MXPA05003434A - Mutaciones de virus de hepatitis b asociadas con susceptibilidad reducida a adefovir. - Google Patents

Abstract

Las solicitantes han identificado 5 mutantes asociados con resistencia del virus de hepatitis B a adefovir, un farmaco antiviral analogo al nucleotido ampliamente utilizado en terapia de hepatitis B; de conformidad con esta invencion, se proveen los mutantes de transcriptasa inversa rtN236T, rtA181V, rtA181T y sus mutantes de antigeno de superficie correspondientes sL173F y/o sL172trunc. Las proteinas mutantes, anticuerpos para las mismas y acidos nucleicos que codifican los mutantes tienen valor de diagnostico en el monitoreo y ajuste de terapia de pacientes con adefovir y en la terapia de pacientes infectados con los mutantes.

Description

MUTACIONES DE VIRUS DE HEPATITIS B ASOCIADAS CON SUSCEPTIBILIDAD REDUCIDA A ADEFOVIR DESCRIPCION DE LA INVENCION Antes de surgir la terapia de adefovir (ADV) , la lamivudina y el mterferón eran las únicas dos terapias aprobadas para tratamiento por infección por virus de hepatitis B crónica. La terapia de interferón está asociada con efectos colaterales severos que incluyen síntomas semejantes a la influenza, fiebre y depresión. La terapia de lamivudina a largo plazo está limitada por la alta incidencia y el rápido inicio de resistencia que ocurrió en 24% de los pacientes en un año y 70% de los pacientes después de cuatro años de terapia [1] . La resistencia a la lamivudina está predominantemente asociada con mutaciones (rtM204V o rtM204I) en el motivo YMDD en el dominio C de la polimerasa del virus de hepatitis B (transcriptasa inversa o "rt"). La nomenclatura de consenso de mutaciones de polimerasa de HBV se usa en todo este reporte [2] . Las mutaciones rtL180M y rtV173L en el dominio B de polimerasa de HBV también se observaron f ecuentemente junto con las mutaciones YMDD (SEQ ID NO:l) en HBV resistente a lamivudina. Las mutaciones de dominio B no confirieron resistencia significativa a lamivudina por sí solas. Más bien, estas mutaciones parecieron incrementar la adaptación de replicación del YMDD Ref. 162878 (SEQ ID NO:l) mutante HBV [3] . Otras mutaciones de polimerasa de HBV se reportaron en frecuencias mucho menores en pacientes que recibieron lamivudina. Estas mutaciones de baja frecuencia no se han establecido como mutaciones de resistencia a lamivudina. Adefovir, un análogo acíclico de monofosfato de adenosina, pertenece a una nueva clase de antivirales de nucléotido. El adefovir ha demostrado tener actividad potente contra HBV resistente a lamivudina y de tipo silvestre in vi tro e in vivo. Además, también mostró actividad contra retrovirus y virus de herpes in vi tro. Adefovir dipivoxil, un profármaco oral de adefovir, incrementa la biodisponibilidad de adefovir en los pacientes. En las células, adefovir requiere dos pasos de fosforilación para convertir al metabolito activo de difosfato de adefovir, que es un inhibidor competitivo potente de polimerasa de HBV con respecto al ATPd del sustrato natural y funciona como un terminador de cadena de replicación viral. La constante de inhibición (Kj) para difosfato de adefovir fue 0.1 µ? en una prueba enzimática mediante el uso de polimerasa de HBV recombinante [4] . Adefovir ha demostrado in vi tro tener actividad antiviral contra HBV humano, HBV de pato (DHBV) , y virus de hepatitis de marmota (WHV) en modelos de cultivo de células con valores de CI50 en el intervalo de 0.2 a 1.2 µ? [5-10] . Dos estudios clínicos de fase 3 demostraron la actividad anti-HBV de ADV a 10 mg diariamente en pacientes con hepatitis B crónica. La mediana de los niveles de ADN de HBV en el suero declinaron por 3.5 y 3.9 log10 copias/ml de la línea basal a la semana 48 en los grupos de dosis de 10 mg de ADV en pacientes con hepatitis B crónica HBeAg-positivos (estudio GS-98-437) y HBeAg-negativos (estudio GS-98-438) , respectivamente [11, 12]. Beneficios virológicos y clínicos adicionales se observaron con terapia ADV extendida hasta 96 semanas en pacientes HBeAg-negativos en el estudio GS-98-438

