JP2003521249A - 薬剤に対して改変された感受性を示す変異型ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）を検出する検定法 - Google Patents
薬剤に対して改変された感受性を示す変異型ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）を検出する検定法Info
- Publication number
- JP2003521249A JP2003521249A JP2001555867A JP2001555867A JP2003521249A JP 2003521249 A JP2003521249 A JP 2003521249A JP 2001555867 A JP2001555867 A JP 2001555867A JP 2001555867 A JP2001555867 A JP 2001555867A JP 2003521249 A JP2003521249 A JP 2003521249A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hbv
- mutant
- virus
- cell
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title claims abstract description 373
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 51
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 87
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 74
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 63
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 57
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 68
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 65
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 43
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 41
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 41
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 32
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 31
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 21
- WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N adefovir depivoxil Chemical compound N1=CN=C2N(CCOCP(=O)(OCOC(=O)C(C)(C)C)OCOC(=O)C(C)(C)C)C=NC2=C1N WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 18
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 11
- -1 nucleoside triphosphate analog Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 229940123014 DNA polymerase inhibitor Drugs 0.000 claims description 7
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical class 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 12
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 166
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 61
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- JNTOCHDNEULJHD-UHFFFAOYSA-N Penciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(CCC(CO)CO)C=N2 JNTOCHDNEULJHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 18
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 16
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 15
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 14
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 13
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- 229960001997 adefovir Drugs 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 5
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 5
- 229960001179 penciclovir Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108700024845 Hepatitis B virus P Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 4
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 102100031561 Hamartin Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 description 2
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091036055 CccDNA Proteins 0.000 description 2
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001940 Massive Hepatic Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 2
- 101150075200 S-2 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 2
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMOLAGKJZFODRK-UHFFFAOYSA-N 2-phenylprop-2-enamide Chemical class NC(=O)C(=C)C1=CC=CC=C1 IMOLAGKJZFODRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 229940127399 DNA Polymerase Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 102000016559 DNA Primase Human genes 0.000 description 1
- 108010092681 DNA Primase Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101100321669 Fagopyrum esculentum FA02 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 206010019772 Hepatitis fulminant Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 229940122426 Nuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229940123066 Polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150027674 S1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- YSGAPESOXHFTQY-IHRRRGAJSA-N Tyr-Met-Asp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N YSGAPESOXHFTQY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- YLEQMGZZMCJKCN-NKWVEPMBSA-N [[(2r,5s)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-1,3-oxathiolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC1 YLEQMGZZMCJKCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 231100000354 acute hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000000797 effect on infection Effects 0.000 description 1
- 208000014616 embryonal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000006451 grace's insect medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000004248 saffron Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、一般的に、薬剤に対して改変された感受性を示す変異型Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を検出する検定法に関する。この変異型ＨＢＶはバキュロウイルスベクターを用いて細胞に送達される。この同じ薬剤は一般に対照のＨＢＶに対して特定の効果を持ち又は効果を持たない。この改変された感受性はウイルスの感染、複製、組立、及び／又は放出の過程の間のどの中間段階をも含むウイルス又はウイルス様粒子の感染、複製、組立、又は放出の一以上の段階に対する該薬剤の効果に関するものである。抗ＨＢＶ剤に対する感受性が改変された変異型ＨＢＶの同定により、交差耐性を監視する手段、又は他の抗ＨＢＶ剤に対する感受性が変化した変異型ＨＢＶに対して効果的な新規な治療法の開発、並びに適切な抗ＨＢＶ剤の投与が保証されるように改良する必要のある治療法を監視することが可能となる。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、薬剤に対して改変された感受性を示す変異型Ｂ型肝炎ウ
イルス（ＨＢＶ）を検出する検定法に関する。該変異型ＨＢＶはバキュロウイル
スベクターを用いて細胞に送達される。この同じ薬剤は一般に対照のＨＢＶに対
して特定の効果を持っていたり持っていなかったりする。この改変された感受性
は、ウイルスの感染、複製、組立、及び／又は放出の過程の間のどの中間段階を
も含むウイルス又はウイルス様粒子の感染、複製、組立、又は放出の一以上の段
階に対する該薬剤の効果に関するものである。抗ＨＢＶ剤に対する感受性が改変
された変異型ＨＢＶの同定により、交差耐性を監視する手段や他の抗ＨＢＶ剤に
対する感受性が変化した変異型ＨＢＶに対する効果的な新規治療法の開発が可能
になり、更には適切な抗ＨＢＶ剤が投与されること又は適切な治療法が実施され
ることを保証するために改良する必要のある治療法の監視が可能となる。本発明
はさらに本発明の検定法により検出されるＨＢＶ変異型及びその成分並びに該成
分の組換え体、化学アナログ、同族体及び誘導体形を提供する。
イルス（ＨＢＶ）を検出する検定法に関する。該変異型ＨＢＶはバキュロウイル
スベクターを用いて細胞に送達される。この同じ薬剤は一般に対照のＨＢＶに対
して特定の効果を持っていたり持っていなかったりする。この改変された感受性
は、ウイルスの感染、複製、組立、及び／又は放出の過程の間のどの中間段階を
も含むウイルス又はウイルス様粒子の感染、複製、組立、又は放出の一以上の段
階に対する該薬剤の効果に関するものである。抗ＨＢＶ剤に対する感受性が改変
された変異型ＨＢＶの同定により、交差耐性を監視する手段や他の抗ＨＢＶ剤に
対する感受性が変化した変異型ＨＢＶに対する効果的な新規治療法の開発が可能
になり、更には適切な抗ＨＢＶ剤が投与されること又は適切な治療法が実施され
ることを保証するために改良する必要のある治療法の監視が可能となる。本発明
はさらに本発明の検定法により検出されるＨＢＶ変異型及びその成分並びに該成
分の組換え体、化学アナログ、同族体及び誘導体形を提供する。
【０００２】
発明の背景
本明細書におけるいずれの先行技術についての言及も、この先行技術がオース
トラリア又は任意の他国での一般的常識の一部をなすという認識又は任意形式の
示唆ではなく、そのように解釈されるべきではない。
トラリア又は任意の他国での一般的常識の一部をなすという認識又は任意形式の
示唆ではなく、そのように解釈されるべきではない。
【０００３】
本明細書において数字で言及される刊行物の書誌的詳細は本記載の終わりにまと
めて付記する。
めて付記する。
【０００４】
アミノ酸配列の特定の突然変異は本明細書において「Xaa1nXaa2」と表される
。ここでXaa1は突然変異前の元のアミノ酸残基であり、ｎは残基の番号であり、
Xaa2は突然変異後のアミノ酸である。略語「Xaa」は三文字又は一文字のアミノ
酸コードであってよい。一文字コードの突然変異は例えばX1nX2と表される。こ
こでX1及びX2はそれぞれXaa1及びXaa2と同一である。Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ酸残基は番号がつけられており、モチーフ「Tyr Met Asp
Asp (YMDD)」におけるメチオニン残基は、残基番号が５５０である。
。ここでXaa1は突然変異前の元のアミノ酸残基であり、ｎは残基の番号であり、
Xaa2は突然変異後のアミノ酸である。略語「Xaa」は三文字又は一文字のアミノ
酸コードであってよい。一文字コードの突然変異は例えばX1nX2と表される。こ
こでX1及びX2はそれぞれXaa1及びXaa2と同一である。Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ酸残基は番号がつけられており、モチーフ「Tyr Met Asp
Asp (YMDD)」におけるメチオニン残基は、残基番号が５５０である。
【０００５】
本明細書において、対照のＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型のＡからＧまでの混成又
は共通のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含むと考えられる（１、２）。
は共通のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含むと考えられる（１、２）。
【０００６】
組換えＤＮＡ技術の急速に高まる精巧性は、医学分野及び関連する保健分野の
進歩を非常に促進している。これはとりわけ治療用組成物及び組換えワクチンの
作製の場合にそうである。組換え技術は治療用組成物に有用な成分をスクリーニ
ング又は同定するための遺伝的基礎を提供する。
進歩を非常に促進している。これはとりわけ治療用組成物及び組換えワクチンの
作製の場合にそうである。組換え技術は治療用組成物に有用な成分をスクリーニ
ング又は同定するための遺伝的基礎を提供する。
【０００７】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、準臨床的な感染から活動性慢性肝炎までに及
ぶ消耗性の病状を惹起でき、急性肝不全又は劇症肝炎に至らせることができる。
ぶ消耗性の病状を惹起でき、急性肝不全又は劇症肝炎に至らせることができる。
【０００８】
ほとんどの患者は、該ウイルスが除去されるまでの間、急性肝炎を患う。劇症
肝炎において、患者は急性肝不全に罹り、これはしばしば患者を死に至らしめる
。北米及び欧州の患者の約５％は該ウイルスを除去できない一方、西アフリカで
は感染患者の１５％までがＨＢＶを排除できない（３）。潜伏期の長いＨＢＶ感
染により、該宿主は慢性肝疾患及び肝細胞癌になりやすくなる（４）。
肝炎において、患者は急性肝不全に罹り、これはしばしば患者を死に至らしめる
。北米及び欧州の患者の約５％は該ウイルスを除去できない一方、西アフリカで
は感染患者の１５％までがＨＢＶを排除できない（３）。潜伏期の長いＨＢＶ感
染により、該宿主は慢性肝疾患及び肝細胞癌になりやすくなる（４）。
【０００９】
該ＨＢＶゲノムは、環状で且つ部分的に二重鎖のＤＮＡ分子に一連の重なり合
う遺伝子を含む（５）[図１も参照せよ]。これらの遺伝子は四つの重なり合うオ
ープン・リーディング・フレームをコードしている。例えば、該ＤＮＡポリメラ
ーゼをコードする遺伝子は、該ウイルスのエンベロープ遺伝子（プリＳ１、プリ
Ｓ２及びＳ）と重なり合い、部分的にＸ遺伝子及びコア遺伝子と重なり合う。小
さなＨＢＶ表面タンパク質のタンパク質成分は通常ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ
）と呼ばれＳ遺伝子配列によりコードされる。該プリＳ１遺伝子配列及び該プリ
Ｓ２遺伝子配列は他のエンベロープ成分をコードする（６）。該コアのオープン
・リーディング・フレームは該Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）及びＨＢ
ｅＡｇの両方をコードし、ＨＢｅＡｇはプリコアの開始コドンから始まる。変異
型ＨＢＶは一つ以上のオーバーラップ遺伝子に単数又は複数の突然変異を持つこ
とができる。
う遺伝子を含む（５）[図１も参照せよ]。これらの遺伝子は四つの重なり合うオ
ープン・リーディング・フレームをコードしている。例えば、該ＤＮＡポリメラ
ーゼをコードする遺伝子は、該ウイルスのエンベロープ遺伝子（プリＳ１、プリ
Ｓ２及びＳ）と重なり合い、部分的にＸ遺伝子及びコア遺伝子と重なり合う。小
さなＨＢＶ表面タンパク質のタンパク質成分は通常ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ
）と呼ばれＳ遺伝子配列によりコードされる。該プリＳ１遺伝子配列及び該プリ
Ｓ２遺伝子配列は他のエンベロープ成分をコードする（６）。該コアのオープン
・リーディング・フレームは該Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）及びＨＢ
ｅＡｇの両方をコードし、ＨＢｅＡｇはプリコアの開始コドンから始まる。変異
型ＨＢＶは一つ以上のオーバーラップ遺伝子に単数又は複数の突然変異を持つこ
とができる。
【００１０】
このＨＢＶのＤＮＡ（以下ＨＢＶ・ＤＮＡと略記する）ポリメラーゼは、逆転
写酵素（即ち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）であり、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ
ポリメラーゼ並びにプライマーゼ及びＲＮアーゼＨの活性も有する。ヌクレオシ
ドアナログ類はＨＢＶのＤＮＡ複製を阻害するために用いられてきた。しかしな
がら、ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に突然変異が生じ、該ヌ
クレオシドアナログに耐性のある変異型ＨＢＶが発生する。耐性は一つのヌクレ
オシドアナログに生じうるし、交差耐性はヌクレオシドアナログの全ファミリー
にも生じうる。さらに、該突然変異がＨＢｓＡｇをコードする遺伝子と重なり合
う領域に生じた場合、該ＨＢｓＡｇ自体に変化が起きワクチン回避突然変異体が
発生しうる。
写酵素（即ち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）であり、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ
ポリメラーゼ並びにプライマーゼ及びＲＮアーゼＨの活性も有する。ヌクレオシ
ドアナログ類はＨＢＶのＤＮＡ複製を阻害するために用いられてきた。しかしな
がら、ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に突然変異が生じ、該ヌ
クレオシドアナログに耐性のある変異型ＨＢＶが発生する。耐性は一つのヌクレ
オシドアナログに生じうるし、交差耐性はヌクレオシドアナログの全ファミリー
にも生じうる。さらに、該突然変異がＨＢｓＡｇをコードする遺伝子と重なり合
う領域に生じた場合、該ＨＢｓＡｇ自体に変化が起きワクチン回避突然変異体が
発生しうる。
【００１１】
幾つかのプリコア変異型ＨＢＶはＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）が陰性のＢ型
肝炎を生じる。世界中で慢性ＨＢＶに感染した患者の７％から３０％はＨＢｅＡ
ｇが陰性であり且つ市販の試験を用いたハイブリダイゼーションによりＨＢＶ・
ＤＮＡは陽性である。このような変異体の一つはＨＢｅＡｇを合成できない。ヌ
クレオチド１８９６（Ａ1896；ユニークなＥｃｏＲＩ部位から数えて）での単塩
基置換（ＧからＡ）は、プリコア遺伝子の最後から二番目のコドン（コドン２８
）に翻訳停止コドンを生じる。他のプリコア及び基底コアプロモーター（ＢＣＰ
）の突然変異を表１に記載する。該コア遺伝子自体は影響されないため、該コア
タンパク質の合成は正常に続行しビリオンを生産できる。プリコアのＡ1896の突
然変異は軽病の抗ＨＢｅ陽性患者と高レベルのウイルス血症及び重篤な慢性肝炎
の患者との両方に起こる。これは慢性の進行性疾患と直接的な因果関係がないこ
とを示唆する。しかしながら、プリコア突然変異ウイルスの感染は劇症肝炎及び
移殖の硬化、移殖の失敗と関連している（１５）。
肝炎を生じる。世界中で慢性ＨＢＶに感染した患者の７％から３０％はＨＢｅＡ
ｇが陰性であり且つ市販の試験を用いたハイブリダイゼーションによりＨＢＶ・
ＤＮＡは陽性である。このような変異体の一つはＨＢｅＡｇを合成できない。ヌ
クレオチド１８９６（Ａ1896；ユニークなＥｃｏＲＩ部位から数えて）での単塩
基置換（ＧからＡ）は、プリコア遺伝子の最後から二番目のコドン（コドン２８
）に翻訳停止コドンを生じる。他のプリコア及び基底コアプロモーター（ＢＣＰ
）の突然変異を表１に記載する。該コア遺伝子自体は影響されないため、該コア
タンパク質の合成は正常に続行しビリオンを生産できる。プリコアのＡ1896の突
然変異は軽病の抗ＨＢｅ陽性患者と高レベルのウイルス血症及び重篤な慢性肝炎
の患者との両方に起こる。これは慢性の進行性疾患と直接的な因果関係がないこ
とを示唆する。しかしながら、プリコア突然変異ウイルスの感染は劇症肝炎及び
移殖の硬化、移殖の失敗と関連している（１５）。
【００１２】
該ＨＢｓＡｇは「ａ」決定基と呼ばれる抗原性領域を含む（７）。この「ａ」
決定基は、複合体であり、立体配座であり、並びに高度に保存されたシステイン
残基間のジスルフィド結合に依存している。「ａ」決定基の変化を導く遺伝的変
異は従来のワクチンに対して生じる免疫学的応答を回避するＨＢＶの突然変異と
関わっている（８〜１２）。特によくある突然変異の一つはＨＢｓＡｇのアミノ
酸位置１４５でのグリシン（Ｇ）からアルギニン（Ｒ）への置換（Ｇ１４５Ｒ）
である。この突然変異は「ａ」エピトープ領域に影響を及ぼす。
決定基は、複合体であり、立体配座であり、並びに高度に保存されたシステイン
残基間のジスルフィド結合に依存している。「ａ」決定基の変化を導く遺伝的変
異は従来のワクチンに対して生じる免疫学的応答を回避するＨＢＶの突然変異と
関わっている（８〜１２）。特によくある突然変異の一つはＨＢｓＡｇのアミノ
酸位置１４５でのグリシン（Ｇ）からアルギニン（Ｒ）への置換（Ｇ１４５Ｒ）
である。この突然変異は「ａ」エピトープ領域に影響を及ぼす。
【００１３】
ＨＢＶ感染の治療又は予防に際して、化学的介入及び免疫学的介入への依存が
増大することから、干渉主義治療に抵抗する変異型ＨＢＶの出現に対してはより
強い選択圧がかかる結果となる。ＨＢＶの重なり合うゲノム構造のため、変異型
ＨＢＶは化学薬剤又はワクチンの使用により直接的又は間接的に選択されうる。
増大することから、干渉主義治療に抵抗する変異型ＨＢＶの出現に対してはより
強い選択圧がかかる結果となる。ＨＢＶの重なり合うゲノム構造のため、変異型
ＨＢＶは化学薬剤又はワクチンの使用により直接的又は間接的に選択されうる。
【００１４】
治療法を変更するために適切な手段が採択できるように変異型ＨＢＶを検出で
きることが重要である。これは、既知の耐性変異型ＨＢＶに対して有効な新規の
治療薬剤の開発にもとりわけ重要であり、化学的に関連性のある抗ウイルス薬剤
のファミリーの中で交差耐性が現れる場合にも重要である。
