CN1280011A - 双表达单元生产乙肝病毒疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程生产疫苗技术领域,将两个相同的乙型肝炎病毒表面抗原基因表达单元克隆在一个DNA表达载体上,然后整合到酵母菌染色体上,提高了重组酵母菌的表达效率。采用单纯筛选慢速型甲醇代谢克隆的方法筛选乙型肝炎病毒表面抗原菌株。

Description

双表达单元生产乙肝病毒疫苗的方法

本发明属于基因工程生产疫苗技术领域，基因重组技术已被广范应用于医学及生物技术的研究及生物制药业中。一些利用微生物表达的蛋白已应用于病症的治疗及预防，乙肝病毒表面抗原疫苗就是其中之一。

乙型肝火是目前人类最重要的传染性病症之一，它可引起慢型活动性肝炎，肝硬化和原发性肝癌。目前尚无有效的治疗手段，预防接种可以有效的防止乙肝病毒的传染，最终达到控制疾病的目的。

乙肝病毒在世界范围内分布极广，但有明显的地区差异。高发区内有8％到15％的病毒携带者，其中感染率约占60％，主要包括亚洲，南美洲亚玛逊河流域地区及太平洋的诸多岛国。中等发病区有2％到7％的病毒携带者，其中感染率约占20％到60％不等，主要分布于欧洲的东南部，前苏联，中亚，日本及南美洲。低发区的病毒携带者低于2％，其中有大约20％的感染率，主要是一些发达国家，如北美，西欧，澳洲及南美洲的南部。另外，根据联合国卫生组织1991年的报告，全球每年有一亿四千五百万的新生儿中约九百九十万的新生儿将成为乙肝病毒的携带者，其中一百八十万预计以后将死于乙肝感染后的并发症。如果免疫接种所有的新生儿，九百九十万受乙肝病毒威胁的新生儿中，七百五十万可免被感染。

根据不同的地理分布，乙型肝炎病毒壳蛋白上的标致也不同。研究证明不同地区来源的乙肝病毒壳蛋白上都具有相同的表面抗原，即在它的139-147位上的氨基酸有相同的序列。(表面抗原又称“a”抗原，它存在于乙肝病毒的壳蛋白上，是引起机体产生保护性抗体的主要抗原)，此外，还根据乙肝病毒表面抗原蛋白第122，127和160位的氨基酸的不同而将乙肝病毒分为不同的亚型。adw2型乙肝病毒主要分布于中国人居住的地区，如中国，印度尼西亚和东亚地区。因此，adw2型病毒又称为中国亚型病毒。病毒亚型可通过单克隆抗体或核苷酸的序列分析而得知。

乙肝病毒不能感染培养的细胞。感染的人及灵长类动物是制备疫苗的唯一来源，乙肝表面抗原最初即是从感染病人的血浆中提纯的，并广范的应用于临床及实验动物的免疫研究。但从血浆分离乙肝表面抗原疫苗有很大的局限性，很难制备成高浓度，能够在大范围内使用的免疫疫苗。此外，这种方法还受到血浆来源和成本太高的限制。

本发明的目的是利用基因重组的方法生产一种更适合于中国人群的乙肝病毒表面抗原疫苗，寻找比目前表达水平更高的乙肝表面抗原基因重组酵母菌菌株。为此，我们新构建了一种DNA结构，即在一个DNA表达载体上带有两个相同的乙肝表面抗原基因表达单元。然后将它们整合子酵母菌的染色体上，提高了表达效率。

目前寻找有表达的菌株，一般先从成千上万个转染有外源性DNA的克隆中挑选出有表达的阳性克隆，然后再从这些阳性克隆中找出相对高表达的菌株。这种方法费时费工，要挑选到一个有较高产量的菌株需要筛选上百个克隆。为了迅速挑选到高产菌株，我们应用新方法减少需挑选的克隆，大大提高了工作效率及成功率。

