KR20020059350A - 재조합 단백질 생산용 숙주로서 아스페르길루스 소재의 용도 - Google Patents

Abstract

선별 마커로서 도입된 아세트아미다제 S(amdS) 유전자를 포함하는 재조합 아스페르길루스 소재가 개시되어 있다. 우라실 및 플루오로-오로트산 함유 배지에서 성장하는 아스페르길루스 소재로서, 상기 아스페르길루스 소재는 또한 우리딘 및 플루오로-오로트산 함유 배지에서 성장하지 않는 것이며, 즉 상기 아스페르길루스 소재는 우라실 영양요구성이고, 상기 아스페르길루스 소재는 우리딘을 이용할 수 없으며, 상기 아스페르길루스 소재는 pyrG 음성이며, 플루오로-오로트산에 내성을 나타내고, 상기 우라실 영양요구성 및 상기 플루오로-오로트산 내성은 활성이 있는 도입된 pyrG 유전자로 보충될 때 경감되는 것이 특징인 아스페르길루스 소재가 개시되어 있다. 아스페르길루스 소재는 추가로 피타제 또는 피타제 활성을 갖는 단백질 또는 임의의 기타 이종 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 피타제 또는 상기 기타 이종 단백질 또는 폴리펩티드의 생물공학적 생산을 위해 사용될 수 있다. 수정된 형태구조를 나타내는 추가의 돌연변이체도 개시되어 있다. 이러한 발현 숙주를 생산하는 방법이 개시되어 있다.

Description

재조합 단백질 생산용 숙주로서 아스페르길루스 소재의 용도{USE OF ASPERGILLUS SOJAE AS HOST FOR RECOMBINANT PROTEIN PRODUCION}

과거, 형질전환용 숙주로서 아스페르길루스 소재의 사용이 제안되어 왔다. 그러나, 현재까지 성공적으로 이종 단백질이 형질전환 및/또는 생산된 데이터는 전혀 제공되지 않았으며, 더욱 구체적으로, 피타제의 발현에 대하여 전혀 밝혀진 바가 없다. 이전에, 발현 수준은, 주로 단백분해로 인해 아스페르길루스 소재 이외의 발현 숙주들에서 지극히 낮았다. 지금 본 발명자는 아스페르길루스 소재에서의 단백질 발현 수준이 기타 균주, 예컨대 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 아와모리 및 트리초데르마에서 동일한 단백질에 대해 수득한 수준을 초월한다는 것을 밝혔다. 밀접하게 관련된 균주에서 이러한 개선점을 발견한 것을 놀라운 것이다. 따라서, 피타제 생산에 관한 종래기술 문헌은 결점을 보인다. 이종 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는데 아스페르길루스 소재를 사용하는 것에 대한 종래 기술의 개시는 불충분하였다.

현재까지 A. 소재 형질전환에 대한 성공적인 시도가 거의 기록되지 않았다는 사실은, 과거에는 밀접하게 관련된 균주인 분류 집단 아스페르길루스 오리재의 형질전환이 다수 성공하였다는 사실의 관점에서 주목할 만하다. 이처럼 밀접한 관계에 기초하여, 당업자는 아스페르길루스 오리재에 대해 사용된 것과 유사한 방법이 아스페르길루스 소재 균주에도 적용가능하다고 예측하며, 사실상 이렇게 예측하였다.

예를들면, WO97/04108는 단백분해 효소 암호화 핵산 서열, 특히 류신 아미노펩티다제 암호화 서열을 분리하는 것과 다양한 숙주 유기체, 예컨대 아스페르길루스 소재를 류신 아미노펩티다제 암호화 서열로 형질전환하는 것에 대하여 기술하고있다. 그러나, 이렇게 특정된 형질전환이 실질적으로 수행되었다는 예시는 전혀 제공되지 않았다. 단순히, 트리초데르마 레에세이, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 포에티두스, 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 포에니시스 및 아스페르길루스 오리재 와 같은 다수의 기타 균주 중에서 형질전환에 사용될 수 있는 잠재적인 숙주로서 하나의 가능성으로 제시된 것에 불과하다. 인용된 문헌에서, 당업계에 용이하게 사용되는 3개의 형질전환 프로토콜이 상기 균주들에 대하여 제안되어 있다. 특히, 임의의 선별 마커 아세트아미다제 S(=amdS)(예, 벡터 p3SR2에서 유지됨), argB 또는 하이그로마이신 B(예, 벡터 pAN7-1을 사용함)가 여기에 기술된 형질전환 프로토콜에 따라 사용될 수 있는 적절한 마커로서 제안되어 있다.

amdS 마커를 갖는 벡터 p3SR2를 사용하는 것은 다양한 균주 예컨대, 아스페르길루스 오리재(EP 0.238.023), 트로초데르마 레에세이(EP 0.244.234) 및 아스페르길루스 니거(EMBO 저널 4, p475-479)를 형질전환하는데 유용한 것이라고 문헌에 기재되어 있다. 결국, 통상 아스페르길루스를 형질전환하기 위한 유사한 사용은 이전의 이들 공개문헌에 기초하여 WO97/04108에서 진전되었다.

특히 WO97/04108의 제17쪽에는, 형질전환 이전에 질소 공급원으로써 오직 기질 아세트아미드 만을 포함하는 최소 배지 상에서 천천이 성장시킨 아스페르길루스 및 트리초데르마가 투명한 성장(clear growth)의 잇점으로 인해 벡터 p3SR2로 형질전환된 이후 선별될 수 있다고 기재되어 있다. 이어서, 이렇게 수득된 형질전환체는 원하는 형질전환체를 찾기 위해 류신 아미노펩티다제(=LAP) 생산성에 대해 더선별하여야 할 필요가 있다. 상기 언급한 바와 같이, 이것은 단순히 아스페르길루스 소재 이외의 균주의 몇몇 성공적인 형질전환에 기초하여 토토(toto)에서 전술한 두개의 속(genus)에 걸쳐 적용가능한 형질전환의 이론적인 방법으로써 표면화된 것이다.

그러나, 제안된 형질전환 프로토콜은 아스페르길루스 소재에 대해서는 실패하였다. 종래기술에 기재된 선별 기준은 벡터 p3SR2를 사용할 때 바람직한 형질전환체의 실질적인 선별을 확인하는데 불충분하다. 본 발명자는 실험에 의해 기재된 방법이 실질적인 선별가능성을 제거하는 과도한 백그라운드 성장으로 인해 실시불가능하다는 것을 발견하였다.

균류 형질전환체에 대하여 일상적으로 사용되는 다른 선별 방법은 오로티딘-5-모노포스페이트 데카르복실라제(=PyrG) 돌연변이체의 형질전환에 대한 것이다. Mattenrn 등의 문헌[Mol. Gen. Genet. 210, p460-461]은 아스페르길루스 니거 pyrG 유전자를 사용하여 아스페르길루스 오리재를 형질전환하는 것을 기재하고 있다. 표준 절차는 양성 선별 마커로서 플루오로-오로트산에 대한 직접적인 내성에 기초하여 pyrG 돌연변이체를 분리하는 것이다. 이 결과 현재까지 다양한 균류에 대한 다수의 pyrG 돌연변이체를 분리하였다.

다수의 상이한 사상균으로 실험한 결과, 영양요구성 pyrG-계 시스템은 다수의 유익한 특성을 갖는다. A. 소재 pyrG 돌연변이체 균주를 수득하기 위해, 돌연변이체 균주의 성장을 도와주는 우리딘을 함유하는 평판 상에서 플루오로-오로트산(FOA)에 내성인 것에 대한 직접적인 선별에 기초한 표준 공정을사용하여 실험을 수행하였다(Van Hartingsveldt et al. in Mol. Gen. Genet.(1987) 206, p 71-75). 그러나, 아스페르길루스 소재 균주에 유사한 방법을 사용하여서는 pyrG 돌연변이체를 유도하지 못했다. 일상적인 방법은 플루오로-오로트산 내성 균주를 유도하나 모든 균주가 우리딘 없이 성장할 수 있는 것은 아니다. 따라서, 이들 균주 중 어느 것도 pyrG 돌연변이체가 아니었다. 통상, pyrG 돌연변이체 분리는 우리딘 선별 배지 상에서 플루오로-오로트산 내성 균주로부터 직접 수행할 수 있다. 그러나, 아스페르길루스 소재의 경우, 이 방법은 실행할 수 없는 것을 밝혀졌다.

확실히, 형질전환에 관해서 아스페르길루스 소재는 밀접하게 관련된 아스페르길루스 오리재와는 상이한 특질을 보여준다. 선별 마커로서 amdS 또는 pyrG를 사용하는 표준 프로토콜은 충분하지 않다. 불행하게도, 선별 마커로서 argB를 사용하는 방법은 사용하고자 하는 모든 숙주 균주에 대하여 대응 argB 돌연변이체를 분리하는 것이 필요하기 때문에 흥미있는 옵션이 아니다. 이것은 시행착오에 기초한 힘겨운 일이다. 필요한 argB 돌연변이체는 무작위 돌연변이유발법 이후 수만개의 콜로니를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. pyrG에 대한 상황은 돌연변이체 자체가 선별가능하기 때문에 더 우수하다. amdS의 경우, amdS의 존재가 우성 선별 마커로서 작용하기 때문에 어떠한 돌연변이체도 요구되지 않는다.

당업자가 재조합 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 발현 숙주로서 아스페르길루스 소재를 사용하는 것을 단념시킨 부가적인 문제가 존재한다. JP-A-02-234666에서, 예컨대 아스페르길루스 소재의 ArgB에 기초한 선별은 다른 균류에 기술된 것과유사한 방법을 사용하여 기재하고 있다. 이러한 공정은 문헌[Biotechnology(1988) 6, p1419-1422]에 아스페르길루스 오리재에 대하여 기술되었다. 인용된 문헌은 또한 아스페르길루스 니둘란스 및 아스페르길루스 니거에 대해 성공적인 유사한 형질전환을 언급하고 있다. 그러나, 일본특허출원에 기재된 아스페르길루스 소재 균주 ATCC42251을 분석한 결과, 바람직하지 못한 단백분해효소 프로필이 발견되었다. 이 균주의 단백분해효소 프로필은 생산 숙주로서 적용하기에 부적합하다. 선행기술에서 특정 아스페르길루스 소재 균주에 대해 형질전환 프로토콜이 제안되었음에도 불구하고, 형질전환에 대한 프로토콜이 성공적일지라도 높은 수준으로 이종 단백질을 발현할 수 없었다.

현재 아스페르길루스 소재 균주의 실용적 적용성을 발견하게 된 것은 바로 알카리 단백분해효소 및 아밀라제를 과량으로 생산하는 아스페르길루스 소재 균주의 분명한 특성 때문이다. 이들은 특별히 복합한 중합체 기질의 분해를 필요로 하는 공정에 사용된다. 따라서, 기껏해야, 생성물이 그 자신의 단백분해효소에 견디는 아스페르길루스 소재 단백질이지 않는 한 최종적으로 성공적인 아스페르길루스 소재의 임의의 형질전환체가 우수한 발현 수준을 유도하지 못할 것이라고 예상하였다.

요컨대, 산업적인 수준으로 이종 재조합 단백질을 발현하기 위해 아스페르길루스 소재를 사용하는 방법을 찾는데 당업자가 직면하는 문제는 많다. 첫째, 발현되기를 원하는 핵산 물질를 도입하는 다수의 공정은 다른 균류에 사용된 방법으로는 적용할 수 없다. 이는 밀접하게 관련된 아스페르길루스 오리재에 유용한 pyrG-및 amdS-기초한 공정을 포함한다. 둘째, 숙주 균주 아스페르길루스 소재의 알려진 과도한 단백분해 활성에도 불구하고 이종 단백질의 고 수준 생산이 실현가능한지 여부를 알아보는 것이 남아있었다.

예상치 못하게도, 상기 언급한 문제들이 해결될 수 있다는 것을 알게 되었고 그 결과 단백질을 생산하기 위한 신규 발현 숙주 및 이종 단백질을 생산하는 신규 방법을 산출하였다. 본 발명자는 amdS 및 pyrG 선별 마커로 A. 소재 균주를 형질전환하는 것을 기술하고 있다. 게다가, 피타제 유전자의 발현을 포함한 효과적인 유전자 발현을 기재하고 있다.

본 발명은 균류 형질전환의 신규 방법 및 이종 단백질 생산에서의 용도에 관한 것이다. 이 방법은 분류 집단 아스페르길루스 소재(Aspergillus sojae)에 속하는 유전적으로 조작된 균류를 포함한다. 과거에 형질전환용 숙주 균주로서 아스페르길루스 소재 사용에 대한 제안이 있어왔다. 그러나, 현재까지 성공적으로 이종 단백질이 형질전환 및/또는 발현된 데이타는 제공된 바 없다. 게다가, 현재까지 아스페르길루스 소재 이외의 발현 숙주에서의 단백분해를 포함한 수개의 이유로 인해 대량으로 발현하기 어려웠던 피타제(phytase)와 같은 특정 단백질은 놀랍게도 아스페르길루스 소재에서 발현될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 아스페르길루스 소재에서의 이종 단백질의 생산 수준은 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 및 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori)에서 동일한 단백질에 대해 달성된 생산 수준을 초월한다는 것이 밝혀졌다. 이에 부가하여, 본 발명의 목적은, 한편으로는 감소된 단백분해 활성이 특징이고 다른 한편으로는 균류의 형태학과 관련된 개선된 발효 특성이 특징인, 발현용으로 개선된 아스페르길루스 소재 균주를 수득하는 방법을 추가로 포괄한다.

도 1은 X. 래비스(XENPC2 및 XNFURIN), S, 세레비시애(SCKEX2), K. 랙티스(KLKEX1), C. 알비칸스(CAKEX2), S. 폼베(SPKRP) 및 Y. 리폴리티카(YLKEX2) 유래의 KEX2-유사 프로세싱 단백분해효소의 아미노산 서열 비교를 제공한다. 최고의 전체 동일성을 갖는 아미노산 서열(담청색 상자로 표시함)을 암호화하는 프라이머가 MBL793, MBL1208, MBL794, MBL1158, PE6, PCL1, PCL2(rev), PE6, PCL3, MBL789, PCL4 및 MBL1219로 표시되어 있다. 전체 동일성 영역(7개 엔트리 중 4개)은 보라색 상자로 표시되어 있다. 갭은 .로 표시되어 있다; 서열 데이터가 없는 것은 ∼로 표시되어 있다; 별표는 단백질의 정지 코돈을 표시한다.

도 2는 2a, b 및 c로 구성되어 있다. 도 2a는 33℃에서 5일간 항온배양한 후 특허 WO97/04108에 기재된 A. 소재 균주의 백그라운드 성장을 제공한다. 상단 그림은 비선별배지 상의 성장을 나타낸다. 하단 좌측 그림은 WO97/04108에 따른 선별배지를 나타내고, 하단 우측 그림은 본 발명에 따라 개선된 배지(아크릴아미드)를 사용한 결과를 나타낸다. 도 2b는 33℃에서 5일간 항온배양한 후 A. 소재 균주 ATCC11906의 백그라운드 성장을 제공한다. 상단 그림은 비선별배지 상의 성장을 나타낸다. 하단 좌측 그림은 WO97/04108에 따른 선별배지를 나타내고, 하단 우측 그림은 본 발명에 따라 개선된 배지(아크릴아미드)를 사용한 결과를 나타낸다. 도 2c는 33℃에서 5일간 항온배양한 후 A. 소재 균주 ATCC20387의 백그라운드 성장을 제공한다. 상단 그림은 비선별배지 상의 성장을 나타낸다. 하단 좌측 그림은 WO97/04108에 따른 선별배지를 나타내고, 하단 우측 그림은 본 발명에 따라 개선된 배지(아크릴아미드)를 사용한 결과를 나타낸다.

도 3(a 및 b)은 양 단부로부터 나온 A. 소재 ATCC11906 및 A. 오리재 amdS 서열 비교를 제공한다. A 및 B는 두개의 단부를 표시한다. 클로닝된 1.6kb A. 소재 서열을 사용하였다. 밑줄친 굵은 염기들은 종/균주 사이에서 상이하다. 인트론 I 서열은 소문자로 표시되어 있다.

도 4(a 및 b)는 pAO4-13 및 pAO4-13deltaCla를 통해 pyrG 파괴 벡터의 제작을 도시한다.

도 5는 XhoI 단편 및 HindIII 단편을 분리한 후 pMTL24안으로 클로닝하여 나온 pAB4-1rep의 제작을 도시한다.

도 6은 alpA 유전자 치환 벡터의 제작을 기술하고 있다. ATCC11906 지놈성 단편을 갖는 pAS1-1유래의 4.4kb EcoRI-StuI 단편, pAB4-1rep 유래의 2.6kb SmaI-NcoI 단편 및 pAS1-2A 유래의 4.4kb NcoI-EcoRI 단편을 3갈래 연결로 연결하고pAS1-deltaalp를 제공한다.

도 7은 A. 니거 pclA 유전자를 운반하는 DNA 단편의 제한 지도를 제공한다.