きることが重要である。これは、既知の耐性変異型ＨＢＶに対して有効な新規の
治療薬剤の開発にもとりわけ重要であり、化学的に関連性のある抗ウイルス薬剤
のファミリーの中で交差耐性が現れる場合にも重要である。
【００１５】
ＨＢＶバキュロウイルスが媒介するＨＢＶ複製は、一過性のシステムであり、
ＨＢＶウイルスゲノムの組込みを必要としない。このシステムは最近デラニーら
（１３、１４）により記述された。該ＨＢＶバキュロウイルス系はＨＢＶを発現
する標準的な一過性トランスフェクション系及び細胞系統を凌ぐ幾つかの利点を
有する。
ＨＢＶウイルスゲノムの組込みを必要としない。このシステムは最近デラニーら
（１３、１４）により記述された。該ＨＢＶバキュロウイルス系はＨＢＶを発現
する標準的な一過性トランスフェクション系及び細胞系統を凌ぐ幾つかの利点を
有する。
【００１６】
ＨＢＶ複製の研究及びＨＢＶに対する治療薬剤の開発において、ＨＢＶ・ＤＮ
Ａを発現できる幾つかの細胞系統が開発されてきた。しかしながら、これらの細
胞系統は、天然で感染した細胞の状態に似ていそうにない異型プロモーター又は
異型調節配列の制御下でのＨＢＶ・ＤＮＡ配列を用いて開発された。
Ａを発現できる幾つかの細胞系統が開発されてきた。しかしながら、これらの細
胞系統は、天然で感染した細胞の状態に似ていそうにない異型プロモーター又は
異型調節配列の制御下でのＨＢＶ・ＤＮＡ配列を用いて開発された。
【００１７】
更に、ＨＢＶを研究するために通常用いられる細胞系統は組込まれたＨＢＶ・
ＤＮＡの多重コピーを含む。ヘパドナウイルスゲノムはエピソーム状の共有結合
で閉鎖された環状（ＣＣＣ）ＤＮＡ分子のプールとしてインビボで感染細胞の核
に保持される。ヒトの肝臓におけるＨＢＶ・ＤＮＡの組込みが報告されてきたが
、これは該ＨＢＶの生活環の必須部分ではなく、組み込みはＨＢＶの複製に必要
ではない。さらに、組込まれたＨＢＶ・ＤＮＡが見出される場合、それはしばし
ば再配列されており大抵転写が休止している。ＨＢＶを発現する細胞系統は安定
に組込まれたＨＢＶ・ＤＮＡを含むため、ウイルス遺伝子の発現及び複製は連続
的であり、従って、これらの過程が開始される時間又は条件を実験的に制御する
ことはできない。安定なＨＢＶを発現する細胞系統は一定数の通常頭−尾方向で
組込まれたＨＢＶゲノムを含み、その状態ではＨＢＶ遺伝子の発現及び複製のレ
ベルは調節され得ず、各細胞系統が含む組込コピーの数に制限される。従って、
該細胞系統にトランスフェクションすること及び／又は新規な細胞系統を選択す
ることなしには、組込まれたＨＢＶゲノムのコピー数を増加又は減少させる影響
を研究することはできない。
ＤＮＡの多重コピーを含む。ヘパドナウイルスゲノムはエピソーム状の共有結合
で閉鎖された環状（ＣＣＣ）ＤＮＡ分子のプールとしてインビボで感染細胞の核
に保持される。ヒトの肝臓におけるＨＢＶ・ＤＮＡの組込みが報告されてきたが
、これは該ＨＢＶの生活環の必須部分ではなく、組み込みはＨＢＶの複製に必要
ではない。さらに、組込まれたＨＢＶ・ＤＮＡが見出される場合、それはしばし
ば再配列されており大抵転写が休止している。ＨＢＶを発現する細胞系統は安定
に組込まれたＨＢＶ・ＤＮＡを含むため、ウイルス遺伝子の発現及び複製は連続
的であり、従って、これらの過程が開始される時間又は条件を実験的に制御する
ことはできない。安定なＨＢＶを発現する細胞系統は一定数の通常頭−尾方向で
組込まれたＨＢＶゲノムを含み、その状態ではＨＢＶ遺伝子の発現及び複製のレ
ベルは調節され得ず、各細胞系統が含む組込コピーの数に制限される。従って、
該細胞系統にトランスフェクションすること及び／又は新規な細胞系統を選択す
ることなしには、組込まれたＨＢＶゲノムのコピー数を増加又は減少させる影響
を研究することはできない。
【００１８】
高い多重度でのＨＢＶバキュロウイルス感染でさえＨｅｐＧ２又はＨｕｈ−７
などの細胞には毒性でない。ＨＢＶの発現は、単なる培養の重感染によりＨＢＶ
バキュロウイルスに感染した細胞集団で促進又は延長できる。
などの細胞には毒性でない。ＨＢＶの発現は、単なる培養の重感染によりＨＢＶ
バキュロウイルスに感染した細胞集団で促進又は延長できる。
【００１９】
バキュロウイルスが媒介するＨｅｐＧ２細胞へのＨＢＶの遺伝子転移と安定に
トランスフェクションされた細胞系統との間の主な差異の一つは複製過程を同時
に開始するその能力である。「2.2.15」と呼ばれるＨｅｐＧ２細胞系統の誘導体
などの安定にトランスフェクションされたＨＢＶ細胞系統においては、各々の細
胞は複製周期の全ての相でウイルスを含む。対照的に、ＨＢＶバキュロウイルス
の感染は、例えばＨｅｐＧ２細胞でのＨＢＶ複製を同時に開始させるために用い
ることができる。なぜなら、これらの細胞は感染前にウイルス産物を含有しない
ためである。ＨＢＶバキュロウイルスに感染したＨｅｐＧ２細胞では、適切な組
換えＨＢＶバキュロウイルスを用いて感染後の時間とＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ
の両方の分泌について経時的推移を追跡できる。
トランスフェクションされた細胞系統との間の主な差異の一つは複製過程を同時
に開始するその能力である。「2.2.15」と呼ばれるＨｅｐＧ２細胞系統の誘導体
などの安定にトランスフェクションされたＨＢＶ細胞系統においては、各々の細
胞は複製周期の全ての相でウイルスを含む。対照的に、ＨＢＶバキュロウイルス
の感染は、例えばＨｅｐＧ２細胞でのＨＢＶ複製を同時に開始させるために用い
ることができる。なぜなら、これらの細胞は感染前にウイルス産物を含有しない
ためである。ＨＢＶバキュロウイルスに感染したＨｅｐＧ２細胞では、適切な組
換えＨＢＶバキュロウイルスを用いて感染後の時間とＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ
の両方の分泌について経時的推移を追跡できる。
【００２０】
従って、特定の薬剤に対して改変された感受性を有する特異的な変異型ＨＢＶ
をスクリーニングするためのバキュロウイルス系を開発する必要がある。
をスクリーニングするためのバキュロウイルス系を開発する必要がある。
【００２１】
発明の概要
本明細書を通して、文脈が他の意味を要しない限り、「含む(comprise)」という
単語、又は「含む(comprises)」若しくは「含む(comprising)」などの変形は、
明記した要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の包含を意味するが、任意
の他の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の排除を意味するものではな
いと理解されるものである。
単語、又は「含む(comprises)」若しくは「含む(comprising)」などの変形は、
明記した要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の包含を意味するが、任意
の他の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の排除を意味するものではな
いと理解されるものである。
【００２２】
ヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、配列同定子、即ち＜４００＞１、＜４０
０＞２などにより言及される。配列表は請求の範囲の後ろに提供する。
０＞２などにより言及される。配列表は請求の範囲の後ろに提供する。
【００２３】
本発明は一般的に薬剤に対して改変された感受性を示す変異型ＨＢＶを検出す
る検定法に関する。具体的には、この検定法は特定の薬剤に対する変異型ＨＢＶ
の感受性についてスクリーニングするためにバキュロウイルス系の使用を含む。
本明細書で意図される薬剤は、ヌクレオチドアナログ及びヌクレオシドアナログ
及び非ヌクレオシドアナログなどの化学薬剤、抗体及びサイトカインなどの免疫
学的薬剤並びに他の治療用分子を含む。これらの薬剤は、一般的に、ＨＢＶ感染
、複製及び／又はウイルス又はウイルス様粒子の組立又は放出を阻害又は低減す
るなど、対照のＨＢＶに対して既知の効果を有するが、それに限定されない。該
検定法は、一般的に、細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む
又はそれに融合した該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子
構築物を最初に作成することにより、ある薬剤に対して改変された感受性を示す
変異型ＨＢＶを検出する工程を含む。該細胞が感染する前、間又は後に、試験す
べき薬剤を該細胞と接触させる。該細胞が同一構築物で又はＨＢＶ野性型若しく
は他のＨＢＶ変異型のゲノムを含む遺伝子構築物で再度感染させる任意選択の更
なる工程がある。次に、該細胞は、該薬剤に耐性であるならば、該変異型ＨＢＶ
が遺伝子配列を複製し、発現し、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を
組み立て、及び／又は放出するのに十分な時間及び条件の下で培養される。次い
で、該変異型ＨＢＶが、薬剤の存在下で、遺伝物質を複製し、発現し、及び／又
は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物若
しくは培養上清液はウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかけられ
る。検出可能な成分の存在又は不存在により、該薬剤に対する耐性又は感受性の
指示が得られる。
る検定法に関する。具体的には、この検定法は特定の薬剤に対する変異型ＨＢＶ
の感受性についてスクリーニングするためにバキュロウイルス系の使用を含む。
本明細書で意図される薬剤は、ヌクレオチドアナログ及びヌクレオシドアナログ
及び非ヌクレオシドアナログなどの化学薬剤、抗体及びサイトカインなどの免疫
学的薬剤並びに他の治療用分子を含む。これらの薬剤は、一般的に、ＨＢＶ感染
、複製及び／又はウイルス又はウイルス様粒子の組立又は放出を阻害又は低減す
るなど、対照のＨＢＶに対して既知の効果を有するが、それに限定されない。該
検定法は、一般的に、細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む
又はそれに融合した該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子
構築物を最初に作成することにより、ある薬剤に対して改変された感受性を示す
変異型ＨＢＶを検出する工程を含む。該細胞が感染する前、間又は後に、試験す
べき薬剤を該細胞と接触させる。該細胞が同一構築物で又はＨＢＶ野性型若しく
は他のＨＢＶ変異型のゲノムを含む遺伝子構築物で再度感染させる任意選択の更
なる工程がある。次に、該細胞は、該薬剤に耐性であるならば、該変異型ＨＢＶ
が遺伝子配列を複製し、発現し、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を
組み立て、及び／又は放出するのに十分な時間及び条件の下で培養される。次い
で、該変異型ＨＢＶが、薬剤の存在下で、遺伝物質を複製し、発現し、及び／又
は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物若
しくは培養上清液はウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかけられ
る。検出可能な成分の存在又は不存在により、該薬剤に対する耐性又は感受性の
指示が得られる。
【００２４】
【外１】
【００２５】
【外２】
【００２６】
【外３】
【００２７】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、特定の薬剤に対する変異型ＨＢＶの感受性についてスクリーニング
するためにＨＢＶバキュロウイルス変異型を用いる検定法を提供する。これらの
薬剤は、一般的に、ウイルス又はウイルス様粒子のＨＢＶ感染、複製及び／又は
組立及び／又は放出を阻害又は低減するなど、対照のＨＢＶに対して既知の効果
を有するが、それに限定されない。本発明は、特定の薬剤に対する変異型ＨＢＶ
の感受性についてスクリーニングするための検定法を提供する。これらの薬剤は
、一般的に、ウイルス又はウイルス様粒子のＨＢＶ感染、複製及び／又は組立及
び／又は放出を阻害又は低減するなど、対照のＨＢＶに対して既知の効果を有す
るが、それに限定されない。
するためにＨＢＶバキュロウイルス変異型を用いる検定法を提供する。これらの
薬剤は、一般的に、ウイルス又はウイルス様粒子のＨＢＶ感染、複製及び／又は
組立及び／又は放出を阻害又は低減するなど、対照のＨＢＶに対して既知の効果
を有するが、それに限定されない。本発明は、特定の薬剤に対する変異型ＨＢＶ
の感受性についてスクリーニングするための検定法を提供する。これらの薬剤は
、一般的に、ウイルス又はウイルス様粒子のＨＢＶ感染、複製及び／又は組立及
び／又は放出を阻害又は低減するなど、対照のＨＢＶに対して既知の効果を有す
るが、それに限定されない。
【００２８】
本発明は、普通の条件下では対照のＨＢＶに対して特定の効果を有しており又
は効果を有していない薬剤に対して改変された感受性を有する変異型ＨＢＶの同
定に一部基づくものである。
は効果を有していない薬剤に対して改変された感受性を有する変異型ＨＢＶの同
定に一部基づくものである。
【００２９】
一般的に、しかし排他的ではないが、該薬剤はウイルス又はウイルス様粒子の
ＨＢＶ感染、複製及び／又は組立及び／又は放出を阻害又は低減する。該検定法
は該薬剤が特定の変異型ＨＢＶに同一の効果を有するか否かを決定する。該検定
法は化学的に又は機能的に関連した抗ウイルス薬剤のグループ内での交差耐性の
程度を決定する際にも有用である。一つの実施態様においては、この変異型ＨＢ
Ｖは回避突然変異体である。しかしながら、本発明は、ある薬剤が対照のＨＢＶ
に対してほとんど効果を有さないが変異型ＨＢＶに対して効果的である場合にも
及ぶ。本目的のため、「対照」ＨＢＶは便宜上「野性型」ＨＢＶとみなされる。
ＨＢＶ感染、複製及び／又は組立及び／又は放出を阻害又は低減する。該検定法
は該薬剤が特定の変異型ＨＢＶに同一の効果を有するか否かを決定する。該検定
法は化学的に又は機能的に関連した抗ウイルス薬剤のグループ内での交差耐性の
程度を決定する際にも有用である。一つの実施態様においては、この変異型ＨＢ
Ｖは回避突然変異体である。しかしながら、本発明は、ある薬剤が対照のＨＢＶ
に対してほとんど効果を有さないが変異型ＨＢＶに対して効果的である場合にも
及ぶ。本目的のため、「対照」ＨＢＶは便宜上「野性型」ＨＢＶとみなされる。
【００３０】
「変異型」という用語は、その最も広い文脈で用いられ、突然変異体、誘導体
、対照ＨＢＶと比べて修飾された及び改変されたＨＢＶの形態を含む。変異型は
通常ウイルスゲノムにおける単数又は複数のヌクレオチド置換、付加及び／又は
欠失又は先端切除の突然変異、並びにウイルスのペプチド、ポリペプチド又はタ
ンパク質において対応する単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失
又は先端切除を含む。
、対照ＨＢＶと比べて修飾された及び改変されたＨＢＶの形態を含む。変異型は
通常ウイルスゲノムにおける単数又は複数のヌクレオチド置換、付加及び／又は
欠失又は先端切除の突然変異、並びにウイルスのペプチド、ポリペプチド又はタ
ンパク質において対応する単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失
又は先端切除を含む。
【００３１】
従って、本発明の一側面はある薬剤に対して改変された感受性を示す変異型Ｈ
ＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工
程、次いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させる工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出する
のに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、及
び／又は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶
解物若しくは培養上清液をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にか
ける工程、 を含む方法を意図する。
ＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工
程、次いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させる工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出する
のに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、及
び／又は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶
解物若しくは培養上清液をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にか
ける工程、 を含む方法を意図する。
【００３２】
この改変された感受性は、ウイルスの感染、複製及び／又はウイルス若しくは
ウイルス様粒子の組み立て及び／又は放出に対する効果又は感染、複製、組立、
及び／又は放出の過程間の中間段階に対する効果を含むことが好ましい。特に好
ましい実施態様において、該変異型ＨＢＶが薬剤に対して耐性であるか否かの確
認が行なわれる。ある一つの薬剤に対する耐性は、交差耐性が発達する間に生じ
うるので、二つ以上の化学的又は機能的に関連した薬剤に対する耐性をも含む。
ウイルス様粒子の組み立て及び／又は放出に対する効果又は感染、複製、組立、
及び／又は放出の過程間の中間段階に対する効果を含むことが好ましい。特に好
ましい実施態様において、該変異型ＨＢＶが薬剤に対して耐性であるか否かの確
認が行なわれる。ある一つの薬剤に対する耐性は、交差耐性が発達する間に生じ
うるので、二つ以上の化学的又は機能的に関連した薬剤に対する耐性をも含む。
【００３３】
従って、本発明の他の側面は、対照ＨＢＶの感染、複製、組立て及び／又は放
出を阻害又は低減する薬剤の存在下で、感染、複製、組み立て及び／又は放出で
きる変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工程、次
いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子物質を複製し、発現し
、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出する
のに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、及
び／又は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞又は細胞
溶解物をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含む方法を提供する。
出を阻害又は低減する薬剤の存在下で、感染、複製、組み立て及び／又は放出で
きる変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工程、次
いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子物質を複製し、発現し
、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出する
のに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、及
び／又は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞又は細胞
溶解物をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含む方法を提供する。
【００３４】
上で言及された任意選択の工程は同一のＨＢＶ又は他のＨＢＶによる共感染の
効果の試験を包含する。
効果の試験を包含する。
【００３５】
従って、本発明の他の側面は、対照ＨＢＶの感染、複製、組立て及び／又は放
出を阻害又は低減する薬剤の存在下で、感染、複製、組み立て及び／又は放出で
きる変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工程、次
いで該構築物で細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 初期感染後に一回以上同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢ
Ｖ変異型のゲノムを含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる
工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子物質を複製し、発現し
、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出する
のに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞又は細胞溶解物
をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含む方法を提供する。
出を阻害又は低減する薬剤の存在下で、感染、複製、組み立て及び／又は放出で
きる変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工程、次
いで該構築物で細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 初期感染後に一回以上同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢ
Ｖ変異型のゲノムを含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる
工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子物質を複製し、発現し
、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出する
のに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞又は細胞溶解物
をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含む方法を提供する。
【００３６】
上で言及された任意選択の工程は同一のＨＢＶ又は他のＨＢＶによる重感染の
効果の試験を包含する。
効果の試験を包含する。
【００３７】
細胞、細胞溶解物及び培養上清液におけるＨＢＶ又はその成分の検出は任意の
簡便な手段によりなされうる。例えば、ＨＢＶの全ＤＮＡ又は全ＲＮＡが測定さ
れ、複製中間体が検出され又はＨＢＶに特異的な産物又は遺伝子転写物が測定さ
れうる。適切な検定手段にはＰＣＲ、ノーザン・ブロット及びサザン・ブロット
などの核酸ハイブリダイゼーション法並びにＥＬＩＳＡなどの抗体手法が含まれ
、ウェスタン・ブロットが用いられてもよい。
簡便な手段によりなされうる。例えば、ＨＢＶの全ＤＮＡ又は全ＲＮＡが測定さ
れ、複製中間体が検出され又はＨＢＶに特異的な産物又は遺伝子転写物が測定さ
れうる。適切な検定手段にはＰＣＲ、ノーザン・ブロット及びサザン・ブロット
などの核酸ハイブリダイゼーション法並びにＥＬＩＳＡなどの抗体手法が含まれ
、ウェスタン・ブロットが用いられてもよい。
【００３８】
本発明の変異型ＨＢＶの例は、臨床環境における選択圧をかけた後に得られる
変異型である。選択圧の一形態は、ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺
伝子での突然変異を選択するＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼに対する化学圧（例え
ばヌクレオシドアナログを介して）である。該ＨＢＶゲノムの重なり合うという
性質により、対応する突然変異はＨＢｓＡｇをコードする遺伝子にも生じうる（
図１Ｂを参照）。従って、ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼをコードする一つ以上の
ヌクレオチドにおける突然変異はＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列に対
して効果を有しうる。
変異型である。選択圧の一形態は、ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺
伝子での突然変異を選択するＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼに対する化学圧（例え
ばヌクレオシドアナログを介して）である。該ＨＢＶゲノムの重なり合うという
性質により、対応する突然変異はＨＢｓＡｇをコードする遺伝子にも生じうる（
図１Ｂを参照）。従って、ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼをコードする一つ以上の
ヌクレオチドにおける突然変異はＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列に対
して効果を有しうる。
【００３９】
本発明の変異型ウイルスは、ＤＮＡポリメラーゼ又は表面抗原にのみ突然変異
を有しうるし、あるいは両遺伝子に突然変異を有しうる。「突然変異」という用
語は、その最も広い文脈で解釈されるべきであり、ＤＮＡポリメラーゼ又は表面
抗原の正常な機能に実質的に影響を及ぼさないサイレント突然変異を含み、又は
