KR101241272B1 - 면역 요법으로서의 효모계 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역 요법으로 치료할 수 있는 다양한 질병 및 용태를 치료 및/또는 예방할 수 있는 조성물 및 방법, 특정 양태로서 동물에서 암을 치료 및/또는 예방할 수 있는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 다양한 질병 및 용태의 예방 및/또는 치료를 위한 백신화 그리고 예방 및/또는 치료용으로서 효모 비히클과 항원 특이적 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 선택된 항원을 포함하는 효모계 백신의 용도와 관련된 개선이 개시되어져 있다.

Description

면역 요법으로서의 효모계 백신{YEAST-BASED VACCINES AS IMMUNOTHERAPY}

본 발명은 체액성 및 세포성 면역의 유도, 한 측면으로는 동물의 다양한 암의 예방 및 치료를 위한 이종성 항원(heterologous antigen)을 포함하는 효모계 백신의 용도에 관한 것이다.

신생물(neoplasia) 또는 신규하고 비정상적인 성장을 초래하는 빠른 세포의 증식 과정은 심각한, 때로는 치명적인 많은 질병들의 특징이다. 일반적으로 세포와 조직의 신생물 성장은 세포의 정상 증식보다 활발하여 세포들은 심지어 선동 인자(예, 종양 프로모터, 발암물질, 바이러스)가 더 이상 존재하지 않은 이후에도 계속해서 성장한다. 이러한 세포의 성장은 정상 조직과 구조적인 유기화 및/또는 협력의 결핍을 보이는 경향이 있으며, 일반적으로 양성 또는 악성일 수도 있는 조직 덩어리(예, 종양)를 생성한다. 악성 세포의 성장, 즉 악성 종양은 전세계의 주도적인 사망 원인이며, 신생물 관련 질병에 효과적인 요법의 발달은 거대한 연구의 목표이다. 암의 예방 및 치료를 위한 다양한 혁신적인 방법이 제안되어 왔음에도 불구하고, 많은 암은 여전히 높은 사망률을 기록하고 있으며 치료하기 어렵거나 전통적인 요법에 상대적으로 반응하지 않는다.

예를 들면, 폐암은 미국에서 두 번째로 가장 흔한 암의 형태이다. 폐암은 모든 암의 15%를, 그리고 모든 암 사망의 28%를 차지하고 있다. 2002년에 대략 177,000의 신규 폐암이 진단될 것이고 166,000이 사망할 것인데, 이는 결장직장, 전립선 및 유방암을 합한 것보다 높은 사망률이다. 일차 폐암의 80%가 비소세포폐암종(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)이다. 표준 화학 요법은 심각한 부작용을 동반한 최소의 생존 효과를 달성하는 다수의 약물 요법과 같이 상대적으로 효과가 없다.

다른 예로서 다형성아교모세포종(신경교종)은 성인에게서 가장 흔한 일차 악성 뇌종양이다. 외과 수술, 방사선 요법 및 화학 요법의 이용에도 불구하고, 치료율 및 정중(median) 환자의 생존은 개선되지 않고 있다. 다른 종양이 또한 뇌로 전이되며 이러한 상황에서 상기 종양은 혈관/뇌 장벽(blood/brain barrier)에 의해 야기되는 약물 전달의 제약으로 인하여 말초의 화학 요법에 대하여 덜 반응한다. 따라서 뇌종양에 대한 더욱 직접적인 치료학적 접근법이 요구된다. 그러한 접근법에 면역 요법이 포함된다. 말초에서 감작된(primed) 림프구가 혈관/뇌 장벽을 관통하여 뇌 조직을 표적화함이 공지되어 있다. 뇌종양 면역 요법에서 주요 표적은 뇌종양 세포에서 특이적으로 발현되는 신규하거나 돌연변이된 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 백신이다. 그 다음 목표는 두개골내 종양에 대하여 광범위하고 강력하며 장기간 지속되는 면역에 의한 보호를 제공할 백신 접근법을 제공하는 것이다.

백신은 질병을 예방하고 이미 확립된 질병을 치료하는데 광범위하게 이용되고 있다(면역 요법 백신). 단백질 항원(예, 재조합 DNA 기술에 의해 개발되어진 서브유니트 백신)은 애드주번트 없이 투여되었을 때 약한 체액성(항체) 면역을 유도하고 제한적인 면역원성을 생성하므로 현재까지는 실망적이었다. 서브유니트 백신 뿐만 아니라 사멸된 바이러스 및 재조합 살아있는 바이러스 백신의 추가 단점은 이들이 애드주번트와 함께 투여되었을 때에는 강한 체액성 면역 반응을 촉진하지만, 보호적 세포성 면역을 유도하지는 못한다는 것이다. 애드주번트는 실험적으로 마우스에서 강력한 면역 반응을 촉진하기 위하여 이용되고 있으며 사람 백신에 이용될 수도 있지만, 사람에게 이용될 수 있도록 허가된 애드주번트는 거의 없다. 실제로 미국에서 상기 용도로 허가된 애드주번트는 알루미늄염, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트이며, 이들 중 어떤 것도 세포-매개 면역(cell-mediated immunity)을 촉진하지 못한다. 알루미늄염 제형은 냉동시키거나 동결건조시킬 수 없으며, 상기 애드주번트는 모든 항원에 효과적이지 않다. 또한, 대부분의 애드주번트는 세포독성 T 림프구(CTL)의 유도를 이끌어내지 못한다. CTL은 바이러스 단백질 및 돌연변이된 "자가" 단백질을 포함한 이상 단백질을 합성하는 세포들을 죽이는데 필요하다. CTL을 촉진하는 백신은 모든 암(예, 흑색종, 전립선암, 난소암등)을 포함한 다양한 질병에 대응하기 위한 용도로서 심도 있게 연구되어져 왔다. 따라서 애드주번트는 CTL 및 세포 매개 면역을 촉진하는데 일반적으로 필요하다.

효모는 서브유니트 단백질 백신의 생산에 이용되고 있다; 그러나 이러한 경우에 효모는 단백질을 생산하는데 이용되는 것이지 효모 세포 또는 이의 아세포(subcellular) 분획물이 환자에게 실질적으로 전달되는 것은 아니다. 효모는 비특이적인 방식으로 면역 반응을 감작시키기 위하여(즉, 식세포작용 뿐만 아니라 보체 및 인터페론의 생산을 촉진하기 위하여) 면역화시키기 전에 동물에게 주입된다. 결과는 모호하고 그러한 프로토콜은 보호적 세포성 면역을 생성시키지 못한다; 예를 들면, Fattal-German et al. 1992, Dev . Biol . Stand . 77, 115-120; Bizzini et al. 1990, FEMS Mircobiol . Immunol . 2, 155-167을 참조.

1998년 11월 3일자로 특허된 Duke 등에 의한 미국특허 제5,830,463호에는 면역반응을 조정할 수 있는 적어도 하나의 화합물을 보유한 비병원성 효모의 용도를 개시하고 있으며, 그러한 복합체가 세포 매개 뿐만 아니라 체액성 면역을 촉진하는데 효과가 있다는 것을 보여주었다. 특히, 미국특허 5,830,463호는 동물에 투여되었을 때 세포 매개 및 체액성 면역 반응 모두를 유도할 수 있는 이종성 항원을 발현하도록 유전 공학적으로 조작된 효모를 개시하고 있다.

암 요법 및 백신 기술에서 최근의 진보에도 불구하고 신생물의 형질전환에 의해 유발되는 질병(암)을 포함한 면역 요법으로 치료할 수 있는 질병, 특히 전통적인 암 요법 및 일반적인 백신 전략을 사용한 치료에 특히 저항성을 보이는 암에 대한 안전하고 효과적인 백신과 애드주번트를 개발할 필요성이 여전히 남아있다.

본 발명의 한 양태는 암 또는 암으로 발전할 위험을 가진 동물에게 상기 동물의 적어도 하나의 암 징후를 감소하거나 예방할 수 있는 백신을 투여하는 단계를 포함한 암에 대하여 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 상기 백신은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 발현되는 융합 단백질을 포함하되, 상기 융합 단백질은 (i) 적어도 하나의 암 항원; 및 (ii) 상기 암 항원의 N-말단에 연결된 펩타이드를 포함하되, 상기 펩타이드는 상기 암 항원에 이종성인 적어도 두 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있으며, 상기 펩타이드는 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키거나 발현된 융합 단백질의 해독후 수정을 방지한다. 상기 융합 단백질은 (1) 융합 단백질의 제 1 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이고; (2) 융합 단백질의 제 2 위치에 있는 아미노산 잔기는 글리신 또는 프롤린이 아니며; (3) 융합 단백질의 2-6 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이 아니고; (4) 융합 단백질의 2-5 위치에 있는 아미노산 잔기는 리신 또는 아르기닌이 아니라는 추가의 요건을 구비한다. 한 측면에서 상기 펩타이드는 암 항원에 이종성인 적어도 2-6개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 다른 양태에서, 상기 펩타이드는 M-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆의 아미노산 서열을 포함하되, X₂는 글리신, 프롤린, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이고; X₃는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이며; X₄는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이고; X₅는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이며; X₆은 메티오닌을 제외한 임의의 아미노산이다. 한 측면에서, 상기 X₆은 프롤린이다. 다른 측면에서, 상기 펩타이드는 M-A-D-E-A-P(서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 양태는 암 또는 암으로 발전할 위험을 가진 동물에게 상기 동물의 적어도 하나의 암 징후를 감소하거나 예방할 수 있는 백신을 투여하는 단계를 포함한 암에 대하여 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 상기 백신은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 발현되는 융합 단백질을 포함하되, 상기 융합 단백질은 (i) 적어도 하나의 암 항원; 및 (ii) 상기 암 항원의 N-말단에 연결된 효모 단백질을 포함하되, 상기 효모 단백질은 내인성 효모 단백질의 약 2개 내지 약 200개의 아미노산으로 이루어지며, 상기 효모 단백질은 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키거나 발현된 융합 단백질의 해독후 수정을 방지한다. 한 측면에서, 상기 효모 단백질은 융합 단백질의 동정 및 정제를 위한 항체 에피토프를 포함한다.

본 발명에 따른 상기 양태들 중 어느 하나에서 하기 추가의 측면이 고려된다. 한 측면에서, 상기 융합 단백질은 적어도 두 개의 암 항원을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 융합 단백질은 하나 이상의 암 항원의 적어도 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 암 항원은 흑색종, 편평세포 암종, 유방암, 두경부 암종, 갑상선 암종, 연조직 육종, 골 육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 맥관 육종, 혈관 육종, 비만 세포 종양, 원발성 간암, 폐암, 췌장암, 위장관암, 신세포 암종, 조혈 신생물 및 이의 전이암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암과 연관된 항원이다.

또 다른 측면에서, 상기 암 항원은 ras 유전자에 의해 암호화된 야생형 또는 돌연변이된 단백질이다. 예를 들면, 상기 암 항원은 K- ras, N- ras 및 H- ras 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 ras 유전자에 의해 암호화된 야생형 또는 돌연변이된 단백질을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 ras 유전자는 단일 또는 다수의 돌연변이를 갖는 Ras 단백질을 암호화한다. 다른 측면에서, 상기 암 항원은 야생형 Ras 단백질에 대하여 12, 13, 59 또는 61 번째 아미노산을 포함하는 야생형 Ras 단백질의 적어도 5-9개의 연속된 아미노산 잔기의 단편을 포함하되, 상기 12, 13, 59 또는 61 번째 아미노산은 야생형 Ras 단백질에 대하여 돌연변이된 것이다.

또 다른 측면에서, 상기 암 항원은 다수의 도메인을 포함하는 융합 단백질 작제물로 이루어지되, 각 도메인은 종양 단백질에서 유래된 펩타이드로 이루어지고, 상기 펩타이드는 상기 종양 단백질에 존재하는 돌연변이된 아미노산을 포함하면서 그 아미노산의 양측에 위치하는 적어도 4개의 아미노산 잔기로 이루어지되, 상기 돌연변이는 종양 유발성과 연관된 것이다. 이러한 측면에서, 상기 융합 단백질 작제물은 다른 돌연변이된 종양 항원과 프레임 내에서 융합된 적어도 하나의 펩타이드로 이루어지되, 상기 펩타이드는 (a) 서열번호: 3의 적어도 8-16 위치부터 포함하되, 상기 서열번호: 3의 제 12위치의 아미노산 잔기는 서열번호: 3과 비교했을 때 돌연변이된 펩타이드; (b) 서열번호: 3의 적어도 9-17 위치부터 포함하되, 상기 서열번호: 3의 제 13위치의 아미노산 잔기는 서열번호: 3과 비교했을 때 돌연변이된 펩타이드; (c) 서열번호: 3의 적어도 55-63 위치부터 포함하되, 상기 서열번호: 3의 제 59위치의 아미노산 잔기는 서열번호: 3과 비교했을 때 돌연변이된 펩타이드; 및 (d) 서열번호: 3의 적어도 57-65위치부터 포함하되, 상기 서열번호: 3의 제 61위치의 아미노산 잔기는 서열번호: 3과 비교했을 때 돌연변이된 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 측면에서, 상기 돌연변이된 종양 항원은 야생형 Ras 단백질 서열에 대하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 Ras 단백질이다.

상기 방법들 중 어느 하나의 한 양태에서, 백신은 기도로 투여된다. 다른 양태에서, 백신은 투여의 비경구 경로에 의해 투여된다. 또 다른 양태에서, 상기 백신은 추가로 수지상 세포 또는 마크로파지를 포함하되, 융합 단백질을 발현하는 효모 비히클은 생체 외에서 수지상 세포 또는 마크로파지로 전달되고 상기 암 항원을 발현하는 효모 비히클을 포함하는 수지상 세포 또는 마크로파지가 동물에게 투여된다. 이러한 양태의 한 측면에서, 상기 수지상 세포 또는 효모 비히클은 유리 항원에 의해 추가로 로딩된다. 한 측면에서, 상기 백신은 치료학적 백신으로서 투여된다. 다른 측면에서, 상기 백신은 예방 백신으로서 투여된다. 한 측면에서, 상기 동물은 뇌암, 폐암, 유방암, 흑색종 및 신세포암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암 또는 그러한 암으로 발전한 위험을 가지고 있다. 다른 측면에서, 상기 동물은 암을 갖고 있으며 백신의 투여는 상기 동물로부터 종양을 외과수술로 절개한 후 수행된다. 또 다른 측면에서, 상기 동물은 암을 갖고 있으며 백신의 투여는 상기 동물로부터 종양을 외과수술로 절개한 후 및 동종의 비골수형성 줄기 세포 이식 후 수행된다. 또 다른 측면에서, 상기 동물은 암을 갖고 있으며 백신의 투여는 상기 동물로부터 종양을 외과수술로 절개한 후, 동종의 비골수형성 줄기 세포 이식 후 및 동종의 공여 림프구 주입 후 수행된다.

본 발명의 다른 양태는 뇌암 또는 폐암 또는 그러한 암으로 발전할 위험을 가진 동물의 기도에 상기 동물에서 뇌암 또는 폐암의 적어도 하나의 징후를 감소 또는 예방할 수 있는 효모 비히클 및 적어도 하나의 암 항원을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함한 뇌암 또는 폐암에 대하여 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 이러한 양태에서 백신은 전술된 융합 단백질 중 어느 하나 뿐만 아니라 다른 항원을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 백신은 적어도 두 개의 암 항원을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 암 항원은 적어도 하나의 암 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 또 다른 측면에서, 상기 암 항원은 하나 이상의 암 항원의 적어도 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.

이러한 양태의 한 측면에서, 백신은 비강내 투여에 의해 투여된다. 다른 측면에서, 상기 백신은 기관내 투여에 의해 투여된다. 또 다른 양태에서, 상기 효모 비히클 및 암 항원은 수지상 세포 또는 마크로파지로 생체 외에서 전달되고 상기 효모 비히클 및 암 항원을 포함하는 수지상 세포 또는 마크로파지는 동물의 기관지로 투여된다.

한 측면에서, 상기 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만 다형성아교모세포종과 같은 일차 뇌암 또는 다른 기관으로부터 전이된 암을 포함함 뇌암에 대하여 동물을 보호한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 일차 폐암(예, 비소세포암종, 소세포암종, 샘암종) 또는 다른 기관으로부터 전이된 암을 포함한 뇌암에 대하여 동물을 보호한다. 한 측면에서, 상기 백신은 치료학적 백신으로서 투여된다. 다른 측면에서, 상기 백신은 예방 백신으로서 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태는 동물에서 항원 특이적 체액성 면역 반응 및 항원 특이적 세포 매개 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 동물에게 치료학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는데, 상기 조성물은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 발현되는 융합 단백질을 포함하되, 상기 융합 단백질은 (i) 적어도 하나의 항원; 및 (ii) 상기 항원의 N-말단에 연결된 펩타이드를 포함하되, 상기 펩타이드는 상기 항원에 이종성인 적어도 두 개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 상기 펩타이드는 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키거나 발현된 융합 단백질의 해독후 수정을 방지한다. 상기 융합 단백질은 융합 단백질의 제 1 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이고; 융합 단백질의 제 2 위치에 있는 아미노산 잔기는 글리신 또는 프롤린이 아니며; 융합 단백질의 2-6 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이 아니고; 융합 단백질의 2-5 위치에 있는 아미노산 잔기는 리신 또는 아르기닌이 아니라는 추가의 요건을 구비한다. 한 측면에서, 상기 펩타이드는 상기 항원에 이종성인 적어도 여섯 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 다른 측면에서, 상기 펩타이드는 M-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆의 아미노산 서열을 포함하되, X₂는 글리신, 프롤린, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이고; X₃는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이며; X₄는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이고; X₅는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이며; X₆은 메티오닌을 제외한 임의의 아미노산이다. 한 측면에서, 상기 X₆은 프롤린이다. 한 측면에서, 상기 펩타이드는 M-A-D-E-A-P(서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 항원은 바이러스의 항원, 과잉발현된 포유동물의 세포 표면 분자, 박테리아의 항원, 곰팡이의 항원, 프로토조아의 항원, 기생충의 항원, 체외 기생충의 항원, 암 항원, 하나 이상의 돌연변이된 아미노산을 보유한 포유동물의 세포 분자, 포유동물 세포에 의해 출생 전 또는 출생 초기에 정상적으로 발현되는 단백질, 역학적 인자(예, 바이러스)의 삽입에 의해 발현이 유도되는 단백질, 유전자 전위에 의해 발현이 유도되는 단백질 및 조절 서열의 돌연변이에 의해 발현이 유도되는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 양태는 상기 방법에서 이용되는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 동물에서 항원 특이적 체액성 면역 반응 및 항원 특이적 세포 매개 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 동물에게 치료학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는데, 상기 조성물은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 상기 효모 비히클에 의해 발현되는 융합 단백질을 포함하되, 상기 융합 단백질은 (i) 적어도 하나의 항원; 및 (ii) 상기 항원의 N-말단에 연결된 효모 단백질을 포함하되, 상기 효모 단백질은 내인성 효모 단백질의 약 2개 내지 약 200개의 아미노산으로 이루어지고, 상기 효모 단백질은 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키거나 발현된 융합 단백질의 해독후 수정을 방지한다. 한 측면에서, 상기 효모 단백질은 융합 단백질의 동정 및 정제를 위한 항체 에피토프를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 방법에서 이용되는 백신이다.