도 8은 A. 니거 pclA 암호화된 단백질의 구조(기능적 구성)을 제공한다. 좌측에서 우측으로 pre, pro, 활성 및 P 도메인을 나타낸다. 밝은 색상의 세모는 KR 부위를 표시한다. 어두운 색상의 세모는 글리코실화 부위를 표시한다. 세로 줄무늬의 밝은 상자는 S/P/T 풍부 영역이다. 우측 끝에 있는 어두운 파형 상자는 D/E 풍부 영역이다.

도 9는 A. 니거 pclA 돌연변이체 균주의 성장 표현형을 도시한다.

도 10은 A. 소재 및 A. 니거 pclA 유전자 사이의 DNA 서열 비교를 제공한다. 수직 막대는 동일성을 표시하고, :는 5를 표시하고, ·는 1을 표시하며, 72.139% 유사성 및 72.073% 동일성이 발견되었다.

도 11은 pclA 유전자 치환 벡터의 제작을 개시하고 있다. ATCC11906 지놈성 단편인 7.6kb ClaI 단편을 pMTL23p 안으로 클로닝하였다. 이 제작물에서 pAB4-1rep 유래의 2.6kb SmaI 단편을 EcoRV-부위 안으로 클로닝하여 pAS2-delta pcl을 제공하였다.

도 12는 S. 세레비시애(Sckex2), K. 랙티스(Klkex1), A. 소재(Aspcla), A. 니거(A. niger), P. 크리소게눔(Penpcl1), A. 비스포루스(Agarmbl129), T. 레에세이(Trichpcl1), R. 오리재(Rhizpcl1), F. 베네나툼(Fuspcl1), S.폼베(Spkrp), C. 알비칸스(Cakex2) 및 Y. 리포리티카(Ylkex2) 유래의 상동성인 각종 PclA의 아미노산 서열 비교를 보여준다. 전체 동일성 영역(12개 엔트리 중 8개)은 노란색 상자로표시되어 있다. 갭은 ..로 표시되어 있다; 서열 데이터가 없는 것은 ∼로 표시되어 있다.

도 13a는 A. 오리재 alpA 프로모터 서열(Q11755)에 대한 서열 데이타를 제공한다. PCR 클로닝을 위한 프라이머 위치를 표시하고 있다. 도 3b는 A. 오리재 amyA 프로모터 서열에 대한 서열 데이타를 제공하며(A02532), 프라이머 위치도 포함한다. 도 3c는 ATCC42149 A. 오리재 유래의 gpdA 프로모터 서열(EP0.436.858 a1)을 제공하고, 프라이머 위치도 포함한다.

도 14는 아스페르길루스의 각종 gpdA 프로모터 서열들 사이의 비교를 제공한다: 상단에서 하단으로, A. 소재 ATCC11906, A. 오리재, A. 니거 및 A. 니둘란스. 별표는 프로모터의 5'비번역 영역에 존재하는 추정 인트론을 표시한다. 화살모자는 CT 풍부 영역을 표시한다. 밑줄친 굵은 문자는 A. 오리재와 A. 소재 서열 사이의 차이를 표시한다.

도 15는 12700bp의 벡터 pGLA6S의 지도를 나타낸다.

언급한 바와 같이, 본 발명은 아스페르길루스 소재 균주 및 재조합 단백질 및 폴리펩티드를 생산하기 위한 이의 적용에 관한 것이다. 먼저, 아스페르길루스 소재 균주에 대한 설명을 제공한다.

<아스페르길루스 소재 결정>

균류 분류법은 복잡한 논점이다. 아스페르길루스 속은 Flavi/Tamarii 섹션에서 아스페르길루스 소재를 포함한다(표 1 참조). A. 소재는 분명하게 동일한 섹션(표 2 참조)에 위치한 A. 오리재와 구별되는 것으로 보여진다. 최근, 아스페르길루스 소재에 속하는 균주는 당업계에서 인식되는 다수의 방식에서 분류학상 밀접하게 관련된 아스페르길루스 오리재 및 밀접하게 관련있는 아스페르길루스 파라시티쿠스와 구별될 수 있다. Ushijama 등(1981), Chang 등(1995), Yuan 등(1995), Kusomoto 등(1998) 및 Watson 등(1999)에 기술된 바와 같이 무작위 PCR 단편인, ver-1, aflR및 rDNA 서열이 각각 언급되어 있다. 또한, 이들 균주의 alpA 서열을 비교할 때 아스페르길루스 오리재는 아스페르길루스 소재와 상이하다는 것이 밝혀졌다. 특히(결정 도구로 사용될 수 있는 A. 오리재와 A. 소재 alpA 사이의 다른 서열 차이가 존재함), 아스페르길루스 소재는 alpA 유전자 내 특정 위치에 XmnI 제한 부위를 포함한다고 밝혀졌다. 수개의 아스페르길루스 오리재 균주의 alpA 유전자 내 상응 위치는 이러한 제한 부위를 보유하지 않는다. 따라서, 이것은 두 유형의 균류 균주 사이의 부가적인 구별점을 제공한다. 결국, 특정 균주가 아스페르길루스 소재인지 여부를 결정하려는 당업자에게 다수의 방법이 유용하다. 최근, 아스페르길루스 소재로 정의된 10개 이상의 균주가 ATCC에 기탁되어 있다. 가장 오래된 10개의 균주를 분석하였다. 10개 중 2개는 최근 언급된 결정 시험을 통과하지 못하였다. 이들 중 하나는 ATCC20235로서, Ushijama 등(1981)에 의하면 형태학적 파라미터에 기초하여 아스페르길루스 소재로서의 분류 필수조건을 충족하지 않았다. 다른 것은 ATCC46250이다. 특허 출원을 통해 사용된 아스페르길루스 소재의 정의는 바람직하게는 alpA 유전자 내 XmnI 제한 부위의 존재와 함께 인용된 문헌에 기술된 필수조건 모두를 충족하는 균주를 내포하는 것을 의미한다. 또한 아스페르길루스 오리재 및 아스페르길루스 소재 서열 모두에 대한 특이적인 동종 프라이머들이 제공되어 있다. 이들은 아스페르길루스 소재로부터 아스페르길루스 오리재를 구별하는데 유용한 스크리닝 시험의 예로써 XmnI 제한 부위의 존재에 대한 시험에 사용될 수 있다(프라이머 서열은 서열번호 1 MBL1784: 5'-CGGAATTCGAGCGCAACTACAAGATCAA-3' 및 서열번호 2 MBL1785: 5'-CGGAATTCAGCCCAGTTGAAGCCGTC-3' 임.). 이들은 alpA 유전자의 암호화 영역으로부터 유래한다. 공지의 서열 데이타에 기초하여 당업자에게는 다른 프로브 또는 프라이머를 생각할 수 있는 것이 분명할 것이다. 이들 프라이머들을 아스페르길루스 DNA상에 사용하여 PCR 증폭한 이후 형성된 DNA 단편을 XmnI로 제한효소 분해하는 것은, A. 오리재 균주로부터 A. 소재 균주를 구별할 수 있는 방법을 제공한다. 아스페르길루스 소재 균주의 정의를 확립하면서 본 발명자는 계속해서 본 발명에 대해 상세한 설명할 수 있다.

일면에서, 본 발명은 선별 마커로서 도입된 아세트아미다제 S(amdS) 유전자를 포함하는 재조합 아스페르길루스 소재를 포괄한다. 이러한 A. 소재는 질소의 유일 공급원으로서 도입된 amdS 단백질의 기질을 포함하는 배지 상에서 선별가능하며, 상기 배지는 탄소 기질을 더 포함하며, 내인성 amdS 유도 기질이 없다. 적절한 배지는 질소의 유일 공급원으로서 도입된 amdS의 기질로서 아크릴아미드를 포함한다. 적절한 배지는 적어도 아스페르길루스 소재의 성장에 필요한 최소 기질을 더 포함한다. 본 발명에 따른 A. 소재의 적당한 카테고리는 아세트아미드 함유 배지 상에서 선별할 수 없는 A. 소재에 의해 형성된다. 본 발명에 따른 A. 소재는 적절하게는 글루코즈 부재 배지, 즉 탄소 공급원이 글루코즈가 아닌 배지 상에서 선별가능한 A. 소재이다. 이러한 배지는 탄소 공급원으로 소르비톨을 갖는 배지일 수 있다. 소르비톨의 경우 최상의 결과는 소르비톨이 유일한 탄소 공급원일 때 얻어진다.

본 발명에 따른 아스페르길루스 소재는 더 도입된 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 더 도입된 핵산 서열은 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 것이 바람직하다. 더 도입된 서열은 숙주 균주의 코돈 사용법에 대해 최적화된 코돈 사용법에 맞게 개작할 수 있거나 유래된 숙주의 원래 코돈을 보유할 수 있다. 원칙상 도입된 서열은 당업자가 발현시키고자 하는 임의의 서열이다. 도입된 서열은 적절하게, 그 안에 도입시키고자 하는 아스페르길루스 소재에 이종성인 즉 외래성일 수 있다. 또한, 천연적이나 하나이상의 추가 사본의 형태로 도입될 수 있다.

본 발명의 목적 중 하나는 피타제 또는 피타제 활성을 보유한 단백질을 발현시키는 것이다. 피타제의 서열 데이타에 대하여 다수의 서열이 당업자에게 알려져 있다. 본 발명자는 EP 684.313, EP 897.010, WO 99/49022, EP 911.416 및 EP 897.985의 내용을 언급하며 이를 본 명세서에 인용하고 있다. 이들 문헌은 각종 천연 또는 수정된 피타제 서열을 설명하고 있다. 또한, 이들은 공통서열을 기술하고 있다. 적절한 구체예가 천연 서열 또는 이의 수정된 서열인 페니오포라(Peniophora)에서 유래한 피타제 서열에 의해 형성된다. 새로운 시스템은 이전의 시스템 보다 더 유연성이 있으며, 따라서 종래 기술인 균류 시스템에서는 발현하기 어려웠던 피타제 또는 피타제 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 이종 서열을 포함하는 이종 서열을 본 발명에 따른 신규 시스템에서 발현할 수 있다.

선별 마커로서 도입된 amdS 유전자를 포함하는 상기 정의된 임의의 구체예에서 정의된 바와 같이 본 발명에 따른 아스페르길루스 소재는 적절하게 활성이 있는 내인성 amdS 유전자를 전혀 보유하지 않을 수 있다. 이러한 구체예에 따른 아스페르길루스 소재는 예로서 내인성 amdS 불활성화 돌연변이를 포함하는 내인성 amdS유전자를 보유할 수 있다. 당업자에게 알려져 있거나 생각할 수 있는 임의의 유형의 불활성화 돌연변이가 일어날 수 있다. 이러한 불활성화 돌연변이의 적절한 예는 결실 또는 파괴일 수 있다. 돌연변이는 유전자 또는 유전자 산물을 불활성화시킬 수 있다. 당업자는 이를 달성하기 위해 다수의 옵션이 유용하며 이들은 용이하게 달성될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 또한 활성이 있는 내인성 amdS 유전자가 없으며 선택 마커로서 도입된 amdS 유전자를 더 포함하는 재조합 아스페르길루스 소재에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 아스페르길루스 소재는 질소의 유일 공급원으로서 amdS의 기질을 함유하는 배지상에서 선별가능하며, 상기 배지는 탄소 기질을 더 포함한다. 적절한 배지는 적어도 A. 소재의 성장에 필요한 최소 기질들을 더 포함한다. 적절한 구체예에서, 내인성 amdS 유전자는 예를들면 불활성화될 수 있다. 이러한 불활성화는 A. 소재가 생존가능한 한, 당업자가 알고 있거나 생각할 수 있는 임의의 유형의 불활성화일 수 있다. 예로서, 내인성 amdS 유전자는 유전자 또는 그 일부의 치환, 결실 또는 삽입의 형태로, 또는 불활성화되도록 유전자의 발현에 영향을 주는 돌연변이에 의해 불활성화 돌연변이를 포함할 수 있다. 완전한 내인성 amdS 유전자가 부재할 수도 있다.

본 발명에 따라 기술된 임의의 구체예에서 아스페르길루스 소재는 amdS 유전자가 도입된 A. 소재일 수 있다. 이것은 예컨대 형질전환 또는 형질감염에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에 따라 형성된 아스페르길루스 소재는 이어서 형질전환 또는 형질감염되지 않은 A. 소재로부터 분리되어야 한다. 전술한 임의의 구체예를 단독 사용하거나 또는 이와 병용하는 것은 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명은 상기 아스페르길루스 소재를 포괄할 뿐만아니라, A. 소재 안으로 핵산 서열을 도입하는 방법도 포괄한다. 이 방법은 균류 안으로 핵산 서열을 도입하는데 알려진 방식 자체로 핵산 서열을 도입하는 것을 아스페르길루스 소재에 에 대해 수행하는 단계를 포함한다. 이러한 방식은 예컨대 A. 소재의 형질전환 또는 형질도입일 수 있다. 이 방법은 핵산 서열로서 amdS 유전자를 도입하는 단계 이후 그 결과 형성된 형질전환 또는 형질도입된 A. 소재를 내인성 amdS 유도 기질이 없는 배지상에서 선별하는 단계를 포함하며, 상기 배지는 질소의 유일 공급원으로서 도입된 amdS의 기질을 더 포함하고 탄소 기질을 더 포함하며, 상기 배지는 기능적인 amdS 유전자가 없는 A. 소재의 성장을 배제하면서 도입된 amdS 유전자를 포함하는 원하는 A. 소재가 성장할 수 있는 것이다. 이러한 방법의 적절한 구체예는 아세트아미드 이외의 amdS의 기질을 포함하는 배지를 적용하는 것을 포함한다. 적절하게는, 이러한 배지는 질소의 유일 공급원으로서 도입된 amdS의 기질로서 아크릴아미드를 포함한다. 적절하게는, 본 발명에 따른 방법의 배지는 글루코즈 이외의 탄소 공급원을 포함한다. 적절하게 본 발명에 따른 방법에 사용하는 배지는 탄소 공급원으로, 바람직하제는 유일한 탄소 공급원으로서 소르비톨을 포함한다. 적절한 배지는 적어도 A. 소재의 성장에 필요한 최소 기질을 더 포함한다.

임의의 구체예에서 전술한 본 발명에 따른 방법은 amdS 유전자 이외에 부가적인 핵산 서열을 도입하는 것을 포함한다. 부가적인 핵산 서열은 예를들면 피타제 또는 피타제 활성을 보유하는 단백질과 같은 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 이 서열은 반드시 비-아스페르길루스 소재 서열이어야 할 필요는 없으며 A. 소재 유래의 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 도입된 서열은 형질전환되지 않은 균주에는 없는 것이거나 또는 본 발명의 A. 소재 보다 낮은 사본수로 존재하는 것으로 의도된다.

천연적으로, 본 발명은 또한 전술한 방법에 의해 수득된 임의의 아스페르길루스 소재를 포괄한다. 기본적으로, 이 방법은, 어떤 이유에서든지 질소의 유일 공급원으로서 amdS의 기질 상에서 성장할 수 있게 하는 충분한 활성 amdS를 생산할 수 없는 서열을 도입한 A. 소재와 반대로, 선별 마커로 작용하기에 충분한 활성 amdS의 존재를 인식할 수 있는 서열을 도입하는 것에 관한 것이다.

형질전환 또는 형질감염된 A. 소재를 선별하는 방법은 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이 방법은 A. 소재(기술된 임의의 구체예에 따라 정의된 활성이 있는 내인성 amdS 유전자를 보유하지 않음)를 핵산 서열로 균류의 형질전환 또는 형질감염시키는 공지된 방식 그 자체로 A. 소재의 형질전환 또는 형질감염의 방법에 따라 수행하는 것을 포함한다. 이 방법은 핵산 서열로서 amdS 유전자를 도입하는 단계 이후, 형성된 형질전환 또는 형질감염된 A. 소재를 선별하는 단계를 포함하며, 상기 선별 단계는 질소의 유일 공급원으로 도입된 amdS의 기질을 포함하는 배지 상에서 일어나며, 상기 배지는 탄소 기질을 더 포함하고, 상기 배지는 선별 배지 상에서 도입된 amdS 유전자 없이 성장할 수 없는 불능성 때문에 형질전환 또는 형질감염되지 않은 A.소재의 성장을 배제하면서 원하는 A. 소재가 성장할 수 있는 것이다. 적절한 배지는 적어도 A. 소재의 성장에 필요한 최소 기질을 더 포함한다.

