JP2001525335A

JP2001525335A - 骨格環状化ペプチド類似体による核への輸送の阻害

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Publication number: JP2001525335A
Application number: JP2000523229A
Authority: JP
Inventors: フリードラー，アサフ; ロイター，アブラハム; ジロン，チャイム; ウォルフ，アムノン
Original assignee: イッサムリサーチディヴェロップメントカンパニーオブザヘブリューユニバーシティーオブエルサレム; ペプター，リミテッド
Priority date: 1997-11-27
Filing date: 1998-11-26
Publication date: 2001-12-11
Also published as: EP1034182A4; CA2311768A1; AU1257499A; US6664368B1; WO1999028338A1; AU754510B2; IL122343A0; EP1034182A1

Abstract

(57)【要約】巨大分子の核局在化シグナル（ＮＬＳ）領域を機能的に模倣する骨格環状化ペプチド類似体の設計および合成を開示する。本発明の原理は、ヒト免疫不全ウイルス１型のタンパク質であるＭＡ、Ｖｐｒ、ＴａｔのＮＬＳ配列およびＨＩＶ−１タンパク質ＶｉｆのＮＬＳ様配列について例示される。我々はＢＣｖｉｒと名付けた新規の非常に強力な骨格環状化ペプチドが３５ｎＭというＩＣ_５０値で核への輸送を阻害するという発見を開示する。この阻害活性の強さは元の直鎖状のＨＩＶ−ＭＡＮＬＳペプチドによって示される１２μＭという値に匹敵するものである。ＢＣｖｉｒはまた、感染した、分裂していない培養ヒトＴ細胞においてＨＩＶ−１の産生を７５％低減させ、トリプシン消化に対して比較的抵抗性であった。これらの特性によって、ＮＬＳもしくはＮＬＳ様配列の骨格環状化ペプチド類似体は、ウイルスゲノムの核への輸送を阻止することに基づく新規薬物の候補となりうるものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（本発明の技術分野）本発明は巨大分子の細胞質から細胞核への移送の調節に関し、核への輸送を阻
害する骨格環状化ペプチドおよびそれらのペプチドを用いて核への局在化および
ウイルス産生を阻害するための組成物および方法に関する。

【０００２】（本発明の背景技術）真核細胞のライフサイクルは機能を有するタンパク質の、細胞質から、ＤＮＡ
複製およびＲＮＡ生合成が起こる場所である核内への移動に依存している。また
、ウイルスゲノムの核−細胞質間の輸送は多数の動物ウイルスの複製およびアセ
ンブリーに不可欠である。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）および
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の核への輸送は、核膜が天然の状態に保たれて
いるような分裂していない細胞への感染がウイルス産生性のものとなるためには
非常に重要である（Ｖｏｎ−Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒら，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，６９９２−６９９６）。

【０００３】核局在化シグナル（ＮＬＳ）はタンパク質内に存在する輸送シグナルで、その
タンパク質の核への取り込みを複雑な機序によって媒介する（Ｍｅｌｃｈｉｏｒ
（１９９５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７，３１０−３１
８；Ｇａｒｃｉａ−Ｂｕｓｔｏｓら，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．ａｃｔａ１０７１，８３−１０１）。ＮＬＳは半コンセンサス配列を有
し、それは一般に５−１５個のアミノ酸残基からなり、それらの残基の大多数は
正に荷電されている（リジンおよびアルギニン）（ＤｉｎｇｗａｌｌとＬａｓｋ
ｅｙ（１９９１），ＴＩＢＳ１６，４７８−４８１）。核への輸送は、細胞質
内におけるＮＬＳと細胞質内受容体（一般に、ＮＬＳ結合タンパク質（ＮＢＰ）
と呼ばれている）との特異的結合によって開始される。ＮＬＳ配列と相互作用す
るタンパク質が多数検出されており、それらは核輸送受容体と同定されている（
Ｎｉｇｇ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８６，７７９−７８７）。最初に発見
された核への輸送経路は、インポーチン（ｉｍｐｏｒｔｉｎ）としても知られて
いるカリオフェリンヘテロ２量体と共に働く（Ｇｏｒｌｉｃｈら，（１９９５）
Ｎａｔｕｒｅ３７７，２４６−２４８）。

【０００４】ウイルスの核への輸送は、核への輸送に不可欠な特有のＮＬＳを有しているウ
イルスタンパク質がそのウイルスのゲノムと複合体を形成することによって可能
となる。少なくとも３種類のＨＩＶ−１タンパク質が、ウイルスプレインテグレ
ーション複合体（ＰＩＣ）の核への輸送に関与しており、部分的には過剰な核局
在化活性を示している：ヌクレオキャプシド成分であるＨＩＶ−１ＭＡ（Ｂｕ
ｋｒｉｎｓｋｙら，同上）、補助的タンパク質であるＶｐｒ（Ｈｅｉｎｚｉｎｇ
ｅｒら，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，
７３１１−７３１５）、およびウイルスインテグラーゼ（Ｇａｌｌａｙら，（１
９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，９８２５−９
８３０）。ＨＩＶ−１はまた、分子量３０ｋＤａ未満の補助的なタンパク質をい
くつか発現している（ＭｉｌｌｅｒとＳａｒｖｅｒ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ３，３８９−３９４）。これらのタンパク質のうち、Ｔａ
ｔ、Ｒｅｖ、ＮｅｆおよびＶｉｆがＮＬＳ様配列を含有し、一定の条件下では感
染細胞の核に蓄積される。最近、Ｖｐｒ（Ｋａｒｎｉら，（１９９８）ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．４２９，４２１−４２５）、Ｔａｔ（Ｅｆｔｈｙｍｉａｄｉｓら，
（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１６２３−１６２８）、および
Ｒｅｖ（ＨｅｎｄｅｒｓｏｎとＰｅｒｃｉｐａｌｌｅ，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．２７４，６９３−７０７）が、別個の非インポーチン経路によって
核への輸送を促進することが報告されている。ＮＬＳ配列に由来する直鎖ペプチ
ドでは、それがＢＳＡと共有結合によるコンジュゲーションを行うとそのコンジ
ュゲートの核への輸送を起こすので、活性ＮＬＳとして機能する（Ｂｕｋｕｒｉ
ｎｓｋｙら，同上；Ｇｏｌｄｆａｒｂら，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２２，６
４１−６４４）。そのようなペプチドは、ＨＩＶ−１マトリクスタンパク質（Ｍ
Ａ）およびそのプレインテグレーション複合体の阻害で示されたものと同様の核
への輸送の阻害も示す（Ｇｕｌｉｚｉａら，（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８
，２０２１−２０２５）。しかし、それらの構造的柔軟性および代謝での不安定
性のために、直鎖状ＮＬＳペプチドを抗ウイルス剤として治療的に用いることは
実際的でない。

【０００５】タンパク質模倣体は、元の大きなタンパク質の構造および／または活性を模し
た小分子である。そのような小分子が利用ができれば、タンパク質の生物学的機
能、分子構造、および折り畳みを詳細に研究するために有用である。さらに、タ
ンパク質模倣体は、現在のところタンパク質およびポリペプチドの治療における
使用を妨げているそれらの抗原性、代謝における不安定性およびバイオアベイラ
ビリティーの低さなどの制限のいくつかを克服しうるので、新しいタイプの薬物
となりうる優れた候補物質である。多数の構造的タンパク質模倣体が既に報告さ
れているが、それらの大多数は元のタンパク質を特徴づけている生物学的機能を
欠いている。また、酵素の触媒部位を模し、その酵素活性を保持させた小ペプチ
ドを得ようとした試みはこれまでのところは失敗に終わっている（Ｃｏｒｅｙと
Ｃｏｒｅｙ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３
，１１４２８−１１４３４）。構造的タンパク質模倣体で対応するタンパク質の
生物的活性を保持しかつ構造的に類似しているものがごくわずか公表されており
、例えば、ジンクフィンガー（Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓら，（１９９６）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２７１，３４２−３４５）および金属結合性タンパク質模倣体（Ｒｏｂｅ
ｒｔｓｏｎら，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８，４２５−４３２；Ｐｅｓｓ
ｉら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６２，３６７−３６９）などである。我々
はここで、タンパク質の活性領域の構造と機能を模した小さな骨格環状化ペプチ
ドの設計と合成のための一般的なアプローチを開示する。

