JP2012503619A - Hcv感染に対する抗ウイルス治療のための標的としての宿主細胞キナーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2008年9月26日に出願された欧州特許出願EP 08 305 604.4に対する優先権を主張する。この欧州特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
C型肝炎ウイルス(HCV)は主な世界的健康問題であり、全世界で推定1.5〜2億人が感染している(欧州連合内での少なくとも500万の感染者を含む)(Pawlotsky, 2004)。世界保健機構によると、300〜400万の新たな感染が毎年生じている。感染はしばしば無症候である。しかし、HCV感染者の大部分が慢性感染を発生する(Hoofnagle, 2002; Lauer, 2001; Seeff, 1995)。慢性HCV感染は、重大な肝臓疾患(線維症及び脂肪症を含む)を招くことが多い(Chisari, 2005)。慢性HCV感染患者の約20%が肝硬変を発生し、その症例の5%が肝細胞癌に進行する(Hoofnagle, 2002)。
本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける、C型肝炎ウイルス(HCV)感染及びHCV関連疾患に対する医学的介入のための新規標的に関する。本発明は、HCVにより起こされる感染及び疾患の処置及び/又は予防のための新規治療プロトコールの標的として、ならびに、新たなHCV抗ウイルス薬剤の同定及び開発のために使用することができるヒト細胞タンパク質キナーゼの同定を提供する。
本明細書を通して、以下のパラグラフにおいて定義されるいくつかの用語を用いる。
上記の通り、本発明は、691個の細胞キナーゼ及び関連タンパク質を標的化する機能的siRNAスクリーニングを適用し、HCV侵入に及ぼすキナーゼ遺伝子サイレンシングの効果を研究することにより同定された抗ウイルス物質のための推定標的としての新たなHCV侵入因子のパネルを提供する。HCV侵入及び感染において直接的又は間接的に役割を果たす同定されたタンパク質キナーゼは、とりわけ、新規治療プロトコール、有用な抗ウイルス治療、ならびに新たな抗ウイルス薬剤を発見及び開発するための新たなスクリーニング方法(例、アッセイ)及び材料を提供する。
それらの精密な一連の実験において(実施例2及び図3を参照のこと)、出願者らは、HCV侵入及びHCV感染の開始に対して影響を与えるヒトキナーゼ遺伝子を同定するための1次及び2次スクリーニングを実施している。より具体的には、これらの遺伝子のサイレンシングは、細胞中へのHCVpp及びHCVcc侵入において顕著な低下をもたらした。これらのスクリーニングよって、以下のGenBank登録番号を有する78個のキナーゼ遺伝子の同定に至った:NM_001743、NM_004383、NM_173515、NM_001123、NM_001258、NM_004064、NM_001262、NM_004431、NM_004444、NM_006712、NM_005248、NM_004517、NM_001570、NM_007229、NM_152835、NM_003559、NM_004203、NM_004073、NM_016457、NM_003576、NM_003390、NM_016508、NM_001619、NM_001826、NM_004734、NM_006182、NM_017729、NM_005255、NM_002220、NM_002749、NM_005884、NM_000455、NM_007271、NM_003331、NM_001106、NM_005876、NM_000051、NM_004217、NM_001721、NM_004333、NM_001786、NM_033487、NM_000075、NM_001260、NM_001277、NM_005198、NM_006383、NM_020990、NM_004080、NM_005228、NM_005233、NM_004441、NM_005246、NM_002011、BF688722、NM_022158、NM_000162、NM_025211、NM_182982、NM_001556、NM_006116、NM_024117、NM_033116、NM_024594、NM_018425、NM_005028、NM_016203、NM_006742、NM_173176、NM_031480、NM_004755、NM_031464、NM_030974、XM_051221、NM_052841、NM_005781、及びNM_014683。
本発明者らにより同定されたヒト細胞タンパク質キナーゼを、新たなHCV抗ウイルス薬剤の同定、設計、及び開発のための標的として使用することができる。HCV抗ウイルス薬剤として有用なキナーゼ阻害剤は、多種多様な分子のファミリーのいずれかに属しうる。限定はされないが、有機化合物(例、小分子、サッカライド、ステロイドなど)、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体(例、キナーゼに結合する抗体)、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子(例、アンチセンス化合物、リボザイム、三重らせん分子、SELEX RNAなど)を含む。既に上で言及した通り、本発明のキナーゼ阻害剤は、その基質のリン酸化を触媒する対象のタンパク質キナーゼの能力の阻害(例、完全な抑制又は部分的な減少)をもたらす種々の機構の1つ又は複数によりその効果を発揮しうる。このように、キナーゼ阻害剤は、例えば、対象のキナーゼをコードする遺伝子の発現を阻害、遮断、もしくは妨害することにより(遺伝子治療アプローチ)、及び/又は酵素活性を阻害、遮断、もしくは妨害することにより(キナーゼの基質の活性又は機能の競合又は調節を通じて、あるいはキナーゼ又はその触媒/酵素ドメインへの競合的結合を通じて、キナーゼ基質への及び/又はキナーゼエフェクターの上流及び/又は下流への競合的結合を通じて、を含む)その効果を発揮しうる。
上記の通り、本発明は、本発明の少なくとも1つのキナーゼの活性を阻害することにより、細胞中へのHCV侵入及び/又はHCV感染を低下、阻害、又は抑制する化合物の同定のための方法を提供する。種々のアッセイプロトコール及び検出技術が、当技術分野において周知であり、この目的のために当業者は容易に適応することができる。そのような方法は、限定はされないが、ハイスループットアッセイ(例、マイクロアレイ技術、ファージディスプレイ技術)ならびにインビトロ及びインビボでの細胞及び組織アッセイを含む。
本発明のアッセイ及びスクリーニング方法は、任意のタイプの生物学的システム(即ち、細胞、生体液、生体組織、又は動物)を使用して行われうる。特定の実施態様において、システムは、本発明の少なくとも1つのキナーゼを発現する(又は発現することができる)生物学的要素である(例、細胞、血液試料、組織サンプル、臓器の全体又は部分、例、肝臓、又は動物モデル)。特定の実施態様において、生物学的システムをHCVに感染させてもよい(例、HCV感受性細胞)。