또한, 본 발명은 재조합 아스페르길루스 소재를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 예컨대 A. 소재 안으로 공지된 방식 자체로 형질전환 또는 형질감염시킴으로써 원하는 핵산 서열을 도입하는 것을 포함하며, 상기 원하는 핵산 서열은 재조합을 확실히 하는데 충분한 일정 길이 및 상동성을 보유한 내인성 amdS 유전자의 절편들에 인접되어 있다. 도입 단계 이후 원하는 핵산 서열을 보유하는 재조합 A. 소재를 선별한다. 원하는 핵산 서열에 포함되거나 이와 함께 형질전환되는 선별 마커에 대한 선별이 일어나며, 상기 선별 마커는 원하는 핵산 서열이 도입되기 이전에는 A. 소재에 부재한다. 또한, 인접 서열은 재조합을 확실하게 하는데 충분한 내인성 amdS 유전자에 상응하는 서열일 수 있다. 당업자는 용이하게 어떠한 서열이 하이브리드화 정보 및 내인성 amdS 유전자의 서열 데이타에 기초하여 충족시키는지를 결정할 수 있다. 재조합 사건은 양 경우에서 내인성 amdS 활성을 제거한다. 선별 마커는 꽤 적절하게는 선별 배지 내 우리딘 대신 우라실이 있으면서 pyrG일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 우라실 및 플루오로-오로트산 함유 배지 상에서 성장하는 아스페르길루스 소재를 포함하며, 상기 A. 소재는 우리딘 및 플루오로-오로트산 함유 배지 상에서 더이상 성장하지 않는다. 이는 A. 소재가 우라실 영양요구성이며, 우리딘을 이용할 수 없으며 pyrG 음성이고 플루오로-오로트산에 내성을 나타낸다는 의미이다. 우라실 영양요구성 및 플루오로-오로트산 내성은 활성이 있는 도입된 pyrG 유전자로 보충될 때 경감될 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 A. 소재는 활성이 있는 내인성 pyrG 유전자가 없을 수 있다. 본 발명에 따른 pyrG 음성 A.소재는 이를 불활성시키는 돌연변이와 함께 내인성 pyrG 유전자를 포함할 수 있다. 돌연변이는 당업자가 알고 있거나 생각할 수 있는 임의의 돌연변이 일 수 있으며, 상기 돌연변이는 pyrG 유전자 또는 이의 발현 산물을 불활성화시킨다. 이러한 돌연변이는 예를들면 유전자 내 핵산 삽입, 유전자의 암호화 서열 중 일부의 치환, 유전자의 암호화 서열 중 일부의 결실 또는 유전자의 전체 암호화 서열의 결실의 형태일 수 있다. 또한, 돌연변이는 유전자의 조절 부위에서 일어날 수 있다. 돌연변이된 pyrG 유전자를 보유하는 본 발명에 따른 아스페르길루스 소재의 경우, 상기 아스페르길루스 소재는 야생형 A. 소재 pyrG 유전자와는 상이한 돌연변이된 pyrG 유전자에 대한 핵산 서열을 보유할 수 있다. 다른 구체예는 본 발명에 따른 임의의 amdS 돌연변이체 A. 소재에 대해 기술된 임의의 특성 그 자체 또는 이를 더 포함하는, 임의의 상기 구체예에 기재된 본 발명에 따른 pyrG 음성 A. 소재를 포함한다.

형질전환 또는 형질감염된 아스페르길루스 소재를 선별하는 방법도 본 발명의 범주에 속한다. 이 방법은 전술된 본 발명의 임의의 구체예에 따른 pyrG 음성 유형의 A. 소재를 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염하는 방법에 따라 수행하는 것을 포함하며, 상기 방법은 형질전환 또는 형질감염에 대해 알려진 방식 그 자체로 pyrG 음성 A. 소재 안으로 활성이 있는 pyrG 유전자를도입하는 단계를 포함한다. 도입 단계 이후 결과물인 형질전환 또는 형질감염된 A. 소재를 우라실 및 플루오로-오로트산이 없는 배지 상에서 선별하며, 상기 배지는 적어도 A. 소재의 성장에 필요한 최소 기질을 더 포함하고, 상기 배지는 불활성화된 pyrG 유전자 때문에 우라실 없이 성장할 수 없는 불능성으로 인해 형질전환 또는 형질감염되지 않은 A.소재의 성장은 배제하면서 바람직한 A. 소재가 성장할 수 있다. 이러한 방법의 적절한 구체예에서, 도입되는 활성이 있는 pyrG 유전자는 동일한 핵산 단편에 인접하고, pyrG 유전자 및 인접 서열의 도입 결과물인 pyrG 양성 A. 소재를 우라실 및 플루오로-오로트산이 없는 배지에서 선별한다. 이어서, pyrG 양성 A. 소재를 우라실 및 플루오로-오로트산 함유 배지 상에서 배양한 후 도입된 pyrG 유전자를 제거하여 우라실 함유 배지 상에서의 성장 및 플루오로-오로트산 내성에 의해 선별가능한 pyrG 음성 A. 소재를 산출한다. 전술한 방법의 적절한 구체예에서, 인접 서열 및 pyrG 유전자는, 또 통합지시서열이 형질전환되는 A. 소재의 특정 서열과 상동성이 있다는 사실로 인해, pyrG 유전자 및 인접 서열들이 특정 위치에 통합되도록 지시하는 서열들에 인접한다. 이것은 특정 서열과 연결된 유전자를 (원하는 경우) 넉-아웃시킬 수 있다. 넉-아웃 돌연변이체 형성 공정 그 자체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 좀 전에 기술된 선별 방법에 관한 임의의 구체예는 아스페르길루스 소재가 추가의 이종 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염되는 단계를 더 포함할 수 있다. 추가의 이종 핵산 서열은 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 것이 바람직하며, 본 발명에 따라 통상 아스페르길루스 소재 및 균류의 다른 구체예에 대한 상기 추가의 핵산 서열의 특성에 대해 다른 곳에서 설명한 것과 동일한 언급이 여기서도 유효하다. 추가의 서열은 동일한 벡터 상에서 또는 도입되는 활성이 있는 pyrG 유전자와 함께 형질전환시킴으로써 활성이 있는 pyrG 유전자와 함께 도입될 수 있다. 기술된 바와 같이 형질전환 또는 형질감염된 A. 소재를 선별하는 방법은 전술한 본 발명에 따른 임의의 구체예에서 이종 amdS 유전자를 도입하는 것을 포함하는 핵산도입 방법과 함께 수행될 수 있다. 자연적으로, 본 발명은 본 발명에 따라 형질 전환 또는 형질감염된 A. 소재를 선별하는 방법에 의해 수득된 임의의 재조합 A. 소재를 포괄한다.

또한, 본 발명은 재조합 아스페르길루스 소재의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 pyrG 유전자 분절 또는, 재조합을 확실히 하게하여 pyrG 유전자를 제거하고 원하는 서열을 도입하기에 충분한 일정 길이 및 상동성을 보유하는 상응 서열에 인접하도록 도입되는 서열을 포함하는 핵산 서열로, pyrG 양성 아스페르길루스 소재를 공지된 방식 그 자체로 형질전환 또는 형질감염하는 단계를 포함하고, 이후 pyrG 음성 표현형을 갖는 A. 소재를 선별함으로써 원하는 서열을 갖는 재조합 아스페르길루스 소재를 선별하는 단계를 포함한다. 핵산 서열과의 하이브리드화 공정에 대한 정보 및 pyrG 유전자의 필요로하는 서열 데이타의 정보 덕분에 당업자는 상응 서열을 결정할 수 있다.

특히 본 발명은 또 전술한 바와 같이 본 발명에 따른 amdS 돌연변이체 A. 소재의 특성을 나타내는 아스페르길루스 소재를 포괄한다. 따라서, 본 발명에 따른 amdS 및/또는 pyrG 도입 방법에 의해 수득된 임의의 아스페르길루스 소재 균주는 본 발명의 범주에 속하는 신규 균주이며, 이러한 신규 균주의 차후 용도도 본 발명에 속한다. 이러한 신규 균주는 원래 상응하는 아스페르길루스 소재 균주에서는 발생하지 않거나, 아스페르길루스 소재, 아스페르길루스 또는 균류에서조차도 발생하지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 서열들은 포유류 기원일 수 있거나, 임의의 동물, 식물 또는 미생물로부터 유래될 수 있다. 또한, 천연적으로는 아스페르길루스 소재 균주에 존재하나 대응하는 형질전환되지 않은 A. 소재에서 낮은 사본수로 존재하는핵산 서열을 발현할 수 있다. 따라서, 상동성 단백질의 생산도 본 발명에 따른 pyrG 및/또는 amdS 아스페르길루스 소재 균주가 관여될 때 본 발명에 포함된다. 바람직한 구체예는 생산되는 특정 단백질 또는 폴리펩티드가 대응하는 비-처리된 A. 소재에 부재하고/하거나 대응하는 비처리된 A. 소재, 즉 핵산 서열의 동입 이전의 A. 소재에서 낮은 사본수로 존재하는 것이다. 균류에서 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 공지된 방식 그 자체로 아스페르길루스 소재의 임의의 신규 균주에 의해 이종 단백질을 발현시키는 것은 균주에서 산출되거나 균주에 대해 외래성인 서열 모두를 포괄한다. 기본적으로, 오직 천연 비-형질전환 또는 -형질감염된 A. 소재만은 보호범위에서 배제된다. 생산 공정은 원하는 서열을 발현시키는데 적절한 조건 하에 균류를 배양하는 단계를 포함한다. 생산 공정은 선택적으로 균류에 의한 단백질 또는 폴리펩티드 생산에 대해 알려진 방식 그 자체로 형성된 폴리펩티드 또는 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 단백질 또는 폴리펩티드는 배양 배지 안으로 분비될 것이다.

바람직한 단백질 또는 폴리펩티드는 아스페르길루스 니거 또는 아스페르길루스 아와모리에 의해 발현될 때 분해되기 쉬운 단백질 또는 폴리펩티드이다. 다수의 이러한 단백질 및 폴리펩티드가 선행기술에 이미 개시되어 있으며, 다수가 아직 결정되지 않은 상태이다. 그러나, 이러한 결정은 당업자에게 일상적인 일이다. 발현될 단백질 또는 폴리펩티드의 다른 바람직한 구체예는 단백질 또는 폴리펩티드가 아스페르길루스 소재 단백분해효소 및 아밀라제와 상이한 경우이다. 바람직한 구체예는 비 아스페르길루스 소재 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.

특히 흥미로운 구체예는 전술한 바와 같이 본 발명에 따른 핵산 서열들을 도입하는 2개의 공정을 병용하는 것을 포함한다. 이것의 장점은 pyrG 마커로 수득된 형질전환 횟수가 amdS 마커의 경우보다 분명히 훨씬 더 높다는 사실이다. 그러나, 아크릴아미드 선별 평판 상에서의 최상 성장에 대해 pyrG+ 균주를 2차 스크리닝 함으로써 최고의 사본수 및 이로인해 가자 그럴듯한 최고 수준의 유전자 발현을 나타내는 재조합 아스페르길루스 소재를 동정할 수 있다.

실시예에 지시된 바와 같이, 동종 및 이종 발현 조절 서열, 즉 균주 그자체의 천연 발생 서열을 아스페르길루스 소재에 의해 사용할 수 있거나 상기 균주에 외래성인 서열을 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 형질전환체는 임의의 상기 조절 서열을 포함할 수 있다. 적절한 조절 영역을 선택하는 것은 당업자의 표준 능력 범위 내에서 잘 확립된 선택의 문제이며 특정 적용예에 좌우될 것이다. 조절 서열은 구성성 또는 유도성일 수 있다. 조절 서열은 균류 또는 비균류일 수 있다. 실시예 A에 광범위하게 예시되어 있다. 다수의 발현 조절 서열은 통상 다른 시스템, 특히 아스페르길루스와 같은 균류 시스템에 대한 기술 분야에서 사용되고 있으며, 일상적으로 본발명에 따른 아스페르길루스에 부당한 부담없이 적용될 수 있다.

원하는 핵산 서열을 아스페르길루스 소재 안으로 도입하는 경우, 균류 숙주 세포 안으로 핵산 서열을 도입하기에 적절한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 다수의 예들이 당해 기술 분야에서 입수가능하다. 특히 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 아와모리 및 아스페르길루스 오리재와 같은 아스페르길루스에서의 형질전환, 형질감염 또는 발현에 적절하다고 밝혀진 벡터들을 적절하게 응용할 수 있다.

전술한 것에 부가하여, 본 발명은 재조합 아스페르길루스 소재의 효율적인 단백질 생산을 기술한다. 이러한 효율적인 생산은 ATCC 42251보다 우수하거나 또는 임의의 ATCC9362, ATCC11906 및 ATCC20387과 적어도 동일하게 우수한 단백분해효소 프로필을 갖는 균주에서 설명되어 있다. 따라서, 본 설명은 A. 소재의 몇몇 알려진 균주가 단백질, 폴리펩티드 및 대사물질의 생산과 같은 것에 이미 잘 적합하다. 이들 아스페르길루스 소재 균주는 참조 균주인 A. 소재 ATCC42251 보다 낮은 단백분해효소 활성을 나타낸다. 특히 두개의 공지된 균주 ATCC11906 및 ATCC20387은 꽤 적합하다. 단백질, 폴리펩티드 및 대사물질의 생산에 바람직한 A. 소재 균주는 두개의 바람직한 균주와 동일하거나 더 낮은 단백분해 활성을 나타낼 것이다. 균주 ATCC11906은 선행기술에 따라 기탁된 ATCC A. 소재 균주 중 최상의 구체예이다. 적절한 단백질 또는 폴리펩티드가 제공될 것이다. 본 발명은 핵산 서열을 도입시킬 수 있기 때문에, A. 소재를 발현 숙주로 사용하여 선택된 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 제공할 수 있다.

본 발명은 현존하는 발현 시스템 보다 나은 개선점을 제공한다. 현존하는 다수의 단백질 생산 시스템은 단백분해작용 때문에 발현상 문제점를 나타낸다. 특히, 새로운 시스템은 현재 자주 적용하는 발현 시스템인 아스페르길루스 니거 및 아스페르길루스 아와모리 보다 우수하다. 본 발명은 이제 발현시키고자 하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 도입된 핵산 서열을 포함하는 재조합 아스페르길루스 소재를 제공할 수 있으며, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 A. 니거 또는 A. 아와모리에 의한 발현시 분해되기 쉬운 것이다. 또한, 본 발명은 발현시키고자 하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 도입된 핵산 서열을 포함하는 재조합 A. 소재를 제공하며, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 A. 소재의 단백분해효소 및 아밀라제가 아닌 것이다. 바람직한 구체예는 도입된 핵산 서열이 비-A. 소재 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 것이다. 이러한 재조합 A. 소재 균주는 또한 본 발명의 범주에 속한다.

게다가, 발현 숙주로서의 적합성을 강화하기 위해 수정된 아스페르길루스 소재 균주의 예들이 널리 제공되어 있다. 이들 수정은 임의의 방법에 의해 유도될 때 단백분해 활성을 감소시킬 수 있다. 특히, UV 무작위 돌연변이유발법의 사용이 예시되어 있다. 또한, 하나 이상의 단백분해효소 유전자의 특이적인 돌연변이가 예시되어 있다. 돌연변이를 도입시킬 수 있는 방법은 당업자에게 일반적인 지식이며, 따라서 다수의 다른 구체예는 원하는 돌연변이체를 얻기 위해 즉시 사용될 수 있다. 적당한 구체예는 알카리 단백분해 활성이 감소된 돌연변이체에 의해 형성된다. 특히, 주요 35 kDa 알카리 단백분해효소의 활성을 제거하는 것이 단백질 및 폴리펩티드 발현을 증가시키는 것으로 예시되어 있다. 특히 본 발명은 감소된 단백분해 활성, 특히 감소된 알카리 단백분해 활성을 나타내는 신규 균주도 포괄한다. 이러한 균주는 당업자가 알거나 생각할 수 있는 임의의 특정 돌연변이 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 전술한 바와 같이 감소된 단백분해 활성을 나타내는 이러한 발현 숙주의 바람직한 구체예는 선별 마커를 더 포함한다. 상당히 적절하게 선별 마커는 amdS, pyrG 또는 이들의 조합일 것이다.

특히 본 발명은 35 kDa 알카리 단백분해효소 유전자를 넉-아웃시킴으로써 단백분해효소가 결여된 A. 소재 돌연변이체를 생산하는 방법을 포괄한다. 상기 유전자에 대하여 제공된 서열 데이타에 기초하여 이것이 잠재적으로 달성될 수 있는 방법은 다수 있다. 특히, 35 kDa 알카리 단백분해효소 유전자의 교환(cross over)을 유도하는 두개의 인접 영역에 연결된 pyrG 선별 마커로 재조합하는 방법으로서, 형성된 균주가 pyrG 선별 마커를 보유하고 35 kDa 알카리 단백분해효소 유전자를 소실한 방법은 우수한 방법이다. 이어서, pyrG 선별 마커는 제거될 수 있으며 따라서 도입될 임의의 소정 서열을 발현시킬 목적으로 사용할 수 있는 35kDa 알카리 단백분해효소 음성 아스페르길루스 소재 돌연변이체를 제공할 수 있다. 자연적으로, 도입될 서열은 pyrG 마커와 동일한 벡터 상에서 또는 함께 형질전환됨으로써 이미 이전 단계에서 통합될 수 있다. 또한, 35kDa 알카리 단백분해효소 유전자 이외의 다른 단백분해효소 유전자가 넉아웃된 방법을 유사하게 수행할 수 있다. 수행될 수 있는 유사한 수단은 다른 단백분해효소 서열의 지식과 함께 본 명세서에 제공된 예시들에 기초할 때 당업자에게 분명하다. 또한 유사하게, amdS 선별 마커는 본 명세서 중 다른 곳에서 기술한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

또한, 향상된 발효 특성을 나타내는 돌연변이체 균류는 본 발명의 추가적인 일면으로서 제공된다. 특히, 본 발명은 프로단백질 전환효소 또는 등가 단백질의 활성을 억제하는 돌연변이를 포함하는 균류에 관한 것이다. 다수의 프로단백질 전환효소는 당업계에 알려져 있다. 특히, 본 발명자는 이러한 다수의 단백질에 대한 서열 데이타를 제공하는 도 1을 참조한다. 본 발명에 따른 균류는 아가리구스, 아스페르길루스, 트리초데르마, 리조푸스, 무코르, 파네로차에테, 트라메테스, 페니실리움, 세팔로스포리움, 뉴로스포라, 톨리포클라디움 및 티엘라비아로부터 적절이 선택된다. 특히 적당한 균류는 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 포에티두스, 아스페르길루스 소재, 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 오리재, 트리초데르마 리에세이, 페니실리움 크리소스포룸, 세팔로스포리움 아크레모니움, 뉴로스포라 그라사, 톨리포클라디움 지오데스 및 티엘라비아 테레스트리스이다. 바람직한 구체예는 아스페르길루스 소재인 경우 돌연변이체를 포괄하며, 본 발명에 따라 전술한 아스페르길루스 소재, 즉, 예컨대 선별 마커 amdS 및/또는 pyrG와 함께, 이종 핵산 서열을 포함하는 아스페르길루스 소재가 가장 특히 바람직하다.

