CN106053863B - 一种检测胆固醇平衡状况的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测胆固醇平衡状况的方法，该方法为根据公式：胆固醇平衡得分=

Description

一种检测胆固醇平衡状况的方法
技术领域
本发明涉及用于测量生物医学数据的方法，具体涉及一种检测胆固醇平衡状况的方法。
背景技术
血浆中胆固醇的存在和运输形式为血浆脂蛋白，即血浆中非极性的脂类包括胆固醇和亲水性的载脂蛋白结合，使得脂蛋白有较强的水溶性可以在血中运输。已知血液、血浆或血清中的总胆固醇水平是指示冠状动脉硬化风险的一类生物医学数据。流行病学和临床研究表明，低密度脂蛋白胆固醇水平与动脉硬化类疾病冠心病的发生率成正相关，高密度脂蛋白胆固醇与动脉硬化类疾病冠心病的发生率成负相关，即具有抗动脉硬化活性。因此高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C是当前临床实验室血脂测定中最有价值的心脑血管疾病的危险因素指标。
胆固醇的检测在健康体检中具有重要的指导作用，特别是在心血管健康的重要健康度量。市场上迫切希望具有准确检测血浆胆固醇平衡的方法，可以对病患的状况进行快速准确地检测，并对病患的健康要检测带来更好的结果和分析。人体胆固醇代谢和血脂异常与心脑血管疾病密切相关。胆固醇代谢由从胃肠道中吸收和体内合成两个途径组成。每个人的代谢途径以哪一个为主都可能有所不同，有的人吸收增多为主，而有的是以体内合成为主。准确了解每个人的胆固醇代谢途径情况，可以制定出个体化精准治疗高胆固醇血症方案。
目前测定胆固醇的方法很多，包括试纸法、超离心法、色谱法、电泳法和沉淀法等。试纸法采用含有合适的反应试剂的测试条测量胆固醇水平；大部分测量条包含试剂的多个垫堆叠在上方覆盖物和下方支持物之间，设计这种堆叠结构以使样品垂直流动，在这一点，上下层之间的接触表面的平滑度以及垫的厚度决定了血液的流速和必需量，特别在包含干试剂的干生物化学试条的情况下，较多数量的垫或较厚的垫引起测量误差增大。超离心法可作为基本的定量法使用，它使用超速离心机进行分离，根据比重的差别分离LDL或HDL，进而测定其中的胆固醇含量；而后来发展的电泳法以醋酸纤维膜或琼脂糖凝胶等做载体分离，然后根据酶法测定胆固醇含量；在沉淀法中，沉淀剂凝结除高密度脂蛋白以外的脂蛋白，凝结的脂蛋白通过离心分离沉淀，根据酶反应测定上清即高密度脂蛋白胆固醇的含量；测定低密度脂蛋白胆固醇的第一代化学沉淀法，采用PVS和PEGME沉淀LDL，用离心分离法收集沉淀物，然后根据酶反应测定其中的胆固醇含量；以上方法均存在较大误差，且操作复杂，，难于自动化，从而无法在临床实验室开展。
国外有关固醇类物质的分析方法有同位素稀释质谱法、电化学分析法、高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱(GC-MS)联用法、液相色谱-质谱(LC-MS)联用法等。由于以上非胆固醇类固醇与胆固醇结构相似，化学性质相近，且血浆内含量较低，一般方法难于分离检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测胆固醇平衡状况的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种检测胆固醇平衡状况的方法，根据公式： 计算出样品胆固醇平衡得分；
当胆固醇平衡得分＞0.9，说明胆固醇合成过量；
当胆固醇平衡得分在0.6～0.9之间，说明胆固醇代谢状况正常；
当胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3，说明胆固醇吸收过量；
上述7-烯胆甾醇比值＝Clathosterol/TC，即7-烯胆甾醇比值等于7-烯胆甾醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，7-烯胆甾醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述链甾醇比值＝Cdesmosterol/TC；即链甾醇比值等于链甾醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，链甾醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述菜油固醇比值＝Ccampesterol/TC；即菜油固醇比值等于菜油固醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，菜油固醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述β-谷固醇比值＝Csitosterol/TC；即β-谷固醇比值等于β-谷固醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，β-谷固醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