[13] . A diferencia de la incidencia alta de resistencia en pacientes que recibieron terapia de lamivudina, no se identificaron mutaciones de resistencia a adefovir en pacientes con hepatitis B crónica en los dos estudios clínicos de ADV de fase 3 después de 48 semanas de terapia de ADV [14] . Además, 48 semanas de tratamiento con ADV no condujeron a la selección de pacientes de post-trasplante de hígado coinfectados con HBV en VIH/HBV con HBV rresistente a lamivudina [15, 16] . SUMARIO DE LA INVENCION Ahora, los inventores de la presente han identificado cinco mutaciones de HBV rt y HBsAg asociadas con resistencia a adefovir: rtN236T, rtA181V, rtA181T, antígeno de superficie ( "sAg" ) L173F y sAg que es N-terminal inmediatamente terminado para el residuo L172 (de aquí en adelante "sL172trunc" ) . Las mutaciones de posición 181 de sAg y rt se relacionan en cuanto que el marco de lectura abierto para rt y sAg se traslapan en parte. Los imitantes de rtA181V y rtA181T corresponden respectivamente a los imitantes de sL173F y sL172trunc (este último resulta de la sustitución de un codón de interrupción en el marco de lectura de sAg) . La secuencia de HbsAg antes del codón de interrupción introducido es SVRFS (SEQ ID NO : 2 ) , en donde el residuo de serina C- erminal está en la posición 171 de sAg . Aunque rtN236T es la única mutación actualmente asociada con manifestaciones clínicas de resistencia, v.gr., rebote de carga viral, las mutaciones restantes tienen un valor en diagnóstico y terapia de infección de HBV, así como sus anticuerpos y ácidos nucleicos que codifican los mutantes . Por consiguiente, modalidades de la invención incluyen ácido nucleico aislado que codifica virus de hepatitis B rtN236T, rtA181V, rtA181T, SL173F y/o sL172trunc; ácido nucleico que codifica virus de hepatitis rtN236T, rtA181V, rtA181T, sL173F y/o sL172trunc que está fusionado con ácido nucleico heterólogo; virus de hepatitis infecciosa aislado que comprende ácidos nucleicos que codifican uno o más de los mutantes; vectores que comprenden ácido nucleico que codifica uno o más de los mutantes; células hospedero transformadas con los vectores y métodos para cultivar estas células y recuperar polipéptido de mutante de las mismas. Modelos animales de infección que contienen uno o más de estos mutantes son otra modalidad de la invención. WHV y DHBV son modelos conocidos, como se indicó anteriormente. En una modalidad de la invención, las mutaciones correspondientes son introducidas a WHV o DHBV y hospederos tolerantes infectados con el virus que contiene mutante. Las mutaciones de marmota y pato co respondientes a rtN236T son respectivamente N620T y N544T. En otras modalidades de la invención los polipéptidos rt o sAg mutantes o sus fragmentos se proveen en forma aislada, fusionados con polipéptidos heterólogos, unidos a un marcador detectable o a una sustancia insoluble o están combinados en una composición con un excipiente farmacéuticamente aceptable. En modalidades adicionales, se proveen anticuerpos que son capaces de unir específicamente uno o más de los polipéptidos mutantes rt o sAg . Estos anticuerpos también se proveen en forma aislada, fusionados con polipéptidos heterólogos, unidos a un marcador detectable o a una sustancia insoluble o se combinan en una composición con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad de la invención, las proteínas o ácido nucleico mutantes se someten a prueba mediante el uso de métodos convencionales y los resultados se usan para guiar la toma de decisiones clínica. En particular, los mutantes (especialmente el mutante rtN236T) son monitoreados y bajo emergencia, un agente terapéutico adicional que no es de resistencia cruzada con adefovir se añade al régimen. Alterna i amen e, esos agentes se utilizan en la profilaxis para suprimir o prevenir emergencia de los mutantes in vivo. En otra modalidad, se provee un equipo de PCR que comprende cebadores capaces de amplificar un ácido nucleico de hepatitis que codifica por lo menos uno de los mutantes de esta invención. Otras modalidades de la invención serán evidentes a partir de la descripción y las reivindicaciones siguientes. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se realizó una observación de resistencia a adefovir de una manera ciega en pacientes con hepatitis B crónica HbeAg-nega ivos tratados durante 96 semanas en un estudio clínico controlado por placebo, con distribución aleatoria, doble ciego de fase 3 (GS-98-438) de 10 mg de adefovir dipivoxil (ADV) . El análisis incluyó 79 pacientes que recibieron 10 mg de ADV durante las primeras 48 semanas y se distribuyeron al azar 10 mg de ADV durante las segundas 48 semanas . • El domino de transcriptasa inversa (RT) del gen de polimerasa de HBV (rtl a rt344) se secuenció para ADN de HBV extraído de la línea basal y muestras de suero de la semana 96 (o la última muestra en estudio) para los 79 pacientes tratados continuamente con ADV durante 96 semanas sí las muestras tuvieron ADN de HBV en el suero detectable (> 1000 copias/ml por prueba de PCR de Roche Amplicor™) en los puntos de tiempo probados. • De los 79 pacientes, líneas básales variadas y secuencias de la semana 96 (o la última muestra en estudio) se obtuvieron para 20 pacientes. No se obtuvieron genotipos variados para 58 de los 79 pacientes tratados con ADV con niveles de ADN de HBV en el suero < 1000 copias/ml en la semana 96 (o la última visita en estudio) . Un paciente adicional no se genotipificó debido a amplificación de PCR no exitoso asociada con un ADN de HBV en el suero bajo (1457 copias/ml) para la muestra de la semana 96. • Mutaciones novedosas de sitio conservado emergidas en cinco pacientes. La mutación rtN236T se observó en dos pacientes (0454-2506 y 0626-1537) . Análisis fenotípicos in vitro de clones de HBV derivados de pacientes que portaban rtN236T mostraron una susceptibilidad reducida de 7 a 14 veces a adefovir. El paciente 0454-2506 también desarrolló otra mutación de sitio conservada rtA181T, que no confirió resistencia a adefovir in vitro. La emergencia de mutación rtN236T fue asociada con rebote de ADN de HBV en el suero (definido como un incremento de > 1.0 log10 confirmado en ADN de HBV de un nadir en tratamiento en dos visitas consecutivas mientras estaba en terapia de ADV) en ambos pacientes. El mutante rtN236T permaneció susceptible a lamivudina (CI50 cambió por < 3.5-veces) in vitro. La supresión de ADN de HBV se observó clínicamente para un paciente (0454-2506) que cambió a terapia de lamivudina. La mutación rtA181V ocurrió en dos pacientes (0624-1517 y 0624-1564) . Los clones de HBV derivados de paciente que contenían la mutación rtA181V demostraron 2.5- a 3-veces de susceptibilidad reducida a adefovir in vitro. Sólo un paciente con mutación rtA181V tuvo rebote de ADN de HBV en el suero. El otro paciente con la misma mutación mantuvo supresión completa de ADN de HBV en el suero (< 1,000 copias/ml después de la semana 112) . La asociación de mutación rtA181V con resistencia a ADV permanece poco clara. Un quinto paciente (0370-3503) desarrolló dos mutaciones de sitio conservado rtK241E y rtK318Q. Esta doble mutación no se asoció con resistencia a adefovir in vitro ni se asoció con rebote de ADN de HBV en el suero in vivo.

• La mutación rtN236T de resistencia a adefovir demostró resistencia cruzada moderada (4 a 8 veces) a nucleótidos acíclicos tenofovir y MCC-478 in vitro. El mutante rtN236T permaneció susceptible a análogos de L-nucleósido tales como lamivudina y L-dT así como análogo de nucleósido carbocíclico entecavir in vitro. La mutación rtN236T novedosa redujo la susceptibilidad a adefovir y el rebote ADN de HBV en el suero se identificó en 2 de 79 (2.5%) pacientes con hepatitis crónica de mutantes de núcleo supuesto que tomaron ADV durante 96 semanas. Esta mutación permaneció susceptible a lamivudina in vitro e in vivo. Las composiciones de rt y sAg de hepatitis B novedosas de esta invención son fácilmente identificadas por métodos hasta ahora conocidos per se en la técnica. Típicamente, una prueba para la proteína mutante, o ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica la misma. Los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, 1) secuenciación de ADN directa de productos amplificados por PCR, 2) secuenciación de ADN viral clonado, 3) pruebas con el uso de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) , 4) ensayos basados en la hibridación de fragmentos de ADN por medio de sondas de ácido nucleico (PCR/PCR de tiempo real que incluye detección diferencial de mutante con sondas de nucleótido, o por análisis de curva de fusión de productos de PCR, y ensayo de sonda de línea (sondas de hibridación de reversa inmobil izadas) , 5) espectrometría de masa de tiempo de vuelo por ionización de desabsorción con láser asistido por matriz (MALDI-TOF MS) (Ding et al., PNAS 100(6) :3059 18 de marzo de 2003) , 6) microordenamientos de oligonucleótídos (chips de ADN) , 7) amplificación de señal lineal (ensayo de I VADER) (Cooksey et al . , Antimicrobial Agents y Chemotherapy 44(5): 1296 mayo de 2000), 8) reacción de amplificación de señal invasiva serial (Ding et al., PNAS 97(15) :8272, 18 de julio de 2000) , y 9) métodos de detección inmunológica tales como ELISA o radioinmunoensayo . Ni el método por el cual las variantes son detectadas ni, la forma en la cual son detectadas es crítico para la práctica de esta invención. "Aislada" cuando se usa en referencia a las variantes de proteínas o ácido nucleico de esta invención significa que la proteína o ácido nucleico no está presente en su ambiente nativo. Típicamente, esto significa que la proteína o ácido nucleico mutante es libre de por lo menos una de las proteínas o ácidos nucleicos virales o del hospedero con el cual está asociado cada uno ordinariamente. En general, las proteínas aisladas son ácidos nucleicos presentes en un ambiente in vitro. "Aislado" no significa que la proteína o ácido nucleico debe ser purificado u homogéneo, aunque esas preparaciones caen dentro del alcance del término. "Aislado" simplemente significa elevado a un grado de pureza al punto requerido para excluir productos de la naturaleza y anticipaciones accidentales del alcance de las reivindicaciones . Las proteínas de esta invención no necesitan ser purificadas en absoluto para ser "aisladas". Por ejemplo, un cultivo de células de células recombinantes que expresan una proteína mutante de esta invención es por sí mismo una forma "aislada" de la proteína mutante. En general, desde luego, se obtienen resultados óptimos con proteína que ha sido más que simplemente colocada en un ambiente que es distinto al que ocurre en forma natural. Por lo tanto, la proteína es opcionalmente purificada (ya sea de virus de hepatitis cultivado o recuperado de células recombinantes de transformantes heterólogos) . Típicamente, las proteínas serán purificadas a una sola banda en cromatografía de gel , pero se utilizan libremente otros métodos. Los métodos adecuados se han usado antes para las proteínas de tipo silvestre. Además, los anticuerpos capaces de unir las proteínas de esta invención se utilizan en la purificación de inmunoafinidad de las proteínas. Estos métodos se conocen per se. Los ácidos nucleicos que codifican las variantes de esta invención opcionalmente son ARN o ADN, que varían opcionalmente en longitud de secuencia y la selección de bases que flanquean el codón de residuo mutante. La longitud de ácido nucleico no es crítica. Suficiente ácido nucleico sólo necesita estar presente para proveer novedad y utilidad para la secuencia que codifica la variante, pero de otra manera la longitud de la secuencia que flanquea el codón seleccionado no es importante. Típicamente, la longitud de la secuencia (que incluye el codón variante) será cualquier entero dentro del intervalo de 9 a 200 pb, generalmente aproximadamente 12 a 30 pb y muy típicamente de 15 a 25 pb. También incluyen secuencias suficientemente largas para codificar las variantes enteras y sus fragmentos enzimáticamente o antagónicamente activos descritos adicionalmente más adelante. La secuencia que flanquea el codón variante tampoco es crítica siempre que se reconozca que sea una secuencia de virus de hepatitis B para el propósito destinado. Este virus es altamente polimórfico. Existe considerable variación de secuencia dentro de su genoma, aunque algunas regiones son más conservadas que otras. El banco de genes Genbank contiene por lo menos 70 secuencias de referencia de HBV solas, y con el transcurso del tiempo se añaden más. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico que flanquean a los sitios de variantes varían considerablemente incluso en las secuencias que ocurren naturalmente. Además, variaciones adicionales o diferentes en secuencia o la elección de codón opcionalmente se introducen en cualesquiera de estas secuencias nativas {por ejemplo, para proveer sitios de restricción novedosos). La secuencia resultante sólo necesita ser capaz de funcionar en una prueba de diagnóstico para la variante natural o en un sistema de expresión para producir proteína que tiene el uso de diagnóstico o terapéutico pretendido. Más variación de secuencia de ácido nucleico se acomoda en conexión con la expresión de las proteínas variantes debido a que cualesquiera codones para el residuo de aminoácido particular se puede utilizar. La secuencia de flanqueo también se varía para permitir la fusión a ácidos nucleicos heterólogos (como en la construcción de vectores de expresión o clonación, en construcciones de ensayo de diagnóstico hasta ahora conocidos, y para la expresión de proteínas de fusión) . Con respecto a los ensayos de diagnóstico para ácidos nucleicos variantes, una o más pares de bases nativas son opcionalmente sustituidas (o una es insertada o deletada) siempre que las secuencias resultantes permanezcan capaces de actuar, por ejemplo, un cebador de PCR o reactivo de hibridación. La determinación de qué variantes de secuencia de ácido nucleico serán útiles es simplemente un asunto de experimentación de rutina y está dentro del alcance del experto en la técnica. El término "ácido nucleico" no pretende indicar una limitación de tamaño. Para los propósitos de la presente invención, incluye oligonucleótidos u otras secuencias de longitud corta, por ejemplo sondas o cebadores.