본 발명의 또 다른 양태는 (a) 암을 가진 환자에게 동종의 공여자에 의해 제공된 줄기 세포로 비골수형성 줄기 세포 이식에 의해 안정한 혼합된 골수 키메라증을 확립하여 치료하는 단계; (b) 동종의 공여자로부터 얻은 림프구를 환자에게 투여하는 단계; 및 (c) (b) 단계 후에 환자에게 효모 비히클 및 적어도 하나의 암 항원을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함한 암을 가진 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 방법은 단계 (a) 전에 동종의 공여자에게 효모 비히클 및 적어도 하나의 암 항원을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 단계 (a)를 수행하기 이전에 환자로부터 종양을 제거하는 단계를 포함한다.

이러한 방법의 한 측면에서, 백신은 적어도 두 개의 암 항원을 포함한다. 다른 측면에서, 암 항원은 하나 이상의 암 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 또 다른 측면에서, 암 항원은 하나 이상의 암 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 다른 측면에서, 상기 암 항원은 다수의 도메인을 포함하는 융합 단백질 작제물로 이루어지되, 각 도메인은 종양 단백질에서 유래된 펩타이드로 이루어지고, 상기 펩타이드는 상기 종양 단백질에 존재하는 돌연변이된 아미노산을 포함하면서 그 아미노산의 양측에 위치하는 적어도 4개의 아미노산 잔기로 이루어지되, 상기 돌연변이는 종양 유발성과 연관된 것이다. 다른 측면에서, 효모 비히클은 암 항원을 발현하고 상기 암 항원은 (i) 적어도 하나의 암 항원; 및 (ii) 상기 암 항원의 N-말단에 연결된 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이되, 상기 펩타이드는 상기 암 항원에 이종성인 적어도 두 개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 상기 펩타이드는 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키거나 발현된 융합 단백질의 해독후 수정을 방지한다: 여기서, 융합 단백질의 제 1 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이고; 융합 단백질의 제 2 위치에 있는 아미노산 잔기는 글리신 또는 프롤린이 아니며; 융합 단백질의 2-6 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이 아니고; 융합 단백질의 2-5 위치에 있는 아미노산 잔기는 리신 또는 아르기닌이 아니다. 다른 측면에서, 상기 효모 비히클은 암 항원을 발현하고 상기 암 항원은 (i) 적어도 하나의 암 항원; 및 (ii) 상기 암 항원의 N-말단에 연결된 효모 단백질을 포함하는 융합 단백질이되, 상기 효모 단백질은 내인성 효모 단백질의 약 2개 내지 약 200개의 아미노산으로 이루어지고, 상기 효모 단백질은 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키거나 발현된 융합 단백질의 해독후 수정을 방지한다.

이러한 양태의 한 측면에서, 백신은 비강내 투여에 의해 투여된다. 다른 측면에서, 백신은 비경구 투여에 의해 투여된다. 다른 측면에서, 상기 효모 비히클 및 암 항원은 수지상 세포 또는 마크로파지로 생체 외에서 전달되고 상기 효모 비히클 및 암 항원을 포함하는 수지상 세포 또는 마크로파지는 동물의 기도로 투여된다.

본 발명에 따른 상술한 방법 및 조성물 중 어느 하나에서, 상기 효모 비히클과 관련된 하기 측면이 본 발명에 포함된다. 한 양태에서, 효모 비히클은 전체 효모, 효모 스페로플라스트, 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 및 아세포(subcellular) 효모 막 추출물 또는 이의 분획물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 측면에서, 효모 비히클을 제조하기 위해 이용되는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트는 항원을 암호화하는 재조합 핵산 분자로 형질전환되어 상기 항원이 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트에 의해 재조합으로 발현되는 것이다. 이러한 측면에서, 상기 항원을 재조합으로 발현하는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트는 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 또는 아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 효모 비히클을 생산하는데 이용된다. 한 측면에서, 상기 효모 비히클은 비병원성 효모로부터 유래된다. 다른 측면에서, 상기 효모 비히클은 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 클루베로마이세스, 한세눌라, 칸디다 및 피키아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효모로부터 유래된다. 한 측면에서, 상기 사카로마이세스는 S. 세레비시애이다.

일반적으로 효모 비히클 및 항원은 본 발명에서 기술된 임의의 기술에 의해 연관될 수 있다. 한 측면에서, 상기 효모 비히클은 세포내에 암 항원에 의해 로딩된다. 다른 측면에서, 상기 암 항원은 효모 비히클에 공유결합으로 또는 비공유결합으로 부착된다. 또 다른 측면에서, 상기 효모 비히클 및 암 항원은 혼합에 의해 연관된다. 다른 측면에서, 항원은 효모 비히클 또는 상기 효모 비히클이 유래되는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트에 의해 재조합으로 발현된다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 면역 요법으로 치료할 수 있는 다양한 질병 및 용태를 치료 및/또는 예방할 수 있는 조성물과 방법, 특정 양태로는 동물에서 암을 치료 및/또는 예방할 수 있는 조성물과 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다양한 질병 및 용태의 예방 및/또는 치료 그리고 예방 및/또는 치료를 위한 백신화(vaccination)에 이용될 수 있는 효모 비히클 및 동물에서 항원 특이적 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 선택된 항원을 포함하는 효모계 백신의 용도를 포함한다. 특히 본 발명자들은 생체 내에서 폐암, 뇌암, 유방암 및 신세포암을 포함한 다양한 서로 다른 형태의 암에서 종양을 감소시키는데 효모계 백신의 용도를 기술한다. 또한, 암 요법 뿐만 아니라 다양한 면역 요법의 방법 및 조성물의 치료에 적용할 수 있는 효모계 백신의 개선을 설명한다.

본 발명자들은 앞서 세포독성 T 세포 (CTL) 반응을 포함한 강력한 세포 매개 면역을 유도하는 백신 기술을 앞서 기술해왔다. 상기 백신 기술은 백신 벡터로서 효모 및 이의 유도체의 이용을 포함하는데, 상기 효모는 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 당해 항원을 발현하도록 조작되거나 상기 항원에 의해 로딩된다. 이러한 기술은 미국특허 제 5,830,463호에 기술되어 있으며, 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다. 본 발명은 미국특허 제 5,830,463호에 기술된 기존의 효모 백신 기술을 채택하고, 효모 비히클 및 선택된 암 항원을 사용하여 암을 감소시키는 방법의 특정 개선 뿐만 아니라 증대된 안정성을 갖는 신규 단백질을 포함하는 신규 효모 백신 및 면역 반응의 유도가 치료 효과를 발휘하는 임의의 질병 또는 용태를 치료하는데 상기 신규 효모 백신의 이용 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 양태에서 이용될 수 있는 효모 백신에 대한 일반적인 설명은 또한 동시계속출원중인 미국출원번호 09/991,363호에 기술되어 있으며, 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다.

특히, 본 발명자들은 다수의 면역화 경로가 말초에 있는 종양을 파괴하는데 동등하게 효과적이지만, 본 발명에서 이용된 효모계 백신은 폐에 특이한 효과기 세포(effector cell)를 감작할 수 있음을 발견하였다. 따라서 다른 투여 경로도 효과적이지만, 기도(예, 비강내, 흡입, 기관지)를 통한 효모 백신의 투여는 놀랍게도 지금까지 연구된 다른 투여 경로를 사용해서 달성하지 못한 강력한 면역 반응 및 항종양 효과를 제공한다. 특히, 본 발명자들은 기도로 효모 백신의 투여는 백신이 말초에 투여된 경우 보다 폐암에서 종양을 감소시키는데 현저하게 우수하다는 것을 발견하였다. 더욱 놀라운 것은 뇌암에서 기도로 효모 백신의 투여는 지금까지 실험된 모든 실험 모델에서 강력한 항종양 반응을 유도하는 반면에, 백신의 말초(피하내) 투여는 뇌암에서 항종양 반응을 유도하는데 덜 효과적이었으며, 뇌암의 경우 적어도 한 실험 모델에서 말초 투여는 뇌에서 상당한 항종양 효과를 제공하지 못하였다는 것이다. 따라서 본 발명에 따른 효모계 백신은 폐에 있는 독특한 면역 효과기 세포의 전구체를 감작할 수 있으며, 그러한 면역 세포는 혈관-뇌 장벽을 관통하는데 특히 효과적이어서 두개골내 종양 성장의 코스(course)에도 영향을 미칠 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만 본 발명자들은 면역화의 경로가 적어도 뇌종양 및 폐종양에 효과적인 백신의 설계에서는 중요한 요소일 것이라고 확신한다. 본 발명의 효모계 백신은 다수의 면역화 경로에 용이하게 적용될 수 있기 때문에 상기 백신은 지금까지 일부 암 치료에서 과소평가된 잠재력을 가진 매우 특이적인 면역 반응을 독특하게 유발할 가능성이 있다.

본 발명자들은 또한 Luznik 등(Blood 101(4): 1645-1652, 2003; 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다)에 의해 개시된 혼합된 동종의 골수 키메라 프로토콜의 신규 변형에서 본 발명에 따른 효모 백신의 이용은 생체 내에서 치료 면역 및 항종양 반응의 강력한 유도를 초래한다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 수령자 유래의 전체 종양물을 사용할 필요 없이, 과립구-마크로파지 집락 자극인자(GM-CSF)와 같은 생물학적 반응 조정자로 백신을 개선시킬 필요 없이 그리고 통상적인 애드주번트를 사용할 필요 없이 달성될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 효모 비히클의 이용은 항원 선택 및 항원의 조합에 상당한 유연성을 제공하며, 상기 항원에 대한 세포성 면역에 상당한 증진을 제공한다. 또한, 본 발명은 제어, 선택적인 방식에 의해 본 발명에 따른 효모 백신으로 공여자를 면역화시킴으로써 상기 프로토콜의 추가 개선점을 제공한다.

또한, 본 발명자들은 효모 비히클에서 이종성 단백질의 발현을 안정화시키고/거나 발현된 이종성 단백질의 해독후 수정(posttranslational modification)을 방지하는 신규 융합 단백질을 이용함으로써 효모계 백신 기술을 개선하였다. 본 발명자들은 효모에서 이종성 항원을 발현시키기 위한 신규 작제물을 개시하였는데, 여기서 원하는 항원성 단백질 또는 펩타이드는 이의 아미노 말단에서 (a) 합성 펩타이드 또는 (b) 내인성 효모 단백질의 적어도 일부분에 융합되고, 상기 융합 파트너는 효모에서 단백질의 발현에 상당히 증대된 안정성을 제공하고/거나 효모 세포에 의한 단백질의 해독후 수정을 방지한다. 또한, 상기 융합 펩타이드는 항체와 같은 선별 인자(selection agent)에 의해 인지될 수 있고, 작제물 중 백신화 항원에 대한 면역 반응에 부정적인 영향을 미치지 않는 에피토프를 구비한다. 상기 선별 인자는 본 발명에서 유용한 단백질의 동정, 선별 및 정제에 유용하다.

또한, 본 발명은 항원 작제물의 C-말단에 융합된 펩타이드의 용도, 특히 단백질의 선별 및 동정을 위한 용도로서 고려한다. 그러한 펩타이드는 이에 제한되는 것은 아니지만, 펩타이드 태그(예, 6 × His) 또는 임의의 다른 짧은 에피토프 태그와 같은 임의의 합성 또는 천연 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 따른 항원의 C-말단에 부착된 펩타이드는 앞서 기술된 N-말단 펩타이드의 부가 또는 부가 없이 이용될 수 있다.

추가로 본 발명자들은 동일한 작제물 내에 하나 이상의 항원으로부터 유래된 다수의 면역원성 도메인을 구비한 효모계 백신에서 이용될 수 있는 신규 융합 단백질 항원을 기술한다. 그러한 융합 단백질은 단일 백신 작제물 내에 여러 개의 상이한 돌연변이 및/또는 천연적으로 당해 항원에 하나 또는 몇 개의 위치에 존재하는 돌연변이의 조합을 포함하는 것이 적절한 경우에 특히 유용하다. 예를 들면, 천연적으로 종양 세포의 표현형과 관련된 ras 유전자 과(family)의 종양 유전자에 여러 개의 서로 다른 돌연변이가 존재하는 것이 알려져 있다. Ras 단백질에서 제 12위치의 아미노산을 암호화하는 코돈에서의 돌연변이가 췌장암의 78%에서, 결장직장암의 34%에서, 비소세포폐암종의 27%에서 그리고 난소암의 24%에서 발견된다. 제 13, 59 및 61위치의 서로 다른 돌연변이가 다양한 암에서 또한 발견되고 있다. 효모계 백신 접근법을 사용하여 본 발명자들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 동일 항원 백신 내에서 동일 위치에 있는 여러 개의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 위치에 있는 서로 다른 돌연변이의 조합을 포괄할 수 있는 ras 돌연변이에 기반을 둔 융합 단백질을 포함한 융합 단백질의 생산에 대하여 설명한다.

본 발명에서 이용된 방법과 조성물에 대한 일반적인 설명으로서, 본 발명의 백신과 방법은 보조적 애드주번트 성분 또는 생물학적 매개자를 필요로 하지 않으면서 효율적인 항원 전달과 매우 효과적인 T 세포 활성화를 강력한 백신 제형으로 통합한다. 본 발명에서 기술된 백신 접근법은 이에 제한되는 것은 아니지만 구조화의 용이함, 대량 생산에서의 저렴함, 생물학적 안정성 및 안전성을 포함한 이상적인 백신 후보자가 될 수 있는 다른 많은 장점을 보유하고 있다. 전체 효모로 면역화함에 의한 역효과가 마우스, 래트, 래비트, 돼지꼬리 원숭이(Macaca nemestrina), 마커크 원숭이(rhesus macaques) 또는 면역 결핍된 CB.17^scid 마우스 중 어느 하나에 대한 초기 백신화 시기 또는 반복 투여시에도 나타나지 않았다(공개되지 않은 결과). 또한, 상기 미국출원번호 09/991,363호에 기술된 수지상 세포를 강력한 항원 제시 세포(APC)로 성숙시키는 효모-항원 복합체의 능력에 의하면 항원을 MHC class-I 및 class-II 프로세싱 경로 모두로 효율적으로 전달하는 것은 효모계 백신 벡터가 다양한 감염성 질병 및 암 표적에 대하여 직접적인 세포-매개 면역을 유도하는 강력한 전략을 제공할 것이라는 것을 암시한다. 실제로 여기에 기술된 데이터 및 효모계 백신에서의 진보는 이전에는 예상하지 못한 관련 기술에서의 상당한 개선을 제공함과 동시에 이러한 일반적인 원리를 계속해서 입증한다.

본 발명에서 효모 비히클은 본 발명의 백신 또는 치료학적 조성물에서 항원과 접합하여 또는 애드주번트로서 사용될 수 있는 임의의 효모 세포(예, 전체 또는 온전한 세포) 또는 (후술하는) 이들의 유도체이다. 따라서 효모 비히클은 이에 제한되는 것은 아니지만, 살아있는 온전한 효모 미생물(즉, 세포벽을 포함한 그것의 모든 성분을 가진 효모 세포), 사멸된(죽은) 온전한 효모 미생물 또는 효모 스페로플라스트(즉, 세포벽이 결핍된 효모 세포), 효모 사이토플라스트(즉, 세포벽과 핵이 결핍된 효모 세포), 세포 고스트(즉, 세포벽, 핵 및 사이토플라즘이 결핍된 세포) 또는 아세포 효모 막 추출물 또는 (앞서 효모 입자로서 언급된) 이의 분획물을 포함한 효모 미생물의 유도체를 포함할 수 있다.

효모 스페로플라스트는 통상적으로 효모 세포벽의 효소를 이용한 분해에 의해 생된다. 그러한 방법은 예를 들면 Franzusoff et al. 1991, Meth . Enzymol . 194, 662-674에 기술되어 있고, 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다. 효모 사이토플라스트는 일반적으로 효모 세포의 탈핵화에 의해 생산된다. 그러한 방법은 예를 들면, Coon, 1978, Natl . Cancer Inst . Monogr . 48, 45-55에 기술되어 있고, 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다. 효모 고스트는 일반적으로 투과되거나 용해된(lysated) 세포를 재봉합하여 생산될 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 세포의 적어도 일부 세포기관(organelle)을 포함할 수 있다. 그러한 방법은 예를 들면, Franzusoff et al. 1983, J. Biol . Chem ., 258,3608-3614 및 Bussey et al. 1979, Biochem . Biophys . Acta 553, 185-196에 기술되어 있으며, 각각 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다. 아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물은 천연 핵 또는 사이토플라즘이 결핍된 효모 막을 의미한다. 상기 입자는 당업계에 알려진 초음파 처리 또는 다른 막 분쇄 방법과 이어지는 재봉합에 의해 생산되는 천연의 효모 막 크기부터 마이크로입자까지를 포함하는 임의의 크기일 수 있다. 아세포 효모 막 추출물을 생산하는 방법은 예를 들면 Franzusoff et al. 1991, Meth . Enzymol . 194, 662-674에 기술되어 있다. 항원이 효모 막 추출물의 제조 이전에 효모에 의해 재조합으로 발현된 경우에는 효모 막 일부분 및 상기 항원을 포함하는 효모 막 추출물의 분획물을 또한 이용할 수 있다.

임의의 효모 균주가 본 발명의 효모 비히클을 생산하는데 이용될 수 있다. 효모는 단일세포(unicellular) 미생물로서 다음 3개의 부류 중 어느 하나에 속한다: 자낭균(Ascomycete), 담지균류(Basidiomycete) 및 불완전 균류(Fungi Imperfecti). 병원성 효모 균주 또는 이의 비병원성 돌연변이체가 본 발명에서 이용될 수 있지만, 비병원성 효모 균주가 바람직하다. 바람직한 효모 균주 속(genera)에는 사카로마이세스, (병원성일 수도 있는) 칸디다, 크립토코쿠스, 한세눌라, 클루베로마이세스, 피카아, 로도토룰라, 스키조사카로마이세스 및 야로위아 등이 포함되며, 사카로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 피키아 및 스키조사카로마이세스가 보다 바람직하고 사카로마이세스가 더욱 바람직하다. 바람직한 효모 균주 종(species)에는 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 칼스버젠시스, 칸디다 알비칸스, 칸디다 케피르, 칸디다 트로피칼리스, 크립토코쿠스 라우렌티, 크립토코쿠스 네오포르만스, 한세눌라 아노말라, 한세눌라 폴리모르파, 클루베로마이세스 프라질리스, 클루베로마이세스 락티스, 클루베로마이세스 마르크시아누스 바르 락티스, 피키아 파스토리스, 로도토룰라 루브라, 스키로사카로마이세스 폼베 및 야로위아 리포리티카 등을 포함한다. 다양한 이와 같은 종들이 아종(subspecies), 유형, 아형(subtype) 등을 포함한다는 것이 자명하며, 그들은 모두 상술한 종 내에 포함된다. 보다 바람직한 효모 종은 S. 세레비시애, C. 알비칸스, H. 폴리모르파, P. 파스토리스 및 S. 폼베를 포함한다. S. 세레비시애는 상대적으로 다루기 용이하고 식품 첨가제로서 이용되는 "Generally Recognized As Safe" or "GRAS"이므로 특히 바람직하다(GRAS, FDA 제안된 Rule 62FR18938, 1997년 4월 17일). 본 발명의 한 양태는 S 세레비시애 cir° 균주와 같이 플라스미드를 더욱 높은 카피수(copy number)로 복제할 수 있는 효모 균주이다.