프로단백질 전환효소의 적절한 등가물은 서열번호 3의 DNA 서열(= A. 니거 프로단백질 전환효소 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 단편)의 추론된 아미노산 서열, 서열번호 4의 DNA 서열(=아스페르킬루스 소재 프로단백질 전환효소 아미노산 서열을 암호화하는 부분적인 유전자 단편)의 추론된 아미노산 서열, 또는 서열번호 5 내지 9의 서열 중 임의의 것과 40% 이상, 바람직하게는 45% 이상의 유사성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 기능적 등가 단백질은 적절하게 엄격 조건하에 서열번호 3 내지 9에 따른 핵산 서열과 하이브리드할 수 있는 핵산 서열을 보유할 수 있다. 엄격 하이브리드화 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 엄격 하이브리드화 조건의 적당한 예는 50℃, 바람직하게는 56℃에서의 하이브리드화 및 3×SCC로의 최종 세척이다. PE4, PCL1 및 PCL2는 특히 암호화 가닥(예, 서열번호 10, 11 및 12)에 대응하는 적당한 올리고뉴클레오티드 혼합물의 예로서 언급되어 있다. 비암호화 가닥의 경우 PE6, PCL2-rev, PCL3 및 PCL4가 언급되어 있다(예컨대, 각각 서열번호 13, 14, 15 및 16). 당업계에 일반적인 증폭 공정에서 이들 프라이머를 사용하는 것은 등가 서열 및 그 용도를 제공할 것이고, 결과물인 새로 발견된 서열 및 본 명세서에 기재된 것과 유사한 방식에서의 이의 적용은 본 발명의 범주에 속한다. 올리고뉴클레오티드가 만들어진 서열은 제공된 단백질들에 대한 다양한 아미노산 서열들의 비교로 부터 결정될 수 있는 바와 같이 잘 보존되어 있다(도 1 참조). 단백질 또는 이의 관련된 활성 부위에 대해 본 특허 출원에 제공된 서열들과 동일 또는 더 높은 정도의 동일성, 유사성 또는 상동성을 나타내는 임의의 다른 핵산 서열들은 본 발명에 포괄되며, 다른 프로단백질 전환효소 또는 등가 단백질 암호화 서열을 찾기 위한 프라이머 또는 프로브로서 이들의 용도 및/또는 이어서 이러한 단백질 암호화 서열에 돌연변이를 도입하기 위한 이들의 용도도 본 발명에 포괄된다. 예를들면, Maniatis 등의 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] 또는 핵산 서열의 클로닝 및/또는 스크리닝에 관한 임의의 다른 핸드북이 참조되어 왔다. 등가 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 3 내지 9에 따른 아미노산 서열을 갖는 것과 같은 프로단백질 전환효소의 활성을 나타낼 것이다. 돌연변이체 균류는 프로단백질 전환효소 또는 등가 단백질의 암호화 서열 내 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 돌연변이체 균류는 적절히 프로단백질 전환효소 또는 등가 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 것에 돌연변이를 포함할 수 있다. 적절한 구체예에서 본 발명에 따른 돌연변이체 균류는등가인 배양 조건하에서 대응하는 비돌연변이된 균류와 비교하여 감소된 점도를 나타낸다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 소정의 도입된 핵산 서열의 발현이 증가한 상기 임의의 구체예에 따른 돌연변이체 균류는 본 발명의 범주에 포함되고, 상기 균류는 대응하는 야생형 균류와 비교하여 등가인 조건하에 단백질 또는 폴리펩티드의 증가된 생산을 나타낸다. 서열번호 3 및 4에 의해 추론된 아미노산 서열 안에 포함된 A. 소재 프로단백질 전환효소의 활성 부위가 확인되었다.

피타제 또는 피타제 활성을 갖는 단백질 또는 임의의 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 바람직하게 재조합 피타제 또는 임의의 다른 이종 단백질 또는 임의의 다른 폴리펩티드를 생산하는 공정은 전술한 임의의 구체예에 따라 돌연변이체 균류를 배양하는 단계를 포함하고 본 발명의 범주에 속한다. 이러한 세포로부터 또는 세포로부터의 분비 이후에 형성된 단백질 또는 폴리펩티드를 수득하는 공정도 포함된다.

피타제 또는 피타제 활성을 보유한 단백질 또는 임의의 다른 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 핵산 서열로 형질전환하고 이후 도입된 임의의 핵산 서열을 발현시키고 그리고 선택적으로 하기의 프로세싱 및/또는 분비 및/또는 분리하기 위해 기술된 임의의 신규 균주를 사용하는 것은 본 발명에 포괄된다.

임의의 피타제 또는 피타제-유사 또는 임의의 다른 이종 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 적절하게 사용할 수 있다. 이것은 균류 또는 비균류 기원의 것일 수 있다. 산 불안정성 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 의해 바람직한 구체예가 형성된다. 적절히 단백질 암호화 서열은 단백분해효소-유사단백질을 암호화하지 않는다. 실시예들은 피타제 서열 및 아스페르길루스 소재 숙주에서의 형질전환 및 발현 용도에 적절한 다수의 이종 단백질을 보여준다. 나아가 발현되는 적절한 단백질의 예는 당업자에게 분명하다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더 예시된다. 실시예는 본 발명의 범위의 해석을 제한하는 것으로 간주되어서는 않된다. 다른 구체예는 관련 기술 분야의 설명 및 지식에 기초하여 당업자가 용이하게 상상할 수 있다. 본 명세서에 인용된 참조문헌의 내용은 인용으로 통합되어 있다. 청구범위는 본 발명이 의도하는 범의를 예시한다.

본 발명에 관한 실험적 상세 설명

아스페르길루스 소재 유전자 라이브러리의 제작

A. 소재의 지놈성 DNA는 이전에 기술한 프로토콜(Punt, van den Hondel, 1992)을 사용하여 ATCC11906으로부터 수득된 원형질체로부터 분리하였다. 분리 이후, Kolar 등의 문헌(1988)에 기술된 프로토콜을 사용하여 원형질체로부터 DNA를 추출하였다. 이어서, MboI로 DNA를 부분 소화시켜 평균 크기가 30-50kb인 DNA 단편을 산출하였다.

유전자 라이브러리의 제작에 사용되었던 벡터 pAOpyrGcosarp1은, Acc65I-BamHI 소화된 pHELP1(Gems등 1991)에서 pANsCos1(Osiewacs, 1994) 유래의 3kb BamHI-HindIII 단편과 pAO4.2(De Ruiter-Jacobs, 1989) 유래의 3.2kb Acc65I-HindIII 단편을 연결시킴으로써 제작되었다. 이 코스미드 벡터는 A. 오리재 pyrG 선별 마커를 운반하며, 사상균에서 자가복제한다. MboI 소화된 지놈성 DNA를 BamHI-소화된 pAOpyrGcosarp1에 연결하고, Stratagene Supercos1 벡터 키트를 사용하여 파아지 입자 내로 라이게이션 혼합물을 포장하였다. 총 30,00개의 클론에서, A. 소재 지놈의 약 30배 표현을 나타내는 각 클론을 수득하였다. 형성된 클론들의 풀 중 저장물(15% 글리세롤 중)을 후사용을 위해 -80℃에서 저장하였다.

AMDS 형질전환 방법 및 형질전환체

두개의 널리 사용되는 프로토플래스팅(protoplasting) 프로토콜 및 형질전환 프로토콜[수정된 OM-방법(Yelton et al., P.N.A.S. 81(1984)1470-1474) 및 NaCl-방법(Punt and Van den Hondel, Meth. Enzym. 216(1993) 447-457)]을 아스페르길루스 소재 균주 ATCC9362에 대해 시험하였다. 양 방법은 원형질체를 산출하였으나, OM-방법 에 의한 생존가능한 원형질체의 수율은 훨씬 더 우수하였다. 전체 수율은 A. 니거에 대해 통상 수득되는 것보다 낮았다. OM 방법을 사용하여 모든 A. 소재에 대해 예비 프로토플래스팅/형질전환 실험을 수행하였다.

형질전환의 경우, 벡터 p3SR2(amdS 마커를 운반)를 pAOpyrGcosARP1과 함께 병용하였다. 후자 벡터는 자가복제하는 아스페르길루스 벡터 Arp1의 유도체이며,이것은 지금까지 시험된 모든 아스페르길루스 종에서 동시형질전환하는 벡터로 사용될 때 매우 증가된 수의 (불안정한) 형질전환체를 산출하였다. 거의 모든 균주의 경우 충분한 원형질체(형질전환 당 약 10E6-10E7)를 수득하였다. 각종 A. 소재에 대한 적절한 AmdS 선별 조건을 분석한 결과 통상 사용되는 선별 아세트아미드 배지에서 대부분의 균주가 왕성하게 성장하는 것으로 나타났다. 분명히, WO97/04108에 보고된 바와 같이 A. 소재 amdS 형질전환체에 대해 제안된 아세트아미드 선별 조건은 A. 소재 형질전환체를 선별하는데 적합하지 않았다. 본 실험의 결과, 놀랍게도 AmdS+ 형질전환체가 오직 아크릴아미드 선별에 의해 선별될 수 있었다는 것이 밝혀졌다. 선별 아크릴아미드 평판 상에서조차도, 형질전환되지 않은 원형질체로부터 상당한 백그라운드가 관찰되었다. 1차 형질전환체의 선별에는 약 3주가 필요하며, 다수의 초기 선별된 추정 형질전환체는 위양성으로 나타났으며, 새로운 선별 아크릴아미드 평상에 옮긴 이후 백그라운드 성장만 나타났다. 형질전환체의 선별을 최적화하기 위해 이러한 백그라운드 성장을 감소시키려고 시도하였다. 선별 평판으로부터 글루코즈를 생략함으로써 개선된 결과가 수득되었다. 표 3에서, 개선된 선별 배지 및 일반 배지의 조성이 나타나 있다. 도 2a, b 및 c는 WO97/04108에 기재된 선별 배지와 표 3에 기재된 개선된 아크릴아미드 선별 배지 상에서 선별된 균주에 대해 관찰된 백그라운드 성장을 보여준다.

3개의 선별된 A. 소재 균주로 추가의 형질전환 실험을 한 결과, ATCC11906 및 ATCC20387의 프로토플래스팅 효율은 NaCl-방법을 사용하여 더 우수하였다. 성공적인 프로토플래스팅이 각종 시판용 프로토플래스팅 효소 제제(예, NOVOZYM,Caylase, Glucanex, 등)를 사용하여 얻어졌다. NaCl 형질전환 프로토콜에 기초하여, 3개의 선별된 A. 소재 균주를 amdS 선별 벡터 p3SR2 또는 이의 유도체로 형질전환시켰다. 수정된 아크릴아미드 선별 평판을 사용하여 왕성하게 성장하는 다수의 형질전환체를 수득하였으며, DNA가 없는 대조군 형질전환에서는 어떠한 성장도 관찰되지 않았다. 비-형질전환된 균사체의 백그라운드 성장을 회피하기 위한 다른 접근법은 야생형 A. 소재 amdS 유전자의 활성을 제거하는 것이다. 이것은 예를들면 A. 소재 amdS 유전자의 파괴에 의해 달성될 수 있다. 제1단계로서, ATCC11906 amdS 서열을 운반하는 특정 DNA 단편을 공개된 A. 오리재 amdS 서열(Gomi et al.,;1991, Gene 108, 91-98)로부터 유래된 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 이전의 실험은 엄격 하이브리드화에 의한 클로닝이 A. 니둘란스 및 A. 소재 amdS 서열 간의 낮은 수준의 서열 보존 때문에 성공적이지 않았다는 것을 보여주었다. amdS 유전자의 암호화 영역의 대부분을 운반하는 약 1.6kb의 예상 단편이 수득되었다. 클로닝된 PCR 단편의 양 단부의 서열분석 결과(도 3a 및 도 3b) A. 소재 amdS 유전자 일부의 클로닝이 확인되었다. 엄격 하이브리드화를 56℃에서 발생시키고 최종 세척을 3xSSC로 하였다. 클로닝된 서열은 공개된 A. 오리재 amdS 서열과 매우 유사하였다. 수개의 하이브리드화 클론(10.000 중 7)은 프로브로서 클로닝된 ATCC11906 amdS 단편을 사용하여 pAOpyrGcosarp1에서 ATCC11906 코스미드로부터 분리하였다. 완전한 amdS 유전자를 운반하는 단편을 서브클로닝한 이후, amdS 유전자 일부는 재사용가능한 pyrG 선별 마커로 치환하며 amdS 치환 벡터를 형성하였다. 이 벡터의 아스페르길루스 소재 ATCC11906PyrG로의 형질전환 결과, pyrG+ 형질전환체가 산출되었다. 이들 형질전환체를 아세트아미드 및 아크릴아미드 선별 평판에서 이어서 분석한 이후, 수개의 이들 형질전환체는 감소된 백그라운드 성장을 보여주었다. 이들 균주 몇개를 서던 분석한 결과, 예상된 유전자 치환이 발생되었다는 것이 밝혀졌다. 이들 균주 중 하나는 아크릴아미드 선별 평판을 사용하여 A. 니둘란스 amdS 유전자로 연이어 형질전환시킨 결과, 다수의 amdS+ 형질전환체가 산출되었다.

PYRG 형질전환 방법 및 형질전환체

(1) 초기 실험

A. 소재의 경우 도입부에 기술한 바와 같이 다른 균류가 pyrG 돌연변이체를 형성하는 선행기술에 사용된 표준 실험의 결과 다수의 플루오-오로트산(FOA)-내성 균주가 산출되었다. 그러나, 이들 균주 모두는 우리딘 없이 배지에서 성장할 수 있었으며, 따라서 pyrG 돌연변이체로 간주되지 않았다. 적절한 돌연변이체 균주를 분리하고자 하는 본 발명자의 최종 목적과 함께, 다수의 대안법이 이어졌다.

(2) 근처-상동성 유전자의 파괴

A. 소재 및 A. 오리재 유래의 pyrG 유전자는 서열상 매우 유사하다(엄격 조건하에 수행된 서던 하이브리드화에 의해 확인되었음)는 예상에 기초하여, Gouka등(1996)에 의해 이전에 기술된 접근법을 사용하여 A. 오리재 pyrG 유전자의 돌연변이체 변형으로 A. 소재 pyrG 유전자를 파괴하는 실험을 수행하였다. 65℃에서 엄격 하이브리드화시키고 0.3xSSC로 최종 세척하였다. pyrG 암호화 영역의 일부를 운반하는 0.5kb ClaI 단편이 결실된 A. 오리제 pyrG 파괴 벡터가 제작되었다(도4). 상기 새로운 벡터로부터 나온 XbaI pyrG 단편을 형질전환 및 FOA 내성 형질전환체의 직접적인 선별에 사용하였다. 수득된 FOA 내성 콜로니는 어느 것도 우리딘을 필요로 하지 않았다.

(3) UV 돌연변이유발 및 여과 농축화

특정 돌연변이체 균주의 수율을 개선시키는 다른 접근법은 여과-농축 단계(Bos et al. 1986, Thesis, Agricultural University Wageningen)를 사용하는 것이다. UV 돌연변이유발된 포자는 최소 배지(MM) 액체 배양의 접종에 사용한다. 반복된 밤새 배양의 결과로부터 최소 배지에서 발아할 수 없는 이들 포자(pyrG 돌연변이체 포자)는, 미라클로스(myracloth)를 통해 여과함으로써 성장된 균사체로부터 분리된다. 수개의 농축 단계 이후 수득된 포자는 FOA 함유 평판 상에서 포자를 접종함으로써 PyrG 표현형에 대해 시험하였다. 다시, 결과물인 FOA 내성 콜로니 중 어느 것도 우리딘을 필요로 하지 않았다. 또한 우리딘 함유 MM 평판 상에서의 상기 농축화 이후 수득된 콜로니 중 어느 것도 우리딘을 필요로 하지 않은 것으로 나타났다.

