KR102175170B1

KR102175170B1 - HBV enhancer 억제인자 ACK1을 포함하는 B형 간염 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102175170B1
Application number: KR1020190019252A
Authority: KR
Inventors: 최병선; 박용광; 이선영; 김경창; 윤철희; 김기순
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2020-11-05
Also published as: KR20200101075A

Abstract

본 발명은 HBV(hepatitis B virus) 인핸서(enhancer) 억제인자 ACK1(activated cdc42-associated kinase 1)을 포함하는 B형 간염 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에서 제작한 ACK1 유전자 및 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 레플리콘(replicon)이 도입된 세포주에서는 ACK1 발현에 따라 HBV의 전사과정 억제에 따른 HBV 복제 억제 및 이에 따른 항원 분비 억제 효과가 나타났고, 상기 효과는 ACK1이 안정적으로 발현된 세포주에서 더 강하게 나타났다. 또한, ACK1의 HBV 인핸서 활성 억제 효과는 HBV 인핸서에 결합하여 그 활성을 조절하는 전사인자의 발현 조절에 의한 것임을 확인한 바, 본 발명의 ACK1 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 조성물은 B형 간염의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

HBV enhancer 억제인자 ACK1을 포함하는 B형 간염 치료용 조성물{Composition for treating hepatitis B comprising inhibitor of HBV enhancer, ACK1}

본 발명은 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 인핸서(enhancer) 억제인자 ACK1(activated cdc42-associated kinase 1)을 포함하는 B형 간염 치료용 조성물에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)는 3.2kb의 DNA 바이러스로 만성 B형 간염, 간경화증, 그리고 간암을 일으키는 주된 원인으로 알려져 있고, 전세계적으로 매년 약 69만명이 HBV로 인한 합병증으로 사망한다는 보고가 있다.

현재 HBV 증식을 억제하기 위해 사용되는 약물로는 바이러스의 중합효소를 표적으로 하여 DNA 합성을 저해하는 라미부딘(lamivudine), 아데포비어(adefovir), 엔테카비어(entecavir), 테노포비어(tenofovir) 등의 핵산유사체가 사용되고 있으나, 장기간 복용으로 인한 약제 내성을 유발하고, HBV 지속감염의 원인인 HBV cccDNA(covalently closed circular DNA)나 RNA를 줄이지 못하는 근본적인 문제가 있다. 따라서, HBV의 다양한 생활사를 표적으로 하는 새로운 항바이러스제의 개발이 요구되고 있다.

HBV 게놈(genome)의 전사과정은 4개의 프로모터(promoter)와 2개의 인핸서(enhancer)에 의해 조절되며, 특히 인핸서 부위는 HBV 유전자 발현 및 프로모터 조절과 같이 전사과정에서 중요한 역할을 한다. 또한, 상기 HBV 인핸서는 인핸서 I 및 II를 포함하는데, HNF1, HNF3, HNF4 및 C/EBP가 인핸서 I 및 II 부위에 결합하여 인핸서 활성을 조절한다고 알려져 있으며, 특히, HNF1α, HNF4α 및 C/EBPα는 HBV 인핸서에 결합하여 그 활성을 증가시키고, HNF3β는 인핸서 활성을 감소시킴으로써 HBV 복제를 조절한다고 알려져 있다.

ACK1은 TNK2(tyrosine kinase non-receptor 2)라고도 불리며, 다양한 조직에서 발현되는 비-수용체 티로신 키나아제(non-receptor tyrosine kinase)이다. ACK1은 주로 전립선 암 생성(carcinogenesis)에 관여하는 세포 인자로 알려져, 항암제 개발의 표적이 되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1932683호

