CN1369016A

CN1369016A - 转化真菌的新方法及其用于异源蛋白质生产的用途

Info

Publication number: CN1369016A
Application number: CN00811088A
Authority: CN
Inventors: 玛格丽特·希瑞克胡伊森; 科内利斯·范登洪德尔; 彼得·蓬特; 尼克·范比泽恩; 阿尔温·阿尔伯斯; 库尔特·福格尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Current assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO; DSM IP Assets BV
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2002-09-11
Also published as: KR20020059350A; JP2003518921A; BR0012856A; AU6323800A; EP1204758A2; AU782116B2; CA2378016A1; WO2001009352A2; AR024989A1; WO2001009352A3; MXPA02001061A

Abstract

本发明公开了包含导入的乙酰胺酶S(amdS)基因作为选择标记的重组酱油曲霉。描述了在含尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上生长的酱油曲霉,所述酱油曲霉进一步在含尿苷和氟乳清酸的培养基上不生长,即所述酱油曲霉显示尿嘧啶辅源营养,所述酱油曲霉不能利用尿苷,所述酱油曲霉是pyrG阴性的,所述酱油曲霉显示对氟乳清酸的抗性,所述尿嘧啶辅源营养和所述氟乳清酸抗性当用一导入的活性pyrG基因互补时可被减轻。该酱油曲霉还包含编码肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质或任何其它异源蛋白质或多肽的核酸序列,其可用于所述肌醇六磷酸酶或所述其它异源蛋白质或多肽的生物工程生产。本发明还公开了显示改变的形态学的另外的突变体。描述了产生这种表达宿主的方法。

Description

转化真菌的新方法及其用于异源蛋白质生产的用途

发明概述

本发明涉及转化真菌及将其用于生产异源蛋白的新方法。此方法包括对属于酱油曲霉(Aspergillus sojae)的真菌进行遗传工程化。过去已提出将酱油曲霉用作转化宿主菌株。然而没有数据表明成功转化和/或表达异源蛋白。另外发现一些蛋白质如肌醇六磷酸酶，其由于一些原因包括在除酱油曲霉之外的表达宿主中被蛋白酶降解而难以大量表达，但却令人惊奇的在酱油曲霉中可表达。已发现异源蛋白在酱油曲霉中的生产水平超过同样的蛋白在黑曲霉(Aspergillusniger)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中的水平。除上述之外，本发明还涉及获得改良的进行表达的酱油曲霉菌株的方法，改良的酱油曲霉菌株特征在于一方面降低蛋白酶解活性，另一方面改良与真菌形态学相关的发酵特性。

发明背景

过去已提出将酱油曲霉用作转化宿主。然而，没有数据表明成功转化和/或生产异源蛋白质，尤其关于肌醇六磷酸酶表达没有任何证明。先前在除了酱油曲霉之外的表达宿主中表达水平特别低，主要由于蛋白酶降解所致。我们现已发现蛋白质在酱油曲霉中的表达水平超过在其它菌株，例如黑曲霉，泡盛曲霉和木霉属(Trichoderma)菌株中的表达水平。在密切相关的菌株中发现这种改进是令人惊奇的。因此，现有技术关于肌醇六磷酸酶生产的揭示呈现出缺点。现有技术在使用酱油曲霉表达异源蛋白或多肽的揭示是不合适的。

直至目前还少有成功进行酱油曲霉转化的报道，这一事实值得注意，因为过去已经阐述了与米曲霉(Aspergillus oryzae)密切相关的菌株的各种成功转化。基于这种密切关系，技术人员应能期望与使用米曲霉的方法类似的方法也可用于酱油曲霉菌株。

例如WO97/04108阐述了编码蛋白酶的核酸序列，尤其亮氨酸氨肽酶编码序列的分离，及用亮氨酸氨肽酶编码序列转化各种宿主有机体，例如酱油曲霉。然而，没有例证表明此特定转化确已进行。其只提出一些其它菌株作为潜在宿主菌株用于转化的可能性，如Trichoderma reesei，黑曲霉，泡盛曲霉，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)，和米曲霉。在所引用的文献中，提出本领域常用的3种转化菌株的方法。特别提出选择标记乙酰胺酶S(＝amdS)(例如保持在载体p3SR2上)，argB或潮霉素B(例如使用载体pAN7-1)，根据其所阐述的转化方法可用作适当的标记。

具有amdS标记的载体p3SR2的使用，在用于转化各种菌株的文献中经常阐述，例如米曲霉(EP 0.238.023)，Trichoderma reesei(EP0.244.234)和黑曲霉(EMBO杂志4，p475-479)。因此，类似用于一般转化曲霉的方法见于基于这些出版物的WO97/04108所述。

特别是WO97/04108的第17页阐述了在转化之前，在包含作为唯一氮源的底物乙酰胺的基本培养基上生长缓慢的曲霉和木霉，可在用载体p3SR2转化后由于明显的生长优势选择。接着，这样获得的转化体需要进一步选择亮氨酸氨肽酶(LAP)产量，以发现所需的转化体。如上所述，这只是基于少数除酱油曲霉之外其它菌株的成功转化，提出的适用上述两个属的转化方法。

然而，提出的转化方法未成功用于酱油曲霉。现有技术阐述的选择标准，在使用载体p3SR2时，不能确保实际选择到所需的转化体。我们已经进行了此试验，并发现所述方法不可操作，因为过量的背景生长消除了实际可选择性。

另一种选择真菌转化体的常用方法是转化乳清苷-5-单磷酸脱羧酶(PyrG)突变体的选择方法。Mattern等，在分子普通遗传学210，p460-461中揭示了用黑曲霉pyrG基因转化米曲霉的方法。标准方法是基于作为阳性选择标记的氟乳清酸的直接抗性，分离pyrG突变体。由此分离各种真菌的许多pyrG突变体。

在用许多不同的丝状真菌进行的试验中，基于营养缺陷的pyrG的系统有许多有利特性。在含有尿苷以支持突变体菌株生长的平板，使用标准程序基于对氟乳清酸(FOA)的抗性直接选择，进行试验以获得酱油曲霉pyrG突变体菌株(Van Hartingsveldt等，分子普通遗传学(1987)206，p71-75)。然而，对酱油曲霉菌株使用类似方法未能产生pyrG突变体。常用的方法不产生氟乳清酸抗性菌株，而是所有菌株均能不用尿苷生长。因此，这些菌株无一是pyrG突变体。通常地，可在尿苷选择培养基上从氟乳清酸抗性菌株中直接分离pyrG突变体。然而对酱油曲霉而言，此方法不可操作。

明显的，当进行转化时，酱油曲霉与密切相关的米曲霉呈现不同的性状。使用amdS或pyrGF作为选择标记的标准方法无效。不幸的是，argB作为选择标记的方法也不可选，因为这需要从每个期望使用的宿主菌株中分离相应的argB突变体。这是基于反复试验的艰苦的工作。所需的argB突变体可通过随机诱变，随后筛选上万个菌落而获得。pyrG的情况较好，因为突变体是自身可选择的。在amdS的情况中，不需要突变体，因为存在的amdS作为显性的选择标记。

还存在阻止技术人员使用酱油曲霉作为表达重组蛋白或多肽的宿主的其它问题。在JP-A-02-234666中，例如阐述了使用与其它真菌相似方法，基于argB选择酱油曲霉。这种方法在生物技术(1988)6，p1419-1422中已就米曲霉加以阐述。所引用的文章还指出成功地类似转化构巢曲霉和黑曲霉。然而，当分析该日本专利申请中揭示的酱油曲霉菌株ATCC42251时，发现非所需的蛋白酶分布图。此菌株的蛋白酶分布图不适于用作生产宿主。因此尽管现有技术对特殊的酱油曲霉已提出一种转化方法，但即使转化方法是成功的也不能高水平表达异源蛋白质。

由于酱油曲霉菌株产生过量的碱性蛋白酶和淀粉酶的鲜明特性，发现其有实际应用价值。它们特别用于降解复杂聚合底物的过程中。因此最好的预期是，只有产物是不受其自身蛋白酶影响的酱油曲霉蛋白时，最终成功的酱油曲霉菌株的任何转化体才导致良好的表达水平。技术人员发现使用酱油曲霉菌株在工业规模表达异源重组蛋白的方法所面临的困难是多种多样的。首先，以用于其它真菌的方式导入所需表达的核酸材料的许多方法不可操作。这包括用于密切相关的米曲霉的基于pyrG和amdS的方法。其次，尽管已知宿主菌株酱油曲霉的过量蛋白酶解活性，仍存在高水平产生异源蛋白质是否是可行的这一问题。

意外地发现可解决上述问题，因此产生新的生产蛋白质的表达宿主，及生产异源蛋白质的新方法。我们阐述了用amdS和pyrG选择标记转化酱油曲霉菌株的方法。另外还阐述了有效的基因表达，包括肌醇六磷酸酶基因的表达。

发明描述

本发明涉及酱油曲霉菌株及其生产重组蛋白质和多肽的用途。首先，阐述酱油曲霉菌株。确定酱油曲霉

真菌的分类学是一复杂问题。曲霉属包含Flavi/Tamarii组中的酱油曲霉(见表1)。酱油曲霉明显示出不同于位于相同组中的米曲霉(见表2)。目前，使用本领域已知的许多方法，可将属于酱油曲霉的菌株与分类学密切相关的米曲霉，及也是密切相关的寄生曲霉区分。参见随机PCR片段，ver-1，aflR或rDNA序列，分别见于Ushijama等，(1981)，Chang等，(1995)，Yuan等，(1995)，Kusomoto等，(1998)，和Watson等(1999)所述。另外，通过对比这些菌株的alpA序列，已发现米曲霉不同于酱油曲霉。特别是(在米曲霉与酱油曲霉之间没有其它不同序列，可用作测定工具)，已发现酱油曲霉在alpA基因中的特殊位置包含XmnI位点。一些米曲霉菌株alpA基因中相应位置没有这种限制酶。由此提供了在两种类型的真菌菌株之间的另一区别点。因此，许多方法适于技术人员用于确定一菌株是否是酱油曲霉。目前有10种以上限定为酱油曲霉的菌株保藏在ATCC中。对这10种最早保藏物已经进行分析。其中两种不能通过所述的后一测定试验。其一是ATCC20235，其根据Ushijama等(1981)所述方法，基于形态学参数，也不符合作为酱油曲霉的分类要求。另一是ATCC46250。本专利申请中使用的酱油曲霉是指一种菌株，其优选符合所引用的文献所述的所有要求，并在alpA基因中存在XmnI限制位点。本发明还提供了米曲霉和酱油曲霉序列的特异同源引物。它们可用于测试XmnI位点的存在与否，例如通过筛选测试以区分酱油曲霉和米曲霉(引物序列是SEQ ID NO：1MBL1784：5’-CGGAATTCGAGCGCAACTACAAGATCAA-3’；和SEQ ID NO：2 MBL1785：5’-CGGAATTCAGCCCAGTTGAAGCCGTC-3’)。它们衍生自alpA基因的编码区。基于已知序列数据，技术人员可对引物和探针加以改动。区分酱油曲霉和米曲霉菌株，可通过用这些引物对曲霉DNA进行PCR扩增，随后用XmnI对所得DNA片段进行限制消化而进行。通过对酱油曲霉菌株的限定，我们可进一步阐述本发明。

本发明一方面涉及重组酱油曲霉，其包含一个导入的乙酰胺酶S(amdS)基因作为选择标记。这种酱油曲霉在包含导入的amdS蛋白的底物作为唯一氮源的培养基上是可选择的，这种培养基还包含碳底物，及没有内源的amdS诱导底物。一种适当的培养基包含作为导入的amdS的底物的丙烯酰胺作为唯一氮源。适当的培养基还至少包含酱油曲霉生长所需的基本底物。根据本发明酱油曲霉的适当类型是由在含有乙酰胺的培养基上不可选择的酱油曲霉形成的。根据本发明的一种酱油曲霉是在无葡萄糖的培养基上可适当选择的酱油曲霉，即所述培养基中碳源不是葡萄糖。这种培养基可以是用山梨糖醇作为碳源的培养基。当用山梨糖醇作为唯一碳源时，可达到最佳结果。

本发明酱油曲霉可包含另外导入的核酸序列，所述另外导入的核酸序列优选编码蛋白质或多肽。另外导入的序列可以经适应使最佳的密码子适于宿主菌株的密码子，或具有衍生自其中的宿主的原始密码子。导入的序列可以是技术人员希望表达的任何序列。导入的序列可以是异源的，即与导入其中的酱油曲霉是异源的。其可以是天然的，也可以是导入一或多个额外拷贝的形式。

本发明的另一方面涉及表达肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质。技术人员已知许多关于肌醇六磷酸酶的序列。我们所指的且并入参考的是EP684.313，EP897.010，WO 99/49022，EP911.416和EP897.985。这些文献阐述了各种天然的和修饰的肌醇六磷酸酶序列。它们还阐述了共有序列。一适当的实施方案是由来自Peniophora的肌醇六磷酸酶序列形成的，可以是其天然的序列或修饰的序列。此新系统比现有的系统更灵活，因此在现有技术的真菌系统中难以表达的编码肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质的异源序列，在本发明的新系统中可表达。

在上述任一实施方案中限定的包含一个导入的amdS基因作为选择标记的本发明的酱油曲霉，可合适地不具有活性的内源性amdS基因。这种实施方案的酱油曲霉，可例如具有内源性amdS基因，但该基因包含内源性amdS失活突变。可以产生技术人员已知或可得到的任何形式的失活突变。这种失活突变例如可以是缺失或破坏。此突变可失活基因或基因产物。技术人员已知有许多方法可用于达到此目的，并易于达到。

在另一实施方案中，本发明涉及一种重组的酱油曲霉，其没有活性的内源amdS基因，并包含一个导入的amdS基因作为选择标记。本发明的重组酱油曲霉在含有amdS的底物作为唯一氮源的培养基上是可选择的，所述培养基还包含碳底物。适当的培养基还至少包含酱油曲霉生长所需的基本底物。在一适当的实施方案中，内源性amdS基因可例如是已经失活的。此失活可以是本领域技术人员已知的或可达到的任何类型失活，而酱油曲霉仍然是存活的。例如内源性amdS基因可包含的失活突变如是取代，缺失或插入基因或其部分，或影响基因表达如使其失活的突变。也可不存在完整的内源性amdS基因。

本发明所述任一实施方案中的酱油曲霉，可以是导入amdS基因的酱油曲霉，这可通过转化或转染达到。本发明所得的酱油曲霉然后必须随之从未转化或转染的酱油曲霉中分离。本发明包括上述任一实施方案或其组合。

本发明不仅涉及这种酱油曲霉，还涉及将核酸序列导入酱油曲霉中的方法。该方法包括参考将核酸序列导入真菌的已知方式，将核酸序列导入酱油曲霉中。这种方式例如是转化或转染酱油曲霉。该方法包括将amdS基因作为核酸序列导入，随后在培养基上选择所得转化或转染的酱油曲霉，该培养基没有内源性amdS诱导底物，所述培养基还包含导入的amdS的底物作为唯一氮源，和碳底物，所述培养基能使包含导入的amdS基因的酱油曲霉生长，同时消除没有功能性amdS基因的酱油曲霉的生长。这种方法的一适当实施方案包括应用包含除乙酰胺之外的amdS的底物的培养基。这种培养基包含作为导入的amdS的底物的丙烯酰胺作为唯一氮源。根据本发明的方法，此培养基包含除葡萄糖之外的碳源。适当的，用于本发明的培养基包含山梨糖醇作为碳源，优选作为唯一碳源。适当的培养基至少还包含酱油曲霉生长所必需的基本底物。

如上述任何实施方案所限定，本发明的方法还包括导入除amdS基因之外的其它核酸序列。所述的其它核酸序列例如编码蛋白质或多肽，如肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质。此序列不是必需是非酱油曲霉序列，也可包括酱油曲霉衍生的序列。但需要指出的是导入的序列是未转化的菌株中不存在的，或以低于本发明酱油曲霉中拷贝数存在的。

自然地，本发明还涉及通过上述方法获得的任何酱油曲霉。基本上，此方法是导入一个序列，该序列能表明作为选择标记的足够活性的amdS的存在情况，与之相反，序列未导入其中的酱油曲霉由于一些原因不能产生足够活性的amdS，使其在作为唯一氮源的amdS的底物上生长。

选择转化的或转染的酱油曲霉的方法也包含在本发明范围内。此方法包括参考用核酸序列转化或转染真菌的已知方式，转化或转染酱油曲霉(不含根据所述任一实施方案限定的活性的内源性amdS基因)。此方法包括将amdS基因作为核酸序列导入，随后选择所得转化的或转染的酱油曲霉，所述选择是在包含导入的amdS的底物作为唯一氮源的培养基上进行，所述培养基还包含碳底物，该培养基能使所需的酱油曲霉生长，同时消除未转化或转染的酱油曲霉生长，因为酱油曲霉在未导入amdS基因的情况下，不具有在选择培养基上生长的能力。适当的培养基至少还包含酱油曲霉生长所必需的基本底物。

