반응이 형성되어 자연적으로 치유된다. 자연적 치유에는 다수특이적인 세포독성 T 림포사이트("CTL") 반응과 강력한 다클론성 세포 면역반응이 관련된다. 즉, 바이러스-특이 항체에 의한 효과적인 중화와, 유도된 CTL에 의한 바이러스-감염 세포에 대한 특이적 사멸로 인해, 감염은 성공적으로 치유되는 것이다. 반면에, 만성 보균자가 되는 사람들은 약한 올리고클론성 면역 반응만을 나타낸다. 이러한 사실은 HBV 형질전환 마우스 실험에서도 또한 관찰되었다.
만성 보균자의 혈청에 존재하는 45 nm 데인 입자(dane particles)는 감염성 형태의 HBV이다. 이외 22 nm 의 구형 입자는 비감염성 형태이다. 각 감염성 입자는 외피, 캡시드(HBcAg), 바이러스 특이적 DNA 중합효소 및 32 kb의 환형의 이중가닥 DNA로 이루어져 있다. 그외 바이러스 특이 단백질인 HBVe 항원(HBeAg)은 혈청에 용해된 상태로 존재한다.
외피 유전자로부터 3종의 표면 항원이 합성된다. 항원으로는 대형 B형 감염 표면 항원(L-HBsAg), 중간형(M-HBsAg) 및 S-항원인 소형 항원(S-HBsAg)이 있다. 거대 항원은 pre-S1-, pre-S2- 및 S-부위의 DNA 서열을 포함하는 완전한 외피 유전자로부터 합성되며, 반면에 중간형 항원은 단지 pre-S2-과 S-부위로부터 합성되며, 소형 항원은 S-부위로부터 합성된다. 이러한 3종의 항원들을 정량적으로 비교하면, 바이러스 입자내에서 S-HBsAg가 가장 많은 부분을 자치하고, M-HBsAg와 L-HBsAg는 전체 외피 항원에 2 내지 5 %에 해당하는 적은 부분을 자치하고 있다.
상업적으로 이용가능한 모든 HBV 백신은 거의 HBV 소형 표면 항원(HBsAg)를 함유하고 있다. HBV S 항원은 HBV 만성 보균자의 혈장에서 두 개의 단백질, P24와 이의 당화된 유도체인 GP28로 이루어진 약 22 nm 입자 형태로 수득할 수 있으며, 상기 단백질들은 S 단백질 코딩 서열 또는 HBV S-유전자로 보고된 HBV 게놈의 226개의 아미노산 코딩 서열에 의해 암호화된 것이다. 그러나, 동물 및 사람 실험에서는 모두 pre-S 부분이 S 항원에 비하여 강한 면역원성을 갖고 있어, S 항원에 비하여 항체를 빨리 형성시키는 것으로 확인되고 있다(S 항원에 비하여 적어도 20주 이상 빠름). 사람에 대한 임상연구들에서, pre-S를 함유한 백신을 단지 2회 주사하여 S 항원 백신을 3회 접종한 수준의 방어효과를 형성시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 더욱이, S 항원 단독 백신에 비하여 pre-S- 함유 백신은 백신 무반응자에게 항체 반응을 매우 효과적으로 유도하였다. 또한 바이러스 감염시 pre-S 단백질이 일차로 간세포에 부착하여 바이러스 수용체(receptor) 리간드로 작용하는 것으로 알려져 있다. 이럴경우, 상기 단백질에 대한 항체 사용은 바이러스를 중화시킬 수 있을 뿐만 아니라 새로운 간세포의 감염을 예방할 수 있다.
상기한 가능성들에도 불구하고, pre-S 단백질의 대량 생산이 확립되지 못하여 백신으로의 활용에 한계가 있다. 동물세포(예, CHO세포)에서 전체 외피 단백질을 발현시키는 경우, S 항원이 과량 발현되어 pre S항원의 함량은 2 내지 3 %로 매우 낮다. 동물세포로부터 항원 생산은 비용적인 측면에서도 효과적이지 않다. B형 간염바이러스 만성 보균자의 혈청으로부터 정제한 바이러스 입자 역시 pre-S항원을 전체 항원에 5 % 미만으로 포함하고 있으므로, 따라서, 상기한 명백한 이유로 백신 항원을 생산하는 것은 비효율적인 방법이다.
현재 HBV 만성 보균자에 대한 치료제로 이용되고 있는 것으로 인터페론(Interferon)과 라미부딘(Lamivudine)이 있다. 인터페론의 HBV 만성 보균자에 대한 치료율은 20 내지 25 % 정도이고, 투약군의 약 10 %가 더 이상 치료를 진행할 수 없을 정도로 심각한 부작용을 나타낸다. 또한 인터페론은 가격이 비싸고 재발위험성이 있다. 또한, 입원치료가 요구되어 불편하다. 라미부딘은 핵산 유도체로, 급성 간염 환자에서는 40 내지 70 %의 상당한 효과를 보이나, 만성 간염 환자에는 제한적이다. 더욱이, 1년 내에 약 20 내지 30 %, 2년에 약 40 % 정도로 빠르게 라미부딘에 내성을 갖는 바이러스가 나타나고 있다.
따라서, 효과적인 치료용 백신을 이용가능한 경우, 비용면에서 효율적이고 사용이 용이할 것이다. 현재 이용가능한 예방용 백신의, HBV 만성 보균자를 치료하기 위한 용도로의 사용가능성은 소규모의 사람 임상 실험으로 확인되었다. 상기한 연구로, M. L. 마이클 등(Vaccine 19, 2395-2399, 2001)은 HBV 만성 보균자에 대한 치료용 백신의 이용가능성을 입증하였으나, 효율적인 치료를 위해 강력한 백신이 요구된다고 결론내렸다. 그외 pre-S와 S 항원을 포함하는 파스테르-메리우스(Pasteur-Merieux) 백신이 S 항원만을 포함한 백신에 비해 다소 효과적이라는 주목되는 결과가 있다. 상기한 연구는 다양한 항원, 예컨대 pre-S1, pre-S2 및 S 항원을 포함하여 백신 효과를 향상시킬 수 있으며, 치료용 백신에 체액성 면역(humoral immunity)과 세포성 면역(cell mediated immunity)을 모두 유도할 수 있는 강력한 보강제가 요구됨을 시사하는 것이다.
