CN102816215A - 抑制hiv的短小多肽及药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制HIV的短小多肽及药物用途。该多肽为下述a）或b）或c）：a）序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；b）在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一个以上氨基酸残基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30个氨基酸残基组成；c）在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在内的任何位点添加或替代1个以上氨基酸得到的由21-30个氨基酸残基组成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。本发明的多肽与其他多肽相比虽然明显短小但却具有极强的抗病毒活性，具有易于合成、成本低廉的优点。

Description

抑制HIV的短小多肽及药物用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及用于抑制HIV的多肽、其药物组合物及其用途。

背景技术

艾滋病(AIDS)主要由人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）引起。自1981年发现艾滋病以来,全球已有超过6000万人感染艾滋病病毒，其中约2500万已经死亡。据WHO统计，现在每年新增HIV感染者约200万，严重威胁人类健康。疫苗是预防艾滋病的最好的手段，但有效的艾滋病疫苗近期恐难有重大突破。因此，研发阻断病毒不同复制阶段的药物是目前防控艾滋病的重点策略。

HIV-1的包膜糖蛋白(ENV)介导病毒进入靶细胞的过程。该蛋白由表面亚基gp120和跨膜亚基gp41通过非共价键连接而成。在天然状态下，ENV为三聚体，其中gp120形成一个球状复合物，而gp41则插入病毒包膜内(1)。gp120的主要功能是与受体CD4和辅助受体（趋化因子受体CCR5或CXCR4等）结合，而gp41主要介导病毒和细胞的膜融合。研究发现，gp41膜外区包含几个重要的功能区，包括疏水性融合肽（FP）、N-末端螺旋重复序列（NHR或HR1）、C-末端螺旋重复序列（CHR或HR2）。早在1997年，通过解析来源于NHR和CHR的多肽复合物的晶体结构，发现gp41的核心结构为六股α-螺旋束（six helix bundle,6-HB），其中三个NHR组成的N-螺旋通过在a和d位置的氨基酸残基相互作用形成位于中心的螺旋三聚体，其e和g位置的氨基酸残基则暴露于中心螺旋体的外围，并与三个CHR组成的C-螺旋的a和d位置相互作用(2-4)。C-螺旋以反向平行的方式分别结合在三个N-螺旋形成的沟槽中。基于gp41的三维结构信息提出了HIV-1膜融合机制：当gp120与靶细胞上的受体结合后发生显著的构象变化，gp41的融合肽（FP）被暴露出来并插入靶细胞膜内，CHR与NHR发生反向结合，形成稳定的6-HB结构，将病毒膜与靶细胞膜拉近而发生融合，从而介导HIV进入靶细胞内(5)。晶体结构揭示NHR含有明显的疏水口袋状结构（hydrophobic pocket）,被认为是抗HIV药物的新靶点。十余年来，针对NHR口袋筛选或设计HIV药物的研究一直是热点之一。

研究表明，CHR包含三个功能区，即位于N端的NHR疏水袋结合区（PBD：pocket-bindingdomain,aa628-635）、NHR结合区（NBD：aa628-666）和脂膜结合区（LBD：lipid-binding domain,aa666-673）。NHR和CHR螺旋间的相互作用对gp41核心结构的稳定性以及病毒的感染活性起着决定性的作用。在6-HB核心结构形成过程中，CHR上PBD的三个氨基酸（Trp628、Trp631和Ile635）以高亲和力插入NHR疏水口袋，对稳定六螺旋束结构至关重要(6-7)。然而，以前报道的6-HB结构CHR都起始于Trp628，对其上游序列的结构没有得到解析(2,4,8)，导致大多研究基于SIV gp41的结构而推测CHR疏水袋结合区上游序列⁶²¹QIWNNMT⁶²⁷也可能呈现α-螺旋结构(9)。然而，He,Y.等发现含有⁶²¹QIWNNMT⁶²⁷的多肽CP621-652可以和NHR多肽形成极其稳定的6-HB（Tm=82℃），远远高于被认为gp41核心结构的N36和C34复合体的稳定性（Tm=64℃）。同时，CP621-652具有显著的抗病毒活性(10)。这些结果提示，CHR上游的⁶²¹QIWNNMT⁶²⁷位点在gp41介导的膜融合过程有重要影响。为此，He,Y.等对gp41功能性核心结构的概念提出了修正。最近，Chong,H.等对基于CP621-652的6-HB进行了结构解析，发现⁶²¹QIWNNMT⁶²⁷序列并非螺旋结构(11)。令人兴奋的重要发现是，紧邻CHR的氨基酸残基Met626和Thr627形成一个独特的“钩子”样结构(命名为M-T钩子)，通过紧紧“钩住”NHR上的疏水口袋而稳定6-HB核心结构。实验结果揭示M-T钩子对HIV的感染性起着至关重要的作用。该发现为深入研发基于M-T钩子的HIV融合抑制剂奠定了理论基础。