本发明还涉及一种生产重组酱油曲霉的方法。该方法包括将所需的核酸序列，例如以已知方式转化或转染入酱油曲霉中，所述所需的核酸序列侧翼为内源性amdS基因片段，其长度和同源性足以确保重组。导入之后，选择具有所需核酸序列的重组酱油曲霉。此选择是通过包含在所需核酸序列中或与其共转化的选择标记进行的，所述选择标记在导入所需核酸序列之前的酱油曲霉中不存在。侧翼序列也可以是相应于内源性amdS基因的确保重组的序列。技术人员基于杂交知识和内源性amdS基因的序列数据，可易于确定哪个序列是适当的。在这两种情况中，重组均消除了内源性amdS的活性。选择标记优选是pyrG，但在选择培养基中要用尿嘧啶代替尿苷。

本发明的另一实施方案包括在含有尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上呈现生长状态的酱油曲霉，所述酱油曲霉在含有尿苷和氟乳清酸的培养基上不生长。这意味着酱油曲霉呈尿嘧啶辅源营养，不能利用尿苷，是pyrG阴性的，并呈现对氟乳清酸抗性。尿嘧啶辅源营养和氟乳清酸抗性可通过活性的导入的pyrG基因的互补作用而减轻。本发明的这种酱油曲霉可没有活性的内源性pyrG基因。本发明pyrG阴性的酱油曲霉可包含经突变失活的内源性pyrG基因。此突变可以是本领域技术人员已知或可达到的任何突变，所述突变失活pyrG基因或其表达产物。这种突变例如是在基因中插入核酸序列，取代基因的部分编码序列，缺失基因的部分编码序列，或缺失基因的全部编码序列。此突变也可发生在基因的调节部分。在具有突变的pyrG基因的本发明酱油曲霉的情况中，所述酱油曲霉可具有与野生型酱油曲霉pyrG基因不同的突变的pyrG基因的核酸序列。另一实施方案包含pyrG阴性的本发明酱油曲霉，其还包含本发明所述amdS变体酱油曲霉的任何特性或其组合。

本发明还包括选择转化或转染的酱油曲霉的方法。此方法包括根据上述用核酸序列转化或转染的方法，对本发明上述任何实施方案的pyrG阴性的酱油曲霉进行转化或转染，所述方法包括用已知的转化或转染方式，将活性pyrG基因导入pyrG阴性的酱油曲霉中。之后在没有尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上选择所得转化或转染的酱油曲霉，所述培养基至少还包含酱油曲霉生长所必需的基本底物，该培养基能使所需的酱油曲霉生长，同时消除未转化或转染的酱油曲霉生长，因为未转化或转染的酱油曲霉的pyrG基因是失活的，在没有尿嘧啶的培养基上没有生长能力。在这种方法的一适当实施方案中，导入的活性的pyrG基因的侧翼为相同核酸序列片段，导入pyrG基因和侧翼序列产生的pyrG阳性的酱油曲霉在无尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上选择。接着，将pyrG阳性的酱油曲霉含有尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上培养，从而消除导入的pyrG基因，这样产生pyrG阴性的酱油曲霉，其可通过在含有尿嘧啶培养基上生长和氟乳清酸抗性而加以选择。在上述方法的一适当实施方案中，指导pyrG基因和侧翼序列整合入特异位置的序列可进一步位于侧翼序列和pyrG基因的侧翼，这是由于整合指导序列与转化的酱油曲霉的特异序列同源。这可剔除(如果需要)与特异序列相关的基因。本领域技术人员熟知产生剔除突变体的方法。所述选择方法的任何实施方案还可包括一个步骤，其中酱油曲霉是用另一种异源核酸序列转化或转染的。此另外的核酸序列优选编码蛋白质或多肽，且在根据本发明的酱油曲霉和一般真菌的其它实施方案中关于这种另外的核酸序列性质的阐述，在此同样有效。此另外序列可在相同载体上与活性pyrG基因一起导入或通过与欲导入的活性pyrG基因共转化而导入。所述选择转化或转染的酱油曲霉的方法，也可与导入核酸序列的方法组合使用，导入方法包括导入上述任何本发明实施方案中的异源amdS基因。自然地，本发明包括通过选择转化或转染的酱油曲霉的方法所得的任何重组酱油曲霉。

本发明还涉及产生重组酱油曲霉的方法，所述方法包括以已知方式用核酸序列转化或转染pyrG阳性的酱油曲霉，该序列包含欲导入的序列和侧翼的pyrG基因片段或相应序列，其长度和特异性足以确保重组消除pyrG基因和导入所需的序列，随后选择含所需的序列的重组酱油曲霉，通过选择具有pyrG阴性表型的酱油曲霉进行选择。技术人员通过其关于用核酸序列进行杂交的知识，和pyrG基因的所需序列数据的知识，可确定相应的序列。

本发明特别涉及这种呈现上述amdS变体酱油曲霉特性的酱油曲霉。因此通过导入amdS和/或pyrS的方法获得的任何酱油曲霉菌株，是本发明范围内的一种新菌株，本发明还包括这种新菌株的应用。这种新菌株可包含一种核酸序列，该序列在原始的酱油曲霉中，甚至在酱油曲霉，曲霉或真菌中不存在。此序列可以源自哺乳动物，或衍生自任何动物，植物或微生物。也可以表达天然存在于酱油曲霉菌株中的核酸序列，但其在相应未转化的酱油曲霉中以较低拷贝数存在。因此，当涉及本发明的pyrG和/或amdS酱油曲霉菌株时，本发明还包括同源蛋白的生产。一优选的实施方案是其中产生的特殊蛋白或多肽在相应的未处理的酱油曲霉中不存在，和/或在相应的未处理的酱油曲霉中以较低拷贝数存在，未处理的酱油曲霉即导入核酸序列之前的酱油曲霉。通过酱油曲霉的任何新菌株以已知在真菌中产生蛋白质或多肽的方式表达异源蛋白质，因此包括与菌株天然或异源的两种序列。基本上，只有天然未转化或转染的酱油曲霉不受保护。生产方法包括将真菌在适当的条件下培养，以发生所需的序列表达。生产方法任选的包括以已知方式分离由真菌产生的多肽或蛋白质。优选的，此蛋白质或多肽分泌于培养基中。

优选的蛋白质或多肽是通过黑曲霉或泡盛曲霉表达易于降解的。现有技术已揭示了许多这种蛋白质和多肽，仍有大量需要测定。这种测定对技术人员是常事。表达的蛋白质或多肽的另一优选实施方案是此蛋白质或多肽不同于酱油曲霉蛋白酶或淀粉酶。一优选的实施方案包括一种非酱油曲霉蛋白或多肽。

特别感兴趣的一实施方案包括组合上述导入核酸序列的两种方法。其优点是用pyrG标记获得的转化的频率，明显高于amdS标记。然而，对在丙烯酰胺选择平板上最佳生长的pyrG阳性菌株的二次筛选，可以鉴别呈现最高拷贝数的那些重组酱油曲霉，因此最可能最高水平基因表达。

如实施例所述，可使用酱油曲霉的同源和异源表达调节序列，即可使用菌株自身天然发生的序列或与菌株异源的序列。因此根据本发明的转化体可包括任何这种调节序列。技术人员可根据特殊应用选择适当的调节区域。调节序列可以是组成型或是可诱导的。调节序列可以是真菌或非真菌的。在实施例中例证了大量序列。大量表达调节序列是现有技术用于其它系统，尤其真菌系统，如曲霉的，并根据本发明可无需过度劳动而常规应用。

为将所需的核酸序列导入酱油曲霉中，可使用适于将核酸序列导入真菌宿主细胞的任何载体。本领域有许多适当的载体。尤其可应用已发现适于在曲霉，如黑曲霉，泡盛曲霉和米曲霉中转化，转染或表达的载体。

除上述之外，本发明阐述了重组酱油曲霉产生蛋白质的效率。这种生产效率在那些具有蛋白酶分布图优于ATCC42251，或至少与ATCC9362，ATCC11906和ATCC20387一样好的菌株中示出。由此证明一些已知的酱油曲霉菌株是非常适于生产蛋白质，多肽和代谢物的。这些酱油曲霉菌株与参比菌株酱油曲霉ATCC42251相比，呈现较低的蛋白酶解活性。尤其两种已知菌株ATCC11906和ATCC20387是特别合适的。因此优选的生产蛋白质，多肽和代谢物的酱油曲霉菌株是与这两种优选菌株相比，表达相同或较低蛋白酶解活性的菌株。菌株ATCC11906是现有技术中在ATCC中保藏的酱油曲霉中最好的实施方案。将生产适当的蛋白质或多肽。本发明可导入核酸序列，由此可用酱油曲霉作为表达宿主选择任何蛋白质或多肽。

本发明提供了对现有表达系统的改进。许多现有的蛋白质生产系统由于蛋白酶解而存在许多问题。本发明的新系统好于目前通用的表达系统黑曲霉和泡盛曲霉。本发明提供了重组酱油曲霉，其包含编码蛋白质或多肽的导入的核酸序列，以进行表达，所述蛋白质或多肽通过黑曲霉或泡盛曲霉表达是易于降解的。本发明还提供了重组酱油曲霉，其包含编码蛋白质或多肽的导入的核酸序列，以进行表达，所述蛋白质或多肽不是酱油曲霉蛋白酶和淀粉酶。一优选的实施方案是其中导入的核酸序列编码非酱油曲霉蛋白或多肽。这种重组酱油曲霉菌株也包含在本发明范围内。

另外，本发明提供了已经修饰的酱油曲霉菌株，以增强其作为表达宿主的适应性。这些修饰可以是通过任何方法诱导的降低蛋白酶解活性。特别地，例证了使用UV随机诱变。还例证了一或多个蛋白酶基因的突变。本领域技术人员已知进行这种突变的方法，且有许多其它的方法可用以得到所需的突变体。一适当的实施方案是碱性蛋白酶解活性降低的突变体。特别例证了消除主要35kDa碱性蛋白酶的特异活性，以确保提高蛋白质和多肽的表达。因此本发明还包括一种新菌株，其呈现蛋白酶解活性降低，尤其碱性蛋白酶解活性降低。这种菌株可通过技术人员已知的任何特异突变而获得。呈现上述蛋白酶解活性降低的这种表达宿主的一优选实施方案还包含可选择的标记。优选的选择标记是amdS，pyrG或其组合。

本发明还包括一种通过剔除35kDa碱性蛋白酶基因，生产蛋白酶缺陷型突变体的方法。基于所提供的此基因的序列数据，有许多方法可达到此目的。尤其一种方法是用连于两个侧翼区的pyrG选择标记进行重组，引起35kDa碱性蛋白酶交换，从而所得菌株具有pyrG选择标记，并失去碱性蛋白酶。接着可除去此pyrG选择标记，由此产生35kDa碱性蛋白酶阴性的酱油曲霉突变体，其可用于表达导入的任何所需的序列。自然，导入的序列在前面的步骤中，已在与pyrG相同的载体上，或在共转化的情况中掺入。也可进行类似的方法，其中与35kDa碱性蛋白酶基因不同的蛋白酶基因被剔除。基于本文提供的例证和其它蛋白酶序列知识，技术人员可进行类似的测定。根据本发明也可类似使用amdS选择标记。

本发明另一方面提供了呈现发酵特性得以改良的突变真菌。本发明特别涉及一种真菌，其包含蛋白原转化酶或等价蛋白的活性抑制的突变体。本领域已知许多蛋白原转化酶。图1列出了一些这种蛋白的序列数据。根据本发明的真菌选自伞菌属，曲霉属，木霉属，根霉属，毛霉属，Phanerochaete，栓菌属，青霉属，头孢属，链孢霉属，Tolypocladium和草根霉属。优选的真菌是黑曲霉，臭曲霉，酱油曲霉，泡盛曲霉，米曲霉，Trichoderma reesei，Penicilliumchrysosporum，Cephalosporium acremonium，Neurospora crassa，Tolypocladium geodes和Thielavia terrestris。当其是酱油曲霉时，一优选的实施方案包括突变体，尤其优选本发明上述的酱油曲霉，即包含异源核酸序列，例如与选择标记amdS和/或pyrG组合。

蛋白原转化酶的一适当等价物是一种蛋白质或多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：3(＝编码黑曲霉蛋白原转化酶氨基酸序列的基因片段)，SEQ ID NO：4(＝编码酱油曲霉蛋白原转化酶氨基酸序列的部分基因片段)，或SEQ ID NO：5-9所示任何DNA序列推断的氨基酸序列，有40％以上，优选45％以上的相似性或相同性。功能等价蛋白可具有在严格杂交条件下，能与SEQ ID NO：3-9的核酸序列杂交的核酸序列。技术人员可易于确定严格杂交条件。严格杂交条件例如是在50℃，优选56℃杂交，并最后用3×SCC冲洗。PE4，PCL1和PCL2例如是特别提及的相当于编码链的适当寡核苷酸混合物(即SEQ ID NO：10，11和12)。提及的非编码链是PE6，PCL2-rev，PCL3和PCL4(即分别是SEQ ID NO：13，14，15和16)。在现有技术中的扩增程序中使用这些引物，可提供等价序列，本发明包括这种使用和所得新发现的序列及其以类似本发明所述方式的应用。产生寡核苷酸的序列是非常保守的，可从所提供的蛋白质的各种氨基酸序列对比加以确定(见图1)。本发明还包括与本专利申请中提供的蛋白质或其相关活性部分的序列相同或呈较高相同性，相似性或同源性的任何其它核酸序列，以及将其用作引物或探针以发现其它蛋白原转化酶或等价蛋白编码序列，和/或接着在这种蛋白质编码序列中导入突变的用途。例如Maniatis等，(1982)分子克隆实验手册，冷泉港实验室，纽约，或其它任何关于克隆和/或筛选核酸序列的手册所述。等价蛋白或多肽呈现具有SEQ ID NO：3-9所示氨基酸序列的蛋白原转化酶活性。突变真菌可在蛋白原转化酶或等价蛋白的编码序列中包含取代，插入或缺失。突变真菌可合适地包括在调节编码蛋白原转化酶或等价蛋白的基因表达中存在的突变。本发明的突变真菌在适当的实施方案中，在相同培养条件下与相应未突变的真菌相比呈现粘度降低。本发明包括表现为所需导入的编码蛋白质或多肽的核酸序列表达提高的上述任何实施方案中的突变真菌，所述真菌与野生型真菌相比，在相同条件下产生更多的蛋白质或多肽。酱油曲霉蛋白原转化酶的活性位点已确定在SEQID NO：3和4推断的氨基酸序列内。

本发明还包括生产肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质或任何其它蛋白质或多肽，优选生产重组肌醇六磷酸酶或任何其它异源蛋白质或多肽的方法，所述方法包括培养上述任何实施方案的突变真菌。本发明还包括如从此细胞中，或在细胞分泌蛋白质或多肽后，获得蛋白质或多肽的方法。

本发明还包括使用所述任何新菌株转化编码肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质或任何其它蛋白质或多肽，及接着表达导入其中的任何核酸序列，及任选的随后的加工和/或分泌和/或分离步骤。

可适当使用任何肌醇六磷酸酶或类肌醇六磷酸酶或任何其它异源蛋白质或多肽编码序列。其可以源自真菌或非真菌。一优选的实施方案是由酸不稳定蛋白质或多肽编码序列形成的。适当的，蛋白质编码序列编码非类蛋白酶蛋白。实施例示出了一种肌醇六磷酸酶序列，和一些适用于转化及在酱油曲霉宿主中表达的异源序列。适当的被表达的蛋白质的其它实例对本领域技术人员是显而易见的。

本发明通过以下实施例得以进一步例证。实施例无任何限制本发明范围之意。技术人员基于本发明的阐述和相关技术领域的知识，可对本发明的实施方案加以改动。文中所引用的内容并入参考。权利要求例证了本发明的范围。实施例构建酱油曲霉基因文库

酱油曲霉的基因组DNA是用先前阐述的方法从得自ATCC11906的原生质体中分离的(Punt，van den Hondel，1992)。在分离后，用Kolar等1988所述方法从原生质体中提取DNA。接着，将此DNA用MboI部分消化，产生平均大小为30-50kb的DNA片段。

用于构建基因文库的载体pAOpyrGcosarpl，是通过在Acc65I-BamHI消化的pHELPl(Gems等，1991)中，连接pANsCosl的3kbBamHI-HindIII片段(Osiewacs，1994)和pAO4.2的3.2kb Acc65I-HindIII片段(De Ruiter-Jacobs，1989)构建的。此粘粒载体携带米曲霉pyrG选择标记，并在丝状真菌中自身复制。

