CN105497895B - 基于paqr3的降低胆固醇、脂肪合成的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于PAQR3的降低胆固醇、脂肪合成的新方法。具体地，本发明公开了PAQR3参与了胆固醇和脂质的生物合成，PAQR3是一个高尔基体上分布的膜蛋白，通过与SREBP和Scap的结合，把它们锚定在高尔基体，促进SREBP的合成胆固醇和脂质。通过调节PAQR3的活性能够实现对体内胆固醇、脂肪合成的调节。

Description

基于PAQR3的降低胆固醇、脂肪合成的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及基于改变PAQR3功能的降低胆固醇、脂肪合成和减肥的新方法。

背景技术

胆固醇又称为胆甾醇，是存在于动物细胞膜中的一种类固醇物质，以游离胆固醇和胆固醇酯的方式存在于细胞内，在维持细胞膜适当的膜透性和流动性方面发挥着重要的作用。胆固醇的主体由环戊烷多氢菲构成，因此赋予了胆固醇分子较为刚性的结构性质。在主体环的两端分别是一个极性的羟基和一个非极性的碳水化合物链，因此，与其他膜脂成分一样，胆固醇同时含有的极性和非极性的结构使其在磷脂双分子层结构中保持正确的体位。

胆固醇不仅是细胞膜的重要组分，也是体内许多重要物质(如维生素D、胆汁酸、肾上腺激素、性激素等)的合成前体。此外，胆固醇及其氧化固醇同源物还是许多重要生物合成途径中的中间介质，如氧化固醇可以激活某些核受体，某些蛋白质需要胆固醇及其代谢中间产物的共价修饰才以发挥作用。

人体内的胆固醇主要来源于自身合成，食物的补充是次要来源。一个70kg体重的成年人，体内大约有胆固醇100g，其中每天体内从头合成约600-900mg，从食物中吸收约300-500mg。动物组织几乎所有器官都能合成胆固醇，但肝脏和小肠粘膜是胆固醇自身生物合成的主要器官，其合成量大约分别占每日新合成胆固醇的50％和24％。其他组织如肾上腺皮质、脾脏等也可以合成胆固醇。饮食来源的胆固醇主要来自于小肠对胆汁和食物胆固醇的吸收，即小肠吸收水解的游离胆固醇后将其酯化，与载脂蛋白组成乳糜微粒进入淋巴和血液循环系统。饮食来源的胆固醇对质膜胆固醇的含量影响很小。

胆固醇代谢紊乱会导致动脉粥样硬化等一系列心血管疾病的发生。血液中胆固醇浓度过高引起高胆固醇血症，诱发动脉粥样硬化症。而动脉粥样硬化症又是引起冠心病、中风、心肌梗死等心血管疾病的最常见原因。此外，血液脂肪酸和甘油三酯水平过高将会引起高甘油三酯血症，对胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生发挥着一定的促进作用。因此，降低胆固醇成为了预防和治疗代谢性疾病的重要方案之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于PAQR3的降低胆固醇、脂肪合成的新方法。

在本发明的第一方面，提供了一种PAQR3或PAQR3调节剂的用途，用于制备药物或组合物，所述药物或组合物用于选自下组的一种或多种用途：

(1)调节PAQR3与Scap的相互作用；

(2)调节PAQR3与SREBP的相互作用；

(3)调节SREBP或Scap在高尔基体的定位；

(4)调节SREBP和Scap的相互作用；

(5)调节胆固醇和/或脂质的合成；和

(6)预防或治疗体内胆固醇和/或脂质异常所引起的疾病。

在另一优选例中，所述PAQR3调节剂包括PAQR3拮抗剂和PAQR3激动剂。

在另一优选例中，所述PAQR3拮抗剂选自下组：

(a)降低或抑制PAQR3的活性的物质；

(b)降低PAQR3的表达或稳定性的物质；

(c)保留PAQR3与SREBP和Scap中之一的结合功能但与SREBP和Scap中另一者的结合功能丧失或下降的PAQR3的衍生蛋白或片段；和

(d)保留PAQR3与SREBP和Scap中至少一种的结合功能但锚定高尔基体膜功能丧失或下降的PAQR3的衍生蛋白或片段。

在另一优选例中，所述PAQR3激动剂是指具有选自下组功能的物质：

(a)增强PAQR3的活性；和/或

(b)提高PAQR3的表达或稳定性。

另一优选例中，所述PAQR3调节剂选自：抗体、多肽、sh-RNA、dsRNA、miRNA、反义寡核苷酸、化合物或其组合。

在另一优选例中，所述PAQR3拮抗剂选自：抗PAQR3抗体，针对PAQR3的反义寡核苷酸、sh-RNA或dsRNA，PAQR3的化学抑制剂。

在另一优选例中，所述PAQR3拮抗剂为多肽，所述多肽包括SEQ ID NO.:30所示的氨基酸序列，以及任选地穿膜肽序列；优选地，所述穿膜肽序列为(但不限于)：

RKKRRQRRR。

可以用于本发明中的穿膜肽序列可以为其它基于TAT的序列、以及多种其它用于能够穿透细胞膜的多肽序列，如文献“穿膜肽的研究进展”(熊维德等，海峡药学，Vol 20NO.9 2008)中涉及的穿膜肽。

在另一优选例中，所述PAQR3拮抗剂为多肽，所示多肽选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽具有与SREBP的结合能力和/或具有与Scap的结合能力；

(C)将SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SREBP结合能力和/或具有与Scap的结合能力的衍生多肽。

在另一优选例中，含有所述PAQR3拮抗剂的药物用于：

(1)降低或阻断PAQR3与SREBP的相互作用；和/或

(2)降低或阻断PAQR3与Scap的相互作用；和/或

(3)抑制SREBP的激活；和/或

(4)抑制SREBP下游基因的表达；和/或

(5)减少SREBP和/或Scap在高尔基体的定位；和/或

(6)降低或阻断SREBP和Scap的相互作用；和/或

(7)抑制胆固醇和/或脂质的合成；和/或

(8)预防或治疗体内胆固醇和/或脂质升高所引起的疾病。

在另一优选例中，所述“胆固醇和/或脂质升高所引起的疾病”选自：肥胖、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、高甘油三酯血症、心肌梗死和脑卒中。