【０００６】骨格環状化は、ペプチド骨格中のＮ^αもしくはＣ^α原子をお互いに結合させる
か、またはそれらの原子と側鎖を結合させるか、またはカルボキシおよびアミノ
末端に結合させることによってコンホメーションの拘束をペプチドに与える一般
的な方法である（Ｇｉｌｏｎら，（１９９１）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３１，
７４５−７５０）。骨格環状化によれば、ペプチドは、直鎖状の元のペプチドと
比較して選択的かつ代謝に安定で、生物学的活性が増強されたタンパク質模倣体
に変換されることが以前から示されており、それは、例えば、ＥＰＯ５６４，
７３９Ａ２およびＷＯ９５／３３７６５；Ｂｙｋら，（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ
．Ｃｈｅｍ．３９，３１７４；Ｂｉｔａｎら，（１９９７）Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅ
ｓ．４９，４２１、で述べられている。シクロスキャン（ｃｙｃｌｏｓｃａｎ）
は、コンホメーション的に拘束された骨格環状化ペプチドライブラリーに基づく
選択方法であり、ＷＯ９７／０９３４４中に開示されているように、所定の配列
に由来する最も活性が高い骨格環状化ペプチドの迅速な検出がそれによって可能
となる。シクロスキャンは多様なことが可能であり、骨格環状化の様式、環の位
置、環の大きさ、および環の化学的性質を調べることができるが、これによって
コンホメーションのみがわずかずつ異なる、配列に順次偏りを持たせたペプチド
を多数作ることができる。”骨格環状化タンパク質模倣体”のアプローチの原理
は、次のステップに基づいている：（ｉ）標的タンパク質の活性残基を明らかに
する（ｉｉ）活性残基を包含し、そのコンホメーションが元のタンパク質と類似
しているような一連の骨格環状化ペプチドのプロトタイプの設計およびモデリン
グ（ｉｉｉ）リード化合物を見出すまで各々の骨格環状化ペプチドのシクロスキ
ャンを行うこと（ｉｖ）最も良いリード化合物の構造分析、および（ｖ）反復に
よる最適化。

【０００７】（発明の概要）本発明の目的の１つは、巨大分子の核局在化シグナル（ＮＬＳ）領域を模した
骨格環状化ペプチド類似体を提供することである。本発明の別の目的は、骨格環
状化ペプチド類似体をＮＬＳ含有巨大分子の細胞核への核輸送を阻害するために
用いることである。本発明のまた別の目的は、ヒト免疫不全ウイルスの各種タン
パク質のＮＬＳ領域を模した骨格環状化ペプチド類似体を提供することである。
本発明のまた別の目的は、該骨格環状化ペプチドを感染細胞中でのウイルス複製
を阻害するために用いるための組成物と方法を提供することである。本発明の原
理に従って、骨格環状化タンパク質模倣体アプローチを用いて、ＮＬＳ配列の領
域を模した骨格環状化ペプチドのライブラリーを設計することが可能であること
をここに開示する。これらのライブラリーを、所望の特定の巨大分子の特異的Ｎ
ＬＳ配列を模倣するためにさらに最適化および改善された分子を同定するために
用いることができる。これらの原理をウイルスタンパク質のＮＬＳ配列を用いて
例示している。得られた骨格環状化ペプチドは、巨大分子の細胞質から細胞核へ
の移動を阻害し、それによって、ウイルスの伝播ができないようにするために有
用である。

【０００８】現在のところ、本発明のより好ましい実施形態としては、ＨＩＶ−１のＮＬＳ
配列およびＮＬＳ様配列の作用を模倣することのできる骨格環状化ペプチド類似
体がある。これらの好ましい実施形態は、ＨＩＶ−１ウイルスタンパク質ＭＡ、
Ｔａｔ、およびＶｐｒから選択されるＮＬＳ配列の骨格環状化類似体を包含して
いる。

【０００９】また、本発明の別の好ましい実施形態では、ＨＩＶ−１タンパク質Ｖｉｆ内の
ペプチドの骨格環状化類似体を提供する。これらの骨格環状化ペプチドは、Ｖｉ
ｆの残基８８から９８、これは塩基性残基からなる短い配列を有するが、これら
の残基の類似体を含む。このウイルス配列は、核への輸送を阻害するが媒介しな
い。

【００１０】現在のところ、本発明の最も好ましい実施形態の１つは、一般式Ｉに示す骨格
環状化ペプチド類似体である。

【００１１】

【化１３】［式Ｉ］〔この式で、ｎは１から１０の整数もしくは０であり、ただしｎが０のときには
ＮＨも存在しない；ｍは１から１０の整数である；Ｒはリジンもしくはグルタミ
ンである；ＡＡおよびＡＡ２は独立にアミノ酸残基を示し、それは同一のもので
も異なるものでもよい。〕本発明のより好ましい実施形態は、一般式ＩＩの骨格環状化ペプチド類似体で
ある。

【００１２】

【化１４】［式ＩＩ］〔この式で、ｎは１から１０の整数もしくは０であり、ただしｎが０のときには
ＮＨも存在しない；Ｈは１から１０の整数である；Ｒはリジンもしくはグルタミ
ンである。〕本発明のまた別の好ましい実施形態は、一般式ＩＩＩの骨格環状化ペプチド類
似体である。

【００１３】

【化１５】［式ＩＩＩ］〔この式で、Ｒはリジンもしくはグルタミンであり、ＡＡはセリン、ロイシンも
しくはメチオニンからなる群から選択される１個のアミノ酸残基であり、ＡＡ２
はバリン、グリシンもしくはシステインからなる群から選択される１個のアミノ
酸残基である。〕現在のところ、本発明の最も好ましい実施形態は、一般式ＩＩＩのペプチドで
、Ｒがリジン、ＡＡがロイシン、ＡＡ２がバリンであるもので、ここではそれを
ＢＣｖｉｒと呼ぶ。

【００１４】本発明のまた別の最も好ましい実施形態は、一般式ＩＶの骨格環状化ペプチド
類似体を含む。

【００１５】

【化１６】［式ＩＶ］〔この式で、ｍおよびｎはそれぞれ独立に１から１０の整数である。〕ＮＬＳ配列を模倣することができる骨格環状化ペプチドを有効成分として含む
医薬組成物を開示し、特許請求する。

【００１６】さらにここに開示した事項は、巨大分子の細胞核から細胞質への移動を、細胞
と該巨大分子のＮＬＳ配列を模倣する骨格環状化ペプチドの有効量とを接触させ
ることによって阻害する方法である。これらの方法は、ｉｎｖｉｔｒｏ、もし
くは治療を必要としている動物のｉｎｖｉｖｏでの、ウイルス感染の予防もし
くは治療に有用である。これらの方法の有用性については、ウイルス感染細胞内
でのウイルス複製の阻害によって例示されている。

【００１７】（発明の詳細な説明）骨格環状化タンパク質模倣体アプローチによって骨格環状化ペプチド類似体の
発見がなされ、それは巨大分子の細胞質から細胞核への核輸送を阻害するが、そ
のような種類の巨大分子は核局在化シグナルの仲介によって核に入り込む。本明
細書および特許請求の範囲において「巨大分子」という用語は、タンパク質また
は１つ以上のタンパク質を別の分子と共に含んでいる複合体を意味する。例えば
、その複合体はＮＬＳ配列もしくはＮＬＳ様配列を有するタンパク質に加えてＤ
ＮＡもしくはＲＮＡを含むことができる。とりわけ複合体はウイルスゲノムを含
むことができる。

