CN112367993A - 治疗乙型肝炎病毒（hbv）感染的方法 - Google Patents
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Abstract
在本发明中，人类肝细胞核中HBc相互作用因子的蛋白质组学鉴定揭示了大部分RNA结合蛋白(RBPs)参与mRNA代谢，并且特别是发现了富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子10(SRSF10)在HBc复合物中富集了近3000倍。发明人证明，用小分子1C8(4‑吡啶酮苯并噻唑咪唑甲酰胺)抑制SRSF10磷酸化，可在持续感染的肝细胞中强烈抑制HBV复制(基因型C和D)，以及在新生感染中强烈抑制HBV cccDNA的建立。因此，本发明涉及一种用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的SRSF10活性抑制剂，所述抑制剂将SRSF10保持在去磷酸化状态，并防止或降低SRSF10的剪接活性。
Description
发明领域
本发明涉及使用SRSF10(富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子10)的生物活性抑制剂治疗乙型肝炎病毒感染的方法和药物组合物，特别是所述抑制剂使SRSF10保持在去磷酸化状态，并阻止或降低SRSF10的剪接活性。
发明背景
尽管存在预防性疫苗，但慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范围内仍然是主要健康问题，因为它们涉及2.5亿人口，并且表现为原发性肝癌(肝细胞癌，HCC)的首要诱因(Petruzziello，2018)。目前临床上公认的针对HBV慢性感染的抗病毒治疗包括直接靶向由病毒DNA转录并间接增强宿主免疫反应的聚乙二醇化干扰素-α(IFN-α和/或特异性抑制HBV逆转录的核苷类似物(NUC)。这些治疗通常会导致患者血液中的病毒血症短暂降低(针对IFN)或持久降低(针对NUC)(Zoulim和Durantel，2015)。然而，很少取得肝脏病毒的清除，因此必须使用NUC进行终身治疗。因此，迫切需要开发能够直接或间接抑制HBV复制的新型抗病毒分子，这些抗病毒分子可用于组合疗法。
在高度复制HBV的细胞中，HBV核心蛋白(HBc)积聚在细胞核中，这意味着，除了众所周知的其在pgRNA的衣壳化和随后的逆转录产生病毒粒子基因组中的作用外，HBc可能还具有其他调控功能。早期研究表明，HBc与HBV cccDNA以及细胞DNA结合(Zlotnick等，2015)。这些发现表明，该病毒蛋白可通过招募表观遗传调控因子和/或阻止接近沉默因子来调节病毒微型染色体(cccDNA)的表达。然而，最近的研究表明，新合成的HBc并非HBV转录本身所需。因此，HBc的细胞核功能仍然不明确(Seeger等，2015)。
为了破译HBc的细胞核功能，发明人鉴定了其在人类分化的肝细胞中的细胞核伙伴。对人类肝细胞核中的HBc相互作用因子的蛋白质组学鉴定揭示了大多数RNA结合蛋白(RBPs)参与mRNA的代谢。特别地，发现了富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子10(SRSF10)在HBc复合物中富集了近3000倍，因此突出了HBc与该核RNA结合因子的强且优先的相互作用。
为了进一步研究SRSF10在HBV复制过程中的作用，发明人使用了化合物1C8(4-吡啶酮苯并异噻唑甲酰胺(4-pyridinonebenzisothiazole carboxamide))，该化合物最近被确定为HIV-1复制的强抑制剂(Shkreta等，2017)。1C8最初被鉴定为IDC16的结构模拟物，IDC16是一种抑制主要SR因子SRSF1剪接功能的药物(Cheung等，2016)。分子分析表明，1C8并不抑制SRSF1，而是阻止SRSF10的磷酸化，从而调节其剪接活性(Shkreta等，2017)。特别地，1C8被揭示可抑制SRSF10在丝氨酸133的磷酸化。此残基的磷酸化以及丝氨酸131发生的磷酸化先前被发现会改变与其他剪接因子的相互作用(Shkreta等，2017)。体外研究表明，1C8强烈抑制HIV复制，而对细胞基因和细胞活力的影响很小。
HIV复制的抑制与剪接的病毒mRNA合成的改变有关并且与SRSF10和HIV mRNAs的结合减少有关(Shkreta等，2017)。专利申请WO2015/164956公开了苯并异噻唑衍生物化合物(属于1C8)及其在治疗HIV感染中的用途。
发明内容
在本发明中，研究HBV复制机制的发明人试图破译HBc的调节功能，通过质谱(MS)分析确定其在人类肝细胞核中的细胞伴侣。该分析鉴定了超过200种蛋白质。功能注释显示，这些因子中约有50％是RNA结合蛋白(RBPs)，并且特别是SR蛋白，其中最相关的功能类别与具有高度相互连接的参与RNA剪接的因子相一致。功能分析确定SRSF10能够强有力地和差异化地调控HBV的复制。此外，靶向SRSF10蛋白活性的小化合物1C8诱导不同株型的HBV(基因型C和D)的病毒复制显著下降。
因此，本发明涉及一种用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的SRSF10活性抑制剂。
在特定的实施方案中，所述抑制剂使SRSF10维持在去磷酸化状态，并防止或降低SFR10的剪接活性。
在特定的实施方案中，SRSF10活性的抑制剂能够在被感染细胞中减少cccDNA和/或pgRNA。
本发明还涉及一种用于筛选可用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的多种候选化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)测试每种候选化合物抑制SRSF10活性的能力，以及(b)并正选择能够抑制所述SRSF10活性的候选化合物。
具体实施方式