본 발명의 목적은 ACK1 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는, B형 간염의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 B형 간염 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ACK1(activated cdc42-associated kinase 1) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는, B형 간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ACK1 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는, B형 간염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) ACK1 유전자를 포함하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 세포에서 ACK1 단백질의 발현 또는 활성을 확인하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 ACK1 단백질의 발현 또는 활성을 무처리 대조군에 비해 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, B형 간염 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 제작한 ACK1 유전자 및 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 레플리콘(replicon)이 도입된 세포주에서는 ACK1 발현에 따라 HBV의 전사과정 억제에 따른 HBV 복제 억제 및 이에 따른 항원 분비 억제 효과가 나타났고, 상기 효과는 ACK1이 안정적으로 발현된 세포주에서 더 강하게 나타났다. 또한, ACK1의 HBV 인핸서 활성 억제 효과는 HBV 인핸서에 결합하여 그 활성을 조절하는 전사인자의 발현 조절에 의한 것임을 확인한 바, 본 발명의 ACK1 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 조성물은 B형 간염의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 ACK1 유전자 및 HBV 레플리콘(HBV1.2)이 도입된 세포주에서 HBV DNA 양을 측정한 서던 블롯팅(southern blotting) 사진(A) 및 이를 정량화한 그래프(B)이다(ACK1 +: ACK1 플라스미드 1 ㎍ 형질감염; 및 ACK1 ++: ACK1 플라스미드 2 ㎍ 형질감염).
도 2는 ACK1 유전자 및 HBV 레플리콘(HBV1.2)이 도입된 세포주에서 HBV의 e항원(HBeAg) 및 S항원(HBsAg)의 분비량을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 ACK1 유전자 및 HBV 레플리콘(HBV1.2)이 도입된 세포주에서 코어(Core) 단백질 및 ACK1 단백질의 발현을 면역형광염색(immunofluorescence)으로 확인한 사진이다.
도 4는 HBV 인핸서(enhancer) I 및 II의 위치 및 제작한 플라스미드들(EnhI·II, EnhI·ΔEnhII, 및 EnhII/Cp)에 대한 모식도이다.
도 5는 ACK1 발현에 따른 HBV 인핸서 활성을 측정한 결과 그래프이다(A: EnhI·II 플라스미드 도입 세포주; B: EnhI·ΔEnhII 플라스미드 도입 세포주; 및 C: EnhII/Cp 플라스미드 도입 세포주).
도 6은 ACK1이 안정적으로 발현된 세포주에 HBV 레플리콘(HBV1.2)을 도입한 후 ACK1 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블롯팅 사진(A), HBV DNA 양을 측정한 서던 블롯팅 사진(B), 이를 정량화한 그래프(C), HBV의 e항원(HBeAg) 및 S항원(HBsAg)의 분비량을 측정한 결과 그래프(D), HBV RNA 양을 측정한 결과 그래프(E), 및 상기 세포주에 HBV 인핸서 플라스미드 도입 후, 인핸서 활성을 측정한 결과 그래프(F)이다(pIRES: ACK1 유전자를 포함하지 않는 플라스미드만을 도입한 세포주; 1.3 및 2.10: ACK1이 안정적으로 발현되는 세포주 클론 2종).
도 7은 ACK1이 안정적으로 발현된 세포주에 HBV 레플리콘(HBV1.2)을 도입한 후 HBV의 코어(Core) 단백질 및 표면(Surface) 단백질 발현을 면역형광염색(immunofluorescence)으로 확인한 사진이다(pIRES: ACK1 유전자를 포함하지 않는 플라스미드만을 도입한 세포주; 1.3 및 2.10: ACK1이 안정적으로 발현되는 세포주 클론 2종).
도 8은 HBV 인핸서에 결합하여 그 활성을 조절하는 전사인자들의 결합위치를 나타낸 모식도이다.
도 9는 ACK1이 안정적으로 발현된 세포주에 HBV 레플리콘(HBV1.2)을 도입한 후 HBV 인핸서 활성을 조절하는 전사인자들의 mRNA(A) 및 단백질(B) 발현을 확인한 도면이다(pIRES: ACK1 유전자를 포함하지 않는 플라스미드만을 도입한 세포주; 1.3 및 2.10: ACK1이 안정적으로 발현되는 세포주 클론 2종).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ACK1(activated cdc42-associated kinase 1) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는, B형 간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 ACK1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

상기 ACK1 단백질은 인간 또는 동물 유래일 수 잇다.

상기 ACK1 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)으로 합성될 수 있으며, 통상적인 유전공학적 방법(Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 등)에 의해 제조될 수 있다.

상기 ACK1 단백질은 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 단백질은 본 발명의 단백질과 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.

상기 ACK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

상기 ACK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 동물 유래일 수 있다.

상기 ACK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있고, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(Lentivirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 조성물은 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)의 인핸서(enhancer) 활성을 억제하는 것일 수 있다.

상기 인핸서 활성의 억제는 인핸서 활성을 조절하는 전사인자의 발현 조절에 의한 것일 수 있고, 상기 전사인자는 HNF1α, HNF4α, HNF3β 또는 C/EBPα일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 ACK1 유전자 및 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 레플리콘(replicon)이 도입된 세포주를 제작하고, 상기 세포주에서 ACK1 발현에 따라 HBV의 전사과정 억제에 따른 HBV 복제 억제 및 이에 따른 항원 분비 억제 효과가 나타남을 확인하였다(도 1 내지 5 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 효과는 ACK1이 안정적으로 발현된 세포주에서 더 강하게 나타남을 확인하였고(도 6 및 7 참조). ACK1의 HBV 인핸서 활성 억제 효과는 HBV 인핸서에 결합하여 그 활성을 조절하는 전사인자의 발현 조절에 의한 것임을 확인하였다(도 8 및 9 참조).