将MboI消化的基因组DNA与BamHI消化的pAOpyrGcosarpl连接，并将此连接混合物用Stratagene Supercosl载体试剂盒包装入噬菌体颗粒中。获得全部30000个克隆，代表近30倍的酱油曲霉基因组。将所得克隆的贮存液(在15％甘油中)集合贮存在-80℃直至使用。amdS转化方法和转化体

用两种通用的原生质体方法和转化方法对酱油曲霉菌株ATCC9362进行测试(修改的OM方法(Yelton等，P.N.A.S.81(1984)1470-1474)和NaCl方法(Punt和Van den Hondel等，酶学方法216(1993)447-457)。这两种方法均产生原生质体，但用OM方法所得的原生质体的存活性明显较好。总产量低于用黑曲霉所得产量。使用OM方法，用全部酱油曲霉菌株进行原生质体/转化预试验。

为进行转化，组合使用载体p3SR2(携带amdS标记)和pAOpyrGcosARPl。后一载体是在测试的所有曲霉物种中自主复制型曲霉载体Arpl的衍生物，当其用作共转化载体时，导致(不稳定的)转化体的数目明显提高。几乎全部的菌株均获得足够的原生质体(每次转化大约10⁶-10⁷)。对各种酱油曲霉菌株在适当amdS选择条件下分析，表明大多数菌株在通用的选择性乙酰胺培养基上茁壮生长。明显的，WO97/04108中报道的对酱油曲霉amdS转化体提出的乙酰胺选择条件，不适用于选择酱油曲霉转化体。我们的试验令人惊奇的证明，amdS阳性转化体只可用丙烯酰胺选择。即使在选择性丙烯酰胺平板上，也观测到来自未转化的原生质体的值得重视的背景。初级转化体要求在大约3周进行选择，开始选择的推定的转化体有一些结果是假阳性的，在移至新鲜选择性丙烯酰胺平板上只显示背景生长。为最佳选择转化体，尝试降低此背景生长。通过从选择性平板中除去葡萄糖可获得改良的结果。在表3中，提供了改良的选择培养基的组分和常用的培养基。图2a，b和c示出在WO97/04108所述的选择培养基上，和在表3所示改良的丙烯酰胺选择培养基上，选择菌株观测的背景生长情况。

用3种选择的酱油曲霉菌株进行的另外的转化试验表明，用NaCl方法ATCC11906和ATCC20387的原生质体效力较好。用各种商购的原生质体酶制品如NOVOZYM，环化酶，Glucanex等，获得成功的原生质体化。基于NaCl转化方法，用amdS选择载体p3SR2或其衍生物转化3种选择的酱油曲霉菌株。使用修改的丙烯酰胺选择平板，获得许多茁壮生长的转化体，而在未用DNA转化的对照组中，未观测到生长。另一种防止未转化的菌丝体背景生长的方法是，消除野生型酱油曲霉amdS基因的活性。这可例如通过破坏酱油曲霉基因而达到。第一步，将携带ATCC11906 amdS序列的特异DNA片段，用衍生自公布的米曲霉amdS序列(Gomi等，1991，基因108，91-98)的引物经PCR扩增。先前的试验已示出通过严格杂交进行克隆不能成功，因为构巢曲霉和酱油曲霉amdS序列之间的低水平序列保守所致。获得大约1.6kb的期望片段，其应携带amdS基因的大部分编码区。对克隆的PCR片段的两个末端(图3a和3b)进行的序列分析证实，部分酱油曲霉amdS基因得以克隆。严格杂交条件是在56℃，最后用3×SSC冲洗。克隆的序列非常类似于公布的米曲霉amdS序列。用克隆的ATCC11906 amdS片段作探针，从在pAOpyrGcosarpl中的ATCC11906粘粒文库中分离到一些杂交克隆(7/10000)。在亚克隆携带完整amdS基因的片段后，将部分amdS基因用可再使用的pyrG选择标记置换，产生amdS置换载体。将此载体转化至酱油曲霉ATCC11906 pyrG中，产生pyrG阳性转化体。接着将这些转化体在乙酰胺和丙烯酰胺选择平板上分析之后，一些转化体示出背景生长降低。对少量这些菌株进行Southern分析，表明发生期望的基因置换。随后，将这些菌株之一使用丙烯酰胺选择平板，用构巢曲霉amdS基因转化，产生一些amdS阳性转化体。pyrG转化方法和转化体(1)初始试验

就酱油曲霉而言，使用现有技术中其它真菌产生pyrG突变体的标准试验，产生众多的氟乳清酸(FOA)抗性菌株。然而，所有这些菌株均能在没有尿苷的培养基上生长，因此不认为是pyrG突变体。我们最终目的是分离适当的突变体菌株，一些变动方法如下。(2)近同源基因破坏

基于来自酱油曲霉和米曲霉的pyrG基因的序列非常相似(在严格条件下通过Southern杂交证实)，进行用突变形式的米曲霉pyrG基因破坏酱油曲霉pyrG基因的试验，所用方法如先前Gouka等(1996)所述。严格条件是在65℃，最后用0.3×SSC冲洗。构建米曲霉pyrG破坏载体，其中携带部分pyrG编码序列的0.5kb ClaI片段缺失(图4)。来自此新载体的XbaI pyrG片段用于转化及直接选择FOA抗性转化体。所得FOA抗性克隆无一需要尿苷。(3)UV诱变和过滤浓缩

另一种改良特异突变体菌株产量的方法是使用过滤富集措施(Bos等，1986，Thesis，Wageningen农业大学)。用UV诱变的孢子接种液态基本培养基(MM)。在所得重复过夜培养物中，将在基本培养基中不能萌发的那些孢子(即pyrG突变孢子)，通过myracloth过滤从生长的菌丝体中分离。对经浓缩后所得孢子测试其pyrG表型，通过将孢子接种于含有FOA的平板进行。再一次，在含有尿苷的MM平板上富集之后所得的菌落，无一需要尿苷。(4)修改的选择条件

我们从前尝试从酱油曲霉中分离pyrG突变体失败提示，所需的pyrG突变体不能利用外源的尿苷，该尿苷是用于FOA选择培养基中以分析尿苷的辅源营养。将现在含有尿嘧啶而非尿苷的一种修改的选择性FOA培养基用于新的分离尝试。在此方法中获得一些需要尿嘧啶的FOA抗性突变体。对这些菌株再测试示出，其不能在补加尿苷的基本培养基上生长。接着，对一些需要尿嘧啶的菌株进行转化试验示出，这些突变体确实可用真菌pyrG基因(如载体pAB4.1；黑曲霉pyrG)互补。在相关的曲霉菌种(构巢曲霉，黑曲霉，米曲霉)和各种其它真菌菌种中，空前观测到pyrG突变体不能在只补加尿苷的基本培养基中生长。(5)可再使用的选择标记

酱油曲霉的通用遗传修饰要求能修饰，破坏和表达在一个真菌菌株中的一些不同基因，这需要一系列不同选择标记。然而，可选择突变体(FOA选择)又可选择转化体(无尿嘧啶的培养基)的标记，如pyrG，提供了在随后的试验中重复使用相同的标记的可能性。为此，设计一种pyrG标记基因，其中互补序列侧翼为源自pyrG基因3’侧翼末端的直接重复序列。所得质粒为pAB4-1rep。此载体的构建详见于图5。此载体的全部序列如SEQ ID NO：17所示。用此载体转化酱油曲霉pyrG突变体，与用pAB4-1转化产生的pyrG阳性转化体数目相似。然而，接下来将选择的pAB4-1和pAB4-1rep转化体的孢子铺板于FOA选择平板上，pAB4-1rep转化体产生更多的FOA抗性/需要尿嘧啶菌落。对这些FOA抗性/需要尿嘧啶的克隆进行Southern分析示出，在大多数pAB4-1rep菌株中，黑曲霉pyrG标记基因已经缺失，在整合基因座只剩下0.7kb的重复区域，而在pAB4-1菌株中，黑曲霉基因仍存在，并推测获得产生pyrG阴性表型的突变。表达宿主：菌株选择蛋白酶产生

酱油曲霉真菌表达系统的非常重要的特性是，在各种培养条件下产生的真菌蛋白酶的水平和类型。有时一些易于转化的菌株不适于作为表达宿主，因为蛋白酶的产生或培养基的酸化对表达产物有害。对各种酱油曲霉菌株的生长习性的分析表明，与黑曲霉相反，在琼脂基础的平板(MacConkey)或摇瓶培养中，不发生培养基酸化。事实上，在摇瓶培养中，不管分析的3种培养基类型(表4)，在大多数情况下甚至获得碱性pH值培养物。基于这些结果和文献数据，预期在酱油曲霉培养液中主要存在碱性蛋白酶。为分析各种菌株培养液的蛋白酶活性，进行乳透明分析。另外，将培养基样品用不同蛋白质温育(例如牛血清白蛋白(BSA))，并随后降解这些蛋白质，以评价测试的菌株作为一些产物的表达宿主的适应性。BSA是在我们先前的试验中用黑曲霉选择的。此蛋白质示出对蛋白酶特别敏感。选择A.terreus肌醇六磷酸酶作为另一种对蛋白酶解不稳定蛋白。通过在生长菌落周围形成乳透明带所示出的乳蛋白降解，是公认的蛋白酶活性标准。通过SDS-PAGE凝胶的Coomassie染色，检测BSA。对肌醇六磷酸酶而言，用特异抗体进行Western分析。如表4所示，与在酱油曲霉培养液中相对比，在黑曲霉培养液中的降解明显不同。在黑曲霉培养液中(pH3-4)，BSA迅速降解。在富含酱油曲霉的培养液中，也发生BSA降解，但比在黑曲霉中少。在大多数酱油曲霉培养液中(pH7-8)，A.terreus肌醇六磷酸酶迅速降解，除ATCC 9362，ATCC11906和ATCC20387培养液之外。通常，在测试条件下，肌醇六磷酸酶降解最低的菌株BSA降解也低。特别的，两种米曲霉菌株ATCC20235和ATCC46250，呈现比大多数酱油曲霉菌株高的蛋白酶解活性。

为排除培养液的pH不同导致的观测结果，将培养液的pH调节为pH4.5(50mM Na/HAc)，pH5.8(50mM Na/HAc)，和pH8.3(50mMTris/HCl)，进行相似的降解试验。表5示出用这些样品所得降解数据。从表中可以看出，在pH7-8具有最高蛋白酶解活性的米曲霉ATCC20235，在其它pH值也示出高蛋白酶解活性。与先前的发现相似，ATCC11906和ATCC20387示出低肌醇六磷酸酶降解活性。ATCC9362在丰富培养基中示出肌醇六磷酸酶降解。由酱油曲霉所降解的BSA与表4所示数据没有明显不同。

总之，这些蛋白酶分析鉴别了3种低蛋白酶酱油曲霉菌株，称为ATCC9362，ATCC11906和ATCC20387。因此，酱油曲霉可用作许多蛋白质的表达宿主，并比现有的转化和表达系统更有优势。菌株改良

一旦确定酱油曲霉的潜在转化能力和表达，考虑产生特性加强的其它菌株以进行表达的方法。开发了可这样使用或组合使用的两种不同的方法，以提供新改良的菌株以表达蛋白质。

一方面，研究产生蛋白酶缺陷的突变体的可能性，并确定由此对表达水平的影响。另一方面，产生形态改变的菌株，以改良发酵特性。为此，以下进行一种迄今未揭示或提出的途径，该途径不仅可用于酱油曲霉，也可用于曲霉和一般的真菌。

产生蛋白酶缺陷的突变体

为获得蛋白酶缺陷的酱油曲霉菌株，使用两种方法。第一种方法是用UV诱变来自ATCC11906和ATCC11906衍生的菌株的孢子。第二种方法是破坏主要碱性蛋白酶的基因。

UV突变体

将从酱油曲霉ATCC11906或其pyrG衍生物之一中新收集的孢子，在Biorad UV室中经UV诱变，剂量为产生20-50％存活性。将系列稀释液铺板于脱脂乳平板上(Mattern等，1992)。在5000个UV存活菌株中，获得4个乳透明带减少的突变菌株。

破坏alpA基因

在此方法中，将克隆自ATCC11906的内源性alpA(碱性蛋白酶)基因，用上述携带可再使用的pyrG选择标记的破坏载体进行破坏。

构建ATCC11906粘粒文库(在pyrG粘粒中)。从10000个独立粘粒克隆中，开始发现4个克隆在同源条件下与酱油曲霉alpA片段杂交，酱油曲霉alpA片段是用MBL1784H和MBL1785引物通过PCR扩增获得的。对这4个克隆再筛选表明，只有一个克隆强杂交。将预期携带完整基因的该克隆的一个4kb EcoRI片段和一个2.5kbHindIII片段亚克隆，并通过限制酶消化和序列分析定性。基于这些亚克隆，构建一种新的基因置换载体，如图6所示。为转化ATCC11906pyrG衍生物，将载体用EcoRI消化，并将8.7kb的alpA缺失片段用于转化(见图6)。用置换盒转化ATCC11906pyrG5，产生许多乳带减少的转化体。对这些菌株进行Southern分析表明成功缺失alpA基因。为接着用pyrG标记转化这些菌株的一种，将此菌株的孢子铺板于含有FOA的培养基上，以选择pyrG突变体。从具有经可再使用的pyrG标记正确整合的破坏盒的菌株中，获得大量FOA抗性菌落。与野生型菌株的自发FOA抗性突变体中所得结果相反，得自这些破坏菌株的FOA菌株实质上均需要尿嘧啶，并是pyrG阴性的。用Southern分析证实在alpA基因座除去了pyrG标记基因，只剩下700bp的“足迹”。

在UV和破坏突变体中分析蛋白酶活性

为分析在ATCC11906的不同低蛋白酶衍生物中蛋白酶的产生水平，进行对照发酵试验。从所得培养物上清中，在各种pH值确定蛋白酶活性。缺失alpA基因在碱性pH值蛋白酶解活性明显降低。对一种UV突变体的蛋白酶活性的分析示出，在pH6和pH8几乎完全没有蛋白酶解活性。因此认为对在这些菌株中产生的分泌性蛋白质的蛋白酶解水平小于在亲代菌株中观测的水平。

产生低粘度突变体

用酱油曲霉进行初始控制的分批或补料分批发酵试验，产生可观的生物量产量，然而在发酵罐中这两种培养物的粘度和孢子生成现象代表非有利的特性。

因此尝试在所需的宿主中改良这些特性。各种专利申请教导了低粘度的突变体可通过各种筛选方法分离。WO96/02653和WO97/26330阐述了呈低粘度的非限定的突变体。然而，在此我们阐述了一种新的完全定性及充分限定的来自酱油曲霉低粘度突变体。发现来自这一生物体的蛋白原加工突变体具有意外的异常生长表型(高度分支)，且对蛋白质的产生无不利影响。用此菌株进行的对照发酵试验表明，在较低粘度值生物量浓度提高。所观测到的特性不仅在酱油曲霉中存在，也存在于其它真菌中如黑曲霉。

(1)构建黑曲霉蛋白原加工突变体

为克隆来自黑曲霉的蛋白原转化酶的编码基因，用来自Saccharomyces cerevisiae KEX2，Schizosaccharomyces pombe KEX1和Xenopus laevis PC2基因的特异性探针进行异源杂交。然而，即使在非常低的严格杂交条件下(47℃，用6×SSC冲洗)，也未获得特异杂交信号，因此排除用此方法克隆相应的黑曲霉基因。

另一种克隆来自黑曲霉的蛋白原转化酶编码基因的方法，是使用PCR。在对比来自各种酵母属和高等真核细胞的各种蛋白原转化酶基因(图1)的基础上，设计不同的PCR引物(SEQ ID NO：10，13，和18-23)，这些引物分别简并2048，49152，4，2，2，512，2048和4608倍。在用PE4和PE6引物扩增中，获得两个单独的克隆，其编码的蛋白质序列示出与S.cerevisiae KEX2序列(SEQ IDNO：24)明显同源。将这些克隆用于进一步试验。