在本研究中，发明人证明了SRSF10是存在于HBc核复合物中的主要因子，并且可以在HBV生命周期中发挥作用。由于1C8被证明了能够调节SRSF10的磷酸化状态，发明人直接研究了这个已经被证明能够调节HIV复制的分子是否也能够抑制HBV的复制。他们发现，1C8化合物确实能够抑制持续感染的肝细胞中HBV(基因型为D和C)的复制，强烈地将细胞内HBVRNAs减少60-70％(见图5A)，并将细胞培养上清液中病毒抗原(HBs和HBeAg)和HBV病毒粒子的分泌减少60-70％(见图5B)。IC8化合物还能够抑制HBV cccDNA在新生感染环境中的建立：在HBV接种之前和接种过程中(基因型C和D)在肝细胞中添加该分子可强有力地减少cccDNA的建立(分别减少70％和50％)，并且其他病毒标志物(即细胞内RNAs、HBeAg、HBsAg)在1C8处理条件下也减少了(图7A和B以及图8A和B)。
感染的肝细胞中的HBV cccDNA是所有病毒亚基因组转录本和前基因组RNA(pgRNA)的模板，负责持续的慢性感染和再激活，以确保新合成的病毒后代和cccDNA池通过细胞内核衣壳回收得到补充。在本发明的上下文中，首次表明SRSF10活性控制1)慢性感染细胞中细胞内HBV RNA(HBV总RNA和HBV前基因组RNA)的命运；和2)新生感染中cccDNA的建立。这些知识为减少HBV感染对象的新生cccDNA合成提供了机会，从而为彻底治愈慢性感染HBV患者提供了机会。
总而言之，这些结果表明，对SRSF10磷酸化的抑制可强烈地抑制肝细胞中的HBV感染，并且展现了一种引人注目的HBV感染新疗法。
因此，本发明涉及用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的SRSF10活性抑制剂。
在特定的实施方案中，所述抑制剂将SRSF10维持在去磷酸化状态，并防止或降低SRSF10的剪接活性。
在特定的实施方案中，SRSF10活性的抑制剂能够在被感染细胞中减少cccDNA和/或pgRNA。
如本文所使用的，术语“HBV感染”是指本技术领域公知的由乙型肝炎病毒(HBV)引起并影响肝脏的传染病。HBV感染可以是急性或慢性感染。有些感染者在初始感染时没有症状，而有些感染者发病迅速，伴有呕吐、皮肤发黄、疲劳、尿色深和腹痛("Hepatitis B Factsheet N°204".who.int，2014年7月，2014年11月4日检索)。这些症状通常会持续数周，并可能导致死亡。可能需要30到180天开始症状。在出生前后被感染的人中，有90％会发展成慢性乙型肝炎感染，而在五岁以后感染的人中，只有不到10％会发展成慢性乙型肝炎感染(“Hepatitis B FAQs for the Public-Transmission”,U.S.Centers for DiseaseControl and Prevention(CDC)，2011-11-29检索)。大多数患有慢性疾病的人没有症状；但最终可能会发展成肝硬化和肝癌(Chang,2007,Semin Fetal Neonatal Med,12:160-167)。这些并发症导致15-25％的慢性病患者死亡(“Hepatitis B Fact sheet N°204”.who.int.July 2014，2014年11月4日检索)。在本文中，术语“HBV感染”包括急性和慢性乙型肝炎感染。术语“HBV感染”还包括初始感染的渐进期、症状期以及HBV感染的渐进慢性期。
在特定的实施方案中，HBV感染是一种慢性感染。
乙型肝炎病毒(HBV)是一种有包膜的、部分双链的DNA病毒。紧凑的3.2kb HBV基因组由四个相互重叠的开放阅读框(ORF)组成，它们编码核心、聚合酶(Pol)、包膜和X蛋白。Pol ORF最长，并且包膜ORF位于其中，而X ORF和核心ORF与Pol ORF重叠。HBV的生命周期有两个主要事件：1)从松弛环状分子(RC DNA)产生封闭环状DNA(cccDNA)，以及2)前基因组RNA(pgRNA)的逆转录产生RC DNA。
如本文所使用的，术语cccDNA(共价闭合环状DNA)是某些DNA病毒在细胞核内增殖过程中产生的一种特殊DNA结构。cccDNA也被称为附加体DNA，或有时称为微染色体。cccDNA是典型的嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)，包括乙型肝炎病毒(HBV)。HBV基因组在肝细胞核中形成稳定的微染色体，即共价闭合的环状DNA(cccDNA)。cccDNA通过衣壳相关的松弛环状DNA(rcDNA)转化形成。HBV cccDNA的形成涉及一个多步骤过程，该过程需要细胞DNA修复机制，并依赖于与特定细胞成分的特异性相互作用，从而促进rcDNA中正链DNA的完成(Alweiss等，2017，Viruses，9(6)：156)。HBV基因组在肝细胞核中形成稳定的微染色体，即共价闭合的环状DNA(cccDNA)。cccDNA是由衣壳相关的松弛环状DNA(rcDNA)转化形成的。HBV cccDNA的形成涉及一个多步骤过程，该过程需要细胞DNA修复机制，并依赖于与不同的细胞成分的特异性相互作用，从而促进rcDNA中正链DNA的完成(Alweiss等，2017，Viruses，9(6)：156)。
如本文所用，术语“治疗”、“医治”等是指获得所需的药理和/或生理效果。该效果可以是预防性的，以完全或部分预防疾病或其症状的方式；和/或可以是治疗性的，以部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的不良影响的方式。如本文所使用的，“治疗”涵盖对施用对象的疾病的任何治疗，并且包括：(a)延长生存时间；(b)降低由于该疾病引起的死亡风险；(c)防止该疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的施用对象中；(d)抑制疾病，即阻止其发展(例如，降低疾病进展的速度)；以及(e)减轻疾病，即引起疾病消退。