ヌクレオシドアナログ耐性又はワクチン回避突然変異の表現型の選択に影響を及
ぼす活性の突然変異でありうる。本発明にしたがって複数の突然変異が生じる場
合又は複数の表現型が一つの突然変異に起因する場合、少なくとも一つの突然変
異は活性でなければならず、又は該ウイルスはヌクレオシドアナログの耐性など
の少なくとも一つの改変された表現型若しくは対照のＨＢＶの表面抗原に対して
低減された抗ＨＢｓの免疫学的相互作用を示さなければならない。
を有しうるし、あるいは両遺伝子に突然変異を有しうる。「突然変異」という用
語は、その最も広い文脈で解釈されるべきであり、ＤＮＡポリメラーゼ又は表面
抗原の正常な機能に実質的に影響を及ぼさないサイレント突然変異を含み、又は
ヌクレオシドアナログ耐性又はワクチン回避突然変異の表現型の選択に影響を及
ぼす活性の突然変異でありうる。本発明にしたがって複数の突然変異が生じる場
合又は複数の表現型が一つの突然変異に起因する場合、少なくとも一つの突然変
異は活性でなければならず、又は該ウイルスはヌクレオシドアナログの耐性など
の少なくとも一つの改変された表現型若しくは対照のＨＢＶの表面抗原に対して
低減された抗ＨＢｓの免疫学的相互作用を示さなければならない。
【００４０】
本発明は、本明細書で対照のＨＢＶを定義すると考えられる式Ｉで示すアミノ
酸配列と比較してＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼの触媒領域のアミノ酸配列におい
て単数又は複数の置換、付加及び／又は欠失又は先端切除を有する任意のＨＢＶ
突然変異を検定することにも及ぶ。
酸配列と比較してＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼの触媒領域のアミノ酸配列におい
て単数又は複数の置換、付加及び／又は欠失又は先端切除を有する任意のＨＢＶ
突然変異を検定することにも及ぶ。
【００４１】
【化１】
【００４２】
上式中、
Ｘ は任意のアミノ酸であり；
Ｚ1 はＮ又はＤであり；
Ｚ2 はＩ又はＰであり；
Ｚ3 はＩ又はＶであり；
Ｚ4 はＳ又はＤであり；
Ｚ5 はＴ又はＮであり；
Ｚ6 はＲ又はＮであり；
Ｚ7 はＮ又はＩであり；
Ｚ8 はＮ又はＹ又はＨであり；
Ｚ9 はＨ又はＹであり；
Ｚ10 はＧ又はＲであり；
Ｚ11 はＤ又はＮであり；
Ｚ12 はＤ又はＮであり；
Ｚ13 はＳ又はＹであり；
Ｚ14 はＮ又はＱであり；
Ｚ15 はＬ又はＭであり；
Ｚ16 はＫ又はＱであり；
Ｚ17 はＹ又はＦであり；
Ｚ18 はＲ又はＷであり；
Ｚ19 はＹ又はＬであり；
Ｚ20 はＳ又はＡであり；
Ｚ21 はＩ又はＶであり；
Ｚ22 はＩ又はＬであり；
Ｚ23 はＶ又はＧであり；
Ｚ24 はＣ又はＬであり；
Ｚ25 はＡ又はＳであり；
Ｚ26 はＶ又はＭであり；
Ｚ27 はＶ又はＴであり；
Ｚ28 はＲ又はＣであり；
Ｚ29 はＦ又はＰであり；
Ｚ30 はＬ又はＶであり；
Ｚ31 はＡ又はＶであり；
Ｚ32 はＳ又はＡであり；
Ｚ33 はＶ又はＬ又はＭであり；
Ｚ34 はＫ又はＲであり；
Ｚ35 はＳ又はＴであり；
Ｚ36 はＶ又はＧであり；
Ｚ37 はＱ又はＥであり；
Ｚ38 はＬ又はＳ又はＲであり；
Ｚ39 はＳ又はＦであり；
Ｚ40 はＦ又はＹであり；
Ｚ41 はＴ又はＡであり；
Ｚ42 はＡ又はＳであり；
Ｚ43 はＶ又はＩであり；
Ｚ44 はＴ又はＣであり；
Ｚ45 はＮ又はＳであり；
Ｚ46 はＦ又はＶであり；
Ｚ47 はＳ又はＤであり；
Ｚ48 はＬ又はＶであり；
Ｚ49 はＮ又はＱであり；
Ｚ50 はＶ又はＩであり；並びに
Ｍ* はアミノ酸５５０である。
【００４３】
従って、本発明の他の側面は、ある薬剤に対して改変された感受性を有する変
異型ＨＢＶを検出する検定法であって、該変異型ＨＢＶは式Ｉで示すアミノ酸配
列と比較して単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失又は先端切除
を含むものであり、該変異型ＨＢＶは該ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオ
シドアナログにより選択されるものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出する
のに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又
は細胞上清液をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、
を含むものである検定法を提供する。
異型ＨＢＶを検出する検定法であって、該変異型ＨＢＶは式Ｉで示すアミノ酸配
列と比較して単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失又は先端切除
を含むものであり、該変異型ＨＢＶは該ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオ
シドアナログにより選択されるものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出する
のに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又
は細胞上清液をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、
を含むものである検定法を提供する。
【００４４】
関連する実施態様において、本発明は変異型ＨＢＶの検定法であって、該変異
型ＨＢＶは、対照のＨＢＶによる感染、複製又は組立て及び／又は放出を他の方
法で阻害又は低減する薬剤に対して低減された感受性を示すものであり、該変異
型ＨＢＶは式Ｉで示すアミノ酸配列と比較して単数又は複数のアミノ酸の置換、
付加及び／又は欠失又は先端切除を含むものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工程、次
いで該構築物で細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝物質を発現し、及び／又
はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て及び／又は放出するのに十分な時
間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞又は細胞溶解物
をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法に関する。
型ＨＢＶは、対照のＨＢＶによる感染、複製又は組立て及び／又は放出を他の方
法で阻害又は低減する薬剤に対して低減された感受性を示すものであり、該変異
型ＨＢＶは式Ｉで示すアミノ酸配列と比較して単数又は複数のアミノ酸の置換、
付加及び／又は欠失又は先端切除を含むものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工程、次
いで該構築物で細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝物質を発現し、及び／又
はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て及び／又は放出するのに十分な時
間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞又は細胞溶解物
をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法に関する。
【００４５】
本発明により意図される他の変異型ＨＢＶは、プリコア配列又は基底コアのプ
ロモーター配列にある。本発明により意図されるプリコア突然変異は、表１に記
載されるものを含む。具体的なプリコア遺伝子及び基底コアプロモーター（ＢＣ
Ｐ）の突然変異には、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、Ｇ１８９６Ａ、Ｇ１８９７
Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ１８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ
／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ及びＣ１６５３Ｔ（番号はＨＢＶ
の唯一のＥｃｏＲＩ部位からのものである）が含まれる。
ロモーター配列にある。本発明により意図されるプリコア突然変異は、表１に記
載されるものを含む。具体的なプリコア遺伝子及び基底コアプロモーター（ＢＣ
Ｐ）の突然変異には、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、Ｇ１８９６Ａ、Ｇ１８９７
Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ１８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ
／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ及びＣ１６５３Ｔ（番号はＨＢＶ
の唯一のＥｃｏＲＩ部位からのものである）が含まれる。
【００４６】
従って、本発明の他の側面は、薬剤に対して改変された感受性をもつ変異型Ｈ
ＢＶについての検定法であって、該変異型ＨＢＶはプリコアヌクレオチド配列に
対して単数又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失を含むヌクレオ
チド配列を含むものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組み立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並び
に 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法を提供する。。
ＢＶについての検定法であって、該変異型ＨＢＶはプリコアヌクレオチド配列に
対して単数又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失を含むヌクレオ
チド配列を含むものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組み立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並び
に 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法を提供する。。
【００４７】
本発明のこの側面にしたがう変異型ＨＢＶは、表１に記載されるようにプリコ
ア遺伝子又はＢＣＰの突然変異を有することが好ましい。特に好ましい実施態様
において、プリコア又はＢＣＰの突然変異は、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、Ｇ
１８９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ１
８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ及びＣ１
６５３Ｔ（番号はＨＢＶの唯一のＥｃｏＲＩ部位からのものである）から選択さ
れる。
ア遺伝子又はＢＣＰの突然変異を有することが好ましい。特に好ましい実施態様
において、プリコア又はＢＣＰの突然変異は、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、Ｇ
１８９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ１
８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ及びＣ１
６５３Ｔ（番号はＨＢＶの唯一のＥｃｏＲＩ部位からのものである）から選択さ
れる。
【００４８】
関連する実施態様において、本発明は、薬剤に対して低減された感受性を示す
変異型ＨＢＶについての検定法であって、該薬剤は対照ＨＢＶによる感染、複製
又は組立て及び／又は放出を他の方法で阻害又は低減するものであり、該変異型
ＨＢＶはプリコアヌクレオチド配列に対して単数又は複数のヌクレオチドの置換
、付加及び／又は欠失を含むヌクレオチド配列を含むものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組み立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並び
に 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法を意図する。
変異型ＨＢＶについての検定法であって、該薬剤は対照ＨＢＶによる感染、複製
又は組立て及び／又は放出を他の方法で阻害又は低減するものであり、該変異型
ＨＢＶはプリコアヌクレオチド配列に対して単数又は複数のヌクレオチドの置換
、付加及び／又は欠失を含むヌクレオチド配列を含むものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組み立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並び
に 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法を意図する。
【００４９】
他の実施態様において、変異型ＨＢＶはＤＮＡポリメラーゼの突然変異又はＢ
型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の対応する突然変異とともにプリコア突然変異を
含む。この実施態様の好ましい突然変異は、Ｌ５２６Ｍ＋Ｍ５５０Ｖ[Ｍ１９５
Ｉ]とプリコア突然変異又はＭ５５０Ｉ[Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ又はＷ１９６Ｓ
ＴＯＰ]とプリコア突然変異などのラミヴゥディン（ＬＡＭ）に対する耐性に起
因するものであるが、これらに限定されない。括弧内の突然変異はＨＢＶ・ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子の突然変異後の対応するＨＢｓＡｇの突然変異である。好
ましいプリコア遺伝子及びＢＣＰの突然変異は、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、
Ｇ１８９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ
１８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ、Ｇ１
６５３Ｔ（表１）である。
型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の対応する突然変異とともにプリコア突然変異を
含む。この実施態様の好ましい突然変異は、Ｌ５２６Ｍ＋Ｍ５５０Ｖ[Ｍ１９５
Ｉ]とプリコア突然変異又はＭ５５０Ｉ[Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ又はＷ１９６Ｓ
ＴＯＰ]とプリコア突然変異などのラミヴゥディン（ＬＡＭ）に対する耐性に起
因するものであるが、これらに限定されない。括弧内の突然変異はＨＢＶ・ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子の突然変異後の対応するＨＢｓＡｇの突然変異である。好
ましいプリコア遺伝子及びＢＣＰの突然変異は、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、
Ｇ１８９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ
１８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ、Ｇ１
６５３Ｔ（表１）である。
【００５０】
従って、本発明の他の側面は、ＬＡＭ又は他の薬剤に対して改変された感受性
をもつ変異型ＨＢＶについての検定法であって、該変異型ＨＢＶは該プリコアヌ
クレオチド配列、該ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子及び任意選択の重複するＨＢｓＡ
ｇヌクレオチド配列に対して単数又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又
は欠失を含むヌクレオチド配列を含むものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組み立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並び
に 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法を提供する。
をもつ変異型ＨＢＶについての検定法であって、該変異型ＨＢＶは該プリコアヌ
クレオチド配列、該ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子及び任意選択の重複するＨＢｓＡ
ｇヌクレオチド配列に対して単数又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又
は欠失を含むヌクレオチド配列を含むものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組み立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並び
に 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法を提供する。
【００５１】
関連する実施態様において、本発明は、ＬＡＭ又は他の薬剤に対して低減され
た感受性を示す変異型ＨＢＶについての検定法であって、該薬剤は対照のＨＢＶ
による感染、複製又は組立て及び／又は放出を他の方法で阻害又は低減するもの
であり、該変異型ＨＢＶは該プリコアヌクレオチド配列、該ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子及び任意選択のＨＢｓＡｇヌクレオチド配列に対して単数又は複数のヌク
レオチドの置換、付加及び／又は欠失をコードするヌクレオチド配列を含むもの
であり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組み立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並び
に 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法を意図する。
た感受性を示す変異型ＨＢＶについての検定法であって、該薬剤は対照のＨＢＶ
による感染、複製又は組立て及び／又は放出を他の方法で阻害又は低減するもの
であり、該変異型ＨＢＶは該プリコアヌクレオチド配列、該ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子及び任意選択のＨＢｓＡｇヌクレオチド配列に対して単数又は複数のヌク
レオチドの置換、付加及び／又は欠失をコードするヌクレオチド配列を含むもの
であり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組み立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並び
に 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである検定法を意図する。
【００５２】
本発明のこれらの側面の変異型ＨＢＶは、表１に記載されるようにプリコア遺
伝子及びＢＣＰの突然変異を有することが好ましい。特に好ましい実施態様にお
いて、プリコア又はＢＣＰの突然変異は、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、Ｇ１８
９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ１８９
９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ及びＣ１６５
３Ｔ（番号はＨＢＶの唯一のＥｃｏＲＩ部位からのものである）から選択される
。該ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（及びＨＢｓＡｇ）の突然変異はＬ５２６Ｍ＋Ｍ
５５０Ｖ[Ｍ１９５Ｉ]又はＭ５５０Ｉ[Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ又はＷ１９６Ｓ
ＴＯＰ]であることが好ましい。
伝子及びＢＣＰの突然変異を有することが好ましい。特に好ましい実施態様にお
いて、プリコア又はＢＣＰの突然変異は、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、Ｇ１８
９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ１８９
９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ及びＣ１６５
３Ｔ（番号はＨＢＶの唯一のＥｃｏＲＩ部位からのものである）から選択される
。該ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（及びＨＢｓＡｇ）の突然変異はＬ５２６Ｍ＋Ｍ
５５０Ｖ[Ｍ１９５Ｉ]又はＭ５５０Ｉ[Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ又はＷ１９６Ｓ
ＴＯＰ]であることが好ましい。
【００５３】
本発明にしたがって試験されるべき変異体の他の例は改変された免疫プロフィ
ールをもつものである。このような変異体は、対照のＨＢＶ又はその表面成分を
含むワクチンなどの従来のＨＢＶワクチンに対する免疫応答を中和することによ
り実質的に影響されない。同様に、該変異型ＨＢＶは、感染、複製、組立て若し
くは放出のレベルで又は該ＨＢＶの生活環での他のレベルで対照のＨＢＶの感染
、複製、組立て又は放出を阻害又は低減できる薬剤により実質的に影響されえな
い。「実質的に影響されない」という表現は、ワクチンにより生じた免疫応答に
対する低減した感受性又は該ＤＮＡポリメラーゼなどのＨＢＶ遺伝子を標的とす
るヌクレオシドアナログなどの化学薬剤に対する低減した感受性を含む。ＤＮＡ
ポリメラーゼ及びあるウイルス表面成分のリーディング・フレームが重なり合う
という性質により、改変された表面成分は該ＤＮＡポリメラーゼにおいて対応す
る改変を有しうる。
ールをもつものである。このような変異体は、対照のＨＢＶ又はその表面成分を
含むワクチンなどの従来のＨＢＶワクチンに対する免疫応答を中和することによ
り実質的に影響されない。同様に、該変異型ＨＢＶは、感染、複製、組立て若し
くは放出のレベルで又は該ＨＢＶの生活環での他のレベルで対照のＨＢＶの感染
、複製、組立て又は放出を阻害又は低減できる薬剤により実質的に影響されえな
い。「実質的に影響されない」という表現は、ワクチンにより生じた免疫応答に
対する低減した感受性又は該ＤＮＡポリメラーゼなどのＨＢＶ遺伝子を標的とす
るヌクレオシドアナログなどの化学薬剤に対する低減した感受性を含む。ＤＮＡ
ポリメラーゼ及びあるウイルス表面成分のリーディング・フレームが重なり合う
という性質により、改変された表面成分は該ＤＮＡポリメラーゼにおいて対応す
る改変を有しうる。
【００５４】
本発明のＨＢＶの好ましい表面成分はＨＢｓＡｇである。本発明のこの側面に
したがって、該変異型ＨＢＶのＨＢｓＡｇは対照のＨＢＶに由来するＨＢｓＡｇ
と比べて改変された免疫プロフィールを示すことが提唱される。本発明の目的の
ため、対照のＨＢＶはノルダーら（１）及びスチュイベルら（２）により述べら
れているアミノ酸配列を実質的にもつＨＢｓＡｇを便宜上含む。これはあらゆる
既知のＨＢＶの遺伝子型を包含する（現在ＡからＧまで）。本発明の検定法は、
特定の薬剤に対する変異型ＨＢＶの感受性に及ぼす改変されたＨＢｓＡｇの効果
をスクリーニングするために用いることができる。
したがって、該変異型ＨＢＶのＨＢｓＡｇは対照のＨＢＶに由来するＨＢｓＡｇ
と比べて改変された免疫プロフィールを示すことが提唱される。本発明の目的の
ため、対照のＨＢＶはノルダーら（１）及びスチュイベルら（２）により述べら
れているアミノ酸配列を実質的にもつＨＢｓＡｇを便宜上含む。これはあらゆる
既知のＨＢＶの遺伝子型を包含する（現在ＡからＧまで）。本発明の検定法は、
特定の薬剤に対する変異型ＨＢＶの感受性に及ぼす改変されたＨＢｓＡｇの効果
をスクリーニングするために用いることができる。
【００５５】
従って、本発明は、式Ｉで上述したＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼの触媒領域に
対する単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失により定義されたよ
うな、下記の式IIで示すアミノ酸配列と比較した場合のＨＢｓＡｇのアミノ酸配
列における任意の単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失又は先端
切除に及ぶ。
対する単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失により定義されたよ
うな、下記の式IIで示すアミノ酸配列と比較した場合のＨＢｓＡｇのアミノ酸配
列における任意の単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失又は先端
切除に及ぶ。
【００５６】
対照のＨＢＶを定義すると考えられるＨＢｓＡｇのアミノ酸配列は以下に式II
に示す。
に示す。
【００５７】
【化２】
【００５８】
上式中、
Ｘ1 は Ｅ又はＧ又はＤであり、
Ｘ2 は Ｎ又はＳ又はＫであり、
Ｘ3 は Ｉ又はＴであり、
Ｘ4 は Ｔ又はＡであり、