本発明のスクリーニング方法を、本発明において同定される少なくともキナーゼの活性を阻害する能力を有する化合物又は薬剤を同定するために使用してもよい。本発明のスクリーニング方法を、一般的に、HCV感染及び/又はHCV関連疾患の予防及び/又は処置において有用な治療薬を開発するという目的で実施する。
本発明のスクリーニング方法に従い、対象のキナーゼの活性を阻害する候補化合物の能力の決定は、キナーゼ又はキナーゼ活性を表す少なくとも1つの因子の活性の測定を含む。キナーゼの活性の決定のための方法は、当技術分野において公知である。キナーゼの活性を表す因子は、任意の適した因子(限定はされないが、発現されたキナーゼの量、リン酸化されたキナーゼ基質の量、キナーゼ基質のリン酸化に起因する細胞特性の修飾などを含む)でありうる。
当業者により理解される通り、本発明のスクリーニング方法により同定されるキナーゼ阻害剤又は当技術分野において既に公知のキナーゼ阻害剤をさらに特徴付けることが一般的に望ましい。
本発明は、HCV感染及び/又はHCV関連疾患の処置及び/又は予防のための新規治療プロトコールに関し、それは、出願者らにより標的として同定されたヒトタンパク質キナーゼの少なくとも1つを標的化するように設計される。より具体的には、本発明は、被験体のHCV感染又はHCV関連疾患を処置又は予防するための方法を提供し、被験体に本発明において同定されたキナーゼの活性を阻害する有効量の薬剤を投与する段階を含む。
本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を治療的及び予防的方法において使用して、HCV感染を処置及び/又は予防し、あるいは肝臓疾患又はHCV感受性細胞(例えば肝臓細胞、リンパ球様細胞、又は単球/マクロファージなど)に影響を与える病理学的状態を処置及び/又は予防してもよい。本発明の実施において、タンパク質キナーゼ阻害剤が、本発明のキナーゼの活性を阻害又は抑制することによりHCV−宿主細胞相互作用に干渉し、それにより細胞中へのHCV侵入及び/又は細胞のHCV感染を低下、阻害、遮断、又は予防する。
本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤を、(場合により、1つ又は複数の適切な薬学的に許容可能な担体又は賦形剤との製剤化後)、所望の投与量で、それを必要とする被験体に任意の適した経路により投与することができる。種々の送達システムが公知であり、本発明のキナーゼ阻害剤を投与するために使用することができる(錠剤、カプセル、注射溶液、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセルなどを含む)。投与の方法は、限定はされないが、経皮、皮内、筋肉内、腹腔内、病巣内、静脈内、皮下、鼻腔内、肺、硬膜外、眼内(ocural)、及び経口経路を含む。本発明のキナーゼ阻害剤又は組成物は、任意の簡便な又は他の適切な経路により、例えば、点滴又はボーラス注射により、上皮内層又は粘膜皮膚内層(例、経口、粘膜、直腸、及び腸粘膜など)を通じた吸収により投与してもよい。投与は全身的又は局所的でありうる。非経口投与は、優先的に患者の肝臓に向けられ、例えば肝動脈への又は胆管中へのカテーテル法などによりうる。当業者により理解される通り、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤が追加の治療用薬剤との組み合わせで投与される実施態様において、キナーゼ阻害剤及び治療用薬剤は同じ経路(例、静脈内)により又は異なる経路(例、静脈内及び経口)により投与されうる。
本発明の本発明のキナーゼ阻害剤(又は組成物)の投与は、送達される量が意図される目的のために効果的であるような投与量でありうる。投与経路、製剤化、及び投与量は、所望の治療効果、処置されるHCV感染又はHCV関連状態の重症度(既に存在する場合)、任意の他の感染の存在、患者の年齢、性別、体重、及び全体的な健康状態ならびに使用されるキナーゼ阻害剤又は組成物の効力、バイオアベイラビリティ、及びインビボでの半減期、併用治療の使用(又は未使用)、及び他の臨床因子に依存しうる。これらの因子は、治療の経過において主治医により容易に決定可能である。あるいは又は加えて、投与量は、動物モデル(例、チンパンジー又はマウス)を使用した試験から決定することができる。これらの又は他の方法に基づいて用量を調整して、最大効力を達成することは、当技術分野において周知であり、訓練を受けた医師の能力の範囲内である。試験が本発明のキナーゼ阻害剤を使用して行われるにつれて、さらなる情報が、適切な投与量レベル及び処置時間に関して出現するであろう。
上で述べた通り、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤は、それ自体で又は医薬組成物として投与されうる。したがって、本明細書に記載する有効量のキナーゼ阻害剤及び少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、組成物は、1つ又は複数の追加の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。
注射用調製物、例えば、無菌注射用水又は油性懸濁剤を、公知の技術に従い、適した分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤を使用して製剤化してもよい。無菌注射用調製物は、また、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶剤中の、例えば、2,3−ブタンジオール溶液としての無菌注射用溶液、懸濁液、又はエマルジョンでありうる。用いてもよい許容可能なビヒクル及び溶剤の内、水リンゲル液、U.S.P.、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。また、無菌の固定油が、溶液又は懸濁媒質として慣習的に用いられる。この目的のために、任意の無菌固定油を用いることができる(合成モノ又はジグリセリドを含む)。脂肪酸、例えばオレイン酸なども注射用製剤の調製において使用してもよい。無菌液体担体は、非経口投与のための無菌液体形態の組成物において有用である。
特定の実施態様において、キナーゼ阻害剤は、本発明の医薬組成物における唯一の活性成分である。他の実施態様において、医薬組成物は、1つ又は複数の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。適した生物学的に活性な薬剤の例は、限定はされないが、ワクチンアジュバント及び治療用薬剤、例えば抗ウイルス薬剤(上記)、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、防腐剤、及びその組み合わせなどを含む。