如本文所使用的，术语“治疗”或“医治”既指预防或预防性治疗，也指治愈或疾病改变性治疗，包括对具有患疾病风险或怀疑患有疾病的患者以及患病或已被诊断为患有疾病或身体状况的施用对象的治疗，并包括抑制临床复发。可以向患有医学疾病或最终可能患有该疾病的施用对象进行治疗，以预防、治愈、延迟发作、减轻严重性，或改善一种或多种疾病或复发性疾病的症状，或为了延长施用对象的存活期，使其超过在没有这种治疗的情况下的预期。所谓“治疗方案”是指疾病的治疗方式，例如，治疗期间使用的给药方式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病的初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向施用对象提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)采用“加药方案”，该方案可以包括药物的剂量比医生在维持方案期间使用的更大，给药比医生在维持方案期间更频繁，或两者兼而有之。短语“维持方案”或“维持期”是指在疾病的治疗期间用于维持施用对象的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使施用对象长时间(数月或数年)处于缓解状态。维持方案可以采用连续治疗(例如，以固定的时间间隔给药，例如，每周、每月、每年等)或间歇治疗(例如，间断治疗、间歇治疗、复发时治疗或在达到特定的预定标准(例如疾病表现等)后进行治疗)。
因此，这里的“治疗HBV感染”包括治疗和预防施用对象中发生HBV感染，以及治疗和预防HBV感染的症状的发生。在本发明中，特别地考虑了预防来自HBV感染的母亲的儿童HBV感染。还考虑了预防急性HBV感染转变为慢性HBV感染。
术语“施用对象”和“患者”，在此可互换使用，指的是哺乳动物，特别是先前已被诊断患有纤维化间质性肺病如特发性肺纤维化或处于患有或发展为特发性肺纤维化的风险中的人。通常，特发性肺纤维化的诊断可以在肺活检后或通过使用高分辨率计算机断层扫描(HRCT)做出。
如本文所使用的术语“富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子10”或“SRSF10”具有其本领域的一般含义。SRSF10(也称为NSSR、TASR、SRp38、TASR1、TASR2、FUSIP1、FUSIP2、SFRS13、SRrp40、SFRS13A、PPP1R149)属于SR(丝氨酸/精氨酸)蛋白家族，是一组参与premRNA剪接的RBPs(RNA结合蛋白)。它在人类中由位于1号染色体上1p36.11处的基因(ID：10772)编码。SRSF10因其在有丝分裂期间和对热休克的应答中的脱磷酸化最初被鉴定为通用剪接阻遏物(Shin等，2004；Shin等，2005)。相反，磷酸化的SRSF10可以激活剪接，并且其磷酸化状态决定其与不同的RBPs如hnRNPs(hnRNPK，F和H)和TRA2B的相互作用(Shkreta等，2017；Shkreta等，2016)。重要的是，磷酸化的SRSF10会激活与应激、DNA损伤、细胞凋亡和致癌途径相关的几种细胞转录物的选择性剪接(Shkreta等，2016；Zhou等，2014a；Zhou等，2014b)。最后，SRSF10还在病毒premRNAs的剪接中发挥作用，特别是HIV-1转录本的剪接(Shkreta等，2017)。
SRSF10活性抑制剂
“SRSF10活性抑制剂”具有其在技术领域的一般含义，是指具有降低或抑制SRSF10的生物学活性的能力的化合物(天然的或非天然的)。在本申请中，所述化合物将SRSF10维持在去磷酸化状态，并阻止或降低SFR10的剪接活性。例如，该化合物可能以SRSF10无法激活病毒和细胞RNAs的剪接并与不同的RBPs结合的方式维持或阻滞SRSF10处于去磷酸化状态(参见Shkreta等，2017；Shkreta等，2016)。从而导致减少被感染细胞中的cccDNA和/或pgRNA。通常地，所述抑制剂是小的有机分子或生物分子(例如多肽、脂质、适配体、抗体……)。
所谓磷酸化的SRSF10的“生物活性”是指引发其在HBV感染细胞上的剪接活性，这与在感染细胞中建立cccDNA和/或pgRNA有关。
确定化合物作为SRSF10活性抑制剂的能力的测试是本领域技术人员众所周知的。在一个优选的实施方案中，该抑制剂特异性地将SRSF10维持在去磷酸化状态，以充分的方式抑制SRSF10的生物活性。将SRSF10维持在去磷酸化状态和抑制SRSF10的生物活性可以通过本领域众所周知的任何测定法来确定。例如，该测定法可以在于确定药剂改变SRSF10的磷酸化状态的能力。直接测量蛋白质磷酸化的经典方法包括用放射性标记的32P-正磷酸孵育整个细胞，生成细胞提取物，用SDS-PAGE分离蛋白质，并在薄膜上显露。其他传统方法包括二维凝胶电泳，这种技术假设磷酸化会改变蛋白质的迁移率和等电点。例如在Shkreta等2016和Shkreta等2017中，描述了SRSF10磷酸化状态的测定方法，基于去磷酸化形式的SRSF10在凝胶条件下与磷酸化形式相比具有更快的迁移率。液相色谱-质谱(LC-MS)也是评估SRSF10磷酸化状态的有用工具。Shkreta等2017也使用该测定法来确定IC8促进SRSF10在丝氨酸133处的去磷酸化。
然后可以安排竞争性测定，以确定该试剂抑制SRSF10的生物学活性的能力。可以设想功能测定法，以便评估诱导或抑制HBV感染细胞中与在感染细胞中建立cccDNA和/或pgRNA相关的剪接活性的能力(参见带有1C8化合物的实例和图7-8)。
本领域技术人员可以容易地确定SRSF10活性抑制剂是否中和、阻滞、抑制、消除、降低或干扰SRSF10的生物学活性。为了检查SRSF10活性抑制剂是否与最初表征的1C8化合物以相同的方式改变SRSF10的磷酸化状态和/或抑制SRSF10的剪接活性和/或抑制HBV感染细胞中的cccDNA和/或pgRNA，可以用每种抑制剂进行检测。例如，肝细胞中的HBV感染可以通过分析病毒参数如cccDNA定量和/或pgRNA定量来测量。对于cccDNA定量，总DNA用T5核酸外切酶(New England Biolabs)消化，然后使用Taqman Fast Advanced Master Mix(LifeTechnologies)进行qPCR。对于pgRNA定量，RT-qPCR可以使用Taqman Fast AdvancedMaster Mix(Life Technologies)进行。使用商业化探针引物混合物(Life Technologies#Hs99999908_m1)将PgRNA水平标准化为GUSB。