于2003年获得美国FDA“快通道”批准的艾滋病治疗药物T20（Enfuvirtide，Fuzeon）即是来源于gp41 CHR的含有36个氨基酸残基的多肽，它主要通过阻断6-HB的形成过程而发挥作用(12)。T20是第一个也是目前唯一的用于临床治疗的HIV膜融合抑制剂，但由于耐药问题而限制了它的广泛应用。过去十余年来，靶向gp41的抗病毒多肽一直是HIV药物研究的热点(13)。研究发现,衍生于gp41CHR的多肽C34比T20具有更高的抗病毒活性。结构上T20和C34都包含NHR结合区，可以和NHR序列相互作用，但C34包含疏水袋结合区（PBD）而T20缺乏这个基序。C34水溶性较差，很难被发展成为药物,但由于其代表着CHR的核心序列，所以被广泛作为新型抗病毒多肽的设计模板(13)。T1249是T20的第二代产品，具有较高的抑制HIV能力，对T20耐药株也非常有效,但由于剂型问题而停止了临床试验(14)。研发第三代或称下一代高效的融合抑制多肽具有重要的理论意义和应用价值。基于C34的序列，国内设计了抗HIV多肽西夫韦肽（Sifuvirtide），已进行II期临床试验(15)。然而令人担忧的是，基于C34设计的抑制剂容易诱导病毒耐药的产生(16-17)。

同时令人关注的是,以前报道的HIV融合抑制多肽大都具有较长的氨基酸序列，如T20和西夫韦肽含有36个氨基酸残基，C34含有34个氨基酸残基,而T1249和T2635均具有39个氨基酸残基。无疑，多肽的长度与其制备的难度和成本密切相关。最近，日本学者报道了一个具有29个氨基酸的多肽（SC29EK），具有类似于C34的抗HIV活性，但进一步的截短（如22个氨基酸的SC22EK）则极大地降低多肽的抗病毒活性及与靶点结合的稳定性(18-19)。最近，何玉先等根据对gp41结构与功能的深入研究，设计了一个含有32个氨基酸的多肽P32（中国发明专利申请号：201110112709.7），其抗病毒活性显著提高，尤其对T20耐药病毒显示极强的优势。

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发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供具有抗HIV活性的长度在21-30个氨基酸残基的多肽、其药用盐、或其衍生物。

本发明所提供的多肽、其药用盐、或其衍生物，其中，所述多肽为下述a）或b）或c）：

a）序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；

b）在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一个以上氨基酸残基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30个氨基酸残基组成；

c）在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在内的任何位点添加或替代1个以上氨基酸得到的由21-30个氨基酸残基组成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。

其中，序列表中的序列14由23个氨基酸残基组成；序列表中的序列19由18个氨基酸残基组成，其氨基酸序列是序列表中序列14的第3-20位所示的氨基酸序列。

在本发明的实施方式中，b）所示的衍生多肽具体为下述b1）-b17）中的任一种多肽：

b1）氨基酸序列是序列表中序列18的多肽ELT23；

b2）氨基酸序列是序列表中序列9的多肽HP25；

b3）氨基酸序列是序列表中序列6的多肽HP28；

b4）氨基酸序列是序列表中序列10的多肽HP24；

b5）氨基酸序列是序列表中序列5的多肽HP30；

b6）氨基酸序列是序列表中序列8的多肽HP26；

b7）氨基酸序列是序列表中序列7的多肽HP27；

b8）氨基酸序列是序列表中序列15的多肽HP25-N3；

b9）氨基酸序列是序列表中序列12的多肽HP24-N2；

b10）氨基酸序列是序列表中序列17的多肽HP27-N3；

b11）氨基酸序列是序列表中序列16的多肽HP26-N3；

b12）氨基酸序列是序列表中序列13的多肽HP24-N3；

b13）氨基酸序列是序列表中序列11的多肽HP24-N1；

b14）氨基酸序列是序列表中序列1的多肽MT-SC22EK；

b15）氨基酸序列是序列表中序列2的多肽MT-SC21EK；

b16）氨基酸序列是序列表中序列3的多肽MT-SC20EK；

b17）氨基酸序列是序列表中序列4的多肽MT-SC19EK。

本发明具体实施方式中所列出的18种多肽的序列如表1所示。

表1.多肽序列

其中氨基酸的缩写具有本领域公知的含义，例如：W为色氨酸、N为天冬酰胺、E为谷氨酸、M为甲硫氨酸、T为苏氨酸、K为赖氨酸、I为异亮氨酸、Y为酪氨酸、L为亮氨酸、S为丝氨酸。

本发明所述多肽的一个或多个氨基酸可以用构象为D-型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或抗病毒活性。其中D-型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸、高丝氨酸等。

上述多肽衍生物可为下述1）-5）中的至少一种：

1）上述任一种多肽的氨基端连接氨基端保护基和/或上述任一种多肽的羧基端连接羧基端保护基得到的连接物；

2）上述任一种多肽的羧基端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；

3）上述任一种多肽的氨基端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；

4）上述任一种多肽的氨基端和羧基端均连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；

5）上述任一种多肽被蛋白质、聚乙二醇、马来酰亚胺修饰得到的修饰物。

其中，1）所述的多肽衍生物中，上述氨基端保护基可为乙酰基、氨基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团；所述羧基端保护基可为NH₂、羧基、酰胺基或叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。在本发明的实施方式中，1）所述的多肽衍生物具体为上述任一种多肽的氨基端连接乙酰基和上述任一种多肽的羧基端连接酰胺基得到的连接物。

2）所述的多肽衍生物中，寡肽可由2-10个氨基酸残基组成；所述亲脂性基团可含有3到20个碳原子的脂肪酸链，如含8-16个碳原子的脂肪酸链。

由上述任种一多肽和/或其药用盐和/或其衍生物形成的多聚体也属于本发明的保护范围。其中，多聚体是指两个以上相同或不同多肽通过氨基酸（如赖氨酸和半胱氨酸）或其他分子连接在一起形成的多聚体。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种组合物。

本发明所提供的组合物，其包含C1）和C2）：C1）上述任种一多肽、其衍生物、或其可药用盐，和/或上述多聚体；C2）药学上可接受的载体或辅料；

所述组合物具有下述D1）-D5）中的至少一种功能：

D1）抗HIV；

D2）治疗和/或预防和/或辅助治疗HIV感染所致疾病；

D3）抑制HIV进行细胞融合；

D4）抑制HIV侵入细胞；

D5）抑制HIV复制。

其中，HIV感染所致疾病可为艾滋病。

在实际应用中，可以将本发明的多肽、其药用盐、其衍生物、多聚体以及组合物作为药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，以达到治疗HIV感染的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料（如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等）、难溶性载体材料（如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等）、肠溶性载体材料（如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等）。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。

通常本发明药物组合物含有0.1－90重量％的C1）。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。本发明的多肽、其药用盐、其衍生物、多聚体以及组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

本发明的多肽、其药用盐、其衍生物、多聚体以及组合物可以直接单独用于HIV感染者的治疗和预防，也可以与一种或多种抗HIV药物联合使用，以达到提高整体治疗效果的目的。这些抗HIV药物包括但不限于逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、侵入抑制剂、整合抑制剂和成熟抑制剂等。上述的逆转录酶抑制剂可以是AZT、3TC、ddI、d4T、ddT、TDF、Abacavir、Nevirapine、Efavirenz和Delavirdine等的一种或几种；上述的蛋白酶抑制剂可以是Saquinavirmesylate、Idinavir、Ritonavir、Amprenavir、Kaletra和Nelfinavir mesylate等的一种或几种；上述的侵入抑制剂可以是Maraviroc、TAK-779、T20、T2635、西夫韦肽、VIRIP等的一种或几种；上述的整合抑制剂可以是Raltegravir等。

本发明的再一方面涉及治疗和/或预防和/或辅助治疗包膜类病毒感染的方法。

该方法包括给与受试者有效量的f1）和/或/f2）和/或f3）的步骤：

f1）上述任一种多肽、其药用盐、或其衍生物；

f2）上述多聚体；

f3）上述组合物。

具体地，所述包膜类病毒感染为HIV感染所致疾病或艾滋病。

对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的多肽、其衍生物、或其可药用盐用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001－1000mg/kg体重/天，例如介于0.01－100mg/kg体重/天，例如介于0.01－10mg/kg体重/天。

本发明的再一方面还要求保护编码上述任一种多肽的核酸分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本发明还要求保护g1）或g2）的生物材料：

g1）含有编码上述任一种多肽的核酸分子的表达盒、重组载体、重组病毒或重组细胞；

g2）表达上述任一种多肽的重组表达载体、重组微生物或重组细胞。

其中，表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

其中，表达盒是包含编码上述任一种多肽的核酸分子及其表达所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达上述任一种多肽。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。在多肽的氨基末端即有信号肽又有肽原区时，肽原区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。

本发明还涉及包含本发明编码上述任一种多肽的核酸分子、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。制备表达载体时，可使编码上述任一种多肽的核酸分子位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fEhrlich,1978，美国国家科学院学报75：1433)。可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的本发明编码上述任一种多肽的核酸分子以提高该基因产物的产量。该核酸分子的拷贝数增加可以通过将该核酸分子的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸分子一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸分子的细胞。用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。

术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。

本发明的再一方面涉及一种含有编码上述任一种多肽的核酸分子的重组细胞。重组细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌（如大肠杆菌细胞）或酵母细胞。

本发明再一方面还要求保护如下产品的制备方法。

该产品的制备方法，包括e1）或e2）的步骤：

e1）化学合成上述任一种多肽的步骤；

e2）生物表达上述任一种多肽的步骤；

所述产品为f1）、f2）或f3）：

f1）上述任一种多肽、其药用盐、或其衍生物；

f2）上述多聚体；

f3）上述组合物。

所述生物表达所述多肽具体可为在生物细胞中表达所述多肽。所述生物细胞可为非人的动物细胞、微生物细胞或植物细胞。

所述化学合成具体可为固相合成、液相合成。

本发明的发明人发现在短肽SC22EK的N末端加上形成“M-T钩子”的两个氨基酸残基（Met626和Thr627）能够显著提高其抗病毒活性和6-HB稳定性。进而，通过对P32多肽序列的截短，发现一组长度在21-30个氨基酸残基的短小多肽具有极强的抑制HIV作用。这些多肽尽管显著短于已报道的其他多肽，但可以稳定结合其作用的NHR靶点序列。本发明所提供的多肽具有明显的优点：

（1）仅含有21-30个氨基酸残基，显著短于其他已报道的多肽，如T20和西夫韦肽（均为36个氨基酸）、T1249和T2635（均为39个氨基酸）、C34和SC34EK（均为34个氨基酸）等。因此，本发明的多肽具有易于合成、成本低廉的优点。

（2）本发明的多肽与其他多肽相比虽然明显短小但却具有极强的抗病毒活性，比如抑制HIV的活性显著高于T20、T1249和西夫韦肽等。

（3）本发明的多肽对T20耐药毒株仍保留极强活性。比如多肽HP25-N2可以完全克服多个临床常见的T20耐药HIV突变毒株。

（4）本发明的多肽由于在N末端含有可以稳定多肽与靶点相互作用的形成“钩子结构”的氨基酸残基以及引入多个可以增强多肽螺旋性的“盐桥结构”（EK位点），因此能够更加牢固地结合靶序列，从而具有超强的稳定性。