一种检测胆固醇平衡状况的方法，包括以下步骤：
一、溶液的配制
1)对照品溶液的制备：配制7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的标准溶液；
2)内标溶液的制备：配制浓度已知的5α-胆甾烷溶液作为内标溶液；
3)氢氧化钾乙醇水溶液的制备；
二、样品中固醇类物质的定性定量分析
1)血浆样品前处理：
将血浆加入5α-胆甾烷内标溶液，再加入氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，加塞密封，置水浴中皂化；皂化后溶液冷却至室温，加入正己烷，涡旋混匀，离心，将上清液正己烷层取出；下层再加入正己烷，涡旋混匀后离心，取出上清液合并，在N2下吹干；残渣中加入衍生化试剂BSTFA-TMCS，置60～80℃烘箱中进行衍生化反应，衍生化反应后直接取样品进样分析；
2)气相色谱-质谱联用法定性定量分析：
将上步前处理后的样品用气相色谱-质谱联用仪进行全扫描分析，通过标准对照品溶液保留时间对待测样品中各组分进行定性，得到样品的全扫描色谱图，同时采用选择离子监测SIM内标法定量，得到样品的选择离子监测图，从而实现同时测定待测血浆中4种非胆固醇类固醇：7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的含量；
3)标准曲线的制作：分别制作链甾醇、7-烯胆甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的标准曲线；
4)根据标准曲线分别计算出样品中链甾醇、7-烯胆甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的浓度；
三、胆固醇平衡状况分析
根据公式：计算出样品胆固醇平衡得分；
当胆固醇平衡得分＞0.9，说明胆固醇合成过量；
当胆固醇平衡得分在0.6～0.9之间，说明胆固醇代谢状况正常；
当胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3，说明胆固醇吸收过量；
上述7-烯胆甾醇比值＝Clathosterol/TC，即7-烯胆甾醇比值等于7-烯胆甾醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，7-烯胆甾醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述链甾醇比值＝Cdesmosterol/TC；即链甾醇比值等于链甾醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，链甾醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述菜油固醇比值＝Ccampesterol/TC；即菜油固醇比值等于菜油固醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，菜油固醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述β-谷固醇比值＝Csitosterol/TC；即β-谷固醇比值等于β-谷固醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，β-谷固醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
进一步的，上述对照品溶液中的溶剂为正己烷。
进一步的，上述内标溶液的溶剂为正己烷。
进一步的，上述氢氧化钾乙醇水溶液中氢氧化钾的浓度为1mol·L-1，乙醇浓度为90％v/v。
进一步的，上述血浆样品前处理的具体操作为：每100μL血浆加入10μL 5α-胆甾烷内标溶液，再加入氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，加塞密封，置水浴中皂化；皂化后溶液冷却至室温，加入3mL正己烷，涡旋混匀，离心，将上清液正己烷层取出；下层再加入3mL正己烷，涡旋混匀后离心，取出上清液合并，在N2下吹干；残渣中加入衍生化试剂BSTFA-TMCS，置60～80℃烘箱中进行衍生化反应，衍生化反应后直接取样品进样分析。
