CN116135979A - 一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用 - Google Patents
一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116135979A CN116135979A CN202111352181.0A CN202111352181A CN116135979A CN 116135979 A CN116135979 A CN 116135979A CN 202111352181 A CN202111352181 A CN 202111352181A CN 116135979 A CN116135979 A CN 116135979A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- engineering
- myceliophthora
- culture
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 39
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 49
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 43
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 28
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 28
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 27
- 241001313536 Thermothelomyces thermophila Species 0.000 claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 22
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 18
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 18
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 18
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 10
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 9
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 9
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 8
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims description 8
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 claims description 8
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 4
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 claims description 4
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 4
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 claims description 4
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 claims description 3
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000018700 F-Box Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010066805 F-Box Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000009015 carbon catabolite repression of transcription Effects 0.000 claims description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 2
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 5
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 5
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 3
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100332773 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) tef101 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101100329404 Aspergillus niger (strain CBS 513.88 / FGSC A1513) creA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241001214974 Thermothelomyces thermophila ATCC 42464 Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明构建了一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株工程改造的方法，将将带有选择性标记基因的DNA序列的转化进入目的真菌原生质体基因组中、流式细胞仪分选、深孔板培养、以及表型快速分析步骤结合起来。可直接用于丝状真菌遗传转化后的原生质体的筛选和分离，解决了现有丝状真菌技术中铺平板培养、转化子挑选、分生孢子制备以及摇瓶鉴定过程中耗时长、费力、通量低的瓶颈问题。本发明的方法操作方便、省时省力，极大提高丝状真菌工程改造的效率，可便捷有效的进行高通量构建丝状真菌高产工程菌。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，具体地，涉及一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株工程改造方法的构建及其应用。
背景技术
丝状真菌工业性状改良的高产菌株主要是通过基因工程技术进行的。但是传统的丝状真菌菌株改造技术是非常复杂和繁琐的，其中包括菌株遗传转化，转化后倒平板、原生质体的平板培养、从选择平板中挑取转化子到固体平板上、培养用于孢子形成的菌落、收集转化子的分生孢子用于后续的PCR验证和用于表型分析的摇瓶培养（现有的工程改造过程如图7所示）。因此，需要大量复杂的人工操作来进行倒平板、从培养板中挑选单个转化子到固体平板中进行分离培养、收集洗涤转化子的分生孢子、以及接种分生孢子到三角摇瓶进行振荡培养，这些操作过程繁杂极其耗时费力且费用大，严重限制了丝状真菌的工业生产菌株选育。
近年来，虽然在里氏木霉中构建了基于流式细胞仪分选的高通量筛选技术，但是这些技术仍然需要进行常规的遗传转化和转化后倒平板的操作，包括将转化的原生质体铺到再生培养平板中，从选择性平板中挑选菌落转移到单个固体平板上进行培养，再收集洗涤形成的分子孢子；或者培养菌丝体以便于进一步制备原生质体进行再次分选培养。这些技术仍就需要费时费力的人工操作。
因此，有必要建立一种方便、快速有效的免平板操作的工程菌株改造的方法来解决目前传统技术所面临的严重瓶颈，为高通量构建丝状真菌高产工程菌株提供一种方便、快速且有效的方法，具有重要的工业应用前景。
发明内容
本发明针对上述瓶颈问题，本发明将遗传操作技术、流式细胞术分选、深孔板培养以及表型快速分析相结合，旨在提供了一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株工程改造的方法，适用于丝状真菌工程菌株的快速构建，尤其是适用于工业丝状真菌高产菌株的简便快速构建。其总体过程如图1所示。
因此，本发明提供一种基于流式细胞术的免平板操作的丝状真菌工程改造的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将带有筛选标记，例如选择性标记基因或者带有营养缺陷型基因，和目标DNA序列的转化进入目的真菌原生质体基因组中；