別の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物の1つ又は複数の成分を含む1つ又は複数の容器(例、バイアル、アンプル、テストチューブ、フラスコ、又はボトル)を含む医薬包装又はキットを提供し、本発明のキナーゼ阻害剤の投与を可能にする。
以下の実施例は、本発明を構成し、実施する好ましい様式の一部を記載する。しかし、実施例が例示目的だけのためであり、本発明の範囲を限定することを意味しないことを理解すべきである。さらに、実施例における記載が過去時制で提示されない場合、テキストは、明細書と同様に、実験が実際に実施されたこと又はデータが実際に得られたことを示唆しているわけではない。
1.材料及び方法
細胞及びレプリコン 本試験で使用されるHEK 293T、Huh7、及びHuh7.5.1細胞が以前に記載されている(Bartosch, 2003; Barth, 2003; Zhong, 2005)。初代ヒト肝細胞を、以前に記載された通りに単離及び培養した(David, 1998、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。本明細書で使用するサブゲノムHCVレプリコンJFH1−SGRも以前に記載されている(Kato, 2005)。
レトロウイルスHCV及びVSV擬似粒子の産生 H77に由来するHCVpp及び由来するVSVppを、以前に記載された通りに生成した(Bartosch, 2003; Barth, 2006)。エンベロープ糖タンパク質をもたない擬似粒子(pp)(コントロールpp)をネガティブコントロールとして使用した(Barth, 2003)。HCVpp及びVSVpp調製物を、Huh7感染後に等しいルシフェラーゼ活性を得るために調整した。
組換えHCVの産生及び感染アッセイ バイシストロニックプラスミドpFK−Luc−Jc1(Koutsoudakis, 2006)は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子ならびにJ6CF及びJFH1セグメントからなるキメラHCVゲノム(Jc1と名付けられる)をコードする。インビトロでのHCV RNA合成及びRNAトランスフェクションを、以前に記載された通りに行った(Wakita, 2005)。トランスフェクト細胞からの培養上清を、以前に記載された通りに、Amicon Ultra 15(Millipore, USA)を使用して精製及び濃縮し、そのまま使用した、又は4℃もしくは−80℃で保存した。ウイルスを、少数の小さな改変を伴うHuh7.5.1細胞での限界希釈アッセイを使用することにより滴定し、TCID50値を以前に記載された方法(Lindenbach, 2005)に基づき算出した。
siRNAを使用したハイスループット遺伝子サイレンシング Human Kinase siRNA Set Version 2.0(Qiagen, Germany)が、4つの独立したsiRNA/標的遺伝子の691プールからなり、Huh7細胞において691の細胞キナーゼ及び関連タンパク質を発現停止させるために適用された。5,000個細胞/0.3cm2を、3.5pmol siRNAを用いて、1μLのInterferrinトランスフェクション試薬(Polyplus, France)を使用してリバーストランスフェクトした。トランスフェクションから72時間後、上清を除去し、細胞を50μLのHCVpp及びVCVppを用いて比較感染させた。100μLの新鮮培養液を6時間のインキュベーション後に37℃で加え、感染から48時間後、細胞培養上清を全て除去し、細胞を100μLのGlo溶解バッファー(Promega, USA)を使用して溶解した。ホタルルシフェラーゼ活性を、細胞溶解から10分後に、25%(v/v)Bright-Gloルシフェラーゼ基質(Promega, USA)を使用して、ハイスループットルミノメーター(Berthold, Germany)により測定した。特定の感染性を、Dcタンパク質アッセイキット(Biorad, USA)を使用した全タンパク質の標準化により評価した。
新規HCV侵入因子の同定 遺伝子サイレンシングの効果を、非特異的siRNAを用いてトランスフェクトされた細胞と比較したHCVpp侵入の増加又は減少により定義した。詳細には、統計分析を、以前に記載された通りに実施し(Ploner, 2006; Raffelsberger, 2008; Wettenhall, 2004)、真の陽性テスト結果(第二種の過誤)にペナルティーを科すことなく偽陽性(第一種の過誤)の最大の低下を確実にする。HCV侵入に対するHCV特異的な効果を、比較実験において実施されたコントロールウイルス(VSVpp)の侵入に及ぼす有意な類似の効果の非存在として決定した(HCV特異的な効果:HCV侵入は有意に減少し、VSVpp侵入は有意に不変又は増加した。及び逆もまた同様)。加えて、ウイルス侵入機構に対して潜在的で一般的な重要性を有するタンパク質キナーゼを同定し、それについて、対応する遺伝子のサイレンシングが、VSVpp侵入に対する遺伝子サイレンシングにより引き起こされる変化にかかわらず、細胞中へのHCVウイルス侵入の顕著な低下をもたらした(再現性が統計的に有意な場合、HCV侵入の>80%阻害と等価である)。感染性HCVのライフサイクルに及ぼす同定された候補キナーゼの効果を、上のpp−siRNAスクリーニングについて記載された通りに、HCVcc感染に対する候補遺伝子サイレンシングの効果を測定する第2のsiRNAスクリーニングにより検証した。さらに、第2のHCVcc−siRNAスクリーニングの特異性を確実にするために、トランスフェクトされたsiRNAのMTT細胞毒性テストを、以前に記載された通りに(Cole, 1986)比較実施した。
タンパク質キナーゼ阻害剤を使用したHCV感染の阻害 本試験において使用された全ての阻害剤をLC Laboratories(USA)から得た。使用前に、それらをDMSOに溶解し、Huh7.5.1細胞培養液で希釈した(Zhong, 2005)。インキュベーションに続き、細胞でのHCVpp侵入及びHCVcc感染を、以前に報告された通りに(Pestka, 2007; Zeisel, 2007)ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現又はHCV RNAのRT−PCRにより評価した。
ノーザンブロッティング Xbal及びEcoRIを用いて消化されたプラスミドJKH1(Wakita, 2005)に由来する9.7kbフラグメントを、α32P−CTPを用いて、NEBlotキット(NEB, USA)を使用して標識した。ノーザンブロッティングを標準的なプロトコール(F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley 1 Sons, Inc., 2007)に従って実施した。
最先端の機能的なハイスループットsiRNA HCVpp侵入スクリーニングを使用し、本出願者らは、宿主細胞キナーゼの2つのパネルを同定している。第1パネルのキナーゼは、無関係のコントロールウイルス(VSVpp)の侵入に影響を与えることなく、HCVpp侵入の有意な特異的阻害を示す。第2パネルのキナーゼは、VSVpp侵入に対する遺伝子サイレンシングにより引き起こされる変化にかかわらず、HCVpp侵入/感染の顕著な阻害を示す。