进一步的，上述气相色谱-质谱联用法所使用的色谱条件为：
进一步的，步骤2)所述选择离子监测SIM在运行过程中各物质选择的定性离子与定量离子的信息为：
5α-胆甾烷选择的定性离子的质荷比为217m/z，232m/z，357m/z，372m/z；
定量离子的质荷比为217m/z；
链甾醇选择的定性离子的质荷比为351m/z，343m/z，327m/z，456m/z；定
量离子的质荷比为343m/z；
7-烯胆甾醇选择的定性离子的质荷比为255m/z，353m/z，443m/z，458m/z；
定量离子的质荷比为255m/z；
菜油固醇选择的定性离子的质荷比为129m/z，343m/z，382m/z，472m/z；
定量离子的质荷比为343m/z；
β-谷固醇选择的定性离子的质荷比为129m/z，357m/z，396m/z，486m/z；
定量离子的质荷比为357m/z。
一种检测4种类固醇浓度的方法，包括以下步骤：
一、溶液的配制
1)对照品溶液的制备：配制7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的标准溶液；
2)内标溶液的制备：配制浓度已知的5α-胆甾烷溶液作为内标溶液；
3)氢氧化钾乙醇水溶液的制备；
二、样品中固醇类物质的定性定量分析
1)血浆样品前处理：
将血浆加入5α-胆甾烷内标溶液，再加入氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，加塞密封，置水浴中皂化；皂化后溶液冷却至室温，加入正己烷，涡旋混匀，离心，将上清液正己烷层取出；下层再加入正己烷，涡旋混匀后离心，取出上清液合并，在N2下吹干；残渣中加入衍生化试剂BSTFA-TMCS，置60～80℃烘箱中进行衍生化反应，衍生化反应后直接取样品进样分析；
2)气相色谱-质谱联用法定性定量分析：
将上步前处理后的样品用气相色谱-质谱联用仪进行全扫描分析，通过标准对照品溶液保留时间对待测样品中各组分进行定性，得到样品的全扫描色谱图，同时采用选择离子监测SIM内标法定量，得到样品的选择离子监测图，从而实现同时测定待测血浆中4种非胆固醇类固醇：7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的含量；
3)标准曲线的制作：分别制作链甾醇、7-烯胆甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的标准曲线；
4)根据标准曲线分别计算出样品中链甾醇、7-烯胆甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的浓度，即可；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
本发明的有益效果是：
本发明方法测定人血浆中4种非胆固醇类固醇含量，能使样品在较短时间内得到较好的分离，且具有良好的精密度、准确度和溶液稳定性，适用于大规模研究和检测试验研究中胆固醇的吸收和合成变化，为个体化治疗临床诊断提供依据。
本发明检测方法灵敏度高，特异性强，已成为目前同时定量几种固醇类物质的最好方法之一。
附图说明
图1为链甾醇的标准曲线图；
图2为7-烯胆甾醇的标准曲线图；
图3为菜油固醇的标准曲线图；
图4为β-谷固醇的标准曲线图；
图5为血浆、混合标准溶液和加标血浆中各非胆固醇类固醇的全扫描色谱图，其中A为健康人血浆，B为表1中4号对照品溶液(混合标准溶液)，C为血浆+表1中4号对照品溶液(加标血浆)；其中峰1表示5α-胆甾醇(IS)；峰2表示链甾醇；峰3表示7-烯胆甾醇；峰4表示菜油固醇；峰5表示β-谷固醇；
图6为血浆、混合标准溶液和加标血浆中各非胆固醇类固醇的SIM色谱图；其中A'为健康人血浆，B'为表1中4号对照品溶液(混合标准溶液)，C'为血浆+表1中4号对照品溶液(加标血浆)；其中峰1表示5α-胆甾醇(IS)；峰2表示链甾醇；峰3表示7-烯胆甾醇；峰4表示菜油固醇；峰5表示β-谷固醇。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1一种检测胆固醇平衡状况的方法
一、溶液的配制
1)对照品溶液的制备
分别精密称取7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇对照品，以正己烷为溶剂配成11.00、6.70、18.00、33.00mg·L-1溶液，作储备液用。分别取储备液加正己烷稀释配制成混合对照溶液最高质量浓度7号，每份含4种待测物质，再依次逐级稀释。具体质量浓度见下表。
表1不同稀释倍数后各组对照品中的7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的浓度