（2）转化后获得的原生质体在含相应于所述选择性标记基因的选择性物质的培养液中进行再生和萌发培养，所述再生和萌发培养是指培养至用于后续筛选的短菌丝形态的转化子，优选地所述短菌丝形态是指不超过70 μm的短菌丝体，具体地培养8-16小时的短菌丝形态的转化子；
（3）利用流式细胞仪检测步骤（2）获得的转化子直接分选至孔板中进行发酵培养，优选地，所述孔板（尤其是深孔板）是具有高通量筛选作用的培养器皿；
（4）分析检测步骤（3）中分选到孔板发酵培养的转化子，离心后取出孔板中上清液进行蛋白测定，比较分泌目标蛋白的相对高低，得到基因工程成功改造的突变菌株。
任选地，还包括下述步骤：
（5）选取上一步得到的突变菌株进行摇瓶复筛，并对选取目标蛋白产量高的突变菌株用步骤（1−4）所述的方法再次进行工程改造。
优选地，所述丝状真菌包括但不限于毁丝霉属（Myceliophthora）、曲霉属（Aspergillus）、梭孢壳霉属（Thielavia）、脉孢菌（Neurospora）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、或根霉属（Rhizopus）中的任意一种，更优选为毁丝霉属（Myceliophthora）和曲霉属（Aspergillus），最优选为嗜热毁丝霉或黑曲霉。
进一步优选地，所述第（3）步所述分选，是每孔分选设定为单个至十个转化子，例如每孔分选设定为单个、双个或三个转化子；所述的深孔板是96深孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板；
更优选地，所述流式细胞仪检测步骤（2）获得的转化子直接分选至深孔板具体是将转化子的悬液经（例如≤70μm孔径白色细胞）筛网过滤后上流式细胞仪进行分析，通过调节优化FSC、SSC、FL1-log-Height参数正确区分再生萌发出芽且目的蛋白成功表达的转化子分选至装有液体培养基的高通量孔板中；
更优选地，所述选择性标记基因是指遗传转化过程中用来筛选转化子细胞的基因，更具体地，包括（但并不限于）：潮霉素抗性基因（hph）、氯嘧璜隆（sur）、G418抗性基因（neo）、草丁膦抗性基因（bar）；所述营养缺陷型基因是指指遗传转化过程中用来筛选转化子细胞的基因，更具体地，包括（但并不限于）：尿嘧啶缺陷基因（pyrG）、色氨酸缺陷基因（trp）、精氨酸营养缺陷型（argB）、组氨酸营养缺陷型（His）、amdS氮源营养筛选基因、niaD氮源营养筛选基因。
进一步地，所述转化还包括共同转化的荧光蛋白基因；对应地，第（4）步中还通过荧光显微镜观察发荧光来筛选转化子；优选地，所述荧光蛋白基因是绿色荧光蛋白GFP，第（4）步中还通过荧光显微镜观察发绿色荧光来筛选转化子；更进一步地，还通过菌落PCR鉴定目标基因的转化。
更具体地，第（1）步所述的转化是将包括2A肽介导的糖化酶TeglaA和绿色荧光蛋白GFP重组表达载体和CRISPR-Cas9介导的基因编辑系统；任选地，第（4）步还包括对转化子进行荧光显微镜观察GFP表达情况和菌落PCR鉴定目标基因的编辑效率。
本发明还提供一种提高生产糖化酶的工程改造丝状真菌，其特征在于，是用如权利要求1至5任一项所述的方法对丝状真菌进行工程改造获得，其中所述目标DNA编码糖化酶基因，通过工程改造提高了工程改造丝状真菌的糖化酶生产能力；
优选地，所述丝状真菌包括但不限于毁丝霉属（Myceliophthora）、曲霉属（Aspergillus）、梭孢壳霉属（Thielavia）、脉孢菌（Neurospora）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、或根霉属（Rhizopus）中的任意一种，更优选为毁丝霉属（Myceliophthora）和曲霉属（Aspergillus），最优选为嗜热毁丝霉和黑曲霉。
具体地，所述丝状真菌是嗜热毁丝霉，且工程改造包括用所述的TeglaA重组表达载体转化嗜热毁丝霉，并基于CRISPR-Cas9技术对嗜热毁丝霉基因组进行多轮编辑，以敲除蛋白酶Mtalp-1和Mtspr-14、碳分解代谢物阻遏效应因子Mtcre-1和F-box蛋白Mtexo-1；
所述丝状真菌是黑曲霉，且工程改造包括用TeglaA重组表达载体转化黑曲霉，同时基于CRISPR-Cas9技术对黑曲霉基因组进行编辑，以敲除碳分解代谢物阻遏效应转录因子AncreA和衔接蛋白亚基Anap3m。
本发明还提供所述的工程改造丝状真菌生产糖化酶的方法。具体地，在淀粉原料或淀粉诱导物存在下，培养所述的工程改造丝状真菌，从而水解淀粉。
与现有技术相比，本发明具有突出的有益效果：针对传统的丝状真菌菌株工程改造操作步骤的复杂繁琐，且费时耗力，难以进行高通量构建工程菌株的现实，本发明提供一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株工程改造的方法。本发明提供的菌株工程改造的技术方法解决了目前丝状真菌传统技术过程复杂繁琐、费时长、且需要大量人工操作的问题。本发明方法结合了基因遗传改造技术、流式细胞术分析分选法、深孔板培养和表型快速鉴定，对丝状真菌菌株改造提供了一种快速有效的方法。本发明方法基于流式细胞仪能够快速对转化后再生萌发的原生质体进行单细胞检测分析，构建了数量大的分析目标群体，流式细胞术直接分选转化子到深孔板培养，省去倒平板和平板生长培养及其后续挑取的繁琐耗时费力的过程，分选速度和筛选效率得以提高。此外，深孔板发酵培养避免了菌落生长产孢所需的较长时间和收集洗涤孢子的复杂人工步骤。相比较传统的平板准备、平板培养、转化子挑取、菌落产孢以及收集洗涤孢子后再发酵方法，菌株工程改造时间由原来的18−24天缩短到5−6天。因此，本发明的方法操作方便、省时省力，极大提高丝状真菌菌株工程改造的时间和效率，为高通量构建丝状真菌高产工程菌株提供一种便捷有效的方法。
进一步的，本发明方法成功应用到工业丝状真菌嗜热毁丝霉和黑曲霉中进行糖化酶高产菌株的构建，可在短时间内获得大量突变体菌株进行鉴定分析，从而快速分选出目的菌株，最终获得的糖化酶高产工程株MtYM6和AnLM3。其中六基因突变的重组菌株MtYM6，其蛋白产量比野生型高达~17.3倍，其糖化酶活力比野生型提高~25.1倍；三基因突变的重组菌株AnLY3，其蛋白产量比目前使用的工业菌株提高~1.2倍，其糖化酶活力提高~1.3倍，具有较大的应用价值。
附图说明
图1为一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株工程改造的方法示意图。
图2为嗜热毁丝霉原生质体在液体培养基中的再生萌发培养的显微镜分析，其中（A−D）为不添加选择压力培养0−12小时的原生质体形态，（E−F）为分别添加抗生素草丁膦（E）或G418（F）培养9小时后的原生质体形态观察。
图3为基于流式细胞术的免平板操作方法在嗜热毁丝霉中构建TeGlaA异源表达的重组菌株。其中（A）为通过基因遗传操作获得待筛选的转化子，（B）为流式细胞仪分析分选出单、双、三个转化子到深孔板，（C）在24深孔板上2%水溶性淀粉条件下发酵培养3天后的突变株。
图4为突变体在24深孔板筛选过程图。其中，（A）是发酵培养3天后上清的蛋白分泌浓度；（B）是重组菌株MtYM3分生孢子和菌丝表达绿色荧光蛋白情况，（C）是Western检测重组菌株分泌MhGlaA-9×His的结果图；（D）重组菌株MtYM3和野生菌株MtWT在2%水溶性淀粉条件下发酵上清的蛋白SDS-PAGE电泳分析图；（E）是发酵上清的蛋白浓度和糖化酶活力。
图5为流式细胞仪分选过程图。其中，（A）和（B）分选第二轮的转化子；（D）和（E）是第三轮编辑后转化子；（C）和（F）是突变体在24深孔板发酵培养3天后上清的蛋白分泌浓度；（G）是重组菌株MtYM4和MtYM6与野生菌株MtWT在淀粉条件下发酵上清的SDS-PAGE电泳分析图；（H）是蛋白分泌和糖化酶活力；（I）中RT-qPCR检测主要的淀粉酶基因和转录因子MtamyR的转录水平。
图6为基于流式细胞术的免平板操作方法在黑曲霉中构建糖化酶高产菌株。其中（A）为黑曲霉原生质体在液体培养基中培养0-18小时的显微镜分析，（B和C）为流式细胞仪分选，（D）为分选出的突变体在24深孔板发酵培养4天后上清的蛋白分泌浓度，（E）为重组菌株AnLM3分生孢子和菌丝表达绿色荧光蛋白情况，（F）为重组菌株AnLM3和出发菌株N1发酵上清的蛋白分泌和糖化酶活力。
图7为现有技术的菌株工程改造的方法示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，提供一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株工程改造的方法及其应用，如图1中B所示。下述实施例利用于表明本发明构建的方法可以快速、有效、省时省力的在嗜热毁丝霉和黑曲霉中构建高产糖化酶的重组菌株MtYM6和AnLM3，如图5和图6所示，能够极显著提升糖化酶生产能力，从而提供一种提高丝状真菌产糖化酶生产能力的菌种工程改造方法。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例中所采用的原始出发菌株嗜热毁丝霉ATCC 42464购自美国模式培养物集存库（American type culture collection），实施例中所采用的黑曲霉出发菌株N1来源于山东隆科特酶制剂有限公司。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。其中，所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分浓度。所用引物和核酸测序均由由苏州金唯智生物科技有限公司GENEWIZ完成。其中，“MYCTH_……”为嗜热毁丝霉的基因位点编号，“An01g09210”、“An02g03830”为黑曲霉的基因位点编号。