따라서, 본 발명의 ACK1 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 B형 간염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 ACK1 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.

상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 10 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 내지 수회일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여 시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

상기 ACK1 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

상기 ACK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

상기 ACK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있고, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 건강기능식품은 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)의 인핸서(enhancer) 활성을 억제하는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 ACK1 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 B형 간염의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조한 식품으로, 인체의 건강을 유지하는데 도움을 주는 식품을 의미하나 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 모두 포함하는 의미로 사용한다.

건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

상기 단계 2)의 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학법(immunohistochemistry) 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. ACK1 발현에 따른 HBV 복제 억제 효과 확인

ACK1 발현에 따른 HBV 복제 억제 효과를 확인하고자 간암 세포주인 HepG2 세포에 HBV 및 ACK을 동시에 형질감염(transfection)시켜 HBV 복제 정도를 측정하였다.

1-1. 세포주의 제작

HepG2 세포를 3 × 10⁵개/웰로 6 웰 플레이트에 시딩(seeding)한 후, 세포 내에서 HBV의 복제가 가능한 레플리콘(replicon)인 HBV1.2를 1 ㎍, ACK1 플라스미드 1 또는 2 ㎍을 동시에 형질감염시켜 세포주를 제작하였다. 대조군으로 HBV1.2 및 ACK1이 모두 없는 세포주와 HBV1.2는 포함하나 ACK1이 없는 세포주를 사용하였다.

1-2. ACK1 발현에 따른 HBV DNA 감소 효과 확인

상기 실험예 1-1에서 제작한 세포를 형질감염 3일 후에 회수하여 서던 블롯팅(southern blotting)을 수행하였다.

구체적으로, 회수한 HepG2 세포를 100㎕의 HEPES 용해 버퍼(lysis buffer)로 깬 후, 핵산효소인 DNase I(Sigma, 미국)과 녹두 뉴클레아제(mung bean nuclease, Takara, 일본)를 처리하여 잔존하는 HBV 1.2 plasmid를 제거하였다. 이후, 코어 파티클(Core particle) 안에 있는 HBV DNA를 추출하기 위해 26% PEG(polyethylene glycol) 용액을 2시간 처리하여 코어 파티클을 모은 후 SDS(sodium dodecyl sulfate)와 페놀(phenol)을 이용하여 HBV DNA만을 추출하였다. 추출한 HBV DNA를 전기영동과 나일론 멤브레인(nylon membrane)에 트랜스퍼(transfer) 후, 동위원소 α-³²P가 부착된 프로브(probe)를 이용하여 HBV DNA를 검출하였다.

그 결과, ACK1이 발현됨에 따라 HBV DNA 양이 상대적으로 감소하여 실험한 범위에서 최대 40%가 감소됨을 확인하였다(도 1).

1-3. ACK1 발현에 따른 HBV의 항원 감소 효과 확인

상기 실험예 1-1에서 제작한 세포의 배양 배지를 형질감염 3일 후에 회수하여 배지로 분비된 HBV의 e항원(HBeAg) 및 S항원(HBsAg)의 양을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정하였다.

구체적으로, HBeAg/HBsAg ELISA 키트(Wantai Bio-Pharm, 중국)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 HBV 항원의 양을 측정하였다.

그 결과, ACK1이 발현됨에 따라 배지로 분비된 HBV의 e항원 및 S항원 양이 모두 감소됨을 확인하였다(도 2).

1-4. ACK1 발현에 따른 HBV의 코어(core) 단백질 감소 효과 확인

상기 실험예 1-1에서 제작한 세포를 형질감염 3일 후에 회수하여 면역형광염색(immunofluorescence, IFC)을 수행하였다.

구체적으로, 회수한 세포를 4% PFA(paraformaldehyde)로 콜라겐-코팅된 플레이트(collagen-coated plate)에 고정시키고 0.25% 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 세포막을 투과시켰다. HBV 코어 단백질은 항-HBV 코어 항체(Cat. #. B0586, Dako, 덴마크), FLAG 태그(tag)가 부착된 ACK1은 항-FLAG-M2 항체(Cat. #. A5316, Sigma)를 각각 사용하여 염색하였고, 세포 핵은 DAPI(Cat. #. 28718-90-3, Sigma)로 염색하였다.

