CN107384813A

CN107384813A - 一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用

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Publication number: CN107384813A
Application number: CN201710660571.1A
Authority: CN
Inventors: 王枫枫; 王丁; 王一丁
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-08-04
Also published as: CN107384813B

Abstract

本发明提供了一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用，属于基因工程领域。本发明的黑曲霉菌株敲除了fluG基因后得到的突变菌株具有蛋白质高产特性；进一步对该突变菌株基因组中引入糖化酶调控因子，得到的突变株FY17(ΔfluGamyR⁺)可以促进同源蛋白和异源蛋白的分泌；将FY17突变菌株敲除pepA基因后，得到的突变株也可显著提高异源蛋白和同源蛋白的分泌量；本发明还发现FY17 SP(ΔfluGΔpepAamyR⁺AnhapC⁺)可作为表达载体生产多种异源蛋白质。本发明的以敲除了fluG基因黑曲霉菌株为出发菌株的各突变株具有良好的生产同源和异源蛋白质的能力，具有良好的市场应用前景。

Description

一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程改造技术领域，具体地说，涉及一种基因工程改造后的黑曲霉菌株及其在蛋白质生产中的应用。

背景技术

丝状真菌黑曲霉作为转化的宿主菌，相比其他微生物如细菌、酵母等有以下优势：黑曲霉有很强的胞外分泌蛋白能力，而细菌表达的重组蛋白往往以无活性的难溶的包含体形式存在；当细菌表达异源真核基因时，由于其翻译和转录不同于真核生物，所转入的基因可能无法正常表达，而丝状真菌不存在这种情况，丝状真菌能对表达蛋白进行正确的翻译后加工，包括肽连剪切和糖基化等后加工；与传统酵母相比，黑曲霉的糖基化模式与哺乳动物细胞相似，这对表达高级真核生物异源蛋白质尤其重要；黑曲霉具有像细菌一样的快速繁殖能力和短的生活周期，比动植物的细胞培养要简单；相比传统酵母和毕赤酵母，其蛋白质分泌量要高；许多丝状真菌如黑曲霉，米曲霉等被长期用与食品工业，被公认为安全微生物；黑曲霉具有成熟的上游基因改造优化特性，以及发酵和后提取纯化工艺。

黑曲霉作为一种腐生真菌，可以依靠多种碳源生长，对于生长环境适应性极强。作为商业微生物菌种已经被广泛应用于有机酸和酶制剂生产。随着基因工程技术的应用，黑曲霉作为理想的宿主菌株也被用于异源蛋白质的表达及生产。作为一种丝状真菌，黑曲霉主要通过菌丝尖分泌蛋白质或酶。之前的研究显示，无论是液态厌氧条件下所形成的微菌落(micro colony)或是好氧固态大型菌落(macro colony),菌落内部和外部转录组呈现明显差异。此外，大型菌落蛋白质分泌检测显示，蛋白质或酶分泌主要通过菌丝尖进行，并主要集中于菌落边缘。因此，如果能够使黑曲霉实现全菌丝体分泌以显著提升蛋白质或酶制剂的生产效率，目前还未有相关报道。

真菌生理学研究显示，黑曲霉孢子生成过程可抑制蛋白质分泌，因此如何抑制孢子生成代谢途径成为能否提高蛋白质分泌水平的关键。研究显示，作为扳机基因，fluG基因主要参与孢子生成相关的胞外信号传导。在构巢曲霉中，可以导致孢子生成出现障碍，在黑曲霉中敲除fluG基因，孢子生成传导途径并未受到显著影响。

amyR是一种丝状真菌GAL4型转录激活子，广泛存在于在曲霉家族中，在真菌降解植物多糖过程中起重要作用；当淀粉或麦芽糖作为碳源时，amyR可以激活糖化酶、α-淀粉酶和á-糖苷酶等。糖化酶在黑曲霉中具有胞外分泌的信号肽片段，因此是一种典型的分泌型蛋白质，可以作为异源蛋白质的载体实现向胞外分泌异源蛋白质，从而有利于大规模工业发酵和目标蛋白质的纯化。作为异源蛋白质分泌的载体，通过蛋白质融合技术，在糖化酶启动子GLA和糖化酶基因glaA之后嵌入外源蛋白基因，可有效的表达和分泌该异源蛋白质，同时通过特异的蛋白内切酶KexB(识别Lys-Arg位点)可以在发酵液中直接获得酶切后的游离异源蛋白质，进一步可优化KexB内切酶位点的序列(如在Lys-Arg前后增加特定氨基酸序列)，从而增强并达到100％内切效果，获得完全游离的目标蛋白质，从而简化后续纯化工艺和生产成本。

黑曲霉胞外分泌蛋白酶(aspergillopepsin)是工业生产异源蛋白质的主要挑战之一。黑曲霉主要胞外分泌的蛋白酶相关基因包括pepA,pepB和pepE。

有研究表明CCAAT box五核苷酸存在于30％真核生物的基因上游区域，在特定基因表达中起不同作用。在黑曲霉中，CCAAT box被发现存在于糖化酶glaA基因上游，与结合蛋白协同作用可调节糖化酶表达。之前研究已经发现一系列结合蛋白对基因表达有正调控作用如hapC，hapB,hapE,hapD等基因为正向反式作用蛋白因子，可与CCAAT box序列结合并改善糖化酶启动子功能及相关基因表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因工程改造的黑曲霉，本发明的另一目的在于提供该基因工程改造的黑曲霉在生产蛋白质以及提高蛋白质产量中的应用。

本发明首先提供一种黑曲霉菌基因工程菌株，其为敲除了fluG基因的黑曲霉菌，所述fluG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明发现敲除fluG基因的黑曲霉工程菌株(ΔfluG)具有蛋白质超分泌的特性。

