CN1079831C

CN1079831C - 编码黑曲霉羧肽酶的基因

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Publication number: CN1079831C
Application number: CN95191058A
Authority: CN
Inventors: D·S·亚夫尔; S·A·索姆普森
Original assignee: Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 2002-02-27
Anticipated expiration: 2015-09-19
Also published as: WO1996009397A1; CN1182795A; FI962099A; US5594119A; JP3236862B2; ATE274590T1; EP0734444B1; US5705376A; DE69533420T2; AU3593195A; DE69533420D1; CN1137293A; ZA957883B; KR970700769A; EP0734444A1; JPH09501061A; US5939305A; FI962099A0; US5688663A; US5693510A

Abstract

本发明涉及编码子囊菌或半知菌羧肽酶Y基因的基因，以及经过修饰而产生减少量的羧肽酶的宿主细胞。

Description

编码黑曲霉羧肽酶的基因

本发明涉及编码真菌液泡蛋白酶的基因。特别是本发明涉及丝状子囊菌类或半知菌类真菌，例如曲霉属的羧肽酶基因。

真菌液泡是含有许多水解酶，包括数种蛋白酶的酸性器官，并且基本上等同于哺乳动物的溶酶体。已经鉴定并表征了特别是酵母的一种或多种真菌的水解酶；这些包括蛋白酶A(PEPA或PrA)，蛋白酶B(PrB)或氨肽酶(APE)，二肽基氨肽酶B(DPAPB)，羧肽酶Y(CPY)和羧肽酶S(CPS)。大多数液泡水解酶是作为非活性前体而合成的糖蛋白。事实上，除APE外，上述所有提到的蛋白酶都有导致过渡通过分泌途径的信号肽。在晚期高尔基体中，液泡蛋白与分泌蛋白分开，然后最终输送到液泡中。除信号肽外，大多数液泡蛋白还含有输送到液泡后被裂解以产生成熟活性酶的原肽。已经证实在原肽中存在PrA和CPY对于以液泡为靶所需的氨基酸信息(Johnson et al.，Cell 48：875-885，1987；Rothman etal.，PNAS USA 83：3248-3252，1989；Valls et al.，Cell 48：887-897；Valls et al.J.Cell Biol.111：361-368，1987)。对于CPY，已经表明有四个氨基酸残基(QRPL)对于定位于液泡是必需的(Valls etal.J.Cell Biol.111：361-368，1990)。一旦输送到液泡后，蛋白酶A(pep4)裂解CPY和PrB的原肽以便激活蛋白酶(Ammerer et al.，Mol.Cell.Biol.6：2490-2499，1986；Woolford et al.，Mol.Cell.Biol.6：2500-2510)。

在啤酒酵母中，已鉴定了错定位或错分类液泡蛋白的三类突变体(Bankaitis et al.，PNAS USA 83：9075-9079，1986；Robinson et al.，Mol.Cell.Biol.，8：4936-4948，1988；Rothman et al.，EMBOJ.8：2057-2065，1989；Rothman and Steven，Cell 47：1041-1051，1986)。这些突变体被称为vps或液泡蛋白分类突变体。利用一种选择来分离数个这样的突变体，所述选择是基于观察到质粒上的高拷贝液泡蛋白酶的过表达会导致分泌液泡蛋白酶(Steven etal.，J.Cell Biol.，102：1551-1557，1986：Rothman et al，PNAS USA83：3248-3241，1986)。这表明在晚期高尔基体中可能有饱和分类机制。

在啤酒酵母中，还表明，缺失PEP4，CPY和PrB的菌株由于所需产物蛋白水解的减少生产较高水平的异源蛋白质。因此，由于生产所研究的液泡蛋白酶的真菌被用于重组生产异源蛋白，因而从商业角度看，所述液泡蛋白酶是很重要的。在发酵中这些蛋白酶的存在是很令人头痛的，因为它们还可以降解所需的蛋白质，从而明显降低生产率。通过破碎或缺失编码其的基因可以有利于消除任何已有蛋白质的功能；但是，这样做首先要鉴定并分离在所需宿主中的相应的基因。如上所述，从各种酵母菌株中只鉴定了很少的所述基因；然而，在丝状子囊菌或半知菌中编码液泡蛋白酶的基因很少有人知道。例如，已经分离了编码另两种黑曲霉液泡蛋白酶的PEPC(Frederich et al.，Gene 125：57-64，1993)和PEPE(Jarai et al.，Gene 145：171-178，1994)基因。PEPC编码蛋白酶B(PrB)同系物，PEPE编码蛋白酶A的同系物。也已经克隆了编码PrA同系物的Neutospora Crassa的PEP4基因(Bowman，17th funga；Genetics Conference，1993)。本文首次描述了来自丝状子囊菌或半知菌的编码液泡CPY的基因。

本发明涉及含有编码丝状子囊菌或半知菌羧肽酶Y的核酸构建体，以及重组生产由其编码的蛋白质。如本文所用的，“核酸构建体”指任何cDNA，基因组DNA，合成的DNA或RNA源的核酸分子。术语“构建体”指核酸片段，所述核酸片段可以是单链或双链的，可以从天然基因中完全或部分地被分离，或可以被修饰以含有以在自然界不存在的方式组合且并置的DNA片段。所述构建体还可以含有其他核酸片段。在优选的实施方案中，所述序列编码曲霉属的羧肽酶。本发明还提供了生产不产生羧肽酶的丝状子囊菌或半知菌细胞的方法，包括破碎或缺失羧肽酶基因以防止功能酶的表达，或通过利用物理或化学处理的经典诱变以产生其生产CPY能力降低或没有了的细胞。另外，本发明还包含不能生产功能羧肽酶或以相对于野生型菌株生产的量而言，生产减少量的羧肽酶的丝状子囊菌或半知菌。所述生物提供了改进重组蛋白质生产方法的基础，其中用编码所述蛋白质的核酸构建体转化羧肽酶缺陷型微生物，然后在表达所述蛋白质的条件下培养。

附图描述图1表示黑曲霉Bo-1基因组CPY克隆的DNA序列及其翻译。图2表示黑曲霉SFAG2 CPYcDNA的DNA序列及其翻译。标明了信号肽酶裂解的预期的位点以及成熟CPY的N-末端。图3说明了在破坏CPY中所用的构建体。

利用啤酒酵母CPY，微紫青霉羧肽酶S1(Svedsen etal.，FEBS333：39-43，1993，和麦芽羧肽酶-MIII(Sorensen et al.，Carlsberg res.Commun.54：193-202，1993)，通过设计一系列的简并寡核苷酸来开始尝试分离曲霉属羧肽酶Y。下文实施例中提供了所述寡核苷酸序列。在利用黑曲霉菌株Bo-1基因组DNA为模板的PCR反应中，用这些序列以各种组合为引物。其中的两个反应(用引物1-1和2-1；以及1-2和2-2)产生了一个1100bp的扩增产物，将其亚克隆并测序，但是没有亚克隆与鉴定为所需基因的CPY明显同源。然后进行了用引物3-1，3-2，4-1，4-2，2-1和2-2的其他PCR反应。在其中的两个反应中(用引物4-1和2-1；以及4-2和2-1)得到了一个600bp的扩增产物。将该产物亚克隆，并将11个亚克隆测序；其中的9个亚克隆是一致的，而且与其他来源的羧肽酶Y基因同源。用一个亚克隆中的插入片段探测黑曲霉基因组DNA；用Bamh I，Hind III，和SAlI消化产物观察到有一个带的杂交，表明在黑曲霉中存在单个CPY基因。于65℃，在1.5×SSPE，1.0％SDS，0.5％脱脂牛奶和200μg/ml鲑精子DNA中进行杂交。