（5）由于在多肽序列中大量引入亲水性的极性氨基酸（如E和K），本发明所述多肽易溶于水。水溶性的提高便于提高药物疗效和药物剂型的开发。

本发明将为研发新一代艾滋病治疗和预防药物奠定坚实的基础。

附图说明

图1为短肽HP25-N2的抗HIV活性及其与对照多肽的比较。

图2为基于SC22EK设计的抗HIV短肽与NHR多肽N36相互作用的圆二色谱分析。

图3为基于P32截短设计的抗HIV短肽与NHR多肽N36相互作用的圆二色谱分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。下述实施例中的所有多肽的氨基酸均为L-型氨基酸。

实施例1、多肽的制备

实施例中使用的所有多肽的合成均采用标准的固相多肽合成法（Fmoc/tBu策略），由羧基端向氨基端方向手动合成。所有多肽序列均按照多肽合成的常规将C-端酰胺化，N-端乙酰化（本领域人员知晓，这些修饰对多肽活性没有根本性影响）。采用N-芴甲氧羰（Fmoc）保护的氨基酸、采用Rink树脂（取代常数为0.44mmol/g）作为固相载体，用25%(体积百分含量)哌啶的DMF溶液脱除氨基保护基Fmoc，每次脱除步骤需进行两次，时长分别为8min和10min。接肽反应选用的缩合方法为DIPC/HOBt法和PyBOP法，氨基酸和活化试剂均采用3倍当量，反应时长为1小时，采用茚三酮定性显色（Kaiser法）监测反应进程。若某个氨基酸缩合反应不完全，适当延长反应时间或重复缩合一次，直至得到所需的目标肽段。使用切割试剂(三氟乙酸∶1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚：H₂O：三异丙基硅烷=68.5:10:10:5:3.5:1，v/v)将目标多肽从树脂上裂解下来并除去侧链保护基（30下℃切割4小时）。滤液加入到大量冷的无水乙醚中使多肽沉淀析出，离心。用乙醚洗涤数次后干燥，即得到多肽粗品。

采用HP1100型（美国安捷伦公司）反相高效液相色谱仪对制备得到的多肽进行纯化。色谱柱型号：Cosmosil 5C4-AR(10×250mm)。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由流动相A和流动相B组成。流动相A为三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的体积百分浓度为0.05%，乙腈的体积百分浓度为2%。流动相B为90%（体积百分浓度）乙腈水溶液。线性梯度洗脱由20%B到40%B，时间20分钟，洗脱流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。冻干溶剂后得到蓬松状态的多肽纯品，其化学结构由MALDI-TOF质谱进行表征，而其纯度则由分析型高效液相色谱仪（流速：每分钟1毫升）给出。其中，分析型高效液相色谱仪的型号：岛津CBM-10AVP PULS，所采用的色谱柱的型号:Agela4.6*250mm C18。色谱操作条件：线性梯度洗脱，洗脱液由流动相A和流动相B组成。流动相A为三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的体积百分浓度为0.05%，乙腈的体积百分浓度为2%。流动相B为三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的体积百分浓度0.05%，乙腈的体积百分浓度为90%。线性梯度洗脱由25%B到45%B，时间20分钟。得到的多肽纯品由分析型反相高效液相色谱仪表征表明纯度均大于95%。根据上述多肽合成方法得到本发明多肽的分子量和纯度如表2所示。

表2.多肽的分子量和纯度

实施例2、高活性抗HIV短肽的发现与鉴定

2.1实验材料与方法

2.1.1多肽对HIV介导的细胞融合的抑制作用

HIV介导的细胞融合抑制实验参照文献（Chong H,Yao X,Qiu Z,Qin B,Han R,Waltersperger S,Wang M,Cui S,He Y.Discovery of Critical Residues for Viral Entry andInhibition through Structural Insight of HIV-1 Fusion Inhibitor CP621-652.J Biol Chem.2012,287(24):20281-20289）。靶细胞为TZM-bl细胞，由美国国立卫生研究院（NIH）艾滋病试剂和参照物项目提供（目录号为8129），其表面表达CD4和CCR5和CXCR4，同时细胞内转录荧光素酶报告基因，但不含该基因的启动子。效应细胞为HL2/3细胞，由美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供（目录号为1294），其表面表达HIV的Env，用以介导对靶细胞的融合，同时细胞内还含有转录荧光素酶报告基因的启动子。两种细胞均为贴壁细胞，用含有氨苄/链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM细胞培养液进行培养。首先将TZM-bl加入到96孔细胞培养板中（1x10⁴个/孔），于37℃、5%CO₂的条件下培养过夜。将测试多肽用DMEM细胞培养液进行3倍倍比稀释，并与HL2/3效应细胞混合，然后加入到TZM-bl靶细胞，继续培养6小时使之充分融合。然后采用Promega公司的荧光素酶报告基因的试剂盒按说明书测定荧光素酶的活性（相对荧光单位，RLU）。计算每一浓度样品抑制率

