KR20230123701A - 북극고래 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물 - Google Patents
북극고래 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 북극고래 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로, 북극고래 유래 섬유아세포 성장인자 11(bowhead whale fibroblast growth factor 11, bhFGF11)의 아미노산으로 치환한 재조합 사람 FGF11은 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)에 대한 유전자 발현 억제, HBx 단백질(hepatitis B virus X protein) 발현 억제, FXR(farnesoid X receptor) 억제와 같은 메커니즘을 가진 사람 FGF11 보다 항바이러스 활성이 높음을 나타내기 때문에, 사람 FGF11 이용을 대체하는 새로운 항바이러스제로 제공될 수 있을 뿐만 아니라 기존의 항바이러스제와 병용 투여제로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 북극고래 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물에 대한 것이다.
B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)는 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae) 과에 속하는 DNA 바이러스로 1967년 Blumberg(1976년 이 공로로 노벨의학상을 받음)에 의해 발견된 이후 세계적으로 가장 높은 감염률로 인류에 피해를 주고 있는 바이러스 중의 하나로 알려져 있다.
세계보건기구(World Health Organization)에 따르면, 전 세계적으로 2억 4천만 명 가량의 만성 HBV 감염 환자가 존재하며 매년 50만 명에서 70만 명에 이르는 사람들이 B형 간염 바이러스의 감염으로 인한 질병으로 사망한다고 보고되었다. 한국의 경우 성인의 5~8%가 HBV 보유자인 것으로 파악되고 있으며, 성인에서 만성 간염 환자의 80%, 간경변증의 65%, 그리고 간세포암종 환자의 70%가 HBV 감염과 연관되어 있는 것으로 조사되었다.
HBV의 감염은 만성 간질환의 가장 중요한 원인이며, 간질환은 국내에서 가장 중요한 사회문제의 하나로 손꼽히는 실정이다. 따라서 이미 감염된 환자에서 만성간질환으로의 진행을 예방하거나 신규 감염을 방지할 수 있는 적절한 항바이러스제 치료가 필수적이다.
HBV에 대한 다양한 종류의 치료제가 개발되고 있으며, 세계적으로 연간 3조 5천억 원 이상, 국내 시장 규모는 연간 2천억 원 이상이고, 중국은 연간 1조 5천억 원 이상의 치료제가 사용되고 있다. 그러나 종래에 개발된 HBV 치료제는 초기 치료를 시작한 1년 내지 5년 까지는 우수한 치료 효과를 나타냈지만, 바이러스 변이가 발생됨에 따라 치료제에 대한 내성 바이러스로 인해 치료 효과가 현저히 감소되는 문제가 있다.
종래에 개발된 대부분의 HBV 치료제는 바이러스의 DNA 또는 RNA 중합효소를 타겟팅하여 작동하고 있으며, 이러한 치료제의 메커니즘이 바이러스의 변이를 유도한다는 연구가 보고되었다. 따라서 바이러스의 변이를 유도하지 않는 새로운 메커니즘으로 작동하는 HBV 치료제의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 북극고래 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로, 북극고래 유래 섬유아세포 성장인자 11(bowhead whale fibroblast growth factor 11, bhFGF11)의 아미노산으로 치환한 재조합 사람 FGF11은 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)에 대한 유전자 발현 억제, HBx 단백질(hepatitis B virus X protein) 발현 억제, FXR(farnesoid X receptor) 억제와 같은 메커니즘을 가진 사람 FGF11 보다 항바이러스 활성이 높음을 나타내기 때문에, 사람 FGF11 이용을 대체하는 새로운 항바이러스제로 제공될 수 있을 뿐만 아니라 기존의 항바이러스제와 병용 투여제로 제공될 수 있다.
도 1은 4종의 FGF11 단백질의 아미노산을 비교 분석한 결과이다.
도 2는 사람 FGF11 단백질의 C 말단에는 없는 고래 FGF11 C 말단의 36개 아미노산이 항바이러스 기능에 영향이 있는지 검토한 결과이다.
도 3은 북극고래 FGF11만의 독특한 아미노산 3개가 북극고래와 사람 FGF11의 기능 차이에 관여하는 가능성을 검토한 결과이다.
도 4는 사람 FGF11-R59G (hFGF11-R59G) 돌연변이 단백질이 사람 FGF11 보다 HBV 유전자 발현 억제 효과에서 차이가 있는지를 검토한 결과이다.
도 5는 hFGF11-R59G 재조합 단백질이 FXRalpha에 의한 HBV 유전자 발현 증가를 크게 억제함을 검토한 결과이다.
도 6은 hFGF11-R59G이 사람 FGF11 보다 FXRalpha 단백질의 안정성을 크게 감소시키는 사실을 검토한 결과이다.
도 7은 사람 FGF11이 FXRalpha와 물리적으로 결합할 수 있지만, hFGF11-R59G은 사람 FGF11 보다 FXRalpha와 더 강하게 결합함을 공동-면역침전분석(co-immunprecipitation) 실험으로 확인한 결과이다.
도 2는 사람 FGF11 단백질의 C 말단에는 없는 고래 FGF11 C 말단의 36개 아미노산이 항바이러스 기능에 영향이 있는지 검토한 결과이다.
