ES2315405T3 - Proteina pre-s del virus de la hepatitis b (vhb) como adyuvante y un componente de una vacuna frente a vhb. - Google Patents
Proteina pre-s del virus de la hepatitis b (vhb) como adyuvante y un componente de una vacuna frente a vhb. Download PDFInfo
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Abstract
Pre-S no glicosilada o parcialmente glicosilada del virus de la hepatitis B (VHB), en la que una o ambas asparaginas en las posiciones 15 y 123 de una pre-S de tipo natural están sustituidas por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, arginina, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
Description
Proteína pre-S del virus de la
hepatitis B (VHB) como adyuvante y un componente de una vacuna
frente a VHB.
La presente invención se refiere a una actividad
adyuvante de pre-S y al uso de pre-S
como componente de una vacuna frente a VHB. Más específicamente, se
refiere a la función de pre-S en la potenciación de
la inmunogenicidad de un antígeno S de VHB y a su uso como
componente de una vacuna frente a VHB profiláctica mejorada y de una
vacuna terapéutica para el tratamiento de portadores de VHB
crónicos.
El virus de la hepatitis B (denominado
"VHB" a continuación en el presente documento) se transmite
principalmente a través de actividades que implican el contacto con
sangre o fluidos derivados de la sangre y entonces se propaga a
otras células hepáticas a través de la sangre.
La mayoría de los individuos que tienen
infección por VHB se recuperan completamente de la infección por el
virus mediante las respuestas inmunitarias del organismo, pero
aproximadamente el 5% de ellos se convierten en portadores
crónicos. Esto empeora (por encima del 90%) en el caso en el que se
infectan lactantes a través de una madre portadora crónica o a
partir de otras fuentes durante el periodo perinatal. Además, la
infección a través de trasplante de órganos conduce a un estado
portador de casi el 100%. La mayoría de los pacientes mantienen una
condición de portador que no muestra síntomas graves, pero del 10 al
30% de estos pacientes experimentan hepatitis crónica, evolucionan
lentamente hacia cirrosis hepática y entonces finalmente desarrollan
un hepatocarcinoma.
Una vez que tiene lugar la infección por VHB,
evoluciona normalmente hacia hepatitis aguda y se producen
respuestas inmunitarias policlonales fuertes, que curan la
hepatitis de manera natural. La cura natural está asociada con
respuestas de linfocitos T citotóxicos ("LTC") multiespecíficos
y una respuesta inmunitaria humoral policlonal fuerte. Es decir, la
neutralización eficaz por anticuerpos específicos frente al virus y
la destrucción específica de las células infectadas por el virus
por LTC inducidos conducen a una recuperación satisfactoria de la
infección. En cambio, las personas que se convierten en portadores
crónicos muestran respuestas inmunitarias oligoclonales débiles.
También se observó un hallazgo similar a partir de un experimento
con ratones transgénicos infectados con VHB.
La forma infecciosa del VHB son partículas Dane
de cuarenta y dos nm presentes en los sueros de portadores
crónicos. Las otras partículas de 22 nm y formas con conformación de
bastón no son infecciosas. Cada partícula infecciosa está compuesta
por una envuelta, una cápsida (HBcAg), una ADN polimerasa específica
de virus y un ADN bicatenario circular de 32 Kb. Otra proteína
específica del virus, el antígeno e de VHB (HBeAg), se encuentra en
forma soluble en el suero.
Se preparan tres antígenos de superficie
diferentes a partir del gen de la envuelta. Son el antígeno de
superficie de hepatitis B grande (L-HBsAg), el
medio (M-HBsAg) y el antígeno pequeño
(S-HBsAg), que también se conoce como
antígeno-S. El antígeno grande se prepara a partir
del gen completo de la envuelta que abarca una secuencia de ADN de
las regiones pre-S1-, pre-S2- y S,
en tanto que el antígeno medio se deriva sólo de las regiones
pre-S2 y S mientras que el antígeno pequeño se
deriva sólo de la región S. Cuando se compara cuantitativamente la
composición de estos tres antígenos en las partículas de virus, el
S-HBsAg constituye la parte más grande, mientras
que el M-HBsAg y el L-HBsAg
constituyen sólo pequeñas partes, que comprenden sólo del 2 al 5% de
los antígenos totales de la envuelta.
Todas las vacunas comercialmente disponibles
frente a VHB, excepto una o dos, contienen el antígeno de superficie
pequeño de VHB (HBsAg). El antígeno S de VHB auténtico puede
recuperarse del plasma de un portador de VHB crónico como
partículas de aproximadamente 22 nm compuestas por dos proteínas
conocidas como P24 y su derivado glicosilado, GP28, ambas de las
cuales están codificadas por la secuencia codificante de 226
aminoácidos en el genoma de VHB conocida como la secuencia
codificante de la proteína S, o gen S de VHB. Sin embargo, tanto
experimentos en seres humanos como en animales han mostrado que la
parte de pre-S tiene una inmunigenicidad más fuerte
que el antígeno S, formando anticuerpos mucho más rápido que los
antígenos S (al menos 20 semanas más rápido que los antígenos S).
De hecho, estudios clínicos en seres humanos han mostrado que sólo
dos inyecciones con vacuna que contiene pre-S
podrían lograr el mismo nivel de protección que tres inyecciones con
vacuna sólo con antígeno S. Además, la vacuna que contenía
pre-S indujo respuestas de anticuerpos más
eficazmente para los pacientes que no respondían al tratamiento en
comparación con las vacunas sólo con antígeno S. También se sabe
que la proteína pre-S se une a las células hepáticas
en primer lugar durante la infección por el virus, actuando
probablemente como ligando del receptor del virus. Si esto es
cierto, los anticuerpos contra esta parte pueden evitar la
infección de nuevas células hepáticas así como neutralizar el
virus.
A pesar de estas posibilidades, no se ha
establecido la producción en masa de la proteína
pre-S, limitando su uso como vacuna. Cuando se
expresa el gen completo de la envuelta en células animales (por
ejemplo, células CHO), se expresan principalmente los antígenos S
de modo que el contenido en antígeno pre-S es tan
bajo como del 2 al 3%. La producción de antígenos a partir de
células animales no es rentable. Las partículas de virus
purificadas de los sueros de portadores crónicos del virus de la
hepatitis B contienen antígenos pre-S al menos del
5% del antígeno total, de modo que ésta tampoco es una forma eficaz
de producir antígenos para vacuna, por varias razones obvias.
Actualmente, se usan el interferón y la
lamivudina como tratamientos para portadores crónicos de VHB. La
eficacia del interferón para el tratamiento de portadores crónicos
de VHB oscila desde el 20 al 25%, y aproximadamente el 10% de los
tratados padecen efectos secundarios tan graves que debe detenerse
el tratamiento. El interferón también es caro y tiene el peligro de
provocar que vuelva a aparecer la hepatitis. Además, no es
conveniente porque puede requerirse hospitalización. La lamivudina
es un derivado de ácido nucleico que muestra una considerable
eficacia con del 40 al 70% de los pacientes con hepatitis aguda,
pero su uso se limita a pacientes con hepatitis crónica aguda.
Además, aparecen rápidamente virus que tienen resistencia a la
lamivudina, a la tasa de aproximadamente el 20 al 30% en el plazo
de un año y de aproximadamente el 40% en el plazo de dos años.
Por tanto, cuando esté disponible una vacuna
terapéutica eficaz, será rentable y conveniente de administrar. La
posibilidad de usar la vacuna preventiva actualmente disponible para
el tratamiento de portadores crónicos de VHB se ha sometido a
prueba en un ensayo clínico en seres humanos a pequeña escala. A
partir de este estudio, M. L. Michel et al (Vaccine 19,
2395-2399, 2001) demostraron la posibilidad de usar
una vacuna para el tratamiento de portadores crónicos de VHB, pero
su conclusión fue que se requiere una vacuna más fuerte con el fin
de tratar eficazmente. Otra observación interesante es que la vacuna
de Pasteur-Merieux que contiene antígeno
pre-S2 y S es ligeramente mejor que la que contiene
sólo el antígeno S. Este estudio también sugiere que la inclusión
de diversos antígenos, por ejemplo pre-S1,
pre-S2 y S, mejorará la vacuna y que una vacuna
terapéutica puede necesitar un adyuvante fuerte que pueda inducir
tanto inmunidad mediada por células como humoral fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un objeto de la invención proporcionar una
proteína pre-S que puede usarse como componente de
una vacuna frente a VHB y como adyuvante.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un vector recombinante que puede expresar eficazmente
el gen de pre-S de VHB en un sistema de expresión de
levadura.
Todavía otro objeto de la presente invención es
proporcionar un transformante que secreta la proteína
pre-S de VHB en el medio de cultivo.
Todavía un objeto adicional de la presente
invención es proporcionar una formulación de una vacuna preventiva
y terapéutica que incluye la proteína pre-S
recombinante.
Todavía un objeto adicional de la presente
invención es proporcionar un reactivo de diagnóstico que puede
detectar anticuerpos contra VHB en sueros humanos o animales.
Con el fin de lograr estos objetos, la presente
invención proporciona una pre-S modificada de VHB
que o bien no está glicosilada o bien está parcialmente
glicosilada. La pre-S modificada incluye una
pre-S mutante en la que una o ambas asparaginas de
la pre-S de tipo natural en las posiciones de
aminoácido 15 o 123 está(n) sustituida(s) por cualquier
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, arginina,
cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina,
isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina,
serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
La presente invención también proporciona un gen
de pre-S mutado que codifica para una
pre-S modificada de VHB de la presente
invención.
La presente invención también proporciona un
vector recombinante que comprende:
- (a)
- un promotor
- (b)
- un gen de pre-S mutante de VHB; y
- (c)
- un factor de terminación transcripcional.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
transformante generado introduciendo el vector recombinante de la
presente invención.
La presente invención también proporciona un
adyuvante que comprende una pre-S de VHB. La
pre-S puede prepararse como una proteína
pre-S recombinante producida a partir del
transformante.
La presente invención también proporciona una
vacuna frente al virus de la hepatitis B que comprende la
pre-S modificada.
La presente invención también proporciona una
composición de diagnóstico para detectar anticuerpos contra el
virus de la hepatitis B, antígenos de superficie del virus de la
hepatitis B o antígenos codificados por la pre-S,
en la que la composición de diagnóstico comprende una
pre-S modificada del virus de la hepatitis B.
La presente invención proporciona también un
método de producción de pre-S de VHB, que
comprende:
(a) insertar el gen que codifica para la
pre-S modificada en un vector;
(b) transfectar el vector que alberga el gen de
pre-S en una célula huésped; y
(c) producir la pre-S cultivando
un transformante en un medio.
La presente invención también proporciona un
método de potenciación de una respuesta de anticuerpos frente a un
antígeno derivado de VHB, en el que el método comprende administrar
una cantidad eficaz potenciadora de anticuerpos de un adyuvante de
la presente invención a un mamífero o un ave.
La presente invención también proporciona el uso
de una pre-S modificada de VHB para preparar una
vacuna para generar inmunidad para el VHB.
La figura 1 es un diagrama del vector
pIL20-pre-S según la presente
invención;
la figura 2 muestra la verificación de la
proteína pre-S recombinante mediante análisis de
SDS-PAGE e inmutransferencia de tipo Western
llevados a cabo sobre el medio de cultivo de Saccharomyces
cerevisiae 2805/pIL20-pre S usando anticuerpos
monoclonales anti-pre-S;
la figura 3 muestra la verificación de la
proteína pre-S recombinante mediante análisis de
SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western
llevados a cabo sobre el medio de cultivo de Saccharomyces
cerevisiae 2805/pIL20-pre S (dm) usando
anticuerpos monoclonales
anti-pre-S;
la figura 4 muestra los análisis de
SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western de la
proteína pre-S recombinante purificada según la
presente invención;
la figura 5 muestra los análisis de
SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western de la
proteína pre-S recombinante (forma glicosilada y no
glicosilada) purificada según la presente invención;
la figura 6 es una gráfica que muestra la
proteína pre-S recombinante analizada mediante
HPLC;
la figura 7 muestra un resultado de la medición
de la inmunogenicidad en ratones con la vacuna frente al virus de
la hepatitis B según la presente invención;
la figura 8 muestra un resultado de la medición
de la inmunogenicidad en una rata con la vacuna frente al virus de
la hepatitis B según la presente invención;
la figura 9 muestra un resultado de la medición
de la inmunogenicidad en un conejo con la vacuna frente al virus de
la hepatitis B según la presente invención;
la figura 10 muestra un resultado de la medición
de las respuestas inmunitarias contra el antígeno S en ratones a
los que se les inyectó el antígeno S y la proteína
pre-S del VHB según la presente invención;
la figura 11 muestra un resultado de la medición
de subtipos de IgG contra el antígeno S en ratones a los que se les
inyectó el antígeno S y una proteína pre-S del VHB
según la presente invención; y
la figura 12 muestra un resultado de la
detección de anticuerpos frente a VHB usando una
pre-S recombinante según la presente invención.
El término "gen de pre-S"
tal como se usa en el presente documento se refiere a un
polinucleótido que consiste en un gen de pre-S1 de
VHB y un gen de pre-S2 de VHB, y
"pre-S" se refiere a la proteína codificada por
el gen de pre-S. El término "antígeno S" se
refiere a un polipéptido codificado por la región S de un genoma de
VHB.
El término "VHB" significa cualquier
subtipo del virus, particularmente adw, ayw, adr, ayr y así
sucesivamente. El gen de pre-S en esta invención es
preferiblemente un gen de pre-S de todos los
subtipos del virus de la hepatitis B, más preferiblemente un
subtipo adr (SEQ ID NO: 1), un subtipo ayw (SEQ ID NO: 2), un
subtipo adw (SEQ ID NO: 3), un subtipo adw2 y un subtipo adyw, y lo
más preferiblemente un gen de pre-S de un subtipo
adr y un gen de pre-S de un subtipo ayw.
La pre-S de la presente
invención está parcialmente glicosilada, o no está glicosilada. La
pre-S parcialmente o no glicosilada es una
pre-S modificada producida a partir de una célula
transformada con un gen que codifica para una pre-S
mutante. También la pre-S no glicosilada puede
sintetizarse ensamblando aminoácidos individuales por medios
químicos.
La pre-S producida a partir de
Saccharomyces está N-glicosilada en las
asparaginas en las posiciones de aminoácido 15 y 123. Por tanto, la
presente invención proporciona una pre-S mutante que
se genera sustituyendo la(s) asparagina(s)
en la posición de aminoácido 15 ó 123 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en alanina, arginina, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Un aminoácido más preferible es histidina o glutamina.
en la posición de aminoácido 15 ó 123 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en alanina, arginina, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Un aminoácido más preferible es histidina o glutamina.
Una pre-S mutante preferida
incluye:
(1) Pre-S-15m
(SEQ ID NO: 9), en la que la asparagina en la posición de aminoácido
15 de la pre-S de tipo natural se sustituye por
histidina;
(2) Pre-S-123m
(SEQ ID NO: 10), en la que la asparagina en la posición de
aminoácido 123 de la pre-S de tipo natural se
sustituye por histidina; y
(3) Pre-S-dm
(SEQ ID NO: 11), en la que ambas asparaginas en las posiciones de
aminoácido 15 y 123 de la pre-S de tipo natural se
sustituyen por histidinas.
\vskip1.000000\baselineskip
La pre-S mutante de la presente
invención puede glicosilarse parcialmente cuando se produce la
pre-S mediante vectores de expresión.
La presente invención proporciona un gen de
pre-S mutada que codifica para la
pre-S mutante de la presente invención. El gen de
pre-S mutada tiene una secuencia de polinucleótido
mutada que abarca las regiones codificantes de
pre-S1 y pre-S2 enteras. El gen de
pre-S mutada codifica para pre-S que
está parcialmente glicosilada o no glicosilada.
La presente invención también proporciona un
vector recombinante que incluye un promotor, un gen de
pre-S y un terminador de la transcripción. El gen
de pre-S es preferiblemente un gen de
pre-S de tipo natural o un gen de
pre-S mutada. El vector recombinante se usa
preferiblemente para la transformación de una célula huésped para
construir un transformante que produce pre-S.
Ejemplos del vector recombinante son
pIL20-pre-S (adr) y
pIL20-pre-S (ayw). El vector
recombinante pIL20-pre-S (adr)
incluye un gen de pre-S del subtipo adr, y
pIL20-pre-S (ayw) incluye un gen de
pre-S del subtipo ayw de VHB. Se muestra un mapa del
vector pIL20-pre-S en la figura 1.
Se muestra la construcción específica del vector
pIL20-pre-S en la siguiente tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Además, la presente invención proporciona un
transformante que produce una pre-S de tipo natural
de VHB o una pre-S mutante. El transformante se
prepara transfectando el vector recombinante que incluye el gen de
pre-S de VHB en una célula huésped. La célula
huésped es preferiblemente una levadura y se selecciona más
preferiblemente del grupo que consiste en Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris y Yarrowia lipolytica.
Los transformantes más preferidos son Saccharomyces
cerevisiae 2805/pIL20-pre-S
(adr), Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (ayw) o
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-dm. El
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (adr) produce la
pre-S de tipo natural de SEQ ID NO: 4 y
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (ayw) produce la
pre-S de tipo natural de SEQ ID NO: 5.
Los transformantes pueden cultivarse a 30ºC
durante 24 horas usando un cultivo de fermentación discontinuo
secuencial (1% de extracto de levaduras, 2% de peptona, 2% de
dextrosa).
Además, la presente invención proporciona una
pre-S recombinante producida a partir de los
transformantes. Para producir la pre-S
recombinante, los transformantes pueden cultivarse a 30ºC durante de
24 a 48 horas en un medio de cultivo de alimentación discontinua
(1% de extracto de levaduras, 2% de peptona) que contiene un 2% de
galactosa como fuente de carbono. La pre-S
recombinante producida se secreta en el medio de cultivo a hasta
850 mg de pre-S recombinante por litro de medio de
cultivo.
La pre-S recombinante puede
purificarse eliminando la célula de levadura del medio de cultivo,
concentrando el medio de cultivo libre de células, dializando
mediante el uso de una membrana ultrafina y separando mediante
intercambio iónico y con columnas de separación por tamaño
molecular.
Ejemplos de la pre-S
recombinante son una proteína de SEQ ID NO: 4, una proteína de SEQ
ID NO: 5, una proteína de SEQ ID NO: 6, una
pre-S-15m de SEQ ID NO: 9, una
pre-S-123m de SEQ ID NO: 10 y una
pre-S-dm de SEQ ID NO: 11.
La pre-S recombinante de la
invención está parcialmente glicosilada o no glicosilada. La
pre-S recombinante parcialmente glicosilada puede
digerirse con glicosidasa para obtener de ese modo la
pre-S no glicosilada.
La presente invención también incluye el uso de
la pre-S de la invención como adyuvante. El
adyuvante puede usarse para potenciar una respuesta inmunitaria
contra un antígeno. Los antígenos son los derivados de parásitos u
otros agentes patógenos, que infectan animales o aves, y más
particularmente, seres humanos o ganado. Ejemplos de parásitos y
agentes patógenos son organismos procariotas; virus incluyendo VIH,
VHB, VHC y rotavirus; y organismos eucariotas tales como levaduras
y hongos, protozoos, metazoos y amebas.
El adyuvante contiene la pre-S o
la pre-S recombinante de la presente invención, es
decir, una pre-S parcialmente glicosilada o una
pre-S no glicosilada.
La presente invención proporciona el uso de la
pre-S de la invención, para preparar un adyuvante
que potencia una respuesta inmunitaria frente a un antígeno
derivado de VHB administrando una cantidad eficaz potenciadora de
anticuerpos del adyuvante a seres humanos, mamíferos o aves. Los
mamíferos incluyen animales de ganado, animales de laboratorio,
animales domésticos y animales salvajes cautivos; y las aves
incluyen pollos o cualquier otra ave doméstica o salvaje.
Además, la presente invención proporciona una
vacuna que puede prevenir la infección por VHB o tratar a portadores
crónicos de VHB. La vacuna frente a VHB contiene la
pre-S o la pre-S recombinante de la
presente invención, y contiene además el antígeno S. La vacuna que
incluye la pre-S y el antígeno S puede prevenir y
tratar eficazmente la hepatitis aguda o la hepatitis crónica
provocada por el VHB. La vacuna frente al VHB puede incluir
antígenos S y pre-S a una razón en peso que oscila
desde 10:1 hasta 1:10.
La vacuna frente a VHB puede prepararse mediante
el método común de preparación de vacunas, y puede incluir
adicionalmente un adyuvante o una o más composiciones farmacológicas
aceptables. Las composiciones farmacológicas son vehículos o
diluyentes. Ejemplos del vehículo o los diluyentes son solución
salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol y
etanol, pero no se limitan a las mismas. Un ejemplo del adyuvante es
hidróxido de aluminio, y el adyuvante usado puede ser uno cualquiera
disponible.
La vacuna frente a VHB de la presente invención
puede administrarse por vía oral o por vía parenteral, usándose
preferiblemente en forma inyectable, y la vacuna puede estar en
forma de suspensión o disolución. La dosificación de la vacuna
frente a VHB es una usada comúnmente para vacunación usando la
vacuna frente a VHB general y es deseable que se aplique la
dosificación exacta de manera diferente, dependiendo del estado,
peso y edad de los pacientes, etc.
La vacuna frente a VHB de la presente invención
puede usarse para generar inmunidad frente a VHB.
Además, la presente invención proporciona una
composición de diagnóstico que puede determinar la formación de
anticuerpos contra VHB y detectar anticuerpos contra VHB, antígenos
de superficie de VHB o antígenos codificados por el gen de
pre-S. La composición de diagnóstico contiene la
pre-S de la presente invención como el antígeno de
captura de anticuerpos específicos frente al VHB para el método de
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ("ELISA") o para
diversos formatos de pruebas de centro de atención.
A continuación en el presente documento, se
proporcionan ejemplos preferidos para ayudar a entender la presente
invención. Sin embargo, los siguientes ejemplos son sólo para el fin
de facilitar el entendimiento de la invención y no deben
interpretarse como limitativos en ningún sentido.
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura del vector recombinante se ilustra
esquemáticamente en la figura 1.
Para clonar el gen de pre-S, se
seleccionó VHB 315 variante coreana (número de registro de la
secuencia de bases AF286594) como el tipo principal entre los
subtipos adr del virus de la hepatitis B y se amplificó el gen de
pre-S mediante el método de PCR. Los cebadores
usados fueron un cebador con sentido de SEQ ID NO: 7 y un cebador
antisentido de SEQ ID NO: 8. El cebador con sentido se une en la
posición 2848 del gen de VHB e incluye los sitios de restricción KEX
2 y XbaI. Además, el cebador antisentido es específico en la
posición 130, e incluye un codón terminal (TAG) y un sitio de
restricción BamHI.
Se llevó a cabo la PCR a lo largo de treinta
ciclos en la condición de desnaturalización (94ºC, 1 min.),
hibridación (45ºC, 1 min.) y polimerización (72ºC, 1 min.), dando
como resultado un producto de PCR de 522 pb de SEQ ID NO: 1. Se
digirió el producto de PCR con las enzimas de restricción
XbaI y BamHI, haciéndolo con extremos cohesivos. Se
insertó el producto de PCR en el vector pIL20 digerido con las
mismas enzimas, y se construyó
pIL20-pre-S (adr).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el subtipo ayw de VHB (número de registro
X02496) como molde y se construyó un vector
pIL20-pre-S (ayw).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformó el vector
pIL20-pre-S (adr) o el vector
pIL20-pre-S (ayw) en levadura
(Saccharomyces cerevisiae 2805) mediante un método de
transformación convencional. El S. cerevisiae 2805 es un
huésped ura^{-} que tiene el genotipo
Matapep4::HIS3prb1-1.6Rcan1GAL2his3-200ura3-52.
Se seleccionó el
transformante/pIL20-pre-S (adr) o
/pIL20-pre-S (ayw) cultivando en un
medio de selección ura^{-}, ade^{-} y trp^{-}
(CAA-glucosa).
La levadura transformada mediante el vector
pIL20-pre-S (adr) se denominó
Saccharomyces cerevisiae
2805/
pIL20-pre-S (adr) y se depositó el 16 de abril de 2001 en la Colección Coreana de Cultivos Tipo ("KCTC"), que es una autoridad de depósito internacional, como KCTC 0987BP. La levadura transformada mediante el vector pIL20-pre-S (ayw) se denominó Saccharomyces cerevisiae 2805/pIL20pre-S (ayw) y se depositó el 8 de mayo de 2001 en la Colección Coreana de Cultivos Tipo ("KCTC") como KCTC 1004BP.
pIL20-pre-S (adr) y se depositó el 16 de abril de 2001 en la Colección Coreana de Cultivos Tipo ("KCTC"), que es una autoridad de depósito internacional, como KCTC 0987BP. La levadura transformada mediante el vector pIL20-pre-S (ayw) se denominó Saccharomyces cerevisiae 2805/pIL20pre-S (ayw) y se depositó el 8 de mayo de 2001 en la Colección Coreana de Cultivos Tipo ("KCTC") como KCTC 1004BP.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aumentar la inmunogenicidad de la
pre-S recombinante, se mutaron los sitios de
glicosilación de la región pre-S (aminoácidos
asparagina 15 y 123) a histidina o glutamina mediante mutagénesis
dirigida al sitio usando el plásmido
pIL20-pre-S como molde.
El codón de nucleótidos AAT que codifica para
asparagina en el aminoácido número 15 se mutó al codón CAC que
codifica para histidina y se construyó el plásmido
pIL20-pre-S (15m). El codón de
nucleótidos AAC que codifica para asparagina en el aminoácido 123
se mutó al codón CAC que codifica para histidina y se construyó el
plásmido pIL20-pre-S (123m). Ambos
codones que codificaban para asparagina en el aminoácido número 15 y
número 123 se mutaron al codón de nucleótidos CAC que codifica para
histidina y se construyó el plásmido mutante doble
pIL20-pre-S (dm).
Se usó de nuevo el
pIL20-pre-S (15m),
pIL20-pre-S (123m) o
pIL20-pre-S (dm) para transformar
levadura, Saccharomyces cerevisiae 2805. A través del mismo
procedimiento de selección descrito anteriormente, se seleccionó la
colonia que tenía la tasa de expresión más alta de la proteína
recombinante como línea celular para la producción para establecer
un banco de células maestras.
Los transformantes Saccharomyces
cerevisiae 2805/pIL20-pre-S
(adr), Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (ayw) y
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (dm) se cultivaron
respectivamente en un cultivo de fermentación discontinuo
secuencial (1% de extracto de levaduras, 2% de peptona, 2% de
glucosa) a 30ºC durante aproximadamente 24 horas. Cuando el nivel
de DO a 600 nm alcanzó de 20 a 30, se añadió lentamente un medio de
cultivo de alimentación discontinua (1% de extracto de levaduras, 2%
de peptona) que contenía un 2% de galactosa, que es un inductor de
la expresión del gen de pre-S y la única fuente de
carbono en el medio de inducción y entonces se continuó el cultivo
durante aproximadamente 24 horas para inducir la expresión de la
pre-S.
Se sometieron de 20 a 30 \mul del medio de
cultivo a un análisis de SDS-PAGE y se llevó a cabo
un análisis de inmunotransferencia de tipo Western con un
anticuerpo monoclonal anti-pre-S
específico frente a pre-S para confirmar la
expresión de la pre-S.
La figura 2a es una fotografía de un análisis de
SDS-PAGE del medio de cultivo, que verifica la
pre-S expresada en Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S y la figura 2b
muestra un resultado del análisis de inmunotransferencia de tipo
Western del gel de electroforesis mostrado en la figura 2a. Los
carriles 1 y 2 de la figura 2 indican el tamaño de los marcadores
de proteína, el carril 3 es el medio de cultivo de Saccharomyces
cerevisiae 2805 transformada con el vector pIL20 sin el gen de
pre-S, los carriles 4 y 5 son el medio de cultivo de
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (adr) y los
carriles 6 y 7 son el medio de cultivo de Saccharomyces
cerevisiae 2805/pIL20-pre-S
(ayw). La pre-S recombinante expresada a partir del
transformante está ampliamente glicosilada de modo que el análisis
de SDS-PAGE muestra una banda amplia con un tamaño
molecular que oscila desde 150 hasta 250 kDa.
Las figuras 3a y 3b muestran análisis de
SDS-PAGE (a) e inmunotransferencia de tipo Western
(b) realizados sobre el medio de cultivo de Saccharomyces
cerevisiae 2805/pIL20-pre-S (dm)
usando un anticuerpo monoclonal
anti-pre-S. El carril 1 es un
marcador de tamaño de proteína, el carril 2 es una
pre-S de tipo natural y el carril 3 es un medio de
cultivo de Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (dm). La
pre-S mutante recombinante,
Pre-S-dm expresada a partir de
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (dm) estaba
parcialmente glicosilada y mostraba un tamaño molecular de
aproximadamente 50 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó la levadura recombinante que produce
PRE-S en un recipiente de fermentación de 10 l. Se
establecieron cultivos simientes en un medio de cultivo básico
(0,6% de ácido casamino, 2% de glucosa, 1x base de nitrógeno de
levaduras) usando frascos de 25 ml y 500 ml.
Se verificó el agotamiento de la glucosa con un
kit de ensayo de glucosa mientras se cultivaba durante 36 horas en
un cultivo de fermentación de alimentación discontinua. Entonces, se
añadió lentamente el medio (1% de extracto de levaduras, 2% de
peptona, 2% de galactosa) y se cultivó durante 36 horas para inducir
la expresión de la pre-S. La densidad de la célula
era un nivel de DO de aproximadamente 50 a 600 nm y la concentración
de la pre-S estaba entre 50 y 60 mg/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Se secretó la pre-S recombinante
expresada en la levadura transformada en el medio de cultivo. Se
eliminaron las células del medio de cultivo mediante centrifugación
y entonces la disolución de cultivo se filtró de manera fina varias
veces a través de una membrana Durapore con un tamaño de 0,45
\mum.
Se sometió la disolución de cultivo anterior a
ultrafiltración y diafiltración a través de un filtro ultrafino con
un valor de punto de corte de peso molecular de 30 kDa.
Se cargó el filtrado sobre la columna
SP-sepharose FF equilibrada con 25 mM de una
disolución de tampón acetato (pH 4,5) y se lavó la columna con la
misma disolución tampón eluyendo con un gradiente de concentración
de cloruro de sodio (NaCl 0,2 M).
Se concentraron de nuevo los eluyentes separados
mediante la cromatografía de intercambio iónico anterior a través
del filtro ultrafino y entonces se cargaron sobre una columna de
filtración en gel sephacryl S-300 (o
S-200). Entonces, se hizo pasar la solución salina
tamponada con fosfato (PBS, pH 7,0) a través de la columna para
eluir la pre-S.
Entre las fracciones eluidas, se agruparon las
fracciones que contenían la pre-S recombinante [Kav
= 0,440-0,475, Kav =
Ve-Vo/Vt-Vo, Ve: volumen eluido de
la proteína, Vo: volumen eluido de azul dextrano, Vt: volumen total
de la columna] y se hicieron pasar a través de un filtro de 0,22 mm,
y entonces se congelaron en un congelador.
La siguiente tabla 2 muestra el rendimiento de
purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 4a a 4d muestran análisis de
SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western de
muestras purificadas a partir de cada etapa del procedimiento de
purificación. La figura 4a muestra un análisis de
SDS-PAGE realizado en medio de cultivo de
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (adr) y 4b es el
análisis de inmunotransferencia de tipo Western del mismo. La
figura 4c es un análisis de SDS-PAGE y la 4d es un
análisis de inmunotransferencia de tipo Western realizado sobre
medio de cultivo de Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (dm). En las
figuras 4a y 4b, el carril 1 es un medio de cultivo, el carril 2 es
una muestra purificada en la fase de filtración, el carril 3 es una
muestra purificada en la fase de cromatografía de intercambio iónico
(Sp-Sepharose), el carril 4 es una muestra
purificada en la fase de separación diferencial por tamaño (S300) y
el carril 5 es un marcador de tamaño. En las figuras 4c y 4d, el
carril 1 es un medio de cultivo, el carril 2 es una muestra
purificada en la fase de filtración, el carril 3 es una muestra
purificada en la fase de cromatografía de intercambio iónico
(Sp-Sepharose), el carril 4 es una muestra
purificada en la fase de cromatografía de intercambio iónico
(Q-Sepharose), el carril 5 es una muestra purificada
en la fase de separación diferencial por tamaño (S200) y el carril 6
es un marcador de tamaño.
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (adr) expresó una
pre-S recombinante hiperglicosilada y
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (dm) expresó una
pre-S-dm parcialmente glicosilada.
Por tanto, puede obtenerse una pre-S recombinante
con un alto grado de pureza a través del procedimiento de
purificación.
Para averiguar si la pre-S
recombinante estaba o no glicosilada, se digirió la
pre-S recombinante producida por Saccharomyces
cerevisiae 2805/pIL20-pre-S
(adr) con N-glucosidasa F (Calbiochem), y se realizó
un análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
Las figuras 5a y 5b muestran análisis de
SDS-PAGE (a) e inmunotransferencia de tipo Western
(b) de la pre-S recombinante purificada según la
presente invención. El carril 1 es la pre-S
recombinante purificada y el carril 2 es la pre-S
recombinante tratada con N-glucosidasa F. Tras
eliminar el resto glicosilo, se observó que el peso molecular de la
pre-S recombinante era aproximadamente de 20
kDa.
Para verificar la pureza de la
pre-S recombinante del ejemplo 3, se llevó a cabo un
análisis de HPLC. Como columna, se usó TSK G3000SW y la velocidad
de flujo era de 1 ml/min en el PBS y se detectó a 214 nm.
La figura 6 muestra el diagrama de HPLC de la
pre-S recombinante. Un único pico en la gráfica
confirma la alta pureza de la pre-S recombinante, y
no hay indicación de contaminación con ningún otro material.
Además, se analizó la secuencia de aminoácidos
N-terminal de la pre-S recombinante
purificada en el ejemplo 3 anterior en un sistema de análisis de
secuencia de proteína (Procise cLC 492, Applied Biosystems), y se
comparó con la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la
secuencia del gen de pre-S.
La tabla 3 muestra una secuencia de aminoácidos
de pre-S recombinante y la secuencia de aminoácidos
deducida a partir de la secuencia de bases del gen de
pre-S gene. "ND" en la tabla 3 significa "no
determinado". Se corresponden perfectamente, excepto por
una.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la reactividad
antígeno-anticuerpo específica de la
pre-S recombinante. Se digirió la
pre-S recombinante producida mediante
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (adr) con
N-glucosidasa F (Calbiochem) y se realizó un
análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
La pre-S recombinante que se
hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal
anti-pre-S2 mostró un tamaño que
oscilaba desde 150 hasta 250 kDa; y se mostró a aproximadamente 20
kDa tras la eliminación del resto de glucosa. Por tanto, la
pre-S recombinante mantiene la especificidad de la
reactividad antígeno-anticuerpo independientemente
de la glicosilación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se absorbieron 10 \mug de la
pre-S recombinante del ejemplo 3 en 0,8 mg de
hidróxido de aluminio para formular una vacuna. Es posible absorber
hasta 20 \mug de pre-S con 0,8 mg de alumbre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron 5-20 \mug de la
pre-S recombinante del ejemplo 3 para la formulación
de vacuna.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron 1-200 \mug de la
pre-S recombinante con adyuvante completo de Freud
(CFA) para preparar inmunógeno para las pruebas de
inmunogenicidad.
Se inyectaron por vía intramuscular 10 \mug de
pre-S preparada mediante los ejemplos 6, 7, y 8 a
cada ratón Balb-c a intervalos de 0, 2 y 4 semanas.
30 días tras la primera inyección, se extrajo sangre para observar
la formación de anticuerpos contra la
anti-pre-S recombinante mediante el
método de ELISA.
La figura 7 muestra los resultados de la
medición de la inmunogenicidad en ratones con la
pre-S recombinante de VHB. \ding{108} es un
título de anticuerpo inducido por la vacuna del ejemplo 6,
\bigcirc es un título de anticuerpo inducido por la vacuna del
ejemplo 7 y \ding{116} es un título de anticuerpo inducido por la
vacuna del ejemplo 8. Tal como se muestra en la figura 7, se
inmunizaron ratones con la pre-S recombinante sola
o mediante inyección conjunta con un adyuvante, y la vacuna del
ejemplo 8 muestra una inmunogenicidad sustancialmente aumentada
cuando se compara con las vacunas de los ejemplos 6 y 7.
Se examinaron la vacuna del ejemplo 6 y una
vacuna formulada mediante PAMIII, un lipopéptido que se ha
comprobado que es dañino para el cuerpo humano, para determinar la
inmunogenicidad en ratas.
Se usó la vacuna del ejemplo 8 como control
positivo y se usó una composición sin la pre-S
recombinante como control negativo.
Se inyectaron por vía intramuscular 20 \mug de
vacunas (vacuna del ejemplo 6, vacuna formulada mediante PAMIII,
control positivo y control negativo) en ratas Sprague Dawley a
intervalos de 0, 2, y 4 semanas respectivamente. 30 días tras la
primera inyección, se sometieron a prueba anticuerpos frente a
pre-S en sueros de ratas inmunizadas con las
vacunas mediante el método de ELISA.
La figura 8 muestra resultados de la medición de
la inmunogenicidad en ratas con la pre-S
recombinante de VHB. \ding{108} es un título de anticuerpo
inducido por la vacuna del ejemplo 6, \bigcirc es un título de
anticuerpo inducido por el control positivo, \ding{116} es un
título de anticuerpo inducido por la vacuna formulada con PAMIII y
\nabla es un título de anticuerpo inducido por el control
negativo. Tal como puede observarse en la figura 8, la vacuna del
ejemplo 6 y la vacuna formulada con PAMIII indujeron una respuesta
inmunitaria contra pre-S en ratas. Además, el
lipopéptido PAMIII también indujo anticuerpos contra los antígenos
pre-S, lo que muestra el potencial de su uso como
agente de soporte inmunitario.
Para observar la inmunogenicidad de la
pre-S recombinante, se inyectaron por vía
intramuscular 100 \mug de la pre-S recombinante
junto con adyuvante completo de Freund tres veces en conejos a
intervalos de 0, 2 y 6 semanas. Diez días tras la inyección final,
se extrajo sangre y se separó el suero para evaluar el título de
anticuerpo específico frente a pre-S, mediante el
método de ELISA.
La figura 9 muestra un resultado de la medición
de la inmunogenicidad en conejos con la pre-S
recombinante de VHB. \ding{108} es un suero de conejo normal,
\bigcirc es un suero de conejo inmunizado nº 1 y \ding{116} es
un suero de conejo inmunizado nº 2.
La pre-S recombinante mostró un
alto título de anticuerpo en conejos.
De manera similar, se sometió a prueba la
inmunogenicidad de otra pre-S modificada, dos
mutantes únicos (pre-S-1 y
pre-S-123m), un mutante doble
(pre-S-dm) y un mutante doble ligado
a la secuencia del toxoide del tétanos, en ratones Balb/c y ratones
ICR. Todas fueron sumamente inmunogénicas con adyuvante completo de
Freund, pero los títulos de anticuerpo fueron muy bajos con
hidróxido de aluminio como adyuvante.
Se usó la pre-S recombinante
modificada para potenciar la respuesta inmunitaria.
Cuando una mezcla (denominada
"LPVac-VHB" a continuación en el presente
documento) de la pre-S recombinante modificada
(Pre-S-dm) y el antígeno S se
adsorbe en hidróxido de aluminio (alumbre) y se administra mediante
inyección intraperitoneal, se aumentó la inmunogenicidad de
LPVac-VHB varias veces con respecto al antígeno S
("HBsAg") solo (figura 10).
Se obtuvieron los sueros a partir de ratones
inmunizados contra a LPVac-VHB o HBsAg, y también se
determinaron los subtipos de IgG (figura 11). Se aumentó la IgG2a
en aproximadamente 10 veces con respecto al antígeno S solo.
Además, pudo incluirse la pre-S
en una formulación de vacuna preventiva para mejorar la calidad
global de vacunas actualmente disponibles que contienen sólo
antígeno S y en la formulación de vacuna terapéutica.
Se inyectó por vía abdominal la vacuna del
ejemplo 6 a ratones ICR a 0, 0,125, 0,25, 0,5, 1 y 2 mg/kg (peso
corporal). Se observaron el peso corporal, los síntomas clínicos y
los hallazgos patológicos del grupo de prueba y se compararon con
el grupo control negativo al que no se le inyectó la vacuna.
En este experimento, no se observaron síntomas
inusuales. Ninguno de los ratones murió incluso con la dosificación
máxima (2 mg/kg); por tanto, no pudo determinarse la DL_{50}. Por
tanto, puede observarse que la vacuna del ejemplo 6 no tuvo
toxicidad aguda para los ratones.
Se inyectó por vía hipodérmica la vacuna del
ejemplo 6 a 0, 50, 100 y 200 \mug/kg (peso corporal) cinco veces
por semana a ratas Sprague Dawley, luego se observaron los cambios.
En comparación con el grupo control al que no se le inyectó la
vacuna, las ratas SD inmunizadas con la vacuna del ejemplo 6 no
mostraron ningún cambio en el peso corporal, los síntomas clínicos
o la patología.
Se eliminó el pelaje de conejos blancos Nueva
Zelanda en el tamaño de 2,5 cm x 2,5 cm, a uno de los cuales se le
extrajo la capa córnea de la epidermis con una aguja para inyección
hipodérmica y al resto se le dejó intacta. Se impregnaron 0,5 mg de
la vacuna del ejemplo 6 en gasa médica y entonces se colocaron en
ambas zonas hasta cubrirlas. Se trató el grupo control con PBS
mediante el mismo procedimiento. Tras el contacto con la piel
durante 24, 48 y 72 horas, se observaron las partes tratadas según
el sistema de puntuación Draize para determinar la seguridad de la
medicación.
En comparación con el grupo control, la piel de
los conejos blancos Nueva Zelanda tratados con la vacuna de
pre-S recombinante no mostró cambios clínicos tales
como eritemas, escaras y edemas.
Se sometió a prueba el uso de la
pre-S recombinante del ejemplo 3 como antígeno de
captura de anticuerpos
anti-pre-S.
Se recubrieron placas de noventa y seis pocillos
(Nunc Maxicorp) con 50 ng/pocillo de pre-S, según un
método convencional. Se lavaron las placas recubiertas tres veces
con PBST (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM,
KH_{2}PO_{4} 2 mM) y entonces se añadieron 100 \mul de
albúmina sérica bovina al 1% ("BSA") a cada pocillo para
bloquear los sitios de unión de antígeno restantes en la placa. Tras
una hora de incubación a 37ºC, se lavaron las placas con PBS y se
almacenaron a 4ºC hasta su uso.
En este ensayo, se usaron anticuerpos
anti-pre-S2 preparados a partir de
suero de ratones o humano con el título de anticuerpo determinado
como controles positivos y el control negativo era PBS. El volumen
de reacción de cada pocillo era de 100 \mul, y experimentaron
reacción durante 90 minutos a 37ºC. De la misma manera, se
sometieron a ensayo 100 \mul de cada suero humano y suero humano
diluido en serie para determinar anticuerpos
anti-pre-S. Se añadió IgG de cabra
anti-ratón o IgG de cabra anti-ser
humano conjugada con peroxidada de rábano ("HRP") como
anticuerpo secundario y luego fenilendiamina ("OPD") como
sustrato para desarrollar color, a temperatura ambiente. Tras
detener la reacción de coloración con HCl 3 M, se midió el nivel de
DO a 492 nm.
La figura 12 muestra que la
pre-S recombinante pudo capturar el anticuerpo
anti-pre-S en el suero humano
positivo para VHB hasta el mismo grado que el control positivo (por
ejemplo, anticuerpo monoclonal frente a pre-S2).
Por tanto, la pre-S recombinante puede usarse para
desarrollar un kit de diagnóstico para detectar los anticuerpos
específicos frente a VHB a partir de la muestra clínica.
<110> Dobeel Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNA PRE-S DEL
VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB) COMO ADYUVANTE Y UN COMPONENTE DE UNA
VACUNA FRENTE AL VHB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR
10-2001-29002
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
25-05-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gen de pre-S de VHB
(subtipo adr)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gen de pre-S de VHB
(subtipo ayw)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gen de pre-S de VHB
(subtipo adw)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína pre-S de
VHB (subtipo adr)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína pre-S de
VHB (subtipo ayw)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína pre-S de
VHB (subtipo adw)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína
pre-S-15m
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína
pre-S-123m
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína
pre-S-dm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (20)
1. Pre-S no glicosilada o
parcialmente glicosilada del virus de la hepatitis B (VHB), en la
que una o ambas asparaginas en las posiciones 15 y 123 de una
pre-S de tipo natural están sustituidas por un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina,
arginina, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina,
isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina,
serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
2. Pre-S de VHB según la
reivindicación 1, en la que la pre-S de tipo natural
se deriva de un VHB seleccionado del grupo que consiste en los
subtipos adr, ayw, adw, adw2 y adyw.
3. Pre-S de VHB según la
reivindicación 1, en la que la pre-S se selecciona
del grupo que consiste en Pre-S-15m
(SEQ ID NO: 9), Pre-S-123m (SEQ ID
NO: 10) y Pre-S-dm (SEQ ID NO:
11).
4. Gen de pre-S que codifica
para la pre-S de VHB según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
5. Vector recombinante que comprende:
- (a)
- un promotor;
- (b)
- un gen de pre-S según la reivindicación 4; y
- (c)
- un terminador transcripcional.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Vector recombinante según la reivindicación
5, en el que el vector es
pIL20-pre-S (adr) depositado en la
KCTC con el número de registro KCTC 0987BP o
pIL20-pre-S (ayw) depositado en la
KCTC con el número de registro KCTC 1004BP.
7. Transformante que comprende el vector
recombinante según la reivindicación 5.
8. Transformante según la reivindicación 7, en
el que el transformante es una levadura.
9. Transformante según la reivindicación 7, en
el que el transformante se selecciona del grupo que consiste en
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (KCTC 0987BP) y
Saccharomyces cerevisiae
2805/pIL20-pre-S (ayw) (KCTC
1004BP).
10. Pre-S recombinante producida
a partir del transformante según la reivindicación 7.
11. Adyuvante que comprende una
pre-S de VHB según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
12. Vacuna frente a VHB que comprende una
pre-S de VHB según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
13. Vacuna frente a VHB según la reivindicación
12, en la que la vacuna frente a VHB comprende además un antígeno S
de VHB.
14. Composición de diagnóstico para detectar
anticuerpos contra VHB, antígenos de superficie de VHB o antígenos
codificados por el gen de pre-S, en la que la
composición de diagnóstico comprende una seleccionada del grupo que
consiste en pre-S de VHB según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
15. Método de producción de una
pre-S de VHB, que comprende:
- (a)
- insertar un gen de pre-S según la reivindicación 4 en un vector;
- (b)
- transfectar el vector que alberga el gen de pre-S según la reivindicación 4 en una célula huésped; y
- (c)
- producir la pre-S cultivando un transformante en un medio.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Uso de una pre-S de VHB
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para preparar un
adyuvante que potencia un anticuerpo contra un antígeno derivado de
VHB en un mamífero o un ave.
17. Uso según la reivindicación 16, en el que el
mamífero se selecciona del grupo que consiste en un ser humano, un
animal de ganado, un animal de experimentación de laboratorio, un
animal doméstico y un animal salvaje
cautivo.
cautivo.
18. Uso según la reivindicación 16, en el que el
ave es un pollo u otra ave de corral.
19. Uso de una pre-S de VHB
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para preparar
una vacuna para generar inmunidad para el virus de la hepatitis
B.
20. Uso según la reivindicación 19, en el que la
vacuna frente a VHB comprende además un antígeno S de VHB.
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