在另一优选例中，含有所述PAQR3激动剂的药物用于：

(1)增强PAQR3与SREBP的相互作用；和/或

(2)增强PAQR3与Scap的相互作用；和/或

(3)增强SREBP的表达或活性；和/或

(4)增强SREBP下游基因的表达；和/或

(5)增加SREBP和/或Scap在高尔基体的定位；和/或

(6)增强SREBP和Scap的相互作用；和/或

(7)促进胆固醇和/或脂质的合成；和/或

(8)预防或治疗体内胆固醇和/或脂质降低所引起的疾病。

在另一优选例中，所述“胆固醇和/或脂质降低所引起的疾病”选自：脂肪萎缩症和肿瘤恶病质。

在另一优选例中，所述SREBP选自：SREBP-1a,SREBP-1c和SREBP-2。

本发明的第二方面提供了一种分离的复合物，所述复合物为PAQR3或PAQR3衍生物与SREBP或Scap相结合所形成的二元复合物；或者，

所述复合物为PAQR3或PAQR3衍生物与SREBP和Scap相结合所形成的三元复合物。

在另一优选例中，所述复合物的结构如式I所示：

B-A-C 式I

式中,

A为PAQR3或PAQR3衍生物；

B为无、或SREBP；

C为无或Scap，

“-”表示元件A与元件B和/或元件C之间的相互结合的结合力；

且B和C不同时为无。

在另一优选例中，所述复合物为PAQR3、SREBP和Scap相结合所形成的三元复合物。

在另一优选例中，所述复合物的分子量≥100KD；优选地所述复合物的分子量≥150KD。

在另一优选例中，所述复合物的分子量为100KD-350KD；优选地为150KD-300KD。

在另一优选例中，所述PAQR3衍生物包括但不限于：PAQR3蛋白的活性片段、PAQR3蛋白的截短形式。

本发明的第三方面，提供了本发明第二方面所述的复合物的应用，用于筛选药物或化合物，所述药物或化合物促进或抑制所述复合物的形成。

在另一优选例中，当应用所述复合物筛选药物时，所述应用包括步骤：

(a)在测试组中，在待测物质存在下，培养细胞，并且设置无待测物质的对照组；

(b)检测测试组中所述复合物的含量H1并与对照组中的复合物含量H0进行比较，其中当H1显著高于H0，则表示所述测试物为PAQR3的激动剂；当H1显著低于H0，则表示所述测试物为PAQR3的拮抗剂。

本发明的第四方面，提供了一种调节体内胆固醇和/或脂质水平的方法，包括步骤：调节PAQR3的活性、表达水平或PAQR3与SREBP或Scap的相互作用。

在另一优选例中，当需要降低体内胆固醇和/或脂质水平时，执行降低PAQR3的活性或表达水平的步骤；

当需要提高体内胆固醇和/或脂质水平时，执行增强PAQR3的活性或表达水平的步骤。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：给需要的对象施用本发明第二方面所述的复合物的激动剂。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：给需要的对象施用本发明第二方面所述的复合物的抑制剂。

本发明的第五方面，提供了一种蛋白或其调节剂的用途，所述的蛋白选自下组：PAQR3、Scap、SREBP或其组合，并且所述蛋白和/或其调节剂用于制备调控本发明第二方面所述复合物形成的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述的调节剂包括拮抗剂或激动剂。

在另一优选例中，所述“拮抗”指抑制本发明第二方面所述的复合物的形成。

在另一优选例中，所述“激动”指促进本发明第二方面所述的复合物的形成。

在另一优选例中，所述调节剂包括PAQR3的衍生蛋白。

在另一优选例中，所述PAQR3的衍生蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽具有与SREBP的结合能力和/或具有与Scap的结合能力；

(C)将SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SREBP结合能力和/或具有与Scap的结合能力的衍生多肽。

本发明的第六方面，提供了一种药物筛选方法，所述方法包括检测本发明第二方面所述的复合物是否形成的步骤和/或检测本发明第二方面所述的复合物的含量的步骤。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)设置具有待测物质的测试组，并且设置无待测物质的对照组；

(b)检测测试组中所述复合物的含量H1并与对照组中的复合物含量H0进行比较，其中当H1显著高于H0，则表示所述测试物为PAQR3的激动剂；当H1显著低于H0，则表示所述测试物为PAQR3的拮抗剂。

本发明的第七方面，提供了一种治疗或预防体内胆固醇和/或脂质水平异常引起的疾病的方法，包括步骤：调节PAQR3的活性或表达水平。

在另一优选例中，当需要降低体内胆固醇和/或脂质水平时，执行降低PAQR3的活性或表达水平的步骤；

当需要提高体内胆固醇和/或脂质水平时，执行增强PAQR3的活性或表达水平的步骤。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：给需要的对象施用本发明第二方面所述的复合物的激动剂。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：给需要的对象施用本发明第二方面所述的复合物的抑制剂。

在另一优选例中，所述“体内胆固醇和/或脂质水平异常引起的疾病”包括但不限于：肥胖、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、高甘油三酯血症、心肌梗死或脑卒中。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了PAQR3通过调控SREBP的激活来调节胆固醇的自身合成。

图2显示了PAQR3促进SREBP-2和Scap在高尔基体的定位。

图3显示了PAQR3通过不同的结构域与SREBP-2和Scap相互作用，并促进两者的结合。

图4显示了Scap与PAQR3和Insig的结合是相互排斥的，并受细胞内胆固醇水平的调控。

图5显示了PAQR3在饥饿—进食模型中调控SREBP活性。

图6显示了PAQR3在不同胆固醇水平的饮食条件下调控小鼠肝脏SREBP的活性。

图7显示了阻断PAQR3与Scap/SREBP的结合能有效抑制SREBP的激活及胆固醇合成。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现PAQR3参与了胆固醇和脂质的生物合成。当细胞需要合成胆固醇和脂质的时候，SREBP和Scap脱离内质网，进入高尔基体，进而SREBP被切割，释放具有转录活性部分，继而启动细胞内的胆固醇和脂质合成程序。PAQR3是一个高尔基体上分布的膜蛋白，通过与SREBP和Scap的结合，把它们锚定在高尔基体，促进SREBP的合成胆固醇和脂质。

胆固醇的自身合成稳态的分子调控机理

胆固醇的自身合成是从含2个碳原子的乙酰辅酶A开始，经过约25步酶促反应，最终合成含有27个碳原子的胆固醇。每合成一分子胆固醇至少消耗18个ATP和16个NADPH，。其中，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(简称HMGCR)是甲羟戊酸途径中的关键限速酶，催化HMG-CoA向甲羟戊酸的生成反应。值得注意的是，胆固醇并不是甲羟戊酸途径的唯一重要产物，许多中间产物，如泛醌、多萜醇等也都是细胞完成正常代谢所必需的物质。