도 3은 북극고래 FGF11만의 독특한 아미노산 3개가 북극고래와 사람 FGF11의 기능 차이에 관여하는 가능성을 검토한 결과이다.
도 4는 사람 FGF11-R59G (hFGF11-R59G) 돌연변이 단백질이 사람 FGF11 보다 HBV 유전자 발현 억제 효과에서 차이가 있는지를 검토한 결과이다.
도 5는 hFGF11-R59G 재조합 단백질이 FXRalpha에 의한 HBV 유전자 발현 증가를 크게 억제함을 검토한 결과이다.
도 6은 hFGF11-R59G이 사람 FGF11 보다 FXRalpha 단백질의 안정성을 크게 감소시키는 사실을 검토한 결과이다.
도 7은 사람 FGF11이 FXRalpha와 물리적으로 결합할 수 있지만, hFGF11-R59G은 사람 FGF11 보다 FXRalpha와 더 강하게 결합함을 공동-면역침전분석(co-immunprecipitation) 실험으로 확인한 결과이다.
본 발명은 북극고래(bowhead whale) 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 북극고래 유래 섬유아세포 성장인자 11(bowhead whale fibroblast growth factor 11, bhFGF11)이 간암세포에서 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)에 대한 유전자 발현 억제, HBx 단백질(hepatitis B virus X protein) 발현 억제, FXR(farnesoid X receptor) 억제와 같은 항바이러스 활성이 사람 FGF11 보다 높음을 나타내는 것을 확인하였다. 사람 FGF11과 차이나는 북극고래 FGF11의 아미노산 서열 중 하나인 R59G를 사람 FGF11 유전자에 치환한 재조합 FGF11(hFGF11-R59G)이 사람 FGF11 보다 항바이러스 기능이 높으며, FGF11 단백질 안정성도 증가함을 확인하였다. 이 결과들은 인체에 적용 가능한 사람 FGF11 단백질의 아미노산 하나(R59G)를 치환한 재조합 hFGF11-R59G 단백질을 기존의 사람 FGF11 보다 항바이러스 기능이 증가한 새로운 항바이러스제로 제공할 수 있다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 바이러스는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 재조합 FGF11는 유비퀴틴화(ubiquitination) 수준이 낮아, 세포 내 재조합 FGF11 단백질의 안정성이 증가될 수 있다.
바람직하게는, 상기 조성물은 FXRα-매개 HBV 유전자의 프로모터 활성을 억제할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조성물은 FXRα 단백질의 분해속도를 증가시켜, FXRα 단백질의 안정성을 감소시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 조성물은 HBx 단백질(hepatitis B virus X protein) 생성 또는 HBx mRNA 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 "서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 FGF11"은 사람 FGF11의 59번 아미노산 위치의 아르기닌(arginine)이 북극고래 FGF11의 글리신(glycine)으로 치환된 것으로서, 본 명세서에서는 "hFGF11-R59G"로 명명하였다.
한편, 사람 FGF11의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시하였고, 북극고래 FGF11의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시하였다.
상기 항바이러스 조성물은 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV)의 유전체 변형을 유도하지 않고, 복제 관련 단백질을 표적하여 작동하기 때문에, 기존의 항바이러스제와 병용투여하면 항바이러스 효과가 우수하게 나타날 수 있다.
상기 항바이러스 조성물은 항바이러스제와 병용하여 투여될 수 있으며, 항바이러스제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(seqeuntial)으로 투여될 수 있다. 항바이러스제는 라미부딘(lamivudine), 텔비부딘(telbivudine), 클레부딘(clevudine), 엔테카비르(entecavir), 아데포비어(adefovir), 테노포르비 디소프록실(tenofovir disoproxil), 테노포비르 알라페나미드(tenofovir alafenamide), 및 베시포비르(besifovir) 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 바이러스는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 액제, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조성물은 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 복막내 주사, 비강 투여, 구강 투여, 경피 투여 또는 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 바이러스는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
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실시예
1> 4종의
FGF11
단백질의 아미노산을 비교 분석
사람 FGF11, 긴수염고래(Fin whale) FGF11, 밍크고래(Minke whale) FGF11 및 북극고래(Bowhead whale) FGF11의 4종의 FGF11 단백질의 아미노산을 비교 분석하였다(도 1).
다른 3종과는 다른 북극고래만의 독특한 아미노산 구성을 탐색하였다. R59G, F101L, R165H 3개의 아미노산이 북극고래만이 가지고 있었다. 그리고 사람 FGF11 단백질에는 없는 C 말단 부위의 36개의 아미노산을 3종의 고래 FGF11은 가지고 있었다.