2)内标溶液的制备
精密称取0.0125g的5α-胆甾烷于25mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，制成内标对照溶液，置4℃冰箱备用。
3)氢氧化钾乙醇溶液的制备
称取5.6g氢氧化钾，溶解于10mL超纯水中，冷至室温后用无水乙醇稀释至100mL，配制成1mol·L-1的氢氧化钾乙醇溶液，置4℃冰箱备用。
二、样品中固醇类物质的定性定量分析
1)血浆样品前处理
取100μL待测血浆样品或配制好的对照品溶液置于10mL离心管中，加入10μL 5α-胆甾烷内标溶液，再加入氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，加塞密封，置水浴中皂化；皂化后溶液冷却至室温，加入3mL正己烷，涡旋混匀离心，将上清液(正己烷层)转移至10mL离心管中；下层再加入3mL正己烷，涡旋混匀后离心，取出上清液合并，在N2下吹干；残渣中加入衍生化试剂BSTFA-TMCS，置60～80℃烘箱中进行衍生化反应。衍生化反应后直接取样品进样分析。
2)气相色谱-质谱联用法(GC-MS)定性定量分析
将上步前处理后的样品(1μL)用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行全扫描(Scan)分析，通过标准对照品溶液保留时间对待测样品中各组分进行定性，得到样品的GC-MS全扫描色谱图。同时采用选择离子监测(SIM)内标法定量，得到样品的选择离子监测(SIM)图。从而实现同时测定待测血浆中4种非胆固醇类固醇(7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇)含量。
上述气相色谱-质谱联用法所使用的色谱条件如表2所示。
表2色谱条件
上述选择离子监测(SIM)扫描过程中选择特征离子(即定性离子)与定量离子的信息如表3所示。
表3扫描过程中选择特征离子(定性离子)与定量离子的信息
物质 定性离子的质荷比/(m/z) 定量离子的质荷比/(m/z)
5α-胆甾烷 217，232，357，372 217
链甾醇 351，343，327，456 343
7-烯胆甾醇 255，353，443，458 255
菜油固醇 129，343，382，472 343
β-谷固醇 129，357，396，486 357
3)标准曲线的制作
另外，分别取表1中1～7号标准溶液100μL至10mL离心管中，除不加血浆外其余按上述“血浆样品前处理”和“气相色谱-质谱联用法定性定量分析”的方法进行操作，以目标化合物定量离子与内标定量离子面积比(x)对化合物浓度(y)进行线性回归，计算各物质的标准曲线，进行定量测定。
其中链甾醇的标准曲线公式为y＝380.5x+0.1639，R2＝0.9992，其标准曲线图如图1所示；7-烯胆甾醇的标准曲线公式为y＝89.384x+0.1064，R2＝0.9995，其标准曲线图如图2所示；菜油固醇的标准曲线公式为y＝246.63x+0.0014，R2＝0.9994，其标准曲线图如图3所示；β-谷固醇的标准曲线公式为y＝757.81x+0.0856，R2＝0.9993，其标准曲线图如图4所示。
三、胆固醇平衡状况分析
一种可以很好评估人体内胆固醇合成、吸收和代谢水平的公式：
其中，7-烯胆甾醇(Lathosterol)比值＝Clathosterol/TC(比值单位为：μmol×100/mmol)，即7-烯胆甾醇比值为7-烯胆甾醇浓度(μM)值/总胆固醇浓度(mM)值的比值再乘以100；
链甾醇(Desmosterol)比值＝Cdesmosterol/TC(比值单位为：μmol×100/mmol)；即链甾醇比值为链甾醇浓度(μM)值/总胆固醇浓度(mM)值的比值再乘以100。
菜油固醇(Campesterol)比值＝Ccampesterol/TC(比值单位为：μmol×100/mmol)；即菜油固醇比值为菜油固醇浓度(μM)值/总胆固醇浓度(mM)值的比值再乘以100。
β-谷固醇(Sitosterol)比值＝Csitosterol/TC(比值单位为：μmol×100/mmol)；即β-谷固醇比值为β-谷固醇浓度(μM)值/总胆固醇浓度(mM)值的比值再乘以100。
当胆固醇平衡得分＞0.9，说明人体胆固醇合成过量，在用药方面，建议以他汀类药物进行治疗；
当胆固醇平衡得分在0.6～0.9之间，说明人体胆固醇代谢状况正常；
当胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3，说明人体胆固醇吸收过量，建议以依折麦布为主要药物进行治疗。