为了维持胆固醇在细胞膜上的正常浓度，细胞中启用了两个内质网膜蛋白—SREBP切割激活蛋白(SCAP)和HMGCR—来监控胆固醇浓度，进而影响甾醇调节元件结合蛋白(Sterol Regulated Element Binding Protein，简称SREBP)的细胞内定位，激活或抑制固醇合成相关基因的转录，从而改变细胞内胆固醇的合成量，对胆固醇的稳态进行反馈调节。

SREBP是能够调节胆固醇合成所需要的所有基因的膜定位转录因子。哺乳动物细胞中有三种相近的SREBP亚型：SREBP-1a，SREBP-1c和SREBP-2(Brown and Goldstein,1997)。三种SREBP都以发卡状存在于内质网上，其N端转录因子区域和C端的调节区域依靠两段跨膜螺旋和一个朝向内质网腔的短环连接而朝向胞质。位于SREBP-1和SREBP-2N端的DNA结合区域有80％的一致性(Rawson,2003)。三种亚型功能的主要区别在于靶基因偏好的不同，SREBP-1a、-1c主要调控脂肪酸合成途径的基因的表达，SREBP-2主要调控胆固醇合成途径的基因的表达以及低密度脂蛋白受体基因表达(Horton et al.,2002)，但SREBP-1和SREBP-2所调控的基因并不是独立和专属的，而是也有部分交叉(Osborne,2000)。SREBP一经合成便通过其C端调节域与位于SCAP的C端的WD重复域相互作用。

SCAP是位于内质网上的一个跨膜蛋白，由八个跨膜域(TM)和几个亲水环所组成，其中TM2-6构成了SCAP的固醇感知域(Nohturfft et al.,1998)。当固醇缺失时，SCAP/SREBP复合体被由COPII包被的小泡带着从内质网上脱离向高尔基体转运(Espenshade etal.,2002；Nohturfft et al.,2000；Sun et al.,2005)。被SCAP结合并护送的SREBP到达高尔基体后被两个高尔基体膜蛋白丝氨酸蛋白酶S1P(位点1蛋白酶)(Espenshade et al.,1999)和Zn²⁺金属蛋白酶S2P(位点2蛋白酶)(Zelenski et al.,1999)进行顺序剪切，产生有活性的N端转录激活结构域进入细胞核行使转录因子的功能，起始胆固醇和脂肪合成相关基因的转录(Brown and Goldstein,1997；Horton et al.,2002)。当内质网胆固醇重新恢复一定浓度后，胆固醇便可与SCAP结合，导致SCAP发生构象改变与Insig结合，从而使SCAP/SREBP复合体停留在内质网上。

Insig是一个具有六个穿膜螺旋及几个很短的亲水环的内质网定位蛋白(Feramisco et al.,2004)，只有N端和C端一段很短的序列朝向胞质。Insig能与结合了胆固醇的SCAP结合，从而阻止SREBP在高尔基体上剪切形成成熟的入核形式(Adams et al.,2003；Yabe et al.,2002)。

HMGCR也是定位在内质网上的固醇感知蛋白，N端为8次跨膜结构域，C端为具有还原酶活性的调节结构域，是胆固醇生物合成的限速酶(Ravid et al.,2000)。一旦固醇积累，HMGCR便与Insig结合并被泛素化降解，从而帮助终止固醇合成(Gil et al.,1985；Skalnik et al.,1988)。

PAQR3基因

PAQR是孕酮和脂联素受体基因家族(progestin and adipoQ receptorssuperfamily)的缩写。这一家族拥有古老的进化根源，哺乳动物中有11个家族成员，即PAQR1-PAQR11。它们均具有与G蛋白耦联受体(G protein coupled receptors，GPCRs)结构类似的七次跨膜的结构，但N端朝向胞内，C端朝向胞外。

PAQR3又名RKTG(Raf kinase trapping to golgi)，是定位于高尔基体的膜蛋白，含有311个氨基酸，分子量约36kD。PAQR3在进化上相对独立，与其他十个家族成员同源性很低，但在各种属中的氨基酸序列相对保守，在人，小鼠，爪蟾，鸟，斑马鱼，线虫中的序列同源性约65％－75％(Feng et al.,2007；Tang et al.,2005)。PAQR3在人和小鼠的各个组织中都有表达，其中皮肤、肝、肾及睾丸的表达水平较高(Feng et al.,2007；Tang et al.,2005)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述PAQR3的氨基酸序列如下,共311氨基酸残基：

MHQKLLKSAHYIELGSYQYWPVLVPRGIRLYTYEQIPGSLKDNPYITDGYRAYLPSRLCIKSLFILSNETVNIWSHLLGFFLFFTLGIYDMTSVLPSASASREDFVICSICLFCFQVCMLCSVGYHLFSCHRSEKTCRRWMALDYAGISIGILGCYVSGVFYAFYCNNYWRQVYLITVLAMILAVFFAQIHPNYLTQQWQRLRSIIFCSVSGYGVIPTLHWVWLNGGIGAPIVQDFAPRVIVMYMIALLAFLFYISKVPERYFPGQLNYLGSSHQIWHILAVVMLYWWHQSTVYVMQYRHSKPCPDYVSHL(SEQ ID NO.:1)。

目前关于PAQR3功能的研究主要集中在其作为抑癌基因所发挥的功能。本发明中，实验数据表明PAQR3基因敲除小鼠的血清胆固醇含量低于野生型小鼠，在高脂喂养时有显著性的降低，同时低密度脂蛋白和高密度脂蛋白均有显著性降低，这提示PAQR3参与了小鼠体内的胆固醇代谢。

本发明中所述PAQR3的衍生蛋白优选地具有与PAQR3相匹配的氨基酸序列的多肽，包括PAQR3蛋白的截短形式，可以作为PAQR3的调节剂。优选地，所述PAQR3蛋白的截短形式包括SEQ ID NO.:1序列所示的第1-第60个氨基酸，更优选地，包括第6-第55个氨基酸。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述PAQR3蛋白的截短形式的氨基酸序列为：

LKSAHYIELGSYQYWPVLVPRGIRLYTYEQIPGSLKDNPYITDGYRAYLP(SEQ ID NO.:30)，更佳地可以在SEQ ID NO.:30所示氨基酸序列的N端或C端连接穿膜肽序列，构成PAQR3的调节剂。