HBV感染也可以通过病毒参数的分析来进行测量，例如通过Elisa(化学发光免疫分析试剂盒Autobio)对分泌的HBe和HBs抗原进行定量分析(分泌的HBe和HBs抗原的水平是肝细胞HBV感染的标准分泌标志物)和/或如实施例部分所述使用特异性HBV引物通过qPCR或RT-qPCR评估从感染细胞中提取的细胞内总HBV DNA或RNA。
已经确定了抑制SRSF10的小分子与SRSF10在HIV中的作用有关；这样的SRSF10抑制剂也被预期为在治疗HBV的本发明中有用。特别是将这种小分子化合物，例如通过共轭接合或制剂，靶向到肝脏，可能对治疗HBV有利。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的活性抑制剂是小的有机分子，例如化合物1C8(或C8)：4-吡啶酮苯并异噻唑甲酰胺(参见Shkreta等2016和Shkreta等2017WO2015164956)或属于1C8的苯并异噻唑衍生物化合物(参见WO2015164956)。WO2015164956中公开的所有活性化合物在此通过引用并入本文。特别是以下化合物：
所有这些化合物均显示出抗HIV活性，尤其是活性最高的1C8化合物，该化合物在残基133处抑制SRSF10的磷酸化，从而调节其剪接活性。
在一个实施方案中，本发明还涉及用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的苯并异噻唑衍生物化合物。
该苯并异噻唑衍生物化合物在WO2015164956中公开，并在此以引用方式纳入。在一个优选的实施方案中，所述化合物选自由1C8、E5、D3、C2或SL309化合物所组成的列表。
在一个特定的实施方案中，本发明还涉及用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的化合物1C8(4-吡啶酮苯并异噻唑甲酰胺)或苯并异噻唑衍生物化合物(E5、D3、C2或SL309化合物)。
药物组合物
SRSF10活性的抑制剂可以与药学上可接受的赋形剂，以及任选的缓释基质，例如生物可降解的聚合物相组合，以形成治疗组合物。
在本发明的用于口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、局部、吸入或直肠给药的药物组合物中，活性成分，单独或与另一种活性成分组合，可以以单位给药形式，作为与常规药物载体的混合物，对动物和人类给药。合适的单位给药形式包括口服途径形式，例如片剂、凝胶胶囊、粉剂、颗粒剂和口服混悬剂或溶液剂、舌下和口腔给药形式、气雾剂、埋植剂、皮下、经皮、局部、腹膜内、肌肉内、静脉内、皮下、经皮、鞘内和鼻内给药形式以及直肠给药形式。
优选地，药物组合物包含赋形剂，这些赋形剂对于能够被注射的制剂是药学上可接受的。这些赋形剂尤其可以是等渗的、无菌的、盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、钠、钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，特别是冻干的组合物，这些赋形剂根据情况加入无菌水或生理盐水后，可以配制注射液。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；剂型包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。在所有情况下，该剂型必须是无菌的，并且必须是流动的，以便于注射。它在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须以防止例如细菌和真菌等微生物的污染的方式保存。
含有本发明化合物作为游离碱(free base)或药学上可接受的盐的溶液可以在水中与表面活性剂，如羟丙基纤维素适当混合制备。分散体也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物和油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以防止微生物的生长。
本发明的SRSF10活性抑制剂可以以中性或盐的形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成)，它是用例如盐酸或磷酸的无机酸形成的，或用例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸酸等有机酸形成的。用游离的羧基形成的盐类也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。
载体也可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。
通过将所需量的活性化合物与所列举的各种其他成分按要求加入适当的溶剂中，然后过滤灭菌，从而制备无菌注射溶液。通常，通过将各种已灭菌的活性成分加入到无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包含基本分散介质和以上列举的所需其他成分。在制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，它从先前的活性成分和任何其他所需成分的无菌过滤溶液中得到其粉末。
配制后，溶液将以与剂型相容的方式和治疗有效的量给药。该制剂容易以多种剂型施用，例如上述的注射液类型，但也可以使用药物释放胶囊等。
例如，对于在水溶液中的肠胃外给药，如果需要，溶液应该适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂呈等渗状态。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。在这方面，可以采用的无菌水介质，将是本领域的技术人员根据本公开内容所知晓的。例如，一个剂量可以溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并加入到1000ml皮下注射液中，或者在建议的输注部位注射。根据治疗对象的状况，剂量必然会出现一些变化。在任何情况下，负责给药的人将确定适合每个施用对象的剂量。