【００１８】本明細書および特許請求の範囲において「骨格環状化ペプチド類似体」という
用語は、ペプチド骨格の少なくとも１個の窒素もしくは炭素を、もう１つの別の
そのような窒素もしくは炭素と、または側鎖と、またはペプチドの末端のうちの
１つと結合させたアミノ酸残基の配列を意味する。さらにその配列の１つ以上の
ペプチド結合が還元されているかもしくは非ペプチド結合で置換されていてもよ
い。

【００１９】「アミノ酸」という用語はアミノ末端およびカルボキシ末端を有する化合物を
意味し、炭素骨格の１，２−、１，３−、もしくは１，４−置換パターンが好ま
しい。α−アミノ酸が最も好ましく、そのようなものとしてはタンパク質中に見
出される２０種の天然アミノ酸（グリシンを除いてはＬ−アミノ酸である）、そ
れらに対応するＤ−アミノ酸、タンパク質中には見出されず生合成によって得ら
れるアミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、シトル
リン、オルニチン、カナバニン、ジェンコール酸、β−シアノアラニン（β−ｃ
ｙａｎｏｌａｎｉｎｅ）、ならびにアミノイソ酪酸、ノルロイシン、ノルバリン
、ホモシステインおよびホモセリンなどの合成α−アミノ酸が挙げられる。β−
アラニン及びγ−アミノ酪酸は１，３−および１，４−アミノ酸の例であり、そ
の他多数のものが当業界で周知である。スタチン（ｓｔａｔｉｎｅ）様アイソス
ター（ＣＯＮＨ結合がＣＨＯＨによって置換されている２個のアミノ酸からなる
ジペプチド）、ヒドロキシエチレンアイソスター（ＣＯＮＨ結合がＣＨＯＨＣＨ
_２によって置換されている２個のアミノ酸からなるジペプチド）、還元アミドア
イソスター（ＣＯＮＨ結合がＣＨ_２ＮＨ結合によって置換されている２個のアミ
ノ酸からなるジペプチド）、およびチオアミドアイソスター（ＣＯＮＨ結合がＣ
ＳＮＨ結合によって置換されている２個のアミノ酸からなるジペプチド）もまた
本発明には有用な残基である。

【００２０】骨格環状化は、ペプチド骨格中のＮ^αもしくはＣ^α原子をお互いに結合させる
か、またはそれらの原子と側鎖を結合させるか、またはカルボキシおよびアミノ
末端に結合させることによって、コンホメーションの拘束をペプチドに与える一
般的な方法である（Ｇｉｌｏｎら，（１９９１）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３１
，７４５−７５０）。骨格環状化はペプチドを直鎖状の元のペプチドと比較する
と選択的かつ代謝に安定で生物学的活性が増強されたタンパク質模倣体に変換す
ることが以前から示されており、それは例えばＥＰＯ５６４，７３９Ａ２お
よびＷＯ９５／３３７６５で述べられている。

【００２１】「シクロスキャン（ｃｙｃｌｏｓｃａｎ）」はコンホメーション的に拘束され
た骨格環状化ペプチドライブラリーに基づく選択方法であり、ＷＯ９７／０９３
４４中に開示されているようにある与えられた配列に由来する最も活性が高い骨
格環状化ペプチドの迅速な検出がそれによって可能となる。これらの公表文献類
の教示は本明細書に参照によりその全体を組み込むこととする。骨格環状化の様
式、環の位置、環の大きさ、および環の化学的性質を含む種々のシクロスキャン
により、コンホメーションのみがわずかずつ異なる、配列に順次偏りを持たせた
ペプチドを多数作製することができる。

【００２２】「骨格環状化タンパク質模倣体」のアプローチの原理は次のステップに基づい
ている：（ｉ）標的タンパク質の活性残基を明らかにし、（ｉｉ）活性残基を包
含しかつそのコンホメーションが元のタンパク質と類似しているような一連のプ
ロトタイプの骨格環状化ペプチドを設計およびモデリングし、（ｉｉｉ）リード
化合物を見出すまで各々の骨格環状化プロトタイプのシクロスキャンを行い、（
ｉｖ）最も良いリード化合物の構造を分析し、そして（ｖ）反復により最適化す
る。

【００２３】巨大分子の細胞質から核への輸送を阻害する骨格環状化ペプチドの能力は、第
１の態様においてｉｎｖｉｔｒｏアッセイ系でＮＬＳ−ＢＳＡを用いたモデル
系で示された。第２の態様では、巨大分子の細胞核への輸送を妨げる骨格環状化
ペプチドの能力を機能アッセイを用いて示し、それによって分裂していない感染
培養細胞中でのＨＩＶ−１産生が、明らかにそのＭＡが媒介する核への取り込み
をブロックすることによって低減することが見出された。これらの結果に基づけ
ば、これらの新規の環状化ペプチドがＨＩＶ−１ＭＡタンパク質のＮＬＳ領域
を模したものであると考えられる。

【００２４】その作用機作には関わらず、巨大分子のＮＬＳ配列を模したこの新規の骨格環
状化ペプチドは、巨大分子のＮＬＳ配列を模した骨格環状化ペプチドの治療的有
効量を有効成分として含む医薬組成物、および巨大分子の細胞質から核への輸送
を阻害するその組成物の有用性を特許請求事項としている。

【００２５】本発明の方法は、ＨＩＶ−１タンパク質ＭＡ、Ｔａｔ、およびＶｐｒのＮＬＳ
配列を模した、もしくは塩基性残基を有するＮＬＳ様配列を含むＶｉｆの８８−
９８残基にまたがる配列を模した骨格環状化ペプチドを用いて本明細書中に例示
されている。開示されているペプチドは感染細胞内でのウイルスの複製を阻害す
ることが示されている。当業者であれば下記の実施例が単に説明のためのもので
あって本発明の原理の非限定的な例示であり、別記の特許請求事項に定義した本
発明の請求事項の範囲内において多数の変更および改変を行いうることを理解す
るであろう。

【００２６】本発明ならびにその製造と使用様式を記述するためにいくつかの略語をここで
用いている。例えば、ＡＡＡはアミノ酸分析を意味し、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキ
シカルボニルを意味し、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを意味し、Ｂｚｌはベンジ
ルを意味し、ＤＣＭはジクロロメタンを意味し、ＤＩＥＡはエチルジイソプロピ
ルアミンを意味し、ＤＭＦはジメチルホルムアルデヒドを意味し、ＤＭＳＯはジ
メチルスルホキシドを意味し、ＤＴＴはジチオスレイトールを意味し、ＥＧＴＡ
はエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸を意味し、ＦＣＳはウシ胎児血清を意味し、Ｆｍｏｃは９−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニルを意味し、ＨＩＶ−１はヒト免疫不全ウイルス１型を
意味し、ＨＯＢｔはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを意味し、ＩＣ_５０は５
０％阻止濃度を意味し、ＭＡはマトリクスタンパク質を意味し、ＭＢＨＡは４−
メチルベンズヒドリルアミンを意味し、ＮＬＳは核局在化シグナルを意味し、Ｎ
ＭＰはＮ−メチルピロリジノンを意味し、ＮＭＲは核磁気共鳴を意味し、ｐＭｅ
ＯＢｚｌはｐ−メトキシベンジルを意味し、ＰＭＳＦはフェニルメチルスルホニ
ルフルオリドを意味し、ＰｙＢｒｏＰはブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウ
ムヘキサフルオロホスフェートを意味し、ＳＭＰＳは同時多重ペプチド合成を意
味し、ＳＰＰＳは固相ペプチド合成を意味し、ＴＢＴＵは２−（１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３テトラメチルウロニウムテトラ
フルオロボレートを意味し、ＴＤＷは３回蒸留水を意味し、ＴＦＡはトリフルオ
ロ酢酸を意味し、ＴＯＦ−ＭＳは飛行時間型質量分析法を意味し、Ｚはベンジル
オキシカルボニルを意味する。