推定HCV補助侵入因子としてのEphA2の同定も、HCV侵入を標的化する新規抗ウイルス薬戦略の開発についての関心事である。なぜなら、EphA2がダサチニブ(慢性骨髄性白血病の処置のための臨床的に許可されたキナーゼ阻害剤)の標的であることが示されているからである(Huang, 2007)。
1.材料及び方法
試薬及び抗体 ヒトキナーゼsiRNA Set Version 2.0(4つのsiRNAのプール)及び個々のsiRNAをQiagenから購入した。エルロチニブ(Tarceva(登録商標))、ダサチニブ(Sprycel(登録商標))、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標))、バンデタニブ(Zactima(登録商標))、及びラパチニブ(Tykerb(登録商標))をIC Laboratoriesから、TpIIIキナーゼ阻害剤及びワートマニンをCalbiochemから、フラボピリドール及びドルソモルフィンをSigma-Aldrichから購入した。抗EphA2 C−20及びプロテインA/G−アガロースビーズをSanta Cruz Biotechnologiesから、EGFRをMilliporeから、及びアルカリホスファターゼ標識二次抗体をGE Healthcareから購入した。
細胞株、初代肝細胞、及びレプリコン。同上。
ゲノムレベルRNAiキナーゼHCV侵入スクリーニング スクリーニングを、Transfected Cell Array(TCA)プラットフォーム(Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire(IGBMC),Illkirch, France)で実施した。このスクリーニングのために使用したライブラリーは、Qiagenから購入のHuman Kinase siRNA Set Version 2.0(4つのsiRNAのプール)であった。個々のsiRNAをQiagenから購入した。691個の細胞キナーゼ及び関連タンパク質を標的化する機能性HCV侵入siRNAスクリーニングを、図4に概説する通りに確立した。各標的について、3.5pmolのsiRNAを、5,000個のHuh7細胞/0.3cm2においてInterferrin(Polyplus)を使用してリバーストランスフェクトした。ウイルス侵入に及ぼす遺伝子サイレンシングの効果を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つHCV偽型粒子(HCVpp H77C;遺伝子型1a)(Bartosh, 2003; Pestka, 2007)を使用し、siRNAトランスフェクションの3日後に研究した。VSVpp侵入に与える影響を比較分析した。ウイルス侵入を、感染の2日後に、Mithras LB940ルミノメーター(Berthold Technologies)を使用しBright Glo Luciferaseアッセイシステム(Promega)により、細胞ライセート中のレポーター遺伝子ルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した。ヒットを、同じ標的mRNAを発現停止させる同じsiRNAライブラリー(Qiagen)からの4つの異なる単一siRNAを使用し、独立して検証した。HCVcc株Luc−Jc1(Dimitrova, 2008;Pietschmann, 2006)(TCID50、約103/mL)を使用した検証を、Huh7.5.1細胞において上に記載する同じプロトコールを使用して実施した。全てのsiRNAスクリーニングを96ウェル細胞培養プレート中で実施した。ルシフェラーゼの結果を、Dcタンパク質アッセイ(Bio-Rad)を使用し、ライセートのタンパク質含量により標準化した。蒸発に起因する非特異的な効果を最小限にするために、外のウェルをスクリーニングに使用せず、リン酸緩衝食塩水(PBS)を用いて満たした。細胞増殖における変化に起因する遺伝子サイレンシングの非特異的な効果を、個々のウェルのタンパク質含量を測定することにより標準化した。確立されたハイスループットスクリーニングの品質、個々のプレート設計ならびに複製物の量を、パイロット実験において、Z因子(Zhang, 1999)を算出することにより評価した。HCVppスクリーニング(Z=0.37)を、スクリーニングのために使用される96の中央プレート位置の60を用いて2連で実施する。HCVcc検証スクリーニング(Z=0.47)を、スクリーニングのために使用される96の中央プレート位置の32を用いて3連で実施した。遺伝子サイレンシングならびにHCVpp及びHCVcc感染の内部品質コントロールとして、ポジティブ及びネガティブコントロールsiRNA(GFP、CD81)を各プレート上に並列でトランスフェクトした。細胞に対する細胞毒性効果を、下に記載する通りに、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を代謝する能力を分析することにより3連で評価した。
ハイスループットスクリーニング:ヒット選択 遺伝子サイレンシングの効果を、コントロールトランスフェクト(GFPを標的化するsiRNA)中への侵入の実験的な平均値と比較した侵入の比率として表わしたHCVpp侵入の増加又は減少により定義した。HCVの特異性を、VSVppコントロールウイルスの侵入に対する有意な類似の効果の非存在として決定した。ログ2比率を、真の陽性テスト結果(第二種の過誤)にペナルティーを科すことなく偽陽性(第一種の過誤)の最大の低下を確実にするために、Bioconductor(Gentleman, 2004)パッケージlimma(Wettenhall, 2004)において実施された経験ベイズ手順を使用して0に対する差についてテストした(Allison, 2006)。経験ベイズテストからの結果として得られるB値を、有意のカットオフを定義するために、それらの分布について検証した(データ示さず)。最後に、HCVppについて閾値−3.5(最高p値4×10−4に対応する)、HCVppについて閾値−4.4(最高p値3×10−6に対応する)、及びVSVppについて閾値−3.6(最高p値1.1×10−3に対応する)を、基礎となる頻度分布に基づくストリンジェントなパラメーターとして選んだ(データ示さず)。VSVppの侵入にかかわらず、HCVpp侵入に対する強い効果(B値>5)を示す遺伝子(合計29個)も、さらなる検証のために含めた。また、各遺伝子についての全ての比較のための局所的な過誤発見率(fdr:false discovery rate)を、ライブラリー「fdrtool」を使用して決定した(Strimmer, 2008)。検証のために、10個の追加遺伝子も含めた。それらは、HCV侵入をプレート平均値から≧2SDだけ減少させたが(即ち、Brass, 2008により使用された戦略)、しかし、高い内部変動が高いp値又は低い対応するB値だけを与えるとの事実に起因して、本発明者らに続くアプローチにより同定されなかったであろう。プールされたsiRNAによるオフターゲットの効果を除外するために、候補を、HCV侵入が、コントロールトランスフェクト細胞と比較し、少なくとも2つの個々のsiRNAにより≧50%だけ低下されるか否かを検証した。
遺伝子オントロジー及び遺伝子アノテーション 遺伝子オントロジー項目及び遺伝子関連性を、Ingenuity Pathwaysデータベース(Mountainview, CA, USA)により検証されたHuman Kinase siRNA Set Version 2.0から得た。同定されたキナーゼの生物学的機能解析を、Ingenuity Pathwaysデータベース(Krishnan, 2008; Tuvin, 2009)を使用して実施した。生物学的機能項目を、それらがp値<10−5を伴い有意に高められた場合に受け入れられた。加えて、同定されたヒットを、公知の予測されたタンパク質相互作用について、ゲノム及びタンパク質の一般的な組で全ての相互作用の証拠をマップするSTRINGメガデータベースを使用して解析した(Jensen, 2009)。
免疫沈降及び免疫ブロットによるキナーゼ発現の分析 EphA2の免疫沈降を、トランスフェクト細胞の溶解後に、50mM Tris(pH 8)、150mM NaCl、1% NP−40、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含む緩衝液を使用して実施した。免疫沈降のために、2.5μgの抗EphA2 C−20抗体(180μgのタンパク質含量)及び25μLのプロテインA/Gビーズ(Santa Cruz Biotechnologies)を使用した。ウエスタンブロットを、GE Healthcareのプロトコールに従い、Hybond-Pメンブランを使用して実施し、ECF基質及びTyphoon Trio高性能蛍光スキャナー(GE Healthcare)を使用して可視化した。
HCVpp及びHCVccを用いたHuh7由来細胞株及び初代ヒト肝細胞の感染 HCVpp(株H77C、HCV−J、UKN2A.2.4、UKN3A、UKN4A.21.16、VD、VH、VK、VN)、VSPpp及びHCVcc(株Jc1、Luc−Jc1)を、以前に記載された通りに作製した(Bartosch, 2003; Dimitrova, 2008; Fati-Kremer, 2009; Pestka, 2007; Pietschmann, 2006; Tarr, 2006;及びZeisel, 2007)。株H77C(1a)に由来するHCVpp、ならびに株Jc1(2a/2a)及びLuc−Jc1(2a/2a)に由来するHCVccを用いた(TCID50 103/mL)Huh7細胞、Huh7.5細胞、及びヒト肝細胞の感染を、記載された通りに実施した(Dimitrova, 2008; Fati-Kremer, 2009; Lan, 2008; Meunier, 2008;及びZeisel, 2007)。遺伝子サイレンシングを、感染の3日前に、RNAiスクリーニングについて記載された通りに実施した。タンパク質キナーゼ阻害剤(例外ワートマニン、最終1% DMSO)を、最終溶媒濃度0.25% DMSOでアプライした。阻害剤を、HCVpp又はHCVcc感染の1時間前に細胞培養液に加えた。
HCV複製の分析 プラスミドpSGR−JFH1に由来するRNAの電気穿孔を、以前に記載された通りに実施した(Lan, 2008)。電気穿孔から4時間後、細胞を、細胞培養上清中で24時間にわたりタンパク質キナーゼ阻害剤とインキュベートした。全RNAを単離し、記載された通りにHCV RNAのノーザンブロット分析により分析した(Lohmann, 1999)。
毒性アッセイ 細胞に対する細胞毒性効果を、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を代謝する能力を分析することにより3連で評価した(Lan, 2008)。siRNA実験のために、MTTを、siRNAを用いた5時間にわたるトランスフェクションの3日後に加えた。MTTの最終濃度は0.6mg/mLであった。細胞により産生されたホルマザン結晶を可溶化し、記載された通りに測定した(Mosmann, 1983)。
siRNAベースのスクリーニングを実施し、Huh7細胞において691個のヒトキナーゼを発現停止し、HCV侵入に関連しうるヒトゲノム中の全ての細胞キナーゼを包括的に同定した。感染の後期段階における欠損(例えば複製、集合、又は分泌など)を、このアッセイにおいて検討しなかった。アッセイの計測は、ルシフェラーゼレポーターを含むHCVpp又はHCVccを用いた遺伝子発現停止された細胞の感染からなった。これには、感染から72時間後にレポーター遺伝子発現をアッセイすることによるウイルス侵入の定量化が続いた。スクリーニングは3段階を含んだ:無関係なコントロールウイルスとしての役割を果たす水胞性口炎ウイルスに由来する偽型粒子(VSVpp)を用いたHCVppを比較使用した一次スクリーニング。感染性ウイルスのライフサイクルについて同定されたヒットの関連性を検証するために、一次スクリーニングにおいて同定されたヒットを、組換えHCVcc及びHuh7.5.1細胞に基づく感染性HCV細胞培養モデルを使用した二次スクリーニングにおいて確認した(図4)。一次及び二次スクリーニングを、同じ遺伝子を標的化する4つのsiRNAのプールを使用して実施した。二次スクリーニングからの候補遺伝子を、三回目のスクリーニングに供し、それにおいて各プール中の4つの成分siRNAを個々に再スクリーニングした(図4)。
同定されたキナーゼ及び関連タンパク質の公知の生理学的機能の分類を得るために、Ingenuity Pathwaysデータを使用したバイオインフォマティクス分析を、他のRNAn siRNAベースのスクリーニングについて記載された通りに実施した(Krishnan, 2008 and Tuvim, 2009)。この分析によって、癌及び細胞死に関与する遺伝子の高い提示が明らかになった(図6A)。HCVに対する影響を与えるが、しかし、VSV侵入に対しては与えないキナーゼを分類する際、5つの最も高度に提示されるカテゴリーは以下を含んだ:アミノ酸代謝、翻訳後修飾、小分子生化学、細胞形態、細胞発生、細胞周期、細胞シグナル伝達、及び癌(図6B)。
a)細胞極性を調節する宿主細胞キナーゼ 最初に、RNAiスクリーニング続くSTRING分析によって、肝臓キナーゼB1(STK11)及びAMP活性化タンパク質キナーゼ(AMP、γ2非触媒サブユニットPRKAG2)がHCV侵入のための宿主因子として同定された(図6〜7)。PRKAG2サブユニットが、AMPKのためのアクチベーターとしての役割を果たす。図7に示す通り、STK11又はAMPKサブユニットPRKAG2についての遺伝子の発現のサイレンシングから、全ての主な遺伝子型に由来するHCVppの侵入の顕著な阻害が生じた(図7A〜B、左パネル)。同様の結果が組換えHCVを用いた感染について得られ、同定されたキナーゼが増殖性感染の開始のために重要であることを示唆する(図7A〜B、右パネル)。対照的に、コントロールsiRNAを用いた細胞のインキュベーションは、HCV侵入又はHCV感染を有意に修飾しなかった(図7)。2つの対応する阻害性AMPKサブユニット、即ち、β1(PRKAB1)及びβ2(PRKAB2)のサイレンシングが、HCVpp侵入を刺激し、AMPK活性がHCV侵入及び感染のために極めて重要であることを示唆する。この経路の影響が、ドルソモルフィン(AMPK活性の阻害剤)の使用によりさらに確認された(Zhou, 2001)。ドルソモルフィンを用いたHuh7.5細胞のプレインキュベーションが、HCVpp侵入を顕著に阻害し(図7C)、AMPK機能がHCV侵入のために実際に重要であることが確認された。
b)タイトジャンクション機能を調節する宿主細胞キナーゼ RNAiスクリーニングによって、タイトジャンクション(TJ)機能の調節に関与するいくつかのキナーゼが同定された。これらは、MAGI−1、EphA2、及びEGFRを含む(図6C)。極性化肝細胞において、TJが、それらの原形質膜を頂端ドメインと側底ドメインに分離する。これはHCV侵入についての関心事及び関連性である。なぜなら、いくつかのTJタンパク質、即ち、クローディン1、6、及び9(Evans, 2007; Harris, 2008; Meertens, 2008)ならびにオクルディン(Benedicto, 2009; Ploss, 2009)が、HCV侵入のための補助因子であることが示されているからである。別々の細胞表面分布を有するいくつかの取込み因子の使用は、HCVが、コクサッキーウイルスBのものと類似の協調侵入経路(肝細胞TJに依存的である)に従いうるとの仮説と一致する(Ploss, 2009)。あるいは、HCVは、TJに関連しないクローディン1の形態を利用しうる(Mee, 2009)。TJの破壊は、CaCo−2細胞におけるHCV侵入を増強することが示されており、外側及び側底細胞ドメイン上で発現されるHCV侵入因子へのウイルスアクセスに対する物理的バリアを提供するモデルを支持する(Mee, 2008)。
c)インテグリンシグナル伝達に関与する宿主細胞キナーゼ STRING分析では細胞接着及びインテグリンシグナル伝達に関与する4つのキナーゼのネットワークが同定された:c−Src(CSK)、焦点接着キナーゼ(PTK2)、焦点接着キナーゼ2(PTK2B)、及びインテグリン結合キナーゼ(ILK)。これらの全てが細胞接着及び細胞マトリックス相互作用を調節する(D Nichila, 1999; Harburger, 2009)(図6C)。CD81(重要なHCV侵入因子)及び他のテトラスパニンが、インテグリンファミリーの接着受容体に会合し、インテグリン依存的な細胞遊走を調節することが示されている(Berditchevski, 2001)。従って機能的なインテグリンシグナル伝達が、HCV侵入因子輸送及び細胞表面上での局在化、ひいてはHCV侵入のために必須でありうることが考えられる。これに関連して、多くのテトラスパニン(CD81を含む)が、II型ホスファチジルイノシトール4キナーゼと会合し、これが、インテグリンヘテロ二量体へこれらの酵素を繋ぎ止めることによりシグナル伝達複合体の集合を促進しることが示唆される(Berditchevski, 2001)。これは、ホスファチジルイノシトール4キナーゼ2型アルファ(PI4KII)のサイレンシングがHCV侵入及び感染を特異的に損なったが、しかし、VSV侵入に影響を与えなかったとの本知見により支持される。さらに、インテグリンシグナル伝達が、他のウイルス、例えばアデノウイルス、ハンタウイルス、及びヘルペスウイルスなどの侵入において中枢的役割を果たすことが公知である(概説については、Stewart, 2007を参照のこと):HCVは、従って、別のインテグリン依存的な侵入機構を有しうる。
d)細胞周期に関与する宿主細胞キナーゼ STRING分析は、細胞周期調節に関与する8つのキナーゼ(細胞分裂周期2キナーゼ(CDC2)、サイクリン依存性キナーゼ3(CDK3)、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)、コリンキナーゼアルファ(CHKA)、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤1B(CDKN1B)、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤2C(CDKN2C)、膜会合チロシン/スレオニンタンパク質キナーゼ1(PKMYT1)、及びWEE1ホモログS.pombe(WEE1)を含む)を含むネットワークを示した(図6C)。これらのCDKが細胞分裂依存的な肝細胞癌モデルシステムの内因性の特性のために同定されたという可能性を除外することはできないが、いくつかの観察がHCV侵入のためのCDKの特定の役割を支持する。第1に、CDK3のサイレンシングが、全ての主なHCV遺伝子型1〜4に由来するHCVppの侵入を顕著に阻害するが、しかし、VSVppは阻害しなかった。HCV侵入に及ぼす特異的な効果も、CDKN1B、CDKN2C、WEE1、及びPKMYT1が発現停止された場合に観察された。第2に、遺伝子サイレンシング後(CHKAを用いた実験とは別に)、細胞毒性が、MTTの細胞代謝により測定された通りに観察されなかった。これは、キナーゼのサイレンシングが非特異的な毒性効果に起因しなかったことを示唆する。第3に、フラボピリドール(十分に特徴付けられたCDK3阻害剤)が、任意の検出可能な細胞毒性効果の非存在において初代ヒト肝細胞中でHCVpp侵入を顕著に阻害した。これらのデータは、CDKの効果が、モデル標的細胞株又は擬似粒子侵入アッセイのいずれにも関連せず、HCV侵入に関連しうることを示唆する。CDKがヒト免疫不全及びヘルペスウイルスのライフサイクルにおいて重要な役割を果たすことが周知である。これらは、CDK9によるHIV転写の調節(Zhou, 2009)ならびにマイクロフィラメント組織化及び細胞形態を調節するCDK4及びCDK6のカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによる活性化(Cuomo, 2005)を含む。このように、類似の機構がHCVについて適用されることが考えられる。
HCVライフサイクルに及ぼす同定されたキナーゼの効果をさらに試験するために、EphA2及びEGFRの機能的な効果を特徴付けた。これらのキナーゼが選択された。なぜなら、それらは同定されたネットワーク中の成分であるからである(図6C)。さらに、EphA2及びEGFRは、臨床的に認可されたキナーゼ阻害剤ダサチニブ(EphA2用)及びエルロチニブ(EGFR用)により強力に阻害され、ウイルスライフサイクルの様々な段階でこれらのキナーゼの機能的な効果を研究することを可能にしている。HCV侵入、複製、及び感染に及ぼすキナーゼ阻害剤の効果を試験した。図9に示す通り、ダサチニブ及びエルロチニブはHCV感染を顕著に阻害した。エルロチニブは、HCV侵入及び感染の最も強力な阻害剤であり(IC50、約0.5μM)、ダサチニブがその次であった(IC50、2μM)。観察されたIC50値は、精製されたEphA2(Huang, 2007)又はEGFR(Minami, 2007)の記載されたIC50値より高かった。肝細胞又は肝細胞由来の細胞株において観察されたより高いIC50値は、肝細胞又は肝細胞癌細胞における阻害剤の迅速な代謝に起因する。それにもかかわらず、追加のキナーゼがダサチニブ及びエルロチニブの抗ウイルス効果に寄付する可能性を除外することはできず、しかし、EGFRの場合において、この結果(図9)は、類似のIC50でHCV感染を阻害した3つの追加のEGFR阻害剤(ゲフィチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ)を用いて確認された(示さず)。HCVcc感染に及ぼすダサチニブ及びエルロチニブの阻害効果は、ルシフェラーゼレポーターの翻訳に及ぼす薬物の非特異的な影響を除き、RT−PCRを使用したウイルスRNAの検出により確認された(データ示さず)。
エルロチニブが達成可能な血漿濃度(平均血漿濃度〜4μM、Hidalgo and Bloedow, 2003)に対応する用量範囲(IC50、0.5μM)においてHCV侵入及び感染を強力に阻害したため、その影響を患者由来の分離株を用いた感染で評価した。初代ヒト肝細胞及び肝臓移植を受けている4人のHCV感染患者に由来するウイルスエンベロープ糖タンパク質を持つHCV偽型を使用し、本出願者らは、増強したウイルス侵入及び抗体媒介性中和からの回避が、肝臓移植片のHCV再感染の間でのウイルスバリアントの選択のための重要な決定要因であることを実証している(Fafi-Kremer, 2009)。この以前の試験での結果は、ウイルス侵入が肝臓移植片のHCV再感染の予防のための実行可能な標的であることを示唆している(Fafi-Kremer, 2009)。本試験において、多種キナーゼ阻害剤の効果を、4人の異なる患者における移植及び肝臓移植片の再感染の間に選択されたHCV株(HCV株VD、VH、VK、VN)からのエンベロープ糖タンパク質を持つHCVppの侵入について試験した。図9に示す通り、同定された宿主細胞キナーゼのサイレンシングならびにキナーゼ阻害剤ダサチニブ及びエルロチニブを用いた細胞のプレインキュベーションが、Huh7.5細胞及び初代ヒト肝細胞において患者由来のHCVppの侵入を顕著に阻害した。エルロチニブは、Huh7.5細胞においてダサチニブより強力であると思われたが、しかし、初代ヒト肝細胞においてはそうではなかった。対照的に、ワートマニン(図10)又はナフチリジンベースのTpI2キナーゼ阻害剤(データ示さず)は、HCVpp感染の再現性のある阻害をもたらさなかった。これらのデータは、エルロチニブ(Erlotininb)及びダサチニブが、肝臓移植片に感染する患者由来の単離株でのHCV侵入を特異的に阻害することを示唆する。毒性効果は、MTTテストに基づく細胞生存の比較分析において検出されなかった(図10)。
本発明の他の実施態様は、本明細書に開示する本発明の明細書又は実施の考察から当業者には明らかであろう。明細書及び実施例は、例示的であるとだけ見なされることを意図し、本発明の真の範囲は以下の特許請求の範囲により示される。
Claims (18)
- 細胞のC型肝炎ウイルス(HCV)感染を予防するための薬剤であって、薬剤がEGFR、PRKAG2、STK11、EPHA2、及びサイクリン依存性キナーゼからなる群より、又はSTK11、PRKAG2、MAGI−1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、CHKA、CDKN1B、CDKN2C、PKMYT1及びWEE1からなる群より、又はCALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、及びTYK2からなる群より、又はCALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、AURKB、BMX、BRAF、CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA、CHKB、CIB2、CKMT1、DGKB、EGFR、EPHA3、EPHB1、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAP1、GRK4、IKBKB、MAP3K7IP1、MAPKAP1、NEK9、PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKH1、PTK2、PTK2B、RIOK1、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、SKIP、STK22C、TNK2、及びULK2からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質キナーゼの活性を阻害する薬剤。
- HCV感染又はHCV関連疾患を被験体において予防又は処置するための薬剤であって、薬剤がEGFR、PRKAG2、STK11、EPHA2、及びサイクリン依存性キナーゼからなる群より、又はSTK11、PRKAG2、MAGI−1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、CHKA、CDKN1B、CDKN2C、PKMYT1、及びWEE1からなる群より、又はCALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、及びTYK2,からなる群より、又はCALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、AURKB、BMX、BRAF、CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA、CHKB、CIB2、CKMT1、DGKB、EGFR、EPHA3、EPHB1、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAP1、GRK4、IKBKB、MAP3K7IP1、MAPKAP1、NEK9、PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKH1、PTK2、PTK2B、RIOK1、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、SKIP、STK22C、TNK2、及びULK2からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質キナーゼの活性を阻害する薬剤。