Los ensayos de reacción de polimerasa (PCR) se utilizan fácilmente para detectar los ácidos nucleicos mutantes de la presente invención. Esos métodos de PCR preferiblemente usan por lo menos un cebador de amplificación incluye el codón mutante o la secuencia complementaria. Por lo tanto, en un equipo de PCR, se suministran cebadores que son capaces de amplificar el ácido nucleico que codifica el mutante, ya sea que las secuencias sean o no novedosas. También se incluyen dentro del alcance de la invención secuencias de ácido nucleico complementarias a los ácidos nucleicos anteriores, vectores que contienen ácido nucleico variante o su complemento, células hospedero transformadas con esos vectores (junto con cultivos de células de las mismas) , y métodos para expresión recombinante de proteínas variantes. Los métodos para expresión recombinante incluyen la expresión de la variante rt en cultivo de células transformadas (células hospedero humanas, animales o microbianas infectadas con virus que contienen el mutante o transformadas por un vector que contiene su ácido nucleico) . Los métodos para expresión recombinante se conocen per se, y muchos de ellos se han usado hasta ahora en la expresión de rt y sAg de tipo silvestre. Cualesquiera de estos son adecuados para usarse aquí . Los ácidos nucleicos de esta invención incluyen ácidos nucleicos que hibridan a las secuencias que ocurren naturalmente. Estas pueden ser secuencias de rt o sAG de longitud completa o cualesquiera fragmentos de las mismas que tienen el carácter deseado. Un ácido nucleico hibridante es uno que se une a la secuencia objetivo bajo condiciones astringentes (véase patente de E.U.A. 6,110,721) . Otros ácidos nucleicos de esta invención se definen por su grado de homología de secuencia a una secuencia nativa. Típicamente, esta podría ser 80, 85, 90, 95 ó 99% homologa a la secuencia de virus de hepatitis B que contiene uno de los mutantes de la presente invención, pero como un asunto práctico, la homología de cebador o sonda se define funcionalmente . La sonda o cebador necesita unirse únicamente a la secuencia objetivo bajo condiciones de prueba comerciales estándares con suficiente especificidad para excluir el virus de hepatitis de tipo silvestre o no mutado en el paciente o población en cuestión. Las condiciones de prueba comerciales estándares desde luego variarán en un sistema de ensayo a otro, y las homologías de secuencia permitidas variarán de acuerdo con ello. Las sondas y cebadores óptimos usarán la elección de codón para los residuos mutantes encontrados dentro de la población de pacientes (y las pruebas de hecho pueden usar una pluralidad en sondas o cebadores representen variación en la población) . La determinación de las secuencias adecuadas entonces es simplemente un asunto de experimentación de rutina que está dentro del alcance de la técnica.