利用GraphPad Prism Software 2.01软件计算半数有效抑制剂量(IC₅₀值)。

2.1.2多肽抑制HIV侵入细胞

采用HIV重组假病毒系统评价多肽对病毒进入靶细胞的抑制作用，具体方法参照文献（Yao X,Chong H,Zhang C,Waltersperger S,Wang M,Cui S,He Y.Broad antiviral activity andcrystal structure of HIV-1 fusion inhibitor Sifuvirtide.J Biol Chem.2012,287:6788-6796.）。基本步骤包括（1）HIV假病毒的制备：将表达HIV ENV蛋白的质粒pcDNA3.1-ENV（将ENV编码基因插入载体pcDNA3.1（-）得到的重组表达质粒）和HIV骨架质粒pSG3^△ENV（表达HIV基因组中除ENV之外的所有蛋白，由美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号为11051），按质量比1:2的比例转染293T细胞，同时设只转染相同量的pSG3^△ENV的对照。于37℃、5%CO₂细胞培养箱中孵育6小时后换液，然后继续孵育48小时使假病毒分泌至上清中。用移液器尽量多地吸出细胞培养瓶或细胞培养板中的上清，经0.45μm滤器过滤或1000g离心10分钟收取上清，向其中加入胎牛血清（FBS）使其终浓度为20%，转移至聚丙烯管中于－80℃保存备用或直接进行病毒滴定。（2）HIV假病毒的滴定：将病毒在96孔板中做5倍稀释，设置4个复孔8个梯度，终体积为100μl。将TZM-bl细胞用胰酶消化并计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至1x10⁵个/ml，每孔加100μl细胞(含15μg/ml DEAE-dextran)，于37℃、5%CO₂培养48小时。然后从细胞培养箱中取出96孔板，从上样孔中吸弃上清，加入30μl细胞裂解液，放置10分钟后加入100μl荧光素酶检测试剂。用移液器从每孔中吸出100μl液体，加于对应的96孔白板中，于微孔板光度计读取发光值。用Reed-Muench法计算病毒滴度。(3)多肽的抗病毒活性检测：将多肽按倍比（3倍）稀释铺入96孔板中，终体积为50μl，其中用50μl DMEM培养基替代多肽作为阴性对照。加入100μl浓度为1x10⁵个/ml的TZM-bl靶细胞（含15μg/ml DEAE-dextran），加入上述获得的HIV假病毒50μl（每孔相当于100TCID₅₀），于37℃、5%CO₂条件下培养48小时后，利用荧光素酶检测试剂（Promega）测定每孔的相对荧光单位（RLU）。计算%抑制率和IC₅₀值,方法同前述。

2.1.3多肽HP25-N2对多肽对HIV毒株NL4-3的抑制作用

多肽对HIV-1NL4-3复制的抑制实验参考文献（Chong H,Yao X,Zhang C,Cai L,Cui S,Wang Y，He Y. Biophysical Property and Broad Anti-HIV Activity of Albuvirtide,a 3-Maleimimidopropionic Acid-Modified Peptide Fusion Inhibitor.PLoS One.2012,7(3):e32599）。编码HIV-1病毒株NL4-3的分子克隆质粒pNL4-3由美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号为114）。采用QIAGEN公司的质粒提取试剂盒制备pNL4-3质粒，采用Invitrogen公司的Lipofectamine^TM2000转染试剂将pNL4-3质粒转染293T细胞，于37℃、5%CO₂细胞培养箱中孵育6小时后换液，然后继续培养48小时。用移液器轻轻收集细胞培养瓶或细胞培养板中的上清，经0.45μm滤器过滤取上清，加入20%FBS，然后分装于聚丙烯管中，放置-80℃保存备用或直接进行病毒滴定，方法同上述HIV假病毒。为测定抗HIV多肽的抗病毒活性，将多肽按倍比（3倍）稀释铺入96孔板中，终体积为50μl，其中用50μl DMEM培养基替代多肽作为阴性对照。加入100μl TZM-bl细胞(10⁵个细胞/ml，含15μg/ml DEAE-dextran)，加入已获得的病毒50μl，每孔相当于100TCID₅₀。培养48小时后，利用荧光素酶检测试剂（Promega）测定每孔的相对荧光单位（RLU）。计算%抑制率和IC₅₀值,方法同前述。

2.2实验结果及分析

2.2.1基于SC22EK鉴定高活性抗HIV短肽

SC29EK是一个基于C34设计的含有29个氨基酸的多肽,其抗HIV活性与C34多肽相当。但在其C末端去除7个氨基酸残基后，截短的多肽SC22EK的抗病毒活性则显著降低（表3，表3中的IC₅₀为三次重复实验的平均值±标准差）。与SC29EK相比，SC22EK抑制HIV介导的细胞融合、假病毒侵入和野生病毒复制的能力都严重下降。基于对“M-T钩子”结构的重要发现，促使提出假设：位于口袋结合区上游的形成M-T钩子的氨基酸残基（Met626和Thr627）是否可以增加多肽尤其是短小多肽的抗病毒活性？为此，设计将Met626和Thr627两个氨基酸残基加入SC22EK的N末端，合成了表3中的多肽MT-SC22EK，并检测了其病毒抑制活性。令人兴奋的发现是，两个氨基酸的加入能够显著提高多肽的抗病毒活性30倍以上。如表3所示，MT-SC22EK抑制HIV介导细胞融合、假病毒侵入和野生病毒复制的IC₅₀值分别是2.6nM、1.7nM和1.2nM,与SC29EK的活性相当。在三个实验系统都比SC22EK的活性显著提高，分别是39.5倍、33.9倍和52.1倍。这个结果说明紧邻口袋结合区的Met626和Thr627氨基酸对改善短多肽的抗HIV能力起到极其重要的作用。这是首次发现如此短小的CHR多肽具有极低纳摩尔水平的抗HIV活性。为寻找具有更短序列的抗HIV多肽，以MT-SC22EK为模板进行C末端逐一截短，合成了多肽MT-SC21EK、MT-SC20EK、MT-SC19EK、MT-SC18EK和MT-SC17EK，序列见表3。采用三个实验方法分别对它们的抗HIV能力进行了定量评价。结果发现在C末端进一步去除1个、2个和3个氨基酸残基对多肽的活性有一定程度的影响，但相应的三个多肽（MT-SC21EK、MT-SC20EK和MT-SC19EK）仍保持较高的抗病毒活性。即使具有21个氨基酸的MT-SC19EK也比SC22EK（含22个氨基酸）的活性明显增高。因此，通过本研究，发现了含有“M-T钩子”结构的长度在21-24个氨基酸残基的四个高活性抗HIV短肽,即MT-SC22EK、MT-SC21EK、MT-SC20EK和MT-SC19EK。