制备在EMBL4中的黑曲霉基因组DNA库，然后用PCRCPY-衍生的基因片段(³²P-标记的)检测，以便分离全长基因。在约28,000个噬菌体中，捡出11个阳性的；将其中的9个在纯化后再用探针杂交。大多数这些克隆共有的5.5HindIII片段被鉴定为黑曲霉CPY基因。将该片段亚克隆并测序；在图1中提供了含有CPY编码区和预期的氨基酸序列的片段的序列。

随后，再筛选来自不同黑曲霉菌株的cDNA库。从该库中还鉴定至少一个全长克隆。将该克隆测序并在图2中描述了所述序列。预期均有两个557个氨基酸长的CPY前体序列。以与来自啤酒酵母的同源基因的比较为基础，来自黑曲霉的CPY似乎有一个137或138个氨基酸的前-原肽。所述基因含有一个61个碱基对的内含子。两个黑曲霉序列的比较表明，在氨基酸序列方面有些不同，这可能反映了所述基因组的和cDNA克隆是分离自不同的菌株。与啤酒酵母和C.albican的相应的CPY基因的比较表明分别有65％和66％的一致性。

本发明并不限于使用图1和2所公开的序列。首先，本发明还包括生产与图1或2中描述的氨基酸序列相同的，但是因遗传密码简并性而不同的核苷酸序列。另外，因相同种的两个菌株而得到不同的氨基酸序列说明在一个种内的序列上的变异是可以容忍的，而且利用本文描述的技术，可以很容易鉴定所述的变异体。因此在本文中提到“黑曲霉”时，应理解包括所有所述的变异体。具体地说，本发明还包括任何变异体核苷酸序列，及由其编码的蛋白质，其中所述蛋白质保留了与图1或2中所示的氨基酸序列至少约80％，优选约85％，最佳为至少约90-95％的同源性，而且在性质上保留了本文所述序列的活性。在上述定义的目录中有用的变异体包括例如，已完成的保守氨基酸取代，所述取代并未显著影响所述蛋白质的活性。所谓保守取代指相同类型的氨基酸可以由该类型的其他氨基酸取代。例如，可以交换非极性的脂肪族残基Ala，Val，Leu，和Ile，碱性残基Lys和Arg，或酸性残基Asp和Glu。相似地，Ser和Thr彼此可以进行保守取代，Asn和Gln也可以。

另外，分离的基因提供了从其他丝状子囊菌或半知菌，例如曲霉种，如米曲霉，臭曲霉，日本曲霉，棘孢曲霉，或构巢曲霉中分离同源基因的方法。其他非曲霉丝状子囊菌包括镰孢属，例如，禾谷镰孢，尖孢镰孢，茄病镰孢大刀镰孢(或相应的teleomorphs)粗糙链孢霉，Trichoderma reesei，Tviridae，T.harzianum T.longibranchiatum，微紫青霉，点青霉，产黄青霉，沙门氏柏干酪青霉，娄格法儿特氏青霉，Humicola insolen，灰色腐质霉thermoidea变种，H.lanuginosa，Scytalidium thermophilumyceliophthora thermophila，和Thielavia terrestris。在Southern杂交中可以用所述基因或以其为基础的寡核苷酸作探针，以分离这些其他种中的同源基因。具体地说，用所述探针在低或高严谨条件下(例如，在42℃，5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切并变性的鲑精DNA，分别为50，35或25％用于高，中和低严谨条件下预杂交和杂交)与所需种的基因组或cDNA进行杂交，标准的Southerm印迹方法后，以鉴定并分离其中相应的CPY基因。用本文所述的简并探针及来自丝状真菌的基因组DNA或第一条链cDNA的PCR也可以得到CPY特异性产物，然后可以用其作为探针克隆相应的基因组或cDNA。

本发明基因在产生丝状子囊菌，例如曲霉的羧肽酶-缺陷型突变体时特别有用。可以用很多方法达到该目的。在一种方法中，如下文进一步描述的，将一个选择性标记克隆到CPY基因个中部。用限制酶将破坏的片段从母本质粒中释放出。用所述线性化的DNA片段转化所选的宿主细胞。在所述的宿主细胞中，同源末端与宿主染色体配对，同源重组产生了染色体基因替代。与真菌细胞宿主可一起使用的可选择标记包括amdS，pyrG；argB，niaD，sC，和hygB。另外，用两种可选择标记可以使用两步法。在所述的一种方法中，用在CPY配对内切割一次以便在转化过程中靶整合到CPY座位的限制酶消化含有截断的CPY基因和可选择标记基因的质粒。然后在选择丢失可选择标记的培养基上使转化体生长，例如若标记为pyrG时，培养基可含有5-fluorootic acid。在野生型CPY和导入的截断的CPY基因之间重组时，常常发生可选择标记的丢失。与约50％的所得菌株应只有截断的CPY基因，而另外50％只含有野生型基因。在Rothstein，Meth.Enzymol.194，281-301，1991中描述了所述方法。

所产生的CPY缺陷型突变体在表达异源蛋白质时，是特别有用的。在本发明中，“异源蛋白质”指在所述宿主中天然不存在的蛋白质，对天然序列已经进行了修饰的天然蛋白质，或用重组DNA技术修饰宿主后，其表达在数量上发生了变化的天然蛋白质。该术语还包括其突变体的表达使用了宿主中天然没有的遗传成分或使用了经加工后，以在宿主中不常见的方式发挥作用的天然成分的天然蛋白质。

正如已经提到的，由所选择的宿主细胞而进行的蛋白酶生产可以在其被回收前通过降解产物而严格限制了所需蛋白质的产率。因此由宿主生产的CPY的消除或量的减少实质上提高了所需蛋白质的产率，而且可以提供商业上可行的用于重组蛋白质生产的商业上通常不使用的宿主细胞。在优选的实施方案中，CPY缺陷型细胞生产至少25％，优选至少50％弱，且最佳为至少70％弱的CPY，与相应的野生型相比，最多可丧失全部的CPY功能。

可以用本发明的突变体真菌细胞以与野生型菌株相同的方法用于重组蛋白质的生产。本领域专业人员很容易从本文所述的具体实施方案中认识各种途径的变化，所述实施方案根据上述菌株而对方法加以改进。用表达载体可以表达活性形式的所需基因。有用的表达载体含有可以使所述载体稳定整合到宿主细胞的基因组中或使载体在宿主细胞基因组外独立自主复制的元件，以及优选的一种或多种可以很容易地筛选转化的宿主细胞的表型标记。所述表达载体还可以包括编码启动子的序列，核糖体结合位点，翻译起始密码子和，可选择的阻遏物基因或激活物基因。为了在控制序列的指导下表达，根据本发明所用的基因优选的在适当的阅读框中与所述的控制序列可操作相连。