También útiles son modelos animales de las mutaciones resistentes de esta invención. Estas se obtienen al introducir mutaciones apropiadas en las posiciones 236 y/o 181 correspondientes de virus de hepatitis B de pato o virus de hepatitis de marmota. Estos se usan para infectar los hospederos tolerantes y se usan para estudiar el efecto de combinaciones de fármaco u otra investigación como será evidente para el experto en la técnica. Los métodos descritos en este párrafo son conocidos per se y no son la invención aquí. Esta práctica está dentro del alcance del experto en la técnica . Es posible que anticipaciones accidentales de la secuencia encontrada dentro de secuencias de longitud más corta existan, es decir, la misma secuencia de pares de bases encontrada en 15 pb de ácido nucleico variante alrededor del sitio de mutación (o su complemento, al considerar la orientación) también pueden existir en un gen no relacionado o un fragmento conocido del mismo. En tales casos, desde luego, las secuencias de flanqueo adicionales serán completamente distintas del virus de hepatitis, pero podría existir traslape sin la secuencia que se compara es suficientemente corta. Por consiguiente, la invención excluye cualquier oligonucleótido o ácido nucleico antes de la fecha efectiva del mismo que tenga una secuencia idéntica a las secuencias mutantes de esta invención, y opcionalmente excluye todas esas secuencias que aunque no son idénticas se unen a una secuencia mutante de las mismas bajo condiciones de hibridación astringentes (como se define en la patente de E.U.A. 6,110,721). Esas secuencias de la técnica anterior son identificadas fácilmente al buscar la base de datos GenBank, y se incorporan expresamente por referencia. En una modalidad importante de la invención, la mutación rtN236T se somete a ensayo para monitorear pacientes para emergencia de resistencia a adefovir. De manera similar, es útil monitorear rtA181V. Sí estas mutaciones aparecen en un paciente bajo tratamiento con adefovir, la intervención clínica podría estar en orden, por ejemplo, co-administrar un agente terapéutico reactivo no cruzado complementario junto con adefovir. Estos agentes incluyen por ejemplo entecavir, L-dT, MCC-478, FTC, L-dC, L-FMAU, L-Fd4C Lamivudina y tenofovir. Otros son fácilmente identificados por el método expuesto más adelante. Las dosis clínicas de esos agentes son conocidas o podrían reducirse fácilmente a partir de información disponible por médicos clínicos expertos, como lo serían las formas de profármaco apropiadas de los agentes (tales como tenofovir DF) . HBV rtA181T, rtA181V, rtN236T, SL173F y sL172trunc tienen una variedad de usos. Por ejemplo, se usan como inmunógenos para producir anticuerpos. Los polipéptidos variantes también son útiles como inmunomoduladores per se o para producir tratamiento inmune pasivo con anticuerpos de infección de hepatitis B. Las proteínas mutantes son aisladas de HBV o producidas en cultivo de célula recom inante , y se usan adecuadamente como un antígeno para producir anticuerpos o como un inmunomodulador , v.gr., vacuna. La variante sAg también es útil como un reactivo en inmunoensayos para SL173F (y por lo tanto, por extrapolación, rtA181V) . De manera similar, sL172trunc se usa para el mismo propósito general, pero detecta rtA181T. Los polipéptidos de esta invención incluyen B sAg o rt de hepatitis de longitud completa, fragmentos de los mismos que comprenden por lo menos el residuo o sitio mutante, y/o cualquiera de éstos fusionados a un polipéptido heterólogo. "Heterólogos" ya sea que define secuencia de ácido nucleico o proteínas no significa lo mismo que las secuencias de flanqueo nativas o conocidas. Las secuencias heterólogas incluyen otras secuencias de HBV, humanas, animales o microbianas, polyHis o sus etiquetas de afinidad, o secuencias completamente fabricadas. Los fragmentos típicamente incluirán los residuos variantes más por lo menos aproximadamente 4 residuos de flanqueo totales distribuidos a cualquiera o ambos flancos del residuo de mutante, generalmente 10 a 20 residuos en total. "Proteína" y "polipéptido" se usan aquí sin ninguna diferencia de tamaño. Los fragmentos tienen un tamaño suficiente para ser inmunológicamente activos, es decir, serán suficientemente inmunogénicos (solos o fusionados a una proteína inmunogénica) por lo menos en animales, típicamente ratones, para producir un anticuerpo que (a) reacción en forma cruzada con el polipéptido variante de longitud completa nativo, y/o (b) reacción en forma cruzada con un anticuerpo producido contra variante de longitud completa. El grado de reactividad cruzada típicamente es suficiente para permitir que el fragmento realice un inmunoensayo para el mutante, o como un inmunógeno en la producción de anticuerpos (como vacunas en humanos) que reaccionan en forma cruzada con rt o sAg de longitud completa nativo. Las preparaciones inmunogénicas de las proteínas de esta invención se formulan opcionalmente con un adyuvante inmune, conocido per se, para incrementar su respuesta. La variante rt o sAg opcionalmente se une a un marcador detectable. Esa proteína marcada típicamente se usa en ensayos de diagnóstico. Los antígenos también son útiles cuando se une a una sustancia insoluble (v.gr. , Sepharose u otra matriz) para absorber anticuerpo marcado en ensayos de diagnóstico o en métodos preparativos para purificar el anticuerpo. Esos métodos son conocidos per se. En breve, las proteínas variantes se usan para producir reactivos de manera convencional, o se someten a ensayo de la misma manera que otras proteínas mediante el uso de métodos conocidos, como en cualquier proteína terapéuticamente o diagnósticamente significativa . Los anticuerpos capaces de unirse a la variante rts o su antígeno de superficie son útiles en ensayos terapéuticos y de diagnóstico. Estos anticuerpos opcionalmente son anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados (hechos por métodos conocidos per se) , o son anticuerpos murinos o monoclonales . El origen no es importante a menos que el anticuerpo se use en inmunización pasiva (como con variantes de sAg de la presente invención) de pacientes humanos, en cuyo caso se desean anticuerpos humanos o humanizados para prevenir reacciones inmunes a la terapéutica . El anticuerpo dirigido contra cualquiera o más de las variantes de rt o sAg opcionalmente es marcada, v.gr. , con un radioisótopo o una enzima, o se une a una sustancia insoluble, generalmente para usarse en inmunoensayos . En otra modalidad, los anticuerpos de esta invención (en forma de una preparación farmacéuticamente aceptable) son útiles en inmunización pasiva, v.gr., contra las variantes de antígeno de superficie (y por implicación, HBV que contiene los mutantes rtl81) . Diseño de estudio clínico El estudio GS-98-438 es un estudio clínico de fase 3 controlado por placebo, doble ciego, distribuido en forma aleatoria de la seguridad y eficacia de ADV para el tratamiento de pacientes con hepatitis B crónica HbeAg-negativo/anti-Hbe-positivo/ADN de HBV positivo. Un total de 184 pacientes recibieron por lo menos una dosis de medicamento de estudio durante las primeras 48 semanas (n=61 y 123 para el placebo y grupos de 10 mg de ADV, respectivamente) . Durante las segundas 48 semanas, todos los pacientes de placebo cambiaron a 10 mg ADV diariamente mientras que los pacientes tratados con ADV fueron distribuidos aleatoriamente ya sea para continuar ADV o recibir placebo a una relación de 2:1. Por consiguiente, todos los pacientes que recibieron por lo menos una dosis de fármaco de estudio durante las segundas 48 semanas se clasificaron en tres grupos: PLB-ADV (n=60), ADV-ADV (n=79), y ADV-PLB (n=40) . Las características y demografías de la enfermedad de línea basal se resumen en la tabla 1.

Tabla 1 Características y demografías de enfermedad de linea basal para población de ITT Tratamiento recibido Total PLB-ADV ADV 10 ADV 10 (n=179) 10 mg mg - ADV mg (n=60) 10 mg Placebo (n=79) (n=40) Mediana del AND de 7.1 7.1 7.2 7.1 HBV (Log19 copias/ml ) Mediana de ALT- 2.4 2.3 2.1 2.3 Múltiples del limite superior de la Normal Mediana de la edad 46 47 47 47 Sexo 83% 82% 83% 83% · -Hombre Raza - Blanca 39 (65%) 55 (70%) 26 (65%) 120 (67%) - Asiática 20 (33%) 20 (25%) 13 (33%) 53 (30%) - Negra 1 (2%) 4 (5%) 1(3%) 6(3%) Subestudio de Virología Un subestudio de virología del estudio GS98-438 incluyó a todos los pacientes en el grupo de ADV 10 mg -ADV 10 mg (n=79) . El dominio de RT del gen de polimerasa de HBV de muestras de suero de un banco de esos pacientes se analizó genotípicamente en la línea basal , y ya sea en la semana 96, o con terminación temprana durante las segundas 48 semanas. Los análisis fenotípicos in vitro de susceptibilidad a adefovir se realizaron para clones de HBV derivados de pacientes sí el paciente tenía una mutación de aminoácido emergente en un residuo conservado de polimerasa de HBV. Análisis Genotípico Criterios de inclusión de muestra Se realizaron análisis genotípicos para línea basal, y ya sea para la semana 96, o para las últimas muestras de suero en fármaco (para pacientes que se retiraron antes de la semana 96) que tuvieron un ADN de HBV en el suero de > 1,000 copias/ml como se determinó por el ensayo de PCR de monitoreo de Roche Amplicor™. Sí el valor de ADN de HBV en el suero de la semana 96 no estaba disponible para un paciente, el valor de ADN de HBV en el suero más cercano antes de la semana 96 se usó. Todas las muestras de la semana 96 y las últimas muestras en fármaco se refieren como muestras de la semana 96 de aquí en adelante. Cabe notar que Roche Molecular Systems elevó el límite inferior de cuantificación de ensayo de PCR de ADN de HBV de 400 copias/ml a 1,000 copias/ml después de que Gilead completó los análisis de la semana 48 para el estudio 438. Métodos de genotipificación Focus Technologies Inc. (Cypress, CA) fue el laboratorio de referencia designado para toda la secuenciación de HBV para el estudio GS-98-438. En breve, el ADN de HBV se aisló de especímenes de suero clínicos y se amplificó por PCR. Las cadenas positivas y negativas del gen de polimerasa de HBV que abarcaban el dominio pol/RT (aminoácidos rtl a rt344) se secuenciarcn mediante el uso de 5 ó 6 cebadores de secuenciación estándares. Las secuencias se resolvieron en un secuenciador de ADN automatizado (ABI Prism 377, ABI, Foster City, CA) . Con base en experimentos de plásmido mezclado, una mezcla de nucleótidos de tipo silvestre y mutantes se pudieron detectar cuando cualquiera estaba presente en la población a una frecuencia de > 30%. Las secuencias de HBV contiguas se ensamblaron a partir de las secuencias de todas las muestras mediante el uso de Autoassembler 2.0 (ABI) . Las secuencias contiguas para todas las muestras se enviaron a Gilead Sciences para identificación de mutaciones de polimerasa de HBV. Todos los datos fueron recibidos en forma de una base de datos electrónica.