- 肝臓移植患者においてHCVの再発を予防するための薬剤であって、薬剤がEGFR、PRKAG2、STK11、EPHA2、及びサイクリン依存性キナーゼからなる群より、又はSTK11、PRKAG2、MAGI−1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、CHKA、CDKN1B、CDKN2C、PKMYT1、及びWEE1からなる群より、又はCALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、及びTYK2からなる群より、又はCALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、AURKB、BMX、BRAF、CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA、CHKB、CIB2、CKMT1、DGKB、EGFR、EPHA3、EPHB1、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAP1、GRK4、IKBKB、MAP3K7IP1、MAPKAP1、NEK9、PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKH1、PTK2、PTK2B、RIOK1、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、SKIP、STK22C、TNK2、及びULK2からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質キナーゼの活性を阻害する薬剤。
- 薬剤が、小分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、RNAポリメラーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、siRNA、siDNA、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬剤。
- 薬剤がEGFRの活性を阻害し、エルロチニブ、バンデタニブ、ゲフィチニブ、及びラパチニブからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬剤。
- 薬剤がAMPKの活性を阻害するドルソモルフィンである、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬剤。
- 薬剤がEPHA2の活性を阻害するダサチニブである、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬剤。
- 薬剤がサイクリン依存性キナーゼの活性を阻害するフラボピリドールである、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬剤。
- HCV感染又はHCV関連疾患の処置及び/又は予防のための医薬の製造のための、請求項1〜8のいずれか一項記載の薬剤の使用。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の有効量の薬剤、及び少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
- 少なくとも1つの生物学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項10記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つの生物学的に活性な薬剤との組み合わせでの使用のために適応される、請求項10記載の医薬組成物。
- 生物学的に活性な薬剤が抗ウイルス薬剤である、請求項11又は請求項12に記載の医薬組成物。
- ウイルス薬剤が、インターフェロン、リバビリン、抗HCVモノクローナル抗体、抗HCVポリクローナル抗体、RNAポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、IRES阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項13記載の医薬組成物。
- 以下の工程を含む潜在的なHCV抗ウイルス薬剤を同定する方法:
(a)少なくとも1つのヒト細胞タンパク質キナーゼを発現する生物学的システムを候補化合物とインビトロで接触させること、ここで前記タンパク質キナーゼが、EGFR、PRKAG2、STK11、EPHA2、及びサイクリン依存性キナーゼからなる群より、又はSTK11、PRKAG2、MAGI−1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、CHKA、CDKN1B、CDKN2C、PKMYT1、及びWEE1からなる群より、又はCALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、及びTYK2からなる群より、又はCALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、AURKB、BMX、BRAF、CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA、CHKB、CIB2、CKMT1、DGKB、EGFR、EPHA3、EPHB1、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAP1、GRK4、IKBKB、MAP3K7IP1、MAPKAP1、NEK9、PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKH1、PTK2、PTK2B、RIOK1、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、SKIP、STK22C、TNK2、及びULK2からなる群より選択され;
(b)前記タンパク質キナーゼの活性を決定すること、ここで候補化合物が、工程(b)において決定された活性が、候補化合物の非存在下の生物学的システムにおいて決定された前記タンパク質キナーゼの活性よりも低い場合、潜在的なHCV抗ウイルス薬剤として同定される。 - 候補化合物が、小分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、RNAポリメラーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、siRNA、siDNA、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項15記載の方法。
- 候補化合物が候補化合物のコレクション又はライブラリーに属する、請求項15又は請求項16記載の方法。
- 生物学的システムが細胞である、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
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