한 양태에서, 본 발명의 바람직한 효모 비히클은 수지상 세포 또는 마크로파지와 같이 효모 비히클과 항원이 전달되는 세포 유형과 융합할 수 있는 것으로, 이에 의하여 효모 비히클과 많은 양태에서는 항원을 상기 세포 유형으로 더욱 효과적으로 전달할 수 있다. 본 발명에서 효모 비히클과 표적 세포 유형의 융합은 효모 세포 막 또는 이의 입자가 표적 세포 유형(예, 수지상 세포 또는 마크로파지)의 막과 융합하여 합포체(syncytium)를 형성하는 능력을 의미한다. 본 발명에서 합포체는 세포의 통합에 의해 생산된 다핵의 프로토플라즘(protoplasm) 덩어리를 말한다. (HIV, 인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스 및 아데노바이러스와 같은 면역 결핍 바이러스의 표면 단백질을 포함한) 수많은 바이러스의 표면 단백질 및 (난자와 정자 간의 융합에 관여하는 것과 같은) 다른 융합제(fusogen)가 두 막 간의 (즉, 바이러스와 포유동물의 세포 막 간 또는 포유동물의 세포 막 간) 융합을 효율적으로 만들 수 있다. 예를 들면, 표면에 HIV gp120/gp41이라는 이종성의 항원을 생산하는 효모 비히클은 CD4+ T-림프구와 융합할 수 있다. 그러나 효모 비히클로 표적 부(moiety)의 통합은 일부 상황에서는 바람직할 수 있지만, 필수적이지 않다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 효모 비히클이 수지상 세포(뿐만 아니라 마크로파지와 같은 다른 세포)에 의해 용이하게 획득되는 것을 보여주었다.

효모 비히클은 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 환자에게 직접 투여되거나 먼저 수지상 세포와 같은 담체로 로딩된 조제물을 포함한 본 발명의 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들면 효모 비히클은 동결건조법에 의해 건조시키거나 액체 질소 또는 드라이 아이스에 노출시켜 냉동시킬 수 있다. 효모 비히클을 함유하는 제형은 베이킹 또는 양조 공정에서 사용되는 효모에 행해지는 바와 같이 효모를 케이크 또는 정제로 패킹(packing)하여 제조할 수 있다. 또한, 항원을 수지상 세포로 로딩하거나 다른 유형의 투여 이전에 효모 비히클은 또한 숙주 세포에 의해 용인(tolerated)될 수 있는 등장성 완충용액과 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합할 수 있다. 그러한 부형제의 예에는 물, 식염수, 링거 용액(Ringer's solution), 덱스트로오스 용액, 한스 용액(Hank's solution) 및 다른 수용성의 생리학적 평형 염 용액을 포함한다. 불휘발유, 참기름, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드와 같은 비수용성 비히클이 또한 사용될 수 있다. 다른 유용한 제형은 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨, 글리세롤 또는 덱스트란과 같은 점도 증진제를 포함한 현탁액을 포함한다. 부형제는 또한 등장성 및 화학적 안정성을 개선하는 성분과 같은 첨가제를 미량 포함할 수 있다. 완충제의 예로는 포스페이트 완충제, 비카르보네이트 완충제 및 트리스 완충제가 포함되는 한편, 보존제의 예에는 티메로살, m- 또는 o-크레솔, 포르말린 및 벤질 알코올이 포함된다. 표준 제형은 주입할 수 있는 액체 또는 주입용 현탁액 또는 용액으로서 적합한 액체에 수용될 수 있는 고체일 수 있다. 따라서 비액체 제형에서 부형제는 예를 들면 덱스트로스, 사람 혈청 알부민 및/또는 보존제를 포함할 수 있으며, 투여 전에 여기에 멸균수 또는 식염수가 첨가될 수 있다.

본 발명의 치료학적 조성물 또는 백신의 한 성분은 동물을 백신화하는 적어도 하나의 항원을 포함한다. 상기 조성물 또는 백신은 하나 이상의 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한 하나, 둘, 몇 개, 여러 개 또는 다수개의 항원을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "항원"은 천연적으로 발생하거나 인공적으로 유래된 단백질의 임의의 일부분(펩타이드, 일부 단백질, 전장 단백질), 세포의 조성물(전체 세포, 세균 용해질(lysate) 또는 분쇄된 세포) 또는 유기체(전체 유기체, 용해질 또는 분쇄된 세포) 또는 탄수화물 또는 기타 분자 또는 이들의 단편을 의미하는데, 이 때 상기 항원은 항원 특이적 면역 반응(체액성 및/또는 세포성 면역 반응)을 유도하거나, 상기 항원이 투여된 동물의 세포 및 조직에서 접할 수 있는 동일하거나 유사한 항원에 대한 용인제(toleragen)로서 작용할 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 면역 반응을 촉진하는 것이 바람직한 경우에용어 "항원"은 용어 "면역원(immunogen)"과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 (즉, 면역원성인) 단백질, 펩타이드, 세포 조성물, 유기체 또는 기타 분자를 기술하기 위해 이용되는 것으로서, (예를 들면, 본 발명에 따른 백신에 의해) 동물에 면역원을 투여하면 동물의 조직 내에서 접할 수 있는 동일하거나 유사한 항원에 대한 항원 특이적 면역 반응을 상승시킨다. 따라서 특정 항원에 대하여 동물을 백신화한다는 것은 한 양태에서는 상기 항원의 투여의 결과로서 그 항원에 대한 면역 반응이 유도된다는 것을 의미한다. 백신화는 바람직하게는 보호 또는 치료 효과를 일으키는데, 여기서 항원 (또는 항원의 근원)에 대한 계속된 노출은 동물에서 질병 또는 용태를 감소시키거나 예방하는 상기 항원 (또는 근원)에 대한 면역 반응을 유도한다. 백신의 개념은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 치료학적 조성물의 투여에 의해 유도된 면역 반응은 상기 백신의 투여가 없는 경우와 대비하였을 때 면역 반응의 한 양상(예, 세포성 반응, 체액성 반응, 사이토카인 생산)에서 임의의 검출할 수 있는 변화일 수 있다.

다른 양태로서, 주어진 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것이 바람직한 경우에, 항원은 용인제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용인제는 항원에 대하여 감소되거나 변화된 면역반응, 바람직하게는 상기 용인제 또는 상기 용인제를 발현하거나 제시하는 세포와 접촉하여 반응하는 면역 시스템 세포의 실질적인 무반응, 아네르기(anergy), 기타 비활성 또는 결실이 있도록 하는 형태, 양 또는 투여 경로로 제공된 단백질, 펩타이드, 세포 조성물, 유기체 또는 기타 분자를 기술하기 위해 이용된다.

"백신화 항원(vaccinating antigen)"은 면역원 또는 용인제일 수 있지만, 백신화 항원에 대한 생물학적 반응(면역 반응의 유도, 용인)이 유도되는 백신에서는 항원이 이용될 수 있다.

주어진 항원의 면역원성 도메인은 동물에게 투여되었을 때 면역원으로서 작용하는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 항원의 임의의 부분(즉, 펩타이드 단편 또는 서브유니트)일 수 있다. 예를 들면, 단일 단백질은 다수의 서로 다른 면역원성 도메인을 포함할 수 있다.

에피토프는 면역 반응을 유도하기에 충분한 주어진 항원 내에 있는 단일 면역원성 부위 또는 면역 반응을 억제, 결실 또는 불활성하게 만들기에 충분한 주어진 항원 내에 있는 단일 용인성 부위를 의미한다. 당업자는 T 세포 에피토프는 B 세포 에피토프에 비해 크기 및 조성에서 상이하고 Class I MHC 경로를 통하여 제시된 에피토프와 Class II MHC 경로를 통하여 제시된 에피토프가 상이하다는 것을 알고 있다. 항원은 단일 에피토프만큼 작거나 더 크거나 다수의 에피토프를 포함할 수 있다. 그에 의해 항원의 크기는 약 5-12개의 아미노산(예, 펩타이드) 정도로 작을 수도 있고, 다량체 및 융합 단백질을 포함한 전장 단백질, 키메라 단백질, 전체 세포, 전체 미생물 또는 이의 일부분(예, 전체 세포의 용해질 또는 미생물의 추출물)만큼 클 수도 있다. 또한, 항원은 암세포에 발현되어 있는 탄수화물과 같은 것을 포함하며, 이들은 본 발명에 따른 효모 비히클 또는 조성물로 로딩될 수 있다. 일부 양태에서 (즉, 항원이 효모 비히클에 의해서 재조합 핵산 분자로부터 발현되는 경우에) 항원은 전체 세포 또는 미생물 보다는 단백질, 융합 단백질, 키메라 단백질 또는 이의 단편이다. 바람직한 양태에서, 항원은 종양 항원 또는 감염성 질병 병소의 항원 (즉, 병소 항원)의 그룹으로부터 선택된다. 한 양태에서, 상기 항원은 바이러스의 항원, 과잉 발현된 포유동물의 세포 표면 분자, 박테리아의 항원, 곰팡이의 항원, 프로토조아의 항원, 기생충의 항원, 체외 기생충의 항원, 암 항원, 하나 이상의 돌연변이된 아미노산을 보유한 포유동물의 세포 분자, 포유동물 세포에 의해 출생 전 또는 출생 초기에 정상적으로 발현되는 단백질, 역학적 인자(예, 바이러스)의 삽입에 의해 발현이 유도되는 단백질, 유전자 전위에 의해 발현이 유도되는 단백질 및 조절 서열의 돌연변이에 의해 발현이 유도되는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명에서 당해 조성물 또는 백신에 이용하기 적합한 항원은 동일 항원으로부터 유래된 둘 이상의 면역원성 도메인 또는 에피토프, 동일 세포, 조직 또는 유기체로부터 유래된 둘 이상 항원의 면역원성 도메인 또는 에피토프, 또는 상이한 세포, 조직 또는 유기체로부터 유래된 둘 이상의 상이한 항원, 면역원성 도메인 또는 에피토프일 수 있다. 바람직하게는 항원은 효모 균주에 이종성이다(즉, 유전적 또는 생물학적 조작이 없는 경우에는 효모 균주에 의해 천연적으로 생산되지 않은 단백질이다).

본 발명의 한 양태는 본 발명의 백신에서 항원으로서 이용되는 여러 개의 개선된 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 효모 비히클에서 이종성 단백질의 발현을 안정화시키고/거나 발현된 이종성의 단백질의 해독후 수정을 방지하는 신규 융합 단백질 작제물을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 가장 일반적으로 효모 비히클(예를 들면, 온전한 효모 또는 효모 스페로플라스트에 의해서, 이들은 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 또는 효모 막 추출물 또는 이들의 분획물로 추가로 처리될 수 있다)에 의해 재조합 단백질로서 생산되지만, 본 발명의 한 양태에서 하나 이상의 상기 융합 단백질은 앞서 기술된 바와 같이 효모 비히클로 로딩되거나 효모 비히클과 복합체를 이루거나 혼합되어서, 본 발명에 따른 백신을 형성할 수 있다.

본 발명에서 유용한 융합 작제물은 (a) (전장 항원의 면역원성 도메인 및 에피토프 뿐만 아니라 본 발명에서 언급된 다양한 융합 단백질 및 다수의 항원 작제물을 포함한) 적어도 하나의 항원; 및 (b) 합성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 합성 펩타이드는 바람직하게는 암 항원의 N-말단에 연결된다. 상기 펩타이드는 암 항원에 이종성인 적어도 두 개의 아미노산 잔기로 이루어지되, 상기 펩타이드는 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키고 발현된 융합 단백질의 해독후 수정을 방지한다. 합성 펩타이드와 항원의 N-말단 일부분은 함께 하기 요건을 구비한 융합 단백질을 형성한다: (1) 융합 단백질의 제 1 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이다 (즉, 합성 펩타이드의 첫 번째 아미노산은 메티오닌이다); (2) 융합 단백질의 제 2 위치에 있는 아미노산 잔기는 글리신 또는 프롤린이 아니다 (즉, 합성 펩타이드의 두 번째 아미노산은 글리신 또는 프롤린이 아니다); (3) 융합 단백질의 2-6 위치에 있는 아미노산 잔기는 메티오닌이 아니다 (즉, 합성 펩타이드가 6개의 아미노산 보다 짧은 경우에는 단백질의 2-6 위치에 있는 아미노산은 합성 펩타이드 또는 단백질의 일부분이라는 여부와 관계없이 메티오닌을 포함하지 않는다); (4) 융합 단백질의 2-5 위치에 있는 아미노산은 리신 또는 아르기닌이 아니다 (즉, 합성 펩타이드가 6개의 아미노산 보다 짧은 경우에는 단백질의 2-5 위치에 있는 아미노산은 합성 펩타이드 또는 단백질의 일부분이라는 여부와 관계없이 리신 또는 아르기닌을 포함하지 않는다). 합성 펩타이드는 두개의 아미노산 정도로 짧은 수 있지만, 보다 바람직하게는 (3, 4, 5개의 아미노산을 포함한) 적어도 2-6개의 아미노산이며, 6개의 아미노산 보다 길어서 약 200개의 아미노산까지 연장될 수 있다.

한 양태에서, 상기 펩타이드는 M-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆의 아미노산 서열을 포함하되, M은 메티오닌이며; X₂는 글리신, 프롤린, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이고; X₃는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이며; X₄는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이고; X₅는 메티오닌, 리신 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산이며; X₆은 메티오닌을 제외한 임의의 아미노산이다. 한 양태에서, X₆은 프롤린이다. 효모 세포에서 항원의 발현의 안정성을 개선시키고/거나 효모에서 상기 단백질의 해독 후 수정을 방지하는 예시적인 합성 서열은 서열 M-A-D-E-A-P(서열번호: 1)을 포함한다. 발현 산물의 증대된 안정성 뿐만 아니라 본 발명자들은 이러한 융합 파트너가 작제물 중 백신화 항원에 대한 면역 반응에 부정적인 영향을 미치지 않을 것으로 확신한다. 또한, 합성 융합 펩타이드는 항체와 같은 선별 인자에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 구비하도록 설계될 수 있다.

본 발명에서 "이종성의 아미노산"은 특정한 아미노산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나(즉, 생체 내에서 천연적으로 존재하지 않는), 특정한 아미노산 서열의 기능과 관련이 없거나, 천연적으로 발생하는 서열 중 뉴클레오타이드가 주어진 아미노산 서열이 유래되는 유기체의 표준 코돈 이용(usage)을 사용하여 해독되었다면 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 천연적으로 발생하는 핵산 서열 측면에 위치하는 뉴클레오타이드에 의해 암호화되지 않는 아미노산 서열이다. 따라서 암 항원에 이종성인 적어도 두 개의 아미노산 잔기는 암 항원의 측면에 천연적으로 존재하지 않는 임의의 두 개의 아미노산 잔기이다.

본 발명의 다른 양태는 (a) (전장 항원의 면역원성 도메인 및 에피토프 뿐만 아니라 본 발명에서 언급된 다양한 융합 단백질 및 다수의 항원 작제물을 포함한) 적어도 하나의 항원과 상기 항원이 융합된 (b) 내인성 효모 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 내인성 효모 단백질은 바람직하게는 암 항원의 N-말단에 융합시키고 효모에서 단백질의 발현에 상당히 증대된 안정성을 제공하고/거나 효모 세포에 의한 상기 단백질의 해독후 수정을 방지한다. 또한, 내인성 효모 단백질은 상기 합성 펩타이드처럼 작제물 중 백신화 항원에 대한 면역 반응에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 내인성 항원에 선택적으로 결합하는 항체는 이미 상업적으로 입수하거나 용이하게 생산할 수 있다. 추가로, 단백질을 세포의 특정 위치(예, 분비 경로, 미토콘드리아, 핵)로 배향시키는 것이 바람직한 경우에 상기 작제물은 세포의 기관(machinery)이 그러한 전달 시스템을 최적화시키는 효모 단백질의 내인성 시그널을 이용할 수 있다.

* 상기 내인성 효모 단백질은 임의의 내인성 효모 단백질의 약 2개 내지 약 200개 (또는 최대 22kDa)의 아미노산으로 이루어지되, 상기 효모 단백질은 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화시키거나 발현된 융합 단백질의 해독후 수정을 방지한다. 이러한 양태에서 임의의 적합한 내인성 효모 단백질이 이용될 수 있고, 특히 바람직한 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만, SUC2(효모의 인버타제; 배지 중 탄소원에 따라 달라지지만 동일 프로모터로부터 세포질 및 분비 경로로 단백질을 발현시킬 수 있으므로 우수한 후보자이다); 알파 인자 시그날 리더 서열; SEC7; CPY; 글루코오스가 존재하는 경우에는 발현이 억제되고 세포질에 위치하는 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 PCK1, 포스포글리세로키나제 PGK 및 트리오스 포스페이트 이소머라제 TPI 유전자 생산물; 세포벽에 위치하고 유지되는 Cwp2p; 세포가 열에 노출되자마자 발현되고 열에 보다 열에 안정적인 히트 쇼크 단백질 SSA1, SSA3, SSA4, SSC1 및 KAR2; 미토콘드리아로의 운반에 관여하는 미토콘드리아의 단백질 CYC1; 딸 세포 형성의 초기 단계 동안에 효모 세포의 버드에 위치하는 BUD 유전자; 액틴 다발에 고정된(anchoring) ACT1을 포함한다.

한 양태에서, 내인성 효모 단백질/펩타이드 또는 합성 펩타이드는 융합 단백질의 동정 및 정제를 위한 항체 에피토프를 포함한다. 바람직하게는 융합 파트너에 선택적으로 결합하는 항체가 이용가능하고 생산된다. 본 발명에서 용어 "선택적으로 결합하는" 이란 항체, 항원 결합 단편 또는 본 발명의 결합 파트너가 바람직하게는 특정한 단백질에 결합하는 것을 의미한다. 보다 구체적으로 "선택적으로 결합하는"이란 한 단백질의 다른 단백질(예, 항체, 이의 단편 또는 항원에 대한 결합 파트너)과의 특이적인 결합을 의미하는 것으로서, 임의의 표준 에세이(예, 면역분석법)에 의해 측정되면 상기 결합의 수준은 상기 에세이에 대한 백그라운드(background) 대조군보다 통계학적으로 유의적으로 더 높다. 예를 들면, 면역분석법을 수행하는 경우에 대조군은 일반적으로 항체 또는 항원 결합 단편 단독을 포함하는 (즉, 항원이 없는) 반응 구/관을 포함하며, 이 때 항원이 없는 상태에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의한 반응(예, 구(well)로의 비특이적인 결합)의 정도가 백그라운드로서 고려된다. 결합은 효소 면역분석법(예, ELISA), 면역블라트 에세이 등을 포함한 당업계에 알려진 다양한 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

항체는 면역글로불린 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하며, 이에 의하여 단백질의 면역글로불린 상과(superfamily)의 일원이다. 본 발명에 따른 분리된 항체는 그러한 항체를 함유하는 혈청 또는 다양한 정도까지 정제된 항체를 포함한다. 본 발명의 전체 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 선택적으로 하나 이상의 항체 도메인이 절단되거나 없는 항원 결합 단편과 같은 전체 항체의 기능적 등가물(예, Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab)₂ 단편) 뿐만 아니라 단일쇄 항체, 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 항체(예, 이중 특이적 항체) 또는 둘 이상의 상이한 항원에 결합할 수 있는 항체(예, 이중- 또는 다중 특이적 항체)를 포함한 유전적으로 조작된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 발명에 도입될 수 있다.