【００２７】天然のコード化されたアミノ酸はＩＵＰＡＣ協定に従って３文字コードもしく
は１文字コードで示している。

【００２８】（実施例）（材料）輸送バッファー：２０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．３、１１０ｍＭ酢酸カリ
ウム、５ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭＤＴＴ、１ｍ
ｇ／ｍＬロイペプチン、１ｍｇ／ｍＬペプスタチン、１ｍｇ／ｍＬアプロ
チニン、０．１ｍＭＰＭＳＦ。

【００２９】培養細胞：（ａ）Ｃｏｌｏ−２０５（ヒト結腸腺癌細胞［ＡＴＣＣＣＣＬ２２２］）お
よびＨｕｔ７８細胞（ヒトＴ細胞系）を、１０％ＦＣＳ、０．３ｇ／ＬＬ−
グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００Ｕ／ｍＬストレプトマ
イシン（ＢｅｉｔＨａｅｍｅｋ，イスラエル）を添加したＲＰＭＩ１６４０
培地中で維持した。Ｃｏｌｏ−２０５細胞を１．２ｘ１０^８細胞／ｍＬの密度と
なるまで増殖させた。遠心（６００ｒｐｍ，５分間）した後、細胞をＡＴＰ再生
系を欠く輸送バッファー中に懸濁した。

【００３０】（ｂ）ＨｅＬａ細胞の単層培養を、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ増殖培地
中で既に報告されているとおり（Ｂｒｏｄｅｒら，（１９９７）ＦＥＢＳＬｅ
ｔｔ．４１２，５３５−５３９）行った。

【００３１】ウイルス：ＨＩＶ−１ _ＩＩＩＢ株はＤｒ．Ｍ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（Ｌａｄｙ
ＤａｖｉｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，カナダモントリオール）の好意により提供を
受けたものである。

【００３２】実施例１．骨格環状化ペプチドの合成骨格環状化ペプチドは既に報告されているとおりに調製した（Ｂｙｋら，（１
９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，３１７４；Ｂｉｔａｎら，（１９９７）
Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．４９，４２１）。簡潔に述べれば、ペプチドをＭＢＨＡ
樹脂（０．５６ｍｅｑ／ｇをロード）上で合成した。ペプチドライブラリーはＳ
ＭＰＳ「ティーバッグ」法（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，５１３１−５１３５）を用いて合成
し、各バッグに第１ライブラリーでは２００ｍｇ、第２ライブラリーでは３００
ｍｇの樹脂部分を入れた。樹脂を４ｘ５ｃｍのポリプロピレン織物のバッグ中
に封入しポリプロピレンの箱の中におき、Ｌａｂｏｔｒｏｎ振盪機（ＩＮＦＯ
ＲＳＨＴ，Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，ドイツ）で振盪させた。ペプチド２２の合
成は手動ＳＰＰＳ容器中で行った。容器をＭｉｌｌｉＧｅｎ５０４振盪機で振
盪させた。アミノ酸は、グリシンとバリンをＢｏｃで保護した以外は全てＦｍｏ
ｃでそのＮ^αを保護した。側鎖保護基はＬｙｓ（Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙ
ｓ（ｐＭｅＯＢｚｌ）とした。ＰｙＢｒｏＰ（３ｅｑ．）をカップリング剤とし
て用い、各カップリングにおいて保護されたアミノ酸の３倍過剰、ＤＩＥＡの７
倍過剰とした。保護アミノ酸は全てカップリング前に１０分間予備活性化させた
。カップリング反応は２時間かけて行った。各ペプチドの第１番目のアミノ酸の
カップリングは２度繰り返した。キャッピングは０．５Ｍ無水酢酸、０．１２５
ＭＤＩＥＡおよび０．０１５ＭＨＯＢＴを含むＤＭＦ中で１時間行った。Ｆ
ｍｏｃ保護基除去は２０％ピペリジンを含むＤＭＦ中で３０分の処理を２度繰り
返して行った。ライブラリーの合成のためにＦｍｏｃ−Ｎ^α−［ω−（Ｂｏｃ−
アミノ）アルキル］グリシンビルディングユニットを既報のとおり調製した（Ｗ
Ｏ９５／３３７６５およびＷＯ９７／０９３４４に示す方法、これらはその全体
を本明細書中に参照により組み込むこととする）。

【００３３】ビルディングユニットの後ろへのリジンのカップリングを３回繰り返した。Ｂ
ｏｃ保護基除去は５５％ＴＦＡを含むＤＣＭ中で２分間行い、次いでさらに３０
分間行った。ラクタム環状化はＴＢＴＵ（３ｅｑ）を４ｅｑのＤＩＥＡと共に用
いてＢｏｃ保護基除去の後に３回行った。ＨＦ切断はＫｅｌＦシステム（ペプ
チド研究所，大阪）で行った。第１ライブラリーではチオアニソールをスカベン
ジャーとして用い、アニソールをその他のペプチドの切断において同じ目的で用
いた。反応は−５℃で２時間行った。ＨＦを蒸発させた後、切断したペプチドお
よび樹脂をＴＦＡで処理し、樹脂をろ過して除き、２ｍｌのＴＦＡで３回洗った
。ＴＦＡ洗液を合わせて窒素雰囲気下で蒸散させ、粗ペプチドを冷エチルエーテ
ルで沈殿させた。粗ペプチドを冷エーテルで数回洗い、乾燥させ、３０％酢酸中
に溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチドをＴＯＦ−ＭＳで分析した結果、その分子
量は期待された値であった。第１ライブラリーは混合物として分析した。その他
のペプチドは全て個別に特徴を調べた。それらのペプチドをＨＰＬＣ（Ｍｅｒｃ
ｋＨｉｔａｃｈｉ６５５ＡにＬ−６２００Ａ勾配ポンプおよび波長可変のＵ
Ｖ−ｖｉｓ検出器を２１５ｎｍにセットして取り付けた）で分析した。流速は１
ｍＬ／分に固定し、勾配は５−６０％アセトニトリル：ＴＤＷ（それぞれ０．１
％および０．０８５％のＴＦＡを含有）、３５分間とした。カラムはＳｈａｎｄ
ｏｎのＲＰ−３を用いた。ペプチド１７−２０、１９．１−１９．４、２１およ
び２２もＡＡＡで特徴を調べた。ペプチド１９．１−１９．４、２１および２２
は半調製的ＨＰＬＣで精製した。分離はＬｉｃｈｏｓｏｒｂＲＰ−８２５０
ｘ１０ｍｍの内径のカラム（Ｍｅｒｃｋ）で流速を４．５ｍＬ／分の定速とし
て行った。勾配は５−６０％アセトニトリル：ＴＤＷ（それぞれ０．１％およ
び０．０８５％のＴＦＡを含有）、４５分間とした。精製したペプチドについて
も分析用ＨＰＬＣ、ＡＡＡ、およびＴＯＦ−ＭＳで特徴を調べた。

【００３４】実施例２．直鎖状ペプチドの合成直鎖状ＮＬＳペプチドをＲｉｎｋアミド樹脂（０．５ｍｍｏｌ／ｇをロード）
上でＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒ４３３Ａ型を用い、ＦａｓｔＭｏｃ^ＴＭ合成法を用いて合成した。５
％アニソールをスカベンジャーとして用いてＴＦＡで樹脂からペプチドを切り出
し、冷エーテル中で沈殿させ、３０％酢酸中に溶解し凍結乾燥した。粗ペプチド
を逆相ＨＰＬＣ（Ｃ３カラム、勾配は５−６０％アセトニトリル：ＴＤＷ、０
．１％ＴＦＡ含有、３５分間）で分析し、ＴＯＦ−ＭＳおよびアミノ酸分析で特
徴を調べた。