此外，所述术语“PAQR3的衍生蛋白”还包括具有结合Scap和/或SREBP功能的、SEQID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明作用PAQR3的衍生蛋白还包括其活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与Scap和/或SREBP结合功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)PAQR3蛋白或其衍生蛋白与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

发明还提供PAQR3蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

术语“调节”包括治疗、预防或干扰。

术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的PAQR3、其激动剂或拮抗剂。

术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。

术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的PAQR3或衍生物、其激动剂或拮抗剂的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随PAQR3或其衍生物、其激动剂或拮抗剂的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。

药物组合物和施用方法

本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明PAQR3或衍生物、其激动剂或拮抗剂(活性成分)及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.001-1000mg的活性成分/剂，较佳地0.05-300mg的活性成分/剂，更佳地，含有0.5-200mg的活性成分/剂。

本发明的活性成分及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明的活性成分或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。活性成分的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。

“药理上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如

、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

施用本发明组合物时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。

本发明组合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

含有本发明的组合物的微胶囊可用于本发明的活性成分的缓释给药。重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素(rhGH)、重组人干扰素(rhIFN)、白介素-2和MNrgp120(Johnson et al.,Nat.Med.,2:795-799(1996)；Yasuda,Biomed.Ther 27:1221-1223(1993)；WO 97/03692,WO 96/40072,WO 96/07399；U.S.Pat.No.5654010。

本发明的活性成分的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物(PLGA)制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年(Lewis,“Controlled release of bioactive agents form lactide/glycolide polymer,”in:M.Chasin and R.Langer(Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990),pp.1-41))。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的活性成分适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示了PAQR3与Scap的相互作用；

(2)首次揭示了PAQR3与SREBP的相互作用。

(3)首次揭示了PAQR3影响SREBP或Scap在高尔基体的定位；

(4)首次揭示了PAQR3能够调节SREBP和Scap的结合；

(5)首次揭示了PAQR3能够调节胆固醇和/或脂质的合成；

(6)首次揭示了PAQR3与体内胆固醇和/或脂质的合成相关。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料和方法

1.1实验材料

1.1.1试剂

Protein A/G PLUS-琼脂糖交联珠购自Santa Cruz Biotechnology公司(St.Louis，USA)；mevaStatin、Betaine PCR reagent、蛋白酶抑制剂(Protease inhibitorcocktail)，磷脂酶抑制剂(Phosphatase inhibitor cocktailI/II)、聚乙烯亚胺(polyethylenime，PEI)、25-Hydroxycholesterol、mevalonate为美国Sigma公司(St.Louis，USA)产品；脂质体转染试剂polyjet购自Signagen laboratories(rockville，MD，USA)；Nonidet P-40(NP-40)购自上海生工生物；Cholesterol购自Amresco公司(Solon，OH，USA)；ECL检测试剂购自Pierce公司；蛋白预染Page Ruler Plus Prestained ProteinLadder购自Fermentas公司；琼脂糖购自biowest(gene company，hongkong)；寡聚核苷酸由上海生工公司(Shanghai，China)合成；strip buffer购自上海启动元生物科技有限公司；去脂蛋白血清(LPPS)购自biomedical technologies(stoughton，MA，USA)；SYBR GreenRealtime PCR Master Mix和AMV逆转录酶系统为日本Toyobo公司产品；质粒小量提取试剂盒、PCR胶回收试剂盒为中国天根公司产品；PVDF膜、0.22μm和0.45μm过滤器为美国Millipore公司产品；Ep管和枪头为美国Axygen公司产品；mRNA抽提试剂Trizol购自LifeTechnologies公司(Rockville，USA)；各种DNA内切酶、PCR试剂、T4DNA连接酶、PyrobestDNA聚合酶、LaTaq酶为中国大连TaKaRa公司产品；其余一般药品及试剂购自中国西巴斯试剂公司，为分析试剂纯；一般试验用器具及耗材购自上海实生公司；测序工作由上海桑尼完成；PAQR3短肽由上海吉尔生化有限公司(GL Biochem，shanghai)合成；各规格细胞培养皿、冻存管、离心管购于康宁(Corning)公司；小鼠高糖低脂饲料TD88122为HarLan公司产品。

1.1.2细胞株及细胞培养基

CHO-7细胞是由中国仓鼠卵巢癌来源的细胞系CHO-K1细胞在含去脂蛋白血清的培养基中筛选得到的亚克隆，培养于含5％血清的培养基A(1:1混合的Ham’s F-12medium和Dulbecco’s modified Eagle’s medium，含100U/ml的氨苄青霉素和100μg/ml链霉素)。Huh7是人肝癌细胞系，293T细胞是293细胞派生，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，Hela是人子宫颈癌细胞系，Huh7、Hela和293T均培养于含10％血清的培养基B(Dulbecco’smodified Eagle’s medium，含100U/ml的氨苄青霉素和100μg/ml链霉素)。293A细胞来源于HEK293细胞，具有更好的贴壁性和空斑形成性，该细胞是养在含有10％灭活FBS(经56℃温育30分钟)的培养基B中。所有细胞培养条件均为：95％湿度，5％CO2，37℃。CHO-7细胞、Huh7、293A、293T、Hela均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.1.3菌株与质粒

大肠杆菌DH5α可以购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。质粒pCS2+MT-PAQR3，pEGFP-C1-PAQR3，pBS-hU6-1-shPAQR3-121，pCMV-3xFlag-ATF6以及PAQR3的缺失突变体的构建见参考文献(Feng et al.,2007)。pCMV-Flag-SREBP-2，pTK-Flag-SREBP-1a，pCMV-6Myc-Insig-1，pGL3-Basic-pSRE-Luciferase质粒的构建见参考文献(Tang et al.,2011)。pCS2+MT-SCAP，pCMV-3xFlag-SREBP-1a，pCMV-3xFlag-SREBP-1c，pCMV-3xFlag-Insig-1均按标准分子克隆方法由人cDNA中克隆得到，构建方法可以参考文献(Tang etal.,2011)，并通过测序验证。