表达载体可以是任何可方便地利用重组DNA技术的载体，而且载体的选择通常取决于其所导入的宿主细胞。在本发明优选的实施方案中，宿主细胞是曲霉属的菌株。因此载体可以是自主复制载体，即可以作为染色体外个体而存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒或一种染色体外元件，小染色体，或人工染色体。另外，所述载体可以是当其导入宿主细胞中时，可整合到宿主细胞染色体并与其所整合上的染色体一起复制的载体。

在所述载体中，所需基因的序列应与适宜的启动子序列可操作相连。所述启动子可以是在所选的宿主细胞中有转录活性的任何DNA序列，并且可以得自编码与宿主细胞同源或异源的基因。为了在真菌宿主中转录，有用的启动子的例子是得自编码米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛葡糖淀粉酶(glaA)，Rhizomucor miehei脂酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶基因的启动子。优选的是TAKA-淀粉酶和glaA启动子。

本发明的表达载体还可以含有适宜的转录终止子，和在真核细胞中与编码异源基因序列的DNA序列可操作相连的多聚腺苷酸序列。终止和多聚腺苷酸序列适宜的可从与启动子相同的来源得到。所述载体还可以含有能够使载体在所研究的宿主细胞中复制的DNA序列。所述序列的实例是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。

所述载体还可以含有选择性标记，例如其产物补充宿主细胞中的缺陷的基因，或赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性的基因。曲霉选择标记的实例包括amdS，PYrGmargB，niaD sC，和hygB，产生hygromycin抗性的标记。在曲霉宿主细胞中优选使用构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG。此外，例如按WO91/17243中的描述通过共转化来完成选择。

通常优选的是表达后得到细胞外产物。因此所述蛋白质含有可以将表达的蛋白质分泌到培养基中的前区。如果需要，所述前区可以是本发明蛋白质的天然的，或经编码相应前区的DNA序列一般取代而用不同前区或信号序列取代的。例如，所述前区可以得自曲霉种的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，杆菌种的淀粉酶基因，Rhizomucor miehei的脂酶或蛋白酶基因，啤酒酵母α-因子的基因或牛前原凝乳酶基因。当宿主是真菌细胞时，特别优选的是米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性淀粉酶，杆菌NCIB 11837的maltogenic淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或地衣形芽孢杆菌蛋白酶的前区。一种有效的信号序列是米曲霉TAKA淀粉酶信号，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶信号和Rhizomucormiehei脂酶信号。

分别用于连接本发明的DNA构建体，启动子，终止子和其他成分然后将其插入含有复制所需的信息的适宜的载体中的方法，是本领域专业人员熟知的(参见例如，Sambrook et al.，MolecularCloning，1989)。

可以用CPY缺陷型突变体表达任何所需的原核或真核蛋白质，而且优选用于表达真核蛋白质。这些细胞特别有用的是适用于表达过氧化氢酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化还原酶，纤维素酶，木聚糖酶，过氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角质酶(cutinase)蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，植酸酶，裂解酶，果胶酶和其他果胶水解(pectinolytic)酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，异构酶，蔗糖酶，转移酶，核糖核酸酶，几丁质酶和脱氧核糖核酸酶。本领域专业人员应该理解，术语“真菌酶”不仅包括天然真菌，而且包括经氨基酸取代，缺失，加入或为提高其活性，热稳定性，pH耐受性等而修饰过的真菌酶。也可以用所述突变体表达药物学上的异源蛋白质，例如激素，生长因子，受体等。

将用下列实施例对本发明作进一步的说明。实施例I.分离黑曲霉CPY基因A.材料和方法

i.菌株

在下文描述的方法中使用了下列生物材料。E.coli K802(ek4-(nrca)，mcr B，hsdR2，galD2，GalT22，wupE44，metB1；E.coliSOLP(E14-(mcrA) (mcrCB-hsdSMR-mr^r)171，sbcC，recB，recJ，uvrC，umuD：：Tn5(kan^r)，lacgryS96，relA1，thi-1，endA1，λ^R[F’proAB lacIqZΔM15]Su-，E.coliJM101supE，thi-1，Δ(lac-proAB)，[F’traD36，proAB，lacIqZΔM15]，E.coli XL-1 Blue rec A1，endAl，gyr A96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，lac[F’proAB lacIqZΔM15，Tn10(tet^R)]，黑曲霉Bo-1，黑曲霉SFAG-2。

ii.PCR扩增

用标准技术在45℃退火来进行PCR。用黑曲霉Bo-1基因组DNA作为模板，用下列简并寡核苷酸。引物1-1(94-282)-GGIGGICCIGGITGYTC引物1-2(94-283)-GGIGGICCIGGITGYAG引物2-1(94-284)-CCIAGCCARTTRCADAT引物2-2(94-285)-CCYAACCARTTRCADAT引物3-1(94-331)-GTIGGITTYTCITAYTCIGG引物3-2(94-332)-GTIGGITTYAGYTAYAGYGG引物4-1(94-329)-GARTCITAYGCIGGICAYTA引物2-1(94-284)-GARAGYTAYGCIGGICAYTA在上述引物中I代表肌苷，Y代表C或T，R代表A或G，D代表A，G或T。iii.亚克隆PCR产物

按制造商的说明，用TA Cloning试剂盒(Invitrogen)将PCR产物亚克隆以进行测序。iv.从λZap II体内切割

通过在大肠杆菌SOLR中传代，然后按照Strategene提供的方法，可从CPY cDNAλZap克隆获得含有在pBluescript SK载体中携带了cDNA插入子的质粒。v.DNA测序用荧光标记的核苷酸，利用聚合酶循环测序确定核苷酸测序。在Applied Biosystems自动DNA测序仪(Model 363 A，1.20版)上电泳测序反应产物。使用下列CPY特异性引物，再使用M13反向(-48)和M13(-20)前向引物(Sanger et al.，J.Mol.Biol.143：163-178)：

94-376 TCGCTGCCAGTCTATGATTGA

94-377 ACATCAACCGCAACTTCCTCT

94-378 TTGCCAATGAGAACGGACTGC

94-379 CGCACTTACCACGGACATCAT

94-503 CAAGCATCCTCAAACTATCGT

94-504 GAGACGCATGAAGGTGAAGTT

94-505 GCCGTCCCTCCCTTCCAGCAG

94-506 GTGCCGACGGGTTCTCCAAGC

94-507 GCAGCGAGGAAGAGCGTTGTC

94-510 GGGTCATTCTCGGGGTCATTG

94-511 GACCCCGAGAATGACCCTGTT

94-512 GTAGGGCTTCATCCAGTCACC

94-513 TCTCACCGTTCTCACCAGTAA

94-514 TCCCTCCCCAAGAAGCACAAC

94-528 AGCGTCTGGGTTACTGGTGAG

94-529 AAGATCGGCCAGGTCAAGTCC

94-530 GAGACGGTGGTAGGGCTTCAT

94-531 AACGTCGGTTACTCTTACAGC

94-532 GTGGTCGGGGCGGCGGTTGTG

94-533 TGTTTGAAGAAGAGGGTAAGC

94-575 CGCTGCTACTTGATTTTTCTA

94-576 CTCAGCGCCAACAGCCTCAAT

94-577 ACCTGCAGTCCGTTCTTATTG

94-634 TGCGATCGATTCATTCTCATC

94-635 GGAGTAACCGACATTGACAGG

94-636 CCTGTCAATGTCGGTTACTCC

94-637 GTCCCATGGCAACTTCACCTT

94-646 CTTCTCACCGTTCTCACCAGT

94-647 CGAGACTCGAAGAACCCTAAGB.结果

用黑曲霉Bo-1基因组DNA为模板，，使用各种组合的CPY特异性简并寡核苷酸，引物1-1，1-2，2-1和2-2(图1)完成PCR反应。所有的反应均以一个循环为95℃5分钟，45℃1分钟和72℃2分钟，接着进行25个下一循环，即95℃1分钟，45℃1分钟和72℃2分钟。在琼脂糖凝胶上将反应物小样(10μl)电泳，在两个反应中，一个使用引物1-2和2-1，另一个使用引物1-2和2-2，约1100bp的扩增产物占大部分。使用假设在那儿的这些寡核苷酸组合而预期的产物的大小在900bp的基因内没有内含子，使用前向和反向引物将1100bp的扩增产物亚克隆并测序。7个亚克隆被测序，但是，没有一个与CPY密码子同源。