本发明提供一种黑曲霉基因工程菌株，其名为FY17(ΔfluG amyR⁺)，为在上述的黑曲霉菌基因工程菌株(ΔfluG)基因组中引入糖化酶调控因子amyR多重拷贝数为5-20，优选8到12个拷贝。所述糖化酶调控因子amyR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明提供一种黑曲霉基因工程菌株，其为黑曲霉基因工程菌株FY17(ΔfluGamyR⁺)的突变体(ΔfluGamyR⁺ΔpepA)，是将黑曲霉基因工程菌株FY17中的pepA基因敲除或使pepA基因功能丧失得到。所述pepA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

简单的敲除PepA基因一般会产生对菌体生理不利的现象(L.Wang et al./Biotechnology Advances 23(2005))，并不利于工业发酵应用。本发明是基于工程菌株FY17的基础上获得的蛋白酶缺陷型黑曲霉基因工程菌株(ΔfluGamyR⁺ΔpepA)，是在保留了FY17菌株高表达和高生长的特性基础上，进一步提高了对蛋白酶敏感的异源蛋白(例如IL6)的分泌量。

更进一步地，本发明提供一种黑曲霉基因工程菌株，其名为FY17SP株(ΔfluGΔpepAamyR⁺AnhapC⁺)，其为在上述的黑曲霉基因工程菌株(ΔfluGamyR⁺ΔpepA)基因组中引入hapC基因而得到；所述hapC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

有研究显示多拷贝的CCAAT序列(如>12个)对基因表达产生负作用。本发明阐述了hapC基因的引入是基于FY17突变株基础上进行的。FY17菌株在液态培养环境下具有的较低自溶现象，即较长的培养时间和蛋白表达周期，可以在获得hapC基因后进一步增强目标基因持续表达的周期，此外其拷贝数量需要通过对菌株进行筛选，获得对目标基因具有持续正向调控作用的菌株。

本发明还提供一种黑曲霉菌基因工程菌株，其为将敲除了fluG基因的黑曲霉基因工程菌株中的pepA基因敲除、使pepA基因功能丧失和/或在其基因组中引入hapC基因得到。

含有本发明上述任一种黑曲霉菌基因工程菌株的生物制品属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述任一种黑曲霉菌基因工程菌株在生产蛋白质中的应用。

本发明首次发现敲除fluG基因的黑曲霉菌株因其具有特殊的生理特点，例如全菌丝体分泌、更多菌丝体、液态培养下较低的菌体自溶现象等，因此具备了蛋白质高产和高分泌的特性。本发明提供了上述任一种黑曲霉菌基因工程菌株在提高蛋白质产量中的应用。

进一步地，本发明提供了fluG基因在使菌株变大、菌丝体增多或在提高菌株蛋白分泌量中的应用，所述fluG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体的是指fluG基因的突变在使菌株变大、菌丝体增多或提高菌株蛋白分泌量中的应用，所述fluG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述fluG基因的突变是指fluG基因的敲除或碱基突变从而使fluG基因丧失原功能。

能使fluG基因表达沉默的siRNA在提高菌株蛋白分泌量中的应用也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明采用基因工程的方法，构建得到多种基因工程改造后的黑曲霉基因工程菌株，这些菌株具有高效表达分泌同源蛋白或异源蛋白的能力。

(1)本发明敲除了fluG基因的黑曲霉工程菌株(ΔfluG)可作为同源蛋白质生产用菌株，包括生产糖化酶蛋白质。该菌株(ΔfluG)分泌蛋白质呈现全菌丝体分泌；菌丝体形态较出发菌株显著变大，导致菌丝体增多；菌体较出发菌更适应在液态下培养，菌体自溶现象较低，说明该黑曲霉基因工程菌株更适应大规模液态发酵，利于工业应用。因该菌株具备了上述良好的特性，可作为进一步进行基因改造和异源蛋白质表达的基础菌株。

(2)本发明经过反复试验发现糖化酶调控因子amyR拷贝数量和蛋白分泌能力大小直接相关，拷贝数过多(>20)或者过少(<5)都不会对蛋白质分泌产生显著正向影响。在进行该基因转入菌体过程中，发明人需要进行大量的工程菌株的筛选工作，从而找到amyR拷贝数在5-20之间的工程菌株，从而保证蛋白质分泌的最佳效果。

本发明的FY17工程菌株是在fluG突变型菌株(ΔfluG)基础上加入8-12个拷贝数的amyR基因后展现了糖化酶的全菌丝超分泌的能力。同时可借助糖化酶在FY17中超分泌的特点，嵌入异源蛋白质基因，利用基因融合技术，实现异源蛋白质高产和高分泌的目的。本发明阐述了该菌株在常规摇瓶液态环境培养条件下，IL6的产量在150mg/L左右。

现有技术往往是通过改善发酵培养条件来增加真菌异源蛋白质的产量，例如通过调节接种量、温度、pH、搅拌速率、dO₂和通气量、培养基种类和培养模式等工艺参数，优化菌体形态、溶氧和传质、碳源供给、菌体量等关键质量属性。而本发明提供的FY17(ΔfluGamyR⁺)在无需调节或改善现有的发酵培养条件的情况下，就能够显著获得蛋白的高产和高分泌。

(3)本发明的黑曲霉突变株(ΔfluGamyR⁺ΔpepA)在具有FY17的生理特点的基础上，可以显著提高在液态培养环境下对蛋白酶敏感的异源蛋白质的分泌产量。本发明阐述了该菌株在常规摇瓶液态环境培养条件下，对蛋白酶敏感的IL6蛋白质产量较FY17菌株提高了1.5-2倍，可达200-300mg/L。有研究表明采用发酵罐模式培养，并通过优化发酵条件，例如pH值、搅拌速率等参数，可以进一步降低丝状真菌的总体蛋白酶活性，从而提高异源蛋白质的产量，报道显示IL6蛋白的产量可提升5-15倍(Punt et al 2002)。