그 결과, ACK1이 발현된 세포에서는 HBV 코어 단백질 발현이 억제됨을 확인하였다(도 3).

상기 실험예 1-1 내지 1-4를 통하여 ACK1의 발현에 따라 HBV DNA가 감소하고, HBV의 항원 분비가 감소되며, HBV의 코어 단백질 발현이 감소됨을 확인하였으며, 이는 ACK1이 HBV의 복제 및 그에 따른 항원 분비를 감소시킴을 제시한다.

실험예 2. ACK1 발현에 따른 HBV 인핸서 활성 억제 효과 확인

ACK1이 HBV의 생활사 중 전사(transcription) 단계에서 HBV 복제를 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 HBV 인핸서 활성에 미치는 영향을 조사하였다.

2-1. 세포주의 제작

HBV의 2종 인핸서에 대한 ACK1의 영향을 조사하기 위하여, 각 인핸서가 모두 포함된 리포터(reporter) 플라스미드(EnhI·II), 인핸서 I만을 포함하는 리포터 플라스미드(EnhI·ΔEnhII), 및 인핸서 II만을 포함하는 리포터 플라스미드(EnhII/Cp)를 제작하였다(도 4). 간암 세포주 HepG2 세포를 1 × 10⁵ 개/웰로 12 웰 플레이트에 시딩한 후, 상기 각 인핸서 플라스미드를 0.5 ㎍, ACK1을 0.5 또는 1 ㎍으로 동시에 형질감염시켰다.

2-2. ACK1 발현에 따른 HBV 인핸서 활성 억제 효과 확인

상기 실험예 2-1에서 제작한 세포주의 인핸서 활성을 발광 측정법(reporter assay)으로 확인하였다.

구체적으로, 상기 세포를 형질감염 48시간 후에 회수하고, 루시퍼라아제 활성 측정 키트(Luciferase Assay system, Promega)를 사용하여 인핸서 활성을 측정하였다. 또한, 베타-갈락토시다아제 활성 측정 키트(β-galactosidase enzyme system, Promega)로 베타-갈락토시다아제 활성을 측정하여 형질감염 효율을 보정하였다.

그 결과, 모든 세포주에서 인핸서 I 및 II 모두 ACK1 발현에 따라 그 활성이 감소되었다(도 5). 이는 ACK1이 HBV의 전사과정을 억제함으로써 최종적으로 HBV의 복제를 억제하는 효과를 나타냄을 제시한다.

HepG2-ACK1 세포주의 제작

HepG2 세포에 퓨로마이신(puromycin)에 저항을 보이는 ACK1 플라스미드를 형질감염시켰다. 3일 후에 FLAG 태그가 부착된 ACK1이 발현되는 세포만을 선별하기 위하여, 세포에 퓨로마이신 1 ㎍/mL를 처리한 후, 살아있는 세포만을 선별하였다. 선별한 세포를 회수하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하였다. 구체적으로, RIPA 버퍼로 세포를 용해하고, SDS-PAGE로 단백질을 분리하여 PVDF 멤브레인에 옮겼다. 5% 스킴 밀크(5% non-fat dry skim milk)를 이용하여 블로킹(blocking)한 후, 1:2,000으로 희석한 항-FLAG-M2(Cat. #. A5316, Sigma) 항체로 ACK1 단백질을 검출하였다. 대조군으로 ACK1 유전자를 포함하지 않는 플라스미드인 pIRES만을 도입한 세포주를 제작하여 ACK1 단백질 발현을 비교하였다.

그 결과, ACK1 단백질을 안정적으로 발현하며, 그 발현량에 차이를 보이는 두 종류의 세포를 선별하였다(1.3 및 2.10 클론, 도 6A).

실험예 3. 안정적으로 ACK1이 발현된 세포에서 HBV 복제 억제 효과 확인

안정적으로 ACK1이 발현되는 시스템에서 ACK1에 의한 HBV 복제 억제효과를 검증하기 위하여 상기 실시예 1에서 제작한 HepG2-ACK1 세포주에 HBV1.2를 형질감염시킨 후, HBV 복제 억제 효과를 확인하였다.

3-1. 세포주의 제작

HepG2-ACK1 세포주 또는 ACK1 유전자를 포함하지 않는 플라스미드인 pIRES만을 도입한 세포주(HepG2-pIRES)를 3 × 10⁵ 개/웰로 6 웰 플레이트에 시딩한 후, HBV1.2를 형질감염시켰다.

3-2. ACK1 발현에 따른 HBV DNA 감소 효과 확인

상기 실험예 3-1에서 제작한 세포를 형질감염 3일 후에 회수하여 상기 실험예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 서던 블롯팅(southern blotting)을 수행하였다.

그 결과, ACK1이 발현되는 세포에서 HBV DNA 양이 상대적으로 감소하였다(도 6B 및 6C).

3-3. ACK1 발현에 따른 HBV의 항원 감소 효과 확인

상기 실험예 3-1에서 제작한 세포의 배양 배지를 형질감염 3일 후에 회수하여 배지로 분비된 HBV의 e항원(HBeAg) 및 S항원(HBsAg)의 양을 상기 실험예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다.

그 결과, ACK1이 발현되는 세포에서 배지로 분비된 HBV의 e항원 및 S항원 양이 모두 감소되었다(도 6D).

3-4. ACK1 발현에 따른 HBV RNA 감소 효과 확인

상기 실험예 3-1에서 제작한 세포를 형질감염 3일 후에 회수하여 HBV RNA의 상대적인 양을 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, 실시간 PCR)으로 측정하였다.

구체적으로, 상기 회수한 세포로부터 RNA 추출 키트(RNeasy Plus mini Kit, Qiagen, 독일)를 이용하여 총 RNA를 추출한 후, cDNA(complementary DNA) 합성 키트(SuperScriptIII First-strand synthesis kit, Invitrogen, 미국)를 이용하여 2㎍의 총 RNA를 cDNA로 합성하였다. 이후, 하기 표 1의 프라이머들 및 PCR 기기(QuantStudio 3.0, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 표 2의 조성으로 제조사의 설명서에 따라 실시간 PCR을 수행하였다.

프라이머명	서열(5‘→3’	서열번호
HBV RNA forward	CTCGTGGTGGACTTCTCTC	3
HBV RNA reverse	CTGCAGGATGAAGAGGAA	4
GAPDH forward	ATCATCCCTGCCTCTACTGG	5
GAPDH reverse	TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC	6

cDNA	2 ㎕
Power SYBR Green Master Mix	25 ㎕
Forward primer (10 pmol)	1 ㎕
Reverse primer (10 pmol)	1 ㎕
D.W.	21 ㎕
Total	50 ㎕

그 결과, ACK1이 발현되는 세포에서 HBV의 상대적인 RNA 양이 감소하였다(도 6E).

3-5. ACK1 발현에 따른 HBV 인핸서 활성 감소 효과 확인

상기 실험예 3-1에서 제작한 세포(HepG2-ACK1)에 HBV 인핸서의 리포터 플라스미드(EnhI·II) 만을 0.5 ㎍으로 형질감염시킨 것을 제외하고는 상기 실험예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 세포주를 제작한 후, 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 인핸서 활성을 측정하였다.

그 결과, ACK1이 발현되는 세포에서 HBV의 인핸서 활성이 현저히 감소하였다(도 6F).

3-6. ACK1 발현에 따른 HBV의 코어 단백질 및 표면(surface) 단백질 감소 효과 확인

상기 실험예 3-1에서 제작한 세포를 형질감염 3일 후에 회수하여, HBV의 표면 단백질에 대한 항체(HBsAg, Cat.#. ab9193, Abcam, 영국)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-4에 기재된 것과 동일한 방법으로 면역형광염색을 수행하였다.

그 결과, ACK1이 발현되는 세포에서 HBV의 코어 단백질 및 표면 단백질 발현이 감소하였다(도 7).

상기 실험예 3-1 내지 3-6을 통하여 ACK1이 안정적으로 발현되는 세포에서 HBV DNA 및 RNA가 감소하고, HBV 인핸서 활성이 감소하며, HBV의 코어 단백질 및 표면 단백질 발현이 감소하고, HBV의 항원 분비가 감소됨을 확인하였다. 이는 상기 실험예 1의 결과와 일치하는 결과이나, ACK1이 안정적으로 발현되는 세포에서 HBV에 대한 항바이러스 효과가 더 크게 나타났으며, 이는 ACK1이 세포 내에서 HBV를 억제하는 분자임을 제시한다.

실험예 4. 안정적으로 ACK1이 발현된 세포에서 HBV 인핸서에 결합하는 전사인자의 발현 조절 효과 확인

안정적으로 ACK1이 발현된 세포에서 HBV 인핸서에 결합하여 그 활성을 조절하는 전사인자들(HNF1α, HNF4α, HNF3β 및 C/EBPα; 도8)의 발현 정도를 측정하였다.

4-1. HNF1α, HNF4α, HNF3β 및 C/EBPα의 mRNA 발현 확인

상기 실험예 3-1에서 제작한 세포를 형질감염 3일 후에 회수하여 PCR을 수행하여 HNF1α, HNF4α, HNF3β 및 C/EBPα의 mRNA 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실험예 3-4에 기재된 것과 동일한 방법으로 회수한 세포로부터 총 RNA를 추출하고, cDNA를 합성한 후, 이를 주형으로 하고 하기 표 3의 프라이머들을 이용하여 표 4의 조성으로 95℃에서 5분간 반응한 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30 사이클(cycle) 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭하는 조건으로 RT-PCR을 수행하였다. 이후, 증폭된 PCR 산물을 아가로스(agarose) 젤에 전기영동하여 밴드 검출 여부를 확인하였다.

프라이머명	서열(5‘→3’	서열번호
HNF1α forward	TGTGCGCTATGGACAGCCTGC	7
HNF1α reverse	CTGTGTTGGTGAACGTAGGA	8
HNF4α forward	GAGTGGGCCAAGTACATCCCAG	9
HNF4α reverse	GCTTTGAGGTAGGCATACT	10
HNF3β forward	AAGATGGAAGGGCACGAGC	11
HNF3β reverse	TGTACGTGTTCATGCCGTTCA	12
C/EBP1α forward	CCTTGTGCAATGTGAATGTGC	13
C/EBP1α reverse	CGGAGAGTCTCATTTTGGCAA	14
GAPDH forward	ATCATCCCTGCCTCTACTGG	5
GAPDH reverse	TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC	6

cDNA	2 ㎕
Ex taq (Cat.#. RR001A, Takara, 일본)	0.5 ㎕
10×Ex taq buffer	2.5 ㎕
dNTP mix (각 2.5 mM)	2 ㎕
Forward primer (10 pmol)	1 ㎕
Reverse primer (10 pmol)	1 ㎕
D.W.	16 ㎕
Total	25 ㎕

그 결과, HBV 인핸서의 활성을 증가시키는 전사인자인 HNF1α, HNF4α 및 C/EBPα의 mRNA 발현은 ACK1 발현에 의해 감소하였다(도 9A).

4-2. HNF1α, HNF4α, HNF3β 및 C/EBPα의 단백질 발현 확인

상기 실험예 3-1에서 제작한 세포를 형질감염 3일 후에 회수하여 항-HNF1α 항체(B-3, Cat.#. sc-393668, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, 미국), 항-HNF4α 항체(H-1, Cat.#. sc-374229, 1:2000, Santa Cruz Biotechnology), 항-HNF3β 항체(D-5, Cat.#. sc-374376, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology) 또는 항-CEBPα 항체(D-5, Cat.#. sc-365318, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하여 HNF1α, HNF4α, HNF3β 및 C/EBPα의 단백질 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, HBV 인핸서의 활성을 증가시키는 전사인자인 HNF1α, HNF4α 및 C/EBPα의 단백질 발현은 ACK1 발현에 의해 감소하였고, HBV 인핸서의 활성을 감소시키는 전사인자인 HNF3β의 단백질 발현은 ACK1 발현에 의해 증가하였다(도 9B).

상기 실험예 4-1 및 4-2를 통하여 ACK1이 HNF1α, HNF4α 및 C/EBPα의 발현 감소 및 HNF3β의 발현 증가를 통하여 HBV 인핸서 활성을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> Composition for treating hepatitis B comprising inhibitor of HBV enhancer, ACK1 <130> 2018P-12-024 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1036 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Pro Glu Glu Gly Thr Gly Trp Leu Leu Glu Leu Leu Ser Glu 1 5 10 15 Val Gln Leu Gln Gln Tyr Phe Leu Arg Leu Arg Asp Asp Leu Asn Val 20 25 30 Thr Arg Leu Ser His Phe Glu Tyr Val Lys Asn Glu Asp Leu Glu Lys 35 40 45 Ile Gly Met Gly Arg Pro Gly Gln Arg Arg Leu Trp Glu Ala Val Lys 50 55 60 Arg Arg Lys Ala Leu Cys Lys Arg Lys Ser Trp Met Ser Lys Val Phe 65 70 75 80 Ser Gly Lys Arg Leu Glu Ala Glu Phe Pro Pro His His Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Phe Arg Lys Thr Ser Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ala Gly Glu Gly 100 105 110 Pro Leu Gln Ser Leu Thr Cys Leu Ile Gly Glu Lys Asp Leu Arg Leu 115 120 125 Leu Glu Lys Leu Gly Asp Gly Ser Phe Gly Val Val Arg Arg Gly Glu 130 135 140 Trp Asp Ala Pro Ser Gly Lys Thr Val Ser Val Ala Val Lys Cys Leu 145 150 155 160 Lys Pro Asp Val Leu Ser Gln Pro Glu Ala Met Asp Asp Phe Ile Arg 165 170 175 Glu Val Asn Ala Met His Ser Leu Asp His Arg Asn Leu Ile Arg Leu 180 185 190 Tyr Gly Val Val Leu Thr Pro Pro Met Lys Met Val Thr Glu Leu Ala 195 200 205 Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Lys His Gln Gly His Phe 210 215 220 Leu Leu Gly Thr Leu Ser Arg Tyr Ala Val Gln Val Ala Glu Gly Met 225 230 235 240 Gly Tyr Leu Glu Ser Lys Arg Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Asn Leu Leu Leu Ala Thr Arg Asp Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly 260 265 270 Leu Met Arg Ala Leu Pro Gln Asn Asp Asp His Tyr Val Met Gln Glu 275 280 285 His Arg Lys Val Pro Phe Ala Trp Cys Ala Pro Glu Ser Leu Lys Thr 290 295 300 Arg Thr Phe Ser His Ala Ser Asp Thr Trp Met Phe Gly Val Thr Leu 305 310 315 320 Trp Glu Met Phe Thr Tyr Gly Gln Glu Pro Trp Ile Gly Leu Asn Gly 325 330 335 Ser Gln Ile Leu His Lys Ile Asp Lys Glu Gly Glu Arg Leu Pro Arg 340 345 350 Pro Glu Asp Cys Pro Gln Asp Ile Tyr Asn Val Met Val Gln Cys Trp 355 360 365 Ala His Lys Pro Glu Asp Arg Pro Thr Phe Val Ala Leu Arg Asp Phe 370 375 380 Leu Leu Glu Ala Gln Pro Thr Asp Met Arg Ala Leu Gln Asp Phe Glu 385 390 395 400 Glu Pro Asp Lys Leu His Ile Gln Met Asn Asp Val Ile Thr Val Ile 405 410 415 Glu Gly Arg Ala Glu Asn Tyr Trp Trp Arg Gly Gln Asn Thr Arg Thr 420 425 430 Leu Cys Val Gly Pro Phe Pro Arg Asn Val Val Thr Ser Val Ala Gly 435 440 445 Leu Ser Ala Gln Asp Ile Ser Gln Pro Leu Gln Asn Ser Phe Ile His 450 455 460 Thr Gly His Gly Asp Ser Asp Pro Arg His Cys Trp Gly Phe Pro Asp 465 470 475 480 Arg Ile Asp Glu Leu Tyr Leu Gly Asn Pro Met Asp Pro Pro Asp Leu 485 490 495 Leu Ser Val Glu Leu Ser Thr Ser Arg Pro Pro Gln His Leu Gly Gly 500 505 510 Val Lys Lys Pro Thr Tyr Asp Pro Val Ser Glu Asp Gln Asp Pro Leu 515 520 525 Ser Ser Asp Phe Lys Arg Leu Gly Leu Arg Lys Pro Gly Leu Pro Arg 530 535 540 Gly Leu Trp Leu Ala Lys Pro Ser Ala Arg Val Pro Gly Thr Lys Ala 545 550 555 560 Ser Arg Gly Ser Gly Ala Glu Val Thr Leu Ile Asp Phe Gly Glu Glu 565 570 575 Pro Val Val Pro Ala Leu Arg Pro Cys Pro Pro Ser Leu Ala Gln Leu 580 585 590 Ala Met Asp Ala Cys Ser Leu Leu Asp Glu Thr Pro Pro Gln Ser Pro 595 600 605 Thr Arg Ala Leu Pro Arg Pro Leu His Pro Thr Pro Val Val Asp Trp 610 615 620 Asp Ala Arg Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala Tyr Asp Asp Val Ala Gln 625 630 635 640 Asp Glu Asp Asp Phe Glu Ile Cys Ser Ile Asn Ser Thr Leu Val Gly 645 650 655 Ala Gly Val Pro Ala Gly Pro Ser Gln Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Phe 660 665 670 Val Pro Glu Gln Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Glu Asp Asn Leu Phe 675 680 685 Leu Pro Pro Gln Gly Gly Gly Lys Pro Pro Ser Ser Ala Gln Thr Ala 690 695 700 Glu Ile Phe Gln Ala Leu Gln Gln Glu Cys Met Arg Gln Leu Gln Ala 705 710 715 720 Pro Gly Ser Pro Ala Pro Ser Pro Ser Pro Gly Gly Asp Asp Lys Pro 725 730 735 Gln Val Pro Pro Arg Val Pro Ile Pro Pro Arg Pro Thr Arg Pro His 740 745 750 Val Gln Leu Ser Pro Ala Pro Pro Gly Glu Glu Glu Thr Ser Gln Trp 755 760 765 Pro Gly Pro Ala Ser Pro Pro Arg Val Pro Pro Arg Glu Pro Leu Ser 770 775 780 Pro Gln Gly Ser Arg Thr Pro Ser Pro Leu Val Pro Pro Gly Ser Ser 785 790 795 800 Pro Leu Pro Pro Arg Leu Ser Ser Ser Pro Gly Lys Thr Met Pro Thr 805 810 815 Thr Gln Ser Phe Ala Ser Asp Pro Lys Tyr Ala Thr Pro Gln Val Ile 820 825 830 Gln Ala Pro Gly Ala Gly Gly Pro Cys Ile Leu Pro Ile Val Arg Asp 835 840 845 Gly Lys Lys Val Ser Ser Thr His Tyr Tyr Leu Leu Pro Glu Arg Pro 850 855 860 Ser Tyr Leu Glu Arg Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Glu Ala Gln Ser Pro 865 870 875 880 Glu Glu Pro Thr Pro Leu Pro Val Pro Leu Leu Leu Pro Pro Pro Ser 885 890 895 Thr Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ala Thr Val Arg Pro Met Pro Gln 900 905 910 Ala Ala Leu Asp Pro Lys Ala Asn Phe Ser Thr Asn Asn Ser Asn Pro 915 920 925 Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Arg Ala Thr Ala Arg Leu Pro Gln Arg 930 935 940 Gly Cys Pro Gly Asp Gly Pro Glu Ala Gly Arg Pro Ala Asp Lys Ile 945 950 955 960 Gln Met Ala Met Val His Gly Val Thr Thr Glu Glu Cys Gln Ala Ala 965 970 975 Leu Gln Cys His Gly Trp Ser Val Gln Arg Ala Ala Gln Tyr Leu Lys 980 985 990 Val Glu Gln Leu Phe Gly Leu Gly Leu Arg Pro Arg Gly Glu Cys His 995 1000 1005 Lys Val Leu Glu Met Phe Asp Trp Asn Leu Glu Gln Ala Gly Cys His 1010 1015 1020 Leu Leu Gly Ser Trp Gly Pro Ala His His Lys Arg 1025 1030 1035 <210> 2 <211> 3111 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgcagccag aggagggcac aggctggctg ctggagctgc tgtccgaggt gcagctgcaa 60 cagtacttcc tgcggctccg agatgacctc aacgtcaccc gcctgtccca ctttgagtac 120 gtcaagaatg aggacctgga gaagatcggc atgggtcggc ctggccagcg gcggctgtgg 180 gaggctgtga agaggaggaa ggccttgtgc aaacgcaagt cgtggatgag taaggtgttc 240 agtggaaagc gactggaggc tgagttccca cctcatcact ctcagagcac cttccggaag 300 acctcgcccg cccctggggg cccagcaggg gaggggcccc tgcagagcct cacctgcctc 360 attggggaga aggacctgcg cctcctggag aagctgggtg atggttcctt tggcgtggtg 420 cgcaggggcg agtgggacgc gccctcaggg aagacggtga gtgtggctgt gaagtgcctg 480 aagcccgatg tcctgagcca gccagaagcc atggacgact tcatccggga ggtcaatgcc 540 atgcactcgc tcgaccaccg aaacctcatc cgcctctacg gggtggtgct cacgccgccc 600 atgaagatgg tgacagagct ggcacctctg 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF3beta reverse <400> 12 tgtacgtgtt catgccgttc a 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C_EBP1alpha forward <400> 13 ccttgtgcaa tgtgaatgtg c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C_EBP1alpha reverse <400> 14 cggagagtct cattttggca a 21

Claims

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1) ACK1 유전자를 포함하는 세포를 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)로 형질감염시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 형질감염된 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 피검물질이 처리된 세포에서 HBV 코어 단백질, 표면 단백질, 전사인자 HNF1α, HNF3β 및 C/EBPα로 이루어진 군으로부터 1종 이상의 발현을 확인하는 단계; 및
4) 무처리 대조군과 대비하여, 상기 단계 3)의 HBV 코어 및 표면 단백질 발현 감소; 전사인자 HNF1α 및 C/EBPα 발현 감소; 및 전사인자 HNF3β 발현 증가;로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 결과인 경우, 상기 피검물질을 B형 간염 치료제 후보 물질로 선별하는 단계;를 포함하는 B형 간염 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학법(immunohistochemistry) 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것인, 스크리닝 방법.