【００３５】実施例３．ｉｎｖｉｔｒｏ系における核への輸送の定量分析核への輸送を、本質的には既に報告されている方法で（Ｍｅｌｃｈｉｏｒら，
（１９９３）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２３（６），１６４９−１６５９）、
ただし、Ｃｏｌｏ−２０５細胞の懸濁液をＨｅＬａ細胞の懸濁液の替わりに用い
、５００ｎＭのビオチニル化ＢＳＡ−ＮＬＳを輸送基質として用いたことを除い
て、定量的に測定した。ＩｇＧ画分を用いる替わりにウサギ抗ＢＳＡ血清でイム
ノモジュールストリップ（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅｓｔｒｉｐ）をコートし
た。結果は３回測定の平均で示しているが標準偏差が±２０％を超えたものはな
かった。

【００３６】実施例４．蛍光顕微鏡観察による核への輸送の評価ＨｅＬａ細胞を１０ｍｍのカバーガラス上でサブコンフルエントな密度となる
まで培養した後、既に報告されている方法（Ｂｒｏｄｅｒら，同上）でジギトニ
ンを用いて透過性を持たせた。ＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳシグナルを担持す
る直鎖状ペプチドを（ＦＩＴＣで）蛍光標識したＢＳＡ分子（Ｇｏｌｄｆａｒｂ
ら，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２２，６４１−６４４）に共有結合で付着さ
せ、その結果得られた蛍光標識ＮＬＳ−ＢＳＡ分子（ＦＬ−ＮＬＳ−ＢＳＡ）の
、ジギトニンで透過性を持たせたＨｅＬａ細胞の核内への移行を蛍光顕微鏡で既
に報告されているように（Ｂｒｏｄｅｒら，同上）観察することによって追跡し
た。実施例５．第１骨格環状化ＮＬＳ模倣体ライブラリーの設計、合成、および
スクリーニング骨格環状化ペプチドライブラリーの設計は、ＮＭＲで決定されたＨＩＶ−１
ＭＡの構造に基づいている（Ｍａｓｓｉａｈら，（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２４４，１９８−２２３；Ｍａｔｔｈｅｗｓら，（１９９４）Ｎａｔｕｒ
ｅ３７０，６６６−６６８）。このタンパク質のＮＬＳ領域の配列は−ＫＫＱ
ＹＫ−もしくは他のＨＩＶ−１株では−ＫＫＫＹＫ−であり（Ｍａｓｓｉａｈら
，（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４，１９８−２２３）、それはβ−
シートの外側の鎖内に位置している。残基Ｋ２６、Ｋ２７、Ｑ２８およびＫ３０
は溶媒に暴露されているがＹ２９の側鎖はタンパク質の内部に面しておりＴ９７
と水素結合を形成している。Ｔｙｒ２９をＰｈｅ残基で置換するとＨＩＶ−１
ＭＡの核への取り込みが顕著に低減する（Ｖｏｎ−Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒら，同上
）。Ｙ２９はタンパク質表面に露出していないので、その役割はＮＬＳ領域の生
物活性を有するコンホメーションの安定化であろうと考えられる。想像するとこ
ろでは、このコンホメーションは推定上のＮＬＳ受容体への結合のために塩基性
残基をアクセス可能とすることに寄与している（Ｇｏｒｌｉｃｈら，（１９９４
）Ｃｅｌｌ７９，７６７−７７８）。この仮定から第１のペプチドライブラリ
ーを、Ｙ２９が骨格環状化ビルディングユニットで置換されるように設計するこ
ととなった。ビルディングユニットの役割はＹ２９の役割を模倣すること、すな
わちＮＬＳにコンホメーションの拘束性（環状化による）を与えることである。
環の大きさについてのシクロスキャンを阻害効果に必要な最適な環の大きさを決
定するために第１ライブラリーについて行った。

【００３７】上述の情報に基づき、図１ａに示す一般式を有するペプチド２０個のＮ−骨格
から末端へ環状化したライブラリーを設計した。用いた骨格環状化ビルディング
ユニットは遊離アミンをＮ−アルキル鎖の末端に持ち、ラクタム環の環状化はペ
プチドのＮ末端へ付着させたジカルボン酸スペーサーへのアミド結合によって形
成した。

【００３８】第１ライブラリーの初回スクリーニングは、そのライブラリーのペプチドのｉ
ｎｖｉｔｒｏ系でのＦＬ−ＮＬＳ−ＢＳＡの核への移動を競合的に阻害する能力
を評価することによって行った（実施例３）。ライブラリーを４つの粗ペプチド
混合物に分けそれぞれを別個にスクリーニングした。これらの混合物のうちの１
つ、混合物４と名付けたもの（ペプチド１７−２０を含有、図１ａ参照）のみが
阻害活性を有することが見出された。次いで、その混合物４中に存在する個々の
粗ペプチドの活性を同じ方法で測定し、その中からペプチド１９（環の大きさが
２６個の原子であるもの）が最も強力な阻害剤であることが見出され、それを第
２ライブラリーのリード化合物として用いた。

【００３９】実施例６．第２骨格環状化ＮＬＳ模倣体ライブラリーの設計、合成、および
スクリーニングＮＬＳ模倣体リード化合物（ペプチド１９）の阻害活性を最適化するために、
図１ｂに示す一般式を有する第２ライブラリーを設計し、合成した。このライブ
ラリーでは、環の大きさと位置はペプチド１９中のものと同様に維持し、アミノ
酸スキャンをその環と元のペプチド双方で行った。システイン残基はＮＬＳ配列
の不可欠な部分ではないが、そのシステイン残基を種々のアミノ酸で置換した。
粗ペプチド（１９．１−１９．４と名付けた）の活性を蛍光顕微鏡で測定した（
実施例４）。それらうちの２個のペプチド、１９．２と１９．４が阻害活性を持
つことが見出された。このライブラリーから精製されたそれらのペプチドのＩＣ
_５０値を、対応する直鎖状の元のＮＬＳペプチドの値と比較したものを表２に示
す。ペプチド１９．２は最も活性の高い骨格環状化ペプチドでＩＣ_５０値が３μ
Ｍであることが見出された。阻害活性を向上させるために、このペプチドをリー
ド化合物として用いてシクロスキャン法をさらに反復して行った。

【００４０】

【表２】この結果はリードペプチド１９．２がプロトタイプのＳＶ４０ＮＬＳよりは
るかに非力であるが、それでもなおＨＩＶ−ＭＡＮＬＳよりは強力であること
を示している。本発明者らは、ペプチド１９．２の相対的に低い活性は環の中の
グリシン残基が予期していたβ構造には重要でなく、その結果安定性のより低い
β構造を有するペプチドになってしまったという事実によるものであろうと考え
ている。β構造をより安定化し、それによってペプチド１９．２の阻害活性を向
上させるために、グリシン残基を、最良のβシート形成物として知られているバ
リン残基（Ｓｍｉｔｈら，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３，５５
１０−５５１７）と置換した。その結果得られた新しいペプチド、それは本発明
者らがＢＣｖｉｒ（ペプチド２２）と名付けたが、そのペプチドの構造を図２に
示す。予期したとおり、精製ＢＣｖｉｒは高い活性を有し、そのＩＣ_５０値は３
５ｎＭに達し、リード化合物である１９．２の値よりも２けた良い値であること
が見出された。比較のために述べれば、直鎖状の元のペプチド、すなわちＨＩＶ
−１ＭＡＮＬＳでのＩＣ_５０値は１２μＭであった。

【００４１】上記の結果を蛍光標識したＮＬＳ−ＢＳＡの核への輸送および蛍光顕微鏡観察
（実施例４）によって確認した。図３にみられるとおり、ＢＣｖｉｒは核への輸
送を完全に抑えた。