(4) 수정된 선별 조건

A. 소재로부터 pyrG 돌연변이체를 분리하고자 하는 본 발명자의 이전 시도는 요구되는 pyrG 돌연변이체가, 우리딘 영양요구성 분석용 FOA 선별 배지에 사용되는 외인성 우리딘을 이용할 수 없는 능력을 제안하지 못했다. 우리딘에 이어지는 우라실을 현재 함유하는 수정된 선별 FOA 배지를 사용하여 새롭게 분리 시도하였다. 이 접근법으로부터, 우라실을 필요로 하는 수개의 FOA 내성 돌연변이체가 수득되었다.이들 균주를 재시험한 결과 이들은 우리딘 보충된 최소 배지에 성장할 수 없다고 나타났다. 몇몇 우라실-요구성 균주로 차후 형질전환 실험한 결과, 이들 돌연변이체는 정말 균류 pyrG 유전자(예, 벡터 pAB4.1; A. 니거 pyrG)로 보충될 수 있다는 것을 보여주었다. 오직 우리딘으로 보충된 최소 배지에서 pyrG 돌연변이체가 성장할 수 없는 능력은 관련된 아스페르길루스 종(A. 니둘란스, A. 니거, A. 오리재) 및 각종 기타 균류 종에서 전례없는 관찰사항이다.

(5) 재사용가능한 선별 마커

A. 소재에 대한 다방면의 유전자 수정은 단일 균류 균주에서 다수의 상이한 유전자를 수정, 파괴 및 발현하는 가능성을 필요로 하며, 이것은 (일련의) 상이한 선별 마커의 유용성을 필요로 한다. 그러나, 돌연변이체(FOA 선별) 및 형질전환체(우라실-부재 배지) 모두를 선별할 수 있는 pyrG와 같은 마커의 유용성은 차후 실험에서 동일한 마커의 반복된 사용 가능성을 제공한다. 이러한 접급법을 위해, pyrG 마커 유전자를 고안하였으며, 여기서 보충 서열은 pyrG 유전자의 3' 인접 단부 유래의 일직선 반복 서열에 인접하였다. 형성된 플라스미드는 pAB4-1rep이다. 이 벡터의 제작은 도 5에 상세히 설명되어 있다. 벡터의 전체 서열은 서열번호 17에 주어져 있다. 이 벡터로 A. 소재 pyrG 돌연변이체를 형질전환시킨 결과 벡터 pAB4-1과 유사한 수의 PyrG+ 형질전환체를 산출한다. 그러나, 이어서 선별된 pAB4-1 및 pAB4-1rep 형질전환체의 포자를 FOA 선별 평판에 평판배양한 결과, pAB4-1rep 형질전환체의 경우 FOA 내성/우라실을 더 요구하는 다수의 콜로니가 산출되었다. 이들 FOA 내성/우라실 요구 콜로니들의 서던 분석 결과, 대부분의 pAB4-1rep 균주에서는A. 니거 pyrG 마커 유전자가 결실되어 오직 소규모의 0.7kb 반복 영역이 삽입 위치에 남아 있으며, pAB4-1 균주에서는 A. 니거 유전자가 여전히 존재하고 추측컨대 pyrG-음성 표현형을 산출하는 돌연변이를 획득하였음을 보여주었다.

발현 숙주: 균주 선별

단백분해효소 생산

균류 발현 시스템의 매우 중요한 특성은 각종 배양 조건하에 생산되는 균류 단백분해효소의 수준 및 유형이다. 때때로, 용이하게 형질전환될 수 있는 균주는 발현 생성물에 해로운 배양 배지의 산성화 또는 단백분해효소의 생산으로 인해 발현 숙주로서 적합하지 않다. 각종 A. 소재 균주의 성장 거동 분석 결과, A. 니거에서 관찰되는 것과 대조적으로 배양 배지의 산성화는 아가계 평판(MacConkey) 또는 진탕 플라스크 배양물에서 발생하지 않았다고 밝혀졌다. 사실상, 진탕 플라스크 배양물에서, 분석된 3개의 배지 유형과 관련없이(표 4), 대부분의 경우 알카리 pH조차도 배양물에서 얻어졌다. 이러한 결과 및 문헌 데이타에 기초하여, 주로 알카리 단백분해효소가 A. 소재 배양액체에 존재할 것이라고 예상된다. 각종 균주의 배양 액체 중 단백분해효소 활성을 분석하기 위해, 우유 청정화 분석(milk clearing assay)을 수행하였다. 부가하여 배지 시료를 상이한 단백질(예, 소 혈청 알부민(BSA))과 함께 항온처리하고, 이들 단백질의 분해를 적절하게 수행하여 생산물 범위에 대해 발현 숙주로서 시험 균주의 적합성을 평가하였다. A. 니거로 한 본 발명자의 이전 실험에서와 같이 BSA가 선택되었다. 이 단백질은 단백분해효소에 매우 민감한 것으로 나타났다. A. 테레우스 피타제를 단백분해에 불안정한 다른 단백질의 예로서 선택하였다. 성장 콜로니 주변에 우유 청정화 대역이 형성되는 것에 의해 보여지는 우유 단백질의 분해는 일반적으로 단백분해효소 활성에 대한 척도로서 수용된다. BSA 검출은 SDS-PAGE 겔을 쿠마시에 염색하여 수행하였다. 피타제의 경우 특이 항체를 사용한 웨스턴 분석을 수행하였다. 표 4에 나타난 바와 같이, A. 니거 배양액에서 분해의 청정화 차이는 이것이 A. 소재 배양액의 것과 비교될 때 분명하다. A. 니거 배양액(pH 3-4)에서, 신속한 BSA 분해가 일어났다. 더 풍부한 배지에서 나온 A. 소재 배양액에서는 A. 니거 배양액에서보다는 작지만 BSA 분해가 발생한다. ATCC9362, ATCC11906 및 ATCC20387 배양액를 제외한 대부분의 A. 소재 배양액(pH 7-8)에서는 신속한 A. 테레우스 피타제 분해가 발생한다. 통상, 최저 피타제 분해하는 균주는 또한 시험 조건 하에 낮은 BSA 분해를 보여준다. 특히 두개의 A. 오리재 균주 ATCC20235 및 ATCC46250은 대부분의 A. 소재 균주보다 더 높은 단백분해 활성을 보여준다.

배양액 pH의 차이가 관찰되는 효과를 야기하는 것을 배제하기 위해, 유사한 분해 실험도 pH를 pH 4.5(50mM Na/HAc), pH 5.8(50mM Na/HAc) 및 pH 8.3(50mM Tris/HCl)로 적정한 배양액을 가지고 수행하였다. 표 5는 이들 시료로 수득된 분해 데이타를 나타낸다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, pH 7-8에서 최고의 단백분해 활성을 보유하는 A. 오리재 ATCC20235는 다른 pH 값에서 높은 단백분해작용을 나타낸다. A. 테레우스 피타제의 분해는 주로 pH 8에서 일어난다. 이전에 밝혀진 것과 유사하게, ATCC11906 및 ATCC20387은 낮은 피타제 분해 활성을 보여주었다. ATCC9362는 풍부한 배지에서 피타제 분해를 보여주었다. A. 소재에 의한 BSA 분해는 표 4에나타난 데이타와 상당한 차이를 보여주지 않았다.

결국, 이들 단백분해효소 분석 결과 3개의 낮은 단백분해효소 A. 소재 균주, 즉 ATCC9362, ATCC11906 및 ATCC20387을 확인하였다. 따라서, A. 소재는 분명히 일정범위의 단백질에 대하여 발현 숙주로서 사용할 수 있으며, 선행기술의 형질전환 및 발현 시스템 보다 나은 일련의 장접을 제공할 수 있다.

균주 개선

일단 형질전환능력 및 발현 가능성이 아스페르길루스 소재에 대해 확인된 이상, 발현상 강화된 특성을 갖는 추가의 균주를 형성시킬 수 있는 수단이 고려되었다. 그자체로 또는 병용하여 사용될 수 있는 두개의 상이한 접근법이 개발되어 단백질 발현에 대한 개선된 신규 균주를 제공하였다.

한편, 단백분해효소 결여 돌연변이체를 개발하는 가능성이 연구되었으며, 발현 수준 상 이것의 영향을 평가하였다. 다른 한편, 보정된 형태구조를 갖는 균주가 발효 특성을 개선하는 관점에서 개발되었다. 지금까지 이를 달성하기 위해, 아스페르길루스 소재뿐만 아니라 아스페르길루스들 그리고 사실 일반적으로 균류에 적용가능한 공개되지 않고 제안되지 않은 방법은 다음과 같다.

단백분해효소 결여 돌연변이체의 개발

단백분해효소 결여된 A. 소재 균주를 수득하기 위한 두개의 접근법은 다음과 같다. 제1 접근법에서 ATCC11906 및 ATCC11906-유래의 균주들로부터 나온 포자를 UV로 돌연변이유발시켰다. 제2 접근법에서, 주요 알카리 단백분해효소의 유전자 파괴를 수행하였다.

UV 돌연변이체

A. 소재 ATCC11906로부터 새로 수집한 포자 또는 그 pyrG 유도체 중 하나를 Biorad UV-챔버에서 20-50% 생존률을 산출하는 양으로 UV-돌연변이유발시켰다. 순차적인 희석물을 탈지유 평판상에서 평판배양하였다(Mattern et al., 1992). 5000 UV-생존 균주들로부터 상당히 감소된 우유-청정화 원(halo)을 갖는 4개의 돌연변이체 균주들을 수득하였다.

AlpA 유전자 파괴

이 접근법에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 재사용가능한 pyrG 선별 마커를 운반하는 파괴 벡터를 사용하여, ACTT11906으로부터 클로닝한 내인성 alpA(알카리 단백분해효소) 유전자를 파괴하였다.

ATCC11906 코스미드 라이브러리를 (PyrG 코스미드로) 제작하였다. 10.000 비의존적 코스미드 클론들로부터 초기에 4개가, 프라이머 MBL1784 및 MBL1785로 PCR하여 수득한 A. 소재 alpA 단편과 상동성 조건하에 하이브리드한다고 밝혀졌다. 4개의 클론을 재스크리닝한 결과, 하나의 클론하고만 오직 강력한 하이브리드화를 하는 것으로 나타났다. 이 클론으로부터 나온 4kb EcoRI 및 2.5kb HindIII 단편은 완전한 유전자를 운반한다고 예상되며, 이들을 서브클론하고 제한 효소 소화 및 서열 분석으로 특성규명하였다. 이들 서브클론에 기초하여, 새로운 유전자-치환 벡터가 도 6에 기술된 바와 같이 제작되었다. ATCC11906 pyrG 유도체의 형질전환의 경우, 벡터를 EcoRI으로 소화시키고, 8.7kb alpA 결실 단편을 사용하여 형질전환시켰다(도 6 참조). 치환 카세트로 ATCC11906 pyrG5를 형질전환시킨 결과 감소된 우유-환(halo)을 갖는 다수의 형질전환체가 산출되었다. 이들 균주의 서던 분석은 alpA 유전자의 성공적인 결실을 나타내었다. pyrG 마커를 이들 균주 중 하나의 형질전환에 차후 사용하기 위해, 이 균주로부터 나온 포자를 pyrG 돌연변이체에 선별적인 FOA 함유 배지 상에 평판배양하였다. 재사용가능한 pyrG 마커를 보유하며 정확하게 삽입된 파괴 카세트를 갖는 균주로부터 다수의 FOA 내성 콜로니를 수득하였다. 야생형 균주 중 자발적인 FOA 내성 돌연변리체에서 얻은 결과와 대조하여, 이들 파괴 균주로부터 수득한 FOA 균주는 거의 모두 우라실을 필요로 하며, 다시 PyrG 음성으로 나타났다. 서던 분석을 사용하여 alpA 좌위에서 원하는 pyrG 마커 제거를 확인하였으며, 오직 700bp "발자국"만이 남았다.

UV 및 파괴 돌연변이체에서 단백분해효소 활성의 분석

ATCC11906의 상이한 낮은 단백분해효소 유도체에서 단백분해효소 생산의 수준을 분석하기 위해, 조절된 회분식 발효 실험을 수행하였다. 형성된 배양 상청액으로부터 단백분해효소 활성을 다양한 pH값에서 측정하였다. alpA 유전자를 결실시킨 결과, 알카리 pH에서 단백분해 활성이 강력하게 감소되었다. UV 돌연변이체 중 하나에서 단백분해효소 활성을 분석한 결과 pH6 및 pH8 모두에서 단백분해 활성의 거의 완전한 부재를 보여주었다. 결국, 이들 균주에서 생산된 분비성 단백질에 대한 단백분해작용의 수준은 부계 균주에서 관찰된 것 보다 상당히 낮았다.

저점도 돌연변이체의 개발

A. 소재로 초기 조절된 회분식 또는 유가식 발효를 시도한 결과 상당한 생물량 수율을 산출하였으나, 발효기 용기 내 배양 점도 및 포자형성 현상 모두는 덜유리한 특성을 보여주었다.

따라서, 원하는 숙주 균주에서 이들 특성을 개선하고자 시도하였다. 각종 특허 출원은 저점도 돌연변이체가 각종 방법의 스크리닝에 의해 분리될 수 있다고 교시한다. WO96/02653 및 WO97/26330은 저점도를 나타내는 규명된 돌연변이체를 전혀 기술하지 않고 있다. 그러나, 여기에서, 본 발명자는 A. 소재로부터 완전히 특성규명되고 완전히 규명된 저점도 돌연변이체로 예상치 못한 신규 경우를 기술하고 있다. 이 유기체 유래의 프로단백질 프로세싱 돌연변이체는 예상치 못한 변종 성장 표현형(초-분지(hyper-brnaching))을 보유하면서 단백질 생산성에 대해서는 전혀 해로운 효과가 관찰되지 않았다. 이 균주로 조절된 발효 실험을 한 결과 증가된 생물량 농도가 상당한 저점도 값에서 수득되었다. 관찰된 특성은 A. 소재 뿐만아니라 다른 균류, 예컨대 A. 니거에도 존재하였다.

(1) A. 니거 프로단백질 프로세싱 돌연변이체의 제작

A. 니거 유래의 프로단백질 전환효소 암호화 유전자를 클로닝하기 위해, 사카로미세스 세레비시애 KEX2, 스키조사카로미세스 폼베 KEX1 및 제노푸스 래비스 PC2 유전자 유래의 특정 프로브를 사용하여 이종 하이브리드화를 수행하였다. 그러나, 어떠한 특정 하이브리드화 신호도 매우 낮은 엄격 하이브리드화 조건(47℃, 6xSSC에서 세척)에서 조차 수득되지 않았으며, 대응하는 A. 니거 유전자를 클로닝하는 접급법의 사용을 배제하였다.

A. 니거 유래의 프로단백질 전환효소 암호화 유전자를 클로닝하는 다른 접근법으로서, PCR이 사용되었다. 각종 효모 종 및 고등 진핵세포(도 1) 유래의 각종프로단백질 전환효소 유전자의 비교에 기초하여, 상이한 PCR 프라이머(서열번호 10, 13 및 18 내지 23)가 고안되었으며, 이 프라이머들은 각각 2048, 49152, 4, 2, 2, 512, 2048 및 4608번 축퇴되어 있다. 프라이머 PE4 및 PE6을 사용한 증폭으로부터 두개의 개별 클론을 획득하였으며, 상기 클론의 암호된 단백질 서열이 에스, 세레비시애 KEX2 서열(서열번호 24)에 상당한 상동성을 보였다. 이들 클론은 추가 실험을 위해 사용되었다.

클로닝된 PCR 단편의 다른 프로단백질 전환효소 유전자와 관찰된 상동성에 기초하여, 대응하는 A. 니거 유전자는 pclA('프로단백질 전환효소-유사(proproteinconvertase-like)'의 약자임)로 지칭되었다. A. 니거의 지놈성 소화물을 서던 분석한 결과 pclA 유전자는 A. 니거 지놈에서 밀접하게 관련된 유전자를 전혀 갖지 않는 단일 사본의 유전자이었으며, 엄격 하이브리드화 조건(50℃; 6xSSC에서 세척)에서 조차도 추가의 하이브리드화 신호가 분명하지 않았다. A. 니거 N401의 EMBL3 지놈성 라이브러리를 1차 스크리닝한 결과 비록 약 10-20개 지놈 등가물을 스크리닝하였음에도 불구하고 양성 하이브리드화 플라크가 산출되지 않았다. 2차 스크리닝에서, pclA 유전자의 전길이 지놈성 사본을 EMBL4 내 A. 니거 N400 지놈성 라이브러리로부터 분리하였다(Goosen et al., 1987). 5-10개의 지놈 등가물을 스크리닝한 후 수득된 8개의 하이브리드화 플라크 중 6개는 제1 재스크링 후 남아있었다. 이들 6개 클론 모두는 십중팔구 완전한 사본의 pclA 유전자를 운반하였으며, PCR 단편을 갖는 모든 클론들에서(지놈성 DNA에서 관찰되었던 바와 같이) 두개의 하이브리드화 EcoRV 단편인 3kb 및 4kb가 존재하였다(PCR 단편(서열번호 24)이 EcoRV 제한 부위를 함유한다는 것에 유의하라). 다른 프로단백질 전환효소의 크기 비교에 기초하여, 함께 이들 단편은 5'- 및 3'-인접 서열과 함께 완전한 pclA 유전자를 함유할 것이다. 두개의 EcoRV 단편 및 중첩하는 5kb EcoRI 단편을 추가 특성규명하기 위해 서브클로닝하였다. pclA 유전자를 운반하는 DNA 단편의 자세한 제한 지도는 도 7에 주어져 있다.