本发明的SRSF10活性或表达的抑制剂可配制在治疗混合物内，每剂约含0.0001至1.0毫克，或约0.001至0.1毫克，或约0.1至1.0或甚至约10毫克左右。也可以给予多个剂量。
除了为肠外给药，如静脉注射或肌肉注射而配制的本发明化合物外，其他药学上可接受的形式包括，例如片剂或其它口服给药的固体；脂质体制剂；缓释胶囊；以及当前使用的任何其他形式。
筛选方法
本发明还涉及一种筛选对治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染有用的多种候选化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)测试每种候选化合物抑制SRSF10活性的能力，以及(b)并并且阳性选择能够抑制所述SRSF10活性的候选化合物。
通常，候选化合物选自有机小分子、肽、多肽或寡核苷酸组成的组。
测试候选化合物是否可以抑制SRSF10活性可以使用本领域已知的报道基因检测方法或常规方法进行测定。
例如，该方法可以包括使表达SRSF10的细胞与候选化合物接触，并测量SRSF10的磷酸化状态(例如，SRSF10剪接活性的激活或抑制)，并将细胞应答与标准细胞应答进行比较。通常，标准细胞应答是在不存在候选化合物的情况下测量的。细胞应答比标准的减少表明该候选化合物是SRSF10的活性抑制剂。
已被阳性选择的候选化合物可进行进一步的选择步骤，以便进一步检测其在从患有HBV感染的施用对象中分离的肝细胞(或被HBV感染的dHeparRG细胞见Grippon等2002)上的特性。例如，已经通过上述筛选方法阳性选择的候选化合物可以被进一步选择，选择具有抑制HBV感染细胞中SRSF10剪接活性的能力或减少HBV感染细胞中cccDNA和/或pgRNA的能力。通常，筛选方法可以进一步包括以下步骤：i)使来自HBV感染患者的肝细胞与阳性选择的候选化合物接触；ii)确定所述HBV感染细胞中cccDNA和/或pgRNA的量；以及iii)将步骤ii)测定的ccDNA和/或pgRNA的量与在没有阳性选择的候选化合物的情况下进行步骤i)时测定的ccDNA和/或pgRNA的量进行比较。如上所述的步骤i)可以通过向肝细胞的培养基中加入一定量的待测候选化合物来进行。通常，准备多个培养样品，以便在不同的培养样品中添加增加量的待测试的候选化合物。通常，还制备至少一种不含候选化合物的培养样品作为阴性对照，以便进一步比较。
最后，可对已经被阳性选择的候选化合物进行进一步的选择步骤，在动物模型上进一步分析其对HBV感染的特性。通常，可以将阳性选择的候选化合物施用于动物模型，确定HBV感染的进展并与未施用候选化合物的动物模型中确定的HBV感染的进展进行比较。
将通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1、实验概述。处理方案：(a)感染前的处理：dHepaRG细胞用100nM PreS1肽(PreS1-pep)或10μM的1C8处理24h(在第1天)，或未经处理(NT)。在第0天，在药物存在下，用HBV(MOI＝250)或HDV(MOI＝25)接种细胞24小时。对于替诺福韦(Tenofovir)对照(TDF为10μM)，在感染后第1天和第4天处理细胞。在感染后第7天收获上清液和细胞。(b)感染后的处理：用HBV(MOI＝250)或HDV(MOI＝25)接种dHepaRG细胞。在感染后第4、7和9天，用TDF 10μM、拉米夫定(Lamivudine)(3TC)10μM、1C8 10μM处理细胞，或未处理的(NT)。在感染后第11天收获上清液和细胞。
图2、StepTag-HBc复合物的纯化程序示意图。HepaRG-TR-StrepTag-HBc细胞大量生长并分化(1亿个细胞)。四环素诱导后，回收细胞核，并用适当的缓冲液裂解(参见IBA方案)。细胞核部分用核酸酶处理(即消化DNA和RNA以避免核酸桥连)，要么不处理，然后通过StrepTactin色谱柱。将洗脱级分2送出进行LC-MS/MS分析
图3、相互作用组研究和初步验证的结果
图4、ST-HBc相关蛋白的富集度得分
图5、1C8在持续感染的dHepaRG细胞中的抗HBV特性：基因型D。将分化的HepaRG以100vge/cell的MOI感染HBV基因型D或以10vge/cell的MOI感染HDV基因型1感染7天，然后每2-3天以10mM的浓度用指示分子处理三次。(A)从细胞中提取总DNA和RNA，并进行qPCR和RTqPCR，以检测HBV cccDNA、总HBV RNA或前基因组HBV RNA。(B)通过ELISA定量上清液中的HBs和HBe分泌的抗原，从上清液中提取病毒核酸后，用qPCR定量检测病毒中含有的HBVDNA。(C)从细胞中提取总RNA后，通过RTqPCR定量检测细胞内HDV RNA。(D)通过
发光细胞活力测定法监测1C8处理(或对照处理；嘌呤霉素是阳性毒性分子)细胞的活力。结果为3种不同分化的HepaRG进行的n＝3的平均值+SEM。统计学上采用双尾Mann-Whitney检验，具有以下显著性：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。nd＝未确定
图6、1C8在持续感染的dHepaRG细胞中的抗HBV特性：基因型C。将分化的HepaRG以100vge/cell的MOI感染HBV基因型C，持续7天，然后每2-3天以10mM的浓度用指示分子处理三次。(A)从细胞中提取总DNA和RNA，并进行qPCR和RTqPCR，以检测HBV cccDNA、总HBV RNA或前基因组HBV RNA。(B)通过ELISA定量上清液中HBs和HBe分泌的抗原，而从上清液中提取病毒核酸后，通过qPCR定量测定病毒颗粒中的HBV DNA。结果为3种不同分化的HepaRG进行的n＝3的平均值+SEM。统计学上采用双尾Mann-Whitney检验，具有以下显著性：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。nd＝未确定。