本发明的技术方案是：将经PCR放大的adw2亚型乙肝病毒表面抗原基因克隆至DNA载体中带有分泌信号肽基因的强促进子的后方，并将两个表达单元联结在一起。酶切打开DNA的载体环，电击转染DNA入酵母菌，带有双表达单元的DNA载体将通过同源基因杂交的方式整合到酵母菌的染色体上。在含有甲醇的固体培养基上，挑选慢速生长的克隆进行培养，检测是否有乙肝表面抗原蛋白的表达。

1．分离乙肝病毒DNA：

取100微升感染有乙型肝炎病毒病人的血清，加15微升的十倍的蛋白激酶缓冲液和10微升浓度为每毫升10毫克的蛋白激酶，调整最终容积为150微升。50'C水浴2小时，加5倍体积的Qiagene PCR纯化溶液(PB)，转移全部液体入Qiagene的离子交换柱，12000转／分离心1分钟，分离PCR产物和小片断的引物；加入750微升的Qiagene PCR纯化溶液(PB)，12000转／分离心1分钟，洗涤结合在离子交换柱上的PCR产物。继续12000转／分离心1分钟去除剩余柱内的液体，加50微升10mM Tris-HCI，PH8．50，12000转／分离心，洗脱结合在柱上的DNA，储存DNA于-20℃。

十倍蛋白激酶的配方：5毫升1 M Tris-HCI，PH8．0，20毫升0．5 M EDTAPH8．0，25毫升10％SDS，最终容积为50毫升。

2．PCR放大乙肝病毒表面抗原基因：套式PCR被用来放大乙肝病毒表面抗原基因，第一组的5‘端引物为：5’CATCCAATACCACATCATCCA及3’端引物为5’CCCCCAATACCACATCATCCA；第二组引物分别在上游的5’末端及下游引物的3’末端各增加了一个EcoRI酶切点，以下为5’端引物5’AATGGAATTCGAGAACATCACATCAGGATTC及3‘端引物5’TAGGCGAATTCTTATTAAATGTATACCCAGAGAC。

放大的PCR产物经序列分析后证明是中国亚型(adw2)乙肝病毒表面抗原基因，下面是它的DNA核苷酸序列：1   ATG GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTG CTC GTG15  TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC ACA ATA29  CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTA43  GGG GGA TCT CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC CCA57  ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCC TGT CCT CCA ATT TGT CCT71  GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC ATA TTC CTC85  TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TTA TTG GTT CTT CTG99  GAT TAT CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA113 TCA ACA ACA ACC AGT ACG GGA CCA TGC AAA ACC TGC ACG ACT127 CCT GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCA TGT TGC TGT ACA141 AAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCG155 TCC TGG GCT TTC GCA AAA TAC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GTC169 CGT TTC TCT TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG183 TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT TCA GCT ATA TGG197 ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC GTG AGT211 CCC TTT ATA CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT CTC TGG GTA225 TAC ATT TAA

从上面的乙肝病毒表面抗原基因的DNA核苷酸序列可看出，从139位到147位(底部细线所表)为所有乙肝病毒表面抗原具有的“a”抗原决定簇，即激发人体产生保护性抗体的主要抗原。122位(黑粗体字母及黑粗线下标)为精氨酸，它决定了中国亚型病毒adw2中的d，127位的脯氨酸(黑粗斜体字母及黑粗线下标)它决定了中国亚型病毒adw2中的w2。因此，通过PCR放大的乙肝病毒表面抗原基因证明是中国亚型adw2。