使用与上述相同的条件，完成使用各种引物组合3-1，3-2，4-1，4-2，2-1和2-2的PCR。在琼脂糖凝胶上电泳小样，在两个反应中，一个使用引物4-1和2-1，另一个使用引物4-2和2-1，约600bp的扩增产物占大部分。根据与其它羧肽酶的同源性而预测的该扩增产物的大少为600bp。将600bp的扩增产物亚克隆，用前向和反向引物确定11个亚克隆的DNA序列。11个克隆中的9个以与啤酒酵母有69％的一致性为基础，为黑曲霉CPY的密码子。。所有9个均彼此相同，说明在黑曲霉中只有一个羧肽酶基因。将含有600bp黑曲霉CPY PCR产物的亚克隆称为pDSY17。

用pDSY17的插入子探测黑曲霉Bo-1基因组DNA的Southerm印迹。用Gibco-BRL的缺口-翻译试剂盒放射性标记探针。所用的杂交条件为于60℃，在1.5×SSPE，1％SDS和0.5％脱脂牛奶和200μg/ml鲑精DNA。于65℃用0.2×SSC，1％SDS和0.1％焦磷酸钠将印迹洗涤两次，每次15分钟。在BamHI，HindIII和SalI的消化产物中，约10，5.5和7kb的单带分别与CPY探针杂交。

为了分离CPY的全长基因，用PCR-产生的CPY基因片段(用Gibco-BRL的缺口-翻译试剂盒标记的)，探测含有约26，000个重组体的黑曲霉Bo-1的EMBL4中的基因组库。将约28，000个噬菌斑放在滤器上并检测。从这些平皿中捡出11个阳性的。纯化后，9个一级克隆仍与CPY探针杂交。从9个克隆中分离DNA，进行限制酶消化以对其进行表征。从限制图谱看，9个中有7个是相同的。其他两个克隆是特有的。从克隆的Southern产物，确定9个中的8个含有与CPY探针杂交的约5.5kb的相同HindIII片段。不含有相同HindIII片段的克隆含有较大(＞12kb)的与CPY探针杂交的HindIII片段。亚克隆共有的HindIII片段以进行DNA测序。基因组DNA序列和推测的氨基酸序列示于图1。

再筛选黑曲霉SFAG-2的λZAPII(Stratagene)中的cDNA库。将42,000个噬菌斑放到滤器上，然后用上述的CPY探针检测，在严格的上述条件下，112个这样的噬菌斑进行了杂交。捡出开始的20个，然后进行再筛选，纯化后，18个仍与CPY探针杂交。从4个阳性克隆中，用配有λZAP试剂盒的体内切割方法分离DNA。用EcoRI消化获救的质粒，然后在琼脂糖凝胶上电泳以确定插入片段的大小。两个克隆(2-1和3-2)似乎有足够大的插入片段，可含有全长CPY的cDNA，而且各含有约1700和250bp的两个EcoRI片段。预计的全长cDNA的大小约为1600bp。另两个cDNA克隆(2-2和2-4)含有较小的插入片段，但是，它们均含有250bp的EcoRI片段。确定了克隆3-2和2-2的部分DNA序列，3-2含有全长cDNA，而克隆2-2在5’末端被截断约200bp。

确定了两个链的完整cDNA序列(图2)。认为cDNA编码557个氨基酸长的CPY前体。到目前为止，cDNA和基因组克隆之间的大多数核苷酸差异均处于摆动范围内，这点不令人惊奇，因为它们是来自两个不同的黑曲霉菌株。以啤酒酵母的CPY排列为基础，黑曲霉CPY看起来含有信号肽和前肽，成熟CPY蛋白质为419或420个氨基酸长。黑曲霉CPY与啤酒酵母和C.albicans的CPY(Mukhtar et al.，Gene 121：173-177，1992)分别有约65％和66％的一致性。II制备CPY缺陷型突变体

为了产生缺失了CPY的黑曲霉菌株，制备其中米曲霉pyrG基因插入到CPY编码区中的构建体(图3)。将含有几乎完整CPY基因和约6kb基因下游的约6.5kb HindIII片段亚克隆到pKS+(Stratagene)衍生物中，其中破坏了PstI位点。用PstI消化所得的重组体，以便从CPY编码区缺失815bp的片段，加入T4 DNA聚合酶和所有4种dNTP而补平因PstI消化而产生的悬末端。将所得的平整末端载体与通过用Hind III消化，然后用Klenow片段填平而得到的约3.8kb平整末端的片段相连。用Hind III消化其中含有pyrG插入片段的最终构建体，以得到用于转化黑曲霉pyrG菌株的线性片段，在基本培养基上生长进行筛选。用Southern印迹筛选转化体以确定那些菌株含有破坏的CPY基因。用Western印迹分析转化体以寻找在细胞内丢失的CPY。一旦鉴定了一个菌株含有破坏了的CPY，就可以确定对异源蛋白质的影响。

生物材料的保藏

已于1994年9月13日将下列生物材料保藏在AgriculturalResearch Service Culture Collection(NRRL)1815 North UniversityStreet，Peoria，Illinois 61604。细胞系保藏号含有pDSY23的 NRRL B-21326E.coli(EMCC#0120)

序列表(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)名称：Novo Nordisk Biotech，Inc.

(B)街道：1445 Drew Avenue

(C)城市：Davis

(D)州：California

(E)国家：US

(F)邮编：95616-4880

(G)电话：(916)757-8100

(H)电传：(916)758-0317

(ii)发明题目：编码黑曲霉羧肽酶的基因

(iii)序列数目：4

(iv)相关地址：

(A)收件人：Novo Nordisk of North America，Inc.

(B)街道：405 Lexington Avenue，Suite 6400

(C)城市：New York

(D)州：New York

(E)国家：U.S.A.

(F)邮编：10174-6401

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)

(vi)目前的申请资料：

(A)申请号：US

(B)申请日：19-9月-1995

(C)分类号：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US08/309,341

(B)申请日：20-9月-1994

(viii)代理人/代理资料：

(A)姓名：Lowney，Karen A.