(4)本发明的黑曲霉突变株FY17SP(ΔfluGΔpep AamyR⁺AnhapC⁺)在相同液态培养条件下，可较长时间的维持对蛋白酶较敏感的异源蛋白质的高表达和高分泌现象，含量持续在200-300mg/L之间达10-12小时，与FY17菌株相比，维持较高IL6产量的时间可提高1.5倍以上。

附图说明

图1为C¹⁴标记实验揭示了蛋白质在野生型与突变体菌丝内部和分泌分布情况。图中A，B，C为野生型，D，E，F为ΔfluG突变体；A,D为菌落生长状况；B，E为蛋白质在菌丝内部分布；C,F为蛋白质分泌分布。与野生型相比，ΔfluG蛋白质分泌呈现全菌落/菌丝分泌。使用ImageJ软件对C¹⁴进行量化，根据信号强度(黑色为信蛋白质分泌信号，白色表示无蛋白质分泌)量化结果显示ΔfluG突变体蛋白质分泌量在大型菌落中心(图1中的F)较野生型(图1中的C)提高1.5倍，在大型菌落边缘蛋白质提高5倍以上。

图2为Lugo淀粉降解检测，结果显示ΔfluG突变体将菌落以下的淀粉全部降解，而野生型淀粉酶呈空间分泌。A为野生型，B为ΔfluG突变体，Lugo实验使用1％可溶淀粉琼脂培养皿，已在麦芽糖培养基上培养7天的大型菌落，被放置在淀粉培养基上4个小时，lugo染色结果显示ΔfluG突变体将菌落一下的淀粉全部降解，而野生型淀粉酶呈空间分泌。使用imageJ软件对淀粉基质降解实验结果量化发现fluG突变体对淀粉降解能力为野生型的2倍以上。

图3为拷贝数检测，检测结果显示ΔfluG突变体在麦芽糖液态培养条件下培养16小时所形成的微菌落较野生大,N402野生型微菌落平均直径为0.2mm，而ΔfluG突变体微菌落平均直径为0.46mm；n402为野生型，ΔfluG为突变体。

图4为摇瓶25mM麦芽糖培养48小时检测；野生型(wt)出现自降解及粉褐色色素积累，而ΔfluG突变体则无异常，微菌落呈白色，培养基澄清；该实验显示ΔfluG突变体在特定碳源条件下有一定抗逆表型，有利于发酵生产过程的优化，例如培养时间对菌体稳定性的优势，降低发酵成本。

图5为菌落western blot检测，左侧野生型；右侧ΔfluGamyR⁺突变体；结果显示ΔfluG突变体转入amyR多重拷贝后显著提升了固态大型菌落的糖化酶分泌水平，使用ImageJ软件对western blot形成的反应区域进行量化显示ΔfluG突变体糖化酶分泌量为野生型的5倍以上。

图6为外分泌酶活检测(nmolemin^-1ml^-1)胞外酶活检测wt为野生型(出发菌株)和ΔfluGamyR⁺突变体突变体(即图中fy17)在三种碳源(25mM单糖或二糖，1％可溶性淀粉)，酶活检测包括α/β-葡萄糖苷酶和α/β-半乳糖苷酶。图中四幅图横坐标项目内容相同。

图7为蛋白质水解活性检测：在pH4.0条件下，不同时间点(1小时，2小时，3小时，4小时)的A 280nm吸收率变化/ml培养上清液(细胞外活性)。纯化上清液中的总细胞外蛋白酶活性：野生型N402，ΔpepA，ΔpepB，ΔpepE。结果表明ΔpepA型的蛋白酶活性最低，对分泌的蛋白质的稳定性影响最小。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。本发明实施例所用的黑曲霉为黑曲霉ATCC16404，采用本领域内公知公用的其他未经基因工程改造的黑曲霉菌株按照本发明记载的方法进行改造也能够实现本发明的效果。

实施例1敲除了fluG基因的黑曲霉基因工程菌株的构建与效果研究

1、fluG上下游测序列以A.niger N402基因组DNA模版进行扩增，同时通过引物引入NotI和XbaI/XhoI限制性内切酶位点到上游测序列的5’和3’端，而XhoI和KpnI则被引入到下游测序列的5’和3’端；所扩增的引物被平末端连接到pJET 1.2(Fermentas,Thermoscientific,Waltham,USA)载体上；所得上下游片段载体，分别进行NotI/XhoI和XhoI/KpnI酶切，所得片段回收备用；接下来以载体pBluescriptIISK(+)为骨架，进行三片段链接；fluG上下游序列中间插入PAN7-1XhoI/XbaI酶切片,该片段含有hygromycine抗性表达基因；最终完成fluG基因敲除质粒BNOfluG构建。

2、对敲除了fluG基因的ΔfluG黑曲霉突变体(出发菌株为N402野生菌株，将fluG基因敲出获得该突变体)敲除了的fluG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。做进一步检测(C¹⁴标记实验)后发现，在以如麦芽糖为碳源的条件下，野生型大型菌落呈部分菌丝分泌蛋白质：蛋白质分泌主要集中于菌落边缘；而ΔfluG突变体菌落蛋白质分泌呈全菌落分泌，特别是菌落中心蛋白质分泌水平有明显提升(见图1)。为进一步检测ΔfluG突变体的蛋白质分泌能力，使用Lugo检测法，检测固态大型菌落对淀粉分解能力，实验结果显示(见图2)ΔfluG突变体较野生型对淀粉分解能力有明显提高。利用流式细胞仪检测微菌落形态，结果(见图3)显示ΔfluG突变体液态微菌落与野生型直径相比较大，表明菌落菌丝较丰富，因其具有全菌丝体分泌特点，具有更强的蛋白质分泌能力。进一步在液态发酵(如以麦芽糖为碳源)条件下，ΔfluG突变体对培养环境较野生型菌株具有更强的适应能力，可以较长时间进行培养，从而提升蛋白质生产时间和产量(见图4)。综上所述，与黑曲霉菌野生型只能在菌落边缘分泌蛋白质的表型相比，ΔfluG黑曲霉突变菌株具有蛋白质高产特性，有利于工业发酵生产。

实施例2黑曲霉突变株FY17(ΔfluGamyR⁺)的构建

在实施例1制得的黑曲霉ΔfluG突变体基础上对amyR基因进行超表达，具体实施如下，使用将4.3kb包含amyR基因的DNA片段(SEQ ID NO.2)引入pGEM11载体并与pIM2101(该载体包含argB基因)共转化，通过转化筛选后得到的突变体，在淀粉基质上进行一系列的进一步筛选工作，获得的菌株，进行分子检测，筛选并确认插入的拷贝数，最终获得FY17菌株。本发明的FY17工程菌株是在fluG突变型菌株(ΔfluG)基础上加入8-12个拷贝数的amyR基因后展现了糖化酶的全菌丝超分泌的能力。

在ΔfluG突变体的基础上将糖化酶(glucoseamylase)调控因子(amyR)多重拷贝引入ΔfluG突变体基因组后，ΔfluG amyR⁺突变体呈显全菌丝糖化酶超分泌(见图5)。进一步胞外酶活检测表明该菌株在麦芽糖为碳源的摇瓶过夜培养条件下β-葡萄糖苷酶和a-半乳糖苷酶活性分别获得至少6倍和15倍的提升(见图6)。

ΔfluG amyR⁺突变体对糖化酶的高表达可以通过类似手段将异源蛋白质基因嵌入，从而受到该调控因子上调表达，进而实现目标异源蛋白质的超表达和超分泌。在实际应用中，以ΔfluG突变体为母本，可以依据异源蛋白质的特性选择性的嵌入多拷贝的调控因子，在质粒中构建糖化酶启动子GLA和糖化酶基因glaA与外源蛋白基因结合产物，并转化到黑曲霉基因组中进行表达、转录、翻译和分泌，从而实现目标异源蛋白质的生产。进一步可通过对发酵和纯化工艺的优化，进一步提升目标异源蛋白质的产率。

本实施例还涉及FY17菌株表达生产IL6异源蛋白质。在制备含IL6基因序列的FY17菌株时，采用了基因融合技术，将IL6基因片段嵌入到糖化酶基因的C端，并通过加入KexB酶切位点识别序列，进一步在该序列的N端加入表达Ile-Ser的序列，在其C端加入表达Gly的三组重复序列。获得和筛选可表达IL6的FY17菌株的方法同上所述。

将菌株在250ml培养瓶中培养，以麦芽糖为碳源，将1×10⁸/ml孢子接种到100ml的MM培养基中，在30℃下培养4-6天，每4小时进行取样，利用商用检测试剂盒对培养液取样进行IL6含量检测，在第72-120小时观察到IL6的产量最高，达95±15mg/L。

实施例3黑曲霉突变株(ΔfluGamyR⁺ΔpepA)的构建

1、构建方法

pepA上下游测序列以A.niger N402基因组DNA模版进行扩增，同时通过引物引入NotI和XbaI/XhoI限制性内切酶位点到上游测序列的5’和3’端，而XhoI和salI则被引入到下游测序列的5’和3’端；所扩增的引物被平末端连接到pJET 1.2(Fermentas,Thermoscientific,Waltham,USA)载体上；所得上下游片段载体，分别进行NotI/XhoI和XhoI/salI酶切，所得片段回收备用；接下来以载体pBluescriptIISK(+)为骨架，进行三片段链接；pepA上下游序列中间插入pXDRFP4(Yang et al.2004)XhoI/XbaI酶切片,该片段含有pryG抗性表达基因；最终完成pepA基因敲除质粒pepAKO构建。使用FY17作为宿主菌株进行转化并完成pepA基因敲除。

2、效果验证

本发明阐述了蛋白酶缺陷型的菌株可针对特定异源蛋白质的物理化学性质，配合pBluescriptIISK(+)基因敲除系统和ΔfluGamyR⁺蛋白质表达平台，制备蛋白酶缺陷型菌株，从而完成对异源蛋白质表达分泌的进一步优化，特别是对蛋白酶敏感的异源蛋白质，有利于进一步提高生产效能，降低成本。

图7为蛋白质水解活性检测试验见图7：在pH4.0条件下，不同时间点(1小时，2小时，3小时，4小时)的A280nm吸收率变化/ml培养上清液(细胞外活性)。纯化上清液中的总细胞外蛋白酶活性：野生型N402，ΔpepA，ΔpepB，ΔpepE(后三者均为在FY17基础上敲除)。结果表明ΔpepA型的蛋白酶活性最低，对分泌的蛋白质的稳定性影响最小。

本实施例进一步将敲除了pepA基因的FY17作为宿主菌株进行IL6基因的转化和表达，所得到的工程菌在液态摇瓶下进行培养，培养条件和检测IL6产量方法如实施例2所述。培养基中检测到的IL6产量可提升至265±40mg/L。

将含有ESAT-6和CFP10抗原基因(序列分别见SEQ ID NO.17和18)的菌株经过液态摇瓶发酵培养，利用抗原检测试剂盒可在培养基中定量分泌型ESAT-6和CFP10抗原蛋白产量，ESAT-6含量可达2.4±0.5g/L，CFP10含量为1.5±0.5g/L。