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실시예
2> 사람
FGF11
단백질의 C 말단에는 없는 고래
FGF11
C 말단의 36개 아미노산에 대한 항바이러스 기능 영향 분석
먼저 h-bh 36aa를 얻기 위해 다음과 같이 클로닝을 실시하였다. PCR을 이용해 사람 FGF11과 북극고래 FGF11 C-말단 36 개 아미노산 부분을 따로 증폭하였다. 프라이머 정보는 아래 표 1에 나타내었다. 이때 사용한 프라이머에서 사람 FGF11을 증폭하는 역방향(reverse) 프라이머에는 북극고래 FGF11 부분이, 북극고래 FGF11 C-말단 36 개 아미노산 부분을 증폭하는 정방향(forward) 프라이머에는 사람 FGF11 부분이 조금 포함되어있어야 하는데, 이 부분은 굵게 표시하였다. 따로 증폭한 PCR 결과물인 DNA는 QIAEX II® Gel Extraction Kit (QIAGEN) 를 이용하여 얻었다. 각각의 DNA를 1:1 비율로 혼합한 후, 이를 주형으로 삼아 제한효소 부위 (SalI, BamHI) 를 포함한 프라이머 (앞의 PCR에서 사용한 사람 FGF11-F, 북극고래 FGF11-R) 를 이용하여 PCR기법으로 증폭하였다. 프라이머 정보는 아래 표 1에 나타냈으며, 제한효소 부위는 밑줄로 나타내었다. PCR 결과물인 증폭된 DNA는 클로닝에 사용 될 삽입물(insert)로, 마찬가지로 QIAEX II® Gel Extraction Kit (QIAGEN) 를 이용하여 얻었다. 얻은 삽입물(insert)과 벡터인 pFLAG-CMV2를 각각 제한효소 (SalI, BamHI) 로 절단한 후, 그 결과물을 QIAEX II® Gel Extraction Kit (QIAGEN) 를 이용하여 얻었다. T4 ligase (Enzynomics) 를 사용하여 제한효소로 절단된 벡터와 삽입물(insert)을 4℃에서 O/N (overnight) 동안 라이게이션(결찰) 시켰다. 트랜스포메이션(형질전환)을 이용하여 클로닝을 확인한 후, QIAfilter Plasmid Midi Kit (QIAGEN) 를 이용하여 pFLAG-CMV2-h-bh 36aa 플라스미드를 확보했다.
| Primer | 서열 | |
| h.FGF11 | Forward | 5’-GTCGACGCGGCGCTGGCCAG-3’ |
| Reverse | 5’-GCATGGCAGGGGGCAGG -3’ | |
| bh.FGF11 36 aa |
Forward | 5’-CTGCCCCCTGCCATGCAG-3’ |
| Reverse | 5’-GGATCCTCAGGGCATGAGCG-3’ | |
| h-bh 36aa | Forward | 5’-GTCGACGCGGCGCTGGCCAG-3’ |
| Reverse | 5’-GGATCCTCAGGGCATGAGCG-3’ | |
본 발명의 실시예 2에서 사용한 인간 간암세포주인 Hep3B는 열처리하여 비활성화시킨 10% FBS (fetal bovine serum, Gibco BRL)와 페니실린 및 스트렙토마이신 (Gibco BRL)이 포함된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, WELGENE) 배지를 이용해 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
본 발명의 실시예 2에서 사용한 FGF11 플라스미드는 한국해양과학기술원(KIOST, Korea Institute of Ocean Science & Technology) 임형순 박사님 연구팀에서 제공받았다.
본 발명의 실시예 2에서 실시한 웨스턴 블럿은 다음과 같은 과정으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 1.2 mer 3x flag HBV, pFLAG-CMV2-h.FGF11, pFLAG-CMV2-bh.FGF11, pFLAG-CMV2-h-bh 36aa 플라스미드를 도 2A 및 도 2B에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 세포를 회수하고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF) 를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 12-15% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 단백질 30 μg을 SDS-PAGE를 실시하여 크기별로 분류하였다. 그 다음으로 폴리아크릴아마이드 겔 내의 단백질들을 트랜스퍼 과정을 통해 PVDF 멤브레인 상으로 이동시킨 후, 1:2000으로 희석한 1차 항체 anti-actin (Sigma), anti-flag (Cell signaling)를 처리한 후 반응시켰다. 그리고 상기의 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하여 표적 단백질의 발현량을 확인하였다.
본 발명의 실시예 2에서 실시한 단백질 안정성 분석법은 다음과 같은 방법으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 pFLAG-CMV2-h.FGF11, pFLAG-CMV2-h-bh 36aa 플라스미드를 도 2C에 나타낸 것처럼 각각 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 단백질 신합성 저해제인 시클로헥시미드 (cycloheximide, CHX) (Sigma) 25 μg/ml을 도 2C에 나타낸 것처럼 20분 간격으로 처리하였다. 세포를 회수하고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF) 를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 상기와 같은 방법으로 웨스턴 블럿을 실시하여 단백질 분해 정도를 확인하여 단백질 안정성을 분석하였다.
상기와 같이 고래 FGF11 C-말단 36개 아미노산이 추가된 재조합 사람 FGF11 제작하여 HBV 바이러스의 HBx 단백질 생성 저해 효과를 분석하였다. 도 2B에서 고래 FGF11의 C-말단의 36개 아미노산은 HBV 유전자 발현에 거의 영향을 나타내지 않는 결과를 보였다.