본 발명의 목적은 HBV 백신 및 보강제로 이용할 수 있는 pre-S 단백질의 비 용 효율적인 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효모 발현 시스템에서 pre-S 유전자를 효율적으로 발현할 수 있는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 HBV의 pre-S 단백질을 배양배지로 분비할 수 있는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 배양배지로부터 재조합 pre-S 단백질의 정제과정을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 pre-S 단백질을 포함하는 예방 및 치료용 백신 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 또는 동물 혈청에서 HBV 항체를 검출할 수 있는 진단시약을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비당화 또는 일부 당화된 변형된 HBV pre-S를 제공한다. 상기 변형된 pre-S는 천연형 pre-S의 15 또는 123번째 아미노산에 위치한 1종 이상 아스파라진이 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 변이체 pre-S를 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명의 변형된 HBV pre-S를 암호화하는 변이체 pre-S 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 프로모터, (b) HBV pre-S 유전자 및 (c) 전사종결인자를 포함하 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터를 도입하여 제조한 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 HBV pre-S를 포함하는 보강제를 제공한다. 상기 pre-S는 형질전환체로부터 생산된 재조합 pre-S 단백질로 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 pre-S를 포함하는 B형 간염 바이러스 백신을 제공한다.
또한 본 발명은 B형 간염 바이러스 pre-S를 포함하며, B형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스의 표면 항원 또는 pre-S에 의해 암호된 항원에 대한 항체를 검출할 수 있는 진단 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) pre-S를 암호화하는 유전자를 벡터에 삽입하고, (b) 상기 pre-S 유전자를 갖는 상기 벡터를 숙주세포에 형질도입하고, 및 (c) 형질전환체를 배지에서 배양하여 pre-S를 생산하는 것을 포함하는 HBV pre-S 생산방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 보강제를 포유류 또는 조류에 항체-증강효과를 갖는 함량으로 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 항체반응성 증강 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 HBV 백신을 투여하여 HBV에 대한 면역성을 형성시키는 방법을 제공한다.
기재된 "pre- S 유전자"는 HBV pre-S1 유전자 및 HBV pre-S2 유전자로 이루어진 폴리뉴클레오티드이며, "pre-S"는 pre-S 유전자에 의해 번역되는 단백질이다. "S 항원"은 HBV 게놈의 S 부위에 의해 번역되는 폴리펩타이드를 의미한다.
"HBV"는 상기 바이러스의 모든 서브타입이며, 특히 adw, ayw, adr 및 ayr 등이다. 본 발명에서 pre-S 유전자는 모든 서브타입의 HBV의 pre-S 유전자가 바람직하고, 더욱 바람직하기로는 adr 서브타입(서열번호: 1), ayw 서브타입(서열번호: 2), adw 서브타입(서열번호: 3), adw2 서브타입, 및 adyw 서브타입의 것이고, 가장 바람직하기로는 adr 서브타입의 pre-S 유전자 및 ayw 서브타입의 pre-S 유전자이다.
본 발명의 pre-S는 완전히 당화되거나, 일부 당화되거나 또는 당화되지 않은 것이다. 완전히 당화된 pre-S는 과발현 시스템을 통하여 생산된 재조합 pre-S이며, 일부 또는 비당화된 pre-S는 변이체 pre-S를 코딩하는 유전자로 형질전환된 세포에서 생산되는 변형된 pre-S이거나, 또는 천연형 pre-S 또는 재조합 pre-S 를 글리코시데이즈로 처리한 변형된 pre-S이다. 또한 비당화된 pre-S는 각각의 아미노산을 조합하여 화학적 방법으로 합성할 수 있다.
사카로마이세스에서 생산되는 pre-S는 15 및 123번째 아미노산 위치의 아스파라진이 N-당화될 수 있다. 이에, 본 발명은 15 또는 123번째 아미노산에 위치한 아스파라진이 알라닌, 아르기닌, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 변이체 pre-S를 제공한다.
바람직한 변이체 pre-S는
(1) Pre-S-15m (서열번호: 9), 천연형 pre-S의 15번째 아미노산인 아스파라진이 히스티딘으로 치환된 것임;
(2) Pre-S-123m (서열번호: 10), 천연형 pre-S의 123번째 아미노산인 아스파라진이 히스티딘으로 치환된 것임;
(3) Pre-S-dm (서열번호: 11), 천연형 pre-S의 15 및 123번째 아미노산인 아스파라진이 모두 히스티딘으로 치환된 것임; 를 포함한다.
본 발명의 변이체 pre-S는 발현 벡터를 이용하여 생산할 경우 일부 당화될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 변이체 pre-S를 암호화하는 변이체 pre-S 유전자를 제공한다. 상기 변이체 pre-S 유전자는 전체 pre-S1 및 pre-S2 코딩 부위를 포함하는 변이된 폴리뉴클레오티드이다. 상기 변이체 pre-S 유전자는 일부 당화된 또는 비당화된 pre-S를 암호화한다.
본 발명은 또한 프로모터, pre-S 유전자 및 전사종결 인자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 pre-S 유전자는 바람직하기로는 천연형 pre-S 유전자 또는 변이체 pre-S 유전자이다. 상기 재조합 벡터는 바람직하기로는 숙주세포에 형질전환하여 pre-S를 생산하는 형질전환체를 제조하기 위한 용도로 사용된다.
상기 재조합 벡터의 예들로는 pIL20-pre-S (adr)와 pIL20-pre-S (ayw)가 있다. 상기 재조합 벡터 pIL20-pre-S (adr)는 HBV adr 서브타입의 pre-S 유전자를 포함하고 있으며, pIL20-pre-S (ayw)는 HBV ayw 서브타입의 pre-S 유전자를 포함하고 있다. The pIL20-pre-S 벡터의 지도는 도 1에 도시되어 있다. pIL20-pre-S 벡 터의 상세구성은 하기 표 1로 나타낸다.
| 작용부 | 특성 |
| 프로모터 | MfF alpha l promoter |
| 분비신호 | Killer toxin, IL-1 beta leader |
| 절단부위 | KEX2 |
| 삽입 유전자 | pre-S gene ( coding region for pre-S1 and - S2) |
| 전사 종결자 | GAPD terminator |
| ura 유전자 | URA3 |
아울러, 본 발명은 천연형 HBV의 pre-S 또는 변이체 pre-S를 생산하는 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 HBV의 pre-S 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 제조된 것이다. 상기 숙주세포는 바람직하기로는 효모이며, 더욱 바람직하기로는 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces serevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 야로이아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 가장 바람직한 형질전환체는 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S (adr), 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S (ayw) 또는 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre- dm이다. 상기 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S (adr)는 서열번호: 4의 천연형 pre-S를 생산하며, 상기 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S (ayw)는 서열번호: 5의 천연형 pre-S를 생산한다.