实施例2一种检测胆固醇平衡状况的方法
一、溶液的配制
同实施例1所述。
二、样品中固醇类物质的定性定量分析
1)血浆样品前处理
100μL健康人血浆(A组-血浆)和100μL表1中4号对照品溶液(B组-混合标准溶液)这2组样品直接进行下面的操作；C组为加标血浆，即100μL健康人血浆在处理前先加入100μL表1中4号对照品溶液(C组-加标血浆)，然后进行下面的操作。
分别将上述三组溶液置于10mL离心管中，加入10μL 5α-胆甾烷内标溶液，再加入1mL 1mol·L-1氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，加塞密封，置60℃水浴中皂化1h；皂化后溶液冷却至室温，加入3mL正己烷，涡旋混匀，离心，将上清液(正己烷层)转移至10mL离心管中；下层水相中再加入3mL正己烷，涡旋混匀后离心，取出上清液合并，在40℃下N2吹干；残渣中加入衍生化试剂(BSTFA-TMCS＝99∶1)100μL，置60～80℃烘箱中反应1h。衍生化反应后直接取样品1μL进样分析。
2)气相色谱-质谱联用法(GC-MS)定性定量分析
将上步前处理后的3组样品(1μL)用气相色谱-质谱进行全扫描(Scan)分析，通过标准对照品溶液保留时间对待测样品中各组分进行定性，得到样品的GC-MS全扫描色谱图。同时采用选择离子监测(SIM)内标法定量，得到样品的选择离子监测(SIM)图。从而实现同时测定待测血浆中4种非胆固醇类固醇(7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇)含量。气相色谱-质谱联用法中相应条件参数据的设置均同实施例1。
气相色谱-质谱联用法(GC-MS)定性定量分析的结果如图5和图6所示。从中可以看出4种非胆固醇类固醇峰能基线分离，峰型良好，说明了本方法对4种待测样品的检测有良好的分离度和良好效能。本发明根据硅烷化后各固醇类物质和内标的质谱测定结果，选择其特征离子作为监测离子，选择丰度较大，特征性较强的离子作为定量离子，排除了背景干扰。
上述3组样品中4种非胆固醇类固醇的浓度检测结果如表4所示。从中可以看出，本发明方法可以很准确地测出样品中7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的浓度；从C组的加标血浆的浓度测定结果中可以看出，在血浆中加入标准溶液后并不影响血浆中7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇浓度的测定，说明本发明方法具有很好的准备性和可应用性。
表4不同样品中4种非胆固醇类固醇的浓度检测结果
实施例3一种检测胆固醇平衡状况的方法(临床样品)
按照实施例1所述的方法，对71份临床血浆样品进行检测，检测出血浆样品中4种非胆固醇类固醇：7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的浓度(μM)(如表5所示)，根据该浓度与血浆样品总胆固醇浓度值(mM)分别计算出7-烯胆甾醇比值、链甾醇比值、菜油固醇比值、β-谷固醇比值(如表5所示)，最后根据实施例1“三”中的公式 计算出各临床血浆样品的胆固醇平衡得分，根据平衡得分得出各临床血浆样品的胆固醇平衡状况(如表5所示)。
表5本发明方法对临床样品胆固醇平衡状况的检测结果
根据表5中的对各临床样品胆固醇平衡状况的评价，指导建议胆固醇平衡不正常患者的用药，即当胆固醇平衡得分＞0.9，说明人体胆固醇合成过量，在用药方面，建议以他汀类药物进行治疗；当胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3，说明人体胆固醇吸收过量，建议以依折麦布为主要药物进行治疗。表5中胆固醇平衡不正常的患者按照该指导用药治疗4周后，再检测各患者的胆固醇平衡状况，并统计数量(如表6所示)。
表6按本发明检测结果的指导进行用药治疗后的疗效
检测结果如表6所示，从中可以看出，胆固醇水平正常的样品数从25份增加到了41份，其中，胆固醇合成过量的样品数从16份降低至7份，并且该7份样品胆固醇合成过量程度相比治疗前得到明显改善；胆固醇吸收过量的样品数从30份降低至23份，并且该23份样品胆固醇吸收过量程度相比治疗前得到明显改善。上述结果说明，本发明胆固醇代谢检测指标具有很好的准确性和用药指导性。
下面对本发明方法作进一步的效果检测。
一、溶液稳定性试验
取同一个体的血浆100μL，按上述方法，配制2份，最终待测溶液混合均匀后，重新分装成3份，用封口膜密封，于4～10℃冰箱中保存，于0天、5天取出，放冷至室温，按上述方法测定样品含量。
表7溶液稳定性试验结果
浓度(μg/mL) 0天 5天