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실시예
3>
북극고래
FGF11만의
독특한 아미노산 3개가
북극고래와
사람 FGF11의 기능 차이에 관여하는지 분석
먼저, h.FGF11 돌연변이체를 얻기 위해 다음과 같이 mutagenesis 후 클로닝을 실시하였다. Mutagenesis는 overlap extension PCR 기법을 이용하여 실시되었다. PCR을 이용해 mutation site를 기준으로 N-말단 부위, C-말단 부위 따로 증폭하였다. 3 개의 mutant 제작이므로 총 6 개의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 클로닝에 사용되는 제한 효소가 포함된 프라이머 하나(예시. R59G N-말단: h.FGF11 cloning forward primer)와 mutation에 사용되는 프라이머 하나(예시. R59G N-말단: R59G mutagenesis reverse primer)가 한 세트를 이룬다. 이때 사용되는 mutagenesis 프라이머는 mutation 된 서열을 가지고 있어야 한다. 프라이머 정보는 아래 표 2에 나타내었다. Mutation 되는 부분은 굵게 표시하였다. 따로 증폭한 PCR 결과물인 DNA는 QIAEX II® Gel Extraction Kit (QIAGEN)를 이용하여 얻었다. 각각의 DNA를 1:1 비율로 혼합한 후, 이를 주형으로 삼아 제한효소 부위 (SalI, BamHI) 를 포함한 클로닝 프라이머를 이용하여 PCR 기법으로 증폭하였다. 3 개의 mutant 제작이므로 총 3 개의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 프라이머 정보는 아래 표 2에 나타내었다. 제한효소 부위는 밑줄로 나타내었다. PCR 결과물인 증폭된 DNA는 클로닝에 사용될 삽입물(insert)로, 마찬가지로 QIAEX II® Gel Extraction Kit (QIAGEN) 를 이용하여 얻었다. 얻은 삽입물(insert)과 벡터인 pFLAG-CMV2를 각각 제한효소 (SalI, BamHI) 로 절단한 후, 그 결과물을 QIAEX II® Gel Extraction Kit (QIAGEN) 를 이용하여 얻었다. T4 ligase (Enzynomics)를 사용하여 제한효소로 절단된 벡터와 삽입물(insert)을 4℃에서 O/N (overnight) 동안 라이게이션(결찰) 시켰다. 트랜스포메이션(형질전환)을 이용하여 클로닝을 확인한 후, QIAfilter Plasmid Midi Kit (QIAGEN)를 이용하여 3 개의 mutant 플라스미드를 확보했다.
| Primer | 서열 | ||
| Mutagenesis | R59G | Forward | 5’-CGGCCCGCGGGGCCGGACCG-3’ |
| Reverse | 5’-GCCGCGGTCCGGCCCCGC-3’ | ||
| F101L | Forward | 5’-GAGGATACCAGCTCCCTCACCCACTTCAACC-3’ | |
| Reverse | 5’-GGTTGAAGTGGGTGAGGGAGCTGGTATCCTC-3’ | ||
| R165H | Forward | 5’-CTCTCTACCGCCAGCATCGTTCTGGCCG-3’ | |
| Reverse | 5’-CGGCCAGAACGATGCTGGCGGTAGAGAG-3’ | ||
| Cloning | h.FGF11 | Forward | 5’-GTCGACGCGGCGCTGGCCAG-3’ |
| Reverse | 5’-GGATCCTCAGGGGGCAGGGGG-3’ | ||
본 발명의 실시예 3에서 실시한 웨스턴 블럿은 다음과 같은 과정으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G, pFLAG-CMV2-h.FGF11 F101L, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R165H 플라스미드를 도 3B에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 세포를 회수하고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 12-15% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 단백질 30 μg을 SDS-PAGE를 실시하여 크기별로 분류하였다. 그 다음으로 폴리아크릴아마이드 겔 내의 단백질들을 트랜스퍼 과정을 통해 PVDF 멤브레인 상으로 이동시킨 후, 1:2000으로 희석한 1차 항체 anti-actin (Sigma), anti-flag (Cell signaling)를 처리한 후 반응시켰다. 그리고 위의 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하여 표적 단백질의 발현량을 확인하였다.
본 발명의 실시예 3에서 실시한 단백질 안정성 분석법은 다음과 같은 방법으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G, pFLAG-CMV2-h.FGF11 F101L, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R165H 플라스미드를 도 3C에 나타낸 것처럼 각각 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 단백질 신합성 저해제인 시클로헥시미드 (cycloheximide, CHX) (Sigma) 25 μg/ml 또는 프로테아좀(단백질 분해) 저해제인 MG-132 (Sigma) 25 μM을 도 3C에 나타낸 것처럼 20분 간격으로 처리하였다. 세포를 회수하고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 상기와 같은 방법으로 웨스턴 블럿을 실시하여 단백질 분해 정도를 확인하여 단백질 안정성을 분석하였고, Image Studio Lite 프로그램을 이용하여 그래프화 하였다.