상기 형질전환체는 연속식 회분발효배지(1 % 효모추출물, 2 % 펩톤, 2 % 덱스트로즈)으로, 30 ℃에서 24시간 배양될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 형질전환체로부터 생산된 재조합 pre-S를 제공한다. 상기 재조합 pre-S를 생산하기 위하여, 상기 형질전환체는 탄소원으로 2 % 갈락토 스를 포함하는 유가식 배양배지(1% 효모추출물, 2 % 펩톤)에서, 30 ℃로 24 내지 48시간 배양될 수 있다. 생산된 재조합 pre-S는 배양배지로 분비되며, 배양액 리터당 850 mg 이상 생산된다.
상기 재조합 pre-S는 배양액으로부터 효모세포를 제거하고, 세포 결핍성 배양액을 농축한 다음 초미세막을 사용하여 투석하고, 이온교환수지와 분자 크기차 분리 컬럼으로 분리하므로써 정제될 수 있다.
상기 재조합 pre-S의 예들로는 서열번호: 4의 단백질, 서열번호: 5의 단백질, 서열번호: 6의 단백질, 서열번호 9의 Pre-S-15m, 서열번호: 10의 Pre-S-123m alc 서열번호: 11의 Pre-S-dm이 있다.
상기 재조합 pre-S는 완전히 당화되거나, 일부 당화되거나 또는 비당화된 것이다. 상기 완전히 당화된 재조합 pre-S 및 일부 당화된 재조합 pre-S는 글루코시데이즈로 분해되어, 비당화된 재조합 pre-S로 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 pre-S의 보강제(adjuvant)로의 용도에 관한 것이다. 보강제는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 용도로 사용될 수 있다. 상기 항원은 기생충 또는 그외 병원성 물질로부터 유래된 것으로, 동물 또는 조류, 특히 사람 또는 가축에 감염되는 것이다. 상기 기생충 또는 병원성 물질로는 원핵 생물, HIV, HBV, HCV 및 로타바이러스를 포함하는 바이러스 및 효모, 진균, 원생동물, 후생동물 및 아메바와 같은 진핵 생물이 있다.
상기 보강제는 pre-S 또는 본 발명이 재조합 pre-S를 포함하며, 더욱 바람직하기로는 일부 당화된 pre-S 또는 비당화된 pre-S를 포함한다.
본 발명은 사람, 포유류 또는 조류에 항체-증강효과를 갖는 함량으로 보강제를 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응 증강 방법을 제공한다. 상기 포유류로는 가축동물, 실험용 동물, 가금 동물 및 포획한 야생동물이 있으며, 상기 조류로는 닭 또는 그외 집에서 키우는 새 또는 야생의 새가 해당된다.
또한 본 발명은 HBV 감염을 예방하거나 만성 보균자를 치료할 수 있는 백신을 제공한다. 상기 HBV 백신은 pre-S 또는 재조합 pre-S 를 포함한며, 또한 S 항원을 더욱 포함할 수 있다. 상기 pre-S 및 S 항원을 포함하는 백신은 HBV에 의한 급성 간염 또는 만성 간염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 상기 HBV 백신은 S 항원 및 pre-S 를 10:1 내지 1:10의 중량비율로 포함할 수 있다.
상기 HBV 백신은 통상적인 백신 제조방법으로 제조할 수 있으며, 보강제 또는 약리학적으로 허용가능한 조성을 1종이상 더욱 포함할 수 있다. 상기 약리학적으로 허용가능한 조성은 부형제 또는 희석제이다. 부형제 또는 희석제의 예들로는 식염수, 완화된 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 에탄올이 있으나 이에 한정되진 않는다. 상기 보강제의 예로는 알루미늄 하이드록사이드가 있으며, 보강제로 사용될 수 있는 것은 모두 가능하다.
본 발명의 HBV 백신은 경구 또는 비경구로 사용될 수 있으며, 바람직하기로는 주사형으로 사용될 수 있으며, 상기 백신은 현탁액 또는 용액 형태일 수 있다. HBV 백신의 투여량은 통상적인 HBV 백신 접종시 사용되는 함량이며, 정확한 투여량은 환자의 상태, 몸무게 및 나이 등에 따라 달리 적용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 HBV 백신은 HBV 에 대한 면역을 형성시키기 위한 용도로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 HBV에 대한 항체 형성을 확인하고, HBV, HBV 표면항원들 또는 pre-S 유전자에 의해 번역된 항원에 대한 항체를 검출할 수 있는 진단 조성물을 제공한다. 상기 진단 조성물은 효소표지면역항체법("ELISA") 또는 의료 테스트(care test)를 목적으로한 다양한 형태에 대한 HBV 특이적 항제-포착성 항원으로, 본 발명의 pre-S를 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 단비 본 발명을 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 structuralpIL20-pre-S 벡터의 구조를 도시한 것이고,
도 2는 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석으로, 단클론성 항-pre-S 항체를 이용하여 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre S의 배양배지에서 재조합 pre-S 단백질을 확인한 것이고,
도 3은 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석으로, 단클론성 항-pre-S 항체를 이용하여 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre S(dm)의 배양배지에서 대한 재조합 pre-S 단백질을 확인한 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 재조합 pre-S 단백질의 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯사진이고,
도 5는 본 발명에 따라 정제한 재조합 pre-S 단백질(당화 또는 비당화 형태) 의 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯사진이고,
도 6은 재조합 pre-S 단백질을 HPLC로 분석한 그래프이고,
도 7은 본 발명에 따른 B형 간염 바이러스 백신의 면역원성을 마우스에서 측정한 결과이고,
도 8은 본 발명에 따른 B형 간염 바이러스 백신의 면역원성을 렛트에서 측정한 결과이고,
도 9는 본 발명에 따른 B형 간염 바이러스 백신의 면역원성을 토끼에서 측정한 결과이고,
도 10은 S 항원과 본 발명의 pre-S 단백질을 주사한 마우스에서 S 항원에 대한 면역반응을 측정한 결과이고,
도 11은 S 항원과 본 발명의 pre-S 단백질을 주사한 마우스에서 S 항원에 대한 IgG 서브타입을 측정한 결과이고,
도 12는 본 발명의 재조합 pre-S 단백질을 이용한 HBV 항체 검출결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 단비 본 발명을 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.재조합 pre-S를 발현하는 효모세포 제조
(1) pIL20-pre-S 벡터의 제조
재조합 벡터의 구조는 도 1에 간략하게 도시하였다.
pre-S 유전자를 클로닝하기 위하여, B형 간염 바이러스 adr 서브타입(subtype) 중 한국형 변이체인 HBV 315(염기서열의 Accession No. AF286594)를 선택하고, pre S 유전자를 PCR법으로 증폭하였다. 사용된 프라이머는 서열번호: 7의 센스 프라이머와 서열번호: 8의 안티센스프라이머이다. 상기 센스 프라이머는 HBV 유전자의 염기서열 2848번 위치에 결합하고, KEX2 절단부위와 제한효소 XbaI 절단부위를 포함하고 있다. 또한 상기 안티센스 프라이머는 130번 위치에 특이적이고, 종결코돈(TAG)과 제한효소 BamHI 절단부위를 포함하고 있다.