基于观测到的与克隆的PCR片段的其它蛋白原转化酶基因的同源性，将相应的黑曲霉基因称为pclA(来自类蛋白原转化酶)。对黑曲霉的基因组消化产物进行的Southern分析表明，pclA基因是一单拷贝基因，与黑曲霉基因组的基因不密切相关，因为即使在严格杂交条件下(50℃；用6×SSC冲洗)，也无明显另外的杂交信号。对黑曲霉N401的EMBL3基因组文库(Hartingsveldt等，1987)的第一次筛选，尽管筛选了大约10-20个基因组等价物，但未产生任何阳性的杂交噬斑。在第二次筛选中，从EMBL4中的黑曲霉N400基因组文库(Goosen等，1987)中分离了pclA基因的全长基因组拷贝。在筛选5-10个基因组等价物后获得的8个杂交噬斑中，在第一次再筛选后剩下6个。这6个克隆几乎均携带pclA基因的全部拷贝，因为在所有克隆(观测基因组DNA)的PCR片段中，均存在两个3和4kb的杂交EcoRV片段(注意此PCR片段(SEQ ID NO：24)含有一个EcoRV限制位点)。基于与其它蛋白原转化酶的大小相对比，这些片段均含有具有5’和3’侧翼序列的完整的pclA基因。将这两个EcoRV片段和一个重叠5kb EcoRI片段亚克隆以进一步定性。携带pclA基因的DNA片段的详细限制图谱见图7所示。

基于图7所示的限制图谱，在EcoRI和EcoRV亚克隆中确定pclA基因的完整DNA序列(SEQ ID NO：3)。对所得序列进行分析表明，一个开放读框与S.cerevisiae KEX2基因和其它蛋白原转化酶的开放读框具有公认的相似性。基于进一步对比，在编码区鉴别了两个推定的内含子序列(SEQ ID NO：3，1838-1889位，和2132-2181位)。接着用在推定的内含子两侧的引物，对基于pEMBLyex的黑曲霉cDNA文库进行PCR分析表明，只在这两个序列的5’端有真正的内含子。编码的pclA蛋白的一般结构与其它蛋白原转化酶的结构非常相似(SEQ ID NO：25和图8)。PclA蛋白与其它蛋白原转化酶的完全相似性为大约50％(图1)。

为证实克隆的pclA基因是编码功能蛋白的功能基因，尝试构建没有pclA基因的菌株。因此，产生一种缺失pclA的载体pPCLlA，其中大部分pclA编码区用米曲霉pyrG选择标记基因置换。接着，从此载体中将5kb的EcoRI插入片段用于转化各种黑曲霉菌株。在这些转化中(基于pyrG选择)，获得许多转化体。令人感兴趣的是，一部分转化体(1-50％)表现非常明显的异常表型(图9)。对一些野生型和异常转化体的Southern分析表明，表现严重限制生长表型的这些异常转化体缺失pclA基因。野生型生长的所有菌株示出携带一个置换片段的拷贝，该片段整合至野生型pclA基因的附近或在非同源位置。

对选择的携带各种葡糖淀粉酶融合基因的pclA突变体菌株产生蛋白质的分析表明，产生未加工的融合蛋白。在pclA突变体中可高水平产生未加工的葡糖淀粉酶-白细胞介素-6融合蛋白。蛋白质分析表明，在pclA突变体菌株中也形成完全加工的内源葡糖淀粉酶，但只是葡糖淀粉酶原。

为进一步改良融合蛋白的产量，进行对照组和补料分批发酵。令人惊奇的，pclA突变菌株的发酵特性明显超过亲代菌株，产生更低的粘度/生物量比值，而生产力不降低。

(2)构建酱油曲霉蛋白原加工突变体

为构建相应的酱油曲霉突变体，从ATCC11906粘粒文库中分离黑曲霉基因组粘粒克隆的低粘度突变体的功能补体，其包含酱油曲霉蛋白原加工蛋白酶pclA基因。对分离的SEQ ID NO：4序列进行的部分序列分析证实，酱油曲霉pclA基因克隆。图10示出部分酱油曲霉和黑曲霉pclA基因的DNA序列对比。基于酱油曲霉序列和酱油曲霉pclA基因编码区的部分限制图谱，用酱油曲霉pclA基因中的EcoRV位点产生置换载体，以克隆在SmaI片段内的可再使用的pyrG标记(图11)。将所得载体用ClaI部分消化，获得10.5kb的δ-pcl片段(见图11)。分离此片段，以用于转化酱油曲霉pyrG菌株。此基因置换载体用于在ATCC11906和ATCC11906衍生物中产生pclA突变体。所得菌株用于表达同源和异源蛋白质。用一些所得转化体进行的对照发酵试验表明，发酵特性改良，尤其培养物粘度/生物量比值较低。(3)克隆与曲霉pclA同源的真菌基因

在将黑曲霉和酱油曲霉pclA基因的氨基酸序列与其它蛋白原加工酶的氨基酸序列进行对比的基础上(图1)，设计一些相当于良好保守的序列的编码或非编码链的寡核苷酸混合物(SEQ ID NO：10-16)。

将这些寡核苷酸混合物用来自Trichoderma reesei QM9414，Fusarium venenatum ATCC20334，Penicillium chrysogenum P2，Trametes versicolor，Rhizopus oryzae ATCC200076，和Agaricusbisporus HORST的染色体DNA，经PCR扩增。根据所用的模板DNA，对一或多个编码和非编码链寡核苷酸进行PCR扩增(30次循环；1分钟94℃；1分钟40℃；2分钟68℃)，产生特异的PCR产物。表6示出了各种扩增反应的结果。对用两种寡核苷酸混合物之一扩增所得的一些PCR片段进行序列分析。这些分析从不同的真菌中鉴别了各种pclA同源物。图12示出了相应的各种DNA片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：5-9)。

(4)生物量和粘度测定实施例

以下运用的参数范围已经用许多不同真菌菌株发酵确定。粘度

粘度是在Haake Viscotester VT500上，用传感器系统MV DIN(管数7)，在20℃操作确定的。在测定细胞中，获得发酵肉汤的新鲜样品，并将40ml肉汤置于测定细胞中。在设定轴速度短时(4分钟)平衡后，测定粘度。在10种不同的轴速度重复此测定。用测定细胞因子的多个轴速度产生剪切速率。用剪切速率γ(l/s)绘制粘度η(厘泊cP)图，并提供发酵肉汤的粘度分布图。

利用以上方法，使用特异的真菌有机体确定发酵粘度范围(表7)。生物量

通过以下方法确定生物量：

将5.5cm的滤纸(Whatman 54)在铝称重盘上预称重。在Buchner漏斗上用5.5cm滤纸过滤25.0ml完全肉汤，用25.0ml去离子水冲洗滤纸上块状物，将冲洗的块状物和滤物置于称重盘中，在60℃干燥过夜。最后在100℃干燥1小时，然后置于干燥器中冷却。测定干燥物的重量。总生物量(g/l)等于(初始重量-最终重量)×40。蛋白质

使用BioRad分析程序确定蛋白质水平。上述数据代表在发酵进行直至发酵结束的48小时内的测定值；所有曲霉和木霉值均是对于商业相关真菌有机体的，并反应真实商业数据。

真菌菌株如酱油曲霉lfvA和酱油曲霉pclA具有低粘度的优点，可在发酵中使用较低能量输入和/或剪切，以符合在那些情况中的氧需求，所述情况是由于对产物分子的物理破坏，对产物的剪切力对生产力不利的情况。在蛋白质生产力高而生物量较低表示一种在发酵培养基转换为产物中更有效的有机体。因此酱油曲霉突变体提供了较好的生物量和粘度数据，同时还释放至少如此多的蛋白质，事实上除了商业使用的这两种系统外，有许多更好的蛋白质典型保藏曲霉或Trichoderma reesei菌株。

由酱油曲霉产生的高蛋白质产量低生物量浓度，如果提供生物量导致生产力提高，可研制更高提高生物量的发酵条件，以在达到限定发酵条件之前生产所需的产物。由木霉longibrachiatum和黑曲霉有机体产生的现有高水平生物量和粘度限制生物量提高，因为现有水平的生物量和粘度接近限定的实际发酵条件。效应基因表达(1)异源调节序列

将3种选择的酱油曲霉菌株用携带不同真菌表达信号的3种GUS报道载体(构巢曲霉PgpdA；pGUS54，黑曲霉PglaA；pGUS64，黑曲霉PbipA；pBIPGUS)，和amdS选择载体p3SR2或其衍生物共转化。在代表性转化体中分析GUS基因的表达(表8)。结果表明在测试条件下，gpdA启动子是最好的启动子，产生大约5000UGUS/mg蛋白质。这相当于细胞蛋白总量的大约5％。bipA启动子产生大约30％的gpdA活性，这相当于在黑曲霉中获得的数据。令人惊奇的，在黑曲霉中非常有活性的(至少如gpdA活性)的glaA启动子，在酱油曲霉中产生少于1％的gpdA活性。(2)酱油曲霉调节序列

我们还分离了酱油曲霉同源启动子并确定了在表达系统中的可应用性。在一些表达情况中，优选使用同源启动子而不用异源启动子。确定同源启动子是否比异源启动子更有效也是令人感兴趣的。

用基于得自米曲霉的序列(SEQ ID NO：26-31)的引物，对3个有效表达的酱油曲霉基因进行PCR克隆，这三个基因称为alpA(碱性蛋白酶；可诱导型)，amyA(淀粉酶；可诱导型)，和gpdA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶；组成型)。图13a，b和c示出了本方法中使用的各种PCR引物的序列和在公布的米曲霉序列中的位置。来自酱油曲霉ATCC11906的基因组模板DNA用于PCR扩增。初始PCR(30次循环；1分钟94℃；1分钟40℃；2分钟68℃)产生期望大小的(400bp)的gpdA的特异PCR产物。在另两个PCR反应中，未获得产物。因此，对alpA所进行的PCR条件较低(10次循环；1分钟94℃；1分钟25℃；2分钟68℃加上20次循环；1分钟94℃；1分钟40℃；2分钟68℃)，这样产生大约1000bp的特异alpAPCR产物。

测定克隆的基因的完整序列。如图14所示，酱油曲霉ATCC11906 gpdA启动子区域，与其它gpdA启动子序列有非常高的同源性，且alpA启动子明显与米曲霉alpA启动子相同(SEQ ID NO：32和33)。异源蛋白产生

对一些异源蛋白质进行测试，这些蛋白质已知对酸性蛋白酶解敏感，并因此在其它熟知的表达系统中不能有效表达。对在另外的系统中有效表达的蛋白质也进行测试，通过对比用酱油曲霉与用其它已知的表达系统如黑曲霉所得的表达水平加以评价。肌醇六磷酸酶产生

将携带各种真菌肌醇六磷酸酶(Wyss等，(1999)应用环境微生物学65，359-366)的DNA片段，在pAN52-1NotI中，与在构巢曲霉gpdA启动子的ATG密码子-3’平端片段下游导入的5’NcoI或BspHI位点连接。将所得载体用于使用amdS和/或pyrG选择标记共转化酱油曲霉试验。用所述肌醇六磷酸酶平板分析筛选产生肌醇六磷酸酶的转化体。

用多拷贝粘粒方法产生进一步改良的肌醇六磷酸酶表达载体。在此方法中，将肌醇六磷酸酶表达盒的一些拷贝再克隆至多克隆位点载体中(pMTL系列，Chambers等，(1988)基因68，139-149)，以使其分离为EcoRI片段。将这些EcoRI片段的一些拷贝通过包装克隆入粘粒载体pAN4cos1中(Verdoses等，(1993)转基因研究2，84-92)，产生携带一些表达盒的粘粒克隆。将所得克隆用amdS选择标记导入酱油曲霉中。用肌醇六磷酸酶平板分析筛选amdS阳性克隆以生产肌醇六磷酸酶。

用GLA融合方法(如Broekhuijsen等，(1993)生物技术杂志31，135-145)，产生进一步的肌醇六磷酸酶表达载体。结果，编码成熟曲霉fumigatus肌醇六磷酸酶蛋白的肌醇六磷酸酶基因片段，用常规限制位点和融合PCR，在载体pAN56-1中与葡糖淀粉酶载体基因(基因库登记号No Z32700)的3’末端融合。在基因融合体的葡糖淀粉酶与肌醇六磷酸酶之间，导入编码蛋白原加工位点的序列(Asn-Val-Ile-Ser-Lys-Arg)。将所得载体用于使用amdS和或pyrG选择标记共转化酱油曲霉的试验中。使用所述的肌醇六磷酸酶平板分析筛选产生肌醇六磷酸酶的转化体。

进行摇瓶发酵产生明显活性水平的肌醇六磷酸酶。此产量明显高于那些报道的(Hartingsveldt等，(1993)基因127，87-94；VanGorcom等，(1991)EP 420358)用黑曲霉进行试验所得结果。用多拷贝粘粒载体所得水平平均高于用单拷贝载体所得水平。用葡糖淀粉酶-肌醇六磷酸酶融合载体所得肌醇六磷酸酶水平产生高水平的葡糖淀粉酶和肌醇六磷酸酶。用一些选择的产生肌醇六磷酸酶的酱油曲霉转化体进行的对照组和补料分批发酵表明，肌醇六磷酸酶水平进一步提高。葡糖淀粉酶产生

一种有效生产的真菌蛋白例如是由黑曲霉glaA基因报道的。载体pGLA6S(图15)衍生自pGLA6(Punt等，(1991)生物技术杂志17，19-334)，是通过将一个携带作为选择标记的构巢曲霉amdS基因的5kb的EcoRI片段导入pGLA6的唯一EcoRI位点中产生的。将携带amdS选择标记和在构巢曲霉gpdA启动子控制下的葡糖淀粉酶基因的载体pGLA6S(图15)，导入酱油曲霉ATCC11906pyrG中，用载体pAB4.1共转化。淀粉平板分析表明，在这些转化体中淀粉酶解活性提高。在所得转化体中，对在丙烯酰胺培养基上茁壮生长的转化体分析葡糖淀粉酶产生情况。在一些这种转化体的培养上清中，经Coomassie Briljant Blue染色的SDS-PAGE凝胶上，观测到相当于葡糖淀粉酶的一个单独的显性蛋白条带。使用抗葡糖淀粉酶的单克隆抗体(Verdoes等，(1993)转基因研究2，84-92)的Western分析，证实此蛋白质条带的相同性。白细胞介素-6的产生

白细胞介素-6是一种对蛋白酶解降解高度敏感的蛋白质，在黑曲霉中不用gla融合策略和蛋白酶缺陷菌株不会产生。即使用所有这些改良措施，在每升培养液中也只产生几毫克的IL-6。将IL-6载体pAN56-4(Broekhuijsen等，(1993)，生物技术杂志31，134-145)导入酱油曲霉中，通过用pyrG或amdS标记共转化，产生表达在此载体中的IL-6融合基因的转化体。从这些转化体中选择几个进一步分析。用这些转化体进行摇瓶发酵试验。对这些菌株的培养上清进行SDS-PAGE和Western分析，令人惊奇的示出正确加工的IL-6水平高于在黑曲霉中报道的最佳水平。使用酱油曲霉的各种类型的蛋白酶缺陷和最佳发酵的突变体，进一步提高得自对照发酵试验的IL-6生产水平(Broekhuijsen等，(1993)，生物技术杂志31，134-145)。绿色荧光蛋白(GFP)

我们在酱油曲霉中尝试产生的另一种酸性不稳定型蛋白是GFP，其来自海蜇Aequoria victoria。此蛋白不仅对蛋白酶解敏感，且在酸性pH丧失活性。将携带GFP或GLA-GFP融合基因(在构巢曲霉gpdA启动子驱动下)的载体，导入酱油曲霉中，用pyrG或amdS选择标记共转化。这两种载体的酱油曲霉转化体均产生明亮的荧光表达。基于观测到的荧光和随后进行的培养上清分析(培养上清经SDS-PAGE和Western分析选择的摇瓶培养的转化体获得的)，确定完整的胞质GFP和分泌的GLA-GFP的产量均高于在黑曲霉蛋白酶缺陷宿主中所得结果(Siedenberg等，生物技术Prog.(1999)15，43-50；Gordon等，微生物学(2000)146，415-426)。与在黑曲霉培养上清中的情况相反，分泌的GFP也示出明显的荧光。

附图说明

图1：该图对比了来自X.laevis(XENPC2和XNFURIN)，S.cerevisiae(SCKEX2)，K.lactis(KLKEX1)，C.albicans(CAKEX2)，S.pombe(SPKRP)，和Y.lipolytica(YLKEX2)的类KEX2加工蛋白酶的氨基酸序列。编码具有最高整体相同性的氨基酸序列(用淡蓝色框表示)的引物是：MBL793，MBL1208，MBL794，MBL1158，PE6，PCL1，PCL2(rev)，PE6，PCL3，MBL789，PCL4和MBL1219。整体相同的区域(7个中有4个)用紫色框表示。缺口用·表示；无序列数据用～表示；^* 表示蛋白质的终止密码子。

图2：由2a，2b和2c组成

图2a示出专利申请WO97/04108所述酱油曲霉菌株在33℃温育5天后的背景生长情况。上图表示在非选择培养基上的生长。左下图示出WO97/04108的选择培养基，右下图示出用本发明改良的培养基(丙烯酰胺)所得结果。