본 발명의 실시예 3에서 실시한 유비퀴틴화 분석법은 다음과 같은 방법으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 pcDAN3-HA-Ub, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G, pFLAG-CMV2-h.FGF11 F101L, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R165H 플라스미드를 도 3D에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 도 3D에 나타낸 것처럼 DMSO 또는 프로테아좀(단백질 분해) 저해제인 MG-132 (Sigma) 25 μM을 4 시간 처리하였다. 세포를 회수하고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF) 를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 각각의 단백질 30 μg은 whole cell lysate 확인용으로 따로 옮겨두었다. 각각의 단백질 500 μg을 500 μl의 lysis buffer에 희석하였다. 도 3D에 나타낸 것처럼 해당 항체와 4℃에서 O/N (overnight) 동안 로테이터 (rotator) 에서 반응시켰다. 그리고 protein G-Sepharose beads (50% suspension) (Invitrogen) 와 4℃에서 2 시간 동안 로테이터 (rotator) 에서 반응시켰다. cold-PBS를 이용하여 3 번 세정한 후, 원심분리(12000 rpm, 3 min) 하여 상층액을 제거하였다. 같은 볼륨의 2x Laemmli sample buffer를 분주하고 95℃에서 5분간 반응시켰다. 원심분리(12000 rpm, 3 min)하여 상층액을 SDS-PAGE 하였다. 이 때, 덜어놓은 단백질 30 μg으로 whole cell lysate에서도 단백질 발현을 확인하였다. 이 후의 과정은 위의 웨스턴 블럿 과정과 동일하다. 1차 항체 anti-actin (Sigma), anti-flag (Cell signaling), anti-HA (Roche) 를 이용하였다.
상기와 같이, 아미노산 3개 각각을 사람 FGF11에 치환한 재조합 사람 FGF11을 제작하여 기능 차이를 분석하였다. 사람과 고래 FGF11에서 차이가 있는 3개의 아미노산을 선정하였다. 59번 아미노산 위치의 arginine(사람)이 glycine(고래)으로 치환된 경우, 101번 아미노산 위치의 phenylalanine(사람)이 leucine(고래)으로 치환된 경우, 그리고 165번 아미노산 위치의 arginine(사람)이 histidine(고래)으로 치환된 경우이다(도 3A). 사람 FGF11과 3개 아미노산이 각각 치환된 재조합 사람 FGF11(hFGF11-R59G, hFGF11-F101L, hFGF11-R165H)를 세포 내에서 발현시켰을 때, R59G를 치환한 사람 FGF11 단백질의 양이 많게 유지되었다(도 3B). 단백질 신생합성 저해제인 cyclohexamide (CHX)와 단백질 분해기구 proteasome 저해제인 MG-132 처리 실험에서도 hFGF11-R59G 단백질의 분해 속도가 가장 느렸으며, 안정적으로 세포 내에서 유지가 되었다(도 3C). 세포 내 단백질을 분해하기 위한 유비퀴틴화(ubiquitination) 반응을 조사한 결과, hFGF11-R59G의 유비퀴틴화(ubiquitination) 정도가 가장 약함을 알 수 있으며, 이는 단백질 분해 정도가 상대적으로 느리다는 것을 나타낸다(도 3D).
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실시예
4> 사람 FGF11-R59G (hFGF11-R59G) 돌연변이 단백질이 사람 FGF11 보다 HBV 유전자 발현 억제 효과에서 차이가 있는지 분석
본 발명의 실시예 4에서 실시한 루시퍼레이즈 리포터 분석법은 다음과 같은 방법으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 각 200 ng의 1.3x HBV-luc, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G, pFLAG-CMV2-h.FGF11 F101L, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R165H 플라스미드를 도 4A에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, cell lyis buffer (Promega)를 사용하여 세포를 회수하고, luminescence luminometer (Promega) 기기를 이용하여 기기의 프로토콜에 따라 실시하였다.
본 발명의 실시예 4에서 실시한 RNA 추출, cDNA 합성 그리고 실시간 정량 PCR 증폭 과정은 다음과 같은 방법으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 각 500 ng의 1.2 mer HBV, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G, pFLAG-CMV2-h.FGF11 F101L, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R165H 플라스미드를 도 4B에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, Trizol (Invitrogen)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 용해시킨 후 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 nanodrop을 이용하여 정량하였다. 0.5 μg의 RNA를 M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics)를 사용하여 최종 용액이 20 μl이 되도록 반응 용액을 만든 후 cDNA를 합성하였다. 위의 과정에 따라 합성된 cDNA는 실시간 정량 PCR 증폭 과정을 통해 mRNA 발현량이 확인되었다. TOPreal qPCR ×2 PreMIX with SYBR green (Enzynomics) 사용하여 StepONETM Real-time PCR System 을 이용해 실시하였다. 프라이머 정보는 아래 표 3에 나타내었다. 상대적인 mRNA 정량분석은 ΔΔCt method를 이용하였고, 결과는 calibrator(RQ=2- Δ ΔCt)에 상대적인 n-fold 차이로 나타내었다.
| Primer | 서열 | 결합 온도 | |
| HBx | Forward | 5’-ATGGCTGCTAGGCTGTGCTGC-3’ | 58℃ |
| Reverse | 5’-TTAGGCAGAGGTGAAAAAGTT-3’ | ||
| GAPDH | Forward | 5’-GTGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3’ | 56℃ |
| Reverse | 5’-TCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG-3’ | ||
본 발명의 실시예 4에서 실시한 웨스턴 블럿은 다음과 같은 과정으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 각 1 μg의 1.2 mer 3x flag HBV, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G, pFLAG-CMV2-h.FGF11 F101L, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R165H 플라스미드를 도 4C에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 세포를 회수하고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF) 를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 12-15% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 단백질 30 μg을 SDS-PAGE를 실시하여 크기별로 분류하였다. 그 다음으로 폴리아크릴아마이드 겔 내의 단백질들을 트랜스퍼 과정을 통해 PVDF 멤브레인 상으로 이동시킨 후, 1:2000으로 희석한 1차 항체 anti-actin (Sigma), anti-flag (Cell signaling)를 처리한 후 반응시켰다. 그리고 위의 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하여 표적 단백질의 발현량을 확인하였다.