일반적으로 항체를 생산하는데 있어서, 예를 들면 이에 제한되는 것은 아니지만, 래비트, 양, 햄스터, 기니아 피그, 마우스, 래트 또는 닭과 같은 적합한 실험 동물을 원하는 항체에 대한 항원에 노출시킨다. 일반적으로 동물은 상기 동물에 주입되는 항원의 효과적인 양으로 면역화된다. 항원의 효과적인 양은 상기 동물에 의해 항체의 생산을 유도하는데 필요한 양을 의미한다. 동물의 면역 시스템은 예정된 시간 이상 반응하도록 유지된다. 면역 과정은 면역 시스템이 항원에 대한 항체를 생산하는 것으로 확인될 때까지 반복될 수 있다. 항원에 특이적인 폴리클로날 항체를 수득하기 위하여 동물로부터 원하는 항체를 포함하는 혈청을 수집한다 (또는 닭의 경우에는 항체가 달걀로부터 수집될 수 있다). 그러한 혈청은 시약으로서 유용하다. 폴리클로날 항체는 예를 들면 혈청을 황산암모늄으로 처리함으로써 혈청 (또는 달걀)으로부터 추가로 정제될 수 있다.

모노클로날 항체는 Kohler 및 Milstein의 방법에 따라 생산될 수 있다(Nature 256:495-497, 1975). 예를 들면, B 림프구를 면역화된 동물의 지라 (또는 임의의 적합한 조직)으로부터 회수한 후 마이엘로마 세포와 융합하여 적합한 배양 배지에서 지속적인 성장을 할 수 있는 하이브리도마 세포군을 수득한다. 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 원하는 항원에 결합하는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 능력을 테스트하여 선별된다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하여 활성화시키거나 억제하도록 설계된, 경우에 따라 결합 파트너로서 언급되는 비항체 폴리펩타이드까지 확장된다. 규정된 리간드 특이성을 보유한 그러한 폴리펩타이드의 설계의 예시가 Beste 등에 의해 제공되며(Proc . Natl . Acad . Sci 96: 1898-1903, 1999), 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 백신의 항원 일부분은 둘 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질로서 생산된다. 한 측면에서, 융합 단백질은 하나 이상의 항원의 둘 이상의 면역원성 도메인 또는 둘 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 융합 단백질은 항원의 둘 이상의 면역원성 도메인, 바람직하게는 다수의 도메인을 포함하는데 상기 다수의 도메인은 천연적으로 상기 항원의 하나 또는 몇 개의 위치에서 일어난 여러 개의 서로 다른 돌연변이 및/또는 돌연변이의 조합을 포함한다. 이는 다양한 환자에서 다양하게 돌연변이되는 것으로 공지된 특정 항원에 대한 백신을 제공할 수 있다는 장점이 있다. 상기 백신은 광범위한 환자에게 항원 특이적 면역을 제공할 것이다. 예를 들면, 본 발명에서 유용한 다수의 도메인 융합 단백질은 다수의 도메인을 가지되, 각각의 도메인은 특정 단백질로부터 유래된 펩타이드로 이루어져 있으며 상기 펩타이드는 그 단백질에 존재하는 돌연변이된 아미노산을 포함하면서 이의 양측에 위치하는 적어도 4개의 아미노산 잔기로 이루어지고 상기 돌연변이는 특정 질병(예, 암)과 연관된다.

Ras는 여러 개의 돌연변이가 특정 위치에서 발생하고 하나 이상의 유형의 암의 발달과 연관되어 있다는 것이 공지된 종양 유전자의 한 예이다. 따라서 특정 암에서 돌연변이되는 것으로 공지된 특정 잔기를 포함하는 펩타이드들로 이루어지되, 그 위치에 존재하는 것으로 공지된 수개 또는 모든 돌연변이를 커버할 수 있도록 각 도메인은 그 위치에 있는 서로 다른 돌연변이를 포함하는 융합 단백질을 작제할 수 있다. 예를 들어 Ras와 관련하여 제 12위치와 이의 양측에 있는 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 면역원성 도메인을 구비할 수 있는데, 여기서 각 도메인은 돌연변이되지 않은 Ras 단백질에 정상적으로 존재하는 글리신과는 상이한 치환체를 갖는다. 예를 들면, 암 항원은 야생형 Ras 단백질에 대하여 제 12, 13, 59 또는 61위치의 아미노산을 포함하는 야생형 Ras 단백질의 적어도 5-9개의 연속된 아미노산 잔기의 단편을 포함한다. 이 때, 야생형 RAS 단백질에 대하여 제 12, 13, 59 또는 61위치의 아미노산 잔기는 돌연변이되었다. 한 측면에서, 융합 단백질 작제물은 다른 돌연변이된 종양 항원과 프레임내에서 융합된 적어도 하나의 펩타이드(예, 야생형 Ras 단백질 서열에 대하여 적어도 하나 의 돌연변이를 포함하는 Ras 단백질)로 이루어지되, 상기 펩타이드는 (a) 서열번호: 3의 적어도 8-16 위치부터 포함하되, 상기 서열번호: 3의 제 12위치의 아미노산 잔기는 서열번호: 3과 비교했을 때 돌연변이된 펩타이드; (b) 서열번호: 3의 적어도 9-17 위치부터 포함하되, 상기 서열번호: 3의 제 13위치의 아미노산 잔기는 서열번호: 3과 비교했을 때 돌연변이된 펩타이드; (c) 서열번호: 3의 적어도 55-63 위치부터 포함하되, 상기 서열번호: 3의 제 59위치의 아미노산 잔기는 서열번호: 3과 비교했을 때 돌연변이된 펩타이드; 및 (d) 서열번호: 3의 적어도 57-65위치부터 포함하되, 상기 서열번호: 3의 제 61위치 아미노산 잔기는 서열번호: 3과 비교했을 때 돌연변이된 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 사람 및 마우스의 서열이 단백질의 상기 위치에서 동일하고, K-Ras, H-Ras 및 N-Ras가 상기 위치에서 동일하기 때문에 상기 위치는 서열번호: 5, 7, 9, 11 또는 13과 상응한다.

상기 전략에 따라 본 발명에서 특히 유용할 수 있는 기타 항원은 당업자에게 자명하며 이에 제한되는 것은 아니지만, 임의의 종양 유전자, (P53으로 알려진) TP53, P73, BRAF, APC, Rb-1, Rb-2, VHL, BRCA1, BRCA2, AR(안드로겐 수용체), Smad4, MDR1 및/또는 Flt-3을 포함한다.

본 발명의 한 양태에서, 본 발명에서 기술된 임의의 아미노산 서열은 특정된 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 각각의 측면에 적어도 하나 내지 적어도 약 20개까지 추가 이종성 아미노산 서열이 위치하도록 제조될 수 있다. 이렇게 형성된 단백질 또는 폴리펩타이드는 특정한 아미노산 서열로 "필수적으로 이루어진"이라고 기술될 수 있다. 본 발명에서 상기 이종성 아미노산 서열은 특정한 아미노산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나(즉, 천연 생체 내에서 발견되지 않는), 특정한 아미노산 서열의 기능과 관련이 없거나, 천연적으로 발생하는 서열에서 그러한 뉴클레오타이드가 주어진 아미노산 서열이 유래되는 유기체의 표준 코돈 이용(usage)을 사용하여 해독되었다면 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 천연적으로 발생하는 핵산 서열 측면에 위치하는 뉴클레오타이드에 의해 암호화되지 않는 아미노산 서열이다. 유사하게, "필수적으로 이루어진"이라는 문구가 본 발명에서 핵산 서열과 관련되어서 사용되면 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'- 말단 각각에 적어도 하나 내지 약 60개까지 추가 이종성 뉴클레오타이드가 측면에 위치하는 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 이종성 뉴클레오타이드는 천연 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나(즉, 천연 생체 내에서 발견되지 않는) 단백질에 어떠한 추가 기능을 부여하거나 특정한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 변화시키는 단백질을 암호화하지 않는다.

본 발명에서 유용한 종양 항원은 종양 세포로부터 유래된 단백질, 당단백질 또는 표면 탄수화물과 같은 종양 항원, 종양 항원으로부터 유래된 에피토프, 전체 종양 세포, 종양 세포의 혼합물 및 이의 일부분(예, 용해질)을 포함할 수 있다. 한 양태로서, 본 발명에서 유용한 종양 항원은 자가의 종양 샘플로부터 분리 또는 유래될 수 있다. 자가 종양 샘플은 치료학적 조성물이 투여될 동물로부터 유래된다. 따라서 그러한 항원은 면역 반응이 유도될 암에 존재할 것이다. 한 측면에서, 백신으로 제공되는 종양 항원은 동일한 조직학적 종양 유형의 적어도 두 개, 바람직하게는 다수의 동종 종양 샘플로부터 분리 또는 유래된다. 본 발명에서 다수의 동종의 종양 샘플은 적어도 주조직적합복합체(MHC) 내 및 일반적으로 다른 유전적 위치에서 유전적으로 상이한 동일한 종의 둘 이상의 동물로부터 분리된, 동일한 조직학적 종양 유형의 종양 샘플이다. 따라서 다수의 종양 항원이 함께 투여된다면, 항원이 유래된 임의의 개체에 존재하는 실질적으로 모든 종양 항원을 대표할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 이러한 양태는 동일한 조직학적 종양 유형의 종양으로부터 유래된 종양 항원을 발현하는 각 환자간의 천연적인 다양성을 보상한 백신을 제공한다. 따라서 이러한 치료학적 조성물의 투여는 다양한 종양 항원에 대한 면역 반응을 유도하기에 효과적이어서 동일 치료학적 조성물이 다양한 서로 다른 개체에게 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 광범위한 백신을 제공하기 위하여 서로 다른 조직학적 종양 유형의 종양에서 유래된 항원이 동물에게 투여될 수 있다.

항원이 분리 및 유래되는 종양은 이에 제한되는 것은 아니지만, 흑색종, 편평세포 암종, 유방암, 두경부 암종, 갑상선 암종, 연조직 육종, 골 육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 맥관 육종, 혈관 육종, 비만 세포 종양, 원발성 간암, 폐암, 췌장암, 위장관암, 신세포 암종, 조혈 신생물 및 이의 전이암을 포함한 임의의 종양 또는 암이다. 본 발명에 따른 백신에서 이용될 수 있는 특정한 암 항원은 이에 제한되는 것은 아니지만 (MAGE3, MAGEA6, MAGEA10을 포함한) MAGE, NY-ESO-1, gp100, 티로시나제, EGF-R, PSA, PMSA, CEA, HER2/neu, Muc-1, hTERT, MART1, TRP-1, TRP-2, BCR-abl 및 p53(TP53), p73, ras, BRAF, APC(선종성 결장 폴립증), myc, VHL(von Hippel's Lindau protein), Rb-1(망막세포종), Rb-2, BRCA1, BRCA2, AR(안드로겐 수용체), Smad4, MDR1, Flt-3의 돌연변이된 종양 유전자의 형태를 포함한다.

본 발명에서, 암 항원은 전술한 임의의 종양 항원 뿐만 아니라 암을 획득할 또는 암으로 발전할 위험과 관련된 임의의 다른 항원 또는 항원에 대한 면역 반응이 암에 대한 치료 효과를 발휘할 수 있는 항원을 포함할 수 있다. 예를 들면, 암 항원은 이에 제한되는 것은 아니지만, 종양 항원, 하나 이상의 돌연변이된 아미노산을 보유한 포유동물의 세포 분자, 포유동물 세포에 의해 출생 전 또는 출생 초기에 정상적으로 발현되는 단백질, 역학적 인자(예, 바이러스)의 삽입에 의해 발현이 유도되는 단백질, 유전자 전위에 의해 발현이 유도되는 단백질 및 조절 서열의 돌연변이에 의해 발현이 유도되는 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 항원 중 일부는 다른 유형의 질병에서 항원(예, 자가면역질환)으로서 작용할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 조성물에 유용한 항원은 병소, 특히 감염성 질병과 연관된(예, 유발하거나 기여하는) 병소로부터 유래된 (전체 병소를 포함한) 항원이다. 감염성 질병의 병소로부터 유래된 항원은 T세포에 의해 인식되는 에피토프를 갖는 항원, B 세포에 의해 인식되는 에피토프를 갖는 항원, 병소에 의해 배타적으로 발현되는 항원 및 병소와 다른 세포에 의해 발현되는 항원을 포함할 수 있다. 병소 항원은 전체 세포와 완전한 병소 유기체 뿐만 아니라 이들의 용해질, 추출물 또는 다른 분획물을 포함할 수 있다. 일부 경우에 항원은 동물에게 본래 병원성이라고 인식되지 않지만 그에 대한 면역화가 바람직한 유기체 또는 그의 일부분을 포함할 수 있다. 항원은 감염성 질병 병소에 존재하는 실질적으로 모든 항원을 대표하는 하나, 둘 또는 다수의 항원을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 동일한 병소 또는 상이한 병소의 둘 이상의 상이한 균주로부터 유래된 항원은 치료 효과 및/또는 백신의 효율을 증가시키는데 이용될 수 있다.

본 발명에서, 병소 항원은 이에 제한되는 것은 아니지만, 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 곰팡이에 의해 발현되는 항원을 포함한다. 본 발명에 따른 방법에서 이용되기 바람직한 병소 항원은 동물에게 만성적인 감염 질병을 유발하는 항원을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명에 따른 방법 또는 조성물에서 이용되는 병소 항원은 바이러스로부터 유래된 항원을 포함한다. 본 발명의 백신에 이용될 수 있는 바이러스 항원의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, env, gag, rev, tar, tat, 뉴클레오캡시드 단백질 및 면역 결핍 바이러스(예, HIV, FIV) 유래의 역전사 효소; HBV 표면 항원 및 코어(core) 항원; HCV 항원; 인플루엔자 뉴클레오캡시드 단백질; 파라 인플루엔자 뉴클레오캡시드 단백질; 사람의 파필로마 유형 16 E6 및 E7 단백질; 엡스타인-바르 바이러스 LMP-1, LMP-2 및 EBNA-2; 헤르페스 LAA 및 당단백질 D; 뿐만 아니라 다른 바이러스 유래의 유사한 단백질을 포함한다. 특히, 본 발명에서 이용되기에 바람직한 항원은 이에 제한되는 것은 아니지만, HIV-1 gag, HIV-1 env, HIV-1 pol, HIV-1 tat, HIV-1 nef, HbsAG, HbcAg, 헤파티티스 c 코어 항원, HPV E6 및 E7, HSV 당단백질 D 및 바실러스 안트라시스 보호 항원을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물(백신)에 포함되기에 다른 바람직한 항원은 예를 들면 알레르겐(allergen), 자가면역질환 항원, 염증성 인자, GVHD, 특정 암에 관여하는 항원, 패혈 쇼크 항원 및 이식 거부 반응에 관여하는 항원에 의해 유발되는 것과 같은 원하지 않은, 즉 해로운 면역 반응을 억제할 수 있는 항원을 포함한다. 그러한 화합물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 항히스타민제, 사이클로스포린, 코르티코스테로이드, FK506, 해로운 면역 반응의 발생과 관련된 T 세포 수용체에 대응되는 펩타이드, Fas 리간드(즉, 세포의 Fas 수용체의 세포외 또는 세포질 도메인에 결합하고 이에 의하여 아폽토시스를 유발할 수 있는 화합물), 용인 또는 아네르기를 발휘할 수 있는 방식으로 제시된 적합한 MHC 복합체, T 세포 수용체 및 자가면역질환 항원을 포함하며, 바람직하게는 세포성 및/또는 체액성 면역을 증진 또는 억제할 수 있는 생물학적 반응 조정자와 조합될 수 있다.

본 발명에서 유용한 다른 항원 및 항원의 조합이 당업자에게는 자명할 것이다. 본 발명은 상술된 바에 의해 항원의 이용을 제한하지 않는다.

본 발명에서 용어 "효모 비히클-항원 복합체" 또는 "효모-항원 복합체"는 효모 비히클과 항원간의 임의의 연관을 기술하기 위해서 이용된다. 그러한 연관은 효모(재조합 효모)에 의한 항원의 발현, 효모로 항원의 도입, 효모로 항원의 물리적 부착, 완충용액 또는 다른 용액 또는 제형 내에서 효모와 항원의 혼합을 포함한다. 이러한 유형의 복합체는 이하 상세히 설명된다.

한 양태에서, 효모 비히클의 제조에 이용되는 효모 세포는 항원을 암호화하는 이종성의 핵산 분자로 형질전환되어 상기 항원은 상기 효모 세포에 의해 발현된다. 그러한 효모는 본 발명에서 재조합 효모 또는 재조합 효모 비히클로서 언급된다. 그 다음 상기 효모 세포는 온전한 세포로서 수지상 세포로 로딩되거나, 살상되거나 효모 스페로플라스트, 사이토플라스트, 고스트 또는 아세포 입자의 형성과 같은 방법에 의해 유도체화되고, 이어서 상기 유도체는 수지상 세포로 로딩될 수 있다. 항원을 발현하는 재조합 스페로플라스를 생산하기 위하여 효모 스페로플라스트는 재조합 핵산 분자로 직접적으로 형질감염될 수 있다(예, 스페로플라스트는 전체 효모로부터 생산되고, 이어서 형질감염된다).

본 발명에서 분리된 핵산 분자 또는 핵산 서열은 그것의 천연 환경으로부터 제거되어진 핵산 분자 또는 서열이다. 그에 따라 "분리된"이란 핵산 분자가 정제된 정도를 필수적으로 반영하지는 않는다. 효모 비히클을 형질감염시키는데 유용한 분리된 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 DNA 또는 RNA의 유도체를 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 본 발명에서 유용한 분리된 핵산 분자는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 이 때, 상기 단편은 본 발명에 따른 조성물에서 유용한 적어도 하나의 에피토프를 포함한다.

본 발명의 효모 비히클로 형질전환된 핵산 분자는 하나 이상의 단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산 분자 서열을 포함할 수 있다. 그러한 핵산 분자는 일부 또는 전체 코딩 영역, 조절 영역 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 효모 균주의 한 장점은 수많은 핵산 분자를 보유할 수 있고 수많은 이종성의 단백질을 생산할 수 있다는 것이다. 본 발명에 따른 효모 비히클에 의해 생산될 바람직한 항원의 개수는 효모 비히클에 의해 적절하게 생산될 수 있는 임의의 항원의 개수이고, 적어도 1개 내지 적어도 약 5개 이상이며 약 2 내지 약 5개의 화합물이 보다 바람직하다.