1.1.4Q-PCR引物序列

小鼠SREBP信号通路相关基因引物参见参考文献(Tang et al.,2011)。其余引物序列如下：

1.1.5抗体

一抗：anti-Myc(9E10)，Normal Mouse IgG，

anti-S1P(SKI-1，H-300)，anti-SREBP-1(H-160)，anti-SCAP(9D5)，anti-GFP(sc-8334)Antibody购于SantaCruz公司。Golgin-97购于molecular probes公司；anti-SREBP-1(2A4)，anti-SREBP-2(ab72856)，anti-Insig-1购于abcam公司；anti-SREBP-2(10007663)from Cayman公司；anti-GAPDH购自SAB(SignalWay Antibody)公司；anti-S2P(MBTPS2)Antibody购自CellSignaling Technology公司；anti-Flag，anti-calnexin购于Sigma-Aldrich公司。

二抗：goat anti-mouse IgG、goat anti-rabbit IgG购于GE Healthcare；AlexaFluor 488donkey anti-mouse IgG、Alexa Fluor 546goat anti-rabbit IgG购于molecular probes。

1.2实验方法

1.2.1分子生物学常规方法

聚合酶链式反应、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶反应、割胶回收、DNA的乙醇沉淀、连接反应、大肠杆菌转化以及质粒抽提等分子克隆常规操作参考《分子克隆》第二版(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd，ed，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)，及《精编分子生物学实验指南》第三版(Short Protocols in MolecularBiology，3rd，ed，John Wiley&Sons，Inc.，1995)。

1.2.2真核表达质粒的转染

293T、Hela用25KDa聚乙烯亚胺(polyethylenime，PEI)法转染。细胞在转染前12-20h进行传代，密度在转染时达到60％左右。转染前给细胞换液，换成无血清和抗生素的DMEM。转染步骤如下：每1μgDNA质粒加到50μlDMEM中混匀，将已稀释好的PEI转染储液(1μg/ml)与质粒按2:1的比例加入另一管50ul DMEM溶液中混匀，静置5分钟后，将两管分别加入了质粒和PEI的50ul DMEM混在一起，室温静置20min，加入培养皿中。6h以后换新鲜培养基继续培养。CHO-7、Huh-7用ployjet转染试剂。细胞在转染前12-20h进行传代，密度在转染时分别达到90％和60％左右。转染前给细胞换液，换成含2％血清的DMEM。转染步骤如下：每1μgDNA质粒加到50μl DMEM中混匀，将ployjet与质粒按3:1的比例加入另一管50ul DMEM溶液中混匀，静置5分钟后，将含有polyjet的DMEM加入含有质粒的DMEM中，混匀，室温静置20min，加入培养皿中。4h以后换新鲜培养基继续培养或换含有处理试剂的培养基进行培养。

1.2.3蛋白的抽提

贴壁细胞用PBS洗两次，吸净残余的PBS后加入含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液(150mM NaCl，10mM Tris pH7.2，0.1％SDS，1％Triton X-100，1％Deoxycholate，5mMEDTA)，刮下转移到1.5ml的EP管中，于冰上放置20min，其间不时弹动使充分裂解。于4℃以12，000rpm离心5min，取上清，用Bradford法测蛋白浓度；然后加入4×SDS上样缓冲液(200mM Tris-Cl，pH 6.8，8％SDS，0.4％溴酚蓝，40％甘油，400mM DTT)100℃煮5min，立即上样或-20℃储存。动物组织蛋白抽提是将组织从液氮中取出，放入1.5ml RNase-free的EP管，加入300ul含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液，匀浆器匀浆后于4度、12000转离心10min，取上清，用Bradford法测蛋白浓度；然后加入4×SDS上样缓冲液，100℃煮5min，立即上样或-20℃储存。

1.2.4蛋白免疫印记杂交(Western Blot)

根据蛋白不同，选用适合浓度的不连续变性聚丙烯酰氨凝胶进行垂直电泳，一般为8％-12％；开始以8V/cm的电压进行电泳，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到15V/cm继续电泳，直到溴酚蓝到达分离胶的底部(10×电泳液:Tris 30g，Glycine 144g，SDS 10g，加dd H2O到1L)。PVDF膜用甲醇泡15sec，和胶一起放入转膜缓冲液中平衡15min(10×转膜缓冲液:Tris30g，Glycine 144g，甲醇200ml，加水到1L)；然后按着阳极-海绵-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-海绵-阴极的顺序安置好，放入转膜容器中，4℃，300mA，转膜时间根据分子量不同而不同，一般为50-140分钟。转膜结束后取出PVDF膜，标好方向和marker，按需裁减。用5％脱脂牛奶室温封闭1h，TBST洗三次，每次5min(10×TBS：24.2g Tris，80g NaCl，用HCl调pH到7.6；TBST：1×TBS，0.1％Tween-20)。进行一抗反应，抗体配置在1×TBST+3％BSA中，4℃过夜。PVDF膜接下来继续用TBST洗三次，每次10min，进行二抗反应，室温一小时后TBST洗膜三次，每次10min。ECL显色，暗房压片。如需进行新一轮抗体的杂交，将膜浸润在stripbuffer中，室温30min，TBST洗5min，进行脱脂牛奶封闭1h，进行新一轮抗体杂交。

1.2.5蛋白免疫共沉淀

将转染或病毒感染24h的细胞培养皿置于冰上，用冰预冷的PBS小心洗一次，吸干PBS，加入500μl预冷的IP Buffer(50mM Tris-HCl，pH 7.4，300mM NaCl，10％glycerol，3mMEDTA，1mM MgCl2，1％Triton X-100)，并补充以蛋白酶抑制剂cocktail(1:200)。从培养皿刮下细胞到冰预冷的离心管中，冰上放置15-20min，使细胞裂解充分。4℃，12000rpm离心5min，上清移至新管，测蛋白浓度。取1000μg蛋白到新的管子中，加入终浓度5μg/ml一抗，以及Normal Mouse IgG，4℃混匀过夜。另取100μg蛋白到新的管子中，加入SDS loadingbuffer(含50mM DTT)，100℃煮10min，冻于-20℃，此为input。第二天向IP的管子中加入20μl protein A/G，4℃混匀3-4h后，4℃3000rpm离心5min，吸去上清后，用IP Buffer洗3次。最后每20μl beads加20μl 2×SDS loading buffer，及50mM DTT，混匀后煮5min，此为IP样品。两步法免疫共沉淀即将第一次得到的IP样品洗脱后作为第二次IP的实验对象，重复上述免疫共沉淀的方法。