【００４２】実施例７．ＢＣｖｉｒのトリプシンによるタンパク質分解性切断に対する安
定性方法：０．０５ｍＬのトリプシン溶液（ＨＣｌ０．００１Ｍ溶液中に８％ｗ
／ｖ含有するもの）、０．５ｍＬＴＥＡバッファーｐＨ７．８（Ｇｅｉｇｅｒ
，Ｒ．とＦｒｉｔｚ，Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃａｎ
ａｌｙｓｉｓ中の記載，Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒら編，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，
Ｖｅｒｌａｇ−ｃｈｅｍｉｅ，（１９８４），１１９−１２９）および０．２ｍ
Ｌのペプチド２２（ＢＣｖｉｒ）水溶液（初濃度１．２５ｍｇ／ｍＬ）を含有す
る混合物を、ペプチド添加直後（ｔ＝０）にＨＰＬＣ（Ｃ３カラム，勾配は５−
６０％アセトニトリル：ＴＤＷ、０．１％ＴＦＡ含有、３５分間）に注入した
。その混合物を室温でインキュベートし、７０分毎にサンプルを注入した。同じ
実験をペプチド１９．４（初濃度３ｍｇ／ｍＬ）およびＨＩＶ−ＭＡＮＬＳ直
鎖状ペプチド（初濃度２０ｍｇ／ｍＬ）でも行った。各タイムインターバルにお
けるピーク面積をｔ＝０のペプチドのピーク面積と比較して相対ペプチド濃度の
尺度とした。

【００４３】結果：ＢＣｖｉｒは４つのリジン残基を含んでいるためトリプシンによるタンパ
ク質分解作用を受けるか調べることは重要である。上述のとおり、骨格環状化ペ
プチドはタンパク質分解酵素に対して比較的抵抗性であろうと予測される。図４
に示した結果はトリプシンによるＢＣｖｉｒ消化のｔ１／２は７時間であり、ペ
プチド１９．４のｔ１／２は９時間、直鎖状ＨＩＶ−ＭＡＮＬＳの元のペプチ
ドでは約１．３時間にすぎないことを示している。そのｔ１／２が長いことに反
映されているように、ＢＣｖｉｒはトリプシンによる切断にかなり高い抵抗性を
有している。ＨＰＬＣのクロマトグラム、そこではＢＣｖｉｒに対応するピーク
面積は減少しており、より短い保持時間を有する別のピークの面積は増加してい
るが、そのクロマトグラムに基づいて、ＢＣｖｉｒの環の外側のリジン−ロイシ
ン結合がゆっくりと切断されているものと本発明者らは仮定した。タンパク質分
解が環の内部で起こると、産物のピークが複数現れる。この仮定は、環の外部の
ペプチド結合を持たないペプチド１９．４がより長いｔ１／２値を有しているこ
とを示す結果によって支持される。

【００４４】実施例８．ＢＣｖｉｒによるＨＩＶ−１産生の阻害方法：Ｈｕｔ７８細胞（０．５ｘ１０^６／ｍＬ）を３７℃で２時間、５μｇ／ｍ
Ｌのアフィジコリンの存在下もしくは不在下でインキュベートした。次いで細胞
にＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ（感染多重度０．１）をＢＣｖｉｒ（１００μｇ／ｍＬ）
の存在下もしくは不在下で感染させた。１時間吸着させた後、細胞を１．５ｍＬ
の同じ培地中でインキュベートし、１２０μＬのサンプルを感染後３，５，７，
および９日後に採取した。ウイルスの伝播は、ＶｉｒｏｎｏｓｔｉｋａＨＩＶ
−１ＡｎｔｉｇｅｎＭｉｃｒｏＥＬＩＳＡシステム（ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋ
ｎｉｋａ，米国）を用いてｐ２４−ＣＡ抗原の培地中への放出量を測定すること
によって調べた。

【００４５】結果：ＢＣｖｉｒは無細胞系でＮＬＳ−ＢＳＡの核への輸送を阻害するので、本
発明者らはそれのウイルス感染細胞におけるＨＩＶ−１産生に及ぼす影響を調べ
た。ＭＡＮＬＳはＨＩＶ−１の分裂していない細胞内での複製にのみ不可欠で
あるので（Ｖｏｎ−Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒら，同上；Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙら，同上
）、ＢＣｖｉｒの効力はアフィジコリンで細胞サイクルを停止させた細胞で調べ
た。図５Ａは感染９日後にＢＣｖｉｒ（１００μｇ／ｍＬ）が分裂していないＨ
ｕｔ７８細胞でのウイルス産生を非処理細胞におけるウイルス産生と比べ７５％
低減させたことを示している。ＢＣｖｉｒはアフィジコリン非処理の分裂細胞で
はウイルス産生に影響を及ぼさない（図５Ｂ）。アフィジコリンが不在の状態で
増殖させた細胞におけるウイルス産生がアフィジコリン存在下で増殖させた細胞
における産生よりも、より効率的であることに注目されたい。

【００４６】実施例９．ＢＣｖｉｒの細胞傷害性の測定方法：Ｈｕｔ７８細胞（０．５ｘ１０^６／ｍＬ）をＢＣｖｉｒ０．１，１，１０
および１００μｇ／ｍＬ存在下もしくは不在下で培養した。生細胞数は細胞を撒
いてから１，２，４および７日後にトリパンブルーで染色して測定した。

【００４７】結果：ＢＣｖｉｒは未感染の培養Ｈｕｔ７８細胞の増殖速度に影響を及ぼさなか
った。

【００４８】実施例１０．ＨＩＶ−１Ｖｉｆタンパク質に由来するペプチドおよびＨＩ
Ｖ−１タンパク質に由来するその他のＮＬＳペプチドによるＳＶ４０−ＮＬＳ−
ＢＳＡの核への取り込みの阻害核への取り込みは特に記したもの以外はＥＬＩＳＡをベースとするアッセイで
測定した。ＩＣ_５０値はペプチドと輸送基質のモル比をそれぞれ５００：１と０
．００５：１の間の比で用いて測定した。全てのペプチドでシステイン残基はも
との配列の一部ではなくＢＳＡとコンジュゲートさせるために付加されたもので
ある。結果は下記の表３に示す。

【００４９】

【表３】（１）数字は天然のタンパク質中での残基の位置を示す。Ｖｉｆの推定上のＮＬ
Ｓに含まれる残基は太字で示す。

【００５０】（２）変異している残基は太字で示す。変異およびリバースＳＶ４０−ＮＬＳペ
プチドは阻害効果を示さなかったことに注目されたい。

【００５１】（３）これらの結果は蛍光顕微鏡観察に基づくものである。

【００５２】（＋）顕微鏡視野の大多数（７０−８０％以上）の細胞が核への取り込みを示し
た（蛍光染料が核内に存在）。

【００５３】（−）顕微鏡視野の大多数（７０−８０％以上）の細胞が核への取り込みを示さ
なかった（細胞の核ではなく、細胞質に蛍光標識が認められた）。

【００５４】実施例１１．ＨＩＶ−１タンパク質由来のペプチドによる核への取り込みの
促進および阻害指定したペプチド（その適当な配列については表３を参照）を標識ＢＳＡ分子
とコンジュゲートさせ、その結果得られたコンジュゲートの核への輸送を上述の
ＥＬＩＳＡベースのアッセイで評価した。核への取り込みの阻害を、上に列記し
たペプチドをＳＶ４０−ＮＬＳ−ＢＳＡを輸送基質として用いる核への輸送系へ
付加することによって評価した。結果は表４に示すとおりで、Ｖｉｆ８８−９
８を除いては蛍光顕微鏡観察（実施例４）によって確認された。

【００５５】

【表４】実施例１２．異なるコンジュゲート中での、ＢＳＡ分子にコンジュゲートされ
たＮＬＳペプチドの数の測定。ＢＳＡ分子各々とコンジュゲートしたＮＬＳペプチドの平均数はアミノ酸分析
で測定した。結果は表５にまとめた。