表3.氨基酸残基Met626和Thr627显著提高抗HIV短肽的活性

2.2.2基于P32序列截短鉴定高活性抗HIV短肽

含有32个氨基酸残基的P32是本发明的发明人最近设计的抗HIV多肽（中国专利申请号：CN201110112709.7），对HIV临床分离毒株和T20耐药病毒皆具有高活性的抑制作用。该多肽N末端序列包含有Met626Thr627残基。为寻求长度较短而活性很强的抗HIV多肽，本实验以P32为模板进行截短而合成一组新的多肽，长度短于或等于30个氨基酸残基（表4所示）。采用上述细胞融合抑制实验和假病毒侵入实验对多肽的抗HIV活性进行了检测。实验结果见表4。首先，对P32从C末端进行逐步截短，分别减去2个（HP30）、4个（HP28）、5个（HP27）、6个（HP26）、7个（HP25）和8个（HP24）氨基酸残基，发现这些截短的多肽有着与P32多肽相当的抗HIV活性，包括对HIV介导细胞融合和侵入的抑制能力。比如，多肽HP25（长度为25个氨基酸）和HP24（长度为24个氨基酸）抑制HIV细胞融合的IC₅₀分别为1.0nM和1.1nM,抑制HIV假病毒的IC₅₀分别为0.78nM和1.0nM,而长度在32个氨基酸残基的多肽P32抑制HIV细胞融合和假病毒的IC₅₀分别为1.21nM和0.92nM。同时，作为对照的多肽C34、CP32M、西夫韦肽、T1249和T20的抗HIV活性显著低于P32及其上述截短多肽。然而，C末端的进一步截短（HP23、HP22和HP19）将导致多肽对病毒的抑制活性明显降低或完全失去（表4）。

为寻找更短的抗HIV多肽，本实验以HP24为模板对其N末端进行逐一截短，分别去除1个（HP24-N1）、2个（HP24-N2）、3个（HP24-N3）、4个（HP24-N4）和5个（HP24-N5）氨基酸残基。结果发现HP24-N2的活性受到甚微的影响，HP24-N1和HP24-N3的活性有接近1倍的下降，但HP24-N4和HP24-N5的活性显著降低，再一次证明N端的氨基酸残基Met626和Thr627对这些短小多肽的抗病毒活性起到关键的作用。

进而，本实验以HP27、HP26和HP25为模板进行截短，发现其N末端的3个氨基酸残基（WNE）确实对多肽的抗病毒活性影响有限，但令人意外的发现是，HP25-N2的活性明显高于其他多肽。与模板HP25相比，HP25-N2的抗HIV细胞融合和假病毒侵入的活性反而得到进一步的改善，其IC₅₀分别为0.74nM和0.58nM，明显低于其他截短多肽和所有对照多肽。为避免甲硫氨酸的侧链易被氧化的问题，以性质类似的亮氨酸(L)替代甲硫氨酸(M),合成了长度同样为23个氨基酸的多肽ELT23（序列见表4），实验结果显示ELT23有着与HP25-N2相似的抗病毒活性，其抑制病毒细胞融合和侵入的IC50分别是0.9nM和0.61nM。

为进一步确认HP25-N2的抗病毒活性,又测试了其对HIV毒株NL4-3复制的抑制作用,并以多肽MT-SC22EK、MT-SC29EK、西夫韦肽、C34和T20作为对照。实验结果见图1所示，T20对HIV-1_NL4-3毒株的抑制活性相对较低，其IC₅₀为54.1nM；MT-SC22EK、MT-SC29EK、西夫韦肽和C34的活性比较接近，IC₅₀分别为1.2nM、1.0nM、1.8nM和1.3nM；相比之下，HP25-N2的抗HIV活性显著为高，其IC₅₀为0.3nM。

因此，通过深入的研究，本发明人首次鉴定了一组长度在21-30个氨基酸残基的高活性抗HIV多肽，包括HP30、HP28、HP27、HP26、HP25，HP24，HP24-N1，HP24-N2，HP24-N3，HP25-N2、HP25-N3、HP27-N3、HP26-N3、ELT23（序列和活性如表4和图1所示，表4中的IC₅₀为三次重复实验的平均值，图1中的数据为三次重复实验的平均值）。相比之下，其中长度为23个氨基酸的HP25-N2和其衍生物ELT23具有较好的抗病毒活性。