1.2.6RNA抽提与定量、逆转录反应、Q-PCR

贴壁细胞培养于12孔板中，吸去原有培液后先用PBS洗一次；加入500ul Trizol，冰上放置10min，转移到1.5ml RNase-free的EP管中，加入100μl(1:5)氯仿，vortex 15sec，冰上放置5min，于4℃以12，000rpm离心15min；取上清于另一个干净EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后，冰上放置10min以上，于4℃以12，000rpm离心10min；弃上清，用75％乙醇洗沉淀3次，自然干燥后，加入20μl DEPC水，充分溶解RNA后，用nano drop(Thermoscientific)进行浓度测定。取1μg总RNA用于逆转录，应用TOYOBO公司AMV逆转录体系，按照其说明书进行逆转录，得到cDNA用于接下来的PCR检测。动物组织RNA抽提是将组织从液氮中取出，放入1.5ml RNase-free的EP管，加入1ml trizol，匀浆器匀浆后于4度、12000转离心10min，取上清，加入200ul氯仿，后续抽提与逆转录步骤同细胞样品的操作方法。PCR引物序列见材料与方法。荧光定量PCR的操作方法参见TOYOBO Realtime PCR Master Mix说明书。

1.2.7小鼠肝原代细胞的分离及培养

小鼠肝原代细胞采用两步灌流法进行分离。概述如下:8-10周的小鼠通过腹腔注射12％的水合氯醛麻醉后，通过下腔静脉向肝中灌注50ml 37℃灌流液(Krebs Ringer缓冲液加入3.6mg/ml Glucose，1M CaCl2和0.66mg/ml collagenase I)。然后将肝剪下，放入一个加有20ml冷的灌流液的10cm细胞培养皿中，用剪刀将肝剪碎。含有肝原代细胞的灌流液用70μM孔径过滤器过滤，去除大块肝组织。得到的肝原代细胞经过4℃，500×g，离心2分钟后，用冷的DMEM洗1次。然后用DMEM重悬，与等体积的percoll-PBS溶液混匀，4℃，300×g，离心10分钟，去除死细胞。管底的肝细胞即为活细胞，用10％FBS的培养基(含1％青霉素/链霉素)重悬，以3×105个细胞/孔的密度铺到已经用胶原处理过的6孔板中，四小时后换液。

1.2.8脂缺乏培养及补充胆固醇培养方法

脂缺乏培养：给细胞换培养基C(含有5％去脂蛋白脂肪酸的血清、10μMmevaStatin、50μM mevalonate的新鲜培养基A)或培养基D(含有5％去脂蛋白脂肪酸的血清、10μM mevaStatin、50μM mevalonate的新鲜培养基B)，37℃培养16小时。胆固醇及25-HC处理：细胞经过脂缺乏培养后换成含有5％去脂蛋白脂肪酸的血清，10μM mevaStatin、50μMmevalonate，1ug/ml25-HC和/或10ug/ml的新鲜培养基A或B。

1.2.9荧光素酶检测

24孔细胞培养板每孔转染0.02μg的Renilla质粒作为内参，并转染0.2μg SRE-luciferase质粒，12小时后加药刺激，16小时后再行检测，进行荧光素酶的检测，如需。将细胞用PBS洗两次，每孔加入100μl裂解缓冲液，4度，摇30min后，吹吸片刻，取10μl到1.5的EP管中，用kenreal公司的荧光素酶双检测试剂盒测量luciferase和renilla的含量。实验设置为延迟2sec，读数10sec。相除得到标准值，每个样品做三个平行孔，取平均值，Excel统计制图，进行SD检验以及T检验。

1.2.10腺病毒包装和纯化

PAQR3shRNA通过Invitrogen网站设计，序列如下：

forward：

5’-CACCGCTTTCCTGTTCTACATTTCCCGAAGGAAATGTAGAACAGGAAAGC-3’SEQ ID NO.:27；

reverse：

5’-AAAAGCTTTCCTGTTCTACATTTCCTTCGGGAAATGTAGAACAGGAAAGC-3’SEQ ID NO.:28。

重组腺病毒是利用invitrogen公司的BLOCK-iT adenoviral RNAi ExpressionSystem完成的，病毒包装以及初步纯化由本实验室按照操作手册完成，实验用腺病毒由上海吉玛(genepharma)制药技术有限公司扩增纯化，并给出滴度测定数据。

1.2.11腺病毒介导的小鼠肝脏PAQR3基因沉默

将病毒用PBS稀释后按照每只小鼠5×108pfu的感染量对小鼠采用尾静脉注射，注射体积约200ul。10天后进行后续实验处理。

1.2.12实验动物饲养及实验处理

实验动物的饲养和操作均参考上海生科院实验动物管理委员会管理条例。饥饿-再进食实验中，将注射过腺病毒的non-fasting组小鼠不做处理，自由进食和饮水；fast组注射过腺病毒的小鼠禁食24小时(19:00-19:00)，自由饮水；refeeding组注射过腺病毒的小鼠禁食24小时(19:00-19:00)后再进食12小时(19:00-7:00)，自由饮水。Non-fasting组和refeeding组小鼠在7:00处死，fasting组于19:00处死。取小鼠血液及肝脏用于后续实验检测。在喂食不同胆固醇含量的实验中，小鼠均在尾静脉注射腺病毒7天后给予不同的饲料喂养3天，后处死。肽段实验中，连续14天向C57BL/6小鼠腹腔中注射500g/kg对照肽或P6-55，后处死。对照肽和P6-55序列分别为

RKKRRQRRR(SEQ ID NO.:29)；

RKKRRQRRRLKSAHYIELGSYQYWPVLVPRGIRLYTYEQIPGSLKDNPYITDGYRAYLP(SEQ IDNO.:2)。

1.2.13免疫荧光及定量

Hela细胞转染48小时后固定并进行confocal分析(Feng et al.,2007)。在肽段实验中，用20ng/ml的对照肽或P6-55处理已转染的Hela细胞12小时后固定细胞并拍照。每个实验中均数至少300个转染细胞，记下定位于高尔基体的Scap和SREBP的细胞比例。

1.2.14统计学分析

实验数据的分析采用双尾Student’s t-test，所有统计数据均以平均值±标准差表示。“***”表示p<0.001，“**”表示p<0.01，“*”表示p<0.05。

实施例1PAQR3通过调控SREBP的激活来调节胆固醇的自身合成

通过前期研究，本发明人发现PAQR3基因敲除小鼠在高脂喂养16周后，血清胆固醇和低密度脂蛋白含量均显著低于野生型小鼠(图1A)，这提示本发明人PAQR3可能参与了小鼠体内的胆固醇代谢。通过对细胞中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量的检测，本发明人进一步确认了paqr3基因敲减能使肝原代细胞中的总胆固醇和甘油三酯显著降低(图1B)。此外，肝原代细胞中敲减paqr3基因使得胆固醇合成中的关键基因，如3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶[HMGCR]、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶[HMGCS]、低密度脂蛋白受体[LDLR]、鲨烯合酶[squalene synthase]显著降低(图1C)；而在HepG2细胞中过表达PAQR3显著促进了这些基因的表达(图1D)。由于上述基因均受SREBP的调控，本发明人检测了PAQR3对SRE转录活性的影响，发现敲减PAQR3无论在正常培养(control)、脂缺乏培养(LD)还是脂缺乏后补充固醇(LD+25-HC/cholesterol)的培养条件下均能显著降低SRE的转录活性(图1E)，而过表达PAQR3均能促进SRE的转录活性(图1F)。此外，在CHO-7细胞中过表达PAQR3能够梯度依赖地促进SREBP-2的剪切，而不影响胆固醇合成中地其他相关蛋白，如Scap,Insig-1,S1P,S2P的表达(图1G)。同样地，在脂缺乏培养条件下以及脂缺乏后补充固醇的条件下，过表达PAQR3对SREBP-2剪切的促进作用仍然存在(图1H，J)；而在敲除paqr3基因的肝原代细胞中，无论正常培养还是脂缺乏培养，paqr3的敲除均显著抑制了SREBP-2的激活(图1I)。因此，PAQR3能通过影响SREBP-2的活性来参与胆固醇自身合成的调控。

实施例2PAQR3促进SREBP-2和Scap在高尔基体的定位

通过免疫荧光的方法，本发明人发现在Hela细胞中外源过表达的SREBP-2、Scap以及Insig-1均与内质网的标记蛋白calnexin有较好的共定位(图2A，B，D，E，G，H)，但当过表达PAQR3后，SREBP-2和Scap均与高尔基体的标记蛋白GM130有较好的共定位(图2C，F，J)，而Insig-1则仍然定位在内质网上(图2I)。因此，PAQR3能改变SREBP-2和Scap的细胞内定位，使他们定位于高尔基体上。

实施例3PAQR3通过不同的结构域与SREBP-2和Scap相互作用，并促进两者的结合

通过免疫共沉淀的方法本发明人发现，在HEK293T细胞中同时过表达PAQR3和Scap，Scap能将PAQR3免疫共沉淀下来(图3A)；相似地，当同时过表达PAQR3和SREBP-2时，PAQR3能将SREBP-2免疫共沉淀下来(图3B)。值得注意的是，内源的PAQR3也能分别将Scap和SREBP-2免疫共沉淀下来(图3C)。此外，本发明人通过两步法免疫共沉淀实验发现，PAQR3,Scap和SREBP-2能够形成三元复合物(图3D)。

为了研究PAQR3与Scap和SREBP-2的相互作用区域，本发明人构建了一系列PAQR3NH₂端的缺失突变体，通过免疫共沉淀的方法，本发明人发现，PAQR3 NH₂端41-60个氨基酸对于PAQR3与Scap的结合至关重要(图3E，G)，而NH₂端的前20个氨基酸对于PAQR3与SREBP-2的结合是必不可少的(图3F，G)。因此，PAQR3在这个三元复合物中是通过不同的区域与Scap、SREBP-2相互作用的。此外，通过免疫共沉淀实验本发明人发现，过表达PAQR3能促进Scap和SREBP-2的相互作用，并且这种促进作用与PAQR3的表达量成剂量依赖的关系(图3H)。因此，PAQR3不仅能与Scap和SREBP-2相互作用，还能促进两者的结合。

实施例4Scap与PAQR3和Insig的结合是相互排斥的，并受细胞内胆固醇水平的调控

由于Scap即能与PAQR3结合，也能与Insig结合，因此本发明人猜想Scap与两者的结合在调控胆固醇稳态的平衡中发挥着一定的作用。为了证实这种猜想，本发明人首先证实了Scap与PAQR3、Insig的结合是相互排斥的(图4A)。进一步通过免疫共沉淀实验，本发明人发现随着PAQR3过表达剂量的增加，Insig与Scap的相互作用逐渐减弱(图4B)；相似地，随着Insig过表达剂量的增加，PAQR3与Scap的相互作用逐渐减弱(图4C)。这提示本发明人PAQR3能与Insig相互排斥的竞争结合Scap，从而影响SREBP的激活状态，这一假设也通过进一步的实验得到了验证，即SREBP的激活程度是由Insig与PAQR3的相对量而决定的(图4D)。

为了进一步探讨这种结合方式的意义，本发明人改变了细胞内胆固醇水平，发现随着细胞内胆固醇缺乏程度的增强，Scap与Insig结合逐渐减弱，与PAQR3结合逐渐增强；而随着胆固醇水平恢复时间的延长，Scap与Insig结合又逐渐增强，与PAQR3结合逐渐减弱(图4E)。因此，在细胞内胆固醇水平较低时自身合成启动，PAQR3在此时对于调控细胞内胆固醇的稳态发挥着重要的作用。综上所述，如图4F中所示，在胆固醇水平较低时，Insig与Scap/SREBP-2复合体分离并被降解，Scap/SREBP-2复合体由内质网转运至高尔基体，被PAQR3锚定在高尔基体上，SREBP被高尔基体上的蛋白酶分解激活，起始胆固醇合成。而当细胞内胆固醇浓度较高时，Scap/SREBP复合体与Insig结合并被锚定在内质网上，SREBP激活受到抑制。在此过程中Insig与PAQR3表达量的变化也进一步促进了这一调控的发生。