Ｘ5 は Ｆ又はＬであり、
Ｘ6 は Ｇ又はＲであり、
Ｘ7 は Ｌ又はＲであり、
Ｘ8 は Ｇ又はＶであり、
Ｘ9 は Ｆ又はＣであり、
Ｘ10は Ｌ又はＳ又はＷであり、
Ｘ11は Ｒ又はＫであり、
Ｘ12は Ｌ又はＲであり、
Ｘ13は Ｔ又はＫであり、
Ｘ14は Ｑ又はＫであり、
Ｘ15は Ｄ又はＨであり、
Ｘ16は Ｇ又はＥ又はＡであり、
Ｘ17は Ｓ又はＡ又はＶ又はＴ又はＬであり、
Ｘ18は Ｐ又はＴであり、
Ｘ19は Ｖ又はＲ又はＴ又はＫ又はＧであり、
Ｘ20は Ｌ又はＰであり、
Ｘ21は Ｑ又はＬ又はＫであり、
Ｘ22は Ｓ又はＬであり、
Ｘ23は Ｐ又はＱであり、
Ｘ24は Ｔ又はＩであり、
Ｘ25は Ｎ又はＳであり、
Ｘ26は Ｓ又はＬであり、
Ｘ27は Ｔ又はＩであり、
Ｘ28は Ｓ又はＣであり、
Ｘ29は Ｉ又はＴであり、
Ｘ30は Ｐ又はＡであり、
Ｘ31は Ｒ又はＱであり、
Ｘ32は Ｆ又はＣであり、
Ｘ33は Ｙ又はＣであり、
Ｘ34は Ｐ又はＨ又はＳであり、
Ｘ35は Ｉ又はＬであり、
Ｘ36は Ｇ又はＲであり、
Ｘ37は Ｓ又はＴであり、
Ｘ38は Ｔ又はＳであり、
Ｘ39は Ｔ又はＶ又はＡであり、
Ｘ40は Ｇ又はＥ又はＱであり、
Ｘ41は Ｐ又はＡ又はＳであり、
Ｘ42は Ｋ又はＲであり、
Ｘ43は Ｔ又はＭであり、
Ｘ44は Ｔ又はＩ又はＳ又はＡであり、
Ｘ45は Ｐ又はＴ又はＡ又はＩ又はＬであり、
Ｘ46は Ａ又はＶであり、
Ｘ47は Ｎ又はＴであり、
Ｘ48は Ｍ又はＫ又はＬであり、
Ｘ49は Ｆ又はＹ又はＩであり、
Ｘ50は Ｓ又はＹであり、
Ｘ51は Ｃ又はＳであり、
Ｘ52は Ｔ又はＩ又はＳであり、
Ｘ53は Ｔ又はＳであり、
Ｘ54は Ｄ又はＡであり、
Ｘ55は Ｓ又はＴであり、
Ｘ56は Ｆ又はＬであり、
Ｘ57は Ａ又はＧ又はＶであり、
Ｘ58は Ｋ又はＲ又はＴであり、
Ｘ59は Ｙ又はＦであり、
Ｘ60は Ｗ又はＧであり、
Ｘ61は Ａ又はＧであり、
Ｘ62は Ｖ又はＡであり、
Ｘ63は Ｆ又はＬであり、
Ｘ64は Ｓ又はＮであり、
Ｘ65は Ｖ又はＡであり、
Ｘ66は Ｐ又はＱであり、
Ｘ67は Ｗ又はＣ又はＳであり、
Ｘ68は Ｆ又はＣであり、
Ｘ69は Ｖ又はＤ又はＡであり、
Ｘ70は Ｇ又はＥであり、
Ｘ71は Ｓ又はＦであり、
Ｘ72は Ｔ又はＩであり、
Ｘ73は Ｌ又はＰであり、
Ｘ74は Ｓ又はＬであり、
Ｘ75は Ａ又はＶであり、
Ｘ76は Ｍ又はＩであり、
Ｘ77は Ｍ又はＩであり、
Ｘ78は Ｙ又はＦであり、
Ｘ79は Ｇ又はＥであり、
Ｘ80は Ｓ又はＮ又はＫであり、
Ｘ81は Ｌ又はＱであり、
Ｘ82は Ｙ又はＦ又はＨ又はＣであり、
Ｘ83は Ｓ又はＧ又はＮ又はＤ又はＴであり、
Ｘ84は Ｖ又はＬであり、
Ｘ85は Ｓ又はＮであり、
Ｘ86は Ｉ又はＭ又はＬであり、
Ｘ87は Ｆ又はＣであり、
Ｘ88は Ｃ又はＹであり、
Ｘ89は Ｗ又はＲであり、
Ｘ90は Ｖ又はＡであり、及び
Ｘ91は Ｙ又はＩ又はＳである。
【００５９】
従って、本発明の他の側面は、ある薬剤に対して改変された感受性を有する変
異型ＨＢＶを検出する方法であって、該変異型ＨＢＶは対照のＨＢＶに由来する
表面抗原と比較して単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失又は先
端切除をもつアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、その結果、該対照の表面抗
原に対して生じる抗体は該変異型ＨＢＶを中和するための改変された能力を示す
ものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含む方法を提供する。。
異型ＨＢＶを検出する方法であって、該変異型ＨＢＶは対照のＨＢＶに由来する
表面抗原と比較して単数又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失又は先
端切除をもつアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、その結果、該対照の表面抗
原に対して生じる抗体は該変異型ＨＢＶを中和するための改変された能力を示す
ものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し
、又は組立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は培養上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含む方法を提供する。。
【００６０】
対照のＨＢＶのＨＢｓＡｇのアミノ酸配列は上記の式IIで示される。
【００６１】
一般的に、本発明の方法は回避突然変異体とみなしうる変異型ＨＢＶを検出で
きる。この回避突然変異体は該ＨＢＶポリメラーゼに対する化学治療又は該表面
抗原に対するワクチン治療により実質的に悪影響を受けることはあり得ない。「
回避」突然変異体という用語は対照のＨＢＶに対する化学治療又はワクチン治療
への感受性の低減をも包含する。
きる。この回避突然変異体は該ＨＢＶポリメラーゼに対する化学治療又は該表面
抗原に対するワクチン治療により実質的に悪影響を受けることはあり得ない。「
回避」突然変異体という用語は対照のＨＢＶに対する化学治療又はワクチン治療
への感受性の低減をも包含する。
【００６２】
より具体的には、本発明の別の一側面は、対照のＨＢＶの複製を阻害又は低減
する薬剤の存在下で複製できる変異型ＨＢＶを検出する方法であって、この対照
のＨＢＶは対照のＨＢＶに由来する表面抗原と比較して単数又は複数のアミノ酸
の置換、付加及び／又は欠失又は先端切除をもつアミノ酸配列を有する表面抗原
を含み、その結果、該対照の表面抗原に対して生じる抗体は該変異型ＨＢＶを中
和するための改変された能力を示すものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工程、次
いで該構築物で細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子物質を複製し、発現し
、又は組立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞又は細胞溶解物をウイルス検出手段
若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含む方法を提供する。
する薬剤の存在下で複製できる変異型ＨＢＶを検出する方法であって、この対照
のＨＢＶは対照のＨＢＶに由来する表面抗原と比較して単数又は複数のアミノ酸
の置換、付加及び／又は欠失又は先端切除をもつアミノ酸配列を有する表面抗原
を含み、その結果、該対照の表面抗原に対して生じる抗体は該変異型ＨＢＶを中
和するための改変された能力を示すものであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成する工程、次
いで該構築物で細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子物質を複製し、発現し
、又は組立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞又は細胞溶解物をウイルス検出手段
若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含む方法を提供する。
【００６３】
本発明はＨＢｓＡｇ若しくはその誘導体を含むワクチン又はそれらを含むＨＢ
Ｖに基づいた免疫選択後の該ＨＢｓＡｇにおける変化にも及ぶ。ここで該ＨＢｓ
Ａｇは実質的に式IIで示されるアミノ酸配列を含む。
Ｖに基づいた免疫選択後の該ＨＢｓＡｇにおける変化にも及ぶ。ここで該ＨＢｓ
Ａｇは実質的に式IIで示されるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
従って、「薬剤」は化学薬剤（例えばヌクレオチドアナログ及びヌクレオシド
アナログ及び非ヌクレオシドアナログ）、免疫薬剤（例えば抗体又はサイトカイ
ン）又は他の治療用分子に及ぶ。本発明により意図される薬剤の一群は非ヌクレ
オシドアナログの逆転写酵素阻害剤（フェニルプロペンアミド誘導体のＡＴ−６
１などだがこれに限定されない；１６）及び非ヌクレオシドアナログのＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤である。本明細書で意図されるヌクレオシドアナ
ログの群は３ＴＣ、ＰＭＥＡ及びＰＣＶ並びに関連分子を含む。
アナログ及び非ヌクレオシドアナログ）、免疫薬剤（例えば抗体又はサイトカイ
ン）又は他の治療用分子に及ぶ。本発明により意図される薬剤の一群は非ヌクレ
オシドアナログの逆転写酵素阻害剤（フェニルプロペンアミド誘導体のＡＴ−６
１などだがこれに限定されない；１６）及び非ヌクレオシドアナログのＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤である。本明細書で意図されるヌクレオシドアナ
ログの群は３ＴＣ、ＰＭＥＡ及びＰＣＶ並びに関連分子を含む。
【００６５】
該表面抗原に関する本発明の改変された免疫プロフィールについての言及は、
改変された体液性応答又はＴ細胞の応答についての言及を含む。改変された免疫
プロフィールの例は、抗体に対する改変された特異性、エピトープ又は「ａ」決
定基内の改変されたアミノ酸配列、対照のＨＢＶに由来するＨＢｓＡｇに感作さ
れたＴ細胞の増殖の改変された誘導能を含む。改変された免疫プロフィールとは
、対照のＨＢＶの血清レベル又は血中レベルを実質的に中和できる又は他の方法
で低減できる中和抗体が該変異型ＨＢＶを実質的に中和及び／又は除去できない
又は低減された中和能及び／又は除去能を示すことを意味することが好ましい。
改変された体液性応答又はＴ細胞の応答についての言及を含む。改変された免疫
プロフィールの例は、抗体に対する改変された特異性、エピトープ又は「ａ」決
定基内の改変されたアミノ酸配列、対照のＨＢＶに由来するＨＢｓＡｇに感作さ
れたＴ細胞の増殖の改変された誘導能を含む。改変された免疫プロフィールとは
、対照のＨＢＶの血清レベル又は血中レベルを実質的に中和できる又は他の方法
で低減できる中和抗体が該変異型ＨＢＶを実質的に中和及び／又は除去できない
又は低減された中和能及び／又は除去能を示すことを意味することが好ましい。
【００６６】
本発明のＨＢｓＡｇ突然変異は該ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼの対応する突然
変異の点から定義されてもよい。該ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼの突然変異は、
アミノ酸４２１〜４３１、４２６〜４３６、４３１〜４４１、４３６〜４４６、
４４１〜４５１、４４６〜４５６、４５１〜４６１、４５６〜４６６、４６１〜
４７１、４６６〜４７６、４７１〜４８１、４７６〜４８６、４８１〜４９１、
４８６〜４９６、４９１〜５０１、４９６〜５０６、５０１〜５１１、５０６〜
５１６、５１１〜５２１、５１６〜５２６、５２１〜５３１、５２６〜５３６、
５３１〜５４１、５３６〜５４６、５４１〜５５１、５４６〜５５６、５５１〜
５６１、５５６〜５６６、５６１〜５７１、５６６〜５７６、５７１〜５８１、
５７６〜５８６、５８１〜５９１、５８６〜５９６、５９１〜６０１、５９６〜
６０１（図２のアミノ酸の番号について言及する）に存在しうる。
変異の点から定義されてもよい。該ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼの突然変異は、
アミノ酸４２１〜４３１、４２６〜４３６、４３１〜４４１、４３６〜４４６、
４４１〜４５１、４４６〜４５６、４５１〜４６１、４５６〜４６６、４６１〜
４７１、４６６〜４７６、４７１〜４８１、４７６〜４８６、４８１〜４９１、
４８６〜４９６、４９１〜５０１、４９６〜５０６、５０１〜５１１、５０６〜
５１６、５１１〜５２１、５１６〜５２６、５２１〜５３１、５２６〜５３６、
５３１〜５４１、５３６〜５４６、５４１〜５５１、５４６〜５５６、５５１〜
５６１、５５６〜５６６、５６１〜５７１、５６６〜５７６、５７１〜５８１、
５７６〜５８６、５８１〜５９１、５８６〜５９６、５９１〜６０１、５９６〜
６０１（図２のアミノ酸の番号について言及する）に存在しうる。
【００６７】
ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼの突然変異には、Ｌ４２６Ｉ／Ｖ、Ｌ４２８Ｉ／
Ｖ、Ｑ４７６、Ｎ４８０Ｇ、Ｎ４８５Ｋ、Ｋ４９５Ｒ、Ｒ４９９Ｑ、Ｇ４９９Ｅ
、Ｗ４９９Ｑ、Ｆ５１２Ｌ、Ｉ５１５Ｌ、Ｖ５１９Ｌ、Ｌ５２６Ｍ、Ｍ５５０Ｖ
、Ｍ５５０Ｉ、Ｖ５５３Ｉ、Ｓ５６５Ｐが含まれることが好ましい。有用な多重
突然変異としては、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｉ、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ、Ｖ５１
９Ｌ／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ及びＶ５１９Ｌ／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｉが挙げ
られる。
Ｖ、Ｑ４７６、Ｎ４８０Ｇ、Ｎ４８５Ｋ、Ｋ４９５Ｒ、Ｒ４９９Ｑ、Ｇ４９９Ｅ
、Ｗ４９９Ｑ、Ｆ５１２Ｌ、Ｉ５１５Ｌ、Ｖ５１９Ｌ、Ｌ５２６Ｍ、Ｍ５５０Ｖ
、Ｍ５５０Ｉ、Ｖ５５３Ｉ、Ｓ５６５Ｐが含まれることが好ましい。有用な多重
突然変異としては、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｉ、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ、Ｖ５１
９Ｌ／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ及びＶ５１９Ｌ／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｉが挙げ
られる。
【００６８】
ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列における突然変異は、ＨＢｓＡｇの１〜１０、５〜
１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜
４５、４０〜５０、４５〜５５、５０〜６０、５５〜６５、６０〜７０、６５〜
７５、７０〜８０、７５〜８５、８０〜９０、８５〜９５、９０〜１００、９５
〜１０５、１００〜１１０、１０５〜１１５、１１０〜１２０、１１５〜１２５
、１２０〜１３０、１２５〜１３５、１３０〜１４０、１３５〜１４５、１４０
〜１５０、１４５〜１５５、１５０〜１６０、１５５〜１６５、１６０〜１７０
、１６５〜１７５、１７０〜１８０、１７５〜１８５、１８０〜１９０、１８５
〜１９５、１９０〜２００、１９５〜２０５、２００〜２１０、２０５〜２１５
、２１０〜２２０、２１５〜２２５、２２０〜２２６のアミノ酸におけるアミノ
酸の置換、欠失及び／又は付加又は先端切除であることが好ましい（式IIの番号
について言及する）。特に有用な突然変異はＧ１１２Ｒ、Ｔ１２３Ｐ、Ｙ／Ｆ１
３４Ｓ、Ｄ１４４Ｅ、Ｇ１４５Ｒ、Ａ１５７Ｄ、Ｅ１６４Ｄ、Ｆ１７０Ｌ、Ｍ１
９５Ｉ、Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ、Ｗ１９６ＳＴＯＰ、Ｍ１９８Ｉ、Ｗ１９９Ｓ
、Ｓ２０４Ｔ及びＳ２１０Ｒである。「ＳＴＯＰ」という用語は停止コドンを意
味する。
１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜
４５、４０〜５０、４５〜５５、５０〜６０、５５〜６５、６０〜７０、６５〜
７５、７０〜８０、７５〜８５、８０〜９０、８５〜９５、９０〜１００、９５
〜１０５、１００〜１１０、１０５〜１１５、１１０〜１２０、１１５〜１２５
、１２０〜１３０、１２５〜１３５、１３０〜１４０、１３５〜１４５、１４０
〜１５０、１４５〜１５５、１５０〜１６０、１５５〜１６５、１６０〜１７０
、１６５〜１７５、１７０〜１８０、１７５〜１８５、１８０〜１９０、１８５
〜１９５、１９０〜２００、１９５〜２０５、２００〜２１０、２０５〜２１５
、２１０〜２２０、２１５〜２２５、２２０〜２２６のアミノ酸におけるアミノ
酸の置換、欠失及び／又は付加又は先端切除であることが好ましい（式IIの番号
について言及する）。特に有用な突然変異はＧ１１２Ｒ、Ｔ１２３Ｐ、Ｙ／Ｆ１
３４Ｓ、Ｄ１４４Ｅ、Ｇ１４５Ｒ、Ａ１５７Ｄ、Ｅ１６４Ｄ、Ｆ１７０Ｌ、Ｍ１
９５Ｉ、Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ、Ｗ１９６ＳＴＯＰ、Ｍ１９８Ｉ、Ｗ１９９Ｓ
、Ｓ２０４Ｔ及びＳ２１０Ｒである。「ＳＴＯＰ」という用語は停止コドンを意
味する。
【００６９】
更により好ましい突然変異はＤ１４４Ｅ、Ｇ１４５Ｒ、Ａ１５７Ｄ、Ｅ１６４
Ｄ、Ｍ１９５Ｉ、Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ、Ｗ１９６ＳＴＯＰ、Ｍ１９８Ｉ、Ｗ
１９９Ｓ及びＳ２１０Ｒである。
Ｄ、Ｍ１９５Ｉ、Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ、Ｗ１９６ＳＴＯＰ、Ｍ１９８Ｉ、Ｗ
１９９Ｓ及びＳ２１０Ｒである。
【００７０】
特に好ましいプリコア遺伝子及びＢＣＰの突然変異はＡ１８１４Ｔ、Ｃ１８５
６Ｔ、Ｇ１８９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６
Ａ／Ｇ１８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ
及びＣ１６５３Ｔ（番号はＨＢＶの唯一のＥｃｏＲＩ部位からのものである）か
ら選択される。
６Ｔ、Ｇ１８９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６
Ａ／Ｇ１８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ
及びＣ１６５３Ｔ（番号はＨＢＶの唯一のＥｃｏＲＩ部位からのものである）か
ら選択される。
【００７１】
本発明は、プリコアの突然変異並びに該ＤＮＡポリメラーゼ及び任意選択の重
なり合うＨＢｓＡｇのヌクレオチド配列における突然変異などの上記突然変異の
二つ以上の組合わせに及び、例えばＬＡＭに対する感受性を低減するが、これら
に限定されない。後者の例はＬ５２６Ｍ＋Ｍ５５０Ｖ[Ｍ１９５Ｉ]又はＭ５５０
Ｉ[Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ又はＷ１９６ＳＴＯＰ]とＧ１８９６Ａなどのプリコ
アの突然変異を含むが、これらに限定されない。
なり合うＨＢｓＡｇのヌクレオチド配列における突然変異などの上記突然変異の
二つ以上の組合わせに及び、例えばＬＡＭに対する感受性を低減するが、これら
に限定されない。後者の例はＬ５２６Ｍ＋Ｍ５５０Ｖ[Ｍ１９５Ｉ]又はＭ５５０
Ｉ[Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ又はＷ１９６ＳＴＯＰ]とＧ１８９６Ａなどのプリコ
アの突然変異を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
本発明の変異型ＨＢＶの改変されたＨＢｓＡｇ分子はヌクレオチドのレベルで
も定義されうる。対照のＨＢＶに由来するＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド
配列は以下に式III に示す。
も定義されうる。対照のＨＢＶに由来するＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド
配列は以下に式III に示す。
【００７３】
【化３】
【００７４】
上式中、
Ｎ1 はＡ又はＣであり；
Ｎ2 は Ｔ又はＡであり；
Ｎ3 は Ｃ又はＴであり；
Ｎ4 は Ｃ又はＴであり；
Ｎ5 は Ｃ又はＴであり；
Ｎ6 は Ｃ又はＴであり；
Ｎ7 は Ａ又はＧであり；
Ｎ8 は Ｔ又はＣであり；
Ｎ9 は Ｃ又はＧであり；
Ｎ10は Ｇ又はＡであり；
Ｎ11は Ｔ又はＡであり；
Ｎ12は Ｔ又はＧであり；
Ｎ13 はＴ又はＣであり；
Ｎ14は Ｃ又はＴであり；
Ｎ15は Ｔ又はＣであり；
Ｎ16は Ｔ又はＣであり；
Ｎ17は Ｔ又はＣであり；
Ｎ18は Ａ又はＴであり；
Ｎ19は Ａ又はＧであり；
Ｎ20は Ｔ又はＧであり；
Ｎ21は Ａ又はＴであり；
Ｎ22は Ａ又はＧであり；
Ｎ23は Ｔ又はＧであり；
Ｎ24は Ａ又はＧであり；
Ｎ25は Ｔ又はＣであり；
Ｎ26は Ｔ又はＣであり；並びに
Ｎ27は Ｔ又はＣである。
【００７５】
従って、本発明の他の一側面は、ある薬剤に対して改変された感受性を有する
変異型ＨＢＶについての検定法であって、該変異型ＨＢＶは式III で示されるヌ
クレオチド配列に対して単数又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠
失を含むヌクレオチド配列を含むものであり、該変異型ＨＢＶは式IIにより定義
された表面抗原と比べて改変された免疫プロフィールを示す表面抗原を有するも
のであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝配列を複製し、発現し、
又は組立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は細胞上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである方法を提供する。。
変異型ＨＢＶについての検定法であって、該変異型ＨＢＶは式III で示されるヌ
クレオチド配列に対して単数又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠
失を含むヌクレオチド配列を含むものであり、該変異型ＨＢＶは式IIにより定義
された表面抗原と比べて改変された免疫プロフィールを示す表面抗原を有するも
のであり、該方法は、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合した
該変異型ＨＢＶに由来するゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程及び該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノムを含
む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝配列を複製し、発現し、
又は組立てるのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、並びに 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、又
は組み立てるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶解物又は細胞上清液をウイ
ルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかける工程、 を含むものである方法を提供する。。
【００７６】
一般的に、バキュロウイルスゲノム内に挿入する必要のあるＨＢＶゲノムの有
効量は、ＨＢＶゲノムの１００％と機能的に同等であるが、１００％以上を含ん
でもよい。例えば、ＨＢＶゲノムのおよそ1.05倍、1.1倍、1.2倍、1.28倍、1.3
倍、1.4倍、1.5倍及び1.6〜1.9倍、2.0倍及び3.0倍を含む構築物が特に有用であ
る。
効量は、ＨＢＶゲノムの１００％と機能的に同等であるが、１００％以上を含ん
でもよい。例えば、ＨＢＶゲノムのおよそ1.05倍、1.1倍、1.2倍、1.28倍、1.3
倍、1.4倍、1.5倍及び1.6〜1.9倍、2.0倍及び3.0倍を含む構築物が特に有用であ
る。
【００７７】
バキュロウイルスにより感染され得る任意の細胞が本発明の実施に使用しうる
。胚芽腫細胞系統のＨｅｐＧ２、又はその誘導体は、特に有用であり、インビト
ロで細胞培養できる。Ｈｕｈ−７細胞も使用しうる。または、任意の肝細胞の細
胞系統及び初代の肝細胞の細胞培養が使用しうる。
。胚芽腫細胞系統のＨｅｐＧ２、又はその誘導体は、特に有用であり、インビト
ロで細胞培養できる。Ｈｕｈ−７細胞も使用しうる。または、任意の肝細胞の細
胞系統及び初代の肝細胞の細胞培養が使用しうる。
【００７８】
便宜上、ＨＢＶゲノム及びバキュロウイルスゲノムの感染に有効な量を含む遺
伝子構築物は、本明細書で「ＨＢＶバキュロウイルス」、「組換えＨＢＶバキュ
ロウイルス」及び「ＨＢＶバキュロウイルスベクター」と呼ばれる。組換えＨＢ
Ｖバキュロウイルスは、ヒトの細胞へのＨＢＶの遺伝情報の送達に有効なベクタ
ーであり、該細胞におけるＨＢＶの遺伝子発現及び複製を開始するために用いら
れ得る。ＨＢＶの転写産物、細胞内のＨＢＶ抗原及び分泌されるＨＢＶ抗原が生
産され、培地中における高レベルの細胞内の複製中間体及び保護されたＨＢＶ・
ＤＮＡの存在により証明されるように複製が起きる。この系において、ＨＢＶの
コア粒子が新しく合成されたＨＢＶゲノムを感染細胞の核内に戻すことができる
ことを示すウイルスＣＣＣ・ＤＮＡが検出され得る。早くも感染の後（p.i.）一
日目に強力なＨＢＶ遺伝子の発現が検出できる。高レベルのＨＢＶの複製中間体
、細胞外ＤＮＡ、及びＣＣＣ・ＤＮＡは少なくとも感染の１１日後にも残存する
。内因性ＨＢＶのエンハンサー及びプロモーターは細胞で高レベルのＨＢＶの発
現及び複製を得るために使用されうる。
伝子構築物は、本明細書で「ＨＢＶバキュロウイルス」、「組換えＨＢＶバキュ
ロウイルス」及び「ＨＢＶバキュロウイルスベクター」と呼ばれる。組換えＨＢ
Ｖバキュロウイルスは、ヒトの細胞へのＨＢＶの遺伝情報の送達に有効なベクタ
ーであり、該細胞におけるＨＢＶの遺伝子発現及び複製を開始するために用いら