图7、1C8对dHepaRG(基因型D)中cccDNA的新生建立的影响。分化的HepaRG需在接种前24小时和接种24小时内，以10mM(1C8和TDF)或100nM(Enth Inh。)的指示药物处理，然后以100vge/cell的MOI感染HBV基因型D或以10vge/cell的MOI感染HDV基因型1，持续7天。(A)从细胞中提取总DNA和RNA，并进行qPCR和RTqPCR，以检测HBV cccDNA、总HBV RNA或前基因组HBV RNA。(B)通过ELISA对上清液中HBs和HBe分泌的抗原进行定量，而从上清液中提取病毒核酸后，通过qPCR对病毒体中的HBV DNA进行定量。(C)从细胞中提取总RNA后，通过RTqPCR定量检测细胞内HDV RNA。结果为3种不同分化的HepaRG进行的n＝3的平均值+SEM。统计学上采用双尾Mann-Whitney检验，具有以下显著性：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。nd＝未确定。
图8、1C8对dHepaRG(基因型C)中cccDNA的新生建立的影响。分化的HepaRG在接种前24小时和接种24小时内，以10mM(1C8和TDF)或100nM(Enth Inh.)的指示药物处理，然后以100vge/cell的MOI感染HBV基因型C，持续7天。(A)从细胞中提取总DNA和RNA，并进行qPCR和RTqPCR，以检测HBV cccDNA、总HBV RNA或前基因组HBV RNA。(B)通过ELISA定量上清液中HBs和HBe分泌的抗原，而从上清液中提取病毒核酸后，通过qPCR定量测定病毒颗粒中的HBVDNA。结果为3种不同分化的HepaRG进行的n＝3的平均值+SEM。统计学上采用双尾Mann-Whitney检验，具有以下显著性：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。nd＝未确定。
图9、1C8对持续感染的原代人肝细胞的影响。在这些实验中使用了来自两个不同供体的两个不同批次的PHH(批次1：图A、B和C；批次2：图D和E)。(A)PHH以100vge/cell的MOI感染HBV基因型D，4天后，每2-3天用浓度为10mM的指定分子处理三次。(B)从细胞中提取细胞内总RNA并进行RT-qPCR以检测HBV pgRNA和总HBV RNA。(C)通过ELISA定量上清液中HBs和HBe分泌的抗原。(D)以100vge/cell的MOI用HBV基因型D感染PHH。感染后6天，用10mM浓度的指示分子处理细胞5次。每次处理后收集上清液，并在感染后第13天收集细胞。(E)通过ELISA定量上清液中HBe和HBs分泌的抗原。结果是n＝3(图A、B和C)或n＝4(图D和E)的平均值+SD。
实施例1
材料与方法：
野生型HepaRG、工程化HepaRG细胞的培养以及HBV感染的条件。
在补充有10％FBS(Perbio)、青霉素/链霉素(500U/mL)、谷氨酰胺(2mM)、氢化可的松Upjohn(2.5mg/L；Serb实验室)、胰岛素(5mg/L；Sigma Aldrich)的Williams培养基(ThermoFisher)中培养人肝祖HepaRG细胞。为进行分化过程，将2％的DMSO添加到上述补充了的Williams培养基中。如前所述(Gripon等，2002)分化后的HepaRG细胞(dHepaRG)感染由HepG2.2.15或HepAD38细胞制备的HBV基因型D接种物或由HepG2细胞制备的HBV基因型C(GenBank:KP017269.1)，该基因型C用线性化pcDNA3-HBV-1.35-基因组单元质粒稳定转染，并进行G418抗性选择。图例中表示了感染的多重性(MOI；表示为病毒基因组当量/细胞)，但如果不预处理，则为100vge/cell。
HepaRG-TR-StepTag-HBc细胞系是通过在表达盒中携带四环素抑制因子(TR)的细小病毒进行双重转导而产生的，该表达盒可以对杀稻瘟菌素(Blasticidine)具有抗性并携带StrepTag-HBc基因，其在可以抗博来霉素的表达盒中编码N端带有StrepTag的HBV核心/衣壳蛋白。将HepaR-TR-StrepTag-HBc细胞在含有100mg/ml博来霉素和10mg/ml杀稻瘟菌素的相同Williams培养基中培养。四环素也被添加到培养基中(1mg/mL)以获得转基因的表达，即StepTag-HBc。
StrepTag纯化
IBA的
系统采用Strep-Tactin亲和柱树脂，是目前应用最广泛的用于蛋白质纯化检测和固定的亲和层析系统之一，并具有许多优势，包括经过生理纯化过程(在有利于蛋白质与蛋白质相互作用的缓冲液条件下)，分离出的复合物纯度高。纯化所使用的程序是制造商推荐的程序，可在网上查询：www.ibalifesciences.com/strep-tactin-system-technology.html。
化学试剂。IC8由Benoit Chabot博士提供。用于抑制HBV进入的PreS1肽(HBVPreS1的第2至48个氨基酸序列，TNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFRANSNNPDWDFNPNKDHWPWPEANKVG(SEQ ID N°1)，在N端用肉豆蔻酰基修饰，并重悬于标准盐酸盐中)由Genscript(Honk-Hong)合成。核苷类似物、拉米夫定(Lamivudine)和替诺福韦(Tenofovir)由GileadSciences提供。用于确定这些分子的抗HBV活性的两种实验方案见图1。
细胞毒性测定
如图1所示的实验方案，在HepaRG细胞中测量细胞毒性，用Promega公司的“
Luminescent Cell Viability Assay”，按照制造商的说明进行药物处理。
病毒参数的分析
从细胞培养上清液中，使用化学发光免疫分析试剂盒(Autobio，中国)按照制造商的说明，通过ELISA对分泌的HBe和HBs抗原进行定量。根据制造商的规程，分别使用MagMAx试剂盒(Thermo scientific)和MagNAPure(Roche)从细胞培养上清液中提取细胞外病毒DNA，并用DNAse-I或RNAse-A处理。分别使用Nucleospin 96Tissue或NucleoSpin 96RNA试剂盒(Macherey-Nagel)从感染的细胞中提取细胞内总HBV DNA或RNA。使用SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen)将RNAs转录为cDNA。使用LightCycler480(Roche)对总细胞内HBV DNA和来自RNA的cDNA进行实时PCR，并管家基因进行归一化，利用以下引物：5'-GCTGACGCAACCCCCACT-3'(HBV正义链：SEQ ID N°2)和5'-AGGAGTTCCGCAGTATGG-3'(HBV反义链：SEQ ID N°3)、5'-TGCTGGGAAGTGCCATGAG-3'(PRP正义链：SEQ ID N°4)和5'-CGGTGCATGTTTTCTCACGATAGTA-3'(PRP反义链：SEQ ID N°5)。
HBV标准品用于细胞外病毒DNA和RNA的定量。对于cccDNA的定量，将总DNA用T5核酸外切酶(New England Biolabs)在37℃下消化6小时，然后使用Taqman Fast AdvancedMaster Mix(Life Technologies)进行qPCR。用β-球蛋白定量将CccDNA归一化。对于pgRNA定量，使用Taqman Fast Advanced Master Mix(Life Technologies)使用自制的探针引物混合物进行qPCR。使用商业探针引物混合物(Life Technologies#Hs99999908_m1)将PgRNA水平归一化为GUSB。
统计学分析。使用GraphPad Prism软件6.0用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析。显著性如下：*P<.05，**P<.01，***P<.001，****P<.0001。
结果：
SRSF10是HBV核心/衣壳蛋白的主要相互作用物
HBV的核心/衣壳蛋白(HBc)是一种结构蛋白，在细胞质区间内对HBV前基因组RNA的封装起作用。封装后，pgRNA被逆转录为松弛的环状DNA(rcDNA)，这是在病毒粒子中发现的HBV的基因组形式。除这种结构功能外，HBc还具有潜在的其他非结构性调节功能，它在高度复制的肝细胞中积累，特别是在受感染细胞的核中。为了深入了解HBc的核功能，我们对四环素诱导的HepaRG-TR-StrepTag-HBc细胞核中的StepTag-HBc相关蛋白复合物进行了质谱分析。该程序的示意图如图2所示。
进行了三个独立的实验，以提高分析的统计能力。在核酸酶(-)和核酸酶(+)的条件下，分别发现了44个和58个HBc相互作用蛋白(p值<0.005，且富集因子>4)。在两组条件之间有37种蛋白质是共有的。这些蛋白质的列表在图3中给出。
许多HBc相互作用蛋白被发现是参与RNA代谢的RNA结合蛋白(preRNA成熟、剪接、RNA运输……)。在这些蛋白质中，我们对SFSF10产生了兴趣，SFSF10是最丰富的StrepTag-HBc相关因子之一，即使存在核酸酶的作用下也是如此(图4)。正如引言部分所指出的，该蛋白质也被发现对HIV复制很重要。而有趣的是，先前已描述了一些具有抑制特性的小分子，其中包括1C8。
1C8在复制HBV的dHepaRG细胞中的抗HBV特性
我们用两种不同的实验方案分析了1C8的潜在抗HBV特性(图1)。在持续感染(HBV基因型D；MOI为100vge/cell)的dHepaRG中，每2-3天用10mM的1C8或对照分子治疗3次，我们发现1C8是唯一能够降低60-70％细胞内HBV RNA积累的药物，而FDA批准的核苷类似物(NUC；拉米夫定(Lamivudine)(3TC)和替诺福韦(Tenofovir)(TDF))不能影响这种病毒参数(图5A)。测试的分子均无法降低HBV的cccDNA。1C8还能够将细胞培养上清液中的病毒抗原(HBs和HbeAg)和HBV病毒粒子(按图5B中的分泌的HBV DNA测量)的分泌减少60-70％；这次也发现了NUCs对HBV病毒粒子的产生有预期的强抑制作用(图5B)。1C8不能抑制丁型肝炎病毒在相同细胞中的复制(图5C)。1C8对通过
发光细胞活力测试法测试的40mM以下的细胞没有毒性(图5D)，因此证明了抗病毒作用对HBV复制的特异性。
HBV以各种基因型存在。在评估宿主靶向制剂(HTA；即抑制细胞功能的分子，这对病毒复制很重要，从而导致抗病毒作用)时，如1C8，重要的是检查HTA的抗病毒特性在基因型之间是否保守。因此，我们评估了1C8对一种主要在亚洲流行的基因型C型病毒复制的影响。我们发现，1C8保留了对该病毒株的抗病毒特性，尽管功效略有降低(图6)。
1C8也损害了原始(naive)dHepaRG中HBV感染的建立
在第二种实验方法中，我们试图确定1C8是否会像进入抑制因子(Li and Urban，2016)或核心组装调节因子(CAMs)(Berke等人，2017)一样，破坏dHepaRG细胞中HBV感染的建立。进入抑制因子，如PreS1肽(例如Myrcludex)，通过阻止HBV病毒体与其细胞受体人类牛磺胆酸钠共转运肽(hNTCP)之间的相互作用，抑制HBV进入肝细胞。CAMs主要是为了抑制衣壳化过程而开发的，也被证明是通过作用于后进入水平来阻止cccDNA的建立，在某种程度上干扰了核苷酸向新感染肝细胞核的进入后运输。相反，临床使用的NUCs不会干扰HBV感染的建立。由于1C8的抗HBV抑制机制尚不清楚，我们在HBV接种前和接种过程中用该分子处理细胞，以确定其是否可以阻止cccDNA池的建立以及随后其他病毒成分的合成/产生。我们发现，在10mM的1C8能够抑制50％的HBV基因型D的cccDNA的建立(图8A)和70％HBV基因型C的cccDNA的建立(图8A)。
这种1C8诱导的抑制作用低于进入抑制剂获得的抑制作用，但高于NUC(替诺福韦；TDF)获得的抑制作用。在抑制cccDNA的建立后，其他病毒标志物(即细胞内RNAs、HbeAg、HbsAg)在1C8处理的条件下也减少了(图7A和B和图8A和B)。在平均时间内，采用相同的实验设定(即接种前24h和接种过程中的处理)，1C8无法阻断HDV感染的建立(对照品Entry Inh.可抑制HDV感染)，因此再次表明了1C8对HBV的作用具有特异性(图7C和8C)。
实施例2
材料与方法：
原代人类肝细胞(PHH)的培养，以及HBV感染的情况。
如前所述(Leycluse和Alexandre，2010年)原代人类肝细胞(PHH)由来自具有法国部级授权的Centre Léon Bérard(里昂)的人类肝脏切除物新鲜的制备。它们在Williams培养基(Thermofisher)中培养，补充有5％的FBS(Perbio)、青霉素/链霉素(500U/mL)、谷氨酰胺(2mM)、氢化可的松Upjohn(2.5mg/L；Serb实验室)和胰岛素(5mg/L；Sigma Aldrich)。PHH按先前描述的方法(Gripon等，2002)，用HBV基因型D接种物以100vge/cell从HepAD38细胞(GenBank：KP017269.1)制备。感染16小时后，洗涤细胞。感染后6天，用浓度为10μM的替诺福韦(TDF)、拉米夫定(3TC)或1C8处理细胞。每次处理后收获上清液，感染后13天收获细胞。
病毒参数分析。
如实施例1所述，分析分泌的HBe和HBs抗原以及细胞内HBV RNA。
统计学分析。使用GraphPad Prism软件6.0用非参数Mann-Whitney检验进行统计学分析。显著性如下：*P<.05，**P<.01，***P<.001，****P<.0001。
结果
1C8可抑制原代人类肝细胞中的HBV复制
对持续感染的PHH也同样测试了1C8的抑制作用。为此，从两个不同供体获得两个不同批次的PHH感染HBV(HBV基因型D；MOI为100vge/cell)，然后用10mM 1C8或对照分子按照两种不同方案进行处理(图9A和D)。对分泌的病毒抗原HBe和HBs的分析表明，用1C8进行治疗会导致病毒复制的稳健下降(>60％的减少)(图9B和D)。正如预期的那样，这些参数不受3TC的影响，3TC是一种靶向HBV pgRNA逆转录的核苷类似物。细胞内病毒RNAs(总RNA和pgRNA)的定量进一步表明，正如先前在HepaRG细胞中观察到的(图6A)，将1C8加入到HBV感染的PHH中导致病毒RNAs的量显著减少(图9C)。
在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所涉及的技术水平。这些参考文献的公开内容在此通过引用结合到本公开中。
参考文献：
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序列表
<110> INSERM（法国国家健康医学研究院）
里昂克罗德·贝尔那大学-里昂第一大学
法国国家科学研究中心（CNRS）
利昂贝拉尔中心
英属哥伦比亚大学
健康与人类科学公司
<120> 治疗乙型肝炎病毒（HBV）感染的方法
<130> 18098INS
<150> EP18305398.2
<151> 2018-04-04
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> PreS1 peptide (aa sequence 2 to 48 of HBV PreS1)
<400> 1
Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln
1 5 10 15
Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe
20 25 30
Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primers HBV sense
<400> 2
gctgacgcaa cccccact 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primers HBV antisense
<400> 3
aggagttccg cagtatgg 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer PRP sens
<400> 4
tgctgggaag tgccatgag 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer PRP-antisens
<400> 5
cggtgcatgt tttcacgata gta 23
Claims (9)
1.一种用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的SRSF10活性抑制剂。
2.根据权利要求1使用的抑制剂，其中，所述HBV感染是慢性感染。
3.根据权利要求1或2使用的抑制剂，其中，所述抑制剂使SRSF10维持在去磷酸化状态，并防止或降低SFR10的剪接活性。
4.根据权利要求1-3中任意一项使用的所述SRSF10活性抑制剂，其中，所述抑制剂能够在被感染细胞中减少cccDNA和/或pgRNA。
5.根据权利要求1-3中任意一项使用的所述SRSF10活性抑制剂，其中，所述活性抑制剂是选自由1C8、E5、D3、C2或SL309化合物所组成的列表的有机小分子。
6.根据权利要求5使用的所述SRSF10活性抑制剂，其中，有机小分子是1C8化合物。
7.一种用于筛选可用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的多种候选化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)测试每种候选化合物抑制SRSF10活性的能力，以及(b)并且阳性选择能够抑制所述SRSF10活性的候选化合物。
8.用于对有需要的施用对象治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法的药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任意一项所述的SRSF10活性抑制剂。
9.一种用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的化合物1C8(4-吡啶酮苯并异噻唑甲酰胺)或苯并异噻唑衍生物化合物(E5、D3、C2或SL309化合物)。
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