도 7의 제한 지도에 기초하여, pclA 유전자의 완전한 DNA 서열을 EcoRI 및 EcoRV 서브클론으로부터 결정하였다(서열번호 3). 수득된 서열의 분석 결과, S. 세레비시애 KEX2 유전자 및 다른 프로단백질 전환효소와 상당한 유사성을 갖는 개방형 해독틀이 밝혀졌다. 추가의 비교에 기초하여 2개의 추정 인트로 서열(서열번호 3, 위치 1838 내지 1889, 위치 2132 내지 2181)을 암호화 영역에서 동정하였다. pEMBLyex계 A. 니거 cDNA 라이브러리 상에서 추정 인트론에 인접한 프라이머로 차후 PCR 분석한 결과, 이들 두개 서열 중 가장 5'인 것만 실질적인 인트론을 나타내었다고 밝혀졌다. 암호화된 PclA 단백질의 일반적인 구조는 분명히 다른 프로단백질 전환효소(서열번호 25 및 도 8)와 유사하였다. 다른 프로단백질 전환효소와 PclA 단백질의 전체 유사성은 약 50%이었다(도 1).

클로닝된 pclA 유전자가 기능적인 단백질을 암호화하는 기능적인 유전자라는 것을 입증하기 위해, pclA 유전자가 없은 균주의 제작하려고 시도하였다. 따라서, 대부분의 pclA 암호화 영역이 A. 오리재 pyrG 선별 마커 유전자로 치환된, pclA 결실 벡터인 pPCL1A가 형성되었다. 이후, 이 벡터로부터 5kb EcoRI 삽입 단편이 각종 A. 니거 균주를 형질전환시키는데 사용되었다. (pyrG 선별에 기초한) 이들 형질전환으로부터, 다수의 형질전환체가 수득되었다. 흥미롭게도, 형질전환체의 한 분획(1-50%범위로 다양함)이 매우 독특한 변종 표현형을 나타내었다(도 9). 수개의 야생형 및 변종 형질전환체의 서던 분석 결과, 심각하게 제한된 성장 표현형을 나타내는 이들 변종 형질전환체는 pclA 유전가를 소실하였다고 밝혀졌다. 야생형 성장을 나타내는 모든 균주는 야생형 pclA 유전자에 인접하여 또는 비상동성 위치에서 삽입된 치환 단편의 사본을 운반하는 것으로 나타났다.

각종 글루코아밀라제 융합 유전자를 운반하는 선택된 pclA 돌연변이체 균주에서의 단백질 생산 분석 결과, 프로세싱되지 않은 융합 단백질이 생산되었다. pclA 돌연변이체에서 프로세싱되지 않은 글루코아밀라제-인터류킨-6 융합 단백질이 고수준으로 생산되었다. 단백질 분석을 통해, pclA 돌연변이체 균주에서 완전히 프로세싱된 내인성 글루코아밀라제가 형성되지 않았으나, 프로-글루코아밀라제만은 예외이다.

융합 단백질의 수율을 더 개선하기 위해, 조절된 회분식 및 유가식 발효를 수행하였다. 놀랍게도, pclA 돌연변이체 균주의 발효 특성은 생산성의 손실 없이, 많이 감소된 점도/생물량 비를 산출하는 부계 균주 보다 월등히 우수하였다.

(2) A. 소재 프로단백질 프로세싱 돌연변이체의 제작

대응하는 돌연변이체 A. 소재를 제작하기 위해 ATCC11906 코스미드로 라이브러리부터 A.니거 지놈성 코스미드 클론의 저점도 돌연변이체의 기능적 보충물을 분리하였으며, 이것은 A. 소재 프로단백질 프로세싱 단백분해효소 pclA 유전자를 포함하였다. 분리된 서열 서열번호 4의 부분적 서열 분석은 A.소재 pclA 유전자의 클로닝을 확인시켰다. 도 10은 A. 니거 및 A. 소재 pclA 유전자 중 일부의 DNA 서열 비교를 보여준다. A. 소재 서열 및, A.소재 pclA 유전자의 암호화 영역을 갖는 부분적인 제한 지도에 기초하여, SmaI 단편으로서 재사용가능한 pyrG 마커를 안쪽에 클로닝하기 위한 A. 소재 pclA 유전자 내 EcoRV-부위를 사용하여 치환 벡터를 형성시켰다(도 11). 형성된 벡터를 ClaI로 부분적으로 소화시켜 10.5kb 델타-pcl 단편을 수득하였다(도 11). 이 단편을 분리하여 A. 소재 pyrG 균주의 형질전환에 사용하였다. 유전자 치환 벡터를 사용하여 ATCC11906 및 ATCC11906 유도체에서 pclA 돌연변이체를 형성하였다. 형성된 균주를 사용하여 상동성 및 이종성 단백질을 발현시켰다. 형성된 형질전환체 몇몇으로 조절된 발효 실험을 한 결과, 발효 특성이 개선되었으며, 특히 배양물의 점도/생물량이 낮아졌다는 것이 밝혀졌다.

(3) 아스페르길루스 pclA과 상동성인 균류 유전자의 클로닝

A. 니거 및 A. 소재 pclA 유전자로부터 추론된 아미노산 서열과 다른 프로단백질 프로세싱 효소의 비교에 기초하여(도 1), 잘 보존된 서열의 암호화 또는 비암호화 가닥에 해당하는 수개의 올리고뉴클레오티드 혼합물을 고안하였다(서열번호 10 내지 16).

이들 올리고뉴클레오티드 혼합물을, 트리초데르마 레에세이 QM9414, 푸사리움 제네나툼 ATCC20334, 페니실리움 크리소제놈 P2, 트라메테스 베르시콜로르, 리조푸스 오리재 ATCC200076, 및 아가리쿠스 비스포루스 HORST 유래의 염색체 DNA로 PCR하는데 사용하였다. 사용된 주형 DNA에 따라, 암호화 및 비암호화 가닥 올리고뉴클레오티드의 하나이상의 조합으로 PCR 증폭(30사이클; 1분 94℃; 1분 40℃; 2분68℃)한 결과 특정 PCR 산물을 산출하였다. 표 6은 다양한 증폭 반응의 결과를 나타낸다. 증폭을 위해 사용되는 2개의 올리고뉴클레오티드 혼합물 중 하나를 사용하여 다수의 수득된 PCR 단편으로 서열분석을 수행하였다. 이들 분석 결과, 이들 상이한 균류로부터 각종 pclA 상동성을 확인하였다. 도 12는 각종 DNA 단편과 대응하는 추론된 아미노산 서열을 나타낸다(서열번호 5 내지 9).

(4) 생물량 및 점도 결정 예

하기 작동 파라미터 데이터 범위는 다수의 상이한 균류 균주를 사용한 균류 발효에 대해 측정하였다.

점도:

20℃에서 작동하는 Haake Viscotester VT500상에서 센서 시스템 MVDIN(용기 번호 7)을 사용하여 점도를 측정한다. 발효 액체배지의 새로운 시료를 수득하고 측정 세포에 액체배지 40ml를 둔다. 정해진 바늘 속도에서의 짧은 기간의 평형(4분) 이후, 점도를 측정한다. 이 측정은 10개의 상이한 바늘 속도에 대해 반복한다. 바늘 속도와 측정 세포 인자를 곱한 결과 전단 속도가 산출된다. 점도 η(단위 센티포즈=cP)을 전단 속도γ(1/s)에 대해 그래프를 그리고, 발효 액체배지의 점도 프로필을 제공한다.

점도 범위는 상기 절차를 사용하여 특정된 균류 유기체를 사용한 발효에 대하여 측정하였다(표 7).

생물량:

생물량은 하기 절차에 따라 결정된다:

알루미늄 무게측정 접시에서 5.5cm 여과지(Whatman 54)의 무게를 미리 측정한다. Buchner 깔대기 상 5.5cm 종이를 통해 전체 액체배지 25.0ml를 여과시키고, 25.0ml 탈이온수로 여과 케이크를 세척하고, 세척한 케이크를 정치하고 무게측정 팬에서 여과한후 60℃에서 밤새 건조시킨다. 100℃에서 1시간동안 건조를 마친 후, 건조기에 정치하여 냉각시킨다. 건조된 물질의 무게를 측정한다. 총 생물량(g/l)은 초기 및 최종 무게의 차이를 40배한 값이다.

단백질:

BioRad 분석 공정을 사용하여 단백질 수준을 측정하였다. 상기 제공된 데이타는 발효 종료점까지 발효 공정 안으로 48시간 측정된 값을 나타낸다: 아스페르길루스 및 트리초데르마의 값 모두는 상업적으로 관련있는 균류 유기체에 대한 것이며 실질적인 상업적 데이터를 반영한다.

A. 소재 lfvA 및 A. 소재 pclA와 같은 균류 균주는, 저점도가 발효에서 더 낮은 힘 입력 및 전단의 사용을 허용하여 생성물 상의 전단 압력이 생성물 분자의 물리적 손상으로 인해 생산성에 해로울 수 있는 경우 산소 요구량을 충족시키는 장점을 보유한다. 단백질 고생산에서 낮은 생물량 생산은 생성물로의 발효 배지 전환에서 더 효과적인 유기체의 필요성을 나타낸다. 따라서, A. 소재 돌연변이체는 더 우수한 생물량 및 점도 데이터를 제공하면서, 또 일반 공개 수집물에서 통상 기탁된 아스페르길루스 또는 트리초데르마 레에세이 균주에 대한 것보다 분명히 더 우수하며, 상업적으로 사용되는 2개의 시스템과 적어도 같은 량의 단백질을 산출하고, 사실 훨씬 더 많은 단백질을 산출한다.

A. 소재 lfvA에 의해 생산되는 낮은 생물량 농도로 단백질 고생산을 하는 것은, 제한 발효 조건에 이르기 전에 원하는 생성물에 대해 증가된 생물량의 결과가 증가된 생산성을 산출한다면 생물량이 더높은 배수로 증가되는 발효 조건을 개발할 수 있게 한다. T. 론기브라치아툼 및 A. 니거 유기체에 의해 생산되는 생물량 및 점도의 현재 고수준은 생물량 및 점도의 현재 수준이 실질적인 발효 조건을 거의 제한하기 때문에 생물량의 증가를 제한한다.

효과적인 유전자 발현

(1) 이종 조절 서열

상이한 균류 발현 신호을 운반하는 3개의 GUS 리포터 벡터(A. 니둘란스 PgpdA; pGUS54, A. 니거 PglaA; pGUS64, A. 니거 PbipA; pBIPGUS)와 amdS 선별 벡터 p3SR2 또는 이의 유도체로 3개의 선택된 A. 소재 균주를 동시 형질전환하였다. 대표적인 형질전환체에서 GUS 유전자의 발현을 분석하였다(표 8). 결과로부터, 시험 조건하에, gpdA 프로모터가 약 5000 U GUS/mg 단백질을 산출하는 가장 최상의 프로모터였다. 이것은 세포성 단백질의 총량 중 약 5%에 해당한다. bipA 프로모터는 약 30%의 gpdA 활성을 산출하고, 이는 A. 니거에서 수득된 발현 데이타에 해당한다. 놀랍게도, A. 니거에서 매우 활성이 있는 glaA 프로모터(적어도 gpdA 만큼 활성이 있음)는 A. 소재에서 1% 이하의 gpdA 활성을 산출한다.

(2) A. 소재 조절성 서열

또한, 본 발명자는 아스페르길루스 소재 상동성 프로모터를 분리하였으며, 발현 시스템 내 적용성을 평가하였다. 발현 중 몇몇 예에서는, 이종 프로모터보다동종 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 동종 프로모터가 이종 프로모터보다 더 효율적인지 여부를 평가하는 것은 흥미로왔다.

A. 오리재로부터 입수가능한 서열(서열번호 26 내지 31)에 기초한 프라이머를 사용하여 3개의 효율적으로 발현되는 A. 소재 유전자, 즉 alpA(알카리 단백분해효소; 유도성), amyA(아밀라제; 유도성) 및 gpdA(글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소; 구성성)을 PCR 클로닝하고자 시도하였다. 도 13 a, b 및 c는 이 접근법에 사용된 각종 PCR 프라이머의 공개된 A. 오리재 서열 내 위치 및 서열을 나타낸다. A. 소재 ATCC11906 유래의 지놈성 주형 DNA를 사용하여 PCR 증폭하였다. 초기 PCR 증폭(30사이클;1분 94℃; 1분 40℃; 2분 68℃) 결과, gpdA에 대해 예상되는 크기(400bp)의 특정 PCR 산물을 산출하였다. 다른 2개의 PCR 반응의 경우, 생성물이 수득되지 않았다. 따라서, aplA의 경우 PCR 조건을 덜 엄격하게 한 결과(10사이클; 1분 94℃; 1분 25℃; 2분 68℃ + 20사이클; 1분 94℃; 1분 40℃; 2분 68℃), 약 1000bp의 특정 alpA PCR 산물을 산출하였다.

클로닝된 유전자의 완전한 서열을 결정하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, A. 소재 ATCC11906 gpdA 프로모터 영역은 다른 gpdA 프로모터 서열과 매우 높은 상동성을 보유하고 있으며, alpA 프로모터는 실질적으로 A. 오리재 alpA 프로모터와 동일하였다(서열번호 32 및 33). 이들 A. 소재 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 운반하는 발현벡터는 상당한 수준의 유전자 발현을 보여준다.

이종 단백질 생산

산 단백분해작용에 민감하다고 알려져서 잘 알려진 다른 발현 시스템에서 효과적으로 발현될 수 없는 다수의 이종 단백질을 시험하였다. 또한, 대안 시스템에서 이미 효과적으로 발현되는 단백질도 시험하여 아스페르길루스 니거와 같은 공지의 다른 발현 시스템에 대하여 아스페르길루스 소재에서 달성한 발현 수준 비교에 의해 평가하였다.

피타제 생산

각종 균류 피타제를 운반하는 DNA 단편(Wyss et al.(1999) Appl. Environ. Microbiol. 65, 359-366)을 pAN52-1NotI 내 A. 니둘란스 gpdA 프로모터의 하류에 있는 ATG 코돈 - 3' 블런트 단부의 단편에 도입된 5' NcoI 또는 BspHI 부위로서 연결시켰다. amdS 및/또는 pyrG 선별 마커를 사용한 A. 소재의 동시형질전환 실험에 형성된 벡터를 사용하였다. 피타제 생산 형질전환체는 기술된 피타제 평판-분석을 사용하여 스크리닝하였다.

다중사본 코스미드 접근법을 사용하여 더 개선된 피타제 발현 벡터를 형성하였다. 이 접근법에서 수개의 피타제 발현 카세트 사본을 다중 클로닝 부위 벡터(pMTL 시리즈, Chambers et al.,(1988) Gene 68, 139-149)에 재클로닝하여 EcoRI 단편으로서 분리하였다. 이들 EcoRI 단편의 수개 사본을 포장을 통해 코스미드 벡터 pAN4cos1 안으로 클로닝하여(Verdoes et al.(1993) Transgenic Research 2, 84-92), 그 결과 다수의 발현 카세트를 운반하는 코스미드 클론을 산출하였다. 형성된 클론을 amdS 선별 마커를 사용하는 A. 소재 안으로 도입시켰다. 피타제 평판-분석을 사용하여 피타제 생산에 대해 amdS+ 클론을 스크리닝하였다.

GLA 융합 접근법(예, Broekhuijsen et al(1993) J. Biotech. 31, 135-145)를사용하여 추가의 피타제 발현 벡터를 형성하였다. 이 목적을 위해, 성숙한 A. 푸미가투스 피타제 단백질을 암호화하는 피타제 유전자 단편을, 편리한 제한 부위 및 융합 PCR을 사용하여 벡터 pAN56-1 내 글루코아밀라제 운반 유전자의 3'단부에 융합하였다(Genbank 허가 번호 Z32700). 프로단백질 프로세싱 부위(Asn-Val-Ile-Ser-Lys-Arg)를 암호하하는 서열을 유전자-융합 중 글루코아밀라제와 피타제 부위 사이에 도입시켰다. amdS 및/또는 pyrG 선별 마커를 사용한 A. 소재의 동시형질전환 실험에서 형성된 벡터를 사용하였다. 기술된 피타제 평판-분석을 사용하여 피타제 생성 형질전환체를 스크리닝하였다.

진탕 플라스크 발효를 수행한 결과 상당한 수준의 활성이 있는 피타제를 산출하였다. 수율은 A. 니거에 대해 문헌에 기록된 것도다 상당히 높았다(Van Hartingsveldt et al.(1993) Gene 127, 87-94; Van Gorcom et al.(1991) EP420358). 평균, 다중사본 코스미드 벡터로 수득한 수준은 단일사본 벡터로 수득한 것보다 더 높았다. 글루코아밀라제-피타제 융합 벡터로 수득한 피타제 수준은 글루코아밀라제 및 피타제 모두의 수준이 높았다. 선택된 수의 피타제 생성 A. 소재로부터 조절된 회분식 및 유가식 발효를 한 결과 피타제 수준이 더 증가되었다고 밝혀졌다.

<글루코아밀라제 생성>

효율적으로 생성되는 균류 단백질의 예는 A. 니거 glaA 유전자의 발현에 의해 제공된다. 벡터 pGLA6S(도 15)는, 선별 마커로서 A. 니둘란스 amdS 유전자를 운반하는 5kb EcoRI 단편을 pGLA6의 유일한 EcoRI 부위 안으로 도입시킴으로써,pGLA6(Punt et al., (1991) J. Biotech. 17, 19-334)로부터 유도되었다. 벡터 pAB4.1와의 동시형질전환을 이용하여, A. 니둘란스 gpdA 프로모터 조절하의 글루코아밀라제 유전자 및 amdS 선별 마커를 운반하는 벡터 pGLA6S(도 15)을 A. 소재 ATCC11906pyrG 안으로 도입시켰다. 전분 평판-분석 결과 이들 형질전환체에서 아밀로분해 활성 수준이 증가된 생산이 입증되었다. 형성된 형질전환체로부터, 아크릴아미드 배지 상 숙달된 성장을 나타내는 것이 글루코아밀라제 생산에 대해 분석되었다. 이들 형질전환체 몇몇의 배양 상청액으로부터 나온 Coomassie Briljant Blue-염색된 SDS PAGE 겔 상에서, 글루코아밀라제에 해당하는 단일의 우세한 단백질 밴드가 관찰되었다. 글루코아밀라제에 대한 단클론성 항체를 사용한 웨스턴 분석(Verdoes et al.(1993) Transgenic Research 2, 84-92)을 사용하여 이 단백질 밴드의 정체(identity)를 확인하였다.

<인터류킨-6 생산>

단백분해효소의 분해에 고도로 민감한 단백질의 예인 인터류킨-6의 생산은 gla-융합 전략 및 단백분해효소 결여 균주의 사용없이는 A. 니거에서 거의 불가능하다고 나타났다. 이들 개선점 모두를 사용한다고 하더라도, IL-6의 수율은 겨우 배양액 ℓ당 2-3mg에 불과하였다. pyrG 또는 amdS 마커와 함께 동시형질전환시킴으로써 A. 소재 안으로 IL-6 벡터 pAN56-4를 도입시킨(Broekhuijsen et al.(1993) J. Biotech. 31, 134-145) 결과, 이 벡터 내에 존재하는 IL-6-융합 유전자를 발현하는 형질전환체를 산출하였다. 형성된 형질전환체로부터, 몇몇을 선별하여 추가의 분석을 하였다. 이들 형질전환체를 가지고 진탕 플라스크 발효 실험을 수행하였다. 수개의 이들 균주 중 배양 상청액을 SDS-PAGE 및 웨스터 분석한 결과 A. 니거에서 최상으로 기록된 경우에서 얻어진 수준보다 약 5-10배 더 높게 정확하게 프로세싱된 IL-6의 수준을 나타내었다. A. 소재로부터 나온 각종 유형의 단백분해효소 결여 및 발효-최적화 돌연변이체를 사용하여 조절된 발효로부터 수득할 수 있는 IL-6 생산 수준을 더 증가시켰다(Broekhuijsen et al.(1993) J.Biotech. 31, 134-145).

<녹색 형광 단백질(GFP)>

본 발명자가 A. 소재에서 생산시키고자 시도한, 산에 불안정한 다른 유형의 단백질은 강장동물 애쿠오리아 빅토리아 유래의 GFP이다. 이 단백질은 단백분해효소에 민감할 뿐만아니라 산 pH에서 그 활성을 소실한다. pyrG 또는 amdS 선별 마커를 사용하여 동시형질전환시킴으로써, GFP 또는 GLA-GFP 융합 유전자를 운반하는 벡터(A. 니둘란스 gpdA 프로모터에 의해 유도됨)를 A. 소재 안으로 도입시켰다. 발현시킨 결과, 양쪽 벡터 유형에 대해 매우 밝은 형광성 A. 소재 형질전환체를 산출하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 분석을 사용한, 선별되고 진탕플라스크-배양된 형질전환체로부터 나온 배양 상청액의 관찰된 형광 및 차후 분석에 기초하여, 완전한 세포질 GFP 및 분비된 GLA-GFP의 수율이 A. 니거 단백분해효소 결여 숙주에서 얻은 것보다 훨씬 높다는 것이 확인되었다(Siedenberg et al. Biotechn. Prog.(1999) 15, 43-50; Gordon et al., Microbiology(2000) 146, 415-426). A. 니거 배양 상청액의 경우와 대조하여, 분비된 GFP는 상당한 형광성을 보여주었다.

[서열목록]

서열번호 1

MBL1784:

서열번호 2

MBL1785:

서열번호 3

프로단백질 전환효소를 암호화하는 아스페르길루스 니거 유전자의 서열.

시작 코돈 및 정지 코돈은 밑줄친 굵은 문자로 표시되어 있다.

인트론은 밑줄친 소문자로 표시되어 있다.

서열번호 4

프로단백질 전환효소를 암호화하는 아스페르길루스 소재 유전자의 암호화 영역 중 부분 서열

서열번호 5

프로단백질 전환효소를 암호화하는 트리초데르마 레에세이 QM9414 유전자의 암호화 영역 중 부분 서열

서열번호 6

프로단백질 전환효소를 암호화하는 푸사리움 베네나툼 ATCC20334 유전자의 암호화 영역 중 부분 서열

서열번호 7

프로단백질 전환효소를 암호화하는 페니실리움 크리소게눔 P2 유전자의 암호화 영역 중 부분 서열

서열번호 8

프로단백질 전환효소를 암호화하는 리조푸스 오리재 ATCC200076 유전자의 암호화 영역 중 부분 서열

서열번호 9

프로단백질 전환효소를 암호화하는 아가리쿠스 비스포루스 HORST 유전자의 암호화 영역 중 부분 서열

서열번호 10

암호화 가닥BamHI-부위가 밑줄쳐져 있음

PE4

2048번 축퇴됨

서열번호 11

암호화 가닥

PCL1

8192번 축퇴됨

서열번호 12

암호화 가닥

PCL2

768번 축퇴됨

서열번호 13

비암호화 가닥BamHI-부위가 밑줄쳐져 있음

PE6

49152번 축퇴됨

서열번호 14

비암호화 가닥

PCL2rev

768번 축퇴됨

서열번호 15

비암호화 가닥

PCL3

1024번 축퇴됨

서열번호 16

비암호화 가닥

PCL4

2048번 축퇴됨

서열번호 17

pAB4-1rep의 서열

.......59-499 bp..........................: pAB4-1의 0.4kb HindIII 단편

1-58bp..........500-513bp......2873-2930bp: pMTL24의 폴리링커 서열

(밑줄친 소문자로 표시됨)

........................514-2872bp........ : pAB4-1의 2.3kb XhoI 단편

서열번호 18

MBL 789EcoRI이 밑줄쳐져 있음

4번 축퇴됨

서열번호 19

MBL 793BamHI이 밑줄쳐져 있음

2번 축퇴됨

서열번호 20

MBL 794EcoRI이 밑줄쳐져 있음

2번 축퇴됨

서열번호 21

MBL 1158EcoRI이 밑줄쳐져 있음

512번 축퇴됨

서열번호 22

MBL 1208ClaI이 밑줄쳐져 있음

2048번 축퇴됨

서열번호 23

MBL 1219BamHI이 밑줄쳐져 있음

4608번 축퇴됨

서열번호 24

제한 부위는 굵게 표시되고 프라이머는 밑줄쳐져 있음

서열번호 25

아스페르길루스 니거 PclA 단백질 서열

서열 26 내지 31

A. 소재 프로모터 클로닝을 위한 PCR-프라이머

제한부위는 밑줄쳐져 있음.

	프라이머	서열(5'-3')
서열번호 26	Alp-1
서열번호 27	Alp-2
서열번호 28	Amy-1
서열번호 29	Amy-2
서열번호 30	AOGPDA-1
서열번호 31	AOGPDA-2

서열번호 32

아스페르길루스 소재 gpdA 프로모터 영역의 서열

서열번호 33

아스페르길루스 소재 alpA 프로모터 영역의 서열

아스페르길루스 속의 분류체계(Samson, 1992)
속	아속	섹션	선별된 종a"아종"b
아스페르길루스	서르쿰다티(Circumdati)	웬티이(Wentii)	A. 웬티(글루코시다제)
		플라비/타마리이(Flavi/Tamarii)	A. 오리재(아밀라제, 단백분해효소)
			A. 타마리이tox
			A. 소재(발효 식품, 단백분해효소)
			A. 파라시티쿠스 tox
			A. 플라부스tox
		니그리(Nigri)	A. 니거------------>A. 풀베루렌테스(발효 식품, A. 포에니시스각종 단백질,A. 아와모리유기산) A. 포에티두스A. 카와치이A. 우사미이A. 피쿠움A. 자포니쿠스------>A. 아쿠레아투스(엔도글루카나제) (글루코시다제.갈락타나제)A. 엘립티쿠스A. 투비젠시스------>"A. 니거"
		서르쿰다티(Circumdati)	A. 오츠라세우스 tox(크술라나제)A. 알리아세우스 tox
		칸디디(Candidi)	A. 칸디두스(리파제, 글루코시다제)
		크레메이(Cremei)	A. 이타코니쿠스(유기산)
		스파르시(Sparsi)	A. 스파르수스

아스페르길루스 속의 분류체계(Samson, 1992)
속	아속	섹션	선별된 종a"아종"b
아스페르길루스	아스페르길루스(Aspergillus)	아스페르길루스	A. 글라우쿠스(발효 식품)
		레스트릭티(Restricti)	A. 레스트릭투스 tox
	푸미가티(Fumigati)	푸미가티	A. 푸미가투스 tox
		세르비니(Cevini)
	오르나티(Ornati)
	클라바티(Clavati)	클라바티	A. 기간테우스 tox
	니둘란테스(Nidulantes)	니둘란테스	A. 니둘란테스 tox
		베르시콜로레스(Versicolores)	A. 시도위이(리파제)
		우스티(Usti)
		테레이(Terrei)	A. 테레우스 tox(글루칸새)
		플라비페데스(Flavipedes)

a: A. 타마리이, A. 스파르수스 및 A. 엘립티쿠스를 제외한 상기 목록에서 선별된 종의 경우, 단백질/유기산/발효 식품의 생산(괄호 안에 표시됨) 및/또는 DNA-매개성 형질전환 공정(밑줄로 표시됨)이 기술되어 있다. 독소를 생산하는 것으로 기록된 종은^tox로 표시되어 있다.

b: 각종 방법에 기초하여 나열된 이름은 주어진 종 이름과 동의어로 간주될 수 있다.

상이한 ATCC 균주의 분류
균주	형태구조1)	아플라톡신 생산	PAPD2)	PCRaflR	PCRalpA	분류4)
ATCC93625)	ND	no7)	A. 소재유형 I	A. 소재	A. 소재	A. 소재
ATCC119066)	A. 소재	no1,7)	A. 소재유형 I	ND	A. 소재	A. 소재
ATCC20235	A. 오리재	no1)	A. 소재유형 II	ND	A. 오리재	A. 오리재
ATCC20245	A. 소재	no1,7)	A. 소재유형 I	A. 소재	A. 소재	A. 소재
ATCC20387	A. 소재	no1)	ND	ND	A. 소재	A. 소재
ATCC20388	A. 소재	no1)	ND	ND	A. 소재	A. 소재
ATCC42249	A. 소재	no1)	A. 소재유형 II	ND	A. 소재	A. 소재
ATCC42250	A. 소재	no1)	ND	ND	A. 소재	A. 소재
ATCC42251	A. 소재	no1)	ND	A. 소재	A. 소재	A. 소재
ATCC46250	ND	ND	ND	ND	A. 오리재	A. 오리재
IFO4177(CBS205.89)	A. 오리재	no8)	ND	ND	A. 오리재	A. 오리재
기호설명:ND=결정되지 않음1) 참조: Ushijima S, Hayashi K and Murakami H(1982) The current taxonomic status of Aspergillus sojae used in Shoyu fermentation. Agric.Biol.Chem., 46:2365-2367, 1981.2) 참조: Yuan GF, Liu CS and Chen CC(1995) Differentiation of Aspergillus parasiticus from Aspergillus sojae by Random Amplification of Polymerphic DNA. Appl. Environm. Microbiol., 61:2384-2387.3) 참조: Chang PK, Bhatnagar D, Cleveland TE and Bennett JW(1995) Sequence variability in homologs of the aflatoxin pathway geneaflRdistinguishes species in Aspergillus section Flavi.4) 표 2에 제시된 데이타에 기초한 TNO에 의해 유도된 분류상 결론5) 이 균주는 A. 오리재로 ATCC에 기탁된 것이나, 나중에 Yuan et al, 19952)및 Chang et al, 19953)에 기초하여 A. 소재로 재분류되었다.6) 이 균주는 A. 파라시티쿠스로 ATCC에 기탁된 것이나, 나중에 Ushijima et al, 19811)및 Yuan et al, 19952)에 기초하여 A. 소재로 재분류되었다.7) 참조: ATCC 카탈로그8) 참조: Liu BH, Chu FS(1998) Appl. Env. Microbiol., 64:3718-3723.

선별 배지의 조성
조성	비선별 배지	선별 배지(WO97/04108)	아크릴아미드선별 배지	개선된 아크릴아미드 선별 배지
KH2PO4	1.5g/ℓ	1.5g/ℓ	1.5g/ℓ	1.5g/ℓ
KCl	0.5g/ℓ	0.5g/ℓ	0.5g/ℓ	0.5g/ℓ
MgSO4·7H2O	0.5g/ℓ	0.5g/ℓ	0.5g/ℓ	0.5g/ℓ
NaNO3	6g/ℓ	----	----	----
글루코즈	10g/ℓ	10g/ℓ	10g/ℓ	----
소르비톨	1.2M	----	1.2M	1.2M
사카로즈	----	1M	----	----
미네랄 용액1)	0.1% v/v	0.1% v/v	0.1% v/v	0.1% v/v
아세트아미드	----	10mM	----	----
아크릴아미드	----	----	10mM	10mM
CsCl	----	15mM	15mM	15mM
아가	15g/ℓ	15g/ℓ	15g/ℓ	15g/ℓ
1) 미네랄 용액 : CuSO4·5H2O 0.16g/ℓFeSO4·7H2O 0.5g/ℓZnSO4·7H2O 2.2g/ℓMnCl2·4H2O 0.5g/ℓCoCl2·6H2O 0.17g/ℓNa2MoO4·2H2O 0.15g/ℓH3BO31.1g/ℓEDTA 5g/ℓ

상이한 배지내 단백분해효소 활성
균주	항온배양 이후 단백질 분해
	최소 배지	완전 배지	최소배지+트루소이	탈지유
	PH	BSA	피타제(A.테레우스)	PH	BSA	피타제(A.테레우스)	PH	BSA	피타제(A.테레우스)	탈지유
ATCC9362	6.75	-	-	7.5	-	-	6.88	-	-	-
ATCC11906	7.00	-	-	8.28	-	-	7.51	-	-	-
ATCC20235(=A.오리재)	8.40	-	+	8.38	+	+	7.70	+	+	+
ATCC20245	8.05	-	+	8.18	-	+	7.65	+	+	+
ATCC20387	7.45	-	-	7.5	+	+	7.76	-	-	-
ATCC20388	8.20	-	+	7.5	-	+	7.74	-	+	+
ATCC42249	8.30	-	+	7.5	-	+	7.77	+	+	+
ATCC42250	8.30	-	+	7.5	-	+	7.55	-	+	+
ATCC42251	8.40	-	+	7.5	-	+	7.50	-	+	+
ATCC46250(=A.오리재)	7.75	-	+	8.0	+	+	7.35	+	+	+
A. 니거	3.85	+	-	4.25	+	-	3.45	+	-	+
기호설명:+ 4시간 항온 배양 후 단백질의 (부분) 분해, 큰 우유 청정화 대역- 4시간 항온 배양 후 단백질의 분해없음, 소규모청정화대역 또는 청정화대역부재30℃에서 항온배양: 27㎕ 배지 시료2.5㎕BSA(25mg/ml)0.5㎕피타제(A.테레우스, 3-4g/l)중간 시료를 배양물로부터 취한 후 BSA 및 피타제를 첨가함.이 시료는 30℃에서 항온배양하고 특정 시점 이후BSA 및 피타제 분해에 대해 시료를 분석함.

상이한 pH 값에서의 단백분해효소 활성
균주	항온배양 이후 최소배지+트루소이 내 단백질의 분해
	pH=4.5	pH=6	pH=8
	BSA	피타제(A.테레우스)	BSA	피타제(A.테레우스)	BSA	피타제(A.테레우스)
ATCC9362	-	-	-	-	-	+
ATCC11906	-	-	-	-	-	-
ATCC20235(A. 오리재)	+	-	+	+	+	+
ATCC20387	-	-	-	-	-	-
기호설명:+ 4시간 항온 배양 후 단백질의 (부분) 분해- 4시간 항온 배양 후 단백질의 분해 없음30℃에서 항온배양: 25㎕ 배지 시료 50mM NaAc pH=4.22㎕ 완충액(50mM) →50mM NaAc pH=5.82.5㎕BSA(25mg/ml) 50mM Tris/HCl pH=8.30.5㎕피타제(A.테레우스, 3-4g/l)중간 시료를 배양물로부터 취한 후 BSA, 피타제 및 완충액을 첨가함.이 시료는 30℃에서 항온배양하고 특정 시점 이후BSA 및 피타제 분해에 대해 시료를 분석함.