下面进一步提供实施例来阐述本发明，其中给出了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于理解本发明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1、基于流式细胞术的免平板操作的丝状真菌菌株改造
1、嗜热毁丝霉原生质体在培养液中的再生与萌发的显微观察
将嗜热毁丝霉野生型菌株ATCC 42464原生质体放入添加了1mol/L山梨醇的MM液体培养基，置于35°C进行培养，选取不同培养时间如0、6、9、12小时进行显微观察。结果如图2所示，在没有选择压力培养9小时后，原生质体再生和萌发成不超过70 μm的短菌丝体，可用于后续流式细胞仪分选；而原生质体在添加了抗生素的培养液中没有观察到萌发。
MM培养基：50×Vogel’s 盐20 mL，蔗糖20 g，琼脂15 g，定容体积到1 L，高压灭菌。50×Vogel’s 盐（1 L）：柠檬酸三钠（1/2H2O）150 g，无水KH2PO4 250 g，无水NH4NO3 100g，MgSO4·7H2O 10 g，CaCl2·2H2O 5 g，微量元素盐溶液5 mL，生物素（0.1 mg/mL）2.5 mL，定容体积到1 L。
2、通过2A肽介导的共表达策略和CRISPR-Cas9编辑系统对目的丝状真菌进行遗传改造
A. 2A肽介导的糖化酶TeGlaA重组表达载体的构建
以质粒pAN52-MhGlaA（Li, F., Liu, Q., Li, X., Zhang, C., Li, J., Sun,W., et al. (2020) Construction of a new thermophilic fungus Myceliophthora thermophila platform for enzyme production using a versatile 2A peptidestrategy combined with efficient CRISPR-Cas9 system. Biotechnology letters42: 1181-1191.）为骨架构建表达载体。将来源于埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）的糖化酶基因TeglaA替换MhGlaA，构建为融合蛋白的表达盒MtPtef1-TeglaA-2A-GFP-TtrpC。再将嗜热毁丝霉翻译延伸因子TEF1A的启动子MtPtef1换成黑曲霉翻译延伸因子TEF1A的启动子AnPtef1，构建为在黑曲霉中重组表达TeglaA的融合蛋白表达盒AnPtef1-TeglaA-2A-GFP-TtrpC。
表达盒构建所需的PCR引物对为MtPtef1-F/MtPtef1-R，TeglaA-F/GFP-R和AnPtef1-F/AnPtef1-R，引物序列如表1所示，PCR反应体系为：5×phusion HF buffer 10 μL，10mM dNTPs 1μL，10mM引物-F和引物-R各2.0 μL，模板DNA 1 μL，Phusion DNApolymerase 0.5 μL，水33.5 μL。PCR反应条件为：先98 °C 30 s；然后98 °C 10 s，65 °C30 s，72 °C 1.5 min，35个循环；最后72 °C 10 min，4 °C 10 min。采用Gibson Assembly技术体系对上述PCR片段进行快速组装到由限制性内切酶Bgl II和BamH I双酶切的骨架质粒上，从而构建TeGlaA重组表达载体pAN52-MtPtef1-TeGlaA和pAN52-AnPtef1-TeGlaA（如图3A所示）。10 µg由限制性内切酶Hind III线型化重组表达载体，用于后续转化。
表1
| SEQ ID NO. | 引物 | 序列 |
| 1 | PMttef1-F1 | TGACTTGAAGTAATCTCTGCAGATCTTTAATTAACTCGAGTCTGGCCATGTTCCGCATCTATCTA |
| 2 | PMttef1-R1 | GAGCGCCAGCAACGAGGGACGCCATACTAGTTCTGAAGAACGAAACTGGCGACTTGCGCT |
| 3 | TeglaA-F | AGCGCAAGTCGCCAGTTTCGTTCTTCAGAACTAGTATGGCGTCCCTCGTTGCTGGCGCTC |
| 4 | GFP-R | GCTGTTTGATGATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCCCTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA |
| 5 | PAntef1-F1 | TTGGCTGACTTGAAGTAATCTCTGCAGATCTTTCTGGTACGGTACCAAATCTTGAG |
| 6 | PAntef1-R1 | GAGCGCCAGCAACGAGGGACGCCATGATGACGGTTGTGAATGAACTCGAA |
| 7 | U6p-F | AGGATCGGTGGAGTGAAGTTCGGAA |
| 8 | U6p-Mtspr14-R | GCTCTAAAACAGCAGCACTGTGGAGGCTGCGAGGAAAGAAAGAAAAGAAGAG |
| 9 | U6p-AncreA-R | GCTCTAAAACTGTTGGAGTTCGACTGTGTACGAGGAAAGAAAGAAAAGAAGAG |
| 10 | U6p-Anap3m-R | GCTCTAAAACCTCATGATGGCGAAGGCAACGAGGAAAGAAAGAAAAGAAGAG |
| 11 | g-Mtspr14-F | TTCTTTCCTCGCAGCCTCCACAGTGCTGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA |
| 12 | g-AncreA-F | TTCTTTCCTCGTACACAGTCGAACTCCAACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA |
| 13 | g-Anap3m-F | TTCTTTCCTCGTTGCCTTCGCCATCATGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA |
| 14 | gRNA-R | AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT |
| 15 | Mtspr14-5-F | ACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCAGCGGCGATCTGCCGCTAATCATCCGAT |
| 16 | Mtspr14-5-R | GCTCCTTCAATATCAGTTAACGTCGTCATCGCGGACGTAGTTCAGACAAT |
| 17 | bar-Mtspr14-F | ATTGTCTGAACTACGTCCGCGATGACGACGTTAACTGATATTGAAGGAGC |
| 18 | bar-Mtspr14-R | ATCGGCGCCCTTGACGACATGGTCCTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGACC |
| 19 | Mtspr14-3-F | GGTCCTGCCCGTCACCGAGATTTGAGGACCATGTCGTCAAGGGCGCCGAT |
| 20 | Mtspr14-3-R | CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGATAGCCACCCTCTCCGCAAGCCAT |
| 21 | Anap3m-5-F | CACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTGGGCCACGGATCATTTTTCCTAAG |
| 22 | Anap3m-5-R | AATTCCAGGGCAAGCAGCGGTTCCGTTAGATGGCGAAGGCAACCTATCCCGACCGGTG |
| 23 | Anap3m-3-F | CACCGGTCGGGATAGGTTGCCTTCGCCATCTAACGGAACCGCTGCTTGCCCTGGAATT |