【００５６】

【表５】実施例１３．Ｔａｔ−ＮＬＳ−ＢＳＡの核への輸送の特徴の検討Ｔａｔ−ＮＬＳおよびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの配列を担持するペプチ
ドを合成し、ビオチニル化したＢＳＡとコンジュゲートさせた。透過性を持たせ
たｃｏｌｏ細胞の核内へのコンジュゲートの進入は上述の方法で評価した。ＢＳ
Ａコンジュゲートを添加する前に、ＡＴＰを枯渇させ、透過性を持たせた細胞と
ＷＧＡ（０．６ｍｇ／ｍＬ）およびＴａｔ−ＮＬＳペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）と
を室温で３０分間プレインキュベーションした。結果は表６に示す。

【００５７】

【表６】

【００５８】実施例１４．骨格環状化Ｔａｔ−ＮＬＳ模倣体ライブラリーのスクリーニン
グＳＶ４０−ＮＬＳ−ＢＳＡおよびＴａｔ−ＮＬＳ−ＢＳＡを輸送基質として用
いる核への輸送をｉｎｖｉｔｒｏＥＬＩＳＡ系を用いて実施した。結果は表
７に示す。

【００５９】

【表７】

【００６０】 ^＊＊ｉｎｖｉｔｒｏアッセイ系におけるＴａｔ−ＮＬＳ−ＢＳＡの核への輸
送には、Ｔａｔ−ＮＬＳが非インポーチン（ｉｍｐｏｒｔｉｎ）経路において核
への取り込みを促進するので、可溶性の細胞質ゾル因子の添加を必要としない。

【００６１】実施例１５．ＶｐｒＮＬＳ模倣体ウイルスタンパク質ｒ（Ｖｐｒ）はウイルスプレインテグレーション複合体（
ＰＩＣ）の核への輸送を媒介するＨＩＶ−１の補助的タンパク質であり、２つの
領域、Ｎ末端およびＣ末端、を含んでおりそれらは核局在化シグナル（ＮＬＳ）
として働くのではないかとされている。本発明者らは双方の領域（ＶｐｒＮおよ
びＶｐｒＣと呼ぶ）に対応するペプチドを合成し、それをウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）とコンジュゲートさせ、透過性を持たせた細胞中での核への輸送を媒介
する活性を調べた。ＶｐｒＣではなく、ＶｐｒＮのみが活性を有するＮＬＳとし
て機能し、コンジュゲートの核内への輸送を促進した。コンジュゲートの核への
輸送はエネルギーおよび温度に依存性であることが見出され、コムギ胚芽アグル
チニン（ＷＧＡ）によって阻害された。しかし、それには細胞質ゾル因子の添加
を必要とせず、プロトタイプのＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳペプチドによって阻
害されなかった。本発明者らの結果はＶｐｒが従来のものではない負電荷を帯び
たＮＬＳを有していることを示し、従ってＶｐｒが固有の核輸送経路を用いてい
ることを示唆している。

【００６２】（結論）本開示はＢＣタンパク質模倣体という新規のアプローチが、ウイルスタンパク
質内の特定の二次構造を有する活性領域の機能を有する模倣体を得るために、う
まく応用しうることを示している。このことはアミノ酸配列がＨＩＶタンパク質
のＮＬＳに対応した骨格環状化ペプチドが発見され、それがｉｎｖｉｔｒｏア
ッセイ系における核への輸送ならびに感染させた培養細胞でのＨＩＶ−１複製を
阻害することができたことによって示された。

【００６３】コンホメーションによる制限によって骨格環状化ＮＬＳペプチドは柔軟性がよ
り低くなり、おそらく直鎖状ペプチドより選択性が高くなる。さらに、骨格環状
化ペプチドはタンパク質分解に抵抗性で、そのことによって代謝に対しての安定
性を強めているはずである。代謝に対して安定となったことで骨格環状化ペプチ
ドは治療用途への応用の候補として魅力のあるものとなった。ＮＬＳ領域が隣接
してないアミノ酸残基、例えば２分節ＮＬＳ配列などからなる場合にはこのよう
なアプローチは明らかに不可欠である。

【００６４】治療目的でＨＩＶの核への輸送をブロックすることは既に示唆されており、そ
の目的のための非ペプチド性の小分子の使用も行われた（Ｄｕｂｒｏｖｓｋｙら
，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１（２），２１７−２３０）。ここに開示した
タイプのものから得た骨格環状化ペプチドはそのもともとの特性を有しかつ核へ
の輸送をブロックする活性があるので、新規のクラスの抗ウイルス剤および特に
抗ＨＩＶ剤を開発するための候補となる。

【００６５】その作用機作には関わらず、巨大分子のＮＬＳ配列を模したこの新規の骨格環
状化ペプチドは、巨大分子のＮＬＳ配列を模した骨格環状化ペプチドの治療的有
効量を有効成分として含む医薬組成物、および巨大分子の細胞質から核への輸送
を阻害するその組成物の有用性を特許請求事項としている。

【００６６】本発明の方法は、ＨＩＶ−１タンパク質ＭＡ、Ｔａｔ、およびＶｐｒのＮＬＳ
配列を模した、もしくは塩基性残基を有するＮＬＳ様配列を含むＶｉｆの８８−
９８残基にまたがる配列を模した骨格環状化ペプチドを用いてここに例示されて
いる。開示されているペプチドは感染細胞内でのウイルスの複製を阻害すること
が示されている。当業者であれば下記の実施例が単に説明のためのものであって
本発明の原理の非限定的な例示であり、別記の特許請求事項に定義した本発明の
請求事項の範囲内において多数の変更および改変を行いうることを理解するであ
ろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】骨格環状化ＮＬＳ模倣体ペプチドの一般構造：（ａ）第１ライブラリー、（ｂ
）第２ライブラリー。

【図２】ＢＣｖｉｒの構造。

【図３】ＢＣｖｉｒは、透過性を持たせたＨｅＬａ細胞の核内へのＦＬ−ＮＬＳ−ＢＳ
Ａの移動を阻害する。透過性を持たせたＨｅｌａ細胞をＦＬ−ＮＬＳ−ＢＳＡと
ＢＣｖｉｒの不在下（ａ）もしくは存在下（ｂ）でインキュベートした。ＢＣｖ
ｉｒ：輸送基質の比を２：１（ｗ／ｗ）として阻害性のＢＣｖｉｒを添加した。

【図４】ＢＣｖｉｒ、ペプチド１９．４、およびＨＩＶ−ＭＡＮＬＳのトリプシン消
化に対する感受性の測定。（Ａ）ＢＣｖｉｒ、（Ｂ）ペプチド１９．４、（Ｃ）
ＨＩＶ−ＭＡＮＬＳ直鎖ペプチド。半減期（ｔ１／２）はそれぞれ７、９、１
．３時間である。