도 4A에서 hFGF11-R59G는 사람 FGF11 보다 HBV 레프리콘 (replicon)을 이용한 HBV 프로모터 활성을 더 감소시킴을 알 수 있었다. 도 4B는 HBx mRNA 생성을 억제 효과가 뛰어남을 보여주며, 도 4C는 HBx 단백질 생성 억제 효과가 커짐을 나타내었다.
<
실시예
5>
hFGF11
-
R59G
재조합 단백질이
FXRalpha에
의한
HBV
유전자 발현 증가를 억제하는지 분석
본 발명의 실시예 5에서 사용한 pCMV-FXRα1 플라스미드는 UCLA Medicine의 Dr.Peter Edward 연구실에서 제공받았다.
본 발명의 실시예 5에서 실시한 루시퍼레이즈 리포터 분석법은 다음과 같은 방법으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 각 200 ng의 1.3x HBV-luc, pCMV- FXRα1, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G, pFLAG-CMV2-h.FGF11 F101L, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R165H 플라스미드를 도 5A, 도 5C 및 도 5E에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 도 5A의 경우, 트랜스펙션하고 24 시간 후, cell lyis buffer (Promega)를 사용하여 세포를 회수하고, luminescence luminometer (Promega) 기기를 이용하여 기기의 프로토콜에 따라 실시하였다. 도 5C 및 도 5E의 경우, 트랜스펙션하고 24 시간 후, FXR의 작용제 (agonist) 인 GW4064 10 μM 또는 FXR의 길항제 (antagonist) 인 z-guggulsterone 10 μM를 24 시간 동안 처리하였다. cell lysis buffer (Promega)를 사용하여 세포를 회수하고, luminescence luminometer (Promega) 기기를 이용하여 기기의 프로토콜에 따라 실시하였다.
본 발명의 실시예 5에서 실시한 웨스턴 블럿은 다음과 같은 과정으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 각 1 μg의 1.2 mer 3x flag HBV, pCMV- FXRα1, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G 플라스미드를 도 5B, 도 5D 및 도 5F에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 도 5B의 경우, 트랜스펙션하고 24 시간 후, 세포를 회수하였다. 도 5D 및 도 5F의 경우, 트랜스펙션하고 24 시간 후, FXR의 작용제 (agonist) 인 GW4064 10 μM 또는 FXR의 길항제 (antagonist) 인 z-guggulsterone 10 μM를 24 시간 동안 처리한 후, 세포를 회수하였다. lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF) 를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 10-15% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 단백질 30 μg을 SDS-PAGE를 실시하여 크기별로 분류하였다. 그 다음으로 폴리아크릴아마이드 겔 내의 단백질들을 트랜스퍼 과정을 통해 PVDF 멤브레인 상으로 이동시킨 후, 1:1000-2000으로 희석한 1차 항체 anti-actin (Sigma), anti-flag, anti-FXR (Cell signaling)을 처리한 후 반응시켰다. 그리고 위의 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하여 표적 단백질의 발현량을 확인하였다.
FXRalpha는 HBV의 유전자 발현 조절 부위인 프로모터 (promoter)에 반응하여 HBV의 유전자 전사 활성을 증가시키는 전사 인자이다. 이전 연구에서 사람 FGF11이 FXRalpha-매개 HBV 유전자 활성을 저해하였는데, hFGF11-R59G는 사람 FGF11 보다 HBV 프로모터 활성의 억제효과가 컸으며(도 5A), HBx 단백질 생성 억제 효과도 일치되게 뛰어남을 알 수 있었다(도 5B). FXRalpha의 agonist인 GW4064에 의해서 현저히 증가한 HBV 유전자 활성에서도 hFGF11-R59G는 사람 FGF11 보다 GW4064 agonist 효과를 크게 억제하였으며, HBx 단백질 생성 억제 효과도 같은 결과를 보였다(도 5C 및 도 5D). FXRalpha의 antagonist인 z-guggulsterone을 처리해서 발생하는 FXRalpha-매개 HBV 유전자 프로모터와 HBx 단백질 생성 억제효과에 있어서 hFGF11-R59G는 사람 FGF11 보다 z-guggulsterone 억제효과를 더 크게 만들었다(도 5E 및 도 5F).