Análisis de datos de secuenciación Las secuencias de nucleótidos contiguas (provistas por Focus Technologies) para la línea basal y muestras de HBV de la semana 96 del mismo paciente se alinearon mediante el uso del programa de alineación de secuencia de egAlign (DNAStar, Madison, WI ) . Los aminoácidos presentes en la muestra de la semana 96 pero no en la muestra de la línea basal para un paciente se documentaron como mutaciones emergentes. Si no hubo mutaciones emergentes en un paciente, el paciente fue documentado como "sin mutación" . Las secuencias de dominio HBV RT de 70 aislados HBV en GenBank y de 698 aislados de HBV de línea basal en los estudios 437 y 438 se usaron como secuencias de referencia para definir sitios conservados. Un sitio conservado se define como un residuo de aminoácido que no es cambiado ya sea entre las 70 secuencias de Genbank de HBV o entre las 698 secuencias de HBV de línea basal de los estudios 437 y 438. Todos los otros lugares en donde se consideró que eran sitios polimórficos en polimerasa de HBV. Las mutaciones de aminoácidos emergentes durante el ensayo en sitios polimórficos de polimerasa de HBV se definieron como mutaciones de sitio polimorficas y aquellas que ocurrieron en sitios conservados se definieron como mutaciones de sitio conservado .

Análisis fenotípico ?? vitro de clones de HBV derivados de pacientes Todas las sustituciones de sitio conservado se evaluaron por sus efectos sobre susceptibilidad a adefovir mediante el uso de un enfoque novedoso para generar clones de HBV de longitud completa derivados de pacientes. En breve, se extrajo ADN viral del suero de pacientes y genomas de HBV entero (3.2 kilobases) se amplificaron por PCR mediante el uso de cebadores Pl (5'-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3') (SEQ ID NO:3) y P2 (5'-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3') (SEQ ID NO:4) . Los genomas virales de longitud completa se clonaron en el vector de selección letal pCAP5 en un sitio Mlu NI a través de ligación de extremo rasurado (PCR Cloning Kit, Roche) y después se subclonó en el plásmido pHY106, un plásmido derivado de pBluescript KS (+) que contenía un promotor de CMV y la secuencia de HBV 5' y 3' mínima necesaria (aproximadamente 180 bases en total) para replicación viral después de la inserción de un aislado de H3V clínico de longitud de genoma . La susceptibilidad a fármacos de clones derivados de pacientes se analizó por transfección transitoria en células HepG2. Las células transfectadas fueron tratadas con varias concentraciones de adefovir o lamivudina durante 7 días y las cantidades de ADN de virus replicante intracelulares fueron después cuantif icadas por Southern blotting para determinar sensibilidad a adefovir.

Mutaciones de polimerasa de HBV emergentes Muestras de suero analizadas Se realizaron análisis genotípicos para todas las 79 muestras de línea basal (tabla 2) . Veinte de las 96 muestras de 79 semanas también se analizaron genotípicamente . Dos de los 20 pacientes con datos de genotipicación de HBV de línea basal y de semana 96 variados (0470-5514 y 0511-4509) tuvieron ADN de HBV en el suero no detectable por el ensayo de PCR de monitoreo de Roche Amplicor™ en las últimas visitas (semana 92) durante la fase ciega (antes de la fase con marcador abierto) del estudio 438. Sin embargo, las muestras de la semana 96 de estos dos pacientes tuvo ADN de HBV en el suero detectable por la prueba de PCR y por lo tanto fueron genotípicamente analizados en este subestudio de virología. Los genotipos de HBV variados no se obtuvieron para los 59 pacientes restantes. Cincuenta y ocho de los 59 pacientes tuvieron niveles de ADN de HBV en el suero no detectables (< 1000 copias/ml) en la semana 96. Un paciente adicional no fue genotipificado debido a amplificación de PCR no exitosa asociada con un ADN de HBV en el suero bajo (1457 copias/ml) para la muestra de la semana 96 (tabla 2) . Estos 59 pacientes se supuso que no portaban cepas de HBV resistentes ya que los niveles de ADN de HBV en el suero fueron indetectables (o casi indetectables) mediante el uso del ensayo comercial más sensible. Los niveles de ADN de HBV en el suero en estos -pacientes estuvieron muy por abajo del umbral de las 100,000 copias/ml de ADN de HBV en el suero que anteriormente se habían propuesto como clínicamente significativas [17] . Tabla 2 Restañen de análisis genotípico de pacientes que recibieron Adefovir Dipivoxil durante 96 semanas en el estudio 438 ¦"¦Muestras de la semana 96 o las últimas muestras en terapia . Mutaciones de polimerasa de HBV emergentes De los 20 pacientes tanto con datos de geno t ipi f i ca c i ón de línea basal como de semana 96, ocho pacientes tuvieron por lo menos una mutación de aminoácido emergente en el dominio pol/RT de polimerasa de HBV en la semana 96. Un total de 21 mutaciones se observaron en estos ocho pacientes (tabla 3) . La mayoría de estas mutaciones (14/21, 67%) ocurrieron en sitios polimórf icos en la polimerasa de HBV. Dado que las mutaciones polimórficas naturalmente existen en HBV de pacientes no tratados, es poco probable que estas mutaciones estén asociadas con resistencia a adefovir. Sin embargo, las mutaciones están presentes en secuencias de HBV y por lo tanto tienen uso en el diagnóstico de HBV por métodos inmuno 1 óg i eos o basados en ácidos nucleicos. Además, todos los tres pacientes (0624-1528, 0624-1529, y 0624-1531) con únicamente mutaciones polimórficas no experimentaron rebote de ADN de HBV en el suero a través de 96 semanas de terapia de ADV , lo que sugirió además que estas mutaciones polimórficas no estaban asociadas con resistencia a adefovir.