3．克隆PCR产物在PYEV表达质粒载体上：

PYEV(yeast expression vector，原名为PHIL-S1，购自美国的Invitrogen生物公司，由以下部分组成：有一甲醇化酶促进子；PH01分泌信号肽；用于可整合到酵母菌染色体上的，具同源基因的部分甲醇化酶基因；组氨酸基因；氨卞青酶素抗性基因；在大肠杆菌中可繁殖的复制区)。表达质粒载体是一种能在大肠肝菌中增殖的载体，它利用了甲醇氧化代谢酶基因的强起动子和促进子表达外源性基因，在其起动子的后方连结有一个能帮助表达的蛋白分泌出细胞的信号肽基因，外源性基因联接于信号肽的后方。甲醇氧化代谢酶基因的表达有赖于甲醇的诱导物。除此外，DNA载体还含有组氨酸合成酶基因，这个基因是一个选择性的标致基因，用于选择那些整合有外源性基因的重组克隆。当该基因被转染后，没有整合有该基因的酵母菌细胞成为组氨酸合成酶缺陷细胞，在缺乏组氨酸的培养基的条件下，不能形成克隆。而整合有外源性基因的重组克隆，可在无组氨酸的培养基上形成肉眼可见的克隆，将PCR放大的乙肝表面抗原基因DNA用EcoRI酶消化，37℃下孵浴12小时，然后连接到EcoRI酶消化的PYEV质粒上，筛选到5’→3’方向的克隆得到含有乙肝表面抗原基因的PYEV质粒，将它命名为PYEV-HBS1见附图1。

4．制备具有两个表达单元的表达DNA载体：

在大肠肝菌中扩增PYEV-HBS1质粒，用BglⅡ和BamHⅠ切下含有BglⅡ-5’AOX1-HBSgene-EcoRⅠ的表达单元的DNA片断，将此表达单元的DNA片断克隆至用BamHⅠ切割的PYEV-HBS1质粒，筛选克隆具有5’→3’方向的PYEV-HBS2质粒，这时完成了具有两个表达单元的DNA质粒的制备，见附图2。

5．筛选慢速甲醇代谢的重组酵母菌：

用于制备重组的酵母菌是一种组氨酸代谢缺陷型的菌株，同时它也是一种筛选的标致。在此酵母菌中，存在两种不同的甲醇氧化代谢酶，一种是快速甲醇氧化代谢酶，另一种是慢速甲醇氧化代谢酶。甲醇是菌株唯一可利用的碳源，如果用BglⅡ切开PYEV-HBS2质粒，打开质粒中的5’-AOX1端及3’AOX1端可和菌株染色体上的快速或慢速甲醇氧化代谢酶基因发生同源重组。整合到染色体上的外源性基因永久不会脱落，组氨酸代谢缺陷型的菌株由于有了外源性组氨酸合成酶基因的替代，能生长在没有组氨酸的培养基上。如外源性基因整合于快速甲醇氧化代谢酶基因上，将灭活该基因，而只保留了有活性的慢速甲醇氧化代谢酶基因。该酶在甲醇培养基上只能缓慢的代谢甲醇，提供碳源，使含有这种酶的细胞需4至5天内才可形成肉眼可见的克隆。

电击转染用BglⅡ酵切的PYEV-HBS2 DNA入酵母菌的方法：

A．无离子酵母菌的准备：接种5微升的酵母菌菌株于含5毫升的YPD(1％yeast extract，2％peptone，2％dextrose)培养液于50毫升的三角瓶中，置30℃，250次／分摇床中培养过夜。取0．5毫升培养液接种于含500毫升的YPD的2升三角瓶中，30℃摇床中250次／分培养过夜。离1500×g离心5分钟收集细胞，弃上清，用250毫升无离子4度水洗三次，保存于-80℃一个月。

B．电击转染DNA：取80微升无离子水洗的细胞，加入20微克的BglⅡ切开PYEV-HBS2 DNA，混合加入电击盒，冰浴5分钟。设定Bio-Rad电击仪于1500伏，阻抗200欧，加入冷的sorbitol 1毫升，立即电击。将电击后的细胞平铺于MM培养皿上。(MM培养皿：1．34％YNB，4×10^-5％biotin，1％甲醇)。