图2b示出酱油曲霉菌株ATCC11906在33℃温育5天后的背景生长情况。上图表示在非选择培养基上的生长。左下图示出WO97/04108的选择培养基，右下图示出用本发明改良的培养基(丙烯酰胺)所得结果。

图2c示出酱油曲霉菌株ATCC20387在33℃温育5天后的背景生长情况。上图表示在非选择培养基上的生长。左下图示出WO97/04108的选择培养基，右下图示出用本发明改良的培养基(丙烯酰胺)所得结果。

图3(a和b)：此图对比了酱油曲霉ATCC11906和米曲霉amdS序列的两个末端。A和B表示两个末端。使用克隆的1.6kb的酱油曲霉序列。下划线的黑体碱基在菌种/菌株之间不同。

图4(a和b)：此图例证了通过pAO4-13和pAO4-13δCla构建pyrG破坏载体。

图5：此图例证了通过分离XhoI和HindIII片段，随后克隆入pMTL24中，从pAB4-1中构建pAB4-1rep的过程。

图6：此图示出构建alpA基因置换载体的过程。以3片段连接将来自具有ATCC11906基因组片段的pAS1-1的一个4.4kb的EcoRI-StuI片段，来自pAB4-1rep的一个2.6kb的SmaI-NcoI片段，和来自pAS1-2A的一个4.4kb的NcoI-EcoRI片段连接，产生pAS1-δalp。

图7：此图示出携带黑曲霉pclA基因的DNA片段的限制图谱。

图8：此图示出黑曲霉pclA基因编码的蛋白质的结构(功能性结构)。从左至右示出前蛋白(pre)结构域，蛋白原(pro)结构域，活性域和P结构域。浅色三角形表示KR位点。黑色三角形表示糖基化位点。竖纹浅色框是S/P/T富集区。在右侧的暗色框是D/E富集区。

图9：此图例证了黑曲霉pclA突变体菌株的生长表型。

图10：此图提供了酱油曲霉和黑曲霉pclA基因之间的DNA序列对比。垂直条代表相同性；：表示5；·表示1；发现72.139％相似性和72.073％相同性。

图11：此图示出构建pclA基因置换载体的过程。将是ATCC11906基因组片段的一个7.6kb的ClaI片段克隆入pMTL23p中。在此构建体中，将来自pAB4-1rep的一个2.6kb的SmaI片段克隆入EcoRV位点中，产生pAS2-δpcl。

图12：此图示出各种pclA同源物的氨基酸序列对比，这些同源物来自S.cerevisiae(Sckex2)，K.lactis(Klkex1)，酱油曲霉(Aspcla)，黑曲霉(A.niger)，P.chrysogenum(Penpcl1)，A.bisporus(Agarmbl129)，T.reesei(Trichpcl1)，R.oryzae(Rhizpcl1)，F.venenatum(Fuspcl1)，S.pombe(Spkrp)，C.albicans(Cakex2)，和Y.lipolytica(Ylkex2)。整体相同的区域(12个中由8个)用黄色框表示。缺口用·表示；无序列数据用～表示。

图13：图13a示出米曲霉alpA启动子序列(Q11755)。指出了进行PCR克隆的引物位置。在图13b中，示出米曲霉amyA启动子序列(A02532)，也包括引物位置。图13c示出ATCC42149米曲霉衍生的gpdA启动子序列(EP0.436.858 al)，也包括引物位置。

图14：此图示出曲霉的各种gpdA启动子序列对比，从上至下为酱油曲霉ATCC11906，米曲霉，黑曲霉和构巢曲霉。^*表示启动子5’未翻译区中推定的内含子。→表示CT富集区域。黑体下划线字母表示米曲霉和酱油曲霉序列之间的不同。

图15：此图示出12700bp的载体pGLA6S的图谱。

表1.曲霉属的分类图解(Samson，1992)属亚属组所选菌种^a “亚种”^b曲霉属 Circumdati 文氏文氏曲霉(葡糖苷酶)

Flavi/Tamarii 米曲霉(淀粉酶，蛋白酶)

塔木里曲霉^tox

酱油曲霉(发酵食品，蛋白酶)

寄生曲霉^tox

黄曲霉^tox

Nigri 黑曲霉-------------------------→A.pulverulentes

(发酵食品，海枣曲霉

各种蛋白质，泡盛曲霉

有机酸) 臭曲霉

川地曲霉

宇佐美氏曲霉

无花果曲霉

日本曲霉 -----------------→棘孢曲霉

(内切葡聚糖酶) (葡糖苷酶，

半乳聚糖酶)

椭圆曲霉

塔宾曲霉-----------------------→＂黑曲霉＂

Circumdati 赭色曲霉^tox(xulanase)

洋葱曲霉^tox

Candidi 白色曲霉(脂酶，葡糖苷酶)

Cremei 分解乌头酸曲霉(有机酸)

Sparsi 稀疏曲霉曲霉属曲霉亚属曲霉组灰绿曲霉(发酵食品)

Restricti 局限曲霉^tox

Fumigati Fumigati 烟曲霉^tox

Cervini

Ornati

Clavati Clavati 巨大曲霉^tox

Nidulantes Nidulantes 构巢曲霉^tox

Versicolores 萨氏曲霉(脂酶)

Usti

Terrei 土曲霉^tox(葡聚糖酶)

Flavipedes^a对于本表所选的菌种，除了塔木里曲霉、稀疏曲霉和椭圆曲霉外，均描述了蛋白质/有机酸/发酵食品的产生(以括号示出)和/或DNA介导的转化程序(以下划线示出)。已记录有毒素产生的菌种以^tox标出。^b基于各种方法，所列名字可被认为与给出的菌种名同义。表2不同ATCC菌株的分类

菌株	形态学¹⁾	黄曲霉毒素产生	RAPD²⁾	PCR_aflR ³	PCR_alpA	分类⁴⁾
菌株	形态学¹⁾	黄曲霉毒素产生	RAPD²⁾	PCR_aflR ³	PCR_alpA	分类⁴⁾	ATCC9362⁵⁾	ND	否⁷⁾	酱油曲霉I型	酱油曲霉	酱油曲霉	酱油曲霉
ATCC11906⁶⁾	酱油曲霉	否^1，7)	酱油曲霉I型	酱油曲霉	酱油曲霉	酱油曲霉	ATCC9362⁵⁾	ND	否⁷⁾	酱油曲霉I型	酱油曲霉	酱油曲霉	酱油曲霉
ATCC11906⁶⁾	酱油曲霉	否^1，7)	酱油曲霉I型	酱油曲霉	酱油曲霉	酱油曲霉	ATCC20235	酱油曲霉	否¹⁾	酱油曲霉II型	米曲霉	米曲霉	米曲霉
ATCC20245	酱油曲霉	否^1，7)	酱油曲霉I型	酱油曲霉	酱油曲霉	酱油曲霉	ATCC20235	酱油曲霉	否¹⁾	酱油曲霉II型	米曲霉	米曲霉	米曲霉
ATCC20245	酱油曲霉	否^1，7)	酱油曲霉I型	酱油曲霉	酱油曲霉	酱油曲霉	ATCC20387	酱油曲霉	否¹⁾	ND	ND	酱油曲霉	酱油曲霉
ATCC20388	酱油曲霉	否¹⁾	ND	ND	酱油曲霉	酱油曲霉	ATCC20387	酱油曲霉	否¹⁾	ND	ND	酱油曲霉	酱油曲霉
ATCC20388	酱油曲霉	否¹⁾	ND	ND	酱油曲霉	酱油曲霉	ATCC42249	酱油曲霉	否¹⁾	酱油曲霉II型	ND	酱油曲霉	酱油曲霉
ATCC42250	酱油曲霉	否¹⁾	ND	ND	酱油曲霉	酱油曲霉	ATCC42249	酱油曲霉	否¹⁾	酱油曲霉II型	ND	酱油曲霉	酱油曲霉
ATCC42250	酱油曲霉	否¹⁾	ND	ND	酱油曲霉	酱油曲霉	ATCC42251	酱油曲霉	否¹⁾	ND	酱油曲霉	酱油曲霉	酱油曲霉
ATCC46250	ND	ND	ND	ND	米曲霉	米曲霉	ATCC42251	酱油曲霉	否¹⁾	ND	酱油曲霉	酱油曲霉	酱油曲霉
ATCC46250	ND	ND	ND	ND	米曲霉	米曲霉	IFO4177(CBS205.89)	米曲霉	否⁸⁾	ND	ND	米曲霉	米曲霉

注：ND＝未确定¹⁾参考文献：Ushijima S，Hayashi K and Murakami H(1982)酱油发酵中所用酱油曲霉的当前分类地位。Agric.Biol.Chem.，46：2365-2367，1981.²⁾参考文献：Yuan GF，Liu CS and Chen CC(1995)通过多态DNA随机扩增区分寄生曲霉和酱油曲霉.Appl.Environm.Microbiol.，61：2384-2387.³⁾参考文献：Chang PK，Bhatnagar D，Cleveland TE and Bennett JW(1995)黄曲霉毒素途径基因aflR同系物中的序列可变性区分曲霉属黄曲霉组的菌种Appl.Environm.Microbiol.，61：40-43.⁴⁾基于此表数据由TNO得出的分类总结⁵⁾此菌株以米曲霉保藏在ATCC，但是随后根据Yuan et al.1995²⁾和Chang et al.1995³⁾重新分类为酱油曲霉⁶⁾此菌株以寄生曲霉保藏在ATCC但是随后根据Ushijima et al，1981¹⁾和Yuan etal，1995²⁾重新分类为酱油曲霉⁷⁾参考文献：ATCC目录⁸⁾参考文献：Liu BH，Chu FS(1998)Appl.Env.Microbiol.，64：3718-3723.表3.选择培养基的组成

组成	非选择培养基	选择培养基(WO97/04108)	丙烯酰胺选择培养基	改进的丙烯酰胺选择培养基
组成	非选择培养基	选择培养基(WO97/04108)	丙烯酰胺选择培养基	改进的丙烯酰胺选择培养基	KH₂PO₄	1.5g/l	1.5g/l	1.5g/l	1.5g/l
KCl	0.5g/l	0.5g/l	0.5g/l	0.5g/l	KH₂PO₄	1.5g/l	1.5g/l	1.5g/l	1.5g/l
KCl	0.5g/l	0.5g/l	0.5g/l	0.5g/l	MgSO₄.7H₂O	0.5g/l	0.5g/l	0.5g/l	0.5g/l
NaNO₃	6g/l	----	----	----	MgSO₄.7H₂O	0.5g/l	0.5g/l	0.5g/l	0.5g/l
NaNO₃	6g/l	----	----	----	葡萄糖	10g/l	10g/l	10g/l	----
山梨糖醇	1.2M	----	1.2M	1.2M	葡萄糖	10g/l	10g/l	10g/l	----
山梨糖醇	1.2M	----	1.2M	1.2M	蔗糖	----	1M	----	----
矿物溶液¹⁾	0.1％v/v	0.1％v/v	0.1％v/v	0.1％v/v	蔗糖	----	1M	----	----
矿物溶液¹⁾	0.1％v/v	0.1％v/v	0.1％v/v	0.1％v/v	乙酰胺	----	10mM	----	----
丙烯酰胺	----	----	10mM	10mM	乙酰胺	----	10mM	----	----
丙烯酰胺	----	----	10mM	10mM	CsCl	----	15mM	15mM	15mM
琼脂	15g/l	15g/l	15g/l	15g/l	CsCl	----	15mM	15mM	15mM

1)矿物溶液：CuSO₄.5H₂O 0.16g/l

FeSO₄.7H₂O 0.5g/l

ZnSO₄.7H₂O 2.2g/l

MnCl₂.4H₂O 0.5g/l

CoCl₂.6H₂O 0.17g/l

Na₂MoO₄.2H₂O 0.15g/l

H₃BO₃ 1.1g/l

EDTA 5g/l表4.不同培养基中的蛋白酶活性

菌株	保温后蛋白质的降解
	保温后蛋白质的降解										基本培养基			完全培养基			基本培养基+Trusoy			脱脂乳
	PH	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreur)	PH	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreur)	PH	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreur)		基本培养基			完全培养基			基本培养基+Trusoy
	PH	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreur)	PH	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreur)	PH	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreur)	ATCC9362	6.75	-	-	7.5	-	-	6.88	-	-		-
ATCC11906	7.00	-	-	8.28	-	-	7.51		-	ATCC9362	6.75	-	-	7.5	-	-	6.88	-	-	-	-
ATCC11906	7.00	-	-	8.28	-	-	7.51		-	ATCC 20235(＝米曲霉)	8.40	-	+	8.38	+	+	7.70	+	+	-	+
ATCC 20245	8.05	-	+	8.18	-	+	7.65	+	+	ATCC 20235(＝米曲霉)	8.40	-	+	8.38	+	+	7.70	+	+	+	+
ATCC 20245	8.05	-	+	8.18	-	+	7.65	+	+	ATCC 20387	7.45	-	-	7.5	+	+	7.76	-	-	+	-
ATCC 20388	8.20	-	+	7.5	-	+	7.74	-	+	ATCC 20387	7.45	-	-	7.5	+	+	7.76	-	-	+	-
ATCC 20388	8.20	-	+	7.5	-	+	7.74	-	+	ATCC 42249	8.30	-	+	7.5	-	+	7.77	+	+	+	+
ATCC 42250	8.30	-	+	7.5	-	+	7.55	-	+	ATCC 42249	8.30	-	+	7.5	-	+	7.77	+	+	+	+
ATCC 42250	8.30	-	+	7.5	-	+	7.55	-	+	ATCC 42251	8.40	-	+	7.5	-	+	7.50	-	+	+	+
ATCC 46250(＝米曲霉)	7.75	-	+	8.0	+	+	7.35	+	+	ATCC 42251	8.40	-	+	7.5	-	+	7.50	-	+	+	+
ATCC 46250(＝米曲霉)	7.75	-	+	8.0	+	+	7.35	+	+	黑曲霉	3.85	+	-	4.25	+	-	3.45	+	-	+	+

注：+在4小时保温后蛋白质(部分)降解，有大的乳透明圈

-在4小时保温后无蛋白质降解，有小的乳透明圈/无乳透明圈在30℃保温：27ul培养基样品

2.5ulBSA(25mg/ml)

0.5ul肌醇六磷酸酶(A.terreus，3-4g/l)

在从培养物取培养基样品后加入BSA和肌醇六磷酸酶，这一样品在30℃保温并在一定时间后分析样品中BSA和肌醇六

磷酸酶的降解。表5.在不同pH下的蛋白酶活性

菌株	保温后在基本培养基+Trusoy中蛋白质的降解
	保温后在基本培养基+Trusoy中蛋白质的降解						pH＝4.5		pH＝6		pH＝8
	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreus)	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreus)	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreus)	pH＝4.5		pH＝6		pH＝8
	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreus)	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreus)	BSA	肌醇六磷酸酶(A.terreus)	ATCC9362	-	-	-	-	-	-
ATCC11906	-	-	-	-	-	-	ATCC9362	-	-	-	-	-	-
ATCC11906	-	-	-	-	-	-	ATCC20235(＝米曲霉)	+	-	+	+	+	+
ATCC20387	-	-	-	-	-	-	ATCC20235(＝米曲霉)	+	-	+	+	+	+

注：+在4小时保温后蛋白质(部分)降解

-在4小时保温后无蛋白质降解在30℃保温：25ul培养基样品

50mMNaAc pH＝4.2

2ul缓冲液 →50mM NaAc pH＝5.8

50mM Tris/HCI pH＝8.3

2.5ul BSA(25mg/ml)

0.5ul肌醇六磷酸酶(A.terreus，3-4g/l)

在从培养物取培养基样品后加入BSA、肌醇六磷酸酶和缓冲液，

这一样品在30℃保温并在一定时间后分析样品中BSA和肌醇六

磷酸酶的降解。表6.克隆真菌pclA基因的PCR结果

引物组合		PCR产物预期大小
引物组合		PCR产物预期大小	1	pcl1+pcl2rev	180bp
2	pcl1+pcl3	350bp	1	pcl1+pcl2rev	180bp
2	pcl1+pcl3	350bp	3	pcl1+pcl4	500bp
4	pcl1+MBL1372	300bp	3	pcl1+pcl4	500bp
4	pcl1+MBL1372	300bp	5	pcl2+pcl3	200bp
6	pcl2+pcl4	350bp	5	pcl2+pcl3	200bp
6	pcl2+pcl4	350bp	7	pcl2+MBL1372	150bp
8	MBL1298+pcl2rev	180bp	7	pcl2+MBL1372	150bp
8	MBL1298+pcl2rev	180bp	9	MBL1298+pcl3	350bp
10	MBL1298+pcl4	500bp	9	MBL1298+pcl3	350bp