PCR은 변성(denaturation, 94 ℃, 1분), 결합(annealing, 45 ℃, 1분) 및 중합(polymerization, 72 ℃, 1분)의 조건으로 30회 수행하였고, 그 결과 서열번호: 1의 522 bp PCR 산물이 증폭되었다. 상기 PCR 산물은 제한효소 XbaI 및 BamHI으로 절단하여 접착말단(cohesive end)화하였다. PCR 산물은 동일 효소로 절단한 pIL20 벡터에 삽입하여 pIL20-pre-S(adr)을 제조하였다.
(2) pIL20-pre-S(ayw) 제조
HBV ayw 서브타입(염기서열의 accession No. X02496)을 주형으로 사용하였고, pIL20-pre S(ayw) 벡터를 제조하였다.
(3) 형질전환체 제조
pIL20-pre-S(adr) 벡터 또는 pIL20-pre-S(ayw) 벡터를 효모(Saccharomyces. cerevisiae 2805)에 통상의 방법으로 형질전환하였다. 상기 효모(S. cerevisiae 2805)는 Matapep4::HIS3prb1-1.6Rcan1GAL2his3-200ura3-52의 유전자형을 가지는 ura- 숙주이다.
형질전환체/pIL20-pre-S(adr) 또는 /pIL20-pre S(ayw)는 ura-, ade- 및 trp-
선택배지(CAA-glucose)에서 배양하여 선별하였다.
pIL20-pre-S(adr) 벡터로 형질전환한 효모는 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 2805/pIL20-pre-S(adr)라 명명하였고, 2001년 4 월 16일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0987BP로 기탁하였다. pIL20-pre-S(ayw) 벡터로 형질전환한 효모는 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 2805/pIL20-pre S(ayw)라 명명하였고, 2001년 5 월 8 일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 1004BP로 기탁하였다.
실시예 2. 재조합 변이체 pre-S를 발현하는 효모세포 제조
재조합 pre-S의 면역원성을 증가시키기 위하여, 플라스미드 pIL20-pre-S를 주형으로 한 부위-특이 돌연변이유발을 실시하여 pre-S 부위의 당화부분(15번 및 123번의 아스파라진)을 히스티딘 또는 글루타민으로 변이시켰다.
15번째 아미노산 위치의 아스파라진을 암호하는 뉴클레오티드 코돈 AAT는 히스티딘을 암호하는 코돈인 CAC로 변이시켜, pIL20-pre-S (15m)를 구축하였다. 123번째 아미노산 위치의 아스파라진을 암호하는 뉴클레오티드 코돈 AAC는 히스티딘을 암호하는 코돈인 CAC로 변이시켜, pIL20-pre-S (123m)를 구축하였다. 15 및 123번째 아미노산 위치의 아스파라진을 암호하는 코돈 모두 히스티딘을 암호하는 코돈인 CAC로 변이시켜, 이중 변이체 플라스미드 pIL20-pre-S (dm)를 구축하였다.
pIL20-pre-S (15m), pIL20-pre-S (123m) 또는 pIL20-pre-S (dm)는 사카로마이세스 세레비지아 2805에 형질전환시켰다. 상기와 동일한 스크리닝방법으로, 재조합 단백질 발현율이 가장 높은 콜로니를 생산용 세포주로 선별하여 마스터 세포은행을 확립하였다.
실시예 3. 재조합 pre-S 생산
(1) 재조합 pre-S의 발현확인
형질전환체들(사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S (adr), 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S (ayw), 및 사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S (dm))은 각각 연속식 회분발효배지(1 % 효모추출물, 2 % 펩톤, 2 % 포도당)에서 30 ℃로 24시간정도 배양하였다. 600 nm에서 OD값이 20 내지 30에 도달했을 때, pre-S 유전자의 발현 유도체이자 탄소원인 갈락토스가 포함된 유가배지(1 % 효모추출물, 2 % 펩톤, 2 % 갈락토스)를 서서히 첨가하면서 다시 24시간 배양하여, pre-S 단백질의 발현을 유도하였다.
상기 배양액 20 내지 30 ul을 SDS-PAGE하고, pre-S 특이적 단클론성 항-pre-S 항체로 웨스턴블롯을 실시하여 pre-S의 발현을 확인하였다.
도 2a는 배양액의 SDS-PAGE 분석 사진으로, 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S에서의 pre-S 발현을 나타낸 것이고, 도 2b는 도 2a의 전기영동 사진에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2에서, 레인 1 및 레인 2는 단백질의 크기 표시이고, 레인 3은 pre-S 유전자를 포함하지 않는 pIL20벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아 2805 배양액이고, 레인 4 및 레인 5는 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S(adr)의 배양액이고, 레인 6 및 레인 7 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre S(ayw) 배양액이다. 상기 형질전환체들로부터 발현된 재조합 pre-S는 당화(glycosylation)정도가 매우 심하여 SDS-PAGE상에서 150-250 kDa 크기로 넓게 나타났다.
도 3a 및 3b는 SDS-PAGE(a) 및 웨스턴 블롯(b) 분석을 나타낸 것으로, 단클론성 항-pre-S 항체를 이용하여 사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S (dm) 배양액에 실시한 것이다. 레인 1은 단백질 크기 표시이고, 레인 2는 천연형 pre-S이고, 레인 3은 사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S (dm)의 배양액이다. 상기 변이체 재조합 pre-S인, 사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S (dm)으로부터 발현된 Pre-S-dm는 일부 당화된 형태로, 약 50 kDa의 분자크기를 나타내었다.
(2) 발효
pre-S를 생산하는 재조합 효모는 10 L 발효조에서 배양하였다. 종균 배양물은 기초 배양배지(0.6 % 카사미노산, 2 % 글루코스, 1X 효모 질소 베이스)에서 25 ml 및 500 ml 플라스크를 이용하여 제조하였다.