C．筛选慢速甲醇代谢的克隆：

电击转染后的酵母菌平铺于不含组氨酸的1％甲醇固体培养基上，只有含整合有外源性组氨酸合成酶基因(HIS4)的酵母菌才可在该培养基上通过自行合成组氨酸而生长。因此，所有在培养基上所见的克隆属于已整合在外源性组氨酸合成酶基因的细胞，一个平板可形成上千个克隆。如同源杂交整合发生于快速甲醇氧化代谢酶的部位，快速甲醇氧化代谢酶将被取代，细胞仅存慢速甲醇氧化代谢酶，克隆将于4-5天内形成，我们估计在4-5天内形的那些克隆中有可能找到高效率表达乙肝表面抗原的高产菌株。而同源杂交整合发生于慢速甲醇氧化代谢酶的部位，细胞仅存快速甲醇氧化代谢酶，因此在1-2天形成可见的克隆，不易找到高产的菌株。具体发生机理为两端带有甲醇代谢酶基因的外源性质粒DNA可通过同源杂交和酵母菌染色体上的甲醇代谢酶基因结合，整合到染色体上。从而使两个乙肝病毒表面抗基因表达单元永久性地整合到酵母菌的染色体上。

6．检测挑选的克隆是否为表达乙肝表面抗原的阳性克隆：

取30个慢速甲醇代谢的克隆，接种于25毫升的YPD培养液中，在28℃摇床中培养一夜，收集细胞，分离酵母菌染色体DNA，利用两对引，5’端的引物设计在5’AOX1的基因上(CGACTGGTTCCAAATTGACAAGCT)，3’端的引物设计在3’端的乙肝表面抗原基因上，(CCTGAGACAAAAGAAAATTGGTAA)经过PCR放大的700个核苷酸长的DNA片断是整合于染色体上的乙肝病毒表面抗原基因。结果发现所有30个克隆均有乙肝表面抗原基因的整合。下一步是在这30个克隆中筛选高效表达的克隆。

分别接种30个慢速甲醇代谢克隆的细胞于含有MGY培养液的25毫升的三角烧瓶中，培养2-3天至OD值达0．2-0．3，接种细胞于含一升的MM培养液的2000毫升的三角瓶中，培养7-8天，每天取5毫升的培养液，离心，保留细胞于-70℃中。将细胞与相同体积的0．45毫米的玻璃珠混和后加入酵母菌细胞裂解液。(50mM磷酸缓冲液，PH7．40，0．5M NaCl，1mMPMSF，1mEDTA，5％甘油)在振荡器上剧烈振荡一分钟，冰上孵浴一分钟，反复12次。12000转／分离心，收集上清液，煮沸5分钟，加入10％SDS-PAGE的胶，转移至硝酸纤维膜上，用羊抗人乙肝表面抗原检测发现，在3，4，5，6天的培养细胞中可见一条27-29KD的糖化带和另一条24-25KD的带。至此，我们成功地得到了2个可表达乙肝表面抗原蛋白的慢速甲醇代谢克隆。

7．分析表达乙肝表面抗原的重组酵母菌菌株：

接种重组酵母菌菌株于含10毫升MGY(1．34％YNB，1％甘油，4×10^-5生物素)培养液的100毫升三角瓶，28℃，250至300次／分摇床中培养至OD_600nm。值达0．3-0．6。取3毫升接种于含50毫升MGY的100毫升三角瓶中，同样条件培养至OD_600nm值达1-1．2。离心收集细胞，分别接种于两个含500毫升的MM(1．34％YNB，4×10^-5生物素，0．5％甲醇)的培养液中，观察在大量培养条件下不同培养时间对乙肝表面抗原产量的影响。在反复培养重组酵母菌中发现，PH6．0-6．50对酵母菌的高效表达乙肝表面抗原是十分重要的条件，PH应当始终维持到6．0-6．50的范围。重组酵母菌分别于28℃，250-300次／分摇床中培养3-4天，收集细胞做进一步分析。