| 24 | Anap3m-3-R | CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGATCGGGACGCTCACCACAACCTCT |
| 25 | AncreA-5-F | CACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTTCGCGTTCCCATTCTGCTCTCCGA |
| 26 | AncreA-5-R | AATGCTCCTTCAATATCATCTTCTGTTCGACTGTGTACTGGACGGAGTAG |
| 27 | hph-AncreA-F | CTACTCCGTCCAGTACACAGTCGAACAGAAGATGATATTGAAGGAGCATT |
| 28 | hph-AncreA-R | TGTTGCTGCGCCTCGAGTTAGGGTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG |
| 29 | AncreA-3-F | CACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAACCCTAACTCGAGGCGCAGCAACA |
| 30 | AncreA-3-R | CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGTGGAGCGACAAATGACGGATAGA |
| 31 | Mtactin-RT-F | AACGCTCCTGCCTTCTAC |
| 32 | Mtactin-RT-R | GTAACACCATCACCAGAGTC |
| 33 | MtamyR-RT-F | CACCGTTGCGTCGTATCTTC |
| 34 | MtamyR-RT-R | GTAGTCACCACCACCAGAGG |
| 35 | 72393-RT-F | GAGACCGAGACGCCTATC |
| 36 | 72393-RT-R | AGTCCAGGTGTAGAAGTAGTC |
| 37 | 2300079-RT-F | CTCCAACAACCAGCACTTG |
| 38 | 2300079-RT-R | AGCCATTCCGAGCCATTG |
B. 靶标基因的sgRNA表达框载体及其同源供体DNA载体的构建
通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因Mtspr-14、Anap3m和AncreA的靶标位点。采用融合PCR的方法将U6p启动子、靶标位点及sgRNA骨架连接在一起，采用基因重叠延伸（SOE）方法构建sgRNA表达框载体MtU6p-Mtspr-14-sgRNA、AnU6p-Anap3m-sgRNA和AnU6p-AncreA-sgRNA。其所需引物序列如表1中所示。PCR反应体系为：5×phusion HF 缓冲液 10μL，10mM dNTPs 1μL，上游/下游引物 2.5μL，模板DNA 1μL，Phusion DNA聚合酶 0.5μL，ddH2O 32.5μL。PCR反应条件为：先98℃ 30s；然后98℃ 10s，65℃ 30s，72℃ 1min，34个循环；最后72℃ 10min，4℃ 10min。
本实施例中同源供体DNA片段分别由目标基因Mtspr-14、AncreA、Anap3m上游和下游同源片段，遗传霉素（G418）抗性基因表达框PtrpC-neo片段、潮霉素（hygromycin）抗性基因表达框PtrpC-neo片段、或者终止密码子TAA。通过Gibson Assembly的方法连接到由限制性内切酶BamH I和Hind III线性化的质粒pUC118中，构建供体DNA片段donor-Mtspr-14、donor-AncreA、donor-Anap3m，其所需的PCR引物序列如表1所示。
其它靶标基因的sgRNA及同源供体DNA表达载体如CRISPR-Cas9编辑元件所示（LiuQ, Zhang Y, Li F, Li J, Sun W, Tian C: Upgrading of efficient and scalableCRISPR-Cas-mediated technology for genetic engineering in thermophilic fungusMyceliophthora thermophila. Biotechnol Biofuels 2019, 12:293.）。
C. 嗜热毁丝霉原生质体转化
将成熟的毁丝霉孢子，用0.05%吐温-80灭菌水收集，经擦镜纸过滤出去菌丝后，涂布于铺有玻璃纸的MM平板，45℃培养16 h。将带有菌丝的玻璃纸放置于30 mL裂解液（配方：0.15 g裂解酶，无菌操作加入30 mL溶液A，过滤除菌；溶液A：1.0361 g 磷酸二氢钾，21.864g山梨醇，溶于90 mL去离子水，氢氧化钾调pH到5.6，定量至100 mL，高温灭菌）中，30 °C裂解2 h，每隔20 min轻轻摇动。而后经过玻璃纸过滤后，2000 rpm 4 °C 离心10 min，弃上清，加入4 mL溶液B（0.735 g氯化钙，18.22 g山梨醇，1mL Tris-HCl 1 M pH 7.5，溶于90mL去离子水，盐酸调pH到7.6，定量至100 mL，高温灭菌），2000 rpm 4 °C 离心10 min；弃上清，按200 μL/质粒加入一定体积溶液B。预冷的15 mL离心管，依次加入50 μL 预冷PEG（12.5 g PEG 6000，0.368 g氯化钙，500 μL Tris HCl 1M pH 7.5），将转化的DNA片段加入200 μL原生质体。放置冰上20 min后加入2 mL预冷PEG，室温5 min，加入4 mL溶液B，轻轻混匀。取3 mL上述溶液加入12 mL融化的含相应抗生素且添加了1mol/L山梨醇的MM液体培养基，置于35℃再生和萌发培养9小时，萌发后形成不超过70 μm的短菌丝体，所用的流式细胞仪最大的检测范围是70 μm，待后续分选（如图3中A所示）。
3、通过流式细胞仪直接分选转化子到深孔板中
将待分选的转化子进行4000 rpm 4 °C 离心10 min，弃上清，加入3 mL 0.05%吐温80溶液。将重悬的转化子悬液进行70μm孔径白色细胞筛网过滤后上流式细胞仪（MoFlo™XDP）分析。根据绿色荧光蛋白发射荧光选择FL1通道检测，通过调节优化FSC、SSC、FL1-log-Height参数正确区分再生萌发出芽且带有荧光的转化子区域，将带有荧光区域且生长萌发出芽的最集中部分设计为门，分选至装有液体培养基的高通量孔板中。用Summit 5.2软件分析，FL1通道（528/29 nm）进行检测，荧光通道电压为500，以FSC-Width为横坐标、FSC-Height为纵坐标，将再生萌发呈短菌丝最集中的部分设定为门，同时以FL1-Log-Height为横坐标、SSC-Log-Height为纵坐标，将带有荧光最集中的部分设定为门，通过这2个门的设定将带有荧光且生长萌发出芽的短菌丝的转化子分选到准备好的24深孔板中，进行2%可溶性淀粉培养发酵（如图3中B所示）。每孔分选设定为单个、双个或三个转化子，每孔中装有发酵培养液4 mL，发酵转速为700 rpm，发酵温度为45度。
4、深孔板发酵培养3天后进行快速的表型鉴定
深孔板发酵培养3天后共获得79个转化子（如图3中A所示），吸取孔板中培养液10000 rpm 4 °C 离心10 min后，取上清液使用伯乐Bradford蛋白快速测试试剂盒检测其蛋白浓度，分析比较这些转化子分泌的蛋白含量。结果如图4中A所示，与野生型相比，55株突变体的蛋白产量都有显著的提高（≥ 1.5倍），其中14株突变体的蛋白产量显著提高了2倍，获得了6个三基因突变重组菌株MtYM3（OE-TeglaAΔMtalp-1）。
以上所述结果表明，本发明成功构建了一种基于流式细胞术的免平板操作的丝状真菌菌株改造的方法，并将其成功应用到嗜热毁丝霉糖化酶的生产中。
实施例2、嗜热毁丝霉生产糖化酶重组菌株MtYM3表型分析
1、重组菌株在淀粉诱导培养基中培养
将实施例1获得的这6株重组菌株MtYM3和野生型菌株MtWT进行诱导产糖化酶培养。诱导培养条件为：在2％（2 g/100mL）水溶性淀粉培养基（配方：50× Vogel’s盐2 mL，水溶性淀粉2 g，酵母提取物0.75 g，定容体积到100 mL，高压灭菌）上45 °C 150 rpm培养4d。培养2 d后，收集菌丝进行荧光显微镜观察。培养4d后样品离心取上清液，进行Westernblot、SDS-PAGE电泳分析、蛋白浓度、糖化酶活力的测定。
2、融合蛋白TeGlaA-9×His-2A-eGFP的检测
对重组菌株MtYM3进行荧光显微观察其分生孢子和菌丝体表达GFP情况，结果如图4B所示，发现重组菌株的孢子和菌丝都具有强烈的绿色荧光。培养4d后上清液进行Westernblot和SDS-PAGE电泳分析检测重组蛋白TeGlaA-9×His，所用一抗为His-Tag兔单克隆抗体，二抗为兔抗IgG HRP抗体。结果如图4中C和D所示，重组蛋白TeGlaA-9×His成功表达分泌，大小约65 kD，且分子大小与预期结果一致，表明融合蛋白TeGlaA-9×His-2A-eGFP已经成功在重组菌株中表达。