회분발효배지(1 % 효모추출물, 2 % 펩톤, 2 % 덱스트로즈)에서 36시간 배양하면서 글루코스의 소진여부를 글루코스 어세이키트로 확인하고, 배지(1 % 효모추출물, 2 % 펩톤, 2 % 갈락토스)를 서서히 첨가하면서 36시간동안 배양하여 pre-S 발현을 유도하였다. 이때 세포의 밀도는 600 nm에서 OD값이 약 50 정도였으며, pre-S의 농도는 50 내지 60 mg/L이었다.
(3) 정제
3-1. 수득 및 여과단계
재조합 pre-S 은 형질전환 효모에서 발현되어 배양배지로 분비된다. 배양배지는 원심분리하여 세포를 제거하고, 분리된 배양액은 0.45 um 크기의 두라포어 막(Durapore membrane)에 수회 미세여과 하였다.
3-2. 초미세 여과단계
상기 배양액은 분자량 제한수치(Molecular weight cut-off value) 30 kDa의 필터로 초미세 여과시켜, 초미세여과(Ultrafiltration)와 투석여과(Diafiltration)하였다.
3-3. 이온교환 크로마토그래피
상기 여과물은 25 mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 평형화된 SP-세파로즈 FF 컬럼에 흘려주고, 같은 완충액으로 컬럼을 세척한 다음, 소듐클로라이드 농도구배 (0.2 M NaCl)로 용출시켰다.
3-4. 크기차 분리단계
상기 이온교환 크로마토그래피로 분리한 용출물은 다시 초미세여과를 통해 농축한 후, 세파크릴 S-300(또는 S-200) 겔 여과 컬럼에 흘려주었다. 이후 PBS(Phosphate buffered saline solution, pH 7.0)를 상기 컬럼에 흘려주어, pre-S를 용출시켰다.
용출분획들 중, 재조합 pre-S를 포함하는 분획[Kav = 0.440 - 0.475, Kav = Ve - Vo/Vt - Vo, Ve: 단백질의 용출부피, Vo: 블루 덱스트란 (Blue dextran)의 용출부피, Vt: 컬럼의 총부피]을 모아서 0.22 mm의 필터를 통과시킨 다음 냉동보관하였다.
하기 표 2는 정제수율을 나타낸 것이다.
| 단계 | 총 단백질 | 총 pre-S | 특이 활성도(mg pre-S/ mg protein) | 정제수율 | 정제도 (Fold) |
| 여과 단계 | 309,440 mg | 347.8 mg | 0.00112 | 100% | 1 |
| 초미세 여과 단계 | 14,780 mg | 336.4 mg | 0.02276 | 96.7% | 20.3 |
| 이온교환 크로마토그래피 | 360 mg | 235.5 mg | 0.65417 | 67.7% | 584.1 |
| 크기차 분리 | 157.9 mg | 155.43 mg | 0.98486 | 44.7% | 878.9 |
도 4a 내지 4d는 정제 과정의 각 단계에서 정제한 시료의 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 도 4a는 사카로마이세스 세레비지아2805/ pIL20-pre-S (adr)의 배양액에 대한 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이고, 4b는 상기 동일 시료에 대한 웨스턴 분석을 나타낸 것이다. 도 4c는 사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S (dm)의 배양액에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 도 4a 및 4b에서, 레인 1은 배양액이고, 레인 2는 여과 단계에서 정제된 시료이고, 레인 3은 이온 교환 크로마토그래피 단계(Sp-세파로즈)에서 정제된 시료이고, 레인 4는 크기차 분리 단계에서 정제된 시료이고, 및 레인 5는 크기 표시이다. 도 4c 및 4d에서, 레인 1은 배양액이고, 레인 2는 여과 단계에서 정제된 시료이고, 레인 3은 이온 교환 크로마토그래피 단계(Sp-세파로즈)에서 정제된 시료이고, 레인 4는 이온 교환 크로마토그래피 단계(Q-세파로즈)에서 정제된 시료이고, 레인 5는 크기차 분리 단계에서 정제된 시료이고, 및 레인 6은 크기 표시이다.
사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S(adr)은 과당화(hyperglycosylated) 재조합 pre-S를 발현하였고, 사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S(dm)은 일부 당화된 Pre-S-dm을 발현하였다. 상기 정제과정으로 고순도의 재조합 pre-S를 수득할 수 있다.
실시예 4. 재조합 pre-S의 물리, 화학적 성질
재조합 pre-S의 당화여부를 확인하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S (adr)로부터 생산된 재조합 pre-S에 N-글리코시데이즈 F(Calbiochem)를 처리하고, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
도 5a 및 5b는 본 발명에 따라 정제된 재조한 pre-S의 SDS-PAGE(a) 및 웨스턴 블롯(b) 분석을 나타낸 것이다. 레인 1은 정제된 재조합 pre-S이고, 레인 2는 N-글리코시데이즈 F로 처리된 재조합 pre-S이다. 당 부분(glycosyl moiety)을 제거하였을 때, 재조합 pre-S 분자량은 약 20 kDa으로 관찰되었다.
실시예 3의 재조합 pre-S의 순도를 확인하기 위하여, HPLC를 실시하였다. 컬럼을 TSK G3000SW를 사용하였고, PBS를 유속 1 ml/분으로 흘려주었고, 214 nm에서 검출하였다.
도 6은 재조합 pre-S의 HPLC 차트이다. 그래프상에서 하나의 피크로 관찰되어, 다른 물질의 오염되지 않은 높은 순도의 재조합 pre-S임을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실시예 3에서 정제한 재조합 pre-S의 N-말단 아미노산 서열을 단백질 서열 분석 시스템(Procise cLC 492, Applied Biosystems)으로 분석하였고, pre-S 유전자 서열로부터 유추한 아미노산 서열과 비교하였다.
표 3은 재조합 pre-S의 아미노산 서열과 pre-S 유전자의 염기로부터 유추한 아미노산 서열을 비교한 것이다. 표 3에서 "ND"는 "확인되지 않음"을 의미한다. 상기 비교결과 1개를 제외하고는 모두 일치하였다.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | |
| 재조합 pre-S | Met | Gly | Gly | Trp | Ser | Ser | Lys | Pro | ND | Gln | Gly | Met | Gly | Thr |
| 유추한 아미노산 서열 | Met | Gly | Gly | Trp | Ser | Ser | Lys | Pro | Arg | Gln | Gly | Met | Gly | Thr |
실시예 5. 단클론성 항-pre-S을 이용한 재조합 pre-S 검증
재조합 pre-S의 특이적 항원-항체 반응성을 실험하였다. 사카로마이세스 세레비지아 2805/ pIL20-pre-S (adr)로부터 생산된 재조합 pre-S에 N-글리코시데이즈 F(Calbiochem)를 처리하고, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
재조합 pre-S는 단클론성 항-pre-S2 항체와 반응하여 150 내지 250 kDa 크기로 확인되었으나, 당 부분을 제거된 경우에는 약 20 kDa 크기로 확인되었다. 즉, 재조합 pre-S는 당화에 관계없이 항원-항체 반응 특이성을 유지하고 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. HBV 백신 제조
실시예 3의 재조합 pre-S 10 ug을, 알루미늄 하이드록사이드(Aluminium Hydroxide) 0.8 mg에 흡착시켰다. pre-S는 알루미늄 하이드록사이드 0.8 mg에 20 ug 이상 흡착시킬 수 있다.
실시예 7. HBV 백신 제조
실시예 3의 재조합 pre-S 5 내지 20 ug을 백신 제제로 사용하였다.
실시예 8. HBV 백신 제조
재조합 pre-S 1 내지 200 ug을 완전한 프레운드 보강제(Freud's adjuvant, CFA)와 혼합하여, 면역원성(immunogenicity) 실험에 대한 면역원(immunogen)으로 사용하였다.
실시예 9. 재조합 pre-S의 면역형성 검증
(1) 면역원성 실험- 마우스 실험
실시예 6 내지 8에서 준비한 pre-S m10 ug을 각각 Balb-c 마우스에 0, 2, 4주 간격으로 근육주사하였다. 첫 접종 후 30일째에 채혈하여 ELISA법으로 항-재조합 pre-S에 대한 항체형성을 관찰하였다.
도 7은 재조합 HBV pre-S의 면역원성을 마우스에서 측정한 결과이다. ●는 실시예 6의 백신에 대한 항체 역가이고, ○는 실시예 7의 백신에 대한 항체 역가이고, 및 ▼는 실시예 8의 백신에 대한 항체 역가이다. 도 7에서 나타낸 바와 같이, 재조합 pre-S는 단독으로 또는 보강제와 공동 접종시 마우스에 면역을 형성시킬 수 있었으며, 실시예 8의 백신은 실시예 6 및 7의 백신에 비하여 면역원성이 높은 것으로 확인되었다.
(2) 면역원성 실험- 렛트 실험
실시예 6의 백신과, 인체에 무해함이 확인된 리포펩타이드인 PAMIII로 제제화된 백신을 제조하여 렛트에서 면역원성을 실험하였다.
실시예 8의 백신은 양성 대조군으로 사용하였고, 재조합 pre-S 무첨가 조성물을 음성 대조군으로 사용하였다.
백신(실시예 6의 백신, PAMIII로 제형화한 백신, 양성 대조군 및 음성대조군) 20 ug을 각각 Sprague Dawley 렛트에 0, 2, 4주 간격으로 근육주사하였다. 첫 접종 후 30일째에, 백신으로 면역화시킨 렛트의 혈청으로부터 pre-S에 대한 항체 형성을 ELISA로 확인하였다.
도 8은 HBV 재조합 pre-S의 면역원성을 렛트에서 측정한 결과이다. ●는 실시예 6의 백신에 의해 형성된 항체 역가이고, ○는 양성 대조군에 의해 형성된 항체 역가이고, ▼는 PAMIII로 제형화된 백신에 의해 형성된 항체 역가이고, 및 ▽는 음성 대조군에 의해 형성된 항체 역가이다. 도 8에서 나타난 바와 같이, 실시예 6의 백신과 PAMIII로 제형화된 백신은 렛트에서 pre-S에 대한 면역 반응을 유도하였다. 또한 리포펩타이드 PAMIII는 pre-S 항원에 대한 항체를 유도하여, 면역 보조제로 사용가능성이 있음이 관찰되었다.
(3) 면역원성 실험-토끼 실험
재조합 pre-S의 면역원성을 확인하기 위하여, 재조합 pre-S 100 ug을 완전한 프레운드 보강제와 함께 0, 2 및 6주 간격으로 토끼에 3회 주사하였다. 마지막 주사 후 10 일째에, 혈액을 채혈하고 혈청을 분리하여 ELISA 법으로 pre-S 특이적 항체 역가를 측정하였다.
도 9는 HBV 재조합 pre-S의 면역원성을 토끼에서 측정한 결과이다. the recombinant pre S ● 는 정상적인 토끼 혈청이고, ○ 는 면역화된 토끼 #1의 혈청이고, 및 ▼ 는 면역화된 토끼 #2의 혈청이다.
재조합 pre-S는 토끼에서 높은 항체 역가를 나타내었다.
(4) 변형된 재조합 pre-S의 면역원성
유사하게, 변형된 pre-S, 즉 2종의 단일 변이체(Pre-S-15m 및 Pre-S-123m), 이중 변이체(Pre-S-dm), 및 파상풍 톡소이드 서열이 연결된 이중 변이체의 면역원성을 Balb/c 마우스와 ICR 마우스에서 실험하였다. 완전한 프레운드 보강제와 공동 주사한 결과 모두 높은 면역원성을 나타내었고, 보강제로 알루미늄 하이드록사이드를 사용하였한 경우 항체 역가는 매우 낮았다.
실시예 10. 변형된 재조합 pre-S의 보강성(adjuvanticity ) 검증
변형된 재조합 pre-S를 면역반응 증강용도로 사용하였다.
변형된 재조합 pre-S(Pre-S-dm) 및 S 항원의 혼합물(이하, "LPVac-HBV"이라 함)을 알루미늄 하이드록사이드(alum)에 흡착시키고 이를 근육주사한 결과, LPVac-HBV 의 면역원성이 S항원("HBsAg") 단독에 비하여 여러배 높게 확인되었다(도 10).
LPVac-HBV 또는 HBsAg에 대하여 면역화된 마우스로부터 혈청을 수득하여 IgG 서브타입을 확인하였다(도 11). 그 결과 IgG2a가 S 항원 단독사용한 경우에 비해 약 10배 이상 높게 측정되었다.
따라서, pre-S는 예방용 백신 조성물 및 치료용 백신 조성물에 포함되어, S 항원만을 포함하고 있는 상용화된 백신의 전반적인 질을 향상시킬 수 있다.
실시예 11. 독성실험- 단회투여독성시험(급성)
실시예 6의 백신을 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mg/(몸무게)kg로 ICR마우스에 각각 복강주사하였다. 상기 실험군은 백신이 주사되지 않은 음성 대조군과 비교하여 몸무게, 임상적 변화 및 병리학적 소견을 관찰하였다. 그 결과 별다음 증 상이 관찰되지 않았다. 마우스는 최대량(2 mg/kg)을 투여한 경우에도 치사하지 않아, LD50를 결정할 수 없었다. 따라서 실시예 6의 백신은 마우스에 대한 급성독성이 없음을 알 수 있다.