TABLA 3 Mutaciones emergentes en dominio de transcriptasa inversa de HBV en pacientes que recibieron 96 semanas de Adefovir Dipivoxil en el estudio 438 ID de Mutación Localización de RT de HBV paciente emergente en RT de HBV a la semana 0370- 3503 rtK241Ei Domino D, sitio conservado rtH267Q Hacia el extremo 3' del dominio E rtK318Q Hacia el extremo 3' del dominio E, sitio conservado 0454- 2506 rtV134D/V Dominios ínter A y B rtLl 45L/M Dominios inter A y B rtFl 51 F/Y Dominios inter A y B rtA181A/T Dominio B, sitio conservado rtN236T Dominio D, sitio conservado 0624- 1517 rtA181A/V Dominio B, sitio conservado rtF221 F/Y Dominios inter C y D 0624- 1528 rtC/Y135N/Y Dominios inter A y B rtA/V214A/P Dominios inter C y D rt!266T Hacia el extremo 3' del dominio E 0624-1529 rtI16I/T Dominios ínter A y B rtH126H/R Dominios ínter A y B 0624-1531 rtS256S/C Dominio E 0624-1564 rtA181V Dominio B, sitio conservado 0626-1537 rtN53D Dominios inter F y A rtY124H Dominios inter A y B rtN236T Dominio D, sitio conservado rtN238T Dominio D Todas las mutaciones de sitio conservado están en negritas. Las secuencias de codificación de nucleótido para mutaciones rtN236T, rtA181V o T y las secuencias circundantes de pacientes que desarrollaron estas mutaciones se resumen en la siguiente tabla (Tabla 3a) (SEQ ID NOS 5-24, respectivamente en orden de aparición) . Los cambios correspondientes en sitios de restricción de enzima también se listan en la tabla.

TABLA 3a .1.2.1.· Mutaciones de sitio conservado Cinco pacientes que participaron en el estudio 438 desarrollaron mutaciones en sitios conservados en el dominio de RT de polimerasa de HBV en la semana 96 (tabla 3) . La mutación rtN236T en el dominio D de la polimerasa de HBV se observó en dos pacientes: 0626-1537 y 0454-2506. Además, una segunda mutación rtA181T de sitio conservado se observó junto con la mutación rtN236T en el paciente 0454-2506. El análisis de secuencíacion retrospectiva para aislados de HBV en puntos de tiempo temprano demostró que la mutación rtN236T se volvió detectable a la semana 56 y la semana 80 en los pacientes 0626-1537 y 0454-2506, respectivamente. La mutación rtA181T sólo se detectó como una mezcla con HBV de tipo silvestre en la muestra de la semana 96 del paciente 0454-2506. La mutación rtA181V en el dominio B de la polimerasa de HBV se observó por separado en dos pacientes (0624-1517 y 0624-1564) en la semana 98 y semana 80, respectivamente (Figura 2) . El paciente 0370-3503 desarrolló mutaciones rtK241E + rtK318Q de sitio doble conservado en la semana 96 (tabla 3) . Susceptibilidad al fármaco in vi tro e in vivo de las mutaciones de sitio conservado Para investigar si estas mutaciones de sitio conservado confirieron resistencia a adefovir, la susceptibilidad a adefovir de aislado de HBV derivados de los cinco pacientes anteriores se evaluó mediante el uso de un ensayo de cultivo de células de genoma de HBV entero como describió antes.

Mutación rtN236T El análisis fenotípico in vitro de clones de HBV derivados de pacientes 0626-1537 y 0454-2506 demostró que la mutación rtN236T confirió una disminución de 7 a 14 veces en susceptibilidad de adefovir cuando se compararon los clones de HBV de la semana 96 que contenían mutación rtN236T con los clones de tipo silvestre de línea basal (Tabla 4). Ambos pacientes que desarrollaron la mutación rtN236T mostraron respuesta de ADN de HBV en el suero subóptima después del inicio de terapia de ADV con HBV de suero reducido por menos de 2 logio, copias/ml de la línea basal (figura 1) . Después de las respuestas iniciales moderadas, los niveles de ADN de HBV en el suero en estos dos pacientes incrementó gradualmente hacia los niveles de línea basal durante el tratamiento con ADV (figura 1) . La emergencia de la mutación rtN236T se asoció con un ensanchamiento de ALT transitorio (451 IU/1 en la semana 92) en el paciente 0454-2506 pero no en el paciente 0626-1537. Los datos in vitro y clínicos confirmaron que la mutación rtN236T se asoció con susceptibilidad reducida a adefovir.

TABLA 4 Susceptibilidad a adefovir in vi. ro de aislados de HBV de pacientes que desarrollaron mutaciones de sitio conservado en la semana 96 en el estudio 438 1 Ambas mutaciones rtN236T y rtA181T se observaron en este paciente en la semana 96. Los clones derivados del paciente que contenían rtN236T y rtA181T del suero en la semana 96 fueron defectuosos en cuanto a replicación in vitro; sólo se probaron los clones con una sola mutación rtN236T.

Mutación rtA181T Un paciente (0454-2506) con la mutación rtN236T también desarrolló una segunda mutación rtA181T de sitio conservada en la semana 96. Sin embargo, todos los aislados de la semana 96 derivados del paciente que codificaron rtN236T y rtAlSlT fueron deficientes en cuanto a replicación in vi tro; la razón de esto no es clara. Para evaluar la sensibilidad al adefovir de HBV que contenía las mutaciones rtN236T y rtA181T, se obtuvo una construcción artificial obtenida al modificar un clón de HBV derivado de paciente existente. La mutación rtA181T se introdujo por mutagénesis dirigida al sitio en clones de HBV replicantes del paciente 0454-2506 que ya codificó rtN236T. Los mutantes dobles resultantes fueron competentes en cuanto a replicación y se usaron para prueba de susceptibilidad a adefovir. Inesperadamente, la susceptibilidad de doble mutante rtN236T + rtA181T a adefovir fue parcialmente reanudada (2.5 veces resistente) en comparación con el mutante rtN236T individual (tabal 5) . La mutación rtA181T también se introdujo en una cepa de HBV estándar (genotipif icada, ay ) para evaluar la contribución individual de la mutación rtA181T. La cepa de laboratorio mutante rtA181T permaneció susceptible a adefovir con CI50 cambiado por sólo 1.3 veces in vi tro (tabla 5) . Los datos de fenotipificación in vitro sugirieron que rtA18lT no confiere resistencia a adefovir, pero tendría utilidad en diagnóstico de HBV.

TABLA 5 Susceptibilidad a adefovir in vitro de cepas de HBV que contienen la mutación rtA181T HBV Mutación CI50 de Cambio en Adefovir número de (µ?) veces de CI50 de tipo silvestre HBV tipo silvestre 0. 21±0.01 1 derivado (linea basal) 7 1 .3 1. 55±0.9 de rtN236T (semana 2 5 0. 53±0.26 paciente 96) rtN236T + (0454- rtA181T (semana 2506) 96) Cepa Lab tipo silvestre 0. 19±0.03 1 HBV rtA181T 0. 24±0.03 1 3 Mutación rtA181V Clones de HBV de la semana 96 derivados de dos pacientes (0624-1517 y 0624-1564) que desarrollaron el mutante rtA181V de HBV presentaron una reducción de 2.5 a 3 veces reprcducible en susceptibilidad a adefovir in vitro (Tabla 4) . La mutación rtA181V pareció conferir un bajo grado de susceptibilidad reducida a adefovir en relación con la mutación rtN236T resistente a adefovir (resistencia de 7 a 14 veces a adefovir in vitro). Además, los dos pacientes con la mutación rtA181V exhibieron perfiles clínicos inconsistentes. El paciente 0624-1564 tuvo un rebote en el ADN de HBV en el suero a la línea basal en la semana 96 (figura 2) , sin embargo, ese paciente también dejó de tomar las tabletas de ADV frecuentemente durante el estudio clínico. Por el contrario, el ADN de HBV del suero en el otro paciente (0624-1517) quedó suprimida por abajo de 1000 copias/ml después de un periodo de interrupción de tratamiento durante el cual se detectó esta mutación (figura 2) . Los niveles de ALT no cambiaron en ninguno de estos pacientes. La importancia clínica de la mutación rtA181V es poco clara con base en los datos de susceptibilidad a fármaco in vitro y los perfiles clínicos desiguales de los dos pacientes, aunque como se notó tendría utilidad de diagnóstico para infección por HBV.