효모 비히클 내에서 핵산 분자에 의해 암호화된 펩타이드 또는 단백질은 전장 단백질 또는 아미노산이 결실(예, 단백질의 절단된 형태), 삽입, 역위, 치환 및/또는 유도체화되고(예, 아세틸화, 당쇄화, 인산화, 글리세로포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵코(anchor)가 부착된), 상기 변형된 단백질은 천연 단백질과 실질적으로 유사한 생물학적 기능을 발휘하는 (또는 천연 단백질과 비교했을 때 증대되거나 억제된 기능을 발휘하는) 기능적으로 등가의 단백질일 수 있다. 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만 단백질에 대한 직접적인 변형 또는 예를 들면 무작위적 또는 표적 돌연변이를 일으킬 수 있는 전통적 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 변형을 일으키는 기술에 의해 달성될 수 있다. 기능적으로 등가의 단백질은 상기 단백질의 생물학적 활성을 측정하는 에세이를 사용하여 선별될 수 있다.

본 발명에 따른 효모 비히클에서 항원의 발현은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 달성된다. 간단히 설명하면, 적어도 하나의 원하는 항원을 암호화하는 핵산 분자는 숙주 효모 세포로 형질전환되었을 때 상기 핵산 분자의 구성성(constitutive) 또는 조절된 발현이 일어나기 위하여 핵산 분자는 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 방식으로 발현 벡터로 삽입시킨다. 하나 이상의 항원을 암호화하는 핵산 분자는 하나 이상의 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 벡터일 수 있다.

본 발명의 재조합 분자에서 핵산 분자는 전사 조절 서열, 해독 조절 서열, 복제 기원(origin of replication) 및 효모 세포와 양립할 수 있는(compatible) 핵산 분자의 발현을 조절하는 기타 조절 서열과 같은 조절 서열을 포함한 발현 벡터에 작동가능하게 연결된다. 특히, 본 발명의 재조합 분자는 하나 이상의 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 포함한다. 용어 "작동가능하게 연결된" 이란 핵산 분자가 숙주 세포로 형질감염(즉, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염)되었을 때 발현될 수 있는 방식으로 상기 핵산 분자가 전사 조절 서열에 연결된 것을 의미한다.

생산되는 단백질의 양을 조절할 수 있는 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 및 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 프로모터 및 업스트림 활성화 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 서열이다. 임의의 적합한 효모의 프로모터가 본 발명에서 이용될 수 있으며 다양한 그러한 프로모터가 당업계에 알려져 있다. 사카로마이세스 세레비시애에서 발현하시키는데 바람직한 프로모터는 이에 제한되는 것은 아니지만 알코올 탈수소효소 I (ADH1) 또는 II (ADH2), CUP1, 포스포글리세리트 키나제(PGK), 트리오스 포스페이트 이소머라제 (TPI), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GADPH; 또는 트리오스 포스페이트 탈수소효소인 TDH3로서 언급됨), 갈락토키나제(GAL1), 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜-트랜스퍼라제(GAL7), UDP-갈락토오스 에피머라제(GAL10), 사이토크롬 c₁(CYC1), Sec7 단백질(SEC7) 및 산 포스파타제(PHO5)를 암호화하는 유전자의 프로모터를 포함하며, ADH2/GADPH 및 CYC1/GAL10 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터가 보다 바람직하고, 세포내 글루코오스 농도가 낮을 때(예, 약 0.1 내지 0.2%) 유도되는 ADH2/GADPH 프로모터가 더욱더 바람직하다. 마찬가지로 인핸서로 언급되기도 하는 수많은 업스트림 활성화 서열(UAS)이 알려져 있다. 사카로마이세스 세레비시애에서 발현시키는데 바람직한 업스트림 활성화 서열은 이에 제한되는 것은 아니지만 PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 및 GAL10을 암호화하는 유전자의 UAS 뿐만 아니라 GAL4 유전자 산물에 의해 활성화되는 다른 UAS를 포함하며, ADH2 UAS가 특히 바람직하다. ADH2 UAS는 ADR1 유전자 산물에 의해 활성화되므로 이종성의 유전자가 ADH2 UAS에 작동가능하게 연결되었을 때 ADR1 유전자를 과잉발현하는 것이 바람직하다. 사카로마이세스 세레비애에서 발현시키는데 바람직한 전사 종결 서열은 α-인자, GADPH 및 CYC1 유전자의 종결 서열을 포함한다.

메틸트로픽 효모(methyltrophic yeast)에서 유전자를 발현시키는데 바람직한 전사 조절 서열은 알코올 산화효소 및 포르메이트 탈수소효소를 암호화하는 유전자의 전사 조절 영역을 포함한다.

본 발명에 따른 효모 세포로 핵산 분자의 형질감염은 세포로 핵산 분자를 투입시키는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 확산, 능동 운반(active transport), 초음파 처리, 전기천공, 미세 주입, 리포펙션, 흡수 및 프로토플라스트 융합을 포함한다. 형질감염된 핵산 분자는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 효모 염색체로 통합되거나 염색체외 벡터로서 유지되도록 할 수 있다. 그러한 핵산 분자를 보유하는 효모 비히클의 예가 본 발명에서 상세히 설명된다. 상기된 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 및 아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물은 원하는 핵산 분자로 온전한 효모 미생물 또는 효모 스페로플라스트를 형질감염시키고, 항원을 생산한 후 당업계에 공지된 기술을 사용하여 상기 미생물 또는 스페로플라스트를 추가로 조작하여 상기 원하는 항원을 함유하는 사이토플라스트, 고스트 또는 아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물을 생산함으로써 재조합에 의해 생산될 수 있다.

재조합 효모 비히클의 생산 및 상기 효모 비히클에 의한 항원의 발현에 효과적인 조건은 효모 균주가 배양될 수 있는 효과적인 배지를 포함한다. 효과적인 배지는 일반적으로 동화할 수 있는 탄수화물, 질소 및 포스페이트 원 뿐만 아니라 적합한 염, 미네랄, 금속 및 비탄민과 성장 인자와 같은 기타 영양분을 포함하는 수용성의 배지이다. 배지는 복합 영양분을 포함하거나 제한된 최소 배지일 수도 있다. 본 발명의 효모 균주는 이에 제한되는 것은 아니지만, 생물 반응기, 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크, 시험관, 마이크로티터 디쉬 및 페트리 플레이트를 포함한 다양한 용기에서 배양될 수 있다. 배양은 효모 균주에 적합한 온도, pH 및 산소 농도에서 수행한다. 그러한 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymolgy , vol.194, Academic Press, San Diego를 참조).

본 발명의 양태에서, 효모 비히클에서 재조합으로 항원을 발현시키는 것에 선택적으로 효모 비히클은 세포내에 단백질 또는 펩타이드 항원 또는 탄수화물 또는 항원으로 작용하는 다른 분자에 의해 로딩된다. 이어서 세포내에 항원을 보유한 효모 비히클은 환자에게 투여되거나 (상기된 바와 같이) 수지상 세포와 같은 담체로 로딩될 수 있다. 이 때, 펩타이드는 약 30-50개의 아미노산 보다 적은 또는 동등한 아미노산 서열을 포함하는 한편 단백질은 약 30-50개의 아미노산 보다 많은 아미노산 서열을 포함하고 단백질은 다량체일 수도 있다. 항원으로서 유용한 단백질 또는 펩타이드는 T 세포 에피토프만큼 작고(즉, 5개의 아미노산 보다 크고) 다수의 에피토프, 단백질 단편, 전장 단백질, 키메라 단백질 또는 융합 단백질을 포함한 것보다 큰 임의의 적합한 크기일 수도 있다. 펩타이드 및 단백질은 천연적으로 또는 인공 합성적으로 유도체화될 수 있다; 그러한 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만, 당쇄화, 인산화, 아세틸화, 미리스틸화, 프레닐화, 팔미토일화, 아미드화 및/또는 글리세로포스파티딜 이노시톨의 부가를 포함할 수 있다. 펩타이드 및 단백질은 확산, 능동 수송, 리포좀 융합, 전기 천공, 식세포작용, 냉동-해동 사이클 및 초음파처리와 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 본 발명의 효모 비히클로 직접적으로 삽입될 수 있다. 펩타이드, 단백질, 탄수화물 또는 기타 분자에 의해 직접적으로 로딩될 수 있는 효모 비히클은 온전한 효모 뿐만 아니라 생산된 후 수지상 세포로 로딩되기 전에 항원에 의해 로딩될 수 있는 스페로플라스트, 고스트 또는 사이토플라스트를 포함한다. 또한, 온전한 효모가 항원에 의해 로딩되고 그 다음 이로부터 스페로플라스트, 고스트, 사이토플라스트 또는 아세포 입자가 제조될 수 있다. 이러한 양태에서 효모 비히클로 로딩될 수 있는 항원의 수는 적어도 1, 2, 3, 4 내지 정수로 증가하는 수백 또는 수천개의 항원이며, 예를 들면 이는 미생물의 로딩, 포유동물의 종양 세포 또는 이의 일부분의 로딩에 의해 구비될 것이다.

본 발명의 다른 양태에서, 항원은 효모 비히클에 물리적으로 부착된다. 효모 비히클로 항원의 물리적인 부착은 이에 제한되는 것은 아니지만, 항원과 효모 비히클의 외부 표면간의 화학적인 교차연결 또는 예를 들면 항체 또는 다른 결합 파트너를 사용함에 의한 항원과 효모 비히클의 외부 표면간의 생물학적 연결을 포함한 공유 및 비공유 연관 방법을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 화학적 교차연결은 예를 들면 글루타르알데히드 연결, 광친화 라벨링(photoaffinity labelling), 카르보디이미드로 처리, 디설파이드 결합할 수 있는 화학 물질로 처리 및 당업계에 알려진 표준의 다른 교차연결 화학 물질로 처리를 포함한 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 효모 막의 지질 이중층 또는 세포벽 조성물의 전하를 변화시킬 수 있는 화학 물질을 효모 비히클과 접촉시켜 효모의 외부 표면이 특정 전하 특성을 갖는 항원과 융합하거나 결합하도록 할 수도 있다. 항체, 결합 펩타이드, 가용성 수용체 및 기타 리간드와 같은 표적 인자가 융합 단백질로서 항원에 통합되거나 효모 비히클로 항원을 결합시키는 항원과 연관될 수 있다.

또 다른 양태에서, 효모 비히클과 항원은 완충 용액 또는 다른 적합한 제형에서 효모 비히클과 항원을 적절히 혼합함으로써 보다 수동적이고, 비특이적 또는 비공유 결합 메커니즘에 의해 서로 연관된다.

본 발명의 한 양태에서, 효모 비히클과 항원은 수지상 세포 또는 마크로파지와 같은 담체로 세포내 로딩되어 본 발명에 따른 치료학적 조성물 또는 백신을 형성할 수 있다. 상기 두 성분의 로딩이 달성될 수 있는 다양한 형태가 이하 상세히 설명된다. 본 발명에서 용어 "로딩" 및 이의 유도체는 임의의 성분(예, 효모 비히클 및/또는 항원)이 세포(예, 수지상 세포)로 삽입, 도입 또는 유입되는 것을 의미한다. 성분을 세포내로 로딩한다는 것은 세포내 구획(예, 플라즈마 멤브레인을 통하여 최소한으로 사이토플라즘, 파고좀, 리소좀 또는 세포의 다른 세포내의 공간)으로 성분을 삽입 또는 도입하는 것을 의미한다. 성분을 세포로 로딩하는 것은 상기 성분이 세포로 (예, 전기천공에 의해) 유입되도록 하거나 성분이 몇몇 과정에 의해 (예, 식세포 작용) 실질적으로 세포로 유입될 수 있도록 하는 환경에 위치시키는 (예, 세포 근처 또는 세포와 접촉하여) 임의의 기술을 의미한다. 로딩 기술은 이에 제한되는 것은 아니지만, 확산, 능동 수송, 리포좀 융합, 전기 천공, 식세포 작용 및 소음파 처리를 포함한다. 바람직한 양태에서, 효모 비히클 및/또는 항원을 수지상 세포로 로딩하는 수동적 메커니즘이 이용되며, 그러한 수동적 메커니즘은 수지상 세포에 의한 효모 비히클 및/또는 항원의 식세포작용을 포함한다.

본 발명의 한 양태에서 백신 조성물은 생물학적 반응 조정자 화합물 또는 그러한 조정자를 생산할 수 있는 능력(즉, 그러한 조정자를 암호화하는 핵산 분자로 형질전환됨에 의해)을 포함할 수 있지만, 그러한 조정자가 본 발명에 따른 강력한 면역 반응을 달성하는데 필수적이지 않다. 예를 들면, 효모 비히클은 적어도 하나의 항원 및 적어도 하나의 생물학적 반응 조정자 화합물로 형질전환될 수 있다. 생물학적 반응 조정자는 면역 반응을 조정할 수 있는 화합물이다. 특정 생물학적 반응 조정자는 보호적 면역 반응을 촉진하는 반면에 일부는 해로운 면역반응을 억제할 수 있다. 특정 생물학적 반응 조정자는 바람직하게는 세포 매개 면역 반응을 증진시키는 한편 다른 생물학적 반응 조정자는 바람직하게는 체액성 면역 반응을 증진시킨다(즉, 체액성 면역에 비해 증가된 수준의 세포성 면역이 있는 면역 반응을 촉진하거나 또는 그와 반대로 촉진할 수 있다). 면역 반응의 촉진 또는 억제를 측정하고 체액성 면역 반응으로부터 세포성 면역 반응을 구별할 수 있는 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다.

적합한 생물학적 반응 조정자는 사이토카인, 호르몬, 리피드의 유도체, 작은 분자 약물 및 이에 제한되는 것은 아니지만, 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 10(IL-10), 인터루킨 12(IL-12), 인터페론 감마(IFN-gamma), 인슐린 유사 성장 인자 I(IGF-I), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β) 스테로이드, 프로스타글란딘 및 류코트리엔과 같은 다른 성장 조정자를 포함한다. IL-2, IL-12 및/또는 IFN 감마를 생산하는 (즉, 발현하는) 그리고 가능한 분비하는 효모 비히클의 능력은 세포 매개 면역을 증진시키는 한편, IL-4, IL-5 및/또는 IL-10을 발현하고 가능한 분비하는 효모 비히클의 능력은 체액성 면역을 증진시킨다.

본 발명에 따른 효모 비히클은 동물을 질병으로부터 보호할 수 있는 다양한 항원과 연관될 수 있으며, 이러한 능력은 효모 비히클과 항원을 수지상 세포 또는 마크로파지로 로딩하여 본 발명의 백신을 형성함으로써 추가로 증진될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 치료학적 조성물 또는 백신의 이용 방법은 바람직하게는 동물에서 면역 반응을 유도함으로써 상기 동물은 암 또는 감염성 질병을 포함한 면역 반응의 유도로 치료될 수 있는 질병으로부터 보호된다. 본 발명에서 용어 "질병으로부터 보호된"이란 질병의 징후가 감소하는 것; 질병의 발병이 감소하는 것 및/또는 질병의 심도가 감소하는 것을 의미한다. 동물을 보호한다는 것은 본 발명에 따른 치료학적 조성물이 동물에게 투여되었을 때, 질병의 발병을 예방하고/거나 질병의 징후, 신호 또는 원인을 치료하거나 완화시킬 수 있는 능력을 의미할 수 있다. 질병으로부터 동물을 보호한다는 것은 질병의 발병을 예방하고 (예방적 치료 또는 예방 백신) 질병을 보유하거나 질병의 초기 징후를 가진 동물을 치료하는(치료학적 치료 또는 치료학적 백신) 것을 포함한다. 특히, 동물을 질병으로부터 보호한다는 것은 일부 경우에는 과잉반응 또는 해로운 면역 반응을 추가로 억제하는(즉, 감소, 억제 또는 차단) 이로운 또는 보호적 면역 반응을 유도하여 동물에서 면역 반응을 유발함으로써 달성된다. 용어 "질병"은 동물의 정상적인 건강에서의 이탈을 의미하며, 질병 징후가 존재하는 상태 뿐만 아니라 이탈(예, 감염, 유전자 돌연변이, 유전자 결핍 등)이 일어났지만 징후가 아직 드러나지 않은 용태를 포함한다.

보다 자세하게 본 발명의 백신이 본 발명에 따른 방법에 의해 동물에게 투여되었을 때 바람직하게는 질병의 완화(예, 질병의 적어도 하나의 징후 또는 임상 소견의 감소), 질병의 제거, 종양 또는 질병과 관련된 환부의 감소, 종양 또는 질병과 관련된 환부의 제거, 일차 질병의 발병으로부터 야기되는 이차 질병(예, 일차 암으로부터 야기되는 전이 암)의 예방 또는 완화, 질병의 예방 및 질병에 대한 효과기 세포 면역의 촉진을 포함한 결과를 초래한다.

본 발명에 따른 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있는 암은 이에 제한되는 것은 아니지만, 흑색종, 편평세포 암종, 유방암, 두경부 암종, 갑상선 암종, 연조직 육종, 골 육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 맥관 육종, 혈관 육종, 비만 세포 종양, 원발성 간암, 폐암, 췌장암, 위장관암, 신세포 암종, 조혈 신생물 및 이의 전이암을 포함한다. 본 발명에 따른 치료학적 조성물로 처리되는데 특히 바람직한 암은 일차 폐암, 폐장 전이성 암, 일차 뇌암 및 전이성 뇌암을 포함한다. 치료되기에 바람직한 뇌암은 이에 제한되는 것은 아니지만 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme)을 포함한다. 치료되기에 바람직한 폐암은 이에 제한되는 것은 아니지만, 비소세포암종, 소세포암종 및 샘암종을 포함한다. 본 발명의 치료학적 조성물은 악성 및 양성 종양을 포함한 상기 암으로 형성될 수 있는 종양을 치료하기 위하여 동물에서 면역 반응을 유도하는데 유용하다. 바람직하게는 암을 가진 동물의 조직에서 암 항원의 발현은 암의 완화, 암과 관련된 종양의 감소, 암과 관련된 종양의 제거, 전이 암의 예방, 암의 예방 및 암에 대한 효과기 세포 면역의 촉진의 그룹으로부터 선택된 결과를 얻을 수 있다.

본 발명의 하나의 특징적인 장점은 상기 미국출원번호 09/991,363호에 기술된 바와 같이 효모 비히클과 항원의 조합이 추가 애드주번트 없이도 강력한 면역 반응을 유도하고 더 나아가 수지상 세포로 상기 성분들을 로딩함으로써 더욱 증진되기 때문에 애드주번트 또는 담체와 같은 면역강화제와 함께 투여될 필요가 없다는 것이다. 그러나 이러한 특징이 본 발명에 따른 조성물에 면역강화제의 이용을 배제하는 것은 아니다. 그에 따라 한 양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 애드주번트 및/또는 담체를 포함할 수 있다.

애드주번트는 일반적으로 특정 항원에 대한 동물의 면역 반응을 증진시키는 성분이다. 적합한 애드주번트는 이에 제한되는 것은 아니자만 프로인트 애드주번트; 기타 박테리아의 세포벽 성분; 알루미늄계 염; 칼슘계 염; 실리카; 폴리뉴클레오타이드; 유독소; 혈청 단백질; 바이러스의 코트 단백질; 기타 박테리아 유래의 조제물; 감마 인터페론; 헌터 티터맥스 애드주번트 (Hunter's Titermax Adjuvant, CytRx^TM, Inc. Norcross, GA)와 같은 블록 혼성중합체 애드주번트; 리비 애드주번트(Ribi Adjuvant, Ribi ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, MT로부터 상업적으로 입수 가능함); 및 사포닌과 퀴일 A(Quil A, Superfos Biosector A/S, Denmark로부터 상업적으로 입수 가능함)와 같은 유도체를 포함한다.