实施例4黑曲霉突变株FY17SP(ΔfluGΔpepAamyR⁺AnhapC⁺)的构建

为特定蛋白(启动子含CCAAT binding位点的蛋白质家族)稳定表达引入hapC基因(SEQ ID NO.4)，保障外源蛋白质能稳定表达。使用pBSIIKS载体克隆AnhapC基因(包括启动子及终止子约1.5kb)与p35R2质粒(含乙酰胺酶amds)共转化，最终得到ΔfluGΔpepAamyR⁺AnhapC⁺稳定表达蛋白质型突变菌株FY17SP。

本发明结合之前开发的多用途表达载体ΔfluGΔpepAamyR⁺，可根据不同异源蛋白质性质，调整优化表达模块，保证蛋白质高效稳定表达。

实施例5黑曲霉突变株FY17SP生产白细胞介素6

白细胞介素6(IL6)是一种重要的人体细胞因子，在免疫系统中具有免疫调节作用，在炎症反应中起关键作用。白介素6由T细胞和巨噬细胞等免疫细胞分泌并参与机体的免疫应答。在临床上当机体产生一些疾病时，如急性感染、自身免疫性疾病和肿瘤等，白介素6的水平往往上升，因此通过临床检验等手段可以协助医生诊断机体的疾病情况。利用工程菌等表达系统可以生产具有生物活性的白介素6蛋白，但是白介素6蛋白容易被蛋白酶水解而损失，本实施例利用实施例4得到的黑曲霉工程菌FY17SP成功高表达白介素6。

基于高表达系统FY17SP菌株进行白介素6的生产，采用融合蛋白技术将白介素6基因序列结合在糖化酶基因之后进行分泌表达。在构建质粒上采用GLA为启动子糖化酶glaA的基因片段(1-1542)下游融合白介素6的基因序列，并在两者序列中加入蛋白酶识别位点Lys-Arg用于在酶切糖化酶与白介素6蛋白，从而利用黑曲霉菌株FY17SP的糖化酶分泌能力生产游离的白介素6蛋白。经过液态发酵培养，利用IL6检测试剂盒可在培养基中定量分泌型白介素6蛋白，含量持续在200-300mg/L之间达10-12小时，在同样培养条件下较不含hapC基因型菌株(实施例3制得的菌株)延长4-5小时。

实施例6黑曲霉突变株FY17SP表达肠道病毒和口蹄疫病毒VLP

肠道病毒EV71和CA16是引起婴幼儿手足口病的病原体，目前EV71已研发出全病毒灭活疫苗用于预防该病原体引发的手足口病，同时也有在研的利用基因工程技术生产的新一代EV71疫苗，同时基因工程的CA16疫苗也在开发之中。利用原核和真核表达系统可以生产EV71和CA16病毒的VLP疫苗，具有较好的低成本和高免疫原性等优点。本发明利用黑曲霉工程菌FY17SP可以成功高表达EV71和CA16的VLP。

肠道病毒脊髓灰质炎病毒可引起人体神经麻痹进而可导致瘫痪，重症可导致死亡。近几年利用基因突变技术已经成功获得较稳定的三个型别的脊灰VLP结构，在此基础上，本发明利用黑曲霉工程菌FY17SP可以成功高表达三个型别的脊灰VLP。

口蹄疫病毒是一种针对偶蹄类动物的高致病性病原体。目前广泛使用的全病毒灭活疫苗的保护效果还有待提高，此外，生产环境要求级别高也限制了疫苗的扩产和成本的进一步降低，因此利用基因工程技术生产VLP疫苗成为了首选的下一代口蹄疫疫苗。本发明利用黑曲霉工程菌FY17SP可以成功高表达O型猪和牛口蹄疫病毒VLP。

基于高表达系统FY17SP菌株进行肠道病毒EV71、CA16、脊灰病毒三型别和O型猪或牛口蹄疫病毒VLP的生产，本发明采用融合蛋白技术将肠道病毒或者口蹄疫病毒的外壳蛋白基因序列P1(仅含有VP0、VP1和VP3序列)结合在糖化酶启动子GLA和glaA基因之后进行分泌表达。构建质粒方法同实施例5所述，并用同样方法另构建含糖化酶基因融合病毒蛋白酶3CD/3C序列的质粒，并共同转化到黑曲霉菌株FY17SP中，用于产生VP0，VP1和VP3衣壳蛋白，经过组装产生病毒VLP。经过液态发酵培养，利用抗原检测试剂盒可在培养基中定量分泌型病毒VLP，含量可达300-450mg/L。维持时间达8-9小时，在同样培养条件下较不含hapC基因型菌株(实施例3制得的菌株)延长4小时。

实施例7黑曲霉突变株FY17SP表达结核分枝杆菌抗原

结核疾病是全球重要的传染疾病之一，目前广泛采用接种BCG卡介苗的方式来预防结合病的发生和传染，但是BCG疫苗对成人的保护率逐渐下降，从而导致结核疾病在成人中的持续高感染率。诊断该疾病的手法主要通过体内和体外诊断试剂的方式进行，其中体内诊断可以通过结核杆菌特有的ESAT-6和CFP10抗原蛋白与特异的结核杆菌抗体的反应来实现，该抗原蛋白组合物不会与卡介苗接种者体内抗体反应，从而可以有效避免BCG疫苗接种者的假阳性结果的出现。本发明利用黑曲霉工程菌FY17SP可以成功高表达ESAT-6和CFP10抗原蛋白。

基于高表达系统FY17SP菌株进行结核杆菌ESAT-6和CFP10抗原蛋白的生产，本发明采用融合蛋白技术将ESAT-6和CFP10抗原蛋白基因序列作为目标基因分别构建到两个质粒中，采用与糖化酶基因融合技术对抗原蛋白进行分泌表达。构建质粒方法同实施例5所述，两个质粒共同转化到黑曲霉菌株FY17SP中，用于产生ESAT-6和CFP10抗原蛋白。经过常规液态发酵培养，利用抗原检测试剂盒可在培养基中定量分泌型ESAT-6和CFP10抗原蛋白产量，含量均可达1.5-3g/L，维持时间达14小时，在同样培养条件下较不含hapC基因型菌株(实施例3制得的菌株)延长5小时。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 王枫枫