(B)登记号：31,274

(C)文件号：4247.204-WO

(ix)通讯资料：

(A)电话：2128670123

(B)电传：2128670298(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2068个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(vi)来源：

(A)生物：黑曲霉

(ix)特征：

(A)名称/关键词：内含子

(B)位置：572…632

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：连接(571..633)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TCCTCTGCCT ACTCATCCCA TCACCATCTC AATTCATACC GCCCCCGTGG GGTTTCAGCA 60CCA ATG AGA GTC CTT CCA GCT GCT ATG CTG GTT GGA GCG GCC ACG GCG 108

Met Arg Val Leu Pro Ala Ala Met Leu Val Gly Ala Ala Thr Ala

1 5 10 15GCC GTT CCT CCC TTC CAG CAG GTC CTT GGA GGT AAC GGT GCC AAG CAC 156Ala Val Pro Pro Phe Gln Gln Val Leu Gly Gly Asn Gly Ala Lys His

20 25 30GGT GCC GAC CAT GCG GCC GAG GTC CCT GCG GAT CAC AGT GCC GAC GGG 204Gly Ala Asp His Ala Ala Glu Val Pro Ala Asp His Ser Ala Asp Gly

35 40 45TTC TCC AAG CCG CTG CAC GCA TTC CAG GAG GAG CTG AAG TCT CTC TCT 252Phe Ser Lys Pro Leu His Ala Phe Gln Glu Glu Leu Lys Ser Leu Ser

50 55 60GAC GAG GCT CGT AAG CTT TGG GAT GAG GTG GCC AGC TTC TTC CCG GAG 300Asp Glu Ala Arg Lys Leu Trp Asp Glu Val Ala Ser Phe Phe Pro Glu

65 70 75AGC ATG GAT CAG AAC CCT CTC TTT TCC CTC CCC AAG AAG CAC AAC CGC 348Ser Met Asp Gln Asn Pro Leu Phe Ser Leu Pro Lys Lys His Asn Arg80 85 90 95CGT CCC GAC TCG CAC TGG GAC CAC ATC GTC CGC GGC TCC GAC GTT CAG 396Arg Pro Asp Ser His Trp Asp His Ile Val Arg Gly Ser Asp Val Gln

100 105 110AGC GTC TGG GTC ACT GGT GAG AAC GGT GAG AAG GAG CGC GAG GTC GAT 444Ser Val Trp Val Thr Gly Glu Asn Gly Glu Lys Glu Arg Glu Val Asp

115 120 125GGC AAG CTG GAA GCC TAT GAT CTC AGG GTC AAG AAG ACC GAT CCT GGC 492Gly Lys Leu Glu Ala Tyr Asp Leu Arg Val Lys Lys Thr Asp Pro Gly

130 135 140TCT CTT GGC ATC GAC CCC GGC GTG AAG CAG TAC ACC GGT TAT CTC GAT 540Ser Leu Gly Ile Asp Pro Gly Val Lys Gln Tyr Thr Gly Tyr Leu Asp

145 150 155GAC AAC GAG AAT GAT AAG CAT TTG TTC TAC GTAAGCACAC CTTGGTTCAA 590Asp Asn Glu Asn Asp Lys His Leu Phe Tyr160 165GATCACGCTT TTTATATGCT CTGGATATCT AACGCAACTT AG TGG TTC TTC GAG 644

Trp Phe Phe Glu

170TCT CGC AAT GAC CCC GAG AAT GAT CCC GTT GTT CTG TGG CTG AAC GGT 692Ser Arg Asn Asp Pro Glu Asn Asp Pro Val Val Leu Trp Leu Asn Gly

175 180 185GGC CCT GGG TGC TCT TCC CTC ACC GGT CTC TTC ATG GAG CTT GGC CCT 740Gly Pro Gly Cys Ser Ser Leu Thr Gly Leu Phe Met Glu Leu Gly Pro190 195 200 205AGC AGC ATC AAC AAG AAG ATC CAG CCG GTC TAC AAT GAC TAC GCT TGG 788Ser Ser Ile Asn Lys Lys Ile Gln Pro Val Tyr Asn Asp Tyr Ala Trp

210 215 220AAC TCC AAC GCG TCC GTG ATC TTC CTT GAC CAG CCT GTC AAT GTC GGT 836Asn Ser Asn Ala Ser Val Ile Phe Leu Asp Gln Pro Val Asn Val Gly

225 230 235TAC TCC TAC AGT AAC TCT GCT GTC AGC GAC ACG GTC GCT GCT GGC AAG 884Tyr Ser Tyr Ser Asn Ser Ala Val Ser Asp Thr Val Ala Ala Gly Lys

240 245 250GAC GTC TAT GCC TTG CTT ACC CTC TTC TTC AAA CAA TTC CCC GAG TAT 932Asp Val Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Phe Phe Lys Gln Phe Pro Glu Tyr

255 260 265GCT AAG CAG GAC TTC CAC ATT GCC GGT GAA TCT TAT GCT GGT CAC TAT 980Ala Lys Gln Asp Phe His Ile Ala Gly Glu Ser Tyr Ala Gly His Tyr270 275 280 285ATC CCC GTC TTC GCT TCG GAG ATC CTG TCT CAC AAG AAG CGC AAC ATC 1028Ile Pro Val Phe Ala Ser Glu Ile Leu Ser His Lys Lys Arg Asn Ile

290 295 300AAC CTG CAG TCC GTT CTC ATT GGC AAC GGT CTC ACC GAC GGA TAC ACC 1076Asn Leu Gln Ser Val Leu Ile Gly Asn Gly Leu Thr Asp Gly Tyr Thr

305 310 315CAG TAC GAG TAC TAC CGT CCC ATG GCC TGC GGT GAC GGC GGT TAC CCA 1124Gln Tyr Glu Tyr Tyr Arg Pro Met Ala Cys Gly Asp Gly Gly Tyr Pro

320 325 330GCT GTC TTG GAC GAG AGC TCC TGC CAG TCC ATG GAC AAC GCT CTT CCT 1172Ala Val Leu Asp Glu Ser Ser Cys Gln Ser Met Asp Asn Ala Leu Pro

335 340 345CGC TGC CAG TCT ATG ATT GAG TCT TGC TAC AGT TCC GAG AGC GCT TGG 1220Arg Cys Gln Ser Met Ile Glu Ser Cys Tyr Ser Ser Glu Ser Ala Trp350 355 360 365GTT TGT GTC CCG GCC TCC ATC TAC TGT AAC AAC GCC CTC CTT GCC CCT 1268Val Cys Val Pro Ala Ser Ile Tyr Cys Asn Asn Ala Leu Leu Ala Pro

370 375 380TAC CAG CGC ACT GGG CAG AAC GTC TAT GAT GTC CGT GGT AAG TGC GAG 1316Tyr Gln Arg Thr Gly Gln Asn Val Tyr Asp Val Arg Gly Lys Cys Glu

385 390 395GAT AGC TCT AAC CTT TGC TAC TCG GCT ATG GGC TAC GTC AGC GAC TAC 1364Asp Ser Ser Asn Leu Cys Tyr Ser Ala Met Gly Tyr Val Ser Asp Tyr

400 405 410CTG AAC AAG CCC GAA GTC ATC GAG GCT GTT GGC GCT GAG GTC AAC GGC 1412Leu Asn Lys Pro Glu Val Ile Glu Ala Val Gly Ala Glu Val Asn Gly

415 420 425TAC GAC TCG TGC AAC TTT GAC ATC AAC CGC AAC TTC CTC TTC CAC GGT 1460Tyr Asp Ser Cys Asn Phe Asp Ile Asn Arg Asn Phe Leu Phe His Gly430 435 440 445GAC TGG ATG AAG CCC TAC CAC CGC CTC GTT CCG GGA CTC CTG GAG CAG 1508Asp Trp Met Lys Pro Tyr His Arg Leu Val Pro Gly Leu Leu Glu Gln

450 455 460ATC CCT GTC TTG ATC TAT GCC GGT GAT GCT GAT TTC ATT TGC AAC TGG 1556Ile Pro Val Leu Ile Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Phe Ile Cys Asn Trp

465 470 475CTG GGC AAC AAG GCC TGG ACT GAA GCC CTG GAG TGG CCC GGA CAG GCT 1604Leu Gly Asn Lys Ala Trp Thr Glu Ala Leu Glu Trp Pro Gly Gln Ala

480 485 490GAA TAT GCC TCC GCT GAG CTG GAG GAT CTG GTC ATT GTC GAC AAT GAG 1652Glu Tyr Ala Ser Ala Glu Leu Glu Asp Leu Val Ile Val Asp Asn Glu

495 500 505CAC ACG GGC AAG AAG ATT GGC CAG GTT AAG TCC CAT GGC AAC TTC ACC 1700His Thr Gly Lys Lys Ile Gly Gln Val Lys Ser His Gly Asn Phe Thr510 515 520 525TTC ATG CGT CTC TAT GGT GGT GGC CAC ATG GTC CCG ATG GAC CAG CCC 1748Phe Met Arg Leu Tyr Gly Gly Gly His Met Val Pro Met Asp Gln Pro

530 535 540GAG TCG AGT CTC GAG TTC TTC AAC CGC TGG TTG GGA GGT GAA TGG TTC 1796Glu Ser Ser Leu Glu Phe Phe Asn Arg Trp Leu Gly Gly Glu Trp Phe

545 550 555TAA AGACGTGCTA CCACCGCATA TAGACTTTCT GGTCATTTGT GACACTGC 1849AGATATGTTT CTTAACGATA GTTTGAGCAT GCTTGTCAAT GCCCACTAGT CCCGATCCTT 1909ATATGTTGCA TGGTATCTAT GAGTTTTGTC ACTATAGTGC ATTATACATG TGTACTTCGT 1969ATGAGAATGA ATCGATCGCA TTTACACGCA TATAAATAGT ACCCACCTCC GCCTGGACAT 2029GAATTAGGCC CGGCCAGTCG TTTACATACA GTGCTAGAA 2068(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：557个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物：黑曲霉

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Arg Val Leu Pro Ala Ala Met Leu Val Gly Ala Ala Thr Ala Ala1 5 10 15Val Pro Pro Phe Gln Gln Val Leu Gly Gly Asn Gly Ala Lys His Gly

20 25 30Ala Asp His Ala Ala Glu Val Pro Ala Asp His Ser Ala Asp Gly Phe

35 40 45Ser Lys Pro Leu His Ala Phe Gln Glu Glu Leu Lys Ser Leu Ser Asp

50 55 60Glu Ala Arg Lys Leu Trp Asp Glu Val Ala Ser Phe Phe Pro Glu Ser65 70 75 80Met Asp Gln Asn Pro Leu Phe Ser Leu Pro Lys Lys His Asn Arg Arg

85 90 95Pro Asp Ser His Trp Asp His Ile Val Arg Gly Ser Asp Val Gln Ser

100 105 110Val Trp Val Thr Gly Glu Asn Gly Glu Lys Glu Arg Glu Val Asp Gly

115 120 125Lys Leu Glu Ala Tyr Asp Leu Arg Val Lys Lys Thr Asp Pro Gly Ser

130 135 140Leu Gly Ile Asp Pro Gly Val Lys Gln Tyr Thr Gly Tyr Leu Asp Asp145 150 155 160Asn Glu Asn Asp Lys His Leu Phe Tyr Trp Phe Phe Glu Ser Arg Asn

165 170 175Asp Pro Glu Asn Asp Pro Val Val Leu Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly

180 185 190Cys Ser Ser Leu Thr Gly Leu Phe Met Glu Leu Gly Pro Ser Ser Ile

195 200 205Asn Lys Lys Ile Gln Pro Val Tyr Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Ser Asn

210 215 220Ala Ser Val Ile Phe Leu Asp Gln Pro Val Asn Val Gly Tyr Ser Tyr225 230 235 240Ser Asn Ser Ala Val Ser Asp Thr Val Ala Ala Gly Lys Asp Val Tyr

245 250 255Ala Leu Leu Thr Leu Phe Phe Lys Gln Phe Pro Glu Tyr Ala Lys Gln

260 265 270Asp Phe His Ile Ala Gly Glu Ser Tyr Ala Gly His Tyr Ile Pro Val

275 280 285Phe Ala Ser Glu Ile Leu Ser His Lys Lys Arg Asn Ile Asn Leu Gln

290 295 300Ser Val Leu Ile Gly Asn Gly Leu Thr Asp Gly Tyr Thr Gln Tyr Glu305 310 315 320Tyr Tyr Arg Pro Met Ala Cys Gly Asp Gly Gly Tyr Pro Ala Val Leu

325 330 335Asp Glu Ser Ser Cys Gln Ser Met Asp Asn Ala Leu Pro Arg Cys Gln

340 345 350Ser Met Ile Glu Ser Cys Tyr Ser Ser Glu Ser Ala Trp Val Cys Val

355 360 365Pro Ala Ser Ile Tyr Cys Asn Asn Ala Leu Leu Ala Pro Tyr Gln Arg

370 375 380Thr Gly Gln Asn Val Tyr Asp Val Arg Gly Lys Cys Glu Asp Ser Ser385 390 395 400Asn Leu Cys Tyr Ser Ala Met Gly Tyr Val Ser Asp Tyr Leu Asn Lys

405 410 415Pro Glu Val Ile Glu Ala Val Gly Ala Glu Val Asn Gly Tyr Asp Ser

420 425 430Cys Asn Phe Asp Ile Asn Arg Asn Phe Leu Phe His Gly Asp Trp Met

435 440 445Lys Pro Tyr His Arg Leu Val Pro Gly Leu Leu Glu Gln Ile Pro Val

450 455 460Leu Ile Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Phe Ile Cys Asn Trp Leu Gly Asn465 470 475 480Lys Ala Trp Thr Glu Ala Leu Glu Trp Pro Gly Gln Ala Glu Tyr Ala

485 490 495Ser Ala Glu Leu Glu Asp Leu Val Ile Val Asp Asn Glu His Thr Gly

500 505 510Lys Lys Ile Gly Gln Val Lys Ser His Gly Asn Phe Thr Phe Met Arg

515 520 525Leu Tyr Gly Gly Gly His Met Val Pro Met Asp Gln Pro Glu Ser Ser

530 535 540Leu Glu Phe Phe Asn Arg Trp Leu Gly Gly Glu Trp Phe545 550 555(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2002个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)来源：

(A)生物：黑曲霉

(ix)特征：

(A)名称/关键词：内含子

(B)位置：349…411

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：连接(348..412)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GCGGCCGCTG CTACTTGCTT TTTCTAATTT GATACTTTTG TGTCCGTACC GTACCTTCCA 60GACCGCAAGG TACCCATCCT CTACCTACTC ATCCCATCAT CATCTCGATT TCATACCAAC 120CCCGTTGGGT TTCAACACA ATG AGA GTT CTT CCA GCT GCT ATG CTG GTT GGA 172