실시예 12. 독성실험- 반복투여 독성시험(아급성)
실시예 6의 백신을 0, 50, 100, 200 ug/(몸무게)kg씩 1주일에 5회, 4주간 Sprague Dawley 랫트에 피하주사한 후 변화를 관찰하였다. 백신이 주사되지 않은 대조군과 비교하여 실험예 6로 면역화시킨 SD 랫트에서는 몸무게, 임상적 변화, 병리학적 소견 등에 차이가 나타나지 않았다.
실시예 13. 독성실험- 피부자극시험
뉴질랜드 흰토끼의 등에 2.5 cm x 2.5 cm크기로 털을 제거하고, 그 중 한 쪽은 피하주사바늘을 이용하여 피부각질층을 벗겨내고, 나머지는 그대로 두었다. 실시예 6의 백신 0.5 mg을 수술용 거즈에 묻혀 상기 두 부위에 덮어두었다. 대조군은 PBS를 같은 방법으로 시술하였다. 피부에 접촉 24, 48, 72시간 후 Draize Scoring System에 따라 처치된 부위를 관찰하고 약제의 안전성을 결정하였다.
재조합 pre-S 백신이 처리된 뉴질랜드 흰토끼 피부는 대조군과 비교하여, 홍반(erythema), 흑반(eschar), 부종(edema)과 같은 임상적 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 14. pre-S의 진단 시약으로 용도
실시예 3의 재조합 pre-S를 항-pre-S 항체-포획성 항원으로의 용도를 실험하였다.
공지방법에 따라, 96 웰 플레이트(Nunc maxisorp)에 재조합 pre-S를 웰 당 50 ng으로 코팅하였다. 코팅된 플레이트는 PBST(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)로 3회 세척하고, 1 % 소 혈청 알부민(BSA)를 웰 당 100 ul씩 넣어 플레이트에 잔류하는 항원 결합부위를 블록킹시켰다. 37 ℃에서 1시간 반응한 후, 플레이트는 PBS로 제척하고 사용하기 전까지 4 ℃에 보관하였다.
본 실험에서, 마우스 또는 사람 혈청으로부터 준비한, 항체역가가 정량된 항-pre-S2 항체를 양성 대조군으로 사용하였고, PBS를 음성 대조군으로 사용하였다. 각 웰의 반응 부피는 100 ul이었고, 37 ℃ 에서 90분간 반응시켰다. 동일한 방법으로, 항-pre-S 항체로 사람 혈청 및 연속 희석시킨 사람 혈청 각 100 ul를 분석하였다. 이차항체로 양고추냉이 페록시데이즈("HRP")가 접합된 염소 항-마우스 IgG 항-사람 IgG를 사용하였고, 상온에서 기질인 페닐렌디아민("OPD")을 첨가하여 발색시켰다. 3M HCl로 발색반응을 중지시킨 후, OD 값을 492 nm에서 측정하였다.
도 12는 재조합 pre-S가 HBV 양성인 사람 혈청에서 항-pre-S 항체를 양성 대조군(예, 단클론성 pre-S2 항체)과 유사한 수준으로, 포획할 수 있음을 나타낸 것이다. 따라서, 재조합 pre-S는 진단키트 개발에 사용하여, 임상시료내 HBV-특이적 항체를 검출할 수 있다.
<110> Dobeel Corporation
<120> PRE S PROTEIN OF HEPATITIS B VIRUS(HBV) AS AN ADJUVANT AND A
COMPONENT OF HBV VACCINE
<150> KR 10-2001-29002
<151> 2001-05-25
<160> 11
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 522
<212> DNA
<213> HBV(adr subtype) pre S gene
<400> 1
atgggaggtt ggtcttccaa acctcgacaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagtg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccaccacatt ccaccaagct ctgctagatc ccagagtgag gggcctatat 420
tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgcctcaccc 480
atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga ac 522
<210> 2
<211> 522
<212> DNA
<213> HBV(ayw subtype) pre S gene
<400> 2
atgggaggtt ggtcttccaa acctcgacaa ggcatggggc agaatctttc caccagcaat 60
cctctgggat tctttcccga ccaccagttg gatccagcct tcagagcaaa caccgcaaat 120
ccagattggg acttcaatcc caacaaggac acctggccag acgccaacaa ggtaggagct 180
ggagcattcg ggctgggatt caccccacca cacggaggcc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tactagaaac gttgccagca aatccgcctc ctgcctctac caatcgccag 300
tcaggaaggc agcctacccc gctgtctcca cctttgagaa acactcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtgag aggcctgtat 420
ttccctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgtctctccc 480
atatcgtcaa tcttctcgag gattggggac cctgcgctga ac 522
<210> 3
<211> 522
<212> DNA
<213> HBV(adw subtype) pre S gene
<400> 3
atgggaggtt ggtcatcaaa acctcgcaaa ggcatgggga cgaacctttc tgttcccaac 60
cctctgggat tctttcccga tcatcagttg gaccctgcat tcggagccaa ttcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc catcaaggac cactggccac aagccaacca ggtaggagtg 180
ggagcatttg ggccagggtt cactccccca cacggaggtg ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattggccac cgtgccagcg atgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaaggc agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360
cagtggaatt ccacagcttt ccaccaagct ctgcaagatc ccagagtcag gggcctgtat 420
tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca ctcaaccctg ttccaactat tgcctctcac 480
atctcgtcaa tctcctcgag gattggggac cctgcaccga ac 522
<210> 4
<211> 174
<212> PRT
<213> HBV(adr subtype) pre S protein
<400> 4
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His
115 120 125
Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro
145 150 155 160
Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn
165 170
<210> 5
<211> 174
<212> PRT
<213> HBV(ayw subtype) pre S protein
<400> 5
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Gln Asn Leu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Glu Thr Leu Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His
115 120 125
Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Val Ser Pro
145 150 155 160
Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn
165 170
<210> 6
<211> 174
<212> PRT
<213> HBV(adw subtype) pre S protein
<400> 6
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Gln Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Ala Thr Val Pro Ala Met Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His
115 120 125
Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Ser Gly Thr Leu Asn Pro Val Pro Thr Ile Ala Ser His
145 150 155 160
Ile Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Pro Asn
165 170
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> primer
<400> 7
gtctctagac aagagaatgg gaggttggtc ttccaaacc 39
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> primer
<400> 8
atcggatccc tagttcggtg cagggtcccc agtcctc 37
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<212> PRT
<213> PreS-15m protein
<400> 9
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1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
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65 70 75 80
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<211> 174
<212> PRT
<213> PreS-123m protein
<400> 10
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
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<212> PRT
<213> PreS-dm protein
<400> 11
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Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly
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Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro
145 150 155 160
Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn
165 170
Claims (43)
- 천연형 pre-S의 아미노산 서열의 15 및 123 번째에 위치하는 아스파라진 중 하나 이상이 각각 아르기닌, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것을 포함하는 것을 특징으로 하고,상기 천연형 pre-S 는 HBV adr 서브타입의 pre-S (서열번호: 4), HBV ayw 서브타입의 pre-S (서열번호: 5), HBV adw 서브타입의 pre-S (서열번호: 6), HBV adw2 서브타입의 pre-S 및 HBV adyw 서브타입의 pre-S로 이루어진 군 중에서 선택된 것인,변형된 B 형 간염 바이러스(HBV)의 pre-S.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 변형된 HBV pre-S는 Pre-S-15m (서열번호: 9), Pre-S-123m (서열번호: 10) 및 Pre-S-dm (서열번호: 11)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 HBV pre-S.