<
실시예
6>
hFGF11
-
R59G이
사람
FGF11
보다
FXRalpha
단백질의 안정성을
감
소시키는지 분석
본 발명의 실시예 6에서 실시한 웨스턴 블럿은 다음과 같은 과정으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 각 1 μg의 pCMV- FXRα1, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G 플라스미드를 도 6A에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 세포를 회수하였고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 10-12% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 단백질 30 μg을 SDS-PAGE를 실시하여 크기별로 분류하였다. 그 다음으로 폴리아크릴아마이드 겔 내의 단백질들을 트랜스퍼 과정을 통해 PVDF 멤브레인 상으로 이동시킨 후, 1:1000-2000으로 희석한 1차 항체 anti-actin (Sigma), anti-flag, anti-FXR (Cell signaling) 을 처리한 후 반응시켰다. 그리고 상기 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하여 표적 단백질의 발현량을 확인하였다.
본 발명의 실시예 6에서 실시한 단백질 안정성 분석법은 다음과 같은 방법으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 각 1 μg의 pCMV-FXRα1, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G 플라스미드를 도 6B에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 단백질 신합성 저해제인 시클로헥시미드 (cycloheximide, CHX) (Sigma) 25 μg/ml 또는 프로테아좀(단백질 분해) 저해제인 MG-132 (Sigma) 25 μM을 도 6B에 나타낸 것처럼 1 시간 간격으로 처리하였다. 세포를 회수하고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF) 를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 위와 같은 방법으로 웨스턴 블럿을 실시하여 단백질 분해 정도를 확인하여 단백질 안정성을 분석하였다.
도 6A에서 hFGF11-R59G의 세포 내 발현이 FXRalpha의 단백질 양을 더 감소시킴을 확인하였다. 도 6B에서 단백질 신생 과정을 저해하는 시클로헥시미드(cyclohexamide; CHX)를 처리하여 hFGF11-R59G이 사람 FGF11 보다 FXRalpha 단백질 분해속도를 증가시킴을 확인하였다.
<
실시예
7>
hFGF11
-
R59G의
FXRalpha와의
결합 정도를 공동-면역침전(co-immunprecipitation) 분석
본 발명의 실시예 7에서 실시한 공동 면역침강법 (Co-Immunoprecipitation, Co-IP)은 다음과 같은 방법으로 실시되었다. Hep3B 세포에 jetPEI (PolyPlus Transfection)을 이용하여 pcDAN3-HA- FXRα1, pFLAG-CMV2-h.FGF11 WT, pFLAG-CMV2-h.FGF11 R59G 플라스미드를 도 7에 나타낸 조합으로 트랜스팩션하였다. 트랜스펙션하고 24 시간 후, 세포를 회수하고, lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.5, protease inhibitor and 1 mM PMSF) 를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물 내의 단백질을 Bradford reagent (Bio-Rad)를 사용하여 농도를 측정하였다. 각각의 단백질 25 μg은 whole cell lysate 확인용으로 따로 옮겨두었다. 각각의 단백질 500 μg을 500 μl의 lysis buffer에 희석하였다. 도 7에 나타낸 것처럼 해당 항체와 4℃에서 O/N (overnight) 동안 로테이터 (rotator) 에서 반응시켰다. 그리고 protein G-Sepharose beads (50% suspension) (Invitrogen) 와 4℃에서 2 시간 동안 로테이터 (rotator) 에서 반응시켰다. cold-PBS 를 이용하여 3 번 세정한 후, 원심분리(12000 rpm, 3 min) 하여 상층액을 제거하였다. 같은 볼륨의 2x Laemmli sample buffer를 분주하고 95℃에서 5분간 반응시켰다. 원심분리(12000 rpm, 3 min)하여 상층액을 10-12% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 SDS-PAGE 하였다. 이때, 덜어놓은 단백질 25 μg으로 whole cell lysate에서도 단백질 발현을 확인하였다. 그 다음으로 폴리아크릴아마이드 겔 내의 단백질들을 트랜스퍼 과정을 통해 PVDF 멤브레인 상으로 이동시킨 후, 1:1000으로 희석한 1차 항체 anti-actin (Sigma), anti-flag, anti-HA (Roche) 을 처리한 후 반응시켰다. 그리고 상기 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하여 표적 단백질의 발현량을 확인하였다.