表4.多肽对HIV-1介导的细胞融合和假病毒侵入的抑制活性（IC₅₀，nM）

实施例3.HP25-N2广谱的抗HIV作用

由于HIV-1易于变异,可以分为多种亚型,包括A-D,F-H,J,和K亚型等。其中A，B和C亚型是引起世界艾滋病流行的主要病毒。而在中国，B/C和A/E重组病毒的流行占据主导地位。为进一步评价抗HIV短肽的活性，制备了一组16株HIV假病毒，包括国际代表毒株和中国目前流行的HIV毒株，其中有A亚型2株、B亚型5株、C亚型3株、A/E重组型3株、B/C重组型3株。假病毒的制备方法如上所述，表达各种亚型的HIV包膜蛋白质粒由中国医学科学院病原生物学研究所何玉先教授实验室保存，参见文献（Yao X,Chong H,Zhang C,Waltersperger S,Wang M,Cui S,He Y.Broad antiviral activity and crystal structure of HIV-1fusion inhibitor Sifuvirtide.J Biol Chem.2012,287:6788-6796）。采用这些HIV假病毒，对HP25-N2（序列表中序列14）的抗病毒进行了检测，并以C34多肽作为对照。实验结果如表5（表5中的IC₅₀为三次重复实验的平均值±标准差）所示，HP25-N2能够有效抑制各种HIV亚型的感染。对多数病毒而言，其IC₅₀值低于C34。比如，HP25-N2抑制B亚型毒株SF162的IC₅₀值为3.6nM，而C34对该株病毒的IC₅₀值为9.5nM。

表5.多肽HP25-N2对不同亚型HIV的抑制作用

实施例4.HP25-N2对T20耐药HIV-1毒株的抑制作用

T20是目前唯一批准用于临床治疗的HIV膜融合抑制剂，然而其活性不但明显低于新一代的多肽，而且很容易诱导耐药突变，导致临床抗病毒治疗的失败。研究表明，药物靶序列NHR区域的氨基酸变异是导致T20耐药的主要原因。开发能够抑制T20耐药病毒的新型抑制剂是当前国际上的热点课题。本实施例观察了HP25-N2（序列表中序列14）对T20和C34耐药HIV毒株的效果。携带NHR突变的假病毒（表6，表6中的IC₅₀为三次重复实验的平均值±标准差）采用文献报道的HIV突变毒株（Chong H,Yao X,Zhang C,Cai L,Cui S,WangY，He Y.Biophysical Property and Broad Anti-HIV Activity of Albuvirtide,a 3-Maleimimidopropionic Acid-Modified Peptide Fusion Inhibitor.PLoS One.2012,7(3):e32599.）。以上述HIV假病毒技术系统进行评价多肽的抑制效果。假病毒的制备和应用方法与实施例2雷同。从表6中的实验结果可知，抗HIV多肽HP25-N2对这些携带gp41突变的HIV毒株具有极高的活性，说明这些突变对HP25-N2的抗病毒活性影响甚微。然而，作为对照的T20的活性则显著下降，表现为极高的耐药性，如V38A突变的耐药倍数为34.2，I37T/N43K和V38A/N42T双突变的耐药倍数在44以上。而且，这些耐药突变也导致C34呈现明显的交叉耐药性。这个实验结果说明，HP25-N2多肽可以用于T20临床耐药HIV毒株的治疗。

表6.HP25-N2对T20和C34耐药HIV毒株的抑制作用

实施例5.圆二色谱（CD）技术研究多肽与NHR靶点的相互作用

5.1实验材料与方法

实验方法参考文献（Chong H,Yao X,Zhang C,Cai L,Cui S,Wang Y，He Y.BiophysicalProperty and Broad Anti-HIV Activity of Albuvirtide,a 3-Maleimimidopropionic Acid-ModifiedPeptide Fusion Inhibitor.PLoS One.2012,7(3):e32599；Chong H,Yao X,Qiu Z,Qin B,Han R,Waltersperger S,Wang M,Cui S,He Y.Discovery of Critical Residues for Viral Entry andInhibition through Structural Insight of HIV-1 Fusion Inhibitor CP621-652.J Biol Chem.2012,287(24):20281-20289）。圆二色谱仪为日产Jasco-815。采用源于NHR的N36多肽作为靶点序列，其序列为：Ac-SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2。将来源于CHR的抗病毒多肽和N36分别溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，根据280nm下紫外吸收确定浓度，然后配制20μM的多肽PBS溶液（pH 7.2）。将抗病毒多肽与N36以1：1体积比混合获得二者混合样品（各肽的终浓度10μM），样品在37℃下放置30分钟使之充分反应。将配制好的样品在圆二色谱仪上测定，仪器扫描波长范围为195-260nm，波长间隔为1nm，扫描3次进行平均。测定在室温进行。先用PBS缓冲溶液扫描得到空白，然后扫描样品信号，将空白信号从样品信号中扣除得到CD信号。根据CD信号判断多肽间的相互作用情况及螺旋含量。通过CD温度扫描测定本发明所描述的抗病毒多肽与N36形成的六螺旋结构的稳定性。具体方法如下：将上述用于测定CD信号的多肽转入样品池（也可以重新配制），将CD仪器程序设为温度扫描，检测波长220nm，扫描范围20-98℃，进行程序温度扫描后得到CD信号随温度变化曲线。根据曲线计算Tm值。