【図５】ＢＣｖｉｒによるＨＩＶ−１産生の阻害：ＢＣｖｉｒをＨＩＶ−１感染の２時
間前にヒトＨｕｔ７８細胞に添加した。（Ａ）細胞サイクルを停止させたヒ
トＨｕｔ７８細胞でのＢＣｖｉｒによるＨＩＶ−１増殖の阻害［ＢＣｖｉｒなし
、ＢＣｖｉｒあり］。（Ｂ）分裂中の細胞では同じペプチドで阻害がみられない
［ＢＣｖｉｒなし、ＢＣｖｉｒあり］。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ロイター，アブラハムイスラエル国 97279 エルサレム，ハアヒムレハランストリート 16 (72)発明者ジロン，チャイムイスラエル国 96755 エルサレム，ゲルバーストリート 18 (72)発明者ウォルフ，アムノンイスラエル国 46684 ヘルツリア，シェベットメナシェストリート 44 Ｆターム(参考） 4C084 AA06 AA07 BA01 BA17 BA27 CA59 NA14 ZB331 ZC451 4H045 AA10 AA30 BA13 BA31 EA29 FA34 FA41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】巨大分子の細胞質から細胞核への移送を阻害することのでき
る骨格環状化ペプチド類似体であって、該巨大分子が核局在化シグナルの媒介に
よって核に進入する種類のものである前記骨格環状化ペプチド類似体。
【請求項２】前記ペプチドが、核局在化シグナル配列の媒介によって核に
進入する種類の巨大分子の該核局在化シグナル配列の骨格環状化類似体である請
求項１記載の骨格環状化ペプチド類似体。
【請求項３】前記ペプチドがウイルスタンパク質の核局在化シグナル配列
の骨格環状化類似体である請求項１記載の骨格環状化ペプチド。
【請求項４】前記ペプチドがＨＩＶ−１タンパク質の核局在化シグナル配
列の骨格環状化類似体である請求項３記載の骨格環状化ペプチド。
【請求項５】前記ペプチドが、ＨＩＶ−１タンパク質ＭＡ、Ｔａｔ、およ
びＶｐｒもしくはＨＩＶ−１タンパク質Ｖｉｆの残基８８−９８から選択される
核局在化シグナル配列の骨格環状化類似体である請求項４記載の骨格環状化ペプ
チド。
【請求項６】前記ペプチドが一般式Ｉ：【化１】［式Ｉ］〔この式で、ｎは１から１０の整数もしくは０であり、ただしｎが０のときには
ＮＨも存在しない；ｍは１から１０の整数である；Ｒはリジンもしくはグルタミ
ンである；ＡＡおよびＡＡ２は独立にアミノ酸残基を示し、それは同一のもので
も異なるものでもよい。〕を有する請求項１記載の骨格環状化ペプチド。
【請求項７】一般式ＩＩ：【化２】［式ＩＩ］〔この式で、ｎは１から１０の整数もしくは０であり、ただしｎが０のときには
ＮＨも存在しない；ｍは１から１０の整数である；Ｒはリジンもしくはグルタミ
ンである。〕を有する請求項６記載の骨格環状化ペプチド。
【請求項８】一般式ＩＩＩ：【化３】［式ＩＩＩ］〔この式で、Ｒはリジンもしくはグルタミンであり、ＡＡはセリン、ロイシンも
しくはメチオニンからなる群から選択される１個のアミノ酸残基であり、ＡＡ２
はバリン、グリシンもしくはシステインからなる群から選択される１個のアミノ
酸残基である。〕を有する請求項６記載の骨格環状化ペプチド。
【請求項９】Ｒがリジンであり、ＡＡがロイシンであり、かつＡＡ２がバ
リンである請求項８記載の骨格環状化ペプチド。
【請求項１０】一般式ＩＶ：【化４】［式ＩＶ］〔この式で、ｍおよびｎはそれぞれ独立に１から１０の整数である。〕を有する請求項１記載の骨格環状化ペプチド類似体。
【請求項１１】巨大分子の細胞質から細胞核への移送を阻害することので
きる骨格環状化ペプチドを有効成分として含む医薬組成物であって、該巨大分子
が核局在化シグナルの媒介によって核に進入する種類のものである前記医薬組成
物。
【請求項１２】前記ペプチドが、核局在化シグナル配列の媒介によって核
に進入する種類の巨大分子の該核局在化シグナル配列の骨格環状化類似体である
請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】前記ペプチドがウイルスの核局在化シグナル配列の骨格環
状化類似体である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】前記ペプチドがＨＩＶ−１の核局在化シグナル配列の骨格
環状化類似体である請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】前記ペプチドが、ＨＩＶ−１タンパク質ＭＡ、Ｔａｔ、お
よびＶｐｒもしくはＨＩＶ−１タンパク質Ｖｉｆの残基８８−９８から選択され
る核局在化シグナル配列の骨格環状化類似体である請求項１４記載の医薬組成物
。
【請求項１６】前記骨格環状化ペプチドが一般式Ｉ：【化５】［式Ｉ］〔この式で、ｎは１から１０の整数もしくは０であり、ただしｎが０のときには
ＮＨも存在しない；ｍは１から１０の整数である；Ｒはリジンもしくはグルタミ
ンである；ＡＡおよびＡＡ２は独立にアミノ酸残基を示し、それは同一のもので
も異なるものでもよい。〕を有する請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】前記骨格環状化ペプチドが一般式ＩＩ：【化６】［式ＩＩ］〔この式で、ｎは１から１０の整数もしくは０であり、ただしｎが０のときには
ＮＨも存在しない；ｍは１から１０の整数である；Ｒはリジンもしくはグルタミ
ンである。〕を有する請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】前記骨格環状化ペプチドが式ＩＩＩ：【化７】［式ＩＩＩ］〔この式で、Ｒはリジンもしくはグルタミンであり、ＡＡはセリン、ロイシンも
しくはメチオニンからなる群から選択される１個のアミノ酸残基であり、ＡＡ２
はバリン、グリシンもしくはシステインからなる群から選択される１個のアミノ
酸残基である。〕を有する請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１９】Ｒがリジンであり、ＡＡがロイシンであり、かつＡＡ２が
バリンである請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】前記骨格環状化ペプチド類似体が一般式ＩＶ：【化８】［式ＩＶ］〔この式で、ｍおよびｎはそれぞれ独立に１から１０の整数である。〕を有する請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項２１】巨大分子の細胞質から細胞核への移送を阻害する方法であ
って、該巨大分子が核局在化シグナルの媒介によって核に進入する種類のもので
あり、該細胞を請求項１に記載の骨格環状化ペプチド類似体の有効量と接触させ
ることを含む前記方法。
【請求項２２】前記ペプチドが、前記巨大分子の核局在化シグナル配列の
骨格環状化類似体である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】前記ペプチドがウイルスの核局在化シグナル配列の骨格環
状化類似体である請求項２１記載の方法。
【請求項２４】前記ペプチドがＨＩＶ−１の前記核局在化シグナル配列の
骨格環状化類似体である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】前記ペプチドが、ＨＩＶ−１タンパク質ＭＡ、Ｔａｔ、お
よびＶｐｒもしくはＨＩＶ−１タンパク質Ｖｉｆの残基８８−９８から選択され
る核局在化シグナル配列の骨格環状化類似体である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】前記骨格環状化ペプチドが一般式Ｉ：【化９】［式Ｉ］〔この式で、ｎは１から１０の整数もしくは０であり、ただしｎが０のときには
ＮＨも存在しない；ｍは１から１０の整数である；Ｒはリジンもしくはグルタミ
ンである；ＡＡおよびＡＡ２は独立にアミノ酸残基を示し、それは同一のもので
も異なるものでもよい。〕を有する請求項２４記載の方法。
【請求項２７】前記骨格環状化ペプチドが一般式ＩＩ：【化１０】［式ＩＩ］〔この式で、ｎは１から１０の整数もしくは０であり、ただしｎが０のときには
ＮＨも存在しない；Ｈは１から１０の整数である；Ｒはリジンもしくはグルタミ
ンである。〕を有する請求項２４記載の方法。
【請求項２８】前記骨格環状化ペプチドが式ＩＩＩ：【化１１】［式ＩＩＩ］〔この式で、Ｒはリジンもしくはグルタミンであり、ＡＡはセリン、ロイシンも
しくはメチオニンからなる群から選択される１個のアミノ酸残基であり、ＡＡ２
はバリン、グリシンもしくはシステインからなる群から選択される１個のアミノ
酸残基である。〕を有する請求項２４記載の方法。
【請求項２９】Ｒがリジンであり、ＡＡがロイシンであり、かつＡＡ２が
バリンである請求項２７記載の方法。
【請求項３０】前記骨格環状化ペプチドが一般式ＩＶ：【化１２】［式ＩＶ］〔この式で、ｍおよびｎはそれぞれ独立に１から１０の整数である。〕を有する請求項２１記載の方法。