담체는 일반적으로 치료되는 동물에서 치료학적 조성물의 반감기를 증가시키는 화합물이다. 적합한 담체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 중합체의 제어 방출 제형, 생물분해성 이식물, 리포좀, 오일, 에스테르 및 글리콜을 포함한다.

본 발명의 치료학적 조성물은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 약제학적으로 허용되는 부형제는 본 발명의 방법에서 이용되는 치료학적 조성물을 생체내 또는 생체외 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미한다. 바람직한 약제학적으로 허용되는 부형제는 효모 비히클(또는 효모 비히클을 함유하는 수지상 세포)을 효모 비히클 또는 세포가 신체내 표적 세포, 조직 또는 부위에 도달하자마자(항원과 연관된) 그 표적 부위에서(표적 위치는 전신일 수도 있다) 상기 효모 비히클 또는 (효모 비히클과 항원으로 로딩된) 수지상 세포가 면역 반응을 유도할 수 있는 형태로 보존할 수 있다. 본 발명의 적합한 부형제는 백신을 한 부위로 특정하게 표적화하지 않지만, 운반하는 부형제 또는 방식을 포함한다(또한, 비특이적인 담체로 언급된다). 약제학적으로 허용되는 부형제의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 물, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함된다. 수용성 담체는 예를 들면 화학적 안정성 및 등장성을 증진시킴으로써 수령자의 생리학적 조건에 근접시키는데 요구되는 적합한 보조 성분을 포함할 수 있다.

적합한 보조 성분은 예를 들면, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 소듐 락테이트, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드 및 포스페이트 완충제, 트리스 완충제 및 비카르보네이트 완충제를 생산하는데 이용되는 다른 성분을 포함한다. 보조 성분은 또한, 티머로살, m- 또는 o-크레솔, 포르말린 및 벤졸 알코올과 같은 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명은 동물에게 본 발명의 조성물 또는 백신을 전달하는 것을 포함한다. 투여 과정은 생체외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 생체외 투여는 효모 비히클과 항원이 세포에 로딩되도록 특정 용태중인 환자로부터 제거된 세포(수지상 세포)의 군에 본 발명의 조성물을 투여하고 그 세포를 환자에게 되돌리는 것과 같은 환자의 외부에서 조절 단계의 일부를 수행하는 것을 의미한다. 본 발명의 치료학적 조성물은 임의의 적합한 투여 모드에 의해 환자에게 되될려지거나 환자에게 투여될 수 있다.

효모 비히클과 항원에 의해 로딩된 수지상 세포를 포함하는 백신 또는 조성물의 투여는 전신으로, 점막으로 및/또는 표적 부위에 근접하도록(예, 종양 근처로) 수행될 수 있다. 바람직한 투여의 경로는 예방 또는 치료될 용태의 유형, 사용되는 항원 및/또는 표적 세포 군 또는 조직에 따라 달라지지만, 당업자에게 자명할 것이다. 바람직한 투여 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 결절내(intranodal) 투여, 치관내 투여, 동맥내 투여 (예, 목동맥로), 피하내 투여, 경피 전달, 기관내 투여, 피하내 투여, 관절내 투여, 심실내 투여, 흡입 (예, 에어로졸), 두개골내, 척수강내, 안구내, 귀내(aural), 비강내, 경구, 폐포내 투여, 카케터(cacheter)의 주입 및 조직으로의 직접 주입을 포함한다. 특히 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 피하내, 피내, 결절내, 근육내, 경피, 흡입, 비강내, 경구, 안구내, 관절내, 두개골내 및 척수강내를 포함한다. 비경구 전달은 피내, 근육내, 복강내, 가슴막내, 폐포내, 정맥내, 피하내, 동맥 카케터 및 정맥의 카케터 경로를 포함할 수 있다. 귀내 전달은 이어 드롭(ear drop)을 포함하거나, 비강내 전달은 노즈 드롭(nose drop) 또는 비강내 주입을 포함하거나, 안구내 전달은 아이 드롭(eye drop)을 포함할 수 있다. 에어로졸(흡입) 전달은 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 Stribling et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 189:11277-11281, 1992, 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 예를 들면, 한 양태에서, 본 발명의 조성물 또는 백신은 적합한 흡입 장치 또는 분무기를 이용하는 분무식 전달에 적합한 조성물로 제형화될 수 있다. 구강 전달은 입을 통하여 섭취될 수 있는 고체 및 액체를 포함할 수 있고 점액 면역의 발달과 효모 비히클을 함유하는 조성물은 예를 들면, 구강 전달용 정제 또는 캡슐로서 용이하게 제조될 수 있을 뿐만 아니라 식품 및 음료 생산물로 제형화될 수도 있기 때문에 유용하다. 점액의 면역을 조정하는 다른 투여 경로는 바이러스에 의한 감염, 상피의 암, 면역억제 질환 및 상피 영역에 영향을 미치는 다른 질병의 치료에 유용하다. 그러한 경로는 기관지내, 경피내, 근육내, 비강내, 다른 흡입식, 직장, 피하내, 국소, 경피, 질 및 요도 경로를 포함한다.

보다 바람직한 전달 경로는 조성물 또는 백신을 호흡기 계통으로 전달하는 임의의 경로로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 흡입, 비강내, 기관내와 같은 것을 포함한다. 앞서 설명되고 실시예에 보여지는 바와 같이 본 발명자들은 이러한 투여 경로를 이용한 본 발명에 따른 백신의 투여가 적어도 피하내 전달과 비교했을 때 개선된 결과를 제공하였고 뇌암 및 폐암의 치료에서 특히 효율적임을 보여주었다.

본 발명에서 효과적인 투여 프로토콜 (즉, 효과적인 방식으로 백신 또는 치료학적 조성물을 투여하는 것)은 질병 또는 용태를 가지고 있거나 질병 또는 용태로 발전할 위험을 가진 동물에서 면역 반응을 유도하여 바람직하게는 그 결과로 동물이 상기 질병으로부터 보호되는 적합한 용량 변수 및 투여 모드를 포함한다. 효과적인 용량 변수는 특정 질병과 관련하여 당업예게 공지된 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 그러한 방법은 예를 들면, 생존율, 부작용(즉, 독성) 및 질병의 진행 또는 퇴행의 확인을 포함한다. 암을 치료하는 경우에 본 발명에 따른 치료학적 조성물의 용량 변수의 효과는 반응 속도를 평가함으로써 결정된다. 상기 반응 속도는 부분적인 또는 완전한 경감 반응을 보인 환자 군에서 치료된 환자의 백분율을 의미한다. 경감은 예를 들면, 종양 크기를 측정하거나 조직 샘플 중 암 세포의 존재를 현미경으로 관찰함으로써 결정될 수 있다.

본 발명에서 적절한 단일 용량 크기는 적합한 투여 기간에 걸쳐서 한 차례 이상 투여되었 때 동물에서 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 용량이다. 용량은 치료되는 질병 또는 용태에 따라 달라질 수 있다. 암의 치료에서, 예를 들면 적합한 단일 용량은 치료되는 암이 일차 종양인지 또는 암의 전이된 형태인지에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 동물의 크기 및 투여 경로를 기반으로 투여하기에 적합한 단일 용량 크기를 결정할 수 있다.

본 발명의 치료학적 조성물 또는 백신의 적합한 단일 용량은 적합한 기간에 걸쳐서 한 차례 이상 투여되었을 때 항원 특이적 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 환자의 주어진 세포 유형, 조직 또는 영역으로 효모 비히클과 항원을 효과적으로 제공할 수 있는 용량이다. 예를 들면, 한 양태에서, 본 발명에 따른 효모 비히클의 단일 용량은 조성물이 투여되는 유기체의 체중 1 킬로그램 당 약 1 × 10⁵ 내지 약 5 × 10⁷의 효모 세포 등가물이다. 보다 바람직하게는 본 발명에 따른 효모 비히클의 단일 용량은 용량 당 (즉, 유기체 당) 약 0.1 Y.U. (1 × 10⁶ 세포) 내지 약 100 Y.U.(1 × 10⁹ 세포)이며, 0.1 × 10⁶ 세포의 증가분(즉, 1.1 × 10⁶, 1.2 × 10⁶, 1.3 × 10⁶...)으로 임의의 중간 용량을 포함한다. 이러한 용량의 범위는 마우스, 원숭이, 사람 등을 포함한 임의의 크기의 임의의 유기체에서 효과적으로 이용될 수 있다. 백신이 효모 비히클과 항원이 수지상 세포로 로딩됨으로써 투여되는 경우에 본 발명에 따른 백신의 바람직한 단일 용량은 1회 투여시 개체당 약 0.5 × 10⁶ 내지 약 40 × 10⁶의 수지상 세포이다. 바람직하게는 단일 용량은 개체당 약 1 × 10⁶ 내지 20 × 10⁶의 수지상 세포이고, 보다 바람직하게는 개체당 1 × 10⁶ 내지 10 × 10⁶의 수지상 세포이다. 치료학적 조성물의 "부스터"는 항원에 대한 면역 반응이 불충분하거나 특정 항원에 대한 면역 반응을 제공하거나 기억 반응(memory response)을 유도하는 것이 필요한 경우에 투여된다. 부스터는 최초 투여 후 약 2주 내지 수년에 걸쳐서 투여될 수 있다. 한 양태에서, 투여 스케줄은 유기체의 체중 1kg 당 조성물 중 약 1 ×10⁵ 내지 약 5 × 10⁷의 효모 세포 등가물이 약 1 개월 내지 약 6개월의 기간에 걸쳐서 약 1 회 내지 약 4회 투여되는 것이다.

동물에게 투여되는 용량의 개수는 질병의 정도 및 각 환자의 치료에 대한 반응에 따라 달라진다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 예를 들면, 커다란 종양은 더 작은 종양에 비하여 더 많은 용량을 요구할 것이고 만성적 질병은 급성 질병보다 더 많은 용량을 요구할 것이다. 그러나 일부 경우에 커다란 종양을 가진 환자가 더 작은 종양을 가진 환자보다 치료학적 조성물에 더욱 긍정적으로 반응한다면, 커다란 종양을 가진 환자가 더 작은 종양을 가진 환자보다 더 적은 용량을 요구할 수도 있다. 따라서 본 발명에서 적합한 용량의 개수는 주어진 질병을 치료하는데 요구되는 임의의 개수를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 암과 같은 질병 또는 용태의 치료 방법은 치료의 효과를 증대시키기 위하여 다른 치료학적 접근법과 조합될 수 있다. 예를 들면, 암 치료에서 본 발명에 따른 백신의 투여는 동물로부터 종양을 외과수술로 절개한 후에 수행할 수 있다. 다른 측면에서, 백신의 투여는 동물로부터 종양을 외과수술로 절개한 후 그리고 (후술되는) 동종의 비골수형성 줄기 세포 이식 후에 수행할 수 있다. 또 다른 측면에서, 백신의 투여는 동물로부터 외과수술로 종양을 제거한 후에, 동종의 비골수형성 줄기 세포 이식 후에 그리고 동종의 공여 림프구 주입 후에 수행할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 암을 가진 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, (a) 안정한 혼합된 골수 키메라증을 확립하는데 효과적인 비골수형성 줄기 세포의 전달에 의해 암을 가진 환자를 치료하는 단계, 이 때 줄기 세포는 동종의 공여자가 제공; (b) 동종의 공여자로부터 얻은 림프구를 환자에게 투여하는 단계 및 (c) 단계 (b) 후에 환자에게 효모 비히클 및 적어도 하나의 암 항원을 보유한 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 동종의 비골수형성 줄기 세포 이식을 통하여 안정한 혼합된 골수 키메라증을 확립하는 과정은 Luznik 등 (Blood 101(4):1645-1652, 2003) 및 다른 문헌 (예, Appelbaum et al. 2001, Hematology pp.62-86)에 개시되어 있다. 간단하게 설명하면, 환자는 치명적이지 않고 비골수형성인 전신 방사선 처리 및 면역억제(예, 방사선 처리 및 화학 요법의 조합)로 치료되고 동종의 공여자로부터 유래된 줄기 세포를 함유하는 세포의 군(예, 골수)으로 접종된다. 이러한 치료는 수령 환자에서 안정한 혼합된 골수 키메라증(즉, 공여자 및 숙주 면역 세포 모두가 존재한다)의 확립을 초래할 것이다. Luznik 등의 프로토콜에서 수령자는 공여자의 리프구를 주입받고, 이어서 자가 종양 세포, GM-CSF의 근원 및 조직적합 항원의 근원의 백신을 공급받는다. 이러한 치료는 상당한 수의 실험 동물에서 종양에 대한 장기간의 생존율을 유발하였다.

본 발명은 동종의 비골수형성 줄기 세포 이식과 본 발명에 따른 효모계 백신 전략을 조합함으로써 동종의 비골수형성 줄기 세포 이식과 종양 세포 백신화에 개선을 제공한다. 실시예 5에 예시된 바와 같이 본 발명의 방법은 Luznik 등의 프로토콜만큼 종양을 치료하는데 효과적이지 않았지만, 수령자 유래의 자가 종양 항원을 이용할 필요가 없고 이전 프로토콜에서 제시된 생물학적 반응 조정자 또는 기타 애드주번트(예, GM-CSF 및 조직적합 항원의 근원)를 사용할 필요가 없다. 본 발명의 변형된 방법은 백신 내에 광범위하며 매우 특이적인 항원 선별 및 조합을 이용할 수 있도록 하고 광범위한 암 환자에 백신을 제공할 수 있는 부가적인 장점을 제공하는 반면에 이전 프로토콜은 수령자 유래의 자가 종양 세포를 이용함에 의해 상기 환자에게만 제한적으로 효과적이었다. 본 발명은 수령자에게 투여될 백신과 동일하거나 다소 상이한 항원을 발현하는 본 발명의 효모계 백신으로 줄기 세포 및 림프구의 공여자를 백신화하는 것을 제공한다. 상기 과정은 백신의 효과를 더욱 증대시킬 것으로 기대된다.

본 발명의 이러한 양태에서, 암을 가진 환자를 안정한 혼합된 골수 키메라증을 확립하기에 효과적인 비골수형성 줄기 세포 전달에 의해 치료하는 단계는 당업계에 알려진 바와 같이(예, 상기 Luznik et al.; Appelbaum et al. 2001, Hematology pp.62-86) 수행되는데, 여기서 상기 줄기 세포는 동종의 공여자에 의해 제공된다. 단계 (b)에 따른 동종의 림프구 주입은 당업계에 공지된 울트라페레시스(Ultrapheresis) 기술과 같이 공여자의 말초 혈액으로부터 동종의 림프구를 수집하고 수령 환자로 주입하는 단계를 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 환자들은 앞서 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 효모계 백신으로 투여된다. 이러한 양태의 한 측면에서, 방법은 단계 (a) 이전에 효모 비히클과 적어도 하나의 항원을 포함하는 백신을 공여자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 측면에서, 방법은 단계 (a)를 수행하기 이전에 환자로부터 종양을 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 방법에서 백신 및 치료학적 조성물은 척추물동 부류, 특별한 제한 없이 영장류, 설치류, 가축 및 애완 동물을 포함한 포유동물의에 투여할 수 있다. 가축은 소비되거나 유용한 생산물을 생산하는 동물(예, 울을 생산하는 양)을 포함한다. 보호될 바람직한 포유동물은 사람, 개, 고양이, 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 및 돼지를 포함하며, 사람이 특히 바람직하다. 본 발명에서 "환자"는 본 발명에서 기술된 진단, 예방 또는 치료학적 치료의 대상이 되는 임의의 동물을 기술하는데 사용될 수 있다.

도 1은 효모계 Ras61-VAX 백신이 생체내에 기존재하는 우레탄에 의해 유도된 폐 종양을 제어함을 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 효모계 RasV-VAX 백신이 피하 및 비강내 경로에 의해 투여된 경우에 폐 종양 성장에 대한 특이적 보호를 제공함을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 Gag를 발현하는 효모계 백신이 비강내로 투여된 경우에 두개골내 종양에 대하여 보호적인 반면에 피하내 투여된 경우에는 그렇지 못함을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 EGFR을 발현하는 효모계 백신(EGFR-tm VAX)이 피하내 및 비강내로 투여된 경우에 EGFR을 발현하는 두개골내 종양의 접종에 보호적임을 보여주는 생존율 그래프이다.
도 5는 동종의 비골수형성 줄기 세포 이식과 접합하여 유방 종양 항원을 발현하는 효모계 백신으로의 백신화가 종양 접종에 보호적임을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6은 흑색종 항원을 발현하는 효모계 백신으로의 백신화가 상기 항원을 발현하는 흑색종 종양 접종에 보호적임을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 본 발명의 효모계 백신에 이용되는 다양한 돌연변이된 Ras 융합 단백질의 작제화를 보여주는 개략도이다.

하기 실험 결과는 예시의 목적으로서 제공되는 것일 뿐 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.

실시예 1

다음의 실시예는 생체에서 비소 세포 폐암종(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)의 치료를 위한 암 항원을 포함한 효모계 백신의 처방에 관한 것이다.

RAS 돌연변이는 사람, 쥐, 래트 및 햄스터의 폐질환 샘 종양에서 종종 일어난다. 사실 ras 프로토-종양 유전자류에서 돌연변이는 사람의 암이나 실험동물의 종양에서 종양 유전자 관련 돌연변이 중 가장 흔하다. 본 발명자들은 돌연변이 단백질-특이성 ras 돌연변이를 목표로 제조된 효모계 백신이 쥐의 폐 샘 종양 모델에서 종양 파괴로 이어지는 생산적인 면역반응을 유도하는지의 여부를 시험하였다. 상기 실험의 총괄적인 목표는 이러한 백신이 사람의 폐암을 치료하는데 이용할 수 있다는 것을 뒷받침하는데 있다.

여기서 설명된 본 실험에서 사용한 모델은 AJ 쥐에게 우레탄(에틸 카르바메이트, 이는 추정되는 발암 대사물인 비닐 카르바메이트로 대사된다)을 주입하는 마우스 모델이다. 과형성은 약 6주 후에 관찰되었고 양성 종양은 8 내지 10주 그리고 악성의 초기 신호는 8개월이 경과된 후 관찰되었다. 10개월이 되었을 때 종양은 폐엽 전체를 점유하고 12개월째 쥐는 호흡 곤란으로 사망한다. 본 실험에서 단일 K-ras 돌연변이가 종양 세포에서 발현되었고 이는 제 61 위치의 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈이다(코돈 61이라고도 함).

본 발명자들은 Ras61-VAX(GlobeImmune)를 제조하였고, 이는 효모 균주로서 코돈 61의 돌연변이(서열번호: 5의 K-ras 서열 비교)에 의해 마우스 K-ras 단백질을 발현하도록 설계되었고, 이는 자생적으로 유도된 마우스 폐 종양 및 마우스 폐종양 세포주에서 발현되는 돌연변이 K-ras 단백질이다. 코돈 61 돌연변이를 목표로 한 Ras61-VAX에 의해 면역화된 동물들은 종양의 진행을 방지하는 능력을 갖든가 우레탄 유도 모델에서 유도 후 크기를 감소시키는 능력을 갖는지의 여부에 대해 시험하였다.

그 결과 Ras61-VAX에 의해 면역화된 동물들은 마우스에서 우레탄 노출에 의해 자생적으로 유도된 기존재하는 폐종양에 대한 상당한 보호를 나타냈다. 종양의 수 및 종양의 크기 모두 대조군 동물(도 1 참조)들에 비해 백신화된 동물들에 있어서 감소하였다. 이러한 결과는 돌연변이 K-ras 단백질을 발현하여 암에 의해 발생하는 질환을 치료 및/또는 예방하는 본 발명자들의 효모계 백신이 치료적 개입의 타당성 및 유용성을 보여준다.

그 외에 도 2는 C57BL/6 마우스가 Ras61-VAX(Q61R 단독)의 피하 투여 또는 2개의 돌연변이(RasV-VAX; G12V+Q61R)를 갖는 돌연변이 Ras를 발현하는 효모 백신의 비강내 대 피하 투여의 1일, 8일, 22일 및 36일째 실험결과를 나타낸다. 마우스는 29일째 피하 투여에 의해 10,000개의 CMT64 세포가 접종되었고, CMT64 세포는 내인성으로 아미노산 제 12 위치의 글리신에서 발린(G12V)으로 치환된 돌연변이 K-ras 단백질을 내인성으로 발현한다. 도 2는 59일째(접종 후 30일) 종양의 크기 및 동물의 전체 수에 대한 종양을 가진 동물의 수(막대그래프 상단)를 나타낸다. 도 2에서 볼 수 있듯이 Ras61-VAX의 투여는 폐 종양 성장(동물 7마리 중 2마리는 무종양)에 대해 최소 보호를 제공하였고, RasV-VAX의 투여는 종양 부피 및 수(피하 백신화된 동물 8마리 중 4마리는 무종양이고 비강내 백신화된 동물 8마리 중 7마리는 무종양이다)를 상당히 감소시킴으로써 특이 면역치료적 보호를 제공하였다. 놀랍게도 백신의 비강내 투여가 동일한 백신의 피하 투여에 비해 우수한 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 효모계 백신 제품에 의한 분자 면역 치료의 특이성을 강조하였다. 이러한 연구는 종양 성장의 면역 매개된 거부반응이 관련 돌연변이된 아미노산을 포함한 암 항원을 함유한 효모계 백신의 투여에 의존한다는 요건을 밝혔다.

실시예 2

다음 실시예는 생체에서 뇌 종양을 치료하기 위한 암 항원을 함유한 효모계 백신의 용도를 설명한다.

다음의 실험에서 5마리의 마우스로 구성된 그룹을 Gag 단백질 발현 백신(GI-VAX) 또는 PBS(모의 주입)로 피하 주입 또는 비강내 투여에 의해 2번 면역화(0일째 및 7일째)시켰고 Gag 단백질을 발현하는 종양을 14일째 접종하였다. 2개의 독립적인 연구결과는 비강내 투여에 의해 백신을 수용한 마우스에서 모의 주입된 쥐에 비해 두개골내 종양에 대한 연장된 생존을 나타내었고, 놀랍게도 피하 경로(도 3 참조)에 의해 백신을 수용한 동물보다도 생존이 연장되었다. 피하 면역화는 동물을 피하 종양 접종(결과 미도시)에 대해 보호하지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 방법이 비강내로 투여되었을때 효과적으로 사용할 수 있고, 호흡기 경로에 의한 투여가 두개골내 종양과 같이 타 투여 경로가 없는 경우 효과가 있다는 것을 보여준다.

실시예 3

다음의 실시예는 생체내에서 흑색종 및 뇌 종양을 치료하기 위해 사람 암 항원(표피 성장인자 수용체, EGFR)을 포함한 효모계 백신의 용도를 설명한다.

보호 면역 반응을 일으키기 위한 면역치료적 전략의 능력은 다수의 중요한 변수에 의존한다. 첫째, 상기 백신은 면역체계를 활성화하여 표적 항원을 인식할 수 있도록 하여야 하며, 즉 애드주번트(adjuvant) 활성을 제공하여야 한다. 효모계 백신의 경우 발명자들은 수지상 세포로의 효모의 섭취는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 단백질의 발현을 상향 조절하고, 애드주번트 활성의 특징(Stubbs 등, Nature Med, 7, 625-629,2001)인 사이토카인의 생산을 개시한다는 것을 종전에 보여주었다. 효모에 의한 내재된 면역체계를 활성화시키는 정도는 세균의 세포벽으로부터 유래된 리포폴리사카라이드(LPS)를 이용하여 관찰된 것과 동등하였다. 둘째, 백신은 면역체계에 대한 표적항원의 면역 우세한 에피토프의 표면 존재를 증진하여야 한다. 본 발명자들은 효모계 백신이 면역체계의 세포 매개(CTL)되고 체액(항체) 반응의 자극을 위해 항원성 에피토프의 제공함에 있어서 매우 강력하다는 것을 보여주었다(Stubbs 등, Nature Medicine, 7, 625-629, 2001). 셋째, 그리고 가장 중요하게 면역체계의 자극은 필요로 하는 신체의 부위에서 면역반응을 개시하여야 한다. 아래 나타낸 바와 같이 놀랍게도 백신의 투여 경로가 신체의 다양한 위치에서 발전되는 종양에 대한 면역반응의 효과에 영향을 주는 것으로 나타났다.

EGFR-tm VAX(암 항원으로 EGFR를 발현하는 본 발명의 효모 백신)의 면역원성을 시험하기 위해 접종 실험에서 사용한 신경교종 종양 세포를 변형시켜야 하였다. B16 마우스 흑색종 세포 및 9L 래트 신경교종 종양 세포는 인간 EGFR(각각 B16-E 세포 및 9L-E 세포)를 발현하도록 형질전환되었다. 클로닝된 9L-E 세포주는 그후 높은, 중간 또는 낮은 수준의 hEGFR를 발현하는 세포로 분류하였다. 그러므로 B16-E 세포 및 9L-E 세포는 효모 백신(즉 인간 EGFR)에 포함된 항원을 보유하고, 악성 세포에서 EGFR의 변형된 발현을 나타내는 사람 신경교종에 대한 적절한 대리 모델을 제공한다. 본 연구의 목표는 효모계 공급 비히클이 래트에게 두개골내에 도입된 9L-E 신경교종 세포의 치명적 용량을 투여하였을 때 보호적인 면역성을 개시한다는 것을 보여주는데 있다.

B16-E 세포 및 9L-E 세포는 균일성 있게 클로닝되었고 플로우 사이토메트리에 의해 측정한 바와 같이 인간 EGFR를 발현하였다. 인간 EGFR 단백질의 이종성 발현이 백신을 투여하지 않은 경우 종양의 면역거부로 이어지지 않도록 확실을 기하기 위해 형질전환된 B16-E는 마우스에서 피하 종양을 형성하는지의 여부에 대해 먼저 시험하였다(데이터 미도시). 형질전환된 9L-E 세포는 래트에서 피하 및 두개골 내에 종양을 형성하였다(데이터 미도시). 이제 마우스에서 B16-E 종양의 접종 및 래트에서 9L-E 종양 접종에 대해 동물을 보호하는 EGFR-tm VAX 효모 백신의 효과를 시험할 수 있었다.

예비 백신 접종 연구는 EGFR-tm VAX에 의한 피하 백신접종이 피하 도입된 B16-E 흑색종 종양 세포의 치명적 용량의 접종에 대해 동물을 효과적으로 보호하는 지의 여부를 결정하기 위해 설계되었다. 본 접근방식은 종양 세포의 사멸을 야기하기 위해 효과적인 신규 표적 암 항원의 유용성에 대한 본 발명자들의 표준 척도를 나타낸다. 본 연구는 모의 면역화된 동물(1/6의 동물이 무종양)에 비해 EGFR-tm VAX에 의해 백신접종된 동물들이 B16-E 종양 접종(4/6의 동물은 무종양)에 대해 보호되는 것을 보여주었다(데이터 미도시). 이러한 결과는 EGFR이 야기된 세포 매개된 면역반응에 대해 적절한 항원을 제공하고, EGFR-tm 백신이 종양 접종에 대해 보호적인 면역반응을 개시한다는 것을 확인시킨다. 그러므로 다음 단계는 래트에서 9L-E 신경교종의 두개골 내 접종에 대한 EGFR-tm VAX의 효과를 시험하는 것이었다.

본 발명자들은 상기 실험에서 효모계 백신이 비강내로 투여되는 경우 피하 흑색종 종양 접종에 대해 백신의 피하 면역화와 동등한 보호를 제공한다(데이터 미도시). 그러므로 피하 B16 흑색종 종양 접종에 대해 보호적 면역 반응을 야기한다는 것을 보여주기 위한 효모계 면역치료적 EGFR-VAX 생성물이 두개골 내 종양 접종에 대해 면역치료적 보호를 제공하는지의 여부를 다음의 실험에서 시험하였다.

EGFR-tm VAX의 효과와 투여 경로의 영향은 래트 모델에서 신경교종 종양 세포를 이용한 두개골 내 접종에 의해 추가 시험하였다. 동물(그룹 당 8마리)들은 hEGFR(EGFR-vax)를 발현하는 2000만 효모세포 또는 효모(벡터 단독)를 비강내(i.n.) 또는 피하(s.c.) 경로에 의해 0일, 7일 및 21일째 면역화시켰다. 면역화된 동물들은 형질전환되지 않은 9L 래트 신경교종(9L 단독) 또는 hEGFR를 발현하는 9L 1,250 세포의 두개골 내 투여에 의해 이루어졌다. 래트의 중량은 매일 모니터링하였고 시체중량의 감소는 임박한 동물의 사망 지표였다.

상기 결과(도 4)는 EGFR-VAX 효모에 의해 면역화된 동물의 50%는 암 항원을 발현하는 래트 9L 신경교종을 이용한 치명적 두개골내 종양 접종에 대해 완전히 보호되었으나, 암 항원이 결여된 종양의 성장을 거부하는 동물은 없었다(즉, 항원 특이 면역성을 유도하는 백신). 그 외에 치명적 접종에 의해 질식사한 나머지 EGFR-VAX 면역화된 동물들은 대조군 동물에 비해 연장된 생존기간을 보여주었다.

더 나아가 피하 경로에 비해 비강내로 면역화된 동물의 통계적 유의성 있는 생존의 향상은 흥미를 자아내고 놀라우며, 마우스에서 두개골 내(흑색종) 종양 접종에 대한 보호에 관한 결과(실시예 2 참조)를 재현한 것이다.

이러한 래트 두개골 내 종양 접종 모델이 인간 신경교종을 가장 근접하게 나타내는 것으로 간주되기 때문에 이러한 연구의 긍정적 데이터는 임상 시도로 이동할 수 있는 훌륭한 전 임상 데이터를 제공한다. 추가의 연구는 용량 범위, 일정, 외과 수술적 재 섹션 연구, 9L-E 생존 동물의 9L 종양의 재접종을 포함할 수 있으며 이는 EGFR-vIII 돌연변이 단백질을 발현하는 효모 비히클의 시험뿐만 아니라 9L 신경교종에서 추가(미지)의 암 항원과 관련하여 면역체계가 "학습"되었는지의 여부를 조사하기 위해 이루어질 수 있고, 임상 급의 백신 제품을 제조하기 위한 기초가 될 수 있다.

위에서 설명된 데이터는 말초의 종양을 파괴하기 위해 다수의 면역화 경로가 효과적일 수 있지만 본 발명의 효모계 백신은 폐에 대해 독특한 프라이밍 효과기(priming effector) 세포에 대해 특히 효과가 있다는 것을 보여준다. 효모계 백신이 가장 중요하고 독특한 효과기 세포 전구체일 수 있으므로 비강내 면역화에 의해 활성화된 면역 세포는 두개골 내 종양 성장 과정에 영향을 주는 혈액-뇌 장벽을 통과하는데 특히 효과적일 수 있다. 그러므로 면역화 경로는 뇌 종양에 대한 효과적인 효모계 백신의 설계에 있어서 임계적이고 종전에는 고려되지 않은 요소일 수 있다. 효모계 백신이 다수 경로에 의한 면역화에 대해 지극히 용이하기 때문에 상기 백신은 일부 암을 치료함에 있어서 저평가된 잠재력을 가진 고도의 전문화된 면역반응을 독특하게 야기할 수 있는 것으로 기대를 갖게 한다.

실시예 4

다음의 실시예는 생체 내에서 신장암을 치료하기 위해 암 항원을 포함한 효모계 백신의 용도를 보여준다.

2001년 신장 세포 암(renal cell cancer, RCC)은 미국에서 약 31,800명에 대해 진단되었고 이중 11,600명이 사망하였다; 이는 전체 암의 2 내지 3%이며 종양에 의한 사망자의 2%에 이른다. 비록 환자들이 혈뇨증, 복부 비만 및 고통의 삼중고, 그리고 체중 감량 현상을 전통적으로 나타내지만 임시적 진단의 증가된 빈도로 인하여 상기 증후는 환자들에게 덜 진단되고 있다. 이러한 질환으로 진단된 다수의 환자들은 비록 수술에 의해 잠재적으로 치유 가능하나 세포가 이미 혈관계에 도달하였기 때문에 재발한다. 더 나아가 전이된 RCC의 치료는 극히 제한적이다. 호르몬 및 화학치료적 접근방법은 10% 미만의 응답률과 생존에 있어서 경미한 변화를 보여준다. 그러나 상기 질환의 면역치료의 적용에 대해서는 오래전부터 관심이 있었다. 즉흥적인 퇴행과 같은 드문 경우 외에 α-인터페론 및 인터루킨-2 모두 치료에 대해 정의된 환자의 소수는 "유의적"활성을 나타내었고, 일부는 완전한 차도를 보였다. 비록 전망있어 보이는 무작위 시도는 거의 없었지만 Cytokine Working Group의 최근 연구요약은 피하의 IL-2/α-인터페론에 의한 환자의 응답률에 비해 고용량의 IL-2에 대해 8%의 완전한 응답률과 25%의 총괄 응답률을 보고하였다. 전체적으로 명백히 RCC에 대해 활성을 나타내지만 오늘날까지 사용된 접근방법은 질환에 대한 특이성 및 강도 모두 결여되었다.

RCC의 60% 이상이 VHL에서 비활성화시키는 돌연변이를 내재하고 이는 RCC에 대해 "문지기" 유전자로서 행동하는 것으로 보이고, 콜론(colon) 암에서 APC의 역할과 유사하다. VHL이 암호화하는 단백질은 VHL/elonginCB/Cul-2(VCB)로 알려진 E3 유비퀴틴-라이게이션(SCF) 복합물의 필수 구성요소이며 26S 프로테아솜에 의한 파괴를 위한 특정 단백질을 표적으로 한다. 다수의 VHL 돌연변이가 미스센스(missense) 또는 프레임 이동된 단백질로 이르게 되므로 종양 특이 항원으로 인식되는 신규 에피토프가 생성될 것이다. 다음의 실험은 RCC의 돌연변이 VHL 단백질이 본 발명의 신규한 효모계 백신에 도입된 후 면역반응에 사용될 수 있다는 가설을 시험하였다.

마우스에서는 비교할만한 돌연변이된 VHL 매개된 종양이 없다. 그러므로 본 발명자들은 클로닝된 마우스 VHL(서열번호: 17)뿐만 아니라 공지의 인간 VHL 서열(서열번호: 16)을 사용하여 뮤린 VHL 서열을 암호화하는 발현 작제물을 준비하였고, 이는 야생형 또는 Y98 또는 R167에 영향을 주는 두개의 특이 돌연변이를 보유하였다(서열번호: 17의 뮤린 서열에 대해). 상기 두 위치에서의 돌연변이는 사람 종양에서 종종 발견되는 핫 스팟(hot spot)에 대응된다. 타이로신 98은 HIF1α와 같은 VHL 표적에 대한 표면 노출된 결합 사이트를 형성하는 반면 아르기닌 167은 알파 헬릭스 H1의 안정화를 위해 중요하다. 양 잔기들은 상당히 용매에 노출되고 면역체계 인식에 접근 가능할 것이다. 아래의 BLAST 비교에 나타낸 바와 같이 인간 및 뮤린 VHL 아미노산 서열은 위치 58에서 190까지 거의 일치하고, 상기 2개의 핫 스팟을 포함한다.

그러므로 이러한 뮤린 작제물에 의해 얻은 결과는 사람 RCC에서의 효과성에 대한 합리적이고 정확한 평가를 제공한다. Y98은 종종 히스티딘으로 돌연변이되는 반면 R167은 전형적으로 글루타민 또는 트립토판으로 돌연변이된다. R167 또한 프레임 쉬프트 돌연변이에 의해 영향을 받는다; R167 코돈 내에서 단일 G 잔기의 삽입은 신규한 프레임 이동된 펩타이드(REPSQA)를 생성하고 STOP 코돈(TGA)에 의해 이어질 것이다. 본 발명자들은 Y98에서 히스티딘 미스센스 돌연변이(Y98H) 및 R167에서 프레임쉬프트 돌연변이 모두를 생성함으로써 공지의 VHL 돌연변이의 특징들을 재현한 잠재적으로 면역원성의 돌연변이 VHL 단백질을 제조한다. 프레임 쉬프트된 VHL 단백질은 보다 많은 신규한 에피토프를 발현할 것이고 그리하여 더욱 면역원성일 것이다. 단일 아미노산 변화를 수반하기 때문에 단일 미스센스 Y98H 돌연변이는 본 접근방법의 보다 엄중한 시험일 것이다. 이러한 돌연변이는 사이트 특이성 뮤타제네시스 프로토콜 및 PCR 모두를 사용하여 전장 길이의 mVHL 서열에 도입하였다. 간략하게 설명하면, 상기 R133 돌연변이는 돌연변이 및 프리머츄어 스톱 코돈을 도입하기 위해 특정한 PCR 프라이머를 사용하여 제조하였다. 야생형(WT) VHL 뿐만 아니라 상기 돌연변이체는 효모 발현을 위해 사용한 pYEX-BX의 효모 발현 벡터에 클로닝되었고, 흑색종 세포에서 형질전환 및 발현을 위해 포유동물 발현벡터 pUP로 클로닝되었다. Y64 포인트 돌연변이는 종전에 성과가 좋았던 Clontech 사의 사이트 특이 뮤타제네시스 프로토콜을 사용하여 제조하였다.

상기 삽입물은 효모 발현벡터 pYEX-BX 및 흑색종 세포에서 형질전환 및 발현을 위해 포유동물 발현벡터 pUP로 클로닝되었다. 이를 위하여 본 발명자들은 VHL 단백질을 발현하는 효모를 작제하였고 다양한 백신 제형의 효과를 마우스에 대해 시험하였다. pYEX-BX 플라스미드는 구리 유도성 프로모터를 함유하는데, 이는 S. cerevisiae의 형질전환 후 뮤린 VHL 단백질의 제어된 유도를 허용할 것이다.

구성 요소인 CMV 초기 프로모터의 제어 하에 VHL 유전자를 함유한 발현벡터는 B16 흑색종 세포로 형질전환되었다. 세포주는 생체 외에서 성장하였고 마우스에게 주입하였을 때 종양으로 성장하였는데, 이는 돌연변이된 VHL 작제물이 형질전환된 세포에 대해 자체적으로 면역원성 또는 달리 치명적이지 않다는 것을 확인시켜주었다. 최초의 백신화/종양 접종 실험은 18마리의 6주령 C57B6 마우스로 이루어졌고 이들은 R133 절단된 돌연변이체(VHLtrunc)를 발현하는 효모 20 × 10⁶ 으로 0일째 및 7일째 피하 주입에 의해 면역화시켰다. 14일째 마우스는 피하 주입에 의해 다음과 같이 종양 접종되었다: 마우스 6마리가 형질전환되지 않은 B16 2.5x10⁴ 접종; 마우스 6마리가 VHLwt를 발현하는 B16 2.5 × 10⁴ 접종; 마우스 6마리가 VHLtrunc를 발현하는 B16 2.5 × 10⁴ 접종. 마우스들은 접종 후 21일째 종양 성장 여부를 평가하였다. 상기 실험의 결과를 아래의 표 1에 요약하였다.

면역화	종양 접종	종양 성장 (종양을 가진 마우스의 수)
mVHLtrunc VAX	B16	5/6
mVHLtrunc VAX	B16 VHLwt	5/6
mVHLtrunc VAX	B16 VHLtrunc	0/6

상기 결과는 VHLtrunc 백신(절단 전 독특한 9개의 아미노산 표적화)이 B16 VHL tMut 종양 접종으로부터 보호를 제공하는 반면 상기 백신이 형질전환되지 않은 B16 또는 B16 VHLwt에 의해 접종된 마우스를 보호하지는 않았다. 그러므로 상기 백신화 프로토콜은 강력한 면역반응을 유도하고 이러한 반응은 백신 접종된 동물들의 항원에 대해서만 국한되는 것이다. 그러나 이러한 절단된 돌연변이체가 야생형 VHL의 그것과 큰 서열 차이를 발생시키므로 보다 더 미묘한 돌연변이(즉, 단 하나의 잔기)가 돌연변이체 및 야생형 모두에 면역반응을 일으킬 것이다.

두 번째 면역화/접종 실험(표 2)에서 마우스는 야생형 VHL 백신(mVHLwtVAX) 또는 위에서 설명된 트런케이션된 돌연변이 VHL 백신(mVHLtrunc VAX)에 의해 면역화되었다. 마우스들은 그룹으로 나누어 형질전환되지 않은 B16, 야생형 VHL을 발현하는 B16 또는 돌연변이된 VHL을 발현하는 B16에 의해 첫 실험에서 설명한데로 접종하였다. 결과는 또 다시 절단된 VHL 백신에 의한 면역화가 종양 접종으로부터의 보호에 이르렀고, 마우스들이 야생형 종양에 의한 접종에 대해서는 보호되지 않는 것을 확인하였다. 야생형 종양에 의해 면역화된 마우스는 야생형 종양에 의한 접종에 대해 보호되지 않았고, 이는 백신이 야생형 단백질에 대한 용인 한계를 넘어서지 않는다는 것을 의미한다. 그러나 돌연변이된 VHL 발현 종양을 접종한 경우 야생형 단백질에 의해 면역화된 마우스의 50%는 보호되었고, 이는 돌연변이된 VHL이 뮤린 면역체계에 의해 어느 정도 인식되었다는 것을 의미한다. 이러한 실험에서 효모계 백신의 특이성 및 효과성이 주어진 경우 인간에게서 가장 통상적인 돌연변이를 표적화하는 효모를 생성하는 것은 상대적으로 간단한 일이 될 것이고 인간의 치료 백신으로서의 잠재적 면역화 접근방법의 길을 닦을 것이다.

면역화	종양 접종	종양 성장 (종양을 가진 마우스의 수)
모의	B16 B16 VHLwt B16 VHLtrunc	3/3 3/3 2/3
mVHLwt VAX	B16 B16 VHLwt B16 VHLtrunc	5/6 5/6 3/6
mVHLtrunc VAX	B16 B16 VHLwt B16 VHLtrunc	5/6 4/5 0/6

실시예 5

다음의 실시예는 생체 내에서 유방암을 치료하기 위한 암 항원을 포함한 효모계 백신의 용도를 설명한다.

폐, 유방 및 콜론과 같이 고형 기관의 초기 암의 대부분의 환자들은 주요 종양의 외과 수술적 제거에 의해 치유될 수 있다. 불행하게도 다수의 환자에게 혈류에 의한 전이로 내재 또는 재발하여 극소수의 예외사항을 제외하고는 외과 수술, 방사선요법, 화학요법, 또는 동종간 줄기세포 이식(allogeneic stem cell transplantation, alloSCT)를 포함한 현재 이용 가능한 방식으로는 치유될 수 없다. 유사하게, 비록 최근에 제조된 암 백신은 근래 수립된 질환의 동물 모델에서는 상당한 강도를 나타내지만 일단 종양이 5일 이상 자리 잡았거나 전이가 일어나면 백신은 단독 제제로서는 일반적으로 비효과적이다(Borello 등, 2000, Blood 95:3011-3019). 이는 부분적으로 종양 형성이 암 항원의 용인을 유도하는 것과 전형적으로 관련 있으며 이는 성공적인 치료를 하기 위해서는 파괴를 하여야 한다(Ye 등, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:3916-3920; Staveley-O'Carroll 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1178-1183). 골수형성 alloSCT 후의 백신화는 증분적 향상을 일으켰으나 아직도 3일 이상 된 종양에 대해서는 영향을 못 준다(Anderson 등, 2000, Blood 95:2426-2433). Luznik, supra, 등은 본 발명에 이의 전체 내용이 포함된 것으로 최근에 마우스 유방암 모델에서 안정한 혼합 골수 키메라 현상을 얻는 비 골수형성 이종 줄기세포 이식(nonmyeloablative allogeneic stem cell transplantation, NST) 프로토콜 후의 백신화가 그라프트 대 호스트 질환(graft-versus-host disease, GVHD)을 유도하지 않으면서 주요 종양이 자리 잡은 지 2주 후에 전이를 제거할 수 있는 상당히 증대된 종양 특이 면역 반응을 일으킨다는 것을 보고하였다. 백신화 단독 또는 자기이식 SCT 또는 완전 alloSCT 후의 백신화에 비해 본 전략의 상당히 증대된 효과는 숙주 및 공여자(donor) 면역체계 모두에 대한 작용에 의존하고 혼합된 키메라 현상의 세팅에서 상호작용한다.

Luznik 등의 실험에서 투여된 백신은 방사선 조사된 자기이식 종양 세포와 과립구 마크로파지 집락 자극인자(GM-CSF)가 혼합된 것으로 구성된다. 다음의 실험에서는 본 발명자들은 효모계 백신이 동등한 효과의 결과를 가지며 동일한 동물 모델에서 방사선 조사된 자기이식 종양 세포와 GM-CSF를 생산하는 세포와 혼합된 것의 이용을 대체할 수 있다는 보여줄 것이다. 간략하게 설명하면, 본 발명자들은 CUP1 프로모터(효모 gp70-IT)의 제어 하에 마우스 유방의 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV)의 gp70 단백질을 암호화하는 효모 발현벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 효모를 포함한 효모계 백신을 제조하였다. gp70 단백질은 MMTV에 의해 감염된 Balb/c 마우스에서 일어나는 자생의 유방암에서 발현한다. Luznik 등이 설명한 프로토콜에 따르면 Balb/c 마우스는 0일째 10,000개의 4T1 종양 세포(MMTV gp70을 발현하는 Balb/c 유래된 자생적 유방암 세포)에 의해 피하 주입된다. 피하 종양은 MHC 부합되는 B10.D2 공여자로부터 비 골수형성 이종 줄기세포 이식(NST) 전에 절개되었다. NST는 13일째 200 cGy TBI, 14일째 1000만개의 공여자 골수 세포의 정맥내 주입, 및 17일째 사이클로포스파미드 200mg/kg의 복막내 주입으로 구성되었다. B10.D2 골수를 받은 마우스에게 다음 중 하나를 접종하였다: (a) 추가 처리 없이 28일째 2000만개의 B10.D2 스플레노사이트(무 백신); (b) 28일째 2000만개의 B10.D2 스플레노사이트에 31일째 자기 이식 종양 백신 첨가(10⁶개의 방사선 조사된 4T1 종양 세포를 5 × 10⁵ B78H1/GM-CSF, GM-CSF 분비하는 MHC 음성 바이스탠더 세포주와 혼합), 또는 (c) 28일째 2000만개의 B10.D2 스플레노사이트에 31일째 본 발명에 따른 효모계 gp70-IT 백신 첨가. 도 5에서 명백히 볼 수 있듯이 본 발명의 효모계 백신에 의해 유도된 치명적 종양에 대한 보호는 GM-CSF를 생산하는 자기이식 종양 세포에 의해 유도된 보호와 구분되지 않았다. 본 발명의 효모계 백신 접근방법의 임상적 유용성은 GM-CSF를 생산하는 바이스탠더(bystander) 세포주와 혼합된 환자의 자기이식 종양 세포를 사용한 것에 비해 기꺼이 긍정적으로 평가되어야 하고 이에 국한된 것은 아니지만 보다 넓은 범위의 환자의 응용, 결과의 감소된 다양성, 백신의 항원 설계를 위한 개선된 능력, 향상된 안전성, 백신에 GM-CSF 등과 같은 생물학적 모디파이어(modifier)를 포함시킬 필요가 없다는 것 등의 장점을 포함한다.

실시예 6

다음의 실시예는 생체 내에서 흑색종을 치료하기 위한 암 항원을 포함한 효모계 백신의 용도를 설명한다.

본 발명에서 표 3을 참조하면 5마리의 마우스로 이루어진 5개의 그룹을 사용하였다. 그룹 A에서 마우스는 4주째 PBS 주입 접종하였고 이는 종양 접종 2주 전이며, 종양 접종 후 17일째인 10일째 50 × 10⁶개의 효모계 hMART-1 백신(인간 MART-1을 발현하는 효모 비히클)을 접종하였다. 그룹 B에서 마우스는 4주째 50 × 10⁶개의 효모계 hMART-1 백신을 주입 접종하였고 이는 종양 접종 2주 전이며, 종양 접종 후 10일째 및 17일째 접종하였다. 그룹 C에서 마우스는 4주째 PBS 주입 접종하였고 이는 종양 접종 2주 전이며, 종양 접종 후 추가 투여는 없었다. 그룹 D에서 4주째 50 × 10⁶개의 효모계 hMART-1 백신을 주입 접종하였고 이는 종양 접종 2주 전이며, 종양 접종 후 추가 투여는 없었다. 그룹 E에서 4주째 50 × 10⁶개의 효모계 EGFR 백신(EGFR을 발현하는 효모 비히클)을 주입 접종하였고 이는 종양 접종 2주 전이며, 종양 접종 후 추가 투여는 없었다. 0일째 모든 마우스는 피하로 제공된 D16 흑색종 세포의 종양 접종을 받았다. 그룹 A 내지 D의 마우스는 50,000개의 D16 흑색종 세포가 접종되었고, 이는 내인성 마우스 MART-1(세포들은 인간 MART-1에 의해 형질전환되지 않음)를 발현하였고 그룹 E의 마우스는 EGFR로 형질감염된 50,000개의 D16 흑색종 세포에 의해 접종되었다.

hMART 백신화

	-4주	-2주	0	10일	17일
A(5)	PBS	PBS	50K B16	2-8 OD	2-8 OD
B(5)	2OD	2OD	50K B16	2OD	2OD
C(5)	PBS	PBS	50K B16
D(5)	2OD	2OD	50K B16
E(5)	2OD EGFR	2OD EGFR	25-50K B16/EGFR

결과는 도 2에 나타냈다. 그룹 B(종양 접종 전후 모두 면역화) 및 D(종양 접종 전 면역화)의 마우스는 종양 부하의 유의적 감소를 나타냈고, 종간에도 흑색종 종양에 대해 흑색종 항원을 발현하는 효모 백신이 효과적임을 보여주었다.

실시예 7

다음의 실시예는 본 발명의 효모 비히클에서 발현을 위한 융합 단백질의 작제를 보여주며, 이때 융합 단백질은 동일한 항원의 다수의 면역원성 도메인과 다수의 돌연변이체를 포함한다.

Ras 패밀리 멤버의 다수에 대해 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 공지되어 있다. 서열번호: 2는 인간 K-ras를 암호화하는 핵산 서열(또는 GenBank Accession No. NM_033360으로 공지)이다. 서열번호: 2는 인간 K-ras를 암호화하고 여기서 서열번호: 3으로 대표된다. 서열번호: 4는 뮤린 K-ras를 암호화하는 핵산서열(또는 GenBank Accession No. NM_021284로 공지)이다. 서열번호: 4는 뮤린 K-ras를 암호화하고 여기서 서열번호: 5로 대표된다. 서열번호: 6은 인간 H-ras를 암호화하는 핵산서열(또는 GenBank Accession No. NM_005343으로 공지)이다. 서열번호: 6은 인간 H-ras를 암호화하고 서열번호: 7로 대표된다. 서열번호: 8은 뮤린 H-ras를 암호화하는 핵산서열(또는 GenBank Accession No. NM_008284로 공지)이다. 서열번호: 8은 뮤린 H-ras를 암호화하며 여기서 서열번호: 9로 대표된다. 서열번호: 10은 인간 N-ras를 암호화하는 핵산서열(또는 GenBank Accession No. NM_002524로 공지)이다. 서열번호: 10은 인간 N-ras를 암호화하고 여기서 서열번호: 11로 대표된다. 서열번호: 12는 뮤린 N-ras를 암호화하는 핵산서열(또는 GenBank Accession No. NM_010937로 공지)이다. 서열번호: 12는 인간 N-ras를 암호화하고 여기서 서열번호: 13으로 대표된다.

도 7은 본 발명의 효모계 백신으로 사용하기 위한 다수의 항원성/면역원성 도메인을 포함하는 융합단백질의 예를 예시한 도면이다. 이러한 예시적 융합 작제물에서 K-Ras 단백질(서열번호: 3의 3-165 위치)의 아미노산 3-165 위치가 사용되었고 이는 N-Ras 및 H-Ras에서도 동등한 아미노산(즉 N-Ras 또는 H-Ras의 3-165 위치를 사용할 경우 동일한 결과에 도달한다)이다. 상기 서열은 그 후 제 12 위치에서 일반적으로 발견되는 글리신(각각 GI-1014, GI-4015 및 GI-4016 참조)을 발린, 시스테인 또는 아스파르트 산 잔기에 의해 치환하여 돌연변이시켰다. 그리고 제 61 위치에서 이 위치에 일반적으로 발션되는 글루탐산을 아르기닌으로 치환시켰다. 두 번째 서열이 상기 서열에 융합(추가)되었다. 상기 두 번째 서열은 서열번호: 3의 K-ras 걸치는 아미노산 56-69 위치의 도메인으로서 제 61 위치에서 일반적으로 나타나는 글루탐산을 로이신으로 치환한 돌연변이를 포함한다. 비록 상기 첫 세 서열이 더 긴 서열의 N 말단에 융합된 Q61L을 나타내지만 다른 작제물들은 도메인의 순서를 거꾸로 하여 제조하였다. GI-1014를 암호화하는 작제물에 대한 뉴클레오타이드 및 해독된 아미노산 서열은 각각 서열번호: 14 및 15로 대표된다.

도 7은 다수 항원 Ras 융합 백신(GI-4018)을 나타낸 것으로 위에서 설명한 제 12 위치의 모든 세 돌연변이를 함유하고 위에서 설명한 제 61 위치의 양자 모두의 돌연변이를 함유한다. 융합 단백질은 다음과 같이 작제되었다. 서열번호: 1을 포함하는 합성 서열은 다양한 Ras 돌연변이를 포함하는 4개의 폴리펩타이드에 의해 이어진다. 첫 4개는 도 7에 나타내었고 K-ras의 N 말단의 3-30 잔기(서열번호: 3)를 포함하고 이때 서열번호: 3에 대해 제 12 위치의 아미노산 잔기는 이 위치에서 자연적으로 발견되는 글리신 대신 발린으로 치환되었다. 4개 도메인의 둘째는 서열번호: 3의 아미노산 잔기 3-39를 포함하고, 이때 서열번호: 3에 대해 제 12 위치의 아미노산 잔기는 이 위치에서 자연적으로 발견되는 글리신 대신 시스테인으로 치환하였다. 4개 도메인의 셋째는 서열번호: 3의 아미노산 3-165 위치로 구성되었고 이는 제 12 위치에서 자연적으로 발견되는 글리신 대신 아스파르트산으로의 치환 및 제 61 위치에서 자연적으로 발견되는 글루탐산 대신 아르기닌으로 치환된 것을 함유한다. 4개 도메인의 넷째는 서열번호: 3의 K-ras 걸치는 아미노산 56-69 위치로부터의 도메인으로서 제 61 위치에서 일반적으로 발견되는 글루탐산을 로이신으로 치환한 돌연변이체를 포함한다. 도 7에 이러한 순서로 도메인이 묘사되었지만 도메인의 순서는 원하는 바에 따라 재조정할 수 있다는 것은 자명하다.

상기 실시예는 얼마나 항원 작제물이 유용하게 본 발명에서 작제될 수 있는 지 단지 설명하기 위한 것이다. 상이한 항원으로부터 도메인, 동일한 항원으로부터 다수의 도메인 또는 상이한 돌연변이를 갖는 반복 도메인을 사용하는 유사한 전략은 다른 항원에 대해서도 사용될 수 있다. 이러한 유형의 작제물은 여러 상이한 돌연변이 및/또는 천연에서 항원의 단일 위치에서 발견될 수 있는 돌연변이의 조합을 단일 백신 작제물에 포괄되도록 하는 것이 바람직할 때 특히 유용하다.

본 발명에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체로서 본 발명에 포함된다.

본 발명의 다양한 실시예가 상세히 기술되어 있지만 당업계에서 본 실시예의 변형 및 응용이 가능함은 명백하다. 그러나 상기 그러한 변형 및 응용은 이하의 청구항에 기재된 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 명백히 이해되어야 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (23)

1. a) 전체 효모; 및
   b) ras 유전자에 의해 암호화되는 돌연변이 단백질, 야생형 또는 돌연변이 EGF-R, 돌연변이 VHL, 또는 MART-1으로부터 선택되는, 상기 효모에 의해 발현되는 하나 이상의 암 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함하는,
   흑색종, 편평세포 암종, 유방암, 두경부 암종, 갑상선 암종, 연조직 육종, 골 육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 맥관 육종, 혈관 육종, 비만 세포 종양, 원발성 간암, 폐암, 췌장암, 위장관암, 신세포 암종, 조혈 신생물, 및 이들의 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 가지는 동물에서, 상기 암의 성장, 암의 체적, 또는 암 존재량(cancer burden)을 감소시키거나, 또는 생존율을 증가시키기 위한 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 암은 폐암, 뇌암, 신장암, 유방암, 흑색종, 및 이들의 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암 항원은 ras 유전자에 의해 암호화되는 돌연변이 단백질인 치료용 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암 항원은 야생형 또는 돌연변이 EGF-R인 치료용 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암 항원은 MART-1인 치료용 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암 항원은 돌연변이 VHL인 치료용 조성물.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전체 효모는 사멸된 전체 효모인 치료용 조성물.
13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전체 효모는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)에서 유래된 치료용 조성물.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사이토카인, 호르몬, 리피드의 유도체, 작은 분자 약물, 및 성장 조절자로 구성되는 군으로부터 선택되는 생물학적 반응 조절자(biological response modifier)를 더 포함하는 치료용 조성물.
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