Met Arg Val Leu Pro Ala Ala Met Leu Val Gly

1 5 10GCG GGC ACT GCG GCC GTC CCT CCC TTC CAG CAG GTC CTT GGA GGT AAC 220Ala Gly Thr Ala Ala Val Pro Pro Phe Gln Gln Val Leu Gly Gly Asn

15 20 25GGT GCC AAG CAC GGT GCC GAC CAT GCG GCC GAG GTC CCT GCG GAT CAC 268Gly Ala Lys His Gly Ala Asp His Ala Ala Glu Val Pro Ala Asp His

30 35 40AGT GCC GAC GGG TTC TCC AAG CCG CTG CAC GCA TTC CAG GAG GAG CTG 316Ser Ala Asp Gly Phe Ser Lys Pro Leu His Ala Phe Gln Glu Glu Leu

45 50 55AAG TCT CTC TCT GAT GAG GCT CGT AAG CTC TGG GAT GAG GTT GCT AGC 364Lys Ser Leu Ser Asp Glu Ala Arg Lys Leu Trp Asp Glu Val Ala Ser60 65 70 75TTC TTC CCG GAG AGC ATG GAT CAG AAC CCT CTC TTC TCC CTC CCC AAG 412Phe Phe Pro Glu Ser Met Asp Gln Asn Pro Leu Phe Ser Leu Pro Lys

80 85 90AAG CAC AAC CGC CGC CCC GAC CAC CAC TGG GAC CAC ATC GTC CGC GGC 460Lys His Asn Arg Arg Pro Asp His His Trp Asp His Ile Val Arg Gly

95 100 105TCC GAC GTT CAG AGC GTC TGG GTT ACT GGT GAG AAC GGT GAG AAG GAG 508Ser Asp Val Gln Ser Val Trp Val Thr Gly Glu Asn Gly Glu Lys Glu

110 115 120CGT GAG GTC GAT GGC AAG CTG GAA GCC TAT GAT CTC AGG GTC AAG AAG 556Arg Glu Val Asp Gly Lys Leu Glu Ala Tyr Asp Leu Arg Val Lys Lys

125 130 135ACC GAT CCT AGC TCT CTT GGC ATC GAC CCT GGC GTA AAG CAG TAC ACC 604Thr Asp Pro Ser Ser Leu Gly Ile Asp Pro Gly Val Lys Gln Tyr Thr140 145 150 155GGT TAT CTC GAT GAC AAC GAG AAC GAC AAG CAT CTG TTC TAC TGG TTC 652Gly Tyr Leu Asp Asp Asn Glu Asn Asp Lys His Leu Phe Tyr Trp Phe

160 165 170TTC GAG TCT CGC AAT GAC CCC GAG AAT GAC CCT GTT GTT CTG TGG CTG 700Phe Glu Ser Arg Asn Asp Pro Glu Asn Asp Pro Val Val Leu Trp Leu

175 180 185AAC GGT GGC CCT GGA TGC TCT TCC CTC ACC GGT CTT TTC ATG GAG CTC 748Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Leu Thr Gly Leu Phe Met Glu Leu

190 195 200GGC CCT AGC AGC ATC AAC AAG AAG ATC CAG CCG GTC TAC AAC GAC TAC 796Gly Pro Ser Ser Ile Asn Lys Lys Ile Gln Pro Val Tyr Asn Asp Tyr

205 210 215GCT TGG AAC TCC AAC GCG TCC GTG ATC TTC CTT GAC CAG CCT GTC AAC 844Ala Trp Asn Ser Asn Ala Ser Val Ile Phe Leu Asp Gln Pro Val Asn220 225 230 235GTC GGT TAC TCT TAC AGC AAC TCT GCT GTC AGC GAC ACC GTT GCT GCT 892Val Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Ser Ala Val Ser Asp Thr Val Ala Ala

240 245 250GGC AAG GAC GTC TAT GCC TTG CTT ACC CTC TTC TTC AAA CAA TTC CCC 940Gly Lys Asp Val Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Phe Phe Lys Gln Phe Pro

255 260 265GAG TAT GCC AAG CAG GAC TTC CAC ATT GCC GGT GAA TCC TAT GCT GGT 988Glu Tyr Ala Lys Gln Asp Phe His Ile Ala Gly Glu Ser Tyr Ala Gly

270 275 280CAC TAT ATC CCC GTC TTT GCT TCG GAG ATT TTG TCT CAC AAG AAG CGC 1036His Tyr Ile Pro Val Phe Ala Ser Glu Ile Leu Ser His Lys Lys Arg

285 290 295AAC ATC AAC CTG CAG TCC GTT CTT ATT GGC AAC GGT CTC ACC GAC GGT 1084Asn Ile Asn Leu Gln Ser Val Leu Ile Gly Asn Gly Leu Thr Asp Gly300 305 310 315CTC ACT CAG TAC GAG TAC TAC CGT CCC ATG GCC TGT GGT GAC GGT GGT 1132Leu Thr Gln Tyr Glu Tyr Tyr Arg Pro Met Ala Cys Gly Asp Gly Gly

320 325 330TAC CCA GCT GTC TTG GAC GAG GGC TCC TGC GAG GCC ATG GAC AAC GCC 1180Tyr Pro Ala Val Leu Asp Glu Gly Ser Cys Gln Ala Met Asp Asn Ala

335 340 345CTT CCT CGC TGC CAG TCT ATG ATT GAG TCT TGC TAT AGT TCC GAG AGC 1228Leu Pro Arg Cys Gln Ser Met Ile Glu Ser Cys Tyr Ser Ser Glu Ser

350 355 360GCT TGG GTT TGT GTC CCG GCC TCC ATC TAC TGT AAC AAC GCC CTC CTT 1276Ala Trp Val Cys Val Pro Ala Ser Ile Tyr Cys Asn Asn Ala Leu Leu

365 370 375GCC CCT TAC CAG CGC ACC GGA CAG AAC GTC TAC GAT GTT CGT GGT AAG 1324Ala Pro Tyr Gln Arg Thr Gly Gln Asn Val Tyr Asp Val Arg Gly Lys380 385 390 395TGC GAG GAT AGC TCC AAC CTC TGC TAC TCG GCC ATG GGC TAC GTC AGC 1372Cys Glu Asp Ser Ser Asn Leu Cys Tyr Ser Ala Met Gly Tyr Val Ser

400 405 410GAC TAC CTG AAC AAG ACC GAG GTC ATT GAG GCT GTT GGC GCT GAG GTC 1420Asp Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Val Ile Glu Ala Val Gly Ala Glu Val

415 420 425AAC GGC TAC GAC TCG TGC AAC TTT GAC ATC AAC CGC AAC TTC CTC TTC 1468Asn Gly Tyr Asp Ser Cys Asn Phe Asp Ile Asn Arg Asn Phe Leu Phe

430 435 440CAC GGT GAC TGG ATG AAG CCC TAC CAC CGT CTC GTT CCG GGA CTC CTG 1516His Gly Asp Trp Met Lys Pro Tyr His Arg Leu Val Pro Gly Leu Leu

445 450 455GAG CAG ATC CCT GTC CTG ATC TAC GCT GGT GAC GCC GAT TTC ATC TGC 1564Glu Gln Ile Pro Val Leu Ile Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Phe Ile Cys460 465 470 475AAC TGG CTG GGC AAC AAG GCC TGG ACT GAA GCC CTT GAG TGG CCC GGA 1612Asn Trp Leu Gly Asn Lys Ala Trp Thr Glu Ala Leu Glu Trp Pro Gly

480 485 490CAG GCT GAA TAT GCC TCC GCT AAG CTG GAG GAC CTG GTC GTG GTC GAG 1660Gln Ala Glu Tyr Ala Ser Ala Lys Leu Glu Asp Leu Val Val Val Glu

495 500 505AAT GAG CAC AAG GGC AAG AAG ATC GGC CAG GTC AAG TCC CAT GGC AAC 1706Asn Glu His Lys Gly Lys Lys Ile Gly Gln Val Lys Ser His Gly Asn

510 515 520TTC ACC TTC ATG CGT CTC TAT GGC GGT GGC CAC ATG GTC CCG ATG GAC 1756Phe Thr Phe Met Arg Leu Tyr Gly Gly Gly His Met Val Pro Met Asp

525 530 535CAA CCC GAG TCG AGT CTT GAA TTC TTC AAC CGC TGG TTG GGA GGT GAA 1804Gln Pro Glu Ser Ser Leu Glu Phe Phe Asn Arg Trp Leu Gly Gly Glu540 545 550 555TGG TTT TAA AGACGTGCTA TCACCGCATA TAGACTTTCC GGTCATTTCG GTGACACTGC 1863Trp PheAGATATGTTT CTTAACGATA GTTTGAGGAT GCTTGTCAAT GCCCACTAAT CCCGAGCCTT 1923ATGTTACATG GTATCTATGA GTTTGTCATT ATAGTGCATT ATGCATTTGT ACTCCGTACG 1983AGAATGAATC AGCGGCCGC 2002(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：557个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物：黑曲霉

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Arg Val Leu Pro Ala Ala Met Leu Val Gly Ala Gly Thr Ala Ala1 5 10 15Val Pro Pro Phe Gln Gln Val Leu Gly Gly Asn Gly Ala Lys His Gly

20 25 30Ala Asp His Ala Ala Glu Val Pro Ala Asp His Ser Ala Asp Gly Phe

35 40 45Ser Lys Pro Leu His Ala Phe Gln Glu Glu Leu Lys Ser Leu Ser Asp

85 90 95Pro Asp His His Trp Asp His Ile Val Arg Gly Ser Asp Val Gln Ser

100 105 110Val Trp Val Thr Gly Glu Asn Gly Glu Lys Glu Arg Glu Val Asp Gly

115 120 125Lys Leu Glu Ala Tyr Asp Leu Arg Val Lys Lys Thr Asp Pro Ser Ser

165 170 175Asp Pro Glu Asn Asp Pro Val Val Leu Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly

180 185 190Cys Ser Ser Leu Thr Gly Leu Phe Met Glu Leu Gly Pro Ser Ser Ile

195 200 205Asn Lys Lys Ile Gln Pro Val Tyr Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Ser Asn

245 250 255Ala Leu Leu Thr Leu Phe Phe Lys Gln Phe Pro Glu Tyr Ala Lys Gln

260 265 270Asp Phe His Ile Ala Gly Glu Ser Tyr Ala Gly His Tyr Ile Pro Val

275 280 285Phe Ala Ser Glu Ile Leu Ser His Lys Lys Arg Asn Ile Asn Leu Gln

290 295 300Ser Val Leu Ile Gly Asn Gly Leu Thr Asp Gly Leu Thr Gln Tyr Glu305 310 315 320Tyr Tyr Arg Pro Met Ala Cys Gly Asp Gly Gly Tyr Pro Ala Val Leu

325 330 335Asp Glu Gly Ser Cys Gln Ala Met Asp Asn Ala Leu Pro Arg Cys Gln

340 345 350Ser Met Ile Glu Ser Cys Tyr Ser Ser Glu Ser Ala Trp Val Cys Val

355 360 365Pro Ala Ser Ile Tyr Cys Asn Asn Ala Leu Leu Ala Pro Tyr Gln Arg

405 410 415Thr Glu Val Ile Glu Ala Val Gly Ala Glu Val Asn Gly Tyr Asp Ser

420 425 430Cys Asn Phe Asp Ile Asn Arg Asn Phe Leu Phe His Gly Asp Trp Met

435 440 445Lys Pro Tyr His Arg Leu Val Pro Gly Leu Leu Glu Gln Ile Pro Val

485 490 495Ser Ala Lys Leu Glu Asp Leu Val Val Val Glu Asn Glu His Lys Gly

500 505 510Lys Lys Ile Gly Gln Val Lys Ser His Gly Asn Phe Thr Phe Met Arg

515 520 525Leu Tyr Gly Gly Gly His Met Val Pro Met Asp Gln Pro Glu Ser Ser

530 535 540Leu Glu Phe Phe Asn Arg Trp Leu Gly Gly Glu Trp Phe545 550 555

Claims

1.一种核酸构建物，它含有

(a)编码黑曲霉羧肽酶丫的核酸序列；

(b)编码具有氨基酸序列SEQ ID No：2的羧肽酶的核酸序列，或在非常严格的条件下与SEQ ID No：1杂交的核酸序列；或

(c)编码具有氨基酸序列SEQ ID No：4的羧肽酶的核酸序列，或在非常严格的条件下与SEQ ID No：3杂交的核酸序列。

2.根据权利要求l的核酸构建物，它含有编码黑曲霉羧肽酶Y的核酸序列。

3.根据权利要求1的核酸构建物，其中核酸序列编码具有SEQ ID No：2所示氨基酸序列的羧肽酶。

4.根据权利要求3的核酸构建物，其中核酸序列为SEQ IDNo：1。

5.根据权利要求l的核酸构建物，其中核酸序列编码具有SEQ ID No：4所示氨基酸序列的羧肽酶。

6.根据权利要求5的核酸构建物，其中核酸序列为SEQ IDNo：3。

7.根据权利要求1的核酸构建物，它含有在非常严格的条件下与SEQ ID No：1杂交的核酸序列。

8.根据权利要求l的核酸构建物，其中核酸序列得自曲霉属、镰孢属，青霉菌属，腐质霉属，

属，Scytalidium，毁丝霉属或草根霉属。

9.根据权利要求1的核酸构建物，它含有在非常严格的条件下与SEQ ID No：3杂交的核酸序列。

10.根据权利要求9的核酸构建物，其中核酸序列得自曲霉属、镰孢属，其霉菌属，腐质聚属，

属，Scytalidium，毁丝霉属或草根霉属。

11．根据权利要求1的核酸构建物，其中一选择标记被插入到羧肽酶序列中。

12.根据权利要11的核酸构建物，其中选择标记为amds，pyrG，argB，niaD，sc或hygB。

13.一种丝状子囊茵或半知菌细胞，它含有权利要求1的核酸构建物．

14.根据权利要求13的丝状子囊茵或半知茵细胞，它为曲霉属、镰孢属，其霉菌属，腐质聚属，

属，Scytalidium，毁丝霉属或草根霉属细胞。