菌株	引物组合
	引物组合										1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	Trichoderma reesei QM9414	+	+	-	-	-	-	-	+	-	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	-
Penicillium chrysogenum P2	Trichoderma reesei QM9414	+	+	-	-	-	-	-	+	-	+	+	+	-	+	-	-	+	-	-	-
Penicillium chrysogenum P2	Fusarium venenatum ATCC20334	+	+	+	-	-	+	-	+	+	+	+	+	-	+	-	-	+	-	-	-
Trametes versicolor TV 1	Fusarium venenatum ATCC20334	+	+	+	-	-	+	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Trametes versicolor TV 1	Rhizopus oryzae ATCC200076	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Agaricus bisporus HORST	Rhizopus oryzae ATCC200076	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-
Agaricus bisporus HORST	Aspergillus sojae ATCC 11906	+	+	+	-	-	+	-	+	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-
阳性对照	Aspergillus sojae ATCC 11906	+	+	+	-	-	+	-	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-

注：+特异PCR产物

-非特异或无PCR产物

+该PCR产物用于测序表7各种酱油曲霉菌株的粘度

菌株	粘度(cP)			生物量(g/l)
	粘度(cP)				剪切速率6.5l/s	剪切速率83.2l/	剪切速率644.4l/s
	野生型酱油曲霉	＞＞2000	1505		剪切速率6.5l/s	剪切速率83.2l/	剪切速率644.4l/s	155	8.8和16.6
酱油曲霉pclA	野生型酱油曲霉	＞＞2000	1505	2000	751	76	7.6和17.2	155	8.8和16.6
酱油曲霉pclA	酱油曲霉lfvA	1565	94	2000	751	76	7.6和17.2	18	6.9和18.8

表8.酱油曲霉转化子中的启动子强度

转化子	启动子	在基本培养基中的GUS活性(U/mg)
		在基本培养基中的GUS活性(U/mg)					5％木糖	5％葡萄糖	5％麦芽糖糊精	5％淀粉	％trusoy
		ATCC11906野生型	----	0	0	0	5％木糖	5％葡萄糖	5％麦芽糖糊精	5％淀粉	％trusoy	0	0
ATCC11906[pGUS54]	gpdA	ATCC11906野生型	----	0	0	0	9141	6291	6667	6937	3391	0	0
ATCC11906[pGUS54]	gpdA	ATCC11906[pGUS64]	glaA	33	50	25	9141	6291	6667	6937	3391	51	176
ATCC11906[pBIPGUS]	bipA	ATCC11906[pGUS64]	glaA	33	50	25	2914	2849	1642	493	2083	51	176

序列表SEQ ID No.1MBL1784：5′-CGGAATTCGAGCGCAACTACAAGATCAA-3′SEQ ID No.2MBL1785：5′-CGGAATTCAGCCCAGTTGAAGCCGTC-3′SEQ ID No.3编码的黑曲霉蛋白原转化酶基因的序列起始密码子和终止密码子以粗体下划线字母表示。内含子以下划线小写字母表示

1 CCATGGCAAG CCTCCTACTT GGCCTGATTA CATCGTCCTG AGAGAGAGAG

51 TTCACCAAAA CTCTCCCCCA AACG ATGCGT CTTACAGGTG GTGTCGCTGC 101 GGCTCTGGGC CTCTGCGCTG CTGCCTCCGC TTCTCTCCAT CCCCATCGTT151 CCTACGAGAC CCATGATTAC TTCGCTCTAC ACCTTGATGA ATCCACCTCG201 CCGGCCGACG TCGCCCAACG ACTAGGTGCT CGCCACGAAG GCCCCGTCGG251 AGAATTACCC TCACATCATA CCTTCTCGAT ACCCCGTGAA AACAGTGACG301 ATGTCCATGC GCTGCTGGAT CAATTGCGCG ATCGTCGGAG GTTACGCCGC351 CGCTCCGGAG ATGACGCCGC TGTCCTTCCC TCCTTGGTCG GGCGAGACGA401 AGGTCTAGGT GGCATTCTTT GGTCCGAGAA GCTGGCTCCC CAGAGAAAGC451 TCCATAAAAG AGTGCCGCCG ACAGGATATG CTGCCAGATC GCCCGTCAAC501 ACTCAGAATG ACCCCCAAGC GCTTGCGGCG CAGAAACGCA TTGCCTCGGA551 ATTGGGCATC GCGGACCCCA TCTTCGGCGA ACAATGGCAT TTGTATAATA601 CTGTTCAGTT GGGCCATGAT CTTAACGTGA CGGGTATCTG GCTGGAGGGC651 GTTACAGGGC AGGGTGTCAC GACGGCCATT GTCGATGACG GTTTGGACAT701 GTACAGCAAC GATCTTAGGC CGAACTATTT TGCGGCGGGT TCTTATGACT751 ATAACGACAA AGTACCAGAG CCGAGGCCGC GCTTGAGCGA TGACCGCCAC801 GGTACTAGAT GCGCGGGTGA AATCGGTGCG GCGAAGAACG ACGTGTGCGG851 GGTTGGTGTT GCGTATGATA GTCGCATCGC TGGTATTCGG ATTCTCTCCG901 CACCCATCGA TGACACTGAT GAGGCTGCGG CTATTAACTA CGCCTATCAG951 GAGAACGATA TCTACTCGTG TTCCTGGGGT CCCTATGATG ATGGCGCCAC1001 AATGGAAGCC CCGGGCACTC TGATCAAGCG GGCCATGGTC AATGGTATCC1051 AAAATGGTCG AGGTGGAAAA GGCTCGGTTT TTGTATTTGC GGCTGGTAAC1101 GGTGCCATTC ATGACGATAA CTGTAACTTT GACGGTTACA CCAACAGTAT1151 CTACAGCATC ACGGTGGGTG CCATTGATCG GGAGGGTAAC CATCCTCCGT1201 ATTCGGAATC CTGCTCGGCG CAACTGGTGG TTGCCTACAG CAGCGGCGCC1251 AGTGATGCAA TTCATACCAC GGACGTCGGC ACAGACAAGT GCTCGACTAC1301 CCATGGTGGA ACTTCGGCGG CCGGCCCGCT CGCTGCGGGA ACCGTGGCGC1351 TGGCCCTCAG TGTGCGGCCG GAACTCACCT GGCGTGACGT TCAGTATTTG1401 ATGATTGAGG CGGCAGTGCC TGTTCATGAA GATGATGGAA GCTGGCAGGA1451 CACTAAGAAC GGGAAGAAGT TCAGCCATGA CTGGGGATAT GGTAAGGTCG1501 ACACATATAC GCTGGTGAAA CGGGCAGAGA CCTGGGATCT GGTGAAGCCT1551 CAAGCCTGGC TCCATTCCCC CTGGCAGCGG GTTGAGCATG AGATCCCACA1601 GGGCGAGCAG GGCTTGGCTA GTTCGTACGA GGTGACGGAG GATATGTTGA1651 AGGGAGCCAA CCTGGAACGG CTGGAGCATG TCACGGTCAC CATGAATGTT1701 AACCACACCC GCCGAGGCGA TCTCAGCGTG GAGTTACGGA GCCCTGATGG1751 TCGGGTCAGT CACCTCAGTA CGCCCCGGCG GCCAGATAAT CAAGAGGTGG1801 GCTATGTTGA TTGGACCTTC ATGAGCGTTG CTCACTG gta agtaaaaact1851 ttttctcggt tgtcggttct tctgctaata catatctagG GGCGAGTCCG1901 GGATTGGCAA ATGGACTGTG ATTGTCAAGG ACACCAATGT CAACGAGCAT1951 ACTGGGCAAT TCATCGATTG GCGACTCAAC TTGTGGGGCG AGGCGATTGA2001 CGGAGCCGAG CAGCCTCTCC ACCCCATGCC TACTGAACAC GATGACGACC2051 ACAGCTATGA GGAAGGAAAC GTGGCTACCA CGAGCATCAG CGCCGTTCCC2101 ACGAAAACCG AGCTGCCTGA CAAGCCCACT GGTGCGTTG ATCGCCCGGT2151 GAACGTTAAG CCTACAACAT CCGCGATGCC GACCGGTAGT CTTACAGAGC2201 CCATCGATGA TGAAGAACTC CAGAAGACCC CTAGTACAGA GGCAAGCTCA2251 ACACCAAGTC CTTCTCCGAC CACCGCGTCA GATAGTATCC TGCCTTCCTT2301 CTTCCCCACG TTCGGTGCGT CGAAGCGGAC CGAAGTTTGG ATCTACGCTG2351 CGATCGGCTC CATCATTGTG TTCTGCATTG GCCTGGGCGT CTACTTCCAT2401 GTGCAGCGCC GCAAACGTAT TCGCGACGAC AGCCGGGATG ACTACGATTT2451 CGAGATGATC GAGGACGAGG ATGAGCTACA GGCAATGAAC GGACGGTCGA2501 ACCGTTCACG TCGCCGGGGT GGCGAGCTGT ACAATGCTTT TGCGGGCGAG2551 AGCGATGAGG AACCATTATT CAGTGATGAG GATGATGAAC CGTATCGGGA2601 TCGGGGGATC AGCGGCGAAC AAGAACGGGA GGGCGCAGAT GGAGAGCATT2651 CTCGGAGA TG AAAGTGCAGT AGATGAGGGT TGACTTTATT TCGGACAGTG2701 TTTCTAACTT GTTGGATGAC CTGCGTTGAA CAATATTTCT GCTGTGTATG2751 CTGCATAGAG AAGCGTGTAT ATACCATGTA TGTGTGCATC ATCGTGATCG2801 GGTTTATCAT TCTTCATCTG CCATGGTTTG TGATCTCCGG AATAGTACCA2851 AAGGAACACT AAATTAAGGG TCTTGGCGAT GACGCTTCCC GTCGCTGCTT2901 TTGACTTCCT CCGCATCTCG TCTCTCCTGC TGTTGACCGC GCGCCAACCA2951 ACCTCCATCT CCTCACTCCT CCCACCTTAA TCTTGCTGTG CTGCTTCTAG3001 AACCCCCCAG TTTAATTTAA AAACCGGCTT TTCCTAGCTC CACGTATTGT3051 ACCTCGCACT GATCCCCATC TCCGCCCACT CCAACGCTAC CGACCCAGGC3101 TTCTCTGGCG GCTCCAGGCG GCAGGCAATC AAACCAACCC CTCGATGGAT3151 CAGCACGACG ACTTCGACAG SGTCTCGTGG AGGCATGACC CGGACAGCGA3201 TCTCTCGCGA CCCACGAACT CCGGAACAGA CACAGAGGAA CAGGCGCCAT3251 ACACTCACGA TGTCAATGGC AAACGGAGGA TGAGCAACCG CTCAAGAAAG3301 CCCTCAGGCT GGACCACTGG CGGATGCCGT CGACCTGGCG GGCATCGCGA3351 CGGCGTACTA GAGTGTCGGG TAGATTCACC GTTGAAGGAG AATATGGACG3401 AAAGACGCTT ATATCTCCTA TTTGGTACAC TACTAGGTGG GTATCTTACC3451 TCAGTGATCT CAGATGGASEQ ID No.4编码酱油曲霉蛋白原转化酶的基因的编码区的部分序列1 CGCGGATCCA TGGAACACGA TGTGCGGGTG AAATTGGAGC AGCTAGGAAT51 GATGTCTGTG GAGTAGGTGT TGCATACGAC AGCCAAGTTG CCGGAATTCG101 GATTTTGTCC GCACCCATTG ACGACGCAGA TGAGGCTGCT GCCATCAACT151 ATGGCTTCCA GCGCAATGAT ATATATTCAT GCTCCTGGGG CCCTCCGGAT201 GATGGCGCCA CGATGGAGGC GCCAGGGATT CTTATCAAAC GAGCTATGGT251 CAACGGTATC CAAAATGGCC GAGGAGGTAA AGGTTCTATC TTCGTCTTTG301 CAGCTGGAAA TGGTGCAGGG TACGATGACA ACTGCAATTT CGACGGTTAT351 ACAAACAGCA TTTACAGCAT CACCGTCGGC GCTATTGATC GAGAGGGCAA401 ACATCCCAGC TACTCGGAAT CATGCTCTGC CCAGTTGGTT GTCGCTTATA451 GCAGTGGCTC GAGTGACGCG ATTCATACCA CCGACGTTGG AACTGATAAA501 TGTTATTCAC TNTCACGGGC GGAACTTCTG CAACTGGACC GCTAGCTGCG551 GGTACTATTG CCCTCGCTCT TAGTGCCCGA CCGGAACTAA CTTGGCGAGA601 TGCCCAGTAC CTGATGATAG AGACCGCAGT TCCCGTCCAC GAAGACGACG651 GGAGCTGGCA GACTACCAAA ATGGGGAAGA AGTTTAGCCA TGACTGGGGT701 TTTGGGAAAG TAGATGCATA TTCACTGGTC CAGCTGGCCA AGACGTGGGA 751 GCTGGTGAAA CCACAGGCGT GGTTCCACTC ACCGTGGCTG CGGGTGAAGC801 ATGAAATCCC ACAAGGTGAC CAGGGCCTTG CCAGCTCATA CGAAATTACC851 AAGGATATGA TGTACCAGGC CAATGTCGAG AAATTGGAAC ATGTCACTGT901 GACCATGAAT GTAAATCACA CTCGCCGAGG CGATATCAGC GTGGAGTTGC951 GCAGCCCCGA AGGTATCGTC AGTCATCTGA GTACAGCGCG GCGGTCAGAT1001 AATGCAAAGG CTGGCTATGA AGATTGGACG TTTATGACTG TGGCTCATTG1051 GTATGTATTT GCTCCCGTAA TTTAGTTTTC GTGCTCAGTC CTGACATTTA1101 CATTTAGGGG TGAGTCCGGT GTTGGAAAGT GGACGGTCAT TGTGAAGGAT1151 ACCAATGTCA ATGATCATGT TGGAGAATTC ATCGACTGGC GGCTCAACCT1201 CTGGGGACTT TCGATCGACG GCTCCAGCCA GCCCCTTCAT CCTATGCCCG1251 ATGAGCATGA CGATGACCAC TCGATTGAAG ATGCCATTGT TGTTACCACT1301 AGTGTTGACC CTATCCCAAC TAAGACTGAA GCCCCACCTG TCCCAACTGA1351 TCCCGTGGAT CGTCCTGTGA ACGCAAAGCC ATCTGCGCAG CCAACGATGC1401 CTTCAGAGGC TCCTGCTCAA GAGACATCTG AAGTTCCCAC CCCGACGAAA1451 CCTAGTTCTA CTGAATCACC TTCTTACCAC CTCCTCTGCG GATAGCTTTT1501 TGCCATCCTT CTTCCCCACG TTCGGTGCGT CGTGAGGATC CAAGCTTGGG1551 TACGTSEQ ID No.5编码Trichoderma reesei QM9414蛋白原转化酶的基因的编码区的部分序列1 GCTGTCCGCA CTGATGCGTG CGGCCTTGGC GTTGCCTACG ACTCCAAGAT 51 TGCTGGCATC CGCATCCTTA GTAGTGCCAT CAGCGATGCG GACGAGGCCG101 AGGCCATGAT TTACAAGTTC CAGGACAACC AGATCTACTC GTGCTCCTGG151 GGGCCTCCCG ACGATGGGAG GTCCATGGAA GCCCCCGACG TCCTGATTCG201 ACGAGCCATG CTCAAGGGCG TCCAGGAGGG ACGAGGAGGC CTCNGCTCCA251 TCTACGNCTT TGCTAGTGGT AACGGTGCCG CCAGTGGCGA TAACTGCAAC301 TNCGACGGAT ACNCAAACASEQ ID No.6编码Fusarium venenatum ATCC20334蛋白原转化酶的基因的编码区的部分序列1 GGTTTNNCCG TTGGTGTTGC TACGACTCCA AGTCGCCGGA ATCCGTATTC51 TCAGCAAACT GATCAGCGAC GCCGACGAAG CAGAAGCGCT TATGTACAAG101 TACCATGACA ACCATATTTA CTCTTGCTCA TGGGGTCCTT CCGATGATGG151 CCAGACTATG GAGGCACCCG ATGTTGTCAT TCGACGAGCA ATGCTTAAGG201 CGATTCAGGA GGGACGTAAT GGTCTTGGCT CTGTCTACGT CTTTGCCAGT251 GGAAACGGTG CAGGCCAAGG AGATAACTGC AACTNCGACG GATCCACCAA301 ACASEQ ID No.7编码Penicillium chrysogenum P2蛋白原转化酶的基因的编码区的部分序列 1 GTGGGTGTTG CCTATGACAG CAAGGTGTCA GGTATCCGGA TTCTGTCCAA51 GGCGATTGAC GACGTCGACG AAGCAGCTGC CATCAACTTT GCCTTCCAAG101 ATAACGATAT ATACTCCTGC TCGTGGGGTC CTCCTGATGA TGGTGCGACC151 ATGGATGCGC CGGGCTTGTT GATCAAGCGG GCGATGGTCA ATGGTGTGCA201 NGAGGGACGA GGTGGAAAGG GTTCGATCTT CGTGTTNGCC GCAGGCAACG251 GTGCTCTTTT TGGCGACAAC TGCAACTTCG ACGGATACAA CAAACASEQ ID No.8编码Rhizopus oryzae ATCC200076蛋白原转化酶的基因的编码区的部分序列1 ACTNGGGGCA TTGGTGAAAT NTTGCTTGTG GNTTGGTGTT GCTTACGACG51 CAAAAATATC TGGTATACGT ATATTATCAG GTGAAATCAC AGAGGCAGAC101 GAGGCTGCTG CTTTGAATTA CAAATATCAA GAAAATCAAA TCTACTCCTG151 CTCNTGGGGC CCASEQ ID No.9编码Agaricus bisporus HORST蛋白原转化酶的基因的编码区的部分序列1 ATGTGGTCTT GGTCTCGCCT ACGAATCCAA GGTCGCTGGT GTTCGCATAT51 TGTCTGGTCC CATAACGGAC GTCGATGAAG CGACTGCGCT CAACTATGGT101 TTCCAAAATG TATCTATCTT CAGCTGTAGT TGGGGCCCAC CTGACAATGG151 TATGTCCATG GAAGGCCCAG GATACCTCAT CAAAAAAGCT GTCGTCAACG201 GCATTAACCA GGGACGTGGC GGGAAGGGCT CCATTTTCGT CTTCGCCAGT251 GGCAACGGCG CTGCTTCGGA TGACCAATGC AACTACGACG GATACACAAA301 CASEQ ID No.10编码链BamHI-位点下划线PE4 5′-CG C GGATC CA(T/C)GGX ACX(C/A)GX TG(T/C)GCX GG-3′