3、分泌蛋白的浓度和糖化酶活力的测定
分泌蛋白的浓度测定：使用伯乐Bradford蛋白快速测试试剂盒检测上清中的蛋白浓度。
糖化酶活力测定：将粗酶液用0.05 M pH 4.8醋酸钠缓冲液稀释适宜的倍数，终体积为0.25 mL，放入50 °C水浴锅内预热，取出，加入50 °C水浴锅内预热后的0.25 mL 1%可溶性淀粉（Difco）底物溶液，混匀，50 °C反应10 min，用0.5 mLDNS溶液终止反应，煮沸10min，至冰上冷却，加蒸馈水定容至2.5 mL，上下摇匀，释放的葡萄糖的量用DNS的方法测定，在波长540 nm下，测定OD值，空白组使用灭活的酶液作对照。糖化酶活力定义：1mL酶液在50°C、pH 4.8的条件下，每min水解可溶性淀粉产生1 μmol葡萄糖的酶量，即为一个酶活力单位（U）。
结果如图4中E所示，与野生型相比，水溶性淀粉生长条件下，重组菌株MtYM3的蛋白分泌水平和糖化酶活力有非常显著的提高，其蛋白产量和酶活力比野生型提高~3.5和~4.1倍。
实施例3、基于免平板操作的技术系统构建嗜热毁丝霉高产糖化酶TeGlaA工程菌株
1、结合CRISPR-Cas9介导的多轮编辑系统通过免平板操作的技术构建高产菌株
通过免平板操作的技术对上述获得的嗜热毁丝霉重组菌株MtYM3进行基因工程的改造，利用CRISPR-Cas9编辑技术介导的多轮编辑系统，对MtYM3实施连续两轮的编辑，敲除重组菌株基因组中的Mtspr-14、neo、bar、Mtcre-1和Mtexo-1基因。将上述靶标基因CRISPR-Cas9编辑元件共转化进入MtYM3原生质体细胞后，原生质体转化步骤与上述实施例一相应方法一致。Cas9在sgRNA介导下，通过protospacer与宿主细胞基因组上的目标基因的DNA链配对来识别靶标位点进行切割，随后供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，通过在液体培养基中加入PPT或G418对转化后的原生质体进行筛选培养。培养9小时后通过流式细胞仪直接分选转化子到24深孔板中进行发酵培养，分选步骤与上述实施例一相应方法一致。
2、嗜热毁丝霉高产糖化酶重组菌株的表型分析
如图5中A−C所示，第二轮编辑深孔板发酵培养3天后共获得89个转化子，通过测定培养上清液中的蛋白浓度比较这些转化子分泌水平，与出发菌株MtYM3相比，33株转化子的蛋白产量都显著提高了1.5倍，获得了20株四基因突变菌株MtYM4（OE-TeglaAΔMtalp-1∆Mtspr-14∆neo）。对重组菌株MtYM4开展了第三轮编辑，通过流式细胞仪分选到24深孔板中进行发酵培养得到了97个转化子（如图5中D−F所示），与出发菌株MtYM4相比，46株转化子的蛋白产量都显著提高了2.0倍，获得了10株六基因突变菌株MtYM6（OE-TeglaAΔMtalp-1∆Mtspr-14∆neoΔMtcre-1ΔMtexo-1Δbar）。
将连续三轮编辑获得重组菌株MtYM3、MtYM4和MtYM6以及野生型菌株MtWT进行诱导产糖化酶培养。诱导培养条件与上述实施例二相应方法一致。培养5d后样品离心取上清液，进行SDS-PAGE电泳分析、蛋白浓度、糖化酶活力的测定。分泌蛋白的浓度测定和糖化酶活力测定同与上述实施例二中相应方法一致。结果如图5中G和H所示，与野生型相比，水溶性淀粉生长条件下，所有重组菌株的蛋白产量都有非常显著的提高，特别是MtYM6重组菌株，其蛋白产量比野生型高达~17.3倍，糖化酶的酶活力比野生型显著提高~25.1倍。
3、糖化酶高产菌株关键淀粉酶基因和转录因子的表达模式分析
将重组菌株MtYM6和野生型菌株MtWT分别接种于液体MM培养基中进行45 °C振荡培养，摇床转速150rpm，培养16 h后收集菌丝体，用无菌水洗涤三次，再将菌丝体转移到2%可溶性淀粉进行诱导培养4 h，然后抽滤得到菌丝，提取RNA检测主要的2个淀粉酶基因（Mycth_72393和Mycth_2300079）以及调控因子MtamyR表达水平。
RNA提取方法：用液氮迅速研磨菌丝样品，研磨好之后转移到螺帽管中。使用MiniBead Beater最大转速振荡30s，重复两次。放在摇床上，室温下温和摇动5min，以去除核小体。向其中加入200μL的氯仿，使用Mini Bead Beater最大转速振荡15s。将离心管放到摇床上，温和摇动2min，4℃，12000×g，离心15min，取出上清液到新的无RNA酶的1.5mL离心管里。向该离心管中加入500μL的异丙醇，混匀以后，室温下温和的摇动10min，4℃，12000×g，离心10min以后，将上清液倒掉。用1mL 75％的酒精洗涤沉淀，4℃，10000×g，离心5min后弃上清，室温放置10min左右，用来去除残余的乙醇。加入50μL DEPC水溶解RNA。所得样品使用商用RNeasy Mini Kit试剂盒进行纯化。纯化后的RNA使用ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO）进行反转录。
RT-qPCR方法：选用Mtactin基因作为内参基因，反应体系按照SYBR GreenRealtime PCRMaster Mix说明书进行操作，以野生型菌株相应的基因表达丰度为对照，所用引物如表1所示。
结果如图5中I所示，在六基因重组菌株MtYM6中，2个关键的淀粉酶基因Mycth_ 72393和Mycth_2300079以及淀粉酶关键调控因子MtamyR转录水平呈现出极显著的上调。其中Mycth_72393和Mycth_2300079的转录水平分别上调了51倍和37倍。
以上所述结果表明，本发明成功连续应用所构建的免平板操作的菌株改造的方法到嗜热毁丝霉糖化酶的生产中，并最终获得了糖化酶生产显著提高的工程菌株MtYM6。
实施例4、基于流式细胞术的免平板操作技术系统在黑曲霉生产糖化酶中的应用
1、显微观察黑曲霉原生质体再生萌发的情况
将黑曲霉工业菌株N1原生质体放入添加了1mol/L山梨醇的MM液体培养基，置于30°C进行再生培养，选取0、12、18小时不同培养时间段进行显微观察。结果如图6中A所示，在没有选择压力培养18小时后，原生质体再生和萌发成不超过70 μm的短菌丝体，可用于后续流式细胞仪分选。
2、对黑曲霉菌株N1进行菌株遗传改造和流式细胞仪检测分选
利用CRISPR-Cas9系统和2A肽共表达对黑曲霉菌株N1基因组进行遗传改造。通过CRISPR-Cas9编辑技术，对黑曲霉菌株N1进行敲除，敲除N1菌株基因组中的Anap3m和AncreA基因。将上述靶标基因CRISPR-Cas9编辑元件和线型化的重组表达载体pAN52-AnPtef1-TeGlaA共转化进入菌株N1原生质体细胞后，原生质体转化步骤与上述实施例一相应方法一致。培养18小时后通过流式细胞仪直接分选转化子到24深孔板中进行发酵培养，每孔中装有发酵培养液4 mL，发酵转速为700 rpm，发酵温度为30度（如图6中B和C所示），分选步骤与上述实施例一相应方法一致。黑曲霉发酵培养配方：3 % 豆粕分，3 % 玉米浆，10 % 葡萄糖，高压灭菌。
3、黑曲霉生产糖化酶工程菌株的生物学表型分析
如图6中C所示，24深孔板发酵培养4天后共获得52个转化子，吸取孔板中培养液10000 rpm 4 °C 离心10 min后，取上清液使用伯乐Bradford蛋白快速测试试剂盒检测其蛋白浓度，分析这些转化子分泌的蛋白含量。与出发菌株N1相比，18株突变体的蛋白产量都有显著的提高（≥ 1.2倍），其获得了5株三基因突变重组菌株AnLM3（E-TeglaA-gfpΔAnap3mΔAncreA）。
将重组菌株AnLM3和出发菌株N1进行摇瓶液体发酵的复筛验证，诱导培养条件为：在发酵培养基（配方：3 % 豆粕分，3 % 玉米浆，10 % 葡萄糖，定容体积到50 mL，高压灭菌）上30 °C 250 rpm培养。培养2 d后，收集菌丝进行荧光显微镜观察。培养6 d后样品离心取上清液，进行分泌蛋白浓度和糖化酶活力的测定。蛋白浓度测定和糖化酶活力测定同与上述实施例二中相应方法一致。显微观察结果突变菌株的GFP表达情况，如图6中E所示，发现重组菌株AnLM3的孢子和菌丝都具有强烈的绿色荧光。与出发菌株N1相比，重组菌株AnLM3的蛋白分泌水平和糖化酶活力有显著的提高，其蛋白产量和酶活力比宿主菌株N1分别提高~1.2和~1.3倍（如图6中F所示）。
以上所述结果表明，本发明构建的一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株改造的方法能够成功应用到工业菌种黑曲霉生产糖化酶中，能够短时间能有效提升糖化酶的产量，具有较高的应用价值。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用
<130>
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TGACTTGAAGTAATCTCTGCAGATCTTTAATTAACTCGAGTCTGGCCATGTTCCGCATCTATCTA 65