<120> 一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用

<130> KHP171113136.4

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2728

<212> DNA

<213> fluG

<400> 1

atggatccgc tcgcgtctct tcgtcgcctc atccaaacgc atcctcttat cgacaaccac 60

gcccataatc tccttgcgca ggccgcagcc cgcaactacg caaaatatcc tttcgaacag 120

atcacttccg aggcccaagg ttccgcccta cacaatgctc cgtccacctt acccctccag 180

cgtgccgccg cccagctagc gaccctttac gattgcccga cttccgagtg ggaccgcgtc 240

aaggcggctc gcgatcaata tgtcgagcgt gactatgatg gcttgatccg tcggtgtctg 300

gaaggcactc atagccttct tcttgatgat ctgcttacgg atcaagatat cgagcctttc 360

acttggcatg atcgtttcac cacagctccg accaagcgga tcgtacggat tgaagttgtg 420

gccgcccaag tccttacctc catccttccc aacggttatg atcagtcctc gagcgacatc 480

accgttcttc gccagtatct ggaccagttc agccagggtt tcaaccagaa gatctcagag 540

gccatcgcag atcccgtggt ggtaggcttc aaatcagtca tctgctatcg tactggactg 600

aacgtccaag tggccgatga caaagacgac agcaatctcc tcgagtcctt ctcccggacc 660

ttgtcgcaag gatctggatc tacatatcgc gtggaggaca aacccctgaa cgattggctg 720

gtcaggcagg ccctgaacca gctgcaatct gccaaggaga aagatgcgtc ggaacccaac 780

aaaccactgc aactgcacac gggactcggc gataatgata tcaacctaat actttcgaat 840

cccgcatatt tacaggattt ggttgcccgt tatcccaagg tggactttgt gcttttgcat 900

tccgcttatc cgtatacccg ggaggccggc tatctcgcct gtgtctaccc gaatgtgtat 960

ctagaccttg gagaggtgtt tcccatggtg agtcgagatg ctcaggaatc tatcattcgc 1020

gagagtctgg agatcgtgcc cacaacccgc cttctgtgga gtaccgatgg ccatttcttc 1080

ccagagacat attggttggc gaacaaacag ttccgcgacg cactggaaaa ggtccgttcc 1140

tgtcatatca agtcctatac atcctttcag aaacttatct ttgctaggtt ctcgtggatt 1200

acgtcattca aggcgatcac agcgtcgatc aggcgaagct agctgctgcc gatatattgt 1260

tccacaactc caaccgcctg tacagcctta atgaaaccgt ttcctacgac gacaggctgg 1320

tccctgccgt cagcaacctt tctggacttt cttcgaccga cgcgttggaa agtttcatgc 1380

acagcaatcc agatgtcaag tatatttgga tgcagttctt tgactacact tccacagtgc 1440

gcgtgcggat gttccctatc cgggagtttg ctaagattgt tcgcaagcaa cgccggatcg 1500

gtatctgtac agccacgttt ttgatgcttc aatccgacac agtctgtccg gaaggttcca 1560

caaccggcca gttctatcta gaaccagatc tctcaaccct ctctcgaaat gtggggatcg 1620

actcgaagag cgccacagta atgacttggg ggcgttctga ggagggtttg gaggtggaag 1680

gatgtccacg gacccttctg cgccgcgtca cgactgattt acgtgccaat catggaatcg 1740

aaattctctg cggattcgag attgaggtta ttctgctgaa gtgcgtcacc aaaccggaca 1800

ccgatgagga agagtttgtt ccatgtgtgc gcaaccactc ctggtcccag atgacccgag 1860

acacccgacg catggtgccg cttcttgagg aaattgtcga tactcttgca tccatcggca 1920

ttgaccttga acaattccac gctgaatcgg ccccgggcca gtttgaattc attctgccac 1980

ccggctcgcc cgtcgccgca gtcgataccc tgctcaaggc acgacaggtc gtgacttata 2040

tcgctgagca gcacggttac cgtgcaaccc ttcatccccg acccttctca cacgctgctg 2100

gctcagccgc acatgcgcat gtctccataa ctcctgcgac tcaggaggag agcttcttgg 2160

ctggtgtgct caagcacttc acctctttga cggccttcac tctgtctaat gatgtcagct 2220

acgaacggat gcactccggc ctctgggctg gaagcgagtg ggtcgcctgg ggcactcaga 2280

accgcgaaac acctatccgc aagatctctg cgggtcactg ggagatcaag gcacttgacg 2340

gtctgtccaa tatgtatctg gcaatggctg caattctagc cgcaggatac ctgggtgtgc 2400

aggacaagct gcccctgacc ctgcaggact gtttatgtaa gtattcctgc cagtgaggtt 2460

atcctctaga gtgcactcat gctaacaaat cgatatagat gacgcggcaa cactcagcga 2520

ggcggaccgc agtgccattg ggataaccac ccaaattccc acgaccctgg cacagagtct 2580

ggataatatg gcagccgaca aggctctccg ggatgtgctt ggcaacacac ttgttgagaa 2640

ctatatcacg gtcaaacgag ccgagagcaa gaagctgaat gcaatggagg cagaagcgcg 2700

acgcaagtgg ctggtcgaga gatactaa 2728

<210> 2

<211> 1942

<212> DNA

<213> amyR

<400> 2

atggactctc atccttcccc taccaaacaa aaggcctcca agcaagcctg cgacaactgt 60

cgtcggcgta agatcaagtg ctcgagagag cttccctgcg ataagtgtcg acgccttctt 120

ctttcttgtt cctacagtga tgtgctccgg cgcaaaggcc ccaagttccg caccttatat 180

ccacttgcgc ccattcatcc cctggtatca cgacaacaga atacatacca acagaattcg 240

tcacaaaatc cgttaaacaa gcaatggact gcagatggag tgggctatcc gttaagctca 300