5.2实验结果及分析

来源于HIV gp41的CHR区的抗病毒多肽主要是通过与NHR区的靶序列相互作用而阻断6-HB结构的形成，继而达到抑制HIV侵入靶细胞。CD测试实验结果表明，所有抗HIV多肽都能与NHR多肽N36形成典型的螺旋结构，表现为在-208和-222呈现典型的吸收峰（如图2、图3和表7所示）。其中，[θ]222负值越大表示CHR和NHR多肽复合物的α-螺旋含量越高。比较而言,基于MT-SC17EK和MT-SC18EK的6-HB的螺旋含量较少,其[θ]222值分别为-21.3和-17.5;基于P32设计的短肽HP22和HP19的6-HB的螺旋含量相对较少,其[θ]222值分别为-17.1和-15.4。这四个多肽在上述的抗病毒实验中没有观察到抑制HIV的活性（大于1000nM）。CD实验的结果发现，MT-SC22EK与N36的Tm值（78.2℃）比SC22EK与N36的Tm值(64.1℃）显著增加，也远远高于SC29EK与N36的Tm值（67.1），说明“M-T构子”氨基酸残基即Met626和Thr627确实显著增加抗病毒多肽与靶序列相互作用的稳定性。实验发现，抗病毒活性较好的多肽HP25-N2的螺旋含量（[θ]₂₂₂=-28.8）和6-HB稳定性（Tm=89.2℃）都相对较高。另外，四个无抗HIV活性的多肽（MT-SC17EK、MT-SC18EK、HP22和HP19）的Tm比其他多肽明显降低，分别是51.1℃、56.1℃、53.1℃和49.1℃。这些结果说明抗HIV多肽的病毒抑制活性与其形成异源6-HB的螺旋性和热稳定性有关。

表7.抗病毒多肽与N36相互作用的圆二色谱分析

注：表中多肽的氨基酸序列如表3和表4。

Claims (10)

1.多肽、其药用盐、或其衍生物，其特征在于：所述多肽为下述a）或b）或c）：

a）序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；

b）在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一个以上氨基酸残基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30个氨基酸残基组成；

c）在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在内的任何位点添加或替代1个以上氨基酸得到的由21-30个氨基酸残基组成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。

2.根据权利要求1所述的多肽、其药用盐或其衍生物，其特征在于：b）所示的衍生多肽为下述b1）-b17）中的任一种多肽：

b1）氨基酸序列是序列表中序列18的多肽ELT23；

b2）氨基酸序列是序列表中序列9的多肽HP25；

b3）氨基酸序列是序列表中序列6的多肽HP28；

b4）氨基酸序列是序列表中序列10的多肽HP24；

b5）氨基酸序列是序列表中序列5的多肽HP30；

b6）氨基酸序列是序列表中序列8的多肽HP26；

b7）氨基酸序列是序列表中序列7的多肽HP27；

b8）氨基酸序列是序列表中序列15的多肽HP25-N3；

b9）氨基酸序列是序列表中序列12的多肽HP24-N2；

b10）氨基酸序列是序列表中序列17的多肽HP27-N3；

b11）氨基酸序列是序列表中序列16的多肽HP26-N3；

b12）氨基酸序列是序列表中序列13的多肽HP24-N3；

b13）氨基酸序列是序列表中序列11的多肽HP24-N1；

b14）氨基酸序列是序列表中序列1的多肽MT-SC22EK；

b15）氨基酸序列是序列表中序列2的多肽MT-SC21EK；

b16）氨基酸序列是序列表中序列3的多肽MT-SC20EK；

b17）氨基酸序列是序列表中序列4的多肽MT-SC19EK。

3.根据权利要求1或2所述的多肽、其药用盐或其衍生物，其特征在于：权利要求1或2所述的多肽衍生物为下述1）-5）中的至少一种：

1）权利要求1或2所述的多肽的氨基端连接氨基端保护基和/或权利要求1或2所述的多肽的羧基端连接羧基端保护基得到的连接物；

2）权利要求1或2所述的多肽的羧基端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；

3）权利要求1或2所述的多肽的氨基端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；

4）权利要求1或2所述的多肽的氨基端和羧基端均连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；

5）权利要求1或2所述的多肽被蛋白质、聚乙二醇、马来酰亚胺修饰得到的修饰物。

4.根据权利要求3所述的多肽、其药用盐或其衍生物，其特征在于：权利要求1或2所述的多肽衍生物为：权利要求1或2所述的多肽的氨基端连接乙酰基和权利要求1或2所述的多肽的羧基端连接酰胺基得到的连接物。

5.由权利要求1-4中任一所述的多肽和/或其药用盐和/或其衍生物形成的多聚体。

6.一种组合物，其包含C1）和C2）：C1）权利要求1-4中任一所述的多肽、其衍生物、或其可药用盐，和/或权利要求5所述的多聚体；C2）药学上可接受的载体或辅料；

所述组合物具有下述D1）-D5）中的至少一种功能：

D1）抗HIV；

D2）治疗和/或预防和/或辅助治疗HIV感染所致疾病（如艾滋病）；

D3）抑制HIV进行细胞融合；

D4）抑制HIV侵入细胞；

D5）抑制HIV复制。

7.权利要求1-4中任一所述的多肽、其衍生物、或其可药用盐，或权利要求5所述的多聚体，或权利要求6所述的组合物在制备如下至少一种产品中的应用：

D1）抗HIV的产品，如药物或疫苗；

D2）治疗和/或预防和/或辅助治疗HIV感染所致疾病的产品，如药物或疫苗；

D3）抑制HIV进行细胞融合的产品；

D4）抑制HIV侵入细胞的产品；

D5）抑制HIV复制的产品。

8.编码权利要求1至4中任一项所述多肽的核酸分子。

9.产品的制备方法，包括e1）或e2）的步骤：

e1）化学合成权利要求1-4中任一所述的多肽的步骤；

e2）生物表达权利要求1-4中任一所述的多肽的步骤；

所述产品为f1）、f2）或f3）：

f1）权利要求1-4中任一所述的多肽、其药用盐、或其衍生物；

f2）权利要求5所述的多聚体；

f3）权利要求6所述的组合物。

10.g1）或g2）的生物材料：

g1）含有权利要求8所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组病毒；

g2）表达权利要求1-4中任一所述多肽的重组表达载体或重组细胞。

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