Mutaciones dobles rtK214E y rtK318Q Un paciente (0370-3503) desarrolló dos mutaciones de sitio conservado (rtK214E y rtK318Q) en la semana 96 en el estudio 438. El análisis fenotípico in vitro de aislados de HBV de este paciente demostró que el HBV mutante rtK241E + rtK318Q permaneció completamente susceptible a adefovir con el CI50 de adefovir cambiado por menos de 0.9 veces en comparación con los clones de HBV de tipo silvestre de línea basal (tabla 4) . Este paciente logró una reducción >5 log10 en el ADN de HBV del suero a 3.1 logio copias/ml en la semana 96 sin evidencia de rebote de ADN de HBV del suero (figura 3) . Los últimos datos de ADN de HBV disponibles (3.6 logio copias/ml) de febrero de 2003 (semana 156) mostraron que el ADN de HBV en el suero permanece suprimido de manera durable. La doble mutación rtK241E + rtK318Q no está asociada con resistencia a adefovir in vitro o clínicamente, pero sería de valor en el diagnóstico de HBV.

Resistencia cruzada La resistencia cruzada de rtN236T y rtA181V a lamivudina se probó in vitro (Tabla 6) . Los aislados de HBV con cualquiera de las mutaciones rtN236T o rtA181V exhibieron disminuciones de 2.3 a 3.5 veces en susceptibilidad a lamivudina lo que sugirió que esas mutaciones no pueden causar falla clínica de lamivudina. Además, un paciente con la mutación rtN236T (0454-2506) se retiró del estudio clínico y cambió a monoterapia de lamivudina en la semana 104 y logró ADN de HBV en el suero no detectable por el ensayo de Digene (límite de detección = 1. x10s copias/ml) así como normalización de ALT después de 6 meses (figura 1) [18] . La respuesta de ADN de HBV en el suero clínica a lamivudina en este paciente confirmó además el hallazgo in vi tro de que la mutación rtN236T no confirió resistencia cruzada significativa a lamivudina. La resistencia cruzada de la mutación rtN236T a análogos de nucleótidos acíclicos tenofovir y CC-478 (forma de ácido libre) y análogos de nucleótidos L-dT y entecavir también se probó in vitro (Tabla 7). La mutación rtN236T demostró resistencia cruzada moderada (4 a 8 veces) a nucleótidos acíclicos tenofovir y MCC-478 in vitro. Sin embargo, el mutante rtN236T permaneció susceptible a análogos de nucleósido L-dT y entecavir in vitro, lo que sugirió que los pacientes infectados con HBV resistente a adefovir pueden ser tratados con L-dT o entecavir.

TABLA 6 Susceptibilidad a lamivudina in vitro aislados de HBV de pacientes que desarrollaron mutaciones de sitio conservado en la semana 96 del estudio 438 1 Ambas mutaciones rtN236T y rtA18lT se observaron en este paciente en la semana 96. Los clones derivados del paciente que contenían rtN236T y rtA181T del suero en la semana 96 fueron defectuosos en cuanto a replicación in vitro; sólo se probaron los clones con una sola mutación rtN236T. 2 No analizado TABLA 7 Susceptibilidad a fármaco in vitro de cepa de HBV derivada de paciente que porta la mutación rt 236T 1 Acido libre de MCC-478 Por consiguiente, los pacientes con mutaciones de resistencia son opcionalmente tratados por uno o más terapéuticos anti-H3V que no tuvieron resistencia cruzada, muy notablemente tenofovir, MCC-478, lamivudina, L-dT o entecavir. Típicamente, el tratamiento es mediante coadministración (ya sea como una dosis individual, co-formulada tal como una tableta o mediante coadministración en el curso de la terapia). Generalmente, se utilizan dos agentes juntos, v.gr., tenofovir y adefovir, entcavir y adefovir, L-dT y adefovir, lamivudina y adefovir y MCC-478 y adefovir .

Efecto de las mutaciones rtN236T, rtA181V y rtA181T sobre HbsAg El genoma de HBV está organizado en cuadros de lectura traslapables . El gen del antígeno de superficie de HBV (HBsAg) es completamente traslapado por el gen de polimerasa de HBV. Las mutaciones . de polimerasa de HBV (rtV173L, rtL180M, y rtM204V o I) asociadas con resistencia a lamivudina simultáneamente hacen que las mutaciones HBsAg confieran afinidad de unión reducida a anticuerpo anti-HBsAg de suero de vacuna [19] . Estos hallazgos hacen que surja la posibilidad de que las mutaciones HBsAg seleccionadas por lamivudina puedan tener el potencial para escapar la neutralización por anticuerpo anti-HBsAg inducido por vacuna. A diferencia de las mutaciones de resistencia a lamivudina, la mutación de resistencia a adefovir rtN236T está localizada hacia el extremo 3' del codón de interrupción del gen HBsAg. Consecuentemente, la mutación rtN236T no causa ningún cambio en la proteína HBsAg y por lo tanto no tiene riesgo de convertirse en una variante de escape de vacuna. Sin embargo, las mutaciones rtA181V y rtA181T en la transcriptasa inversa de HBV causan simultáneamente mutaciones en HBsAg. La mutación rtA18lV causa una mutación SL173F en el HBsAg mientras que la mutación rtA181T causa un codón de interrupción en el marco de lectura abierta de HBsAg. La importancia clínica de estas mutaciones de HBsAg correspondientes sigue siendo poco clara. En una modalidad de la invención, el antígeno de superficie que porta la mutación sL173F o que termina inmediatamente antes de L172 es útil desde el punto de vista de diagnóstico para determinar la emergencia de las mutaciones o para preparar vacunas útiles en la terapia de estas mutaciones. Todas las referencias y citas de la presente invención se incorporan expresamente por referencia.