ctaatgtcgc cttctttcac agtggcagac cctcaatact taccccatga cgctcccgag 360

ccgttctctc agtttcctcc gccagagcta gtctcctcac ccgactcaac caattcattg 420

tcagactcta gtatggcact agtgcgccct tatgcacgac gcctgtctgc tccggtgcta 480

cttgctcatg tgaatgttta tctaaaatat ctgttcccca tcatgcctgt ggtgcggaag 540

gaggagcttc aacaagattg ccaccagcct gaacggttat cgccccaacg atatgccttt 600

cttgtcgccc tatgcgcagc cacacacatc cagctgaaac tagatggcac agcatctgtc 660

ccagaacctt cacaccttca agccgggatt gacgggcatt cctggatgtc cggcgaagag 720

ttgctggctg aagcagtacg cgcaaggaag gattgcgacc cagtagacgg catgaacata 780

gaaagccttc ttacgtcttt cttcctgttt gcttcgtatg gtaacctgga caaacaggac 840

catgcctggt tctacctttg tcaggcaaca tccatggtct tcacgctggc actccaccga 900

gagtcaagtt atgtggatct gagtaccgaa gaagcagagg aacgacgcag ggtgttttgg 960

ctactgtttg tcaccgaaag gtaggtgcat cctatgaaag cattgcccat ttttcgacta 1020

atgtgaatca ggggctacgc acttcaacaa tcgaaaccgg taatgctgcg taattcaatc 1080

cgcaagcctc aagtactttg ctccgaagat cctatcttgg cctacggttt catcaatctt 1140

attagcatct ttgagaaact gaccgtcaac ctttatgact gggtctctgc gggaggcatg 1200

gacggctcgt ccgagatgcc ccctacatct gctattcagt ctagtctctg caacgcaatt 1260

tcggtcgacg gagtctcgga gattcaaaag gtcgacatac tcatcaccca gcaatggcta 1320

cagacagtaa tgtggaaact ttctatgact cgtgctactc agcctggatc tcgcgatgag 1380

gcggttcttc cctttcatct ccccgttctt gtcggaaaag ccgttatgaa tgttattggt 1440

gctgcatccc agggagctgt tgatgttcac ggcattggca tggtcagtat cttagttccg 1500

gcgcagcaca tgccaatacc atttactaac aacataacag gaacaaaaat tattcgacct 1560

gggttcctca gttgcagacg tggcacgatc actcaactcc aaagctgcgc accgccttac 1620

tgaagcggcc gtcgatcctc gcgaactcct ttggggcatt cttaccacct tatcacgcat 1680

ccgcggctct cagtcctacc tctttccttc attgttggag cgatgcaaag gcgccctgga 1740

ctttacctcc cccacgtcga tgggcaactt cctccctcca ttatccactg cttccacatg 1800

ggaagaggaa acggggctcg ccgtggtttc tgtcccggag aatcctgacc ctcatgaaca 1860

agaagcagca ttaatggagc cgctatcgca gctcttacca actccacagg tgcaattccc 1920

ggaaaataat cttttgaact ag 1942

<210> 3

<211> 1347

<212> DNA

<213> pepA

<400> 3

atggtcgtct tcagcaaaac cgctgccctc gttctgggtc tgtcctccgc cgtctctgcg 60

gcgccggctc ctactcgcaa gggcttcacc atcaaccaga ttgcccggcc tgccaacaag 120

acccgcacca tcaacctgcc aggcatgtac gcccgttccc tggccaagtt tggcggtacg 180

gtgccccaga gcgtgaagga ggctgccagc aagggtagtg ccgtgaccac gccccagaac 240

aatgacgagg agtacctgac tcccgtcact gtcggaaagt ccaccctcca tctggacttt 300

gacaccggat ctgcagatct gtaagcttcc ctgctcgggt gttcgggcaa atcgtgacta 360

acctggacta gctgggtctt ctcggacgag ctcccttcct cggagcagac cggtcacgat 420

ctgtacacgc ctagctccag cgcgaccaag ctgagcggct acacttggga catctcctac 480

ggtgacggca gctcggccag cggagacgtg taccgggata ctgtcactgt cggcggtgtc 540

accaccaaca agcaggctgt tgaagcagcc agcaagatca gctccgagtt cgttcagaac 600

acggccaatg acggcctttt gggactggcc tttagctcca tcaacactgg tgagtcaatc 660

ctacatcagc cgggttgacc tacctgctga ccgatacaca gtccagccca aggcgcagac 720

caccttcttc gacaccgtca agtcccagct ggactctccc cttttcgccg tgcagctgaa 780

gcacgacgcc cccggtgttt acgactttgg ctacatcgat gactccaagt acaccggttc 840

tatcacctac acggatgccg atagctccca gggttactgg ggcttcagca ccgacggcta 900

cagtatcggt gacggcagct ccagctccag cggcttcagc gccattgctg gtaagaaccg 960

ccttcattta acacacaact tgtccacctc tttactaact agtgtataga caccggtacc 1020

accctcatcc tcctcgatga cgaaatcgtc tccgcctact acgagcaggt ttctggcgct 1080

caggagagcg aggaagccgg tggctacgtt ttctcttgct cgaccaaccc ccctgacttc 1140

actgtcgtga ttggcgacta caaggccgtt gttccgggca agtacatcaa ctacgctccc 1200

atctcgactg gcagctccac ctgctttggc ggtatccaga gcaacagcgg tctgggactg 1260

tccatcctgg gtgatgtttt cttgaagagc cagtacgtgg tcttcaactc tgagggccct 1320

aagctgggat tcgccgctca ggcttag 1347

<210> 4

<211> 1039

<212> DNA

<213> hapC

<400> 4

atgtcgtcga cctctccctc caaggagccc gaggtggaac aggaacctca atcgggtgaa 60

gaacacgagc aaatggacaa ggaacaagat aaccaaacgc aaggtcaggg agagttcgag 120

gtgaaggaac aagacagatg gctaccaatc gcaaatggtt agttacgttc ccttgcagct 180