简并2048次SEQ ID No.11编码链PCL1 5′-CA(T/C)GGX ACX(C/A)GX TG(T/C)GCX GGX GA-3′

简并8192次SEQ ID No.12编码链PCL2 5′-AT(C/T/A)TA(T/C)TCX TG(T/C)TCX TGG GGX CC-3′

简并768次SEQ ID No.13非编码链BamHI-位点下划线PE6 5′-CGC GGA TCC XCC(A/G)TT XCC X(C/G)(A/G)XGC

(G/A/C)(C/A)A XAC-3′

简并49152次SEQ ID No.14非编码链PCL2rev 5′-GG XCC CCA XGA(A/G)CA XGA(A/G)TA(A/T/G)AT-3′简并768次SEQ ID No.15非编码链PCL3 5′-(A/G)TT XGT(A/G)TA XCC(A/G)TC(A/G)(A/T)A(A/G)TT-3′

简并1024次SEQ ID No.16非编码链PCL4 5′-GC XGC XGA XGT XCC XCC(A/G)TG-3′

简并2048次SEQ ID No.17pAB4-1rep的序列........59-499bp...............................：pAB4-1的0.4kb HindIII片段1-58bp........500-513bp.............2873-2930bp：pMTL24的多接头序列

(以下划线小写字母表示)......................514-2872bp...............：pAB4-1的2.3kb Xhol片段1 ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga gtcgacctgc51 aggcatgcAA GCTTGGTCAG CAGTACCAGA CGCCCGGATC GGCTATCGGC101 CGGGGTGCTG ACTTCATTAT CGCGGGTCGC GGTATCTACG CCGCCGCGGA151 TCCGGTGCAG GCTGCGCAAC AGTATCAGAA GGAGGGGTGG GAAGCCTACC201 TGGCCCGTGT CGGCGGAAAC TAATACTATA AAAGGAGGAT CGAAGTTCTG251 ATGGTTATGA ATGATATAGA AATGCAACTT GCCGCAACGG ATACGGAAGC301 GGAAACGGAC CAATGTCGAG CACGGGTAGT CAGACTGCGG CATCGGATGT351 CCAAACGGTA TTGATCCTGC AGGCTACTAT GGTGTGGCAC AAGGATCAAT401 GCGGTACGAC GATTTGATGC AGATAAGCAG GCTGCGAAGT AGTAACTCTT451 GCGTAGAGAA AATGGCGACG GGTGGGCTGA TAAGGGCGGT GATAAGCTT g 501 catgcctgca ggcCTCGAGC TAACATACAT TCCGAACCGT GCAGCCCAAG551 GCCGAGCAGT TCAACTGCGC TCAGCGCGCT CATGCCAACT TCCTTGAGAA601 CTCCAGCCAA ACTATGCTCT TCCTCCTGGT AGCTGGACTG AAGTACCCCC651 AGTTGGCGAC TGGCCTCGGA AGCATCTGGG TCCTCGGTCG CTCACTGTTC701 CTTTACGGAT ATGTGTACTC CGGCAAGCCG CGGGGTCGCG GTCGTTTGTA751 CGGCAGCTTC TACTTGCTTG CACAGGGAGC TCTCTGGGGC NTGACGTCTT801 TTGGAGTTGC GAGGGAGTTG ATTTCCTACT TCTAAGTTTG GACTTGAATC851 CGTGGTGTGA TTGAGGTGAT TGGCGATGTT TGGCTATACC AGCTATATGT901 AATAATCTCT ACTGTATACT ACTATTCAAC GCATTTTACT ATGCGTGCTG951 CTAGGGTCGG CAATGACAAT GGCAATCTGA CTGACGTGGT CTATTTCTCC1001 ATGTGCAGCA GGGAATACGA GCTCCAATGG ACCTCGGGAG TGGCACAGTC1051 AATGGCAAGG AAACTCCGCC TTTGCAGGTG TGGCTGAACC CCACGGGTCG1101 GAGGCGGAGC AATCCACCCC CGATGTGGCT GGTGCGTGGA GGGGCTCGCG1151 ATGATTTTAC TGAGCTTGCT TTTCTTGTCG ACATTGAACA TTGTCCTTGG1201 TCTTCCTTCA GATTTAAGGG TCAGTCACTG CTACATTTCT CAGTAGTATC1251 CGCGCACGTC TCTGGATTTA CGAATCAGGG TCCACCAGTC AAACTTCGA1301 ACTACTCTCA TTATACAATC CTCTTTCCAT TCCCGCATTA ACCCCTCCAT1351 CAACACCATG TCCTCCAAGT CGCAATTGAC CTACACTGCC CGTGCCAGCA1401 AGCATCCCAA TGCTCTGGCG AAGAGGCTGT TCGAGATTGC CGAGGCCAAG1451 AAGACCAATG TGACTGTCTC GGCTGACGTT ACCACCACTA AGGAGCTACT1501 AGATCTTGCT GACCGTAGGC CGACCCGCTA CTCTGCCTGA TTATGCTGCA1551 TGCAAACTTA TTAACGGTGA TACCGGACTG CAGGTCTCGG TCCCTACATT1601 GCCGTGATCA AAACCCACAT CGATATCCTC TCTGATTTCA GCAACGAGAC1651 CATTGAGGGA CTTAAGGCTC TCGCGCAGAA GCACAACTTT CTCATCTTCG1701 AGGACCGCAA GtTCATTGAC ATCGGCAACA CGGTCCAGAA GCAATACCAC1751 GGCGGTACCC TCCGTATCTC GGAATGGGCC CACATCATCA ACTGCAGCAT1801 TCTCCCTGGT GAGGGTATCG TCGAGGCTCT CGCTCAGACG GCGTCTGCAC1851 CGGACTTCGC CTACGGCCCC GAACGCGGTC TGTTGATCTT GGCAGAGATG1901 ACCTCTAAGG GCTCCTTGGC TACCGGCCAG TACACTACTT CCTCGGTCGA1951 TTATGCCCGG AAATACAAGA ACTTCGTTAT GGGATTCGTG TCGACGCGCG2001 CGTTGGGTGA GGTGCAGTCG GAAGTCAGCT CTCCTTCGGA TGAGGAGGAC2051 TTTGTGGTCT TCACGACTGG TGTGAACATT TCTTCCAAGG GAGATAAGCT2101 TGGTCAGCAG TACCAGACGC CCGGATCGGC TATCGGCCGG GGTGCTGACT2151 TCATTATCGC GGGTCGCGGT ATCTACGCCG CGCCGGATCC GGTGCAGGCT2201 GCGCAACAGT ATCAGAAGGA GGGGTGGGAA GCCTACCTGG CCCGTGTCGG2251 CGGAAACTAA TACTATAAAA GGAGGATCGA AGTTCTGATG GTTATGAATG2301 ATATAGAAAT GCAACTTGCC GCAACGGATA CGGAAGCGGA AACGGACCAA2351 TGTCGAGCAC GGGTAGTCAG ACTGCGGCAT CGGATGTCCA AACGGTATTG2401 ATCCTGCAGG CTACTATGGT GTGGCACAAG GATCAATGCG GTACGACGAT2451 TTGATGCAGA TAAGCAGGCT GCGAAGTAGT AACTCTTGCG TAGAGAAAAT2501 GGCGACGGGT GGGCTGATAA GGGCGGTGAT AAGCTTAATT GTCATCGCAG2551 ATAAGCACTG CTGTCTTGCA TCCAAGTCAG CGTCAGCAGA AATACGGGAC2601 TTCCGAAAGT ATATGGCAAA ATTAAAGAAC TTGACTCTCC AGCAATGTTT2651 TGCCCTGACC GTCGCTAAAA CGTTACTACC CCTATACCCG TCTGTTTGTC2701 CCAGCCCGAG GCATTAGGTC TGACTGACAG CACGGCGCCA TGCGGGCTTG2751 GGACGCCATG TCCGTCGCGT GATAAGGGTT GATCCATGCA GCTACTATCC2801 TTCCATCGTT CCATTCCCAT CCTTGTCCTA TCTCCATCCT TGAAACTTTA2851 CTAGTTTAGT TGGATGCTCG AG atctccat ggacgcgtga cgtcgactct2901 gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcgSEQ ID No.18MBL789 EcoRI下划线

5′-G GAA TTC(A/G)GA ATA(T/A)GG AGG ATG TAG-3′

简并4次SEQ ID No.19MBL 793 BamHI下划线

5′-C GGATCCG CAG TGG CAC TTG(G/A)TC AAT CCA A-3′

简并2次SEQ ID No.20MBL 794 EcoRI下划线

5′-G GA ATT CTT AAA A(T/G)C CCA AGA ACC TTC A-3′

简并2次SEQ ID No.21MBL 1158 EcoRI下划线

5′-G GAA TTC(T/C)TC(T/G)CC(T/G)GC(A/G)CA(C/G)C(T/G)

(C/G)GT(T/G)CC(A/G)TG-3′

简并512次SEQ ID No.22MBL 1208 ClaI下划线

5′-CGG ATC GA(T/C)GGX ACX(C/A)GX TG(T/C)GCX GG-3′

简并2048次SEQ ID No.23MBL 1219 BamHI下划线

5′-C GG ATC(C/T)TG XA(G/T/C)(A/G)TC XC(T/G)CCA XGT

(C/A/G)AG-3′

简并4608次SEQ ID No.24限制位点粗体字表示引物下划线表示BaHmI PE4引物GGATCCATGG CACGAGATGT GCAGGTGAAA PTCGGTGCGGC GAAAGAAAACAACGTGTGCG 60GGGTTGGTGT TGCGTATGAT AGTCGCATCG CTGGTATTCG GATTCTCTCCACACCCATCG 120

EcoRVATGACACTGA TGAGGCTGCG GCTATTAACT ACGCCTATCA GGAGAACGATATCTACTCGT 180GTTCCTGGGG TCCCTATGAT GATGGCGCCA CAATGGAAGC CCCGGGCACTCTGATCAAGC 240GGGCCATGGT CAATGGTATC CAAAATGGTC GAGGTGGAAA AGGCTCGGTTTTT GTCTGCG300

PE6引物CCCCCGGAAA TGGTGGATCC320

BamHISEQ ID No.25Aspergillus niger PclA蛋白序列 1 Met Arg Leu Thr Gly Gly Val Ala Ala Ala Leu Gly Leu Cys

Ala16 Ala Ala Ser Ala Ser Leu His Pro His Arg Ser Tyr Glu Thr

His31 Asp Tyr Phe Ala Leu His Leu Asp Glu Ser Thr Ser Pro Ala

Asp46 Val Ala Gln Arg Leu Gly Ala Arg His Glu Gly Pro Val Gly

Glu61 Leu Pro Ser His His Thr Phe Ser Ile Pro Arg Glu Asn Ser

Asp76 Asp Val His Ala Leu Leu Asp Gln Leu Arg Asp Arg Arg Arg

Leu91 Arg Arg Arg Ser Gly Asp Asp Ala Ala Val Leu Pro Ser Leu

Val106 Gly Arg Asp Glu Gly Leu Gly Gly Ile Leu Trp Ser Glu Lys

Leu121 Ala Pro Gln Arg Lys Leu His Lys Arg Val Pro Pro Thr Gly

Tyr136 Ala Ala Arg Ser Pro Val Asn Thr Gln Asn Asp Pro Gln Ala

Leu151 Ala Ala Gln Lys Arg Ile Ala Ser Glu Leu Gly Ile Ala Asp

Pro166 Ile Phe Gly Glu Gln Trp His Leu Tyr Asn Thr Val Gln Leu

Gly181 His Asp Leu Asn Val Thr Gly Ile Trp Leu Glu Gly Val Thr

Gly196 Gln Gly Val Thr Thr Ala Ile Val Asp Asp Gly Leu Asp Met

Tyr211 Ser Asn Asp Leu Arg Pro Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Ser Tyr

Asp226 Tyr Asn Asp Lys Val Pro Glu Pro Arg Pro Arg Leu Ser Asp

Asp241 Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Ile Gly Ala Ala Lys

Asn256 Asp Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asp Ser Arg Ile Ala

Gly271 Ile Arg Ile Leu Ser Ala Pro Ile Asp Asp Thr Asp Glu Ala

Ala286 Ala Ile Asn Tyr Ala Tyr Gln Glu Asn Asp Ile Tyr Ser Cys

Ser301 Trp Gly Pro Tyr Asp Asp Gly Ala Thr Met Glu Ala Pro Gly

Thr316 Leu Ile Lys Arg Ala Met Val Asn Gly Ile Gln Asn Gly Arg

Gly331 Gly Lys Gly Ser Val Phe Val Phe Ala Ala Gly Asn Gly Ala

Ile346 His Asp Asp Asn Cys Asn Phe Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile

Tyr361 Ser Ile Thr Val Gly Ala Ile Asp Arg Glu Gly Asn His Pro

Pro376 Tyr Ser Glu Ser Cys Ser Ala Gln Leu Val Val Ala Tyr Ser

Ser391 Gly Ala Ser Asp Ala Ile His Thr Thr Asp Val Gly Thr Asp

Lys406 Cys Ser Thr Thr His Gly Gly Thr Ser Ala Ala Gly Pro Leu

Ala421 Ala Gly Thr Val Ala Leu Ala Leu Ser Val Arg Pro Glu Leu

Thr436 Trp Arg Asp Val Gln Tyr Leu Met Ile Glu Ala Ala Val Pro

Val451 His Glu Asp Asp Gly Ser Trp Gln Asp Thr Lys Asn Gly Lys

Lys466 Phe Ser His Asp Trp Gly Tyr Gly Lys Val Asp Thr Tyr Thr

Leu481 Val Lys Arg Ala Glu Thr Trp Asp Leu Val Lys Pro Gln Ala

Trp496 Leu His Ser Pro Trp Gln Arg Val Glu His Glu Ile Pro Gln

Gly511 Glu Gln Gly Leu Ala Ser Ser Tyr Glu Val Thr Glu Asp Met

Leu526 Lys Gly Ala Asn Leu Glu Arg Leu Glu His Val Thr Val Thr

Met541 Asn Val Asn His Thr Arg Arg Gly Asp Leu Ser Val Glu Leu

Arg556 Ser Pro Asp Gly Arg Val Ser His Leu Ser Thr Pro Arg Arg

Pro571 Asp Asn Gln Glu Val Gly Tyr Val Asp Trp Thr Phe Met Ser

Val586 Ala His Trp Gly Glu Ser Gly Ile Gly Lys Trp Thr Val Ile

Val601 Lys Asp Thr Asn Val Asn Glu His Thr Gly Gln Phe Ile Asp

Trp616 Arg Leu Asn Leu Trp Gly Glu Ala Ile Asp Gly Ala Glu Gln

Pro631 Leu His Pro Met Pro Thr Glu His Asp Asp Asp His Ser Tyr

Glu646 Glu Gly Asn Val Ala Thr Thr Ser Ile Ser Ala Val Pro Thr

Lys661 Thr Glu Leu Pro Asp Lys Pro Thr Gly Gly Val Asp Arg Pro

Val676 Asn Val Lys Pro Thr Thr Ser Ala Met Pro Thr Gly Ser Leu

Thr691 Glu Pro Ile Asp Asp Glu Glu Leu Gln Lys Thr Pro Ser Thr

Glu706 Ala Ser Ser Thr Pro Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Ser Asp

Ser721 Ile Leu Pro Ser Phe Phe Pro Thr Phe Gly Ala Ser Lys Arg

Thr736 Glu Val Trp Ile Tyr Ala Ala Ile Gly Ser Ile Ile Val Phe

Cys751 Ile Gly Leu Gly Val Tyr Phe His Val Gln Arg Arg Lys Arg

Ile766 Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Tyr Asn Phe Glu Met Ile Glu

Asp781 Glu Asp Glu Leu Gln Ala Met Asn Gly Arg Ser Asn Arg Ser

Arg796 Arg Arg Gly Gly Glu Leu Tyr Asn Ala Phe Ala Gly Glu Ser

Asp811 Glu Glu Pro Leu Phe Ser Asp Glu Asp Asp Glu Pro Tyr Arg

Asp826 Arg Gly Ile Ser Gly Glu Gln Glu Arg Glu Gly Ala Asp Gly

Glu841 His Ser Arg ArgSEQ ID Nos.26 to 31酱油曲霉启动子克隆所用PCR引物限制位点下划线

引物	序列(5′-3′)
引物	序列(5′-3′)	Alp-1	G GAATTCGCGGCCGCGGTTATTCTGCGGAAGCGEcoRI NotI
Alp-2	G GAATTCCCATGGTGAGAAGATTGTAAAGEcoRI NcoI	Alp-1	G GAATTCGCGGCCGCGGTTATTCTGCGGAAGCGEcoRI NotI
Alp-2	G GAATTCCCATGGTGAGAAGATTGTAAAGEcoRI NcoI	Amy-1	G GAATTCGCGGCCGCAGATCTGCCCTTATAAATCTCCEcoRI NotI
Amy-2	G GAATTCCCATGGATGCCTTCTGTGGGGEcoRI NcoI	Amy-1	G GAATTCGCGGCCGCAGATCTGCCCTTATAAATCTCCEcoRI NotI
Amy-2	G GAATTCCCATGGATGCCTTCTGTGGGGEcoRI NcoI	AOGPDA-1	G GAATTCGCGGCCGCCTATGAAACCGGAAAGEcoRI NotI
AOGPDA-2	G GAATTCTAG CCATGGTTTAGATGTGEcoRI NcoI	AOGPDA-1	G GAATTCGCGGCCGCCTATGAAACCGGAAAGEcoRI NotI

SEQ IDNo.26SEQ IDNo.27SEQ IDNo.28SEQ IDNo.29SEQ IDNo.30SEQ IDNo.31SEQ ID No.32酱油曲霉gpdA启动子区 1 AATTGCGGCC GCTATGAAAC CGGAAAGGGC TGCTGAGAGC TGGGGAACGG51 CGCAAGCCGG GAAAACAGCT GACAAGGACC CATTTCACTC TGGATCTTGA101 GGAGAGCTGT AGCTTTTGCC CCGTCTGTCC ACCCGGTGAC TGGATTAGTG151 ACCTGGTCGT TGCGTCAGTC AACATTGCTC TTTTTTTATC TCCCCCTCCC201 CCGCCGTCCG ACTTTTCTCC CCTTTTCTAC TCTCTTCGTA TACTCACCAC251 TGCAATCATC TTATCCCTTT GTCTTCTTAC TTAAAGTGAG TCGTCTCCCG301 CCCATCGTTC CCTTTGAACC TTGTAAATCA GAGCCACTTT CAAGTGTCTA351 CCGTTTCCTT TCCACATAGA TTGACTGACA GCTACCCCGC CACACCAGCA401 GACACATCTA AACCATGGSEQ ID No.33酱油曲霉alpA启动子区的序列1 GCGGCCGCGG TTATTCTGCG GAAGCGGACC CCCCCCTTCC GCCCAAACAG51 GGCGAATGTG CCCAAGTTCT GATACTATCA GAAGACCTCC AGGAGCACAT101 GCCTGTTCGC ATAACCCTGG TGTAGCACCA GGAATTGCTT AGCTTAGCTT151 CTTCGACTGA GGGGCCAGAA AGTGCTTATC GCAAAGATCC CACTTCTTTG201 TGTGATAGCC CCTCCCGCGG CCCTTGATCA AGCCGTTCTC GCTATCCAAT251 ATTGAAAGCG TGATATTATA GGTGCACATG GTTATTATCC TTTTTCTTTT301 TCTCTTTCTT TGCTTTTCAT GCAACCCCAT ACGTTGCCGA ATTTGGCTAC351 ACCTTGGGGC TCATTCTTCG AAGTTTAGAT TCCGACAAGA CCTCACCACC401 CAATCAAAAC CCTTGATTCC TGATAAAAGA CGTGGAAAGA AGCGGATATC451 GCGTGAGGAT GCCAAGCAAA GGGAATGGGT CACATTGATC TCTGTCGCGT 501 TGTTAGGATG ATCTTCACTC CTAAAGGCAT CGCCCGCGGC ACTAGGTCCT551 TCCTGTCCAG GATATCGTTT ACTCCTCTCA TTATGGCGAG CTACTTTGTG601 AATTAATTGA CTGAGGGATA TACCACCTTC CCTTTGAAGG TACCAAGCCA651 CTACCTTGAG CGTTAGTTAC TTTTTCGAGG AAAGCGTCCT ATGCTGGTCT701 CCGCCAAACC CTCGACAACT TGCCATAGCC TTGTGTTCTT CATGGTCTAT751 CGGAGTACCC GTTCATGACT GAAGCGGGTC AGCGTCCGTG GTGGTCATCA801 TCATTCTCAT CTTTCATCAT GCCCGCTGAT TGATAGAGTA ATTTCCGGTG851 GAGCACAACG CCGTCCTCTG AGATGCAATG TCACCCTGTA AGTTTCAACT901 ACACTCTGTA GTACAGAGCA TCCTTGCCAT TGCATGCTGT GCAAGTGATC951 TAAATCCGTA GAATCTGCTC GAGAACGGGG AAATATAGAA CTCCTGAAGG1001 TTATAAATAC CACATGCATC CCTCGTCCAT CCTCATTTCC ATCATCAAGC1051 CAGCGGTTTC TATCCTCCGA CTTGAGTCGT TCTCGCGCAT CTTTACAATC1101 TTCTCACCAT GG

Claims

1.一种重组的酱油曲霉，其包含一个导入的乙酰胺酶S(amdS)基因作为选择标记。

2.权利要求1的酱油曲霉，所述酱油曲霉在包含导入的amdS的底物作为唯一氮源的培养基上可选择，所述培养基还包含碳源，且没有内源性amdS诱导底物。

3.权利要求1或2的酱油曲霉，其中氮源是丙烯酰胺。

4.前述任一权利要求的酱油曲霉，其中酱油曲霉没有活性内源性amdS基因，例如因为内源性amdS基因包含内源性amdS失活突变，例如缺失或破坏。

5.一种将核酸序列导入酱油曲霉的方法，所述方法包括根据已知的将核酸序列导入真菌的方法，将核酸序列导入酱油曲霉中，例如通过转化或转染，所述方法包括将amdS基因作为核酸序列(此后称为导入的amdS基因)导入，随后在无内源性amdS诱导底物的培养基上选择所得的转化或转染的酱油曲霉，所述培养基还包含作为唯一氮源的导入的amdS的底物，并还包含碳底物，所述培养基能使包含所述核酸序列的所需酱油曲霉生长，同时消除无所述导入核酸序列的酱油曲霉的生长，因为这种酱油曲霉不导入amdS基因在选择培养基上没有生长能力，所述培养基还包含作为唯一氮源的除乙酰胺外的amdS的底物，例如作为导入的amdS的底物的丙烯酰胺。

6.一种通过权利要求5的方法获得的酱油曲霉。

7.一种选择转化或转染的酱油曲霉的方法，所述方法包括将权利要求1-4和6任一项的酱油曲霉，根据已知用核酸转化或转染真菌的方法转化或转染，所述方法包括将amdS基因作为核酸序列导入，随后在培养基上选择转化或转染的酱油曲霉，所述培养基包含导入的amdS的底物作为唯一氮源，还包含碳底物，所述培养基能使所需的酱油曲霉生长，同时消除未转化或未转染的酱油曲霉的生长，因为这种酱油曲霉不导入amdS基因在选择培养基上没有生长能力。

8.一种生产重组酱油曲霉的方法，所述方法包括将一种核酸序列以已知方式例如通过转化或转染导入权利要求1-4和6任一项的酱油曲霉中，所述核酸序列包含欲导入的所需序列及其侧翼的长度和同源性足以保证重组的内源性amdS基因片段或相应序列，从而同时消除内源性amdS基因，并导入所需序列，随后选择具有所需序列的重组酱油曲霉，这是通过选择包含在所需序列中或与所需序列共转化的选择标记而进行，所述选择标记在导入核酸序列之前的酱油曲霉中不存在，合适的选择标记是pyrG。

9.一种能在包含尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上生长的酱油曲霉，所述酱油曲霉在包含尿苷和氟乳清酸的培养基上不生长，即所述酱油曲霉呈尿嘧啶辅源营养，所述酱油曲霉不能利用尿苷，所述酱油曲霉是pyrG阴性的，所述酱油曲霉对氟乳清酸有抗性，所述尿嘧啶辅源营养和氟乳清酸抗性可通过导入的活性pyrG基因的互补作用而减轻，合适地，所述酱油曲霉没有活性的内源性pyrG基因；例如酱油曲霉内源性pyrG基因在基因或基因调节序列中包含插入，取代或缺失形式的突变，例如缺失整个基因编码序列。

10.权利要求9的酱油曲霉，其组合权利要求1-4和6任一项的酱油曲霉的特性。

11.一种选择转化或转染的酱油曲霉的方法，所述方法包括将权利要求9或10的酱油曲霉用核酸序列转化或转染，所述方法包括将活性的pyrG基因根据已知转化或转染真菌的方式，导入酱油曲霉中，随后在不含尿嘧啶和氟乳清酸培养基上选择所得转化或转染的酱油曲霉，所述培养基至少还包含酱油曲霉生长所必需的基本底物，所述培养基能使所需酱油曲霉生长，同时消除未转化或未转染的酱油曲霉生长，因为这种酱油曲霉由于pyrG基因失活而无尿嘧啶不能生长。

12. 权利要求11的方法，其中导入的活性pyrG基因侧翼为相同核酸序列片段，在不含尿嘧啶和氟乳清酸培养基上选择通过导入pyrG基因和侧翼序列而产生的pyrG阳性酱油曲霉，接着将pyrG阳性酱油曲霉在包含尿嘧啶和氟乳清酸的培养基上培养，从而消除已导入的pyrG基因，由此产生pyrG阴性酱油曲霉，其可通过在包含尿嘧啶的培养基上生长和氟乳清酸抗性加以选择，适当地，侧翼序列和pyrG基因的侧翼进一步包括指导pyrG基因和侧翼序列整合入特异位置的序列，因为整合指导序列与待转化的酱油曲霉的特异序列同源，从而如果需要可剔除与该特异序列相关的基因。

13.权利要求11或12的方法，其中权利要求9或10的酱油曲霉还导入了另外一种核酸序列，所述另外的核酸序列优选编码蛋白质或多肽，所述另外的核酸序列是与活性pyrG基因在相同载体上导入的，或通过与导入的活性pyrG基因共转化而导入的。

14.一种选择转化或转染的酱油曲霉的方法，通过组合权利要求11-13任一项的方法和权利要求5的方法进行。

15.一种生产重组酱油曲霉的方法，所述方法包括将一种核酸序列导入pyrG阳性酱油曲霉中，例如通过已知的转化或转染方式，所述核酸序列包含所需序列及其侧翼的长度和同源性足以保证重组的pyrG基因片段或相应序列，从而消除pyrG基因并导入所需序列，随后通过选择具有pyrG阴性表型的酱油曲霉而选择具有所需序列的重组酱油曲霉。

16.一种通过权利要求11-15任一项的方法获得的重组酱油曲霉，其任选的还包含权利要求1-4，6，9和10任一项的酱油曲霉的特性。

17.一种重组酱油曲霉，其包含编码用于表达的蛋白质或多肽的导入的核酸序列，所述蛋白质或多肽通过黑曲霉或泡盛曲霉表达时易被降解。

18.一种重组酱油曲霉，其包含编码用于表达的蛋白质或多肽的导入的核酸序列，所述蛋白质或多肽不是酱油曲霉蛋白酶和淀粉酶，所述蛋白质或多肽优选是非酱油曲霉蛋白质或多肽。

19.一种突变的或重组的酱油曲霉，其包含失活蛋白酶基因、合适地是碱性蛋白酶基因的一种突变。

20.一种突变或重组的酱油曲霉，其包含失活主要蛋白酶基因的一种突变，合适地是失活主要碱性蛋白酶基因例如编码35kDa主要碱性蛋白酶基因的基因的突变。

21.一种生产重组酱油曲霉的方法，所述重组酱油曲霉显示蛋白酶解活性降低，所述方法包括将一种核酸序列以已知方式例如通过转化或转染导入酱油曲霉中，所述核酸序列包含一种欲导入的选择标记编码序列，及其侧翼的欲消除的蛋白酶基因片段，所述侧翼序列和选择标记编码序列包含在长度和同源性足以保证在蛋白酶基因重组的序列中，由此同时消除蛋白酶基因并导入所需的选择标记编码序列，导入后通过选择选择标记而选择重组酱油曲霉，其中在例如通过转化或转染导入核酸序列之前，酱油曲霉不含欲导入的选择标记，例如将酱油曲霉在导入核酸序列之前突变，由此酱油曲霉不能产生活性的选择标记，合适的选择标记是pyrG基因，合适地此方法与权利要求11-15任一项的方法组合使用。

22.一种根据权利要求21的方法获得的重组酱油曲霉。

23.权利要求17-20或22任一项的突变或重组的酱油曲霉，其包含一种选择标记，优选地是权利要求1-4或6任一项中定义的amdS和/或权利要求9，10或16中定义的pyrG。

24.权利要求1-4，6，9，10，16-20，22和23任一项的重组酱油曲霉，其包含编码肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质的导入的核酸序列。

25.一种表达编码蛋白质或多肽的导入的核酸序列的方法，所述蛋白质或多肽包含于权利要求1-4，6，9，10，16-20，22-24任一项定义的，或通过权利要求5，7，8，11-15和21任一项的方法获得的重组或突变的酱油曲霉中，所述表达方法包括培养重组或突变的酱油曲霉，合适地，编码蛋白质或多肽的导入的核酸序列在相应的未转化或野生型酱油曲霉中不存在和/或以较低拷贝数存在。

26.一种重组真菌，其在编码蛋白原转化酶或功能等价蛋白的基因中包含一种突变。

27.权利要求26的真菌，当与相应野生型真菌相比时，在相同条件下其产生蛋白质，多肽或代谢物的能力提高。

28.权利要求26或27的真菌，所述突变是通过用已知方式转化或转染进行特异基因修饰而获得的。

29.权利要求26-28任一项的真菌，所述蛋白原转化酶或功能等价蛋白是由一种核苷酸序列编码的，该序列的片段可以用SEQID NO：10-16中给出任何两种核苷酸混合物，通过体外DNA扩增方法而扩增。

30.权利要求27所述的真菌，所述蛋白原转化酶或功能等价蛋白是由一种核苷酸序列编码的，这种核苷酸序列功能性互补黑曲霉突变体的生长表型，该黑曲霉突变体具有一种抑制蛋白原转化酶或功能等价蛋白活性的突变。

31.权利要求26-30任一项的真菌，所述真菌是酱油曲霉。

32.权利要求26-30任一项的真菌，所述真菌还含有一个导入的amdS基因或pyrG基因。

33.一种表达由一种核苷酸序列编码的蛋白质或多肽，优选重组蛋白质或多肽的方法，所述方法包括培养权利要求26-32任一项的真菌。

34.一种生产蛋白质或多肽，优选重组蛋白质或多肽的方法，所述方法包括权利要求33的表达方法，任选的还包括加工和/或分泌和/或分离表达的蛋白质或多肽。

35.一种生产肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质，优选重组的肌醇六磷酸酶或重组的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质的方法，所述方法包括权利要求33的方法，任选的还包括加工和/或分泌和/或分离表达的肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质。