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GAGCGCCAGCAACGAGGGACGCCATACTAGTTCTGAAGAACGAAACTGGCGACTTGCGCT 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
AGCGCAAGTCGCCAGTTTCGTTCTTCAGAACTAGTATGGCGTCCCTCGTTGCTGGCGCTC 60
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GCTGTTTGATGATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCCCTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA 66
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TTGGCTGACTTGAAGTAATCTCTGCAGATCTTTCTGGTACGGTACCAAATCTTGAG 56
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
GAGCGCCAGCAACGAGGGACGCCATGATGACGGTTGTGAATGAACTCGAA 50
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
AGGATCGGTGGAGTGAAGTTCGGAA 25
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
GCTCTAAAACAGCAGCACTGTGGAGGCTGCGAGGAAAGAAAGAAAAGAAGAG 52
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
GCTCTAAAACTGTTGGAGTTCGACTGTGTACGAGGAAAGAAAGAAAAGAAGAG 53
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
GCTCTAAAACCTCATGATGGCGAAGGCAACGAGGAAAGAAAGAAAAGAAGAG 52
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
TTCTTTCCTCGCAGCCTCCACAGTGCTGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA 52
<210> 12
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
TTCTTTCCTCGTACACAGTCGAACTCCAACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA 53
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
TTCTTTCCTCGTTGCCTTCGCCATCATGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA 52
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT 27
<210> 15
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCAGCGGCGATCTGCCGCTAATCATCCGAT 61
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
GCTCCTTCAATATCAGTTAACGTCGTCATCGCGGACGTAGTTCAGACAAT 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ATTGTCTGAACTACGTCCGCGATGACGACGTTAACTGATATTGAAGGAGC 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ATCGGCGCCCTTGACGACATGGTCCTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGACC 50
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
GGTCCTGCCCGTCACCGAGATTTGAGGACCATGTCGTCAAGGGCGCCGAT 50
<210> 20
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGATAGCCACCCTCTCCGCAAGCCAT 58
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
CACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTGGGCCACGGATCATTTTTCCTAAG 59
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
AATTCCAGGGCAAGCAGCGGTTCCGTTAGATGGCGAAGGCAACCTATCCCGACCGGTG 58
<210> 23
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
CACCGGTCGGGATAGGTTGCCTTCGCCATCTAACGGAACCGCTGCTTGCCCTGGAATT 58
<210> 24
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGATCGGGACGCTCACCACAACCTCT 58
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
CACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTTCGCGTTCCCATTCTGCTCTCCGA 59
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
AATGCTCCTTCAATATCATCTTCTGTTCGACTGTGTACTGGACGGAGTAG 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
CTACTCCGTCCAGTACACAGTCGAACAGAAGATGATATTGAAGGAGCATT 50
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
TGTTGCTGCGCCTCGAGTTAGGGTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG 50
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
CACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAACCCTAACTCGAGGCGCAGCAACA 50
<210> 30
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGTGGAGCGACAAATGACGGATAGA 58
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
AACGCTCCTGCCTTCTAC 18
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
GTAACACCATCACCAGAGTC 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
CACCGTTGCGTCGTATCTTC 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
GTAGTCACCACCACCAGAGG 20
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
GAGACCGAGACGCCTATC 18
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
AGTCCAGGTGTAGAAGTAGTC 21
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
CTCCAACAACCAGCACTTG 19
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