균류 pclA 유전자를 클로닝한 PCR 결과

프라이머 조합	PCR 산물의 예상 크기
1	pcl1+pcl2rev	180bp
2	pcl1+pcl3	350bp
3	pcl1+pcl4	500bp
4	pcl1+MBL1372	300bp
5	pcl2+pcl3	200bp
6	pcl2+pcl4	350bp
7	pcl2+MBL1372	150bp
8	MBL1298+pcl2rev	180bp
9	MBL1298+pcl3	350bp
10	MBL1298+pcl4	500bp

균주	프라이머 조합
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
트리초데르마 레에세이 QM9414	+	+/□	-	-	-	-	-	+	-	+
페니실리움 크리소게눔 P2	+	+/□	+	-	+	-	-	+	-	-
푸사리움 베네나툼 ATCC20334	+	+/□	+	-	-	+	-	+	+	-
트라메테스 베르시콜로르 TV1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
리조푸스 오리재 ATCC200076	+/□	-	-	-	-	-	-	+	-	-
아가리쿠스 비스포루스 HORST	-	+	-	-	-	-	-	-	+/□	-
아스페르길루스 소재 ATCC11906	+	+	+	-	-	+	-	+	-	-
양성 대조군	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
기호 설명: + 특이적인 PCR 산물- 비특이적인 PCR 산물 또는 PCR 산물 없음+/□ 이 PCR 산물을 서열분석에 사용하였다.

각종 A. 소재 균주의 점도 범위
균주	점도(cP)	생물량(g/ℓ)
	전단속도 6.5ℓ/s		전단속도 83.2ℓ/s	전단속도 644.4ℓ/s
A. 소재 야생형	>>2000	1505	155	8.8 및 16.6
A. 소재 pclA	2000	751	76	7.6 및 17.2
A. 소재 lfvA	1565	94	18	6.9 및 18.8

A. 소재 형질전환체 내 프로모터의 세기
형질전환체	프로모터	최소 배지 내 GUS 활성(U/mg)
		5%크실로즈	5%글루코즈	5%말토덱스트린	2%전분	5%트루소이
ACTT11906 야생형	----	0	0	0	0	0
ATCC11906[pGUS54]	gpdA	9141	6291	6667	6937	3391
ATCC11906[pGUS64]	glaA	33	50	25	51	176
ATCC11906[pBIPGUS]	bipA	2914	2849	1642	493	2083

Claims (35)

1. 선별마커로서 도입된 아세트아미다제 S(amdS) 유전자를 포함하는 재조합 아스페루길루스 소재(Aspergillus sojae).
2. 제1항에 있어서, 아스페루길루스 소재는 질소의 단일 공급원으로 유도된 amdS의 기질을 포함하는 배지 상에서 선별가능하고, 상기 배지는 탄소 기질을 더 포함하며 내인성 amdS 유도성 기질이 없는 것이 특징인 아스페루길루스 소재.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 질소의 공급원은 아크릴아미드인 것이 특징인 아스페루길루스 소재.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대 내인성 amdS 유전자가 결실 또는 파괴 같은 내인성 amdS 불활성화 돌연변이를 포함하기 때문에 활성이 있는 내인성 amdS 유전자를 보유하지 않는 것이 특징인 아스페루길루스 소재.
5. 아스페루길루스 소재 안으로 핵산 서열을 도입하는 방법으로서, 상기 방법은 균류 안으로의 핵산 서열 도입에 대해 알려진 방식 그자체로 아스페루길루스 소재의 핵산 서열을 도입하는 방법(예, 형질전환 또는 형질감염)을 아스페루길루스 소재에 대해 수행하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 핵산 서열로서 amdS 유전자를도입하는 단계(이후 '도입된 amdS 유전자'로 지칭함) 이후에 결과물로 형성된 형질전환 또는 형질감염된 아스페루길루스 소재를 내인성 amdS 유도성 기질이 없는 배지 상에서 선별하는 단계를 포함하고, 상기 배지는 질소의 단일 공급원으로서 도입된 amdS의 기질을 추가로 포함하고 탄소 기질을 추가로 포함하며, 상기 배지는 핵산 서열을 포함하는 원하는 아스페루길루스 소재가 성장할 수 있게 하면서 선별 배지 상에서 도입된 amdS 유전자 없이는 아스페루길루스 소재가 성장할 수 없는 불능성으로 인해 소위 도입된 핵산 서열이 없는 아스페루길루스 소재의 성장을 배제시키며, 상기 배지는 적절하게 아세트아미드 이외의 amdS의 기질, 예컨대 질소의 단일 공급원으로서 도입된 amdS의 기질로서 아크릴아미드를 포함하는 것이 특징인 방법.
6. 제5항의 방법에 의해 수득된 아스페루길루스 소재
7. 형질전환 또는 형질감염된 아스페루길루스 소재를 선별하는 방법으로서, 상기 방법은 핵산 서열로의 균류 형질전환 또는 형질감염에 대해 알려진 방식 그자체로 아스페루길루스 소재를 형질전환 또는 형질감염하는 방법을 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 아스페루길루스 소재에 대해 수행하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 핵산 서열로서 amdS 유전자를 도입한 단계 이후 결과물로 형성된 형질전환 또는 형질감염된 아스페루길루스 소재를 질소의 단일 공급원으로서 도입된 amdS의 기질을 포함하는 배지에서 선별하는 단계를 포함하고, 상기 배지는 탄소 기질을 추가로 포함하며, 상기 배지는 원하는 아스페루길루스 소재가 성장할 수 있게 하면서 선별 배지 상에서 도입된 amdS 유전자 없이는 아스페루길루스 소재가 성장할 수 없는 불능성으로 인해 형질전환 또는 형질감염되지 않은 아스페루길루스 소재의 성장을 배제시키는 것이 특징인 방법.
8. 재조합 아스페루길루스 소재를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 알려진 방식 그자체로 형질전환 또는 형질감염시킴으로써 예컨대 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 아스페루길루스 소재 안으로 핵산 서열을 도입하는 단계 및 이어서 원하는 서열과의 동시형질전환에서 포함되거나 형질전환된 선별마커를 선별함으로써 원하는 서열을 갖는 재조합 아스페르길루스 소재를 선별하는 단계를 포함하며,

   상기 핵산 서열은 내인성 amdS 유전자의 절편에 인접하여 도입시키고자 하는 소정 서열 또는 재조합을 확실히 하게 하여 동시에 내인성 amdS 유전자를 제거하고 소정 서열을 도입하기에 충분한 일정 길이와 상동성을 갖는 대응 서열을 포함하며,

   상기 선별 마커는 핵산 서열 도입 이전에 아스페르길루스 소재에 부재하는 것이고 적절하게 선별 마커는 pyrG인 것이 특징인 방법.
9. 우라실 및 플루오로-오로트산 함유 배지에서 성장하는 아스페루길루스 소재로서, 상기 아스페르길루스 소재는 우리딘 및 플루오로-오로트산 함유 배지 상에서 성장하지 않으며, 즉 아스페르길루스 소재는 우라실 영양요구성이며, 상기 아스페르길루스 소재는 우리딘을 이용할 수 없고 pyrG 음성이며 플루오로-오로트산에 내성이고, 상기 우라실 요구성 및 상기 플루오로-오로트산 내성은 활성이 있는 도입된 pyrG 유전자에의 보충에 의해 경감되며, 적절하게는 상기 아스페르길루스 소재는 활성이 있는 내인성 pyrG 유전자가 없고, 예컨대 아스페르길루스 소재 내인성 pyrG 유전자는 유전자 또는 유전자 조절 서열 내에 삽입, 치환 또는 결실(예컨대 유전자의 전체 암호화 서열의 결실) 형태의 돌연변이를 포함하는 것이 특징인 아스페루길루스 소재.
10. 제9항에 있어서, 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 아스페르길루스 소재의 특성을 함께 갖는 것이 특징인 아스페르길루스 소재.
11. 형질전환 또는 형질감염된 아스페르길루스 소재를 선별하는 방법으로서, 상기 방법은 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염하는 방법을 제9항 또는 제10항에 따른 아스페르길루스 소재에 대해 수행하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 균류의 형질전환 또는 형질감염에 대해 알려진 방식 그자체로 활성이 있는 pyrG 유전자를 아스페르길루스 소재 안으로 도입하는 단계 및 이어서 결과로 형성된 형질전환 또는 형질감염된 아스페르길루스 소재를 우라실 및 플루오로-오로트산이 없는 배지 상에서 선별하는 단계를 포함하며, 상기 배지는 적어도 아스페르길루스 소재의 성장에 필요한 최소 기질을 더 포함하고, 상기 배지는 원하는 아스페르길루스 소재를 성장시키면서 불활성화된 pyrG 유전자로 인해 우라실 없이 성장할 수 없는 불능성으로 인해 형질전환 또는 형질감염되지 않은 아스페르길루스 소재의 성장을 배재하는 것이 특징인 방법.
12. 제11항에 있어서, 도입된 활성이 있는 pyrG 유전자는 동일한 핵산 서열 단편에 인접하고, pyrG 유전자 및 인접 서열의 도입 결과 형성된 pyrG 양성 아스페르길루스 소재를 우라실 및 플루오로-오로트산이 없는 배지 상에서 선별하고 이어서 pyrG 양성 아스페르길루스 소재를 우라실 및 플루오로-오로트산 함유 배지 상에서 배양하여 도입된 pyrG 유전자를 배재시킨 결과 우라실 함유 배지 상의 성장 및 플루오로-오로트산 내성에 의해 선별가능한 pyrG 음성 아스페르길루스 소재를 산출하며, 적절하게는 통합 지시 서열이 형질전환될 아스페르길루스 소재의 특정 서열과 상동성이 있으며 이로인해 원하는 경우 특정 서열과 연결된 유전자를 녹아웃시킬 수 있다는 사실 때문에 추가로 인접 서열 및 pyrG 유전자가 특정 위치 안으로 pyrG 유전자 및 인접 서열의 통합을 지시하는 서열에 인접하는 것이 특징인 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 제9항 또는 제10항의 아스페루길루스 소재는 그 안에 도입될 추가의 핵산 서열을 보유하고, 바람직하게는 상기 추가의 핵산 서열은 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 추가의 핵산 서열은 동일한 벡터 상에서 또는 도입되는 활성이 있는 pyrG 유전자와 함께 동시형질전환됨으로써 활성이 있는 pyrG 유전자와 함께 도입되는 것이 특징인 방법.
14. 제5항의 방법을 병용하면서 제11항 내지 제13항에 따른 방법을 수행함으로써 형질전환 또는 형질감염된 아스페르길루스 소재를 선별하는 방법.
15. 재조합 아스페르길루스 소재를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은, 예컨대 알려진 방식 그자체로 형질전환 또는 형질감염시킴으로써, pyrG 양성 아스페르길루스 소재 안으로 핵산 서열을 도입하는 단계 및 이어서 pyrG 음성 표현형을 갖는 아스페르길루스 소재를 선별함으로써 원하는 서열을 갖는 재조합 아스페르길루스 소재를 선별하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 서열은 pyrG 유전자의 절편에 인접한 소정 서열 또는 재조합을 확실히 하게 하여 pyrG 유전자를 제거하고 원하는 서열을 도입하기에 충분한 일정 길이와 상동성을 갖는 대응 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 재조합 아스페르길루스 소재로서, 임의로 제1항 내지 제4항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 아스페르길루스 소재의 특성을 더 포함하는 것이 특징인 아스페르길루스 소재.
17. 발현시키기 위한 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 도입된 핵산 서열을 포함하는 재조합 아스페르길루스 소재로서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 아스페르길루스 니거 또는 아스페르길루스 아와모리에 의해 발현될 경우 분해되기 쉬운것이 특징인 아스페르길루스 소재.
18. 발현시키기 위한 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 도입된 핵산 서열을 포함하는 재조합 아스페르길루스 소재로서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 아스페르길루스 소재 단백분해효소 및 아밀라제 이외의 것이며, 바람직하게는 비-아스페르길루스 소재 단백질 또는 폴리펩티드인 것이 특징인 아스페르길루스 소재.
19. 단백분해효소 유전자 바람직하게는 알카리 단백분해효소 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 또는 재조합 아스페르길루스 소재.
20. 주요 단백분해효소 유전자를 불활성화시키는 돌연변이, 적절하게는 주요 알카리 단백분해효소 유전자, 예컨대 35kDa의 주요 알카리 단백분해효소를 암호화하는 유전자를 불활성시키는 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 또는 재조합 아스페르길루스 소재.
21. 재조합 아스페르길루스 소재를 생산하는 방법으로서, 상기 재조합 A. 소재는 감소된 단백분해 활성을 나타내고, 상기 방법은 제거될 단백분해효소 유전자의 절편에 인접하여 도입될 선별 마커 암호화 서열을 포함하는 핵산 서열을 예컨대 알려진 방식 그자체로 형질전환 또는 형질감염시킴로써, A. 소재 안으로 도입하는 단계; 및 이어서 선별 마커를 선별함으로써 재조합 A. 소재를 선별하는 단계를 포함하며,

    추가로 상기 인접서열 및 선별 마커 암호화 서열은 단백분해효소 유전자에서의 재조합을 확실히 하게 하여 동시에 단백분해효소 유전자를 제거하고 원하는 선별 마커 암호화 서열을 도입하기에 충분한 일정 길이와 상동성을 갖는 서열들 사이에 포함되고, 예컨대 형질전환 또는 형질감염에 의한 핵산 서열 도입 이전에 A. 소재는 도입될 선별 마커가 없고, 예컨대 핵산 서열의 도입 이전에 A. 소재는 A. 소재가 활성이 있는 선별 마커를 생산할 수 없도록 돌연변이되어 있으며, 적절하게는 선별 마커가 pyrG 유전자이고, 적절하게는 상기 방법이 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법과 함께 수행되는 것이 특징인 방법.
22. 제21항의 방법에 따라 수득된 재조합 아스페르길루스 소재.
23. 선별마커, 바람직하게는 제1항 내지 제4항 또는 제6항에 정의된 amdS 및/또는 제9항, 제10항 또는 제16항에 정의된 pyrG를 포함하는 제17항 내지 제20항 또는 제22항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 또는 재조합 아스페르길루스 소재.
24. 피타제 또는 피타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 도입된 핵산 서열을 포함하는 제1항 내지 제4항, 제6항, 제9항, 제10항, 제16항 내지 제20항, 제22항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아스페르길루스 소재.
25. 제1항 내지 제4항, 제6항, 제9항, 제10항, 제16항 내지 제20항, 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의되거나 제5항, 제7항, 제8항, 제11항 내지 제15항 및 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 재조합 또는 돌연변이체 아스페르길루스 소재에 포함되어 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 도입된 핵산 서열을 발현시키는 공정으로서, 상기 공정은 재조합 또는 돌연변이체 A. 소재를 배양하는 단계를 포함하고, 적절하게는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 도입된 핵산 서열이 대응하는 비형질전환된 또는 야생형 A. 소재에 부재하고/하거나 낮은 사본수로 존재하는 것이 특징인 공정.
26. 프로단백질 전환효소 또는 기능적 등가 단백질을 암호화하는 유전자 내 돌연변이를 포함하는 재조합 균류.
27. 제26항에 있어서, 대응하는 야생형 균류와 비교하여 등가 조건하에 단백질, 폴리펩티드 또는 대사물질의 생산이 증가된 것이 특징인 균류.
28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 돌연변이는 알려진 방식 그 자체로 형질전환 또는 형질감염을 사용한 특정 유전자 수정에 의해 수득된 것이 특징인 균류.
29. 제26항 내지 제28항에 있어서, 상기 프로단백질 전환효소 또는 기능적 등가 단백질은 서열번호 10 내지 16에 주어진 뉴클레오티드의 임의의 두개 혼합물을 사용하여 시험관내 DNA 증폭에 의해 증폭될 수 있는 단편을 보유한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것이 특징인 균류.
30. 제27항에 있어서, 상기 프로단백질 전환효소 또는 기능적 등가 단백질은 프로단백질 전환효소 또는 기능적 등가 단백질의 활성을 억제하는 돌연변이를 포함하는 아스페르길루스 니거 돌연변이체의 성장 표현형을 기능적으로 보충할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것이 특징인 균류.
31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 아스페르길루스 소재인 균류
32. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 도입된 amdS 유전자 또는 pyrG 유전자를 더 함유하는 균류.
33. 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 단백질 또는 폴리펩티드, 바람직하게는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 공정으로서, 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따라 균류를 배양하는 단계를 포함하는 공정.
34. 단백질 또는 폴리펩티드, 바람직하게는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 공정으로서, 상기 공정은 제33항에 따른 발현 공정을 포함하고, 선택적으로 발현된 단백질 또는 폴리펩티드의 프로세싱 및/또는 분비 및/또는 분리를 포함하는 것이 특징인 공정.
35. 피타제 또는 피타제 활성을 갖는 단백질, 바람직하게는 재조합 피타제 또는 피타제 활성을 갖는 재조합 단백질을 생산하는 공정으로서, 제33항에 따른 발현 공정을 포함하고, 선택적으로 발현된 피타제 또는 피타제 활성을 갖는 단백질의 프로세싱 및/또는 분비 및/또는 분리를 포함하는 것이 특징인 공정.