れ得る。ＨＢＶの転写産物、細胞内のＨＢＶ抗原及び分泌されるＨＢＶ抗原が生
産され、培地中における高レベルの細胞内の複製中間体及び保護されたＨＢＶ・
ＤＮＡの存在により証明されるように複製が起きる。この系において、ＨＢＶの
コア粒子が新しく合成されたＨＢＶゲノムを感染細胞の核内に戻すことができる
ことを示すウイルスＣＣＣ・ＤＮＡが検出され得る。早くも感染の後（p.i.）一
日目に強力なＨＢＶ遺伝子の発現が検出できる。高レベルのＨＢＶの複製中間体
、細胞外ＤＮＡ、及びＣＣＣ・ＤＮＡは少なくとも感染の１１日後にも残存する
。内因性ＨＢＶのエンハンサー及びプロモーターは細胞で高レベルのＨＢＶの発
現及び複製を得るために使用されうる。
【００７９】
ＨＢＶバキュロウイルスに感染した細胞におけるＨＢＶの発現及び複製のレベ
ルは、単に感染多重度を変更することにより相当の範囲にわたって改変できる。
ルは、単に感染多重度を変更することにより相当の範囲にわたって改変できる。
【００８０】
さらに、共感染又は重感染は、二つ以上の変異型ＨＢＶ又は一つの変異型と一
つの野性型株など二つ以上のＨＢＶ型に由来するゲノムを用いて起こり得る。こ
の点で、幾つかのＨＢＶ準種は通常二つ以上の変異型ＨＢＶ又は一つの変異型（
若しくは複数の変異型）と一つの野性型株から構成されるＨＢＶに感染した患者
から単離される。ある状況ではこれらの準種について試験すること並びに該治療
用薬剤に対する該準種の改変された感受性又は抵抗性を測定することが重要であ
る。核酸又は抗体の検出系は異なるＨＢＶの相対量を検出するために使用しうる
。これは、単一種の変異型ＨＢＶ並びに野性型株を含む複数の変異型ＨＢＶに対
して効果的であるために必要な治療法の開発に重要である。
つの野性型株など二つ以上のＨＢＶ型に由来するゲノムを用いて起こり得る。こ
の点で、幾つかのＨＢＶ準種は通常二つ以上の変異型ＨＢＶ又は一つの変異型（
若しくは複数の変異型）と一つの野性型株から構成されるＨＢＶに感染した患者
から単離される。ある状況ではこれらの準種について試験すること並びに該治療
用薬剤に対する該準種の改変された感受性又は抵抗性を測定することが重要であ
る。核酸又は抗体の検出系は異なるＨＢＶの相対量を検出するために使用しうる
。これは、単一種の変異型ＨＢＶ並びに野性型株を含む複数の変異型ＨＢＶに対
して効果的であるために必要な治療法の開発に重要である。
【００８１】
該検出検定法に関する「ＨＢＶ」又はその「成分」についての言及は、ＲＮＡ
、ＤＮＡ、抗原性分子又はＨＢＶに特異的な活性の存在についての言及を含む。
便宜上、該検定法は定量的、部分的に定量的、又は定性的に実施される。ＨＢＶ
の全ＲＮＡ又は全ＤＮＡを検出することが最も好ましく、これは特定の薬剤の存
在下におけるＲＮＡ又はＤＮＡの量を提供する。変異型ＨＢＶが野性型株と比べ
て特定の薬剤に対してより耐性である場合、全ＲＮＡ又は全ＤＮＡ対薬剤濃度の
図式表示から、減少した阻害の勾配及び／又はＲＮＡ又はＤＮＡの生成阻害のた
めに必要な薬剤濃度の増加が得られる可能性がある。
、ＤＮＡ、抗原性分子又はＨＢＶに特異的な活性の存在についての言及を含む。
便宜上、該検定法は定量的、部分的に定量的、又は定性的に実施される。ＨＢＶ
の全ＲＮＡ又は全ＤＮＡを検出することが最も好ましく、これは特定の薬剤の存
在下におけるＲＮＡ又はＤＮＡの量を提供する。変異型ＨＢＶが野性型株と比べ
て特定の薬剤に対してより耐性である場合、全ＲＮＡ又は全ＤＮＡ対薬剤濃度の
図式表示から、減少した阻害の勾配及び／又はＲＮＡ又はＤＮＡの生成阻害のた
めに必要な薬剤濃度の増加が得られる可能性がある。
【００８２】
本発明の他の側面は、変異型ＨＢＶバキュロウイルスに感染した細胞から単離
されたＨＢＶ粒子に由来するポリメラーゼ活性の検出方法を提供する。該方法は
ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログである逆転写酵
素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログであるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻
害剤に対する該ポリメラーゼの感受性を測定する。該ＨＢＶ粒子は変異型ＨＢＶ
の細胞培養液、細胞溶解物又は感染細胞から採取できる。この検定法は、対照の
ＨＢＶ及び変異型ＨＢＶに対するヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌク
レオシドアナログである逆転写酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログであるＤ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の効果を測定する。
されたＨＢＶ粒子に由来するポリメラーゼ活性の検出方法を提供する。該方法は
ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログである逆転写酵
素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログであるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻
害剤に対する該ポリメラーゼの感受性を測定する。該ＨＢＶ粒子は変異型ＨＢＶ
の細胞培養液、細胞溶解物又は感染細胞から採取できる。この検定法は、対照の
ＨＢＶ及び変異型ＨＢＶに対するヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌク
レオシドアナログである逆転写酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログであるＤ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の効果を測定する。
【００８３】
従って、本発明のこの側面は、ある薬剤に対して改変された感受性を示すＤＮ
Ａポリメラーゼを含む変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合
した該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、次いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノム
を含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが遺伝子配列を複製し、発現し、及び／又はウイルス若し
くはウイルス様粒子を組み立て及び／又は放出するのに十分な時間及び条件の下
で該細胞を培養する工程、及び ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログの逆転写
酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害
剤の存在下若しくは非存在下で、該細胞、細胞溶解物若しくは培養上清液又はそ
れから精製されたＨＢＶ粒子をＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ検定法にかける工程
、 を含む方法を提供する。。
Ａポリメラーゼを含む変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合
した該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、次いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノム
を含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが遺伝子配列を複製し、発現し、及び／又はウイルス若し
くはウイルス様粒子を組み立て及び／又は放出するのに十分な時間及び条件の下
で該細胞を培養する工程、及び ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログの逆転写
酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害
剤の存在下若しくは非存在下で、該細胞、細胞溶解物若しくは培養上清液又はそ
れから精製されたＨＢＶ粒子をＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ検定法にかける工程
、 を含む方法を提供する。。
【００８４】
本発明の更なる側面は、ある薬剤に対して改変された感受性を示すＤＮＡポリ
メラーゼを含む変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合
した該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、次いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と任意選択的に接触
させる工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノム
を含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発
現し、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て及び／又は放出す
るのに十分な時間及び条件の下で該細胞を培養する工程、及び ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログの逆転写
酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害
剤の存在下若しくは非存在下で、該細胞、細胞溶解物若しくは培養上清液又はそ
れから精製されたウイルスをＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ検定法にかける工程、
を含む方法を提供する。
メラーゼを含む変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合
した該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、次いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と任意選択的に接触
させる工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノム
を含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発
現し、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て及び／又は放出す
るのに十分な時間及び条件の下で該細胞を培養する工程、及び ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログの逆転写
酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害
剤の存在下若しくは非存在下で、該細胞、細胞溶解物若しくは培養上清液又はそ
れから精製されたウイルスをＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ検定法にかける工程、
を含む方法を提供する。
【００８５】
その上、本発明の更なる側面は抗ウイルス剤の存在下でＤＮＡポリメラーゼ活
性を検出する方法であって、 該ＤＮＡポリメラーゼを生産できるＨＢＶ由来のゲノムの複製可能量を含
む遺伝子構築物を作成する工程であって、該ゲノムが細胞に感染できるバキュロ
ウイルスゲノムのある量を含み又はそれに融合しているものである工程、及び次
いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前及び／又は後に、テストすべき抗ウイルス剤と該細胞を接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で若しくはＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ株のゲノム
を含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し、
及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組立て及び／又は放出するのに十
分な時間及び条件の下で該細胞を培養する工程、及び ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログの逆転写
酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害
剤の存在下若しくは非存在下に、該細胞、細胞溶解物若しくは培養上清液又はそ
れから精製されたウイルスをＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ検定法にかける工程、
を含む方法を意図する。
性を検出する方法であって、 該ＤＮＡポリメラーゼを生産できるＨＢＶ由来のゲノムの複製可能量を含
む遺伝子構築物を作成する工程であって、該ゲノムが細胞に感染できるバキュロ
ウイルスゲノムのある量を含み又はそれに融合しているものである工程、及び次
いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前及び／又は後に、テストすべき抗ウイルス剤と該細胞を接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で若しくはＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ株のゲノム
を含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し、
及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組立て及び／又は放出するのに十
分な時間及び条件の下で該細胞を培養する工程、及び ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログの逆転写
酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害
剤の存在下若しくは非存在下に、該細胞、細胞溶解物若しくは培養上清液又はそ
れから精製されたウイルスをＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ検定法にかける工程、
を含む方法を意図する。
【００８６】
本発明は下記の非制限的な実施例によりさらに説明される。
【００８７】
実施例１
ＨＢＶの重なり合うゲノム
ＨＢＶの重なり合うゲノムは図１に示される。ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ）をコ
ードする遺伝子は、ウイルスのエンベロープ遺伝子であるプリ−Ｓ１及びプリ−
Ｓ２と重なり、そして部分的にはＸ遺伝子及びコア（Ｃ）遺伝子と重なる。ＨＢ
Ｖエンベロープは小、中及び大のＨＢＶ表面抗原を含む。この大タンパク質成分
はＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）と呼ばれ、Ｓ遺伝子配列によって囲まれている
。プリ−Ｓ１及びプリ−Ｓ２遺伝子配列は他のエンベロープ成分をコードする。
ードする遺伝子は、ウイルスのエンベロープ遺伝子であるプリ−Ｓ１及びプリ−
Ｓ２と重なり、そして部分的にはＸ遺伝子及びコア（Ｃ）遺伝子と重なる。ＨＢ
Ｖエンベロープは小、中及び大のＨＢＶ表面抗原を含む。この大タンパク質成分
はＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）と呼ばれ、Ｓ遺伝子配列によって囲まれている
。プリ−Ｓ１及びプリ−Ｓ２遺伝子配列は他のエンベロープ成分をコードする。
【００８８】
実施例２
ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸コンセンサス配列
遺伝子型ＡからＧまでのＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼタンパク質のアミノ酸コ
ンセンサス配列は図２に示す。
ンセンサス配列は図２に示す。
【００８９】
実施例３
ＨＢｓＡｇのコンセンサス配列
表面抗原をコードするＨＢＶの種々の株からのヌクレオチド配列を図３に示す
。アミノ酸１０８で始まる表面抗原のアミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示
す。
。アミノ酸１０８で始まる表面抗原のアミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示
す。
【００９０】
実施例４
部位特異的突然変異誘発により作成されたＨＢＶ変異型
表１は部位特異的突然変異誘発により作成されたＨＢＶ変異型の一部の概要を
示す。
示す。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【外４】
【００９３】
【外５】
【００９４】
実施例５
細胞培養
Ｓｆ２１昆虫細胞は補充したグレース昆虫培地にさらに１０％（ｖ／ｖ）の加
熱失活牛胎仔血清（ギブコＢＲＬ，ガイザースブルグ，ＭＤ）を補充した培地で
加湿インキュベーター中でＣＯ2 と共に２８℃で維持した。ＨｅｐＧ２細胞は１
０％（ｖ／ｖ）の加熱失活牛胎仔血清（ＭＥＭ−ＦＢＳ）を補充した最小必須培
地中で維持した。ＨｅｐＧ２細胞は３７℃の加湿インキュベーター中５％（ｖ／
ｖ）ＣＯ2 で成長させた。
熱失活牛胎仔血清（ギブコＢＲＬ，ガイザースブルグ，ＭＤ）を補充した培地で
加湿インキュベーター中でＣＯ2 と共に２８℃で維持した。ＨｅｐＧ２細胞は１
０％（ｖ／ｖ）の加熱失活牛胎仔血清（ＭＥＭ−ＦＢＳ）を補充した最小必須培
地中で維持した。ＨｅｐＧ２細胞は３７℃の加湿インキュベーター中５％（ｖ／
ｖ）ＣＯ2 で成長させた。
【００９５】
実施例６
バキュロウイルス・トランスファー・ベクターの調製
組換えトランスファーベクターは、変異型ＨＢＶゲノム構築物の必要量を含む
断片を切断し、それをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（インビトロゲン社，カールスバ
ド，ＣＡ）などのバキュロウイルスベクターの多重クローニング領域中にクロー
ニングすることにより作成した。図４Ａ及び４Ｂは組換えトランスファーベクタ
ー１．２８及び１．５ＨＢＶゲノム構築物をそれぞれコードするプラスミドの表
示である。同様のバキュロウイルストランスファーベクターはＨＢＶ１．３構築
物からも構築しうる。組換えトランスファーベクターＨＢＶ１．３の図式的表示
は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１１５３〔ＷＯ９９／３７８２１〕の
図１に示してある。制限地図による組換えトランスファーベクターの解析から、
該構築物にはＨＢＶゲノム部分のたった１個のコピーしか存在しないことが証明
された。このプラスミドのヌクレオチド配列、及び部位特異的突然変異誘発によ
り作成された点突然変異はＡＢＩプリズム・ビッグ・ダイ・ターミネーター・サ
イクル・シーケンシング・レディ・リアクション・キットを用い、製造業者（パ
ーキン・エルマー，シータス ノルウォーク，ＣＴ）の説明に従って配列決定す
ることにより確認した。
断片を切断し、それをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（インビトロゲン社，カールスバ
ド，ＣＡ）などのバキュロウイルスベクターの多重クローニング領域中にクロー
ニングすることにより作成した。図４Ａ及び４Ｂは組換えトランスファーベクタ
ー１．２８及び１．５ＨＢＶゲノム構築物をそれぞれコードするプラスミドの表
示である。同様のバキュロウイルストランスファーベクターはＨＢＶ１．３構築
物からも構築しうる。組換えトランスファーベクターＨＢＶ１．３の図式的表示
は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１１５３〔ＷＯ９９／３７８２１〕の
図１に示してある。制限地図による組換えトランスファーベクターの解析から、
該構築物にはＨＢＶゲノム部分のたった１個のコピーしか存在しないことが証明
された。このプラスミドのヌクレオチド配列、及び部位特異的突然変異誘発によ
り作成された点突然変異はＡＢＩプリズム・ビッグ・ダイ・ターミネーター・サ
イクル・シーケンシング・レディ・リアクション・キットを用い、製造業者（パ
ーキン・エルマー，シータス ノルウォーク，ＣＴ）の説明に従って配列決定す
ることにより確認した。
【００９６】
実施例７
１．２８ＨＢＶゲノム及び１．５ＨＢＶゲノムの配列
１．２８ＨＢＶゲノム及び１．５ＨＢＶゲノムの配列（それぞれ、図５Ａ及び
５Ｂ）はＡＢＩプリズム・ビッグ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケン
シング・レディ・リアクション・キットを用い、製造業者（パーキン・エルマー
，シータス ノルウォーク，ＣＴ）の説明に従って解明された。
５Ｂ）はＡＢＩプリズム・ビッグ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケン
シング・レディ・リアクション・キットを用い、製造業者（パーキン・エルマー
，シータス ノルウォーク，ＣＴ）の説明に従って解明された。
【００９７】
実施例８
１．２８ＨＢＶ構築物、１．５ＨＢＶ構築物、及び１．３ＨＢＶ構築物
を含む組換えバキュロウイルスの作成
精製した組換えトランスファーベクター及び直鎖状のＡｃＭＮＰＶバキュロウ
イルスＤＮＡを、インビトロゲン社（カールスバド，ＣＡ）のＢａｃＮＢｌｕｅ
・トランスフェクション・キットを用いて、Ｓｆ２１細胞中に同時にトランスフ
ェクトした。組換え体ウイルスは製造業者の指示に従ってプラークアッセイによ
り単離した。一連の組換え体ウイルスは、１００ｍｍ皿のＳｆ２１細胞に感染さ
せることにより単離したプラークから増幅させた。標準的手順を用いて増幅した
ウイルスからウイルスＤＮＡを抽出した。精製したウイルスＤＮＡを制限酵素で
消化し、次いで１．０％（ｖ／ｖ）アガロースゲル中電気泳動により分画した。
どのウイルス単離物が完全な１．２８、１．５、又は１．３ＨＢＶ構築物を含む
かを決定するため、サザン・ブロッティングを行なった。ベーリンガー・マンハ
イム・ランダム・プライム・ＤＮＡ・ラベリング・キット（インディアナポリス
，ＩＮ）を用いて〔Ｐ32〕−放射標識プローブを作成した。全ての放射標識プロ
ーブのために完全長の二本鎖ＨＢＶゲノムを鋳型として用いた。ウイルスＤＮＡ
配列は、センスプライマー５’ＧＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＧＧＧ ＴＣ
Ａ ＣＣＡ ＴＡ−３’〔＜４００＞１〕（ＨＢＶゲンバンク受託番号Ｍ３８４
５４のヌクレオチド１４０８から１４３０まで）及びアンチセンスプライマー５
’−ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＣＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＣＣＡ ＡＴ−３’〔＜４００
＞２〕（ＨＢＶゲンバンク受託番号Ｍ３８４５４のヌクレオチド２８１７から２
７９８まで）を用いてポリメラーゼ触媒領域のＰＣＲ増幅により確認した。内部
領域の配列決定には次のプライマーを利用した。５’−ＴＧＣ ＡＣＧ ＡＴ
Ｔ ＣＣＴ ＧＣＴ ＣＡＡ−３’〔＜４００＞３〕（ＨＢＶゲンバンク受託番
号Ｍ３８４５４のヌクレオチド２３４５から２３６２まで）及び５’−ＴＴＴ
ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧ−３’〔＜４００＞４〕（ＨＢ
Ｖゲンバンク受託番号Ｍ３８４５４のヌクレオチド１７９０から１８１０まで）
である。
イルスＤＮＡを、インビトロゲン社（カールスバド，ＣＡ）のＢａｃＮＢｌｕｅ
・トランスフェクション・キットを用いて、Ｓｆ２１細胞中に同時にトランスフ
ェクトした。組換え体ウイルスは製造業者の指示に従ってプラークアッセイによ
り単離した。一連の組換え体ウイルスは、１００ｍｍ皿のＳｆ２１細胞に感染さ
せることにより単離したプラークから増幅させた。標準的手順を用いて増幅した
ウイルスからウイルスＤＮＡを抽出した。精製したウイルスＤＮＡを制限酵素で
消化し、次いで１．０％（ｖ／ｖ）アガロースゲル中電気泳動により分画した。
どのウイルス単離物が完全な１．２８、１．５、又は１．３ＨＢＶ構築物を含む
かを決定するため、サザン・ブロッティングを行なった。ベーリンガー・マンハ
イム・ランダム・プライム・ＤＮＡ・ラベリング・キット（インディアナポリス
，ＩＮ）を用いて〔Ｐ32〕−放射標識プローブを作成した。全ての放射標識プロ
ーブのために完全長の二本鎖ＨＢＶゲノムを鋳型として用いた。ウイルスＤＮＡ
配列は、センスプライマー５’ＧＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＧＧＧ ＴＣ
Ａ ＣＣＡ ＴＡ−３’〔＜４００＞１〕（ＨＢＶゲンバンク受託番号Ｍ３８４
５４のヌクレオチド１４０８から１４３０まで）及びアンチセンスプライマー５
’−ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＣＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＣＣＡ ＡＴ−３’〔＜４００
＞２〕（ＨＢＶゲンバンク受託番号Ｍ３８４５４のヌクレオチド２８１７から２
７９８まで）を用いてポリメラーゼ触媒領域のＰＣＲ増幅により確認した。内部
領域の配列決定には次のプライマーを利用した。５’−ＴＧＣ ＡＣＧ ＡＴ
Ｔ ＣＣＴ ＧＣＴ ＣＡＡ−３’〔＜４００＞３〕（ＨＢＶゲンバンク受託番
号Ｍ３８４５４のヌクレオチド２３４５から２３６２まで）及び５’−ＴＴＴ
ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧ−３’〔＜４００＞４〕（ＨＢ
Ｖゲンバンク受託番号Ｍ３８４５４のヌクレオチド１７９０から１８１０まで）
である。
【００９８】
実施例９
調製のためのバキュロウイルスの増幅及び精製
バキュロウイルスは、対数期にあるＳｆ２１細胞の懸濁培養に０．５ｐｆｕ／
細胞の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させることにより増幅した。感染は、フラス
コ中の細胞の大部分が感染の可視的徴候を示すまで行なわせた（４〜５日）。感
染したＳｆ２１培地から８０，０００×ｇで遠心分離することによりビリオンを
濃縮し、次いで２０〜６０％（ｗ／ｖ）の蔗糖勾配を通して精製した。精製した
ウイルスは端点希釈法によりＳｆ２１細胞中で４連で滴定した。高力価貯蔵品そ
れぞれの部分標本を用いてＤＮＡ抽出を行なった。このポリメラーゼ遺伝子を増
幅し、実施例８と同様に部位特異的突然変異誘発の存在を確認するため配列決定
を行なった。
細胞の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させることにより増幅した。感染は、フラス
コ中の細胞の大部分が感染の可視的徴候を示すまで行なわせた（４〜５日）。感
染したＳｆ２１培地から８０，０００×ｇで遠心分離することによりビリオンを
濃縮し、次いで２０〜６０％（ｗ／ｖ）の蔗糖勾配を通して精製した。精製した
ウイルスは端点希釈法によりＳｆ２１細胞中で４連で滴定した。高力価貯蔵品そ
れぞれの部分標本を用いてＤＮＡ抽出を行なった。このポリメラーゼ遺伝子を増
幅し、実施例８と同様に部位特異的突然変異誘発の存在を確認するため配列決定
を行なった。
【００９９】
実施例１０
組換えＨＢＶを発現するバキュロウイルスを用いてのＨｅｐＧ２細胞の感染
ＨｅｐＧ２細胞を約２０〜４０％のコンフルーエンシーで播き、１６〜２４時
間増殖させた後感染させた。感染の日に、３連の細胞プレートをトリプシン処理
し、生存細胞の数をトリパン・ブルー排除を用い血球計で測定した。平均的細胞
数を計算し、用いて、示されたｍｏｉで細胞を感染させるために必要な高力価ウ
イルス貯蔵品の量を決定した。ＨｅｐＧ２細胞を無血清ＭＥＭで１回洗浄して微
量の血清を除いた。１００ｍｍ、６０ｍｍ、及び３５ｍｍの皿のそれぞれを感染
させるため１．０、０．５、及び０．２５ｍｌの容量を用い、適切なｍｏｉを得
るため、バキュロウイルスを血清を含まないＭＥＭ中に希釈した。バキュロウイ
ルスを、種ウイルスが均等に分布するように１５分毎にゆっくりと揺さぶりなが
ら３７℃で１時間、ＨｅｐＧ２細胞に吸着させた。次いで種ウイルスを吸引し、
ＨｅｐＧ２細胞をリン酸塩緩衝化食塩水で２回洗浄した後、種々の濃度の薬剤を
添加した又は添加してないＭＥＭ−ＦＢＳに再投入した。
間増殖させた後感染させた。感染の日に、３連の細胞プレートをトリプシン処理
し、生存細胞の数をトリパン・ブルー排除を用い血球計で測定した。平均的細胞
数を計算し、用いて、示されたｍｏｉで細胞を感染させるために必要な高力価ウ
イルス貯蔵品の量を決定した。ＨｅｐＧ２細胞を無血清ＭＥＭで１回洗浄して微
量の血清を除いた。１００ｍｍ、６０ｍｍ、及び３５ｍｍの皿のそれぞれを感染
させるため１．０、０．５、及び０．２５ｍｌの容量を用い、適切なｍｏｉを得
るため、バキュロウイルスを血清を含まないＭＥＭ中に希釈した。バキュロウイ
ルスを、種ウイルスが均等に分布するように１５分毎にゆっくりと揺さぶりなが
ら３７℃で１時間、ＨｅｐＧ２細胞に吸着させた。次いで種ウイルスを吸引し、
ＨｅｐＧ２細胞をリン酸塩緩衝化食塩水で２回洗浄した後、種々の濃度の薬剤を
添加した又は添加してないＭＥＭ−ＦＢＳに再投入した。
【０１００】
実施例１１
分泌されたＨＢＶ抗原の分析
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及びＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の検出は
アボットラボラトリーズ（アボット・パーク，ＩＬ）から購入したキットを用い
て放射免疫検定及び微粒子酵素免疫検定により行なった。ＨｅｐＧ２細胞からの
培地を集め、６，０００ｇで遠心分離して細胞破砕物を除き、クリーンな試験管
に移し、分析するまで２０℃で貯蔵した。ＨＢｓＡｇの量は既知量のＨＢｓＡｇ
（該キットと共に供給される）を用いて作成された標準曲線から計算した。ＨＢ
ｅＡｇの値は陽性対照の倍数として表される。培地試料は、放射免疫検定の結果
が標準曲線（ＨＢｓＡｇ）の中に納まるように、又は陽性対照の値（ＨＢｅＡｇ
）の下になるように適当に希釈した。
アボットラボラトリーズ（アボット・パーク，ＩＬ）から購入したキットを用い
て放射免疫検定及び微粒子酵素免疫検定により行なった。ＨｅｐＧ２細胞からの
培地を集め、６，０００ｇで遠心分離して細胞破砕物を除き、クリーンな試験管
に移し、分析するまで２０℃で貯蔵した。ＨＢｓＡｇの量は既知量のＨＢｓＡｇ
（該キットと共に供給される）を用いて作成された標準曲線から計算した。ＨＢ
ｅＡｇの値は陽性対照の倍数として表される。培地試料は、放射免疫検定の結果
が標準曲線（ＨＢｓＡｇ）の中に納まるように、又は陽性対照の値（ＨＢｅＡｇ
）の下になるように適当に希釈した。
【０１０１】
実施例１２
細胞内の複製中間体の検出
ＨＢＶコア粒子は、０．５％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０中で溶解されたＨｅｐＧ２
細胞の細胞質画分から単離された。細胞質抽出液を１０ミリモル／リットルのＭ
ｃＣ１２に調節し、５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫと３７℃で１．５時間
インキュベートすることにより保護されていないＤＮＡを除去した。フェノール
及びクロロホルムによる逐次抽出の後に、核酸をエタノール沈殿により回収した
。核酸を５０μｌ／リットルＴＥ（１０ミリモル／リットルのトリス、１ミリモ
ル／リットルのエチレンジアミンテトラ酢酸）に再懸濁し、ＯＤ２６０により規
格化し、ついで１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ（ベーリンガー・マンハイム，イ
ンディアナポリス，ＩＮ）で、３７℃で１時間消化した後、電気泳動及びサザン
ブロッティングにより分析した。ＢｉｏＲａｄ・ＧＳ−６７０イメージング・デ
ンシトメータ及びモレキュラー・アナリスト・ソフトウエア（バイオラッド、ヒ
キュルズ，カリフォルニア）を用いてサザン・ブロットの適当な曝露を分析した
。デンシトメトリーのデータはジャンデル・サイエンティフィックのテーブル・
カーブ２Ｄ・ソフトウエア・パッケージを用いて、ロジスティック用量応答曲線
に適合させた。ロジスティック用量応答方程式を用いてＩＣ50値及びＩＣ90値、
及び変動係数を計算した。
細胞の細胞質画分から単離された。細胞質抽出液を１０ミリモル／リットルのＭ
ｃＣ１２に調節し、５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫと３７℃で１．５時間
インキュベートすることにより保護されていないＤＮＡを除去した。フェノール
及びクロロホルムによる逐次抽出の後に、核酸をエタノール沈殿により回収した
。核酸を５０μｌ／リットルＴＥ（１０ミリモル／リットルのトリス、１ミリモ
ル／リットルのエチレンジアミンテトラ酢酸）に再懸濁し、ＯＤ２６０により規
格化し、ついで１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ（ベーリンガー・マンハイム，イ
ンディアナポリス，ＩＮ）で、３７℃で１時間消化した後、電気泳動及びサザン
ブロッティングにより分析した。ＢｉｏＲａｄ・ＧＳ−６７０イメージング・デ
ンシトメータ及びモレキュラー・アナリスト・ソフトウエア（バイオラッド、ヒ
キュルズ，カリフォルニア）を用いてサザン・ブロットの適当な曝露を分析した
。デンシトメトリーのデータはジャンデル・サイエンティフィックのテーブル・
カーブ２Ｄ・ソフトウエア・パッケージを用いて、ロジスティック用量応答曲線
に適合させた。ロジスティック用量応答方程式を用いてＩＣ50値及びＩＣ90値、
及び変動係数を計算した。
【０１０２】
実施例１３
細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡの分析
ＨｅｐＧ２細胞からのコンディション化培地を集め、これを６，０００ｇで５
分間遠心分離して細胞破砕物を除去した。ＨＢＶ粒子を１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ
８０００で沈殿させ、１２，０００×ｇで遠心分離により濃縮した。ウイルスの
ペレットを１ｍｌのＭＥＭ−ＦＢＳ中に再懸濁し、二つの等分に分割した。１セ
ットの部分標本を７５０μｇ／ｍｌのプロナーゼで１時間処理し、次いで５００
ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ１で１時間処理した。次に、両方のセットの標本をプロ
テイナーゼＫで消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出した。ＤＮＡを０．
１容量の３モル／リットルの酢酸ナトリウム及び１容量のイソプロパノールで沈
殿させた。転移ＲＮＡの１０μｇを沈殿の間の担体として添加した。ペレットを
２５μｌのＴＥに再懸濁し、０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼで１時間消化した。
次にＤＮＡを電気泳動及びサザンブロッティングにより分析した。
分間遠心分離して細胞破砕物を除去した。ＨＢＶ粒子を１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ
８０００で沈殿させ、１２，０００×ｇで遠心分離により濃縮した。ウイルスの
ペレットを１ｍｌのＭＥＭ−ＦＢＳ中に再懸濁し、二つの等分に分割した。１セ
ットの部分標本を７５０μｇ／ｍｌのプロナーゼで１時間処理し、次いで５００
ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ１で１時間処理した。次に、両方のセットの標本をプロ
テイナーゼＫで消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出した。ＤＮＡを０．
１容量の３モル／リットルの酢酸ナトリウム及び１容量のイソプロパノールで沈
殿させた。転移ＲＮＡの１０μｇを沈殿の間の担体として添加した。ペレットを
２５μｌのＴＥに再懸濁し、０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼで１時間消化した。
次にＤＮＡを電気泳動及びサザンブロッティングにより分析した。
【０１０３】
実施例１４
３ＴＣ、ＰＭＥＡ及びＰＣＶ処理
３ＴＣ及びＰＣＶはスミスクラインビーチャム（カレッジヴィル，ＰＡ）のエ
ッサー，クラウスから恵与された。ＰＭＥＡはギリード（フォスター市，カリフ
ォルニア）から入手した。３ＴＣは、この薬物の反復凍結融解を避けるために、
無菌水に再懸濁し、等分に分け、−２０℃で凍結させた。ＰＭＥＡは、ＮａＯＨ
でｐＨを７．０に調節した後、無菌水に再懸濁した。ＰＣＶはジメチルスルホキ
シドに再懸濁した。３ＴＣを含む培地は、新鮮な３ＴＣの標品を用いて必要なと
きに毎日調製した。ウイルス感染の後に３ＴＣ処理が開始された実験では、Ｈｅ
ｐＧ２細胞は、ＨＢＶバキュロウイルスで感染させた直後に３ＴＣの指示された
濃度に曝された。３ＴＣでの前処理を利用する実験では、細胞は、ＨＢＶバキュ
ロウイルス感染の１６時間前に、３ＴＣを含む培地に投入された。ＨＢＶバキュ
ロウイルス感染は３ＴＣを含む培地中でも行なわれた。細胞は感染が完了し、洗
浄操作の直後に３ＴＣを含む新鮮な培地に再投入された。ＰＭＥＡ及びＰＣＶで
の処理は同様に行なわれた。
ッサー，クラウスから恵与された。ＰＭＥＡはギリード（フォスター市，カリフ
ォルニア）から入手した。３ＴＣは、この薬物の反復凍結融解を避けるために、
無菌水に再懸濁し、等分に分け、−２０℃で凍結させた。ＰＭＥＡは、ＮａＯＨ
でｐＨを７．０に調節した後、無菌水に再懸濁した。ＰＣＶはジメチルスルホキ
シドに再懸濁した。３ＴＣを含む培地は、新鮮な３ＴＣの標品を用いて必要なと
きに毎日調製した。ウイルス感染の後に３ＴＣ処理が開始された実験では、Ｈｅ
ｐＧ２細胞は、ＨＢＶバキュロウイルスで感染させた直後に３ＴＣの指示された
濃度に曝された。３ＴＣでの前処理を利用する実験では、細胞は、ＨＢＶバキュ
ロウイルス感染の１６時間前に、３ＴＣを含む培地に投入された。ＨＢＶバキュ
ロウイルス感染は３ＴＣを含む培地中でも行なわれた。細胞は感染が完了し、洗
浄操作の直後に３ＴＣを含む新鮮な培地に再投入された。ＰＭＥＡ及びＰＣＶで
の処理は同様に行なわれた。
【０１０４】
実施例１５
１．野性型ＨＢＶバキュロウイルスを用いて行なわれた抗ウイルス試験
野性型ＨＢＶに及ぼす３ＴＣ及びＰＭＥＡの用量効果は図６（Ａ、Ｂ）にグラ
フで示してあり、ＰＣＶの次第に増加する濃度の存在下で野性型ＨＢＶ−バキュ
ロウイルスで形質導入されたＨｅｐＧ２細胞により生産された細胞内ＨＢＶ複製
中間体及び細胞外ウイルスのサザンブロットは図６Ｃに示し、抗ウイルス剤それ
ぞれのＩＣ50は表２に示してある。３ＴＣは野性型ＨＢＶ複製に対して最も強い
効果を有していたが、ＰＣＶは中程度の効果を有していた。
フで示してあり、ＰＣＶの次第に増加する濃度の存在下で野性型ＨＢＶ−バキュ
ロウイルスで形質導入されたＨｅｐＧ２細胞により生産された細胞内ＨＢＶ複製
中間体及び細胞外ウイルスのサザンブロットは図６Ｃに示し、抗ウイルス剤それ
ぞれのＩＣ50は表２に示してある。３ＴＣは野性型ＨＢＶ複製に対して最も強い
効果を有していたが、ＰＣＶは中程度の効果を有していた。
【０１０５】
２．Ｌ５２６Ｍ・ＨＢＶバキュロウイルスを用いる抗ウイルス試験
図７Ａは図１Ａの野性型に比べてＬ５２６Ｍが３ＴＣに対して強い耐性を持つ
ことを示す。そこでは、ＩＣ50の０．５より大きな対数シフトが見られた。ＰＭ
ＥＡ又はＰＣＶでは有意の変化は観察されなかった（図７Ｂ、７Ｃ）。
ことを示す。そこでは、ＩＣ50の０．５より大きな対数シフトが見られた。ＰＭ
ＥＡ又はＰＣＶでは有意の変化は観察されなかった（図７Ｂ、７Ｃ）。
【０１０６】
３．Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ・ＨＢＶバキュロウイルスを用いる抗ウイルス試験
図８ＡはＬ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖが３ＴＣに対して完全に耐性であることを示
す。ＰＭＥＡ又はＰＣＶに対しては実質的な変化は見られなかった（図８Ｂ、８
Ｃ）。
す。ＰＭＥＡ又はＰＣＶに対しては実質的な変化は見られなかった（図８Ｂ、８
Ｃ）。
【０１０７】
４．Ｍ５５０Ｉ・ＨＢＶバキュロウイルスを用いる抗ウイルス試験
Ｍ５５０Ｉは３ＴＣに対して完全に耐性である（図９Ａ）。このＭ５５０Ｉ・
ＨＢＶバキュロウイルスは、図９Ｂに示すように、ＰＭＥＡに対して野性型ウイ
ルスと同様の感受性を持っていた。
ＨＢＶバキュロウイルスは、図９Ｂに示すように、ＰＭＥＡに対して野性型ウイ
ルスと同様の感受性を持っていた。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】表２の脚注
測定は各オートラジオグラフ中の二本鎖（ｄｓ）ＨＢＶ・ＤＮＡバンドのイメ
ージ密度を評価し、その結果を無処理の対照の平均密度の百分率として表すこと
により行なった。 ロジスティック用量応答（ＬＤＲ）方程式はこれらのデータのセットを正確に
記述しなかった。そうではなくて、ａ及びｂというパラメータは１個の指数減衰
方程式 ｙ＝ａ(-bx) に対するものである。 示した値は平均値又は平均値±標準誤差である。幾つかのケースでは、低濃度
の阻害剤がＨＢＶ複製を刺激し、１００％より大きなａ値に反映された。１μＭ
の薬物濃度で起こる百分率阻害は適合曲線のそれぞれから評価された。負の値（ ** ）は、対照と比較した場合の複製の刺激を表す。 *** 外挿値。 「耐性係数（Resistance Factor)」は、突然変異体に対して評価されたＩＣ50 値が野性型に対して評価された対応値とそれだけ異なっているという係数（最も
近い整数）であって、突然変異体のＩＣ50を野性型のＩＣ50で割って求められる
。
ージ密度を評価し、その結果を無処理の対照の平均密度の百分率として表すこと
により行なった。 ロジスティック用量応答（ＬＤＲ）方程式はこれらのデータのセットを正確に
記述しなかった。そうではなくて、ａ及びｂというパラメータは１個の指数減衰
方程式 ｙ＝ａ(-bx) に対するものである。 示した値は平均値又は平均値±標準誤差である。幾つかのケースでは、低濃度
の阻害剤がＨＢＶ複製を刺激し、１００％より大きなａ値に反映された。１μＭ
の薬物濃度で起こる百分率阻害は適合曲線のそれぞれから評価された。負の値（ ** ）は、対照と比較した場合の複製の刺激を表す。 *** 外挿値。 「耐性係数（Resistance Factor)」は、突然変異体に対して評価されたＩＣ50 値が野性型に対して評価された対応値とそれだけ異なっているという係数（最も
近い整数）であって、突然変異体のＩＣ50を野性型のＩＣ50で割って求められる
。
【０１１０】
実施例１６
１．ＨＢＶバキュロウイルス感染細胞からのＨＢＶ粒子の調製
ＨｅｐＧ２細胞を５０〜２００のｍｏｉで１．５ＨＢＶバキュロウイルスで感
染させた。感染３日後に開始し、コンディション化された培地を感染細胞から集
め、３０００×ｇで遠心分離して細胞破砕物を除去し、−２０℃で凍結保存した
。ＨＢＶ粒子はＳＷ２８ロータ中２７，０００ｒｐｍで５時間の超遠心分離によ
りコンディション化培地から濃縮した。ペレット状のウイルスを小容量のリン酸
塩緩衝化食塩水中に再懸濁し、等分に分け、−２０℃で凍結した。
染させた。感染３日後に開始し、コンディション化された培地を感染細胞から集
め、３０００×ｇで遠心分離して細胞破砕物を除去し、−２０℃で凍結保存した
。ＨＢＶ粒子はＳＷ２８ロータ中２７，０００ｒｐｍで５時間の超遠心分離によ
りコンディション化培地から濃縮した。ペレット状のウイルスを小容量のリン酸
塩緩衝化食塩水中に再懸濁し、等分に分け、−２０℃で凍結した。
【０１１１】
２．ＨＢＶバキュロウイルス感染細胞から調製されたＨＢＶ粒子を用いる内因性
ポリメラーゼの検定 ウイルスの部分標本を融解し、最終濃度が0.5 ％ＮＰ−４０、2.5 ｍＭトリス
ｐＨ7.5 、6 ｍＭのＤＴＴとし室温に１０分間置いてウイルスエンベロープを破
砕した。このウイルス溶液を次に 150ｍＭのＮａＣｌ、10ｍＭのＭｇＣｌ2 、20
ｍＭのＫＣｌ及び10ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰとした。10ｍＣの32 Ｐ標識化ｄＣＴＰ（約 0.2ｍＭ) を添加し、この反応物を３７℃で４０分間イン
キュベートしてＨＢＶポリメラーゼをウイルスＤＮＡゲノムに伸長させた。この
反応を停止させるため、 0.5％ＳＤＳ、25ｍＭトリス、及び10ｍＭのＥＤＴＡに
調整した。この反応混合物を 500μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにより３７℃で
一晩消化し、ＨＢＶ・ＤＮＡを１：１フェノール：クロロホルムで１回抽出した
後エタノール沈殿により精製した。ＤＮＡペレットを小容量の水中に再懸濁し、
１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを通す電気泳動に２時間かけた。ゲルをバイオラ
ッド・ゲル・ドライヤーを用いて乾燥し、乾燥したゲルのオートラジオグラフィ
を行なってＨＢＶポリメラーゼによりＨＢＶゲノム中に組み込まれた32Ｐ標識化
ｄＣＴＰの量を可視化した。
ポリメラーゼの検定 ウイルスの部分標本を融解し、最終濃度が0.5 ％ＮＰ−４０、2.5 ｍＭトリス
ｐＨ7.5 、6 ｍＭのＤＴＴとし室温に１０分間置いてウイルスエンベロープを破
砕した。このウイルス溶液を次に 150ｍＭのＮａＣｌ、10ｍＭのＭｇＣｌ2 、20
ｍＭのＫＣｌ及び10ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰとした。10ｍＣの32 Ｐ標識化ｄＣＴＰ（約 0.2ｍＭ) を添加し、この反応物を３７℃で４０分間イン
キュベートしてＨＢＶポリメラーゼをウイルスＤＮＡゲノムに伸長させた。この
反応を停止させるため、 0.5％ＳＤＳ、25ｍＭトリス、及び10ｍＭのＥＤＴＡに
調整した。この反応混合物を 500μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにより３７℃で
一晩消化し、ＨＢＶ・ＤＮＡを１：１フェノール：クロロホルムで１回抽出した
後エタノール沈殿により精製した。ＤＮＡペレットを小容量の水中に再懸濁し、
１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを通す電気泳動に２時間かけた。ゲルをバイオラ
ッド・ゲル・ドライヤーを用いて乾燥し、乾燥したゲルのオートラジオグラフィ
を行なってＨＢＶポリメラーゼによりＨＢＶゲノム中に組み込まれた32Ｐ標識化
ｄＣＴＰの量を可視化した。
【０１１２】
３．バキュロウイルス感染細胞から調製された「ＨＢＶ粒子」を用いる内因性ポ
リメラーゼ検定法を用いる、放射標識化〔α32Ｐ〕−ｄＣＴＰ組み込みと冷ｄＣ
ＴＰ組み込みとの競争を測定するための検定法 ポリメラーゼ検定は、標識化ｄＣＴＰの組み込みと競争させるため冷ｄＣＴＰ
が各反応に添加されたことを除き上述のように行なった。別の反応では、0.1 、
１、10、 100、及び1000ｍＭの濃度が標識化ｄＣＴＰと同時に添加され、ついで
ポリメラーゼ反応が進行させられた。ウイルスＤＮＡの抽出及びゲル電気泳動と
オートラジオグラフィによる分析の後、各反応からの標識化ＤＮＡの量をオート
ラジオグラムのデンシトメトリーにより定量した。デンシトメトリーデータをＴ
ａｂｌｅｃｕｒｖｅ２Ｄソフトウエアを用いてロジスティック用量応答曲線に適
合させた。図１０は32Ｐ標識化ｄＣＴＰに及ぼす冷ｄＣＴＰの競争の効果を示す
。
リメラーゼ検定法を用いる、放射標識化〔α32Ｐ〕−ｄＣＴＰ組み込みと冷ｄＣ
ＴＰ組み込みとの競争を測定するための検定法 ポリメラーゼ検定は、標識化ｄＣＴＰの組み込みと競争させるため冷ｄＣＴＰ
が各反応に添加されたことを除き上述のように行なった。別の反応では、0.1 、
１、10、 100、及び1000ｍＭの濃度が標識化ｄＣＴＰと同時に添加され、ついで
ポリメラーゼ反応が進行させられた。ウイルスＤＮＡの抽出及びゲル電気泳動と
オートラジオグラフィによる分析の後、各反応からの標識化ＤＮＡの量をオート
ラジオグラムのデンシトメトリーにより定量した。デンシトメトリーデータをＴ
ａｂｌｅｃｕｒｖｅ２Ｄソフトウエアを用いてロジスティック用量応答曲線に適
合させた。図１０は32Ｐ標識化ｄＣＴＰに及ぼす冷ｄＣＴＰの競争の効果を示す
。
【０１１３】
４．バキュロウイルス感染細胞から調製されたＨＢＶ粒子を用いる、内因性ポリ
メラーゼ検定法における抗ウイルス剤の効力を測るために使用できる検定法 上の実施例で記述したものと同様にして、ＨＢＶポリメラーゼの触媒活性を阻
害する際の、ヌクレオシド三リン酸や非ヌクレオシドアナログポリメラーゼ阻害
剤などの抗ウイルス剤の効力は、この検定法を用いて試験することができる。ヌ
クレオシド三リン酸には、３ＴＣ−三リン酸、ＰＭＥＡ−三リン酸、又はＰＣＶ
−三リン酸などの化合物が含まれる。ポリメラーゼ検定は、標識化ｄＣＴＰ又は
別の放射標識化デオキシヌクレオチド三リン酸の組み込みと競争させるため、抗
ウイルス剤の種々の濃度が各反応に添加できることを除き、実施例２０（２）部
で記述されたように行なうことができる。別の反応では、該薬剤の種々の濃度が
標識化ｄＣＴＰと同時に添加され、ついでポリメラーゼ反応を進行させる。ウイ
ルスＤＮＡの抽出及びゲル電気泳動とオートラジオグラフィーによる分析の後、
各反応からの標識化ＤＮＡの量がオートラジオグラムのデンシトメトリーにより
定量される。デンシトメトリーのデータはＴａｂｌｅｃｕｒｖｅ２Ｄソフトウエ
アを用いてロジスティック用量応答曲線に適合させる。
メラーゼ検定法における抗ウイルス剤の効力を測るために使用できる検定法 上の実施例で記述したものと同様にして、ＨＢＶポリメラーゼの触媒活性を阻
害する際の、ヌクレオシド三リン酸や非ヌクレオシドアナログポリメラーゼ阻害
剤などの抗ウイルス剤の効力は、この検定法を用いて試験することができる。ヌ
クレオシド三リン酸には、３ＴＣ−三リン酸、ＰＭＥＡ−三リン酸、又はＰＣＶ
−三リン酸などの化合物が含まれる。ポリメラーゼ検定は、標識化ｄＣＴＰ又は
別の放射標識化デオキシヌクレオチド三リン酸の組み込みと競争させるため、抗
ウイルス剤の種々の濃度が各反応に添加できることを除き、実施例２０（２）部
で記述されたように行なうことができる。別の反応では、該薬剤の種々の濃度が
標識化ｄＣＴＰと同時に添加され、ついでポリメラーゼ反応を進行させる。ウイ
ルスＤＮＡの抽出及びゲル電気泳動とオートラジオグラフィーによる分析の後、
各反応からの標識化ＤＮＡの量がオートラジオグラムのデンシトメトリーにより
定量される。デンシトメトリーのデータはＴａｂｌｅｃｕｒｖｅ２Ｄソフトウエ
アを用いてロジスティック用量応答曲線に適合させる。
【０１１４】
実施例１７
１．プリコア突然変異（Ｇ１８６９Ａ）ＨＢＶバキュロウイルスの抗ウイルス試
験 この研究では、組換えＨＢＶバキュロウイルス系を用いて、野性型（1.3 ×ゲ
ノム長ＨＢＶ）及びプリコア突然変異ＨＢＶによる匹敵するＨＢＶ・ＤＮＡの生
産が見出された。ラミヴゥディン、アデフォヴィル、及びペンシクロヴィルの、
野性型ＨＢＶ／バキュロウイルスウイルス及びプリコア突然変異（Ｇ１８９６Ａ
）ＨＢＶに及ぼす用量効果は図１１（Ａ、Ｂ、Ｃ）に示し、計算されたＩＣ50は
表３に示す。Ｇ１８９６Ａという特定の突然変異を持つＨＢＶは、アデフォヴィ
ルに対して少なくとも感受性であるように見え、ラミヴゥディン及びペンシクロ
ヴィルに対しては野性型ＨＢＶと比べてより一層感受性であるように見える。
験 この研究では、組換えＨＢＶバキュロウイルス系を用いて、野性型（1.3 ×ゲ
ノム長ＨＢＶ）及びプリコア突然変異ＨＢＶによる匹敵するＨＢＶ・ＤＮＡの生
産が見出された。ラミヴゥディン、アデフォヴィル、及びペンシクロヴィルの、
野性型ＨＢＶ／バキュロウイルスウイルス及びプリコア突然変異（Ｇ１８９６Ａ
）ＨＢＶに及ぼす用量効果は図１１（Ａ、Ｂ、Ｃ）に示し、計算されたＩＣ50は
表３に示す。Ｇ１８９６Ａという特定の突然変異を持つＨＢＶは、アデフォヴィ
ルに対して少なくとも感受性であるように見え、ラミヴゥディン及びペンシクロ
ヴィルに対しては野性型ＨＢＶと比べてより一層感受性であるように見える。
【０１１５】
２．プリコア突然変異（Ｇ１８６９Ａ）、及びＬ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ又はＭ５
５０ＩのＨＢＶバキュロウイルスを用いる抗ウイルス試験 種々の組換えＨＢＶ／バキュロウイルス（Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ、プリコア
／Ｌ５２６Ｍ／Ｌ５５０Ｖ、Ｍ５５０Ｉ及びプリコア／Ｍ５５０Ｉを含む）で形
質導入されたＨｅｐＧ２細胞により生産される細胞内ＨＢＶ・ＤＮＡ及び細胞外
ウイルスは、図１２に示す。種々の突然変異体からのＨＢＶ・ＤＮＡの収率は、
野性型及びプリコア突然変異体が匹敵すること、Ｍ５５０ＩとＬ５２６Ｍ／Ｍ５
５０Ｖ突然変異体は野性型よりも遙に低いＨＢＶ・ＤＮＡ生産を示すこと、そし
てプリコア／Ｍ５５０Ｉとプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５２Ｖ突然変異体はプリ
コア突然変異体として類似のレベルのＤＮＡを生産（細胞内及び細胞外の両者と
も）することを示した。Ｍ５５０ＩとＬ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖの変化の存在は、
プリコア突然変異体と比べてそれらの複製適合性を低減させるようには見えなか
った。
５０ＩのＨＢＶバキュロウイルスを用いる抗ウイルス試験 種々の組換えＨＢＶ／バキュロウイルス（Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ、プリコア
／Ｌ５２６Ｍ／Ｌ５５０Ｖ、Ｍ５５０Ｉ及びプリコア／Ｍ５５０Ｉを含む）で形
質導入されたＨｅｐＧ２細胞により生産される細胞内ＨＢＶ・ＤＮＡ及び細胞外
ウイルスは、図１２に示す。種々の突然変異体からのＨＢＶ・ＤＮＡの収率は、
野性型及びプリコア突然変異体が匹敵すること、Ｍ５５０ＩとＬ５２６Ｍ／Ｍ５
５０Ｖ突然変異体は野性型よりも遙に低いＨＢＶ・ＤＮＡ生産を示すこと、そし
てプリコア／Ｍ５５０Ｉとプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５２Ｖ突然変異体はプリ
コア突然変異体として類似のレベルのＤＮＡを生産（細胞内及び細胞外の両者と
も）することを示した。Ｍ５５０ＩとＬ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖの変化の存在は、
プリコア突然変異体と比べてそれらの複製適合性を低減させるようには見えなか
った。
【０１１６】
種々の組換えＨＢＶバキュロウイルス（Ｍ５５０Ｉ、プリコア／Ｍ５５０Ｉ、
Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ、及びプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｌ５５０Ｖを含む）で形
質導入されたＨｅｐＧ２細胞により、アデフォヴィル又はラミヴゥディン又はペ
ンシクロヴィルの存在下で生産される細胞内ＨＢＶ・ＤＮＡ及び細胞外ウイルス
は、図１３（Ａ〜Ｆ）に示し、アデフォヴィルの計算されたＩＣ50は表４に示す
。５０％だけＨＢＶ複製（細胞内一本鎖ＤＮＡ）を阻害するのに必要なアデフォ
ヴィルの濃度（ＩＣ50）は、組換えＨＢＶ−バキュロウイルス突然変異体Ｍ５５
０Ｉ及びＬ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖに対してそれぞれ０．９４μＭ及び０．９３μ
Ｍ、プリコア／Ｍ５５０Ｉ及びプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖに対してそれ
ぞれ０．２８μＭ及び０．４７μＭであった。それぞれの組換えＨＢＶ−バキュ
ロウイルスで形質導入されたＨｅｐＧ２細胞により生産された細胞内ＨＢＶ複製
中間体及び細胞外ウイルスのサザンブロットにより、Ｍ５５０Ｉ又はＬ５２６Ｍ
／Ｍ５５０Ｖに突然変異をコードするいかなるＨＢＶ／バキュロウイルス変異型
についても、これらの変化はラミヴウディン及びペンシクロヴィルに対する高度
の耐性を与えることが示された。従って用量応答はプロットできなかった。
Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ、及びプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｌ５５０Ｖを含む）で形
質導入されたＨｅｐＧ２細胞により、アデフォヴィル又はラミヴゥディン又はペ
ンシクロヴィルの存在下で生産される細胞内ＨＢＶ・ＤＮＡ及び細胞外ウイルス
は、図１３（Ａ〜Ｆ）に示し、アデフォヴィルの計算されたＩＣ50は表４に示す
。５０％だけＨＢＶ複製（細胞内一本鎖ＤＮＡ）を阻害するのに必要なアデフォ
ヴィルの濃度（ＩＣ50）は、組換えＨＢＶ−バキュロウイルス突然変異体Ｍ５５
０Ｉ及びＬ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖに対してそれぞれ０．９４μＭ及び０．９３μ
Ｍ、プリコア／Ｍ５５０Ｉ及びプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖに対してそれ
ぞれ０．２８μＭ及び０．４７μＭであった。それぞれの組換えＨＢＶ−バキュ
ロウイルスで形質導入されたＨｅｐＧ２細胞により生産された細胞内ＨＢＶ複製
中間体及び細胞外ウイルスのサザンブロットにより、Ｍ５５０Ｉ又はＬ５２６Ｍ
／Ｍ５５０Ｖに突然変異をコードするいかなるＨＢＶ／バキュロウイルス変異型
についても、これらの変化はラミヴウディン及びペンシクロヴィルに対する高度
の耐性を与えることが示された。従って用量応答はプロットできなかった。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】a
２実験（0.25及び0.22μＭ) の平均b
２実験（0.20及び0.19μＭ) の平均c
２実験（0.06及び 0.047μＭ) の平均 d
２実験（0.02及び 0.03 μＭ) の平均 e
３実験（0.067 、0.085 及び 0.0572 μＭ) の平均f
３実験（0.014 、0.014 及び 0.032μＭ) の平均 g
３実験（0.022 、0.0293 及び 0.0095 μＭ) の平均 h
３実験（0.012 、0.01 及び 0.01 μＭ) の平均 i
細胞内一本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡj
細胞外の弛緩環ＨＢＶ・ＤＮＡ
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
ＮＤＲ 用量応答なし*
低過ぎて測定できないＨＢＶ・ＤＮＡ生産
ＩＣ ＳＳ 細胞内一本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ
ＥＣ ＲＣ 細胞外弛緩環ＨＢＶ・ＤＮＡ
【０１２１】
当業者は、本明細書に記述された発明が具体的に記述されたもの以外への変更
や修飾を受け易いことを認めるであろう。本発明はそのような変更及び修飾をす
べて包含するものと理解されるべきである。本発明は本明細書において個別的に
又は集合的に参照し又は指摘した工程、特徴、組成物及び化合物の全て及びこれ
らの工程又は特徴の如何なる２以上の任意の又は全ての組合せをも包含する。
や修飾を受け易いことを認めるであろう。本発明はそのような変更及び修飾をす
べて包含するものと理解されるべきである。本発明は本明細書において個別的に
又は集合的に参照し又は指摘した工程、特徴、組成物及び化合物の全て及びこれ
らの工程又は特徴の如何なる２以上の任意の又は全ての組合せをも包含する。
【０１２２】
参照文献
１．ノルダーら，J. Gen. Virol. 74: 341-1348 (1993)。
２．ステュイバーら，"A new genotype of hepatitis B virus: complete gen
ome and phylogenetic relatedness" J Gen Virol. 81: 67-74 (2000) 。
３．ライダーら，Lancet ii(8400): 449-52 (1984)。
４．ベースレイら，Lancet ii; 1159-63 (1981) 。
５．チオライスら，Nature 317: 489-495 (1985) 。
【０１２３】
６．ガーリッチら，Viral Hepatitis and Liver Disease. F.B. Hollinger et
al. eds Williams-Wilkens, Baltimore, MD, pp121-134 (1991) 。
７．カーマンら，Gastroenterology 102: 711-719 (1992）。
８．カーマンら，Lancet 336: 325-329 (1990)。
９．オカモトら，Paediatric Research 32: 264-268 (1992) 。
10. マクマホンら，Hepatology 15: 757-766 (1992)。
【０１２４】
11. フジイら，Biochem. Biophys. Res. Commun. 184: 1152-1157 (1992)。
12. ハリソンら，J. Hepatol. 13: 5105-5107 (1991)。
13. デラニーとイソム，エイチシー，Hepatology 28: 1134-46 (1998) 。
14. デラニーら，Antimicrob Agents Chemother 43: 2017-26 (1999)。
15. アングスら，Hepatology 21: 14-8 (1995)。
16. キングら，Antimicrob Agents Chemother. 42: 3179-86 (1998)。
【配列表】
【図１Ａ】
図１Ａは、ＨＢＶの重なり合うゲノムを示す図式的表示である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、プリコア、エンベロープ及びポリメラーゼの遺伝子中に検出される
主要な突然変異の例を示す図式的表示である。
主要な突然変異の例を示す図式的表示である。
【図２】
図２は、ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼタンパク質取り巻き領域由来のアミノ酸
コンセンサス配列の表示である。このコンセンサス配列はＲＮＡポリメラーゼタ
ンパク質でも保存されている。これらの領域はドメインＡ〜Ｅとして示され、下
線が引いてある。このコンセンサス配列では、ＹＭＤＤモチーフのＭはアミノ酸
番号５５０と命名される。３ＴＣ及び／又はＦＣＶ処理の間に突然変異を受ける
このアミノ酸は太線で示してある。星印（* ）はコンセンサス配列のこの位置の
３より大きなアミノ酸の可能性があることを示す。中和ドメインを含むＨＢｓＡ
ｇの主要な親水性領域は二重線で示され、ＨＢｓＡｇを改変するポリメラーゼ突
然変異はイタリックで示してある。
コンセンサス配列の表示である。このコンセンサス配列はＲＮＡポリメラーゼタ
ンパク質でも保存されている。これらの領域はドメインＡ〜Ｅとして示され、下
線が引いてある。このコンセンサス配列では、ＹＭＤＤモチーフのＭはアミノ酸
番号５５０と命名される。３ＴＣ及び／又はＦＣＶ処理の間に突然変異を受ける
このアミノ酸は太線で示してある。星印（* ）はコンセンサス配列のこの位置の
３より大きなアミノ酸の可能性があることを示す。中和ドメインを含むＨＢｓＡ
ｇの主要な親水性領域は二重線で示され、ＨＢｓＡｇを改変するポリメラーゼ突
然変異はイタリックで示してある。
【図３】
図３は、表面抗原をコードするＨＢＶの種々の株からのヌクレオチド配列の表
示である。アミノ酸１０８で始まる表面抗原のアミノ酸配列はヌクレオチド配列
の上方に示してある。
示である。アミノ酸１０８で始まる表面抗原のアミノ酸配列はヌクレオチド配列
の上方に示してある。
【図４Ａ】
図４Ａは、ＨＢＶ１．２８ゲノムを保持するｐＢＢＨＶＢ１．２８の図式的表
示である。
示である。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、ＨＢＶ１．５ゲノムを保持するｐＢＢＨＶＢ１．５の図式的表示で
ある。
ある。
【図５Ａ】
図５Ａは、ＨＢＶ１．２８ゲノムのヌクレオチド配列の表示である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ＨＢＶ１．５ゲノムのヌクレオチド配列の表示である。
【図６Ａ】
図６Ａは、３ＴＣを用い、野性型ＨＢＶバキュロウイルスを用いて行なわれた
抗ウイルステストのグラフ表示である。
抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、ＰＭＥＡを用い、野性型ＨＢＶバキュロウイルスを用いて行なわれ
た抗ウイルステストのグラフ表示である。
た抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図６Ｃ】
図６Ｃは、野性型ＨＢＶバキュロウイルスに及ぼすＰＣＶの効果を示すサザン
ブロットの写真である。
ブロットの写真である。
【図７Ａ】
図７Ａは、３ＴＣを用い、Ｌ５２６Ｍ・ＨＢＶバキュロウイルスで行なわれた
抗ウイルステストのグラフ表示である。
抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、ＰＭＥＡを用い、Ｌ５２６Ｍ・ＨＢＶバキュロウイルスで行なわれ
た抗ウイルステストのグラフ表示である。
た抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図７Ｃ】
図７Ｃは、ＰＣＶを用い、Ｌ５２６Ｍ・ＨＢＶバキュロウイルスで行なわれた
抗ウイルステストのグラフ表示である。
抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図８Ａ】
図８Ａは、３ＴＣを用い、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ・ＨＢＶバキュロウイルス
で行なわれた抗ウイルステストのグラフ表示である。
で行なわれた抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、ＰＭＥＡを用い、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ・ＨＢＶバキュロウイル
スで行なわれた抗ウイルステストのグラフ表示である。
スで行なわれた抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図８Ｃ】
図８Ｃは、ＰＣＶを用い、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ・ＨＢＶバキュロウイルス
で行なわれた抗ウイルステストのグラフ表示である。
で行なわれた抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図９Ａ】
図９Ａは、３ＴＣを用い、Ｍ５５０Ｉ・ＨＢＶバキュロウイルスで行なわれた
抗ウイルステストのグラフ表示である。
抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、ＰＭＥＡを用い、Ｍ５５０Ｉ・ＨＢＶバキュロウイルスで行なわれ
た抗ウイルステストのグラフ表示である。
た抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図９Ｃ】
図９Ｃは、ＰＣＶを用い、Ｍ５５０Ｉ・ＨＢＶバキュロウイルスで行なわれた
抗ウイルステストのグラフ表示である。
抗ウイルステストのグラフ表示である。
【図１０】
図１０は、バキュロウイルス感染細胞から調製された粒子と内因性ポリメラー
ゼ検定法を用いる放射標識〔α32Ｐ〕−ｄＣＴＰと冷ｄＣＴＰとの競争を示すグ
ラフ表示である。
ゼ検定法を用いる放射標識〔α32Ｐ〕−ｄＣＴＰと冷ｄＣＴＰとの競争を示すグ
ラフ表示である。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、次第に増加する濃度のアデフォヴィル（adefovir）に曝した野性
型（ＷＴ）及びプリコア（Ｇ１８９６Ａ）組換えＨＢＶバキュロウイルスで形質
導入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサザン
ブロットを示す写真である。ＩＣは細胞内、ＥＣは細胞外、ＲＣは弛緩環ＨＢＶ
・ＤＮＡ、ＤＳは直鎖状二本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ、ＳＳは一本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡを
指す。
型（ＷＴ）及びプリコア（Ｇ１８９６Ａ）組換えＨＢＶバキュロウイルスで形質
導入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサザン
ブロットを示す写真である。ＩＣは細胞内、ＥＣは細胞外、ＲＣは弛緩環ＨＢＶ
・ＤＮＡ、ＤＳは直鎖状二本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ、ＳＳは一本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡを
指す。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、次第に増加する濃度のラミヴゥディン（lamivudine) に曝した野
性型（ＷＴ）及びプリコア（Ｇ１８９６Ａ）組換えＨＢＶバキュロウイルスで形
質導入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサザ
ンブロットを示す写真である。ＩＣは細胞内、ＥＣは細胞外、ＲＣは弛緩環ＨＢ
Ｖ・ＤＮＡ、ＤＳは直鎖状二本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ、ＳＳは一本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ
を指す。
性型（ＷＴ）及びプリコア（Ｇ１８９６Ａ）組換えＨＢＶバキュロウイルスで形
質導入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサザ
ンブロットを示す写真である。ＩＣは細胞内、ＥＣは細胞外、ＲＣは弛緩環ＨＢ
Ｖ・ＤＮＡ、ＤＳは直鎖状二本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ、ＳＳは一本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ
を指す。
【図１１Ｃ】
図１１Ｃは、次第に増加する濃度のペンシクロヴィル（penciclovir)に曝した
野性型（ＷＴ）及びプリコア（Ｇ１８９６Ａ）組換えＨＢＶバキュロウイルスで
形質導入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサ
ザンブロットを示す写真である。ＩＣは細胞内、ＥＣは細胞外、ＲＣは弛緩環Ｈ
ＢＶ・ＤＮＡ、ＤＳは直鎖状二本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ、ＳＳは一本鎖ＨＢＶ・ＤＮ
Ａを指す。
野性型（ＷＴ）及びプリコア（Ｇ１８９６Ａ）組換えＨＢＶバキュロウイルスで
形質導入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサ
ザンブロットを示す写真である。ＩＣは細胞内、ＥＣは細胞外、ＲＣは弛緩環Ｈ
ＢＶ・ＤＮＡ、ＤＳは直鎖状二本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ、ＳＳは一本鎖ＨＢＶ・ＤＮ
Ａを指す。
【図１２】
図１２は、種々の組換えＨＢＶバキュロウイルスＭ５５０Ｉ、プリコア／Ｍ５
５０Ｉ、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ及びプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖで形質
導入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサザン
ブロットを示す写真である。
５０Ｉ、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ及びプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖで形質
導入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサザン
ブロットを示す写真である。
【図１３Ａ〜１３Ｆ】
図１３Ａ〜１３Ｆは、種々の濃度のアデフォヴィル、又はラミヴゥディン、又
はペンシクロヴィルに曝された組換えＨＢＶバキュロウイルス〔Ｍ５５０Ｉ及び
プリコア／Ｍ５５０Ｉ（図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｅ）、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ
及びプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ（図１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ）で形質導
入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサザンブ
ロットを示す写真である。Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖで形質導入された細胞からの
細胞外ウイルス生産は余りに低レベルで測定できなかった。ＩＣは細胞内、ＥＣ
は細胞外、ＲＣは弛緩環ＨＢＶ・ＤＮＡ、ＤＳは直鎖状二本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ、
ＳＳは一本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡを指す。
はペンシクロヴィルに曝された組換えＨＢＶバキュロウイルス〔Ｍ５５０Ｉ及び
プリコア／Ｍ５５０Ｉ（図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｅ）、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ
及びプリコア／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ（図１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ）で形質導
入されたＨｅｐＧ２細胞からの細胞内及び細胞外ＨＢＶ・ＤＮＡ生産のサザンブ
ロットを示す写真である。Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖで形質導入された細胞からの
細胞外ウイルス生産は余りに低レベルで測定できなかった。ＩＣは細胞内、ＥＣ
は細胞外、ＲＣは弛緩環ＨＢＶ・ＤＮＡ、ＤＳは直鎖状二本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡ、
ＳＳは一本鎖ＨＢＶ・ＤＮＡを指す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年３月２７日（２００２．３．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(71)出願人 ザ ペン ステート リサーチ ファウン
デーション
ＴＨＥ ＰＥＮＮ ＳＴＡＴＥ ＲＥＳＥ
ＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
米国，ペンシルヴァニア州 16802，ユニ
ヴァーシティ パーク，オールド メイン
304
304 Ｏｌｄ Ｍａｉｎ， Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐａｒｋ， ＰＡ 16802，
ＵＳ
(72)発明者 デラニー，ウィリアム四世
アメリカ合衆国、カリフォルニア州
94402、サン マテオ、パーム アベニュ
ー 1217番地
(72)発明者 ロカルニニ，スティーブン，アリスター
オーストラリア国、ビクトリア州 3183、
セント キルダ イースト、 カーリッス
ル アベニュー 13番地
(72)発明者 チェン，ロバート，ヤング，ミング
オーストラリア国、ビクトリア州 3031、
フレミントン、シールズ ストリート 28
番地
(72)発明者 バルトロメウス，アンジェリン
オーストラリア国、ビクトリア州 3163、
カーネギー、ミラー ストリート 64番地
(72)発明者 イソム，ハリエット
アメリカ合衆国、ペンシルベニア州
17033、ハーシー、ユニバーシティ ドラ
イブ 500番地、ハーシー メディカル
センター、ペン ステート カレッジ オ
ブ メディシン、デパートメント オブ
マイクロバイオロジー アンド イミュノ
ロジー
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA10 BA33 BA80
CA02 DA02 DA03 DA20 EA02
EA04 FA02 GA11 GA25 HA11
4B063 QA01 QA06 QQ10 QQ28 QR67
QR68 QR77 QR79 QR80 QS36
QX07 QX10
4B065 AB01 AC14 AC20 BA02 BA16
BA30 CA46
Claims (24)
- 【請求項１】 ある薬剤に対して改変された感受性を示す変異型ＨＢＶ（
Ｂ型肝炎ウイルス）を検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合
した該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、次いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は間、及び／又は後に該細胞とテストすべき薬剤とを
接触させる工程、 同一遺伝子構築物で又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノム
を含む遺伝子構築物で該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発
現し、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出
するのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、及び 変異型ウイルスが、該薬剤の存在下で、遺伝子物質を複製し、発現し、及
び／又は組み立て及び／又は放出されるか否かを決定するため、該細胞、細胞溶
解物若しくは培養上清をウイルス検出手段若しくはウイルス成分検出手段にかけ
る工程、 を含む方法。 - 【請求項２】 該変異型ＨＢＶが対照ＨＢＶの感染、複製又は組み立てを
阻害し若しくは低減させる薬剤の存在下で複製することができるものである、請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該薬剤がヌクレオシドアナログ又は非ヌクレオシドアナロ
グである、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 該薬剤が非ヌクレオシドアナログである逆転写酵素阻害剤
及び／又は非ヌクレオシドアナログであるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害
剤である、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 該ヌクレオシドアナログが３ＴＣ、ＰＭＥＡ又はＰＣＶで
ある、請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 該薬剤が免疫相互作用性分子である、請求項２記載の方法
。 - 【請求項７】 該免疫相互作用性分子が抗体である、請求項６記載の方法
。 - 【請求項８】 該変異型ＨＢＶが改変されたＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ
を含むものである、請求項１〜請求項７いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 該改変されたＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼが、Ｌ４２６Ｉ
／Ｖ、Ｌ４２８Ｉ／ＶＮ４８０Ｇ、Ｎ４８５Ｋ、Ｋ４９５Ｒ、Ｒ４９９Ｑ、Ｇ４
９９Ｅ、Ｗ４９９Ｑ、Ｆ５１２Ｌ、Ｉ５１５Ｌ、Ｖ５１９Ｌ、Ｌ５２６Ｍ、Ｍ５
５０Ｖ、Ｍ５５０Ｉ、Ｖ５５３Ｉ、Ｓ５６５Ｐから選択されるものである、請求
項７記載の方法。 - 【請求項１０】 該改変されたＨＢＶが、Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｉ、Ｌ５
２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ、Ｖ５１９Ｌ／Ｌ５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｖ及びＶ５１９Ｌ／Ｌ
５２６Ｍ／Ｍ５５０Ｉから選択される多重突然変異体である、請求項１〜請求項
７いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 該変異型ＨＢＶが改変されたＨＢＶプリコア遺伝子又は
基底コアプロモーターを含むものである、請求項１〜請求項７いずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項１２】 該改変されたＨＢＶのプリコアプロモーター又は基底コ
アプロモーターが、Ａ１８１４Ｔ、Ｃ１８５６Ｔ、Ｇ１８９６Ａ、Ｇ１８９７Ａ
、Ｇ１８９８Ａ、Ｇ１８９９Ａ、Ｇ１８９６Ａ／Ｇ１８９９Ａ、Ａ１７６２Ｔ／
Ｇ１７６４Ａ、Ｔ１７５３Ｃ、Ｇ１７５７Ａ及びＣ１６５３Ｔ（番号はＨＢＶの
ユニークなＥｃｏＲＩ部位からのものである）から選択されるものである、請求
項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 該変異型ＨＢＶが改変されたＨＢｓＡｇを含むものであ
る、請求項１〜請求項７いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 該改変されたＨＢｓＡｇが、Ｇ１１２Ｒ、Ｔ１２３Ｐ、
Ｙ／Ｆ１３４Ｓ、Ｄ１４４Ｅ、Ｇ１４５Ｒ、Ａ１５７Ｄ、Ｅ１６４Ｄ、Ｆ１７０
Ｌ、Ｍ１９５Ｉ、Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ、Ｗ１９６ＳＴＯＰ、Ｍ１９８Ｉ、Ｗ
１９９Ｓ、Ｓ２０４Ｔ、Ｓ２１０Ｒから選択されるものである、請求項１３記載
の方法。 - 【請求項１５】 該改変されたＨＢｓＡｇが、Ｄ１４４Ｅ、Ｇ１４５Ｒ、
Ａ１５７Ｄ、Ｅ１６４Ｄ、Ｍ１９５Ｉ、Ｗ１９６Ｌ、Ｗ１９６Ｓ、Ｗ１９６ＳＴ
ＯＰ、Ｍ１９８Ｉ、Ｗ１９９Ｓ及びＳ２１０Ｒから選択されるものである、請求
項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 該変異型ＨＢＶが改変されたＨＢＶプリコアプロモータ
ー又は基底コアプロモーター及び改変されたＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼを含む
ものである、請求項１〜請求項７又は請求項８〜請求項１２のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項１７】 該変異型ＨＢＶが改変されたＨＢＶプリコアプロモータ
ー又は基底コアプロモーター及び改変されたＨＢＶ・ＨＢｓＡｇを含むものであ
る、請求項１〜請求項７のいずれか１項、又は請求項１１又は請求項１２、又は
請求項１３〜請求項１５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１８】 該変異型ＨＢＶが改変されたＨＢＶ・ＨＢｓＡｇ及び改
変されたＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼを含むものである、請求項１〜請求項７、
請求項８〜請求項１０又は請求項１３〜請求項１５のいずれか１項に記載の方法
。 - 【請求項１９】 該変異型ＨＢＶが改変されたＨＢＶプリコアプロモータ
ー又は基底コアプロモーター及び改変されたＨＢＶ・ＨＢｓＡｇ及び改変された
ＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼを含むものである、請求項１〜請求項７、又は請求
項８〜請求項１５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２０】 請求項１〜請求項１９いずれか１項に記載の方法によっ
て検出されるＨＢＶ変異型若しくはその組換え体若しくは誘導体若しくはその化
学的等価物又はその成分の組換え体若しくは化学的等価物。 - 【請求項２１】 該細胞が、改変されたＨＢＶプリコアプロモーター又は
基底コアプロモーター及び／又は改変されたＨＢＶ・ＨＢｓＡｇ及び／又は改変
されたＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ又はそれらの組合せを含む変異型ＨＢＶの複
数の組合せで共感染されるものである、請求項１〜請求項７のいずれか１項、又
は請求項８〜請求項１９いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２２】 該細胞が、改変されたＨＢＶプリコアプロモーター又は
基底コアプロモーター及び／又は改変されたＨＢＶ・ＨＢｓＡｇ及び／又は改変
されたＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ又はそれらの組合せを含む変異型ＨＢＶの複
数の組合せで重感染されるものである、請求項１〜請求項７のいずれか１項、又
は請求項８〜請求項１９いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２３】 ある薬剤に対して改変された感受性を示すＤＮＡポリメ
ラーゼを含む変異型ＨＢＶを検出する方法であって、 細胞に感染できるバキュロウイルスゲノムのある量を含む又はそれに融合
した該変異型ＨＢＶ由来のゲノムの複製能力ある量を含む遺伝子構築物を作成す
る工程、次いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前、及び／又は後に該細胞をテストすべき薬剤と接触させる工程、 同一遺伝子構築物で、又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ変異型のゲノ
ムを含む遺伝子構築物で、該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該変異型ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発
現し、及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組み立て、及び／又は放出
するのに十分な時間及び条件の下で、該細胞を培養する工程、及び ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログである逆
転写酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログであるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ
ーゼ阻害剤の存在下若しくは非存在下で、該細胞、細胞溶解物若しくは培養上清
又はそれから精製されたウイルスをＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ検定法にかける
工程、 を含む方法。 - 【請求項２４】 抗ウイルス剤の存在下でＤＮＡポリメラーゼ活性を検出
する方法であって、 該ＤＮＡポリメラーゼを生産できるＨＢＶ由来のゲノムの複製可能量を含
む遺伝子構築物を作成する工程であって、該ゲノムが細胞に感染できるバキュロ
ウイルスゲノムのある量を含み又はそれに融合しているものである工程、及び次
いで該構築物で該細胞を感染させる工程、 感染の前及び／又は後に、テストすべき抗ウイルス剤と該細胞を接触させ
る工程、 同一遺伝子構築物で、又はＨＢＶ野性型若しくは別のＨＢＶ株のゲノムを
含む遺伝子構築物で、該細胞を任意選択的にさらに感染させる工程、 該ＨＢＶが、該薬剤に耐性であるならば、遺伝子配列を複製し、発現し、
及び／又はウイルス若しくはウイルス様粒子を組立て及び／又は放出するのに十
分な時間及び条件の下で該細胞を培養する工程、及び ヌクレオシド三リン酸アナログ若しくは非ヌクレオシドアナログである逆
転写酵素阻害剤又は非ヌクレオシドアナログであるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ
ーゼ阻害剤の存在下若しくは非存在下で、該細胞、細胞溶解物若しくは培養上清
又はそれから精製されたウイルスをＨＢＶ・ＤＮＡポリメラーゼ検定法にかける
工程、 を含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17994800P | 2000-02-03 | 2000-02-03 | |
| US60/179,948 | 2000-02-03 | ||
| PCT/AU2001/000098 WO2001057244A1 (en) | 2000-02-03 | 2001-02-02 | AN ASSAY FOR DETECTING VARIANT HAPATITIS B VIRUSES (HBVs) WHICH EXHIBIT ALTERED SENSITIVITY TO AGENTS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003521249A true JP2003521249A (ja) | 2003-07-15 |
Family
ID=22658642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001555867A Pending JP2003521249A (ja) | 2000-02-03 | 2001-02-02 | 薬剤に対して改変された感受性を示す変異型ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）を検出する検定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1257661A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003521249A (ja) |
| AU (1) | AU3141501A (ja) |
| WO (1) | WO2001057244A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005516617A (ja) * | 2002-02-07 | 2005-06-09 | メルボルン ヘルス | ヌクレオシドアナログに対する感受性の変化を有するウイルス変種およびその使用 |
| JP2016198057A (ja) * | 2015-04-10 | 2016-12-01 | 国立大学法人広島大学 | 高力価のｂ型肝炎ウイルスを産生する細胞及びその作製方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7405039B2 (en) | 2002-02-07 | 2008-07-29 | Austin Health | Viral variants with altered susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof |
| WO2003087351A1 (en) | 2002-04-12 | 2003-10-23 | Melbourne Health | Hepatitis b viral variants with redused susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof |
| AU2003213874B2 (en) * | 2002-04-12 | 2008-12-04 | Austin Health | Hepatitis B viral variants with redused susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof |
| CA2529997A1 (en) | 2003-06-20 | 2004-12-29 | Dade Behring Marburg Gmbh | Novel surface protein (hbsag) variant of hepatitis b virus |
| ES2385481T3 (es) | 2003-06-20 | 2012-07-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | Nueva variante de proteína de superficie (HbsAg) del virus de hepatitis B |
| WO2006105597A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Melbourne Health | Variants of hepatitis b virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof |
| AU2006230802A1 (en) | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Austin Health | Variants of hepatitis B virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996010649A1 (en) * | 1994-09-30 | 1996-04-11 | Southwest Foundation For Biomedical Research | Isolated human hepatitis b virus polymerase and uses thereof |
| AU762355B2 (en) * | 1998-01-21 | 2003-06-26 | Penn State Research Foundation, The | Methods and compositions to investigate infection by hepatitis B virus and agents to prevent and treat the infection |
-
2001
- 2001-02-02 WO PCT/AU2001/000098 patent/WO2001057244A1/en not_active Application Discontinuation
- 2001-02-02 EP EP01903503A patent/EP1257661A1/en not_active Ceased
- 2001-02-02 JP JP2001555867A patent/JP2003521249A/ja active Pending
- 2001-02-02 AU AU31415/01A patent/AU3141501A/en not_active Abandoned
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005516617A (ja) * | 2002-02-07 | 2005-06-09 | メルボルン ヘルス | ヌクレオシドアナログに対する感受性の変化を有するウイルス変種およびその使用 |
| JP2016198057A (ja) * | 2015-04-10 | 2016-12-01 | 国立大学法人広島大学 | 高力価のｂ型肝炎ウイルスを産生する細胞及びその作製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001057244A1 (en) | 2001-08-09 |
| EP1257661A1 (en) | 2002-11-20 |
| AU3141501A (en) | 2001-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Feld et al. | The phenylpropenamide derivative AT-130 blocks HBV replication at the level of viral RNA packaging | |
| Tacke et al. | Basal core promoter and precore mutations in the hepatitis B virus genome enhance replication efficacy of Lamivudine-resistant mutants | |
| Chen et al. | Effect of the G1896A precore mutation on drug sensitivity and replication yield of lamivudine‐resistant HBV in vitro | |
| Sterneck et al. | Hepatitis B virus genomes of patients with fulminant hepatitis do not share a specific mutation | |
| US7927601B2 (en) | Variants of hepatitis B virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof | |
| EP1476543B1 (en) | Viral variants with altered susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof | |
| US8211633B2 (en) | Viral variants with altered susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof | |
| JP2003521249A (ja) | 薬剤に対して改変された感受性を示す変異型ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）を検出する検定法 | |
| US8211443B2 (en) | Variants of hepatitis B virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof | |
| Friedt et al. | Complete hepatitis B virus genome analysis in HBsAg positive mothers and their infants with fulminant hepatitis B | |
| US20050272031A1 (en) | Viral variants and uses therefor | |
| US6969583B2 (en) | Method for detecting variant HBV | |
| Mayerat et al. | Mutations in the basal core promoter and precore/core gene of hepatitis B virus in patients with chronic active but not acute hepatitis B | |
| AU2003202301B8 (en) | Viral variants with altered susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof | |
| WO2006039739A1 (en) | Hepatitis b viral (hbv) mutants detection and application | |
| Tang et al. | Virological Factors Involved in AECHB | |
| Chang et al. | Characterization of nonconventional hepatitis B viruses lacking the core promoter | |
| CN101555468B (zh) | 对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用 | |
| AU2005289372B2 (en) | Variants of hepatitis B virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof | |
| Nekhwevha | Molecular characterization and genotyping of hepatitis B virus (HBV) from sudanese end stage renal disease (ESRD) patients with overt and occult HBV infection | |
| Rosenkranz et al. | Hepatitis B and Hepatitis D Viruses | |
| Balan et al. | Chronic Hepatitis B and D | |
| Bonino et al. | Diagnostic advances in viral hepatitis: the discovery of hepatitis C virus and genetic heterogeneity of hepatitis B virus | |
| Lott | The analysis of hepatitis B virus core-polymerase interactions for encapsidation and genomic replication | |
| Said | Hepatitis B virus genotypes and pre-core/core-promoter mutations in Palestinian patients with chronic HBV and liver complications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060227 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20060227 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060901 |