实施例5PAQR3在饥饿—进食模型中调控SREBP活性

前面的实验在细胞水平证实了PAQR3在调控SREBP活性中的功能，然而其在生理水平的功能还有待探索。为了进一步验证PAQR3基因在体内的生理功能，本发明人引入了饥饿-再进食模型，通过尾静脉注射腺病毒敲减肝脏原代细胞中的paqr3，检测肝脏特异性敲减paqr3对饥饿-再进食过程中发挥的作用。结果显示，在病毒敲减效率达到50％以上(图5C)的情况下，肝脏中敲减paqr3明显的降低了饥饿后再进食引起的SREBP的overshot(图5A)。并且小鼠肝脏中总胆固醇和甘油三酯在未饥饿、饥饿和再进食时均有不同程度的降低(图5B)。同时，肝脏中paqr3表达降低使得肝脏中与胆固醇合成与摄取相关的重要基因HMGCR、HMGCS、LDLR、SS；与脂肪酸、甘油三酯合成相关的重要基因乙酰辅酶A羧化酶[ACC]、硬脂酰CoA脱氢酶-1[SCD-1]、脂肪酸合酶[FAS]、ATP-柠檬酸裂解酶[ACLY]、甘油-3-磷酸乙酰转移酶[GPAT]；以及SREBP信号通路中的重要基因SREBP-2、SREBP-1c、Insig-1均在未饥饿(Non-Fast，NF)和饥饿后再进食(Refeed，R)时较对照组有显著降低。作为实验对照，Scap，IRS2，ApoE，PEPCK基因的表达并没有受paqr3基因敲减的影响。综上所述，PAQR3基因在饥饿－再进食情况下能够调控SREBP的活性及其下游基因的表达。

实施例6PAQR3在不同胆固醇水平的饮食条件下调控小鼠肝脏SREBP的活性

由于饮食和自身合成是哺乳动物获得胆固醇的两大方式，本发明人在不同胆固醇含量的饮食条件下检测了PAQR3对肝脏脂合成的影响。在给肝脏敲减paqr3基因的小鼠喂食不含胆固醇的饲料3天后，肝脏中全长形式的SREBP(P-SREBP)和入核形式的SREBP(N-SREBP)均较对照组由明显下降(图6A)。与蛋白变化一致，SREBP的下游基因HMGCR,HMGCS,LDLR,FDPS,SS,ACC,FAS,SCD-1,GPAT也均在敲减paqr3基因后较对照组显著下降(图6B)。此外，SREBP信号通路中的基因，如SREBP-1a,SREBP-1c,SREBP-2,Insig-1在敲减paqr3后也显著下降，但Scap没有变化(图6B)。敲减paqr3基因后，肝脏中总胆固醇和甘油三酯较对照组有显著下降(图6C)。

在给小鼠喂养胆固醇含量逐渐增加(正常饲料分别添加0.02％，0.2％，2％胆固醇)的饲料后，本发明人发现在低胆固醇饮食时，敲减paqr3能够导致相对更为明显的SREBP激活减弱；而在高胆固醇饮食下，paqr3敲减导致的SREBP激活差异相对减弱(图6D)。与蛋白变化一致，敲减paqr3导致SREBP下游基因在低胆固醇喂养下显著降低，而在高胆固醇喂养时这种差异明显减弱(图6E)。因此，PAQR3主要在胆固醇浓度较低时发挥其调控胆固醇合成的作用。

实施例7阻断PAQR3与Scap/SREBP的结合能有效抑制SREBP的激活及胆固醇合成

通过前面的研究，本发明人证实了PAQR3能够通过将Scap/SREBP锚定在高尔基体上从而调控SREBP信号通路及胆固醇的合成。为了进一步证实这一观点，本发明人合成了一段短肽P6-55，这段短肽由PAQR3NH₂端第6至55个氨基酸组成，同时包含了PAQR3与SREBP和Scap的结合区域，但并不包含将PAQR3锚定于高尔基体上的七次跨膜结构(图3G)，并在这段短肽的NH₂端加入了TAT序列以增加其细胞膜穿透性。通过免疫共沉淀的方法本发明人发现，P6-55能剂量依赖地阻断PAQR3与Scap的相互作用(图7A)；同样地，P6-55也能剂量依赖地阻断PAQR3与SREBP-2的相互作用(图7B)。此外，在CHO-7细胞中，无论在正常培养还是在脂缺乏培养时，P6-55均能抑制SREBP的激活，但是对SREBP信号通路中的其他重要蛋白(如Scap,S1P,S2P,Insig-1)的表达均无影响(图7C)。除了抑制SREBP的激活，P6-55还能抑制SREBP下游基因的表达，如HMGCR,HMGCS,LDLR,ACC，FAS(图7D)。通过对Scap和SREBP亚细胞定位的分析，本发明人发现P6-55能使PAQR3过表达所导致的Scap和SREBP在高尔基体的定位显著减少(图7E，F)。

最后，本发明人分析了P6-55在小鼠体内的生理功能。通过连续14天向C57BL/6小鼠腹腔中注射500g/kg对照肽或P6-55，本发明人发现P6-55能显著抑制小鼠肝脏中SREBP蛋白的激活(图7G)，肝脏中SREBP下游基因的表达(图7H)，以及肝脏总胆固醇和甘油三酯的含量(图7I)。综上所述，无论在体内还是体外，阻断PAQR3与Scap/SREBP的结合均能有效抑制肝脏中SREBP的激活及脂类合成。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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Claims (6)

1.一种PAQR3拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备药物或组合物，所述药物或组合物用于(A)抑制胆固醇和/或脂质的合成；和/或(B)预防或治疗体内胆固醇和/或脂质升高所引起的疾病

并且所述PAQR3拮抗剂为多肽，所述多肽为SEQ ID NO.:30所示的氨基酸序列的多肽或由穿膜肽序列和SEQ ID NO.:30所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述穿膜肽序列为：

RKKRRQRRR。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PAQR3拮抗剂为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述“胆固醇和/或脂质升高所引起的疾病”选自：肥胖、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、高甘油三酯血症、心肌梗死和脑卒中。

5.一种复合物的应用，其特征在于，用于筛选抑制胆固醇合成的PAQR3拮抗剂药物或化合物，所述复合物为PAQR3与SREBP-2和Scap相结合所形成的三元复合物，当应用所述复合物筛选药物或化合物时，所述应用包括步骤：

(a) 在测试组中，在待测物质存在下，培养细胞，并且设置无待测物质的对照组；

(b) 检测测试组中所述复合物的含量H1并与对照组中的复合物含量H0进行比较，其中当H1显著低于H0，则表示所述测试物为PAQR3的拮抗剂。

6.一种抑制胆固醇合成的PAQR3拮抗剂药物筛选方法，其特征在于，所述复合物为PAQR3与SREBP-2和Scap相结合所形成的三元复合物，所述方法包括步骤：

(a) 在测试组中，在待测物质存在下，培养细胞，并且设置无待测物质的对照组；

(b) 检测测试组中所述复合物的含量H1并与对照组中的复合物含量H0进行比较，其中当H1显著低于H0，则表示所述测试物为PAQR3的拮抗剂。

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