链甾醇 1.602 1.627
7-烯胆甾醇 1.522 1.509
菜油固醇 7.369 7.263
β-谷固醇 4.747 4.658
结论：从表7中可以看出，本方法处理的待测溶液，在4～10℃保存条件下，具有良好的溶液稳定性。
二、日间精密度试验
取3个不同个体的血浆，连续3天，每天各取血浆100μL，按上述方法处理，测定样品含量，计算各组分的相对标准偏差(RSD)，考察本方法的日间精密度。
表8日间精密度试验结果
结论：从表8中可以看出，按本方法连续3天处理的样品，各组分含量的RSD值均＜15％，可见本方法的日间精密度良好。
三、日内精密度试验
取同一个体的血浆，取血浆100μL，按上述方法，平行处理3份，每份样品连续测定3次，计算各组分的相对标准偏差(RSD)，考察本方法的日内精密度。
表9日内精密度试验结果
结论：从表9中可以看出，按本方法在同一天内，同一个体血浆，配制3份，每份测定3次，各组分含量的RSD值均＜15％，可见本方法的日内精密度良好。
四、回收率试验
取表1中2～7号对照品溶液100μL，分别加入人血浆100μL，混匀作为供试品溶液(见表10中的1#～12#供试品溶液)，按上述实施例1的方法处理并配制成最终待测溶液，作为加样回收试验溶液。另取人血浆100μL，同法同步处理，作为空白试验溶液。计算扣除空白后的加样回收试验溶液的含量，并得到回收率。
表10回收率试验结果
结论：按本方法进行加样回收试验，平均回收率均约为110％，可见本方法具有较好的回收率。
综合上述方法及实验数据，可以判定，本发明方法测定人血浆中4种非胆固醇类固醇含量，能使样品在较短时间内得到较好的分离，且具有良好的精密度、准确度和溶液稳定性，适用于大规模研究和检测试验研究中胆固醇的吸收和合成变化，为个体化治疗临床诊断提供依据。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测胆固醇平衡状况的方法，其特征在于：根据公式： 计算出样品胆固醇平衡得分；
当胆固醇平衡得分＞0.9，说明胆固醇合成过量；
当胆固醇平衡得分在0.6～0.9之间，说明胆固醇代谢状况正常；
当胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3，说明胆固醇吸收过量；
上述7-烯胆甾醇比值＝Clathosterol/TC，即7-烯胆甾醇比值等于7-烯胆甾醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，7-烯胆甾醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述链甾醇比值＝Cdesmosterol/TC；即链甾醇比值等于链甾醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，链甾醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述菜油固醇比值＝Ccampesterol/TC；即菜油固醇比值等于菜油固醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，菜油固醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述β-谷固醇比值＝Csitosterol/TC；即β-谷固醇比值等于β-谷固醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，β-谷固醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
2.一种检测胆固醇平衡状况的方法，其特征在于：包括以下步骤：
一、溶液的配制
1)对照品溶液的制备：配制7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的标准溶液；
2)内标溶液的制备：配制浓度已知的5α-胆甾烷溶液作为内标溶液；
3)氢氧化钾乙醇水溶液的制备；
二、样品中固醇类物质的定性定量分析
1)血浆样品前处理：
将血浆加入5α-胆甾烷内标溶液，再加入氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，加塞密封，置水浴中皂化；皂化后溶液冷却至室温，加入正己烷，涡旋混匀，离心，将上清液正己烷层取出；下层再加入正己烷，涡旋混匀后离心，取出上清液合并，在N2下吹干；残渣中加入衍生化试剂BSTFA-TMCS，置60～80℃烘箱中进行衍生化反应，衍生化反应后直接取样品进样分析；
2)气相色谱-质谱联用法定性定量分析：