ctgctgttcc cctgatttgc gcgtaccttg cttttatccg ctggtctact gctgtcgcca 240

tactatccga gcaccctgcc gttgattgca tacttccttt ctcactcgcg tcacacttgc 300

ctggataact tggtttctct cgcgcccagg gctcaagctg ttttcagccc ttcttgtttg 360

aggagtagtg tttctcgtga tgctaacaat aattctacag ttgcgcgcat catgaaatta 420

gcattgccag agaatgcaaa gattgcaaaa gaagctaaag aatgcatgca agaatgcgtg 480

agcgaattca tctcttttat tactagcgag ggtgagtgtt ctattcgcaa atagttattt 540

gatggagact aatccctctg aagcttccga aaaatgtcaa caggaaaaac gcaagacagt 600

caatggagag gacatcctgt ttgctatgac ctcgcttggc tttgaaaact atgctgaggc 660

cctcaaaatc tatttgtcga aatatcgaga ggtaagacct gtgcaacgtt tttggacgat 720

cctgtctatc ccagacagcc tttgtgctag ggcaagtgtt gctaataaat atcagactca 780

gtctgccagg ggagagcatc agaatcggcc gccaagtagt gggtatgccg ggggcggacc 840

cgtcggcgga gctgccagcg gcccttcagt cgtgcgtgcc gggggtgctg cagctggagg 900

cgccttcccc gaagcctctg ataatgcagg cagcattatg aatcagggct tggacccatc 960

tgagcaggac gcctcagctt atggataccc tcccatggtt ggccaaggtc ataacggagc 1020

tggtggcgaa tcttattag 1039

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 5' flank fluGfw primer

<400> 5

ataagaatgc ggccgcgtga cttggaggag aggagctg 38

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 5' flank fluG rev primer

<400> 6

ccgctcgagt taatcctagt ctagagctga ttggttggcc ggttc 45

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 3' flank fluGfw primer

<400> 7

ccgctcgaga ccctgtgcat acatacatag c 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 3' flank fluG rev primer

<400> 8

cggggtaccc ctcgcactga tcgccatatc 30

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> amyRfw

<400> 9

atggactctc atccttcccc t 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> amyRrv

<400> 10

ctagttcaaa agattatttt cc 22

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 5' flank pepAfw

<400> 11

ataagaatgc ggccgcatgg tcgtcttcag caaaaccgct 40

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> 5' flank pepArv

<400> 12

ccgctcgagt taatcctagt ctagatcggc cagcggagac gtgtaccggg at 52

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 3' flank pepAfw

<400> 13

ccgctcgagg cacgacgccc ccggtgtt 28

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 3' flank pepArv

<400> 14

ttccgcggcc gctatggccg acgtcgacgc gtctaagcct gagcggcgaa tcccagctt 59

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> hapCfw

<400> 15

atgtcgtcga cctctccctc caa 23

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> hapCrv

<400> 16

ctaataagat tcgccaccag ctccgttat 29

<210> 17

<211> 288

<212> DNA

<213> ESAT-6

<400> 17

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcatag 288

<210> 18

<211> 300

<212> DNA

<213> CFP10

<400> 18

gcagagatga agaccgatgc cgctaccctc gcgcaggagg caggtaattt cgagcggatc 60

tccggcgacc tgaaaaccca gatcgaccag gtggagtcga cggcaggttc gttgcagggc 120

cagtggcgcg gcgcggcggg gacggccgcc caggccgcgg tggtgcgctt ccaagaagca 180

gccaataagc agaagcagga actcgacgag atctcgacga atattcgtca ggccggcgtc 240

caatactcga gggccgacga ggagcagcag caggcgctgt cctcgcaaat gggcttctga 300

Claims

1.一种黑曲霉基因工程菌株，其特征在于，其为敲除了fluG基因的黑曲霉菌，所述fluG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种黑曲霉基因工程菌株，其特征在于，其为在权利要求1所述的黑曲霉基因工程菌株基因组中引入糖化酶调控因子amyR；所述糖化酶调控因子amyR的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求2所述的黑曲霉基因工程菌株，其特征在于，糖化酶调控因子amyR在菌中的拷贝数为5-20。

4.一种黑曲霉基因工程菌株，其为权利要求2或3所述的黑曲霉基因工程菌株的突变体，其特征在于，将权利要求2或3所述的黑曲霉基因工程菌株中的pepA基因敲除或使pepA基因功能丧失得到；所述pepA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种黑曲霉基因工程菌株，其特征在于，其为在权利要求4所述的黑曲霉基因工程菌株基因组中引入hapC基因；所述hapC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种黑曲霉基因工程菌株，其特征在于，其为将权利要求1所述的黑曲霉基因工程菌株中的pepA基因敲除、使pepA基因功能丧失和/或在其基因组中引入hapC基因得到。

7.含有权利要求1-6任一所述的黑曲霉菌基因工程菌株的生物制品。

8.权利要求1-6任一所述的黑曲霉菌基因工程菌株在生产蛋白质中的应用。

9.fluG基因的突变在使菌株变大、菌丝体增多或提高菌株蛋白分泌量中的应用，所述fluG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述fluG基因的突变是指fluG基因的敲除或碱基突变从而使fluG基因丧失原功能。

10.使fluG基因表达沉默的siRNA在提高菌株蛋白分泌量中的应用。