取一定的细胞和等量的0．45mm的玻璃珠相混合，在有酵母菌细胞裂解液的存在下(50mM磷酸缓冲液，PH7．40，0．5M NaCl，1mMPMSF，1mMEDTA，5％甘油)，在振荡器上剧烈振荡一分钏，冰浴一分钟，反复12次，12000转离心，收集上清液，取一定量的样品及已知量的羊IgG，煮沸5分钟，加入10％SDS-PAGE凝胶，转移至硝酸纤维膜上，用羊抗人乙肝表面抗原检测表达量。在分析过程中，使用Bio-Rad的图相分析系统分析结果。发现同样的条件下，96小时比72小时重组酵母菌可产生更多的细胞总蛋白及乙肝表面抗原。

8．酵母菌表达的乙肝表面抗原以22nm的聚合体形式存在：

将重组酵母菌的细胞裂解液和感染有乙肝病毒患者的血清加入含有5％到30％的蔗糖的连续梯度管中，40000转／分超速离心18小时，可见来自人的和来自重组酵母菌表达的乙肝表面抗原多以多聚体(22nm颗粒)的形式存在，与单个的表面抗原蛋白相比，它有更强的刺激机体产生抗体及对乙肝病毒免疫的能力。酵母菌产生的重组型表面抗原疫苗具有如下优势：酵母菌是真核细胞，其内部环境接近人体细胞；酵母菌可以糖化蛋白，蛋白质的糖化对蛋白质的完整性，可溶性及生物活性至关重要；大部分酵母菌的表面抗原可形成类似于乙肝病毒在人体内形成的表面抗原多聚体颗凿，(即22nm表面抗原颗粒)。多聚体表面抗原与单个的表面抗原相比具很强的刺激肌体产高滴度的，长时间的免疫效应。

本发明与已有技术相比，有以下几个特点：1．应用普通培养学方法，该菌株即能高效表达乙肝表面抗原蛋白，其产量大大高于目前应用发酵方法生产乙肝表面抗原蛋白的产量；2．为了增加表达量，首次将两个相同的乙型肝炎病毒表面抗原基因表达单元克隆在一个DNA表达载体上，然后整合到酵母菌染色体上，提高了重组酵母菌的表达效率；3为了从成千个克隆中找到高效表达乙肝表面抗原蛋白的菌株，首次应用了单纯筛选慢速型甲醇代谢克隆的方法，成功地从30个克隆中发现了两个高产表达菌株，从而减小了所需筛选的克隆数及工作量，提高了成功率；4发现了新的培养条件用于提高本菌株的表达产量；5首次应用了乙型肝炎病毒中的中国亚型(adw2)表面抗原基因作为表达基因，该基因更适合中国人居住区地区(中国大陆，香港，台湾及东南亚)人群的免疫接种，提高免疫的效果。

此外，酵母菌的发酵生产工艺可提高表达效率。发酵能增加细胞氧合效果和单位体积中的细胞密度。与一般的摇床培养方法相比，蛋白质表达的产量可增加两至三倍。因此，如果利用发酵工艺培养我们所制备的菌株，可获得更高产量的乙肝表面抗原。

图面说明：

附图1PYEV-HBS1质粒图解；

附图2具有二个表达单元的PYEV-HBS2质粒图解。

Claims (3)

1．一种乙型肝炎病毒表百抗原疫苗的生产方法，其特征在于应用基因重组技术，将两个相同的乙型肝炎病毒表面抗原基因表达单元克隆在一个DNA表达载体上，然后整合到酵母菌染色体上，生产乙型肝炎病毒表面抗原疫苗。

2．一种从重组酵母菌中寻找乙型肝炎病毒表面抗原高效表达菌的方法，其特征在于采用单纯筛选慢速型甲醇代谢克隆的方法，筛选乙型肝炎病毒表面抗原菌株。

3．一种乙型肝炎病毒表面抗原疫苗的生产方法，其特征在于应用中国亚型(adwz)表面抗原基因作为表达基因生产乙型肝炎病毒表面抗原。

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