- 삭제
- 제1항 또는 제4항에 따른 변형된 HBV pre-S를 암호화하는 변이체 HBV pre-S 유전자.
- 삭제
- 삭제
- (a) 프로모터;(b) 제6항의 변이체 HBV pre-S 유전자, 또는 HBV adr 서브타입의 pre-S (서열번호: 4), HBV ayw 서브타입의 pre-S (서열번호: 5), HBV adw 서브타입의 pre-S (서열번호: 6), HBV adw2 서브타입의 pre-S 및 HBV adyw 서브타입의 pre-S로 이루어진 군 중에서 선택된 천연형 HBV pre-S의 코딩 유전자; 및(c) 전사종결자;를 포함하는 재조합 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 9항에 있어서, 상기 벡터는 pIL20-pre-S (adr) 또는 pIL20-pre-S (ayw)인 재조합 벡터.
- 제 9항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 14항에 있어서, 상기 형질전환체는 효모인 형질전환체.
- 제 14항에 있어서, 상기 형질전환체는 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S (KCTC 0987BP) 및 사카로마이세스 세레비지아 2805/pIL20-pre-S (ayw) (KCTC 1004BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 형질전환체.
- 제 14항의 형질전환체로부터 생산되는 재조합 HBV pre-S로서,HBV adr 서브타입의 pre-S (서열번호: 4), HBV ayw 서브타입의 pre-S (서열번호: 5), HBV adw 서브타입의 pre-S (서열번호: 6), HBV adw2 서브타입의 pre-S 및 HBV adyw 서브타입의 pre-S로 이루어진 군 중에서 선택된 pre-S의 아미노산 서열의 15 및 123 번째에 위치하는 아스파라진 중 하나 이상이 각각 알라닌, 아르기닌, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는,재조합 HBV pre-S.
- 제14항의 형질전환체로부터 생산되는 재조합 HBV pre-S로서, HBV adr 서브타입의 pre-S (서열번호: 4), HBV ayw 서브타입의 pre-S (서열번호: 5), HBV adw 서브타입의 pre-S (서열번호: 6), HBV adw2 서브타입의 pre-S 및 HBV adyw 서브타입의 pre-S로 이루어진 군 중에서 선택된 천연형 HBV pre-S의 15 및 123번째 아미노산 중 하나가 N-당화되거나, 상기 15 및 123번째 아미노산이 모두 N-당화되지 않은 것을 특징으로 하는 재조합 HBV pre-S.
- 제 21항에 있어서, 상기 재조합 HBV pre-S는 글리코시데이즈로 더욱 처리된 것인 재조합 pre-S.
- HBV adr 서브타입의 pre-S (서열번호: 4), HBV ayw 서브타입의 pre-S (서열번호: 5), HBV adw 서브타입의 pre-S (서열번호: 6), HBV adw2 서브타입의 pre-S 및 HBV adyw 서브타입의 pre-S로 이루어진 군 중에서 선택된 천연형 HBV pre-S; 제1항 또는 제4항에 따른 변형된 HBV pre-S; 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 이들의 재조합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 보강제.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- HBV adr 서브타입의 pre-S (서열번호: 4), HBV ayw 서브타입의 pre-S (서열번호: 5), HBV adw 서브타입의 pre-S (서열번호: 6), HBV adw2 서브타입의 pre-S 및 HBV adyw 서브타입의 pre-S로 이루어진 군 중에서 선택된 천연형 HBV pre-S; 제1항 또는 제4항에 따른 변형된 B 형 간염 바이러스의 pre-S; 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 이들의 재조합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 HBV 백신.
- 제 27항에 있어서, 상기 HBV 백신은 HBV의 S 항원을 더욱 포함하는 것인 HBV 백신.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- HBV, HBV 표면 항원 또는 pre-S 유전자에 의해 번역되는 항원에 대한 항체 검출용 진단 조성물로서,상기 조성물은 HBV adr 서브타입의 pre-S (서열번호: 4), HBV ayw 서브타입의 pre-S (서열번호: 5), HBV adw 서브타입의 pre-S (서열번호: 6), HBV adw2 서브타입의 pre-S 및 HBV adyw 서브타입의 pre-S로 이루어진 군 중에서 선택된 천연형 HBV pre-S; 제1항 또는 제4항에 따른 변형된 B 형 간염 바이러스의 pre-S; 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 이들의 재조합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물.
- 삭제
- (a) 제 6항의 변이체 HBV pre-S 유전자를 벡터에 삽입하고;(b) 상기 pre-S 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포에 형질전환하고; 및(c) 형질전환체를 배지에서 배양하여 pre-S를 생산하는;것을 포함하는 HBV pre-S 생산방법.
- 삭제
- 제 23항에 있어서, 상기 보강제는 바이로스, 세균, 효모 또는 진균으로부터 유래된 항원에 대한 항체 반응성 증강에 적용되는 것인 면역 보강제.
- 제 38항에 있어서, 상기 바이러스는 HIV, HBV, HCV, 또는 로타바이러스인 면역 보강제.
- 제 23항에 있어서,상기 보강제는 포유류에 적용되며,상기 포유류는 사람, 가축동물, 실험용 동물, 가금 동물 및 포획한 야생 동물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 면역 보강제.
- 제 23항에 있어서,상기 보강제는 조류에 적용되며,상기 조류는 가금 조류인 것인 면역 보강제.
- 삭제
- 삭제
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