将上步前处理后的样品用气相色谱-质谱联用仪进行全扫描分析，通过标准对照品溶液保留时间对待测样品中各组分进行定性，得到样品的全扫描色谱图，同时采用选择离子监测SIM内标法定量，得到样品的选择离子监测图，从而实现同时测定待测血浆中4种非胆固醇类固醇：7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的含量；
3)标准曲线的制作：分别制作链甾醇、7-烯胆甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的标准曲线；
4)根据标准曲线分别计算出样品中链甾醇、7-烯胆甾醇、菜油固醇、β-谷固醇的浓度；
三、胆固醇平衡状况分析
根据公式：计算出样品胆固醇平衡得分；
当胆固醇平衡得分＞0.9，说明胆固醇合成过量；
当胆固醇平衡得分在0.6～0.9之间，说明胆固醇代谢状况正常；
当胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3，说明胆固醇吸收过量；
上述7-烯胆甾醇比值＝Clathosterol/TC，即7-烯胆甾醇比值等于7-烯胆甾醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，7-烯胆甾醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述链甾醇比值＝Cdesmosterol/TC；即链甾醇比值等于链甾醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，链甾醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述菜油固醇比值＝Ccampesterol/TC；即菜油固醇比值等于菜油固醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，菜油固醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述β-谷固醇比值＝Csitosterol/TC；即β-谷固醇比值等于β-谷固醇浓度值除以总胆固醇浓度值的比值再乘以100；其中，β-谷固醇浓度值为单位是μM时的值，总胆固醇浓度值为单位是mM时的值；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液中的溶剂为正己烷。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述内标溶液的溶剂为正己烷。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钾乙醇水溶液中氢氧化钾的浓度为1mol·L-1，乙醇浓度为90％v/v。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述血浆样品前处理的具体操作为：每100μL血浆加入10μL 5α-胆甾烷内标溶液，再加入氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，加塞密封，置水浴中皂化；皂化后溶液冷却至室温，加入3mL正己烷，涡旋混匀，离心，将上清液正己烷层取出；下层再加入3mL正己烷，涡旋混匀后离心，取出上清液合并，在N2下吹干；残渣中加入衍生化试剂BSTFA-TMCS，置60～80℃烘箱中进行衍生化反应，衍生化反应后直接取样品进样分析。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用法所使用的色谱条件为：
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述选择离子监测SIM在运行过程中各物质选择的定性离子与定量离子的信息为：
5α-胆甾烷选择的定性离子的质荷比为217m/z，232m/z，357m/z，372m/z；定量离子的质荷比为217m/z；
链甾醇选择的定性离子的质荷比为351m/z，343m/z，327m/z，456m/z；定量离子的质荷比为343m/z；
7-烯胆甾醇选择的定性离子的质荷比为255m/z，353m/z，443m/z，458m/z；定量离子的质荷比为255m/z；
菜油固醇选择的定性离子的质荷比为129m/z，343m/z，382m/z，472m/z；定量离子的质荷比为343m/z；
β-谷固醇选择的定性离子的质荷比为129m/z，357m/z，396m/z，486m/z；定量离子的质荷比为357m/z。
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