AGCCATTCCGAGCCATTG 18
Claims (9)
1.一种基于流式细胞术的免平板操作的丝状真菌工程改造的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将带有筛选标记，例如选择性标记基因或者带有营养缺陷型基因，和目标DNA序列的转化进入目的真菌原生质体基因组中；
（2）转化后获得的原生质体在含相应于所述选择性标记基因的选择性物质的培养液中进行再生和萌发培养，所述再生和萌发培养是指培养至用于后续筛选的短菌丝形态的转化子，优选地所述短菌丝形态是指不超过70 μm的短菌丝体，具体地培养8-16小时的短菌丝形态的转化子；
（3）利用流式细胞仪检测步骤（2）获得的转化子直接分选至孔板中进行发酵培养，优选地，所述孔板是具有高通量筛选作用的培养器皿；
（4）分析检测步骤（3）中分选到孔板发酵培养的转化子，离心后取出孔板中上清液进行蛋白测定，比较分泌目标蛋白的相对高低，得到基因工程成功改造的突变菌株；
任选地，还包括下述步骤：
（5）选取上一步得到的突变菌株进行摇瓶复筛，并对选取目标蛋白产量高的突变菌株用步骤（1−4）所述的方法再次进行工程改造。
2.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述丝状真菌包括但不限于毁丝霉属（Myceliophthora）、曲霉属（Aspergillus）、梭孢壳霉属（Thielavia）、脉孢菌（Neurospora）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、或根霉属（Rhizopus）中的任意一种，更优选为毁丝霉属（Myceliophthora）和曲霉属（Aspergillus），最优选为嗜热毁丝霉或黑曲霉。
3.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述第（3）步所述分选，是每孔分选设定为单个至十个转化子，例如每孔分选设定为单个、双个或三个转化子；所述的深孔板是96深孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板；
优选地，所述流式细胞仪检测步骤（2）获得的转化子直接分选至深孔板具体是将转化子的悬液经（例如≤70μm孔径白色细胞）筛网过滤后上流式细胞仪进行分析，通过调节优化FSC、SSC、FL1-log-Height参数正确区分再生萌发出芽且目的蛋白成功表达的转化子分选至装有液体培养基的高通量孔板中；
优选地，所述选择性标记基因是指遗传转化过程中用来筛选转化子细胞的基因，更具体地，包括（但并不限于）：潮霉素抗性基因（hph）、氯嘧璜隆（sur）、G418抗性基因（neo）、草丁膦抗性基因（bar）；所述营养缺陷型基因是指指遗传转化过程中用来筛选转化子细胞的基因，更具体地，包括（但并不限于）：尿嘧啶缺陷基因（pyrG）、色氨酸缺陷基因（trp）、精氨酸营养缺陷型（argB）、组氨酸营养缺陷型（His）、amdS氮源营养筛选基因、niaD氮源营养筛选基因。
4.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述转化还包括共同转化的荧光蛋白基因；对应地，第（4）步中还通过荧光显微镜观察发荧光来筛选转化子；优选地，所述荧光蛋白基因是绿色荧光蛋白GFP，第（4）步中还通过荧光显微镜观察发绿色荧光来筛选转化子；更进一步地，还通过菌落PCR鉴定目标基因的转化。
5.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，第（1）步所述的转化是将包括2A肽介导的糖化酶TeglaA和绿色荧光蛋白GFP重组表达载体和CRISPR-Cas9介导的基因编辑系统；任选地，第（4）步还包括对转化子进行荧光显微镜观察GFP表达情况和菌落PCR鉴定目标基因的编辑效率。
6.一种提高生产糖化酶的工程改造丝状真菌，其特征在于，是用如权利要求1至5任一项所述的方法对丝状真菌进行工程改造获得，其中所述目标DNA编码糖化酶基因，通过工程改造提高了工程改造丝状真菌的糖化酶生产能力；
优选地，所述丝状真菌包括但不限于毁丝霉属（Myceliophthora）、曲霉属（Aspergillus）、梭孢壳霉属（Thielavia）、脉孢菌（Neurospora）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、或根霉属（Rhizopus）中的任意一种，更优选为毁丝霉属（Myceliophthora）和曲霉属（Aspergillus），最优选为嗜热毁丝霉和黑曲霉。
7.如权利要求6所述的工程改造丝状真菌，其特征在于，所述丝状真菌是嗜热毁丝霉，且工程改造包括用所述的TeglaA重组表达载体转化嗜热毁丝霉，并基于CRISPR-Cas9技术对嗜热毁丝霉基因组进行多轮编辑，以敲除蛋白酶Mtalp-1和Mtspr-14、碳分解代谢物阻遏效应因子Mtcre-1和F-box蛋白Mtexo-1；
所述丝状真菌是黑曲霉，且工程改造包括用TeglaA重组表达载体转化黑曲霉，同时基于CRISPR-Cas9技术对黑曲霉基因组进行编辑，以敲除碳分解代谢物阻遏效应转录因子AncreA和衔接蛋白亚基Anap3m。
8.通过如权利要求6至7任一项所述的工程改造丝状真菌生产糖化酶的方法。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在淀粉原料或淀粉诱导物存在下，培养权利要求6至7任一项所述的工程改造丝状真菌，从而水解淀粉。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111352181.0A CN116135979A (zh) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111352181.0A CN116135979A (zh) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116135979A true CN116135979A (zh) | 2023-05-19 |
Family
ID=86332474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111352181.0A Pending CN116135979A (zh) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116135979A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0215594A2 (en) * | 1985-08-29 | 1987-03-25 | Genencor International, Inc. | Heterologous polypeptide expressed in filamentous fungi, processes for their preparation, and vectors for their preparation |
| WO2001025468A1 (en) * | 1999-10-06 | 2001-04-12 | Mark Aaron Emalfarb | High-throughput screening of expressed dna libraries in filamentous fungi |
| US20120030839A1 (en) * | 2006-12-10 | 2012-02-02 | Dyadic International, Inc. | Expression and High-Throughput Screening of Complex Expressed DNA Libraries in Filamentous Fungi |
| CN105463009A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-06 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法 |
| CN107384813A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-24 | 王枫枫 | 一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用 |
| CN110760537A (zh) * | 2018-07-27 | 2020-02-07 | 中国农业科学院饲料研究所 | 用于快速筛选重组菌株的重组表达载体及应用 |
| CN111378674A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-07-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 异宗毁丝霉糖化酶MhglaA及其编码基因和在葡萄糖生产中的应用 |
-
2021