REFERENCIAS 1. Lai C-L, Dienstag J, Schiff E, Leung NWY, Atkins M, Hunt C, Brown N, Woessnsr NI, Boehme R y Condreay L. Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B. Clinical Inf ectious Diseases 2003;36:687-696 2. Stuyver LJ, Locarnini SA, Lok A, Richman DD, Carman WF, Dienstag JL y Schinazi RF . Nomenclature for ant i vi ra 1 - re s i s t ant human hepatitis B virus mutations in the polymerase región. Hepatology 2001;33:751-757 3. Delaney E , Yang H, Westland C, Das K, Arnold E, Miller M, Gibbs C y Xiong S. Functional analysis of rtV173L, an HBV polymerase mutation frequently observed in 1 ami vudi ne - re s i s t ant chronic hepatitis B patients [poster] . En: 53rd Annual Meeting of The American Association for the Study of Liver Diseases-The Liver Meeting. Boston, ass: Poster 102710, 2002 4. Xiong X, Flores C, Yang H, Toóle JJ y Gibbs CS . Mutations in hepatitis B DNA polymerase associated with resistance to lamivudine do not confer resistance to adefovir in vitro. Hepatology 1998;28:1669-1673 5. Yokota T, Konno K, Shigeta S, Holy A, Balzarini J y De Clercq E. Inhibitory effects of acyclic nucleoside phosphonate analogues of hepatitis B virus DNA synthesis in HB611 cells. Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1994 ; 5 : 57-63 6. Yokota T, Mochizuki S, Konno K, Mor S, Shigeta S y De Clercq E. Inhibitory effects of selected antiviral compounds on human hepatitis B virus DNA synthesis. ' Ant imicrobial Agents and Chemotherapy 1991;35:394-397 7. Heijtink RA, Kruining J , de Wilde GA, Balzariní J, De Clercq E y Schalm SW . Inhibitory effects of acyclic nucleoside phosphonates on human hepatitis B virus and duck hepatitis B virus infections in tissue culture. Ant imi crobial Agents and Chemotherapy 1994;38:2180-2182 8. Heijtink RA, De Wilde GA , Kruining J, Berk L, Balzarini J, De Clercq E, Holy A y Schalm SW. Inhibitory effect of 9- (2-phosphonylmethoxyethyl ) adenine (PMEA) on human and duck hepatitis B virus infection. Antiviral Research 1993;21:141-153 9. Korba BE, Milman G. A cell culture assay for compounds which inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Research 1991;15:217-228 10. Dandri M, Burda MM . Increased hepatocyte turnover and inhibition of woodchuck hepatitis B virus replication by adefovir in vitro do not lead to reduction of the closed circular DNA. Hepatology 2000;32:139-146 11. Marcellin P, Chang T-T, Lim SG, Tong MJ, Sievert , Shiffman ML, Jeffers L, Goodman Z, ulfsohn MS, Xiong S, Fry J, Brosgart C y el Grupo de Estudio 437 para Adefovir Dipivoxil. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine 2003;348:808-816 12. Hadziyannis SJ, Tassopoulos N, Heathcote EJ, Chang T-T, Kitis G, Rizzetto M, Marcellin P, Lim SG, Goodman Z, Wulfsohn MS, Xiong S, Fry J, Brosgart C y el Grupo de Estudio para Adefovir Dipivoxil 438. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine 2003;348:800-807 13. Hadziyannis S, Tassopoulos N, Heathcote J, Chang TT, Kitis G, Rizetto M, Marcellin P, Lim SG, Chen S-S, Wulfsohn M, Wollman M, Fry J, Brosgart C y el Grupo de Estudio 438. Two year results from a double-blind, randomized, placebo-controlled study of adefovir dipivoxil (ADV) for presumed precore mutant chronic hepatitis B [abstract] . Journal of Hepatology 2003;38:143. Abstract 492 14. Westland CE, Yang H, Delaney WE, IV, Gibbs CS, Miller MD, Wulfsohn M, Fry J, Brosgart CL, Xiong S y los Equipos de Estudio 437 y 438. Week 48 resistance surveillance in two phase 3 clinical studies of adefovir dipivoxil for chronic hepatitis B. Hepatology 2003;38:96-103 15. Benhamou Y, Bochet M, Thibault V, Calvez V, Fievet MH, Vig P, Gibbs CS , Brosgart C, Fry J, Namini H y Katlama C. Safety and efficacy of adefovir dipivoxil in patients co-infected with HIV-1 and lamivudine-resistant hepatitis B virus: an open-label pilot study. Lancet 2001;358 = 718-723 16. Westland CE, Delaney W, IV, Yang H , Gibbs CS, Miller MD , Lama N, Fry J, Brosgart CL, Wulfsohn M y Xiong S. Genotypic analysis of HBV isolates from liver transplant patients with lamivudine-resistant HBV who received adefovir dipivoxil therapy for one year [resumen] . En: Therapies for Viral Hepatitis. Boston, Mass: Abstract 2748,2002 17. EASL Jury. Conferencia del Consenso Internacional de EASL sobre Hepatitis B. 13-14 de septiembre de 2002: Geneva, Suiza. Declaración del consenso (versión corta) . Journal of Hepatology 2003;38:533-540 18. Angus P, Vaughan R, Xiong S, Yang H, Delaney W, Gibbs C, Brosgart C, Colledge D, Edwards , Ayres A, Bartholomeusz A y Locarnini S . Resistance to adefovir dipivoxil therapy associated with the selection of a novel mutation in the HBV poiymerase. Gastroenterology 2003;125:292-297 19. Torresi J. The virological and clinical significance of mutations in the overlapping envelope and polymerase genes of hepatitis B virus. Journal of Clinical Virology 2002;25:97-106 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Acido nucleico aislado caracterizado porque codifica para rtN236T, rtA181V, rtA181T, SL173F y/o sL172trunc de virus de hepatitis B o sus ácidos nucleicos complementarios . 2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es hepatitis B humana.
3. 3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es virus infeccioso intacto .
4. 4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es aproximadamente de 10 a 35 pares de bases.
5. 5. Acido nucleico caracterizado porque codifica por lo menos para uno de los mutantes rtN236T, rtA181V, rtA181T, SL173F y/o sL172trunc de virus de hepatitis B, el ácido nucleico está fusionado al ácido nucleico heterólogo.
6. 6. rtN236T, rtA181V, rtA181T, SL173F y/o sL172trunc caracterizados por un virus de hepatitis 3 de pato.
7. 7. Un pato infectado con rtN236T, rtA181V, rtA181T, sL173F y/o sL172trunc de virus de hepatitis B de pato.
8. 8. rtN236T, rtA181V, rtA181T, SL173F y/o sL172trunc de virus de hepatitis de marmota.
9. 9. Marmota infectada con rtN236T, rtA181V, rtA181T, SL173F y/o sL172trunc de virus de hepatitis de marmota.
10. 10. Un vector que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.
11. 11. Una célula hospedero transformada con un vector de la reivindicación 10.
12. 12. Un método caracterizado porque comprende cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 11 y recuperar rtN236T, rtA181V, rtA181T, SL173F y/o sL172trunc de la misma.
13. 13. Una composición caracterizada porque comprende (a) un mutante rtN236T, rtA181V, rtA181T, SL173F y/o sL172trunc de virus de hepatitis B aislado y/o (b) un mutante rtN rtN236T, rtA181V, rtA181T, sL173F y/o sL172trunc de virus de hepatitis 3 fusionado a un polipéptido heterólogo.
14. 14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el mutante se une a un marcador detectable, se une a una sustancia insoluble o se formula en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. 15. El mutante de conformidad con la reivindicación 13, en un virus de hepatitis B infeccioso.
16. 16. Un anticuerpo caracterizado porque es capaz de unirse específicamente a rtN236T, rtA181V, rtA181T, sL173F y/o sLI72trunc.
17. 17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque está unido a un marcador detectable, unido a una sustancia insoluble o formulado en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
18. 18. Un método para inmunoterapia caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una composición de la reivindicación 13.
19. 19. Un método para inmunoterapia caracterizado porque comprende administrar a un sujeto el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16.
20. 20. Un método para el tratamiento de HBV que comprende administrar adefovir a un sujeto infectado con HBV, determinar si el sujeto está infectado con rtN236T, rtA181V, rtA181T, sL173F y/o sL172trunc de HBV y, si es así, administrar al sujeto un fármaco anti-HBV ai cual el mutante de HBV no tiene resistencia cruzada a adefovir.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el adefovir y el fármaco se administran sustancialmente en forma simultánea al sujeto.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el fármaco se selecciona del grupo que consiste de entecavir, L-dT, MCC-478, FTC , L-dC, L-FMAU, L-Fd4C, Lamivudina y tenofocir.
23. 23. Un método caracterizado porque es para la prevención de emergencia de rtN236T, rtA181V, rtA181T, sL173F y/o sL172trunc en un sujeto que está bajo terapia para HBV que comprende administrar adefovir y por lo menos un fármaco anti-HBV sin resistencia cruzada.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el adefovir y el fármaco anti-HBV se administran sustancialmente en forma simultánea.
25. 25. Un equipo de PCR de diagnóstico para los mutantes rtN236T, rtA181V, rtA181T, sL173F y/o sL172trunc de HBV caracterizado porque comprende cebadores capaces de amplificar específ camente una secuencia de rt o sAg de HBV que contiene por lo menos uno de esos mutantes.