도 7에서는 사람 FGF11이 FXRalpha와 물리적으로 결합할 수 있지만, hFGF11-R59G은 사람 FGF11 보다 FXRalpha와 더 강하게 결합함을 co-immunprecipitation 실험으로 확인하였다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation
Korea Institute of Ocean Science ＆ Technology
<120> Antiviral composition comprising recombinant fibroblast growth
factor 11 derived from bowhead whale
<130> ADP-2021-0839
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hFGF11-R59G
<400> 1
Met Ala Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ile Arg Gln Lys Arg Glu Val Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gly Gly Ser Arg Pro Val Ser Ala Gln Arg Arg Val Cys Pro
20 25 30
Arg Gly Thr Lys Ser Leu Cys Gln Lys Gln Leu Leu Ile Leu Leu Ser
35 40 45
Lys Val Arg Leu Cys Gly Gly Arg Pro Ala Gly Pro Asp Arg Gly Pro
50 55 60
Glu Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Lys Leu Phe Cys Arg Gln Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Pro Asp Gly Ser Ile Gln Gly Thr Pro Glu
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Phe Thr His Phe Asn Leu Ile Pro Val Gly Leu Arg
100 105 110
Val Val Thr Ile Gln Ser Ala Lys Leu Gly His Tyr Met Ala Met Asn
115 120 125
Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Pro His Phe Thr Ala Glu Cys Arg
130 135 140
Phe Lys Glu Cys Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Leu Tyr Ala Ser Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Arg Gln Arg Arg Ser Gly Arg Ala Trp Tyr Leu Gly Leu Asp
165 170 175
Lys Glu Gly Gln Val Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala
180 185 190
Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Leu Leu Glu Val Ala Met Tyr Gln Glu
195 200 205
Pro Ser Leu His Ser Val Pro Glu Ala Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala
210 215 220
Pro
225
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> Human
<400> 2
Met Ala Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ile Arg Gln Lys Arg Glu Val Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gly Gly Ser Arg Pro Val Ser Ala Gln Arg Arg Val Cys Pro
20 25 30
Arg Gly Thr Lys Ser Leu Cys Gln Lys Gln Leu Leu Ile Leu Leu Ser
35 40 45
Lys Val Arg Leu Cys Gly Gly Arg Pro Ala Arg Pro Asp Arg Gly Pro
50 55 60
Glu Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Lys Leu Phe Cys Arg Gln Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Pro Asp Gly Ser Ile Gln Gly Thr Pro Glu
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Phe Thr His Phe Asn Leu Ile Pro Val Gly Leu Arg
100 105 110
Val Val Thr Ile Gln Ser Ala Lys Leu Gly His Tyr Met Ala Met Asn
115 120 125
Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Pro His Phe Thr Ala Glu Cys Arg
130 135 140
Phe Lys Glu Cys Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Leu Tyr Ala Ser Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Arg Gln Arg Arg Ser Gly Arg Ala Trp Tyr Leu Gly Leu Asp
165 170 175
Lys Glu Gly Gln Val Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala
180 185 190
Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Leu Leu Glu Val Ala Met Tyr Gln Glu
195 200 205
Pro Ser Leu His Ser Val Pro Glu Ala Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala
210 215 220
Pro
225
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> Bowhead whale
<400> 3
Met Ala Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ile Arg Gln Lys Arg Glu Val Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gly Gly Ser Arg Pro Val Ser Ala Gln Arg Arg Val Cys Pro
20 25 30
Arg Gly Thr Lys Ser Leu Cys Gln Lys Gln Leu Leu Ile Leu Leu Ser
35 40 45
Lys Val Arg Leu Cys Gly Gly Arg Pro Ala Gly Pro Asp Arg Cys Pro
50 55 60
Glu Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Lys Leu Phe Cys Cys Gln Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Pro Asp Gly Ser Ile Gln Gly Thr Pro Glu
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Leu Thr His Phe Asn Leu Ile Pro Val Gly Leu Arg
100 105 110
Val Val Thr Ile Gln Ser Ala Lys Leu Gly His Tyr Met Ala Met Asn
115 120 125
Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Pro His Phe Thr Ala Glu Cys Arg
130 135 140
Phe Lys Glu Cys Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Leu Tyr Ala Ser Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Arg Gln His Arg Ser Gly Arg Ser Trp Tyr Leu Gly Leu Asp
165 170 175
Lys Glu Gly Arg Val Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala
180 185 190
Ala Ala His Phe Val Pro Lys Leu Leu Glu Val Ala Val Tyr Arg Glu
195 200 205
Pro Ser Leu His Ser Val Pro Glu Thr Ser Pro Ser Arg Pro Pro Ala
210 215 220
Pro Cys His Ala Val Pro Gly Leu Glu Ala Pro Cys Pro Arg His His
225 230 235 240
His Ser Leu Ser Pro Ser Pro Ala Ser Gly Pro Ala Leu Thr Pro Ala
245 250 255
Ala Thr Leu Met Pro
260
Claims (10)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)인 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 FGF11는 유비퀴틴화(ubiquitination) 수준이 낮아, 세포 내 재조합 FGF11 단백질의 안정성이 증가된 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 FXRα-매개 HBV 유전자의 프로모터 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 FXRα 단백질의 분해속도를 증가시켜, FXRα 단백질의 안정성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 HBx 단백질(hepatitis B virus X protein) 생성 또는 HBx mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 바이러스는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 섬유아세포 성장인자 11(fibroblast growth factor 11; FGF11)을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 바이러스는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220020779A KR20230123701A (ko) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 북극고래 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220020779A KR20230123701A (ko) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 북극고래 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230123701A true KR20230123701A (ko) | 2023-08-24 |
Family
ID=87841560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220020779A KR20230123701A (ko) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 북극고래 유래 재조합 섬유아세포 성장인자 11을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230123701A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101813324B1 (ko) | 2015-07-29 | 2017-12-29 | 서울대학교병원 | 혈관신생에 관련된 인간 ｆｇｆ11의 용도 |
-
2022
- 2022-02-17 KR KR1020220020779A patent/KR20230123701A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101813324B1 (ko) | 2015-07-29 | 2017-12-29 | 서울대학교병원 | 혈관신생에 관련된 인간 ｆｇｆ11의 용도 |
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