- 2021-11-16 CN CN202111352181.0A patent/CN116135979A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0215594A2 (en) * | 1985-08-29 | 1987-03-25 | Genencor International, Inc. | Heterologous polypeptide expressed in filamentous fungi, processes for their preparation, and vectors for their preparation |
| WO2001025468A1 (en) * | 1999-10-06 | 2001-04-12 | Mark Aaron Emalfarb | High-throughput screening of expressed dna libraries in filamentous fungi |
| US20120030839A1 (en) * | 2006-12-10 | 2012-02-02 | Dyadic International, Inc. | Expression and High-Throughput Screening of Complex Expressed DNA Libraries in Filamentous Fungi |
| CN105463009A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-06 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法 |
| CN107384813A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-24 | 王枫枫 | 一种可用于蛋白质生产的黑曲霉菌株及其应用 |
| CN110760537A (zh) * | 2018-07-27 | 2020-02-07 | 中国农业科学院饲料研究所 | 用于快速筛选重组菌株的重组表达载体及应用 |
| CN111378674A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-07-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 异宗毁丝霉糖化酶MhglaA及其编码基因和在葡萄糖生产中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BJARNE R NIELSEN等: "Cloning, heterologous expression, and enzymatic characterization of a thermostable glucoamylase from Talaromyces emersonii", PROTEIN EXPR PURIF., vol. 26, no. 1, 18 September 2002 (2002-09-18) * |
| 李少平, 牛云彤: "丝状真菌的药物敏感性测定研究进展", 国外医学.临床生物化学与检验学分册, no. 05, 25 September 2004 (2004-09-25) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7334997B2 (ja) | 高酵素活性のセルラーゼ高分泌発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法 | |
| US20160289690A1 (en) | Mortierella alpina recombinant gene expression system and construction method and use thereof | |
| Liang et al. | A high efficiency gene disruption strategy using a positive–negative split selection marker and electroporation for Fusarium oxysporum | |
| Han et al. | An efficient Agrobacterium-mediated transformation method for aflatoxin generation fungus Aspergillus flavus | |
| CN110760465B (zh) | 一株高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| Yang et al. | Development of a flow cytometry-based plating-free system for strain engineering in industrial fungi | |
| Kuo et al. | A reliable transformation method and heterologous expression of β-glucuronidase in Lentinula edodes | |
| Wang et al. | Optimization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method of oleaginous filamentous fungus Mortierella alpina on co-cultivation materials choice | |
| CN112226437B (zh) | 梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合及应用 | |
| CN111944706B (zh) | 一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用 | |
| WO2020253671A1 (zh) | 一种农杆菌介导的油菜黑胫病菌的遗传转化方法 | |
| US7973215B2 (en) | Method for the introduction of a heterologous polynucleotide into a mushroom | |
| US20130011876A1 (en) | Process for preparing filamentous fungal strains having a sexual cycle and a process for preparing sexually crossed filamentous fungal strains | |
| CN116135979A (zh) | 一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用 | |
| Vlaardingerbroek et al. | Fluorescence assisted selection of transformants (FAST): using flow cytometry to select fungal transformants | |
| CN110628788A (zh) | 紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法 | |
| CN110747221B (zh) | 一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用 | |
| Kiyohara et al. | Intergeneric hybridization between Monascus anka and Aspergillus oryzae by protoplast fusion | |
| CN111378674B (zh) | 异宗毁丝霉糖化酶MhglaA及其编码基因和在葡萄糖生产中的应用 | |
| CN108949579B (zh) | 嗜热子囊菌基因表达系统 | |
| KR20020059350A (ko) | 재조합 단백질 생산용 숙주로서 아스페르길루스 소재의 용도 | |
| CN110846266B (zh) | 一株生产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN115820746B (zh) | 激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用 | |
| JP7352929B2 (ja) | 固体培養時の糖質分解酵素生産能が高いアスペルギルス属菌株の作出方法 | |
| CN113943666B (zh) | 一种酿酒酵母工程菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |