JP3236862B2 - アスペルギルス・ニガーのカルボキシペプチダーゼをコードする遺伝子 - Google Patents
アスペルギルス・ニガーのカルボキシペプチダーゼをコードする遺伝子Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明の菌類の空胞プロテアーゼする遺伝子に関す
る。特に、本発明は糸状子嚢菌類又は不完全菌類のカル
ボキシペプチダーゼ遺伝子、例えばアスペルギルス（As
pergillus）属のそれに関する。
る。特に、本発明は糸状子嚢菌類又は不完全菌類のカル
ボキシペプチダーゼ遺伝子、例えばアスペルギルス（As
pergillus）属のそれに関する。
発明の背景 菌類の空胞は数多くのヒドロラーゼ類、例えばいく種
かのプロテアーゼを含んでいる酸性オルガネラであり、
そして哺乳動物のリソゾームと本質的に同等である。一
又は複数菌類、特に酵母においていく種かのヒドロラー
ゼが同定及び特性決定されている。それには、プロテア
ーゼＡ（PEP4又はPrA）、プロテアーゼＢ（PrB）、アミ
ノペプチダーゼ（APE）、ジペプチジルアミノペプチダ
ーゼＢ（DPAP B）、カルボキシペプチダーゼＹ（CPY）
及びカルボキシペプチダーゼＳ（CPS）が含まれる。空
胞ヒドロラーゼのほとんどは不活性な前駆体として合成
される糖タンパク質である。実際、APEを除く上記のプ
ロテアーゼの全てが、分泌経路を通過させるようにする
シグナルペプチドをもっている。後期ゴルジの中で、空
胞タンパク質の分泌タンパク質から種分けられ、そして
最終的に空胞へと運ばれる。シグナルペプチドに加え
て、空胞タンパク質のほとんどはプロペプチドももって
おり、それは空胞への輸送により切断され、成熟活性酵
素となる。空胞へのターゲッティングに必要とされてPr
A及びCPYにおけるアミノ酸情報はプロペプチド内にある
ことが実証されている（Johnsonら、Cell 48:875−885,
1987;Rothmanら、PNAS USA 83:3248−3252,1989;Valls
ら、Cell 48:887−897,1989;Vallsら、J.Cell Biol.11
1:361−368。1987）。CPYに関し、４個のアミノ酸残基
の鎖（QRPL）が空胞への局在化にとって必要であること
が示されている（Vallsら、J.Cell Biol.111:361−368,
1990）。空胞へと運ばれると、プロテアーゼＡ（pep4）
はCPY及びPrBのプロペプチドを切断し、プロテアーゼの
活性化をもたらす（AmmererらMol.Cell.Biol.６:2490−
2499,1986;Woolfordら、Mol.Cell.Biol.６:2500−2510,
1986）。
かのプロテアーゼを含んでいる酸性オルガネラであり、
そして哺乳動物のリソゾームと本質的に同等である。一
又は複数菌類、特に酵母においていく種かのヒドロラー
ゼが同定及び特性決定されている。それには、プロテア
ーゼＡ（PEP4又はPrA）、プロテアーゼＢ（PrB）、アミ
ノペプチダーゼ（APE）、ジペプチジルアミノペプチダ
ーゼＢ（DPAP B）、カルボキシペプチダーゼＹ（CPY）
及びカルボキシペプチダーゼＳ（CPS）が含まれる。空
胞ヒドロラーゼのほとんどは不活性な前駆体として合成
される糖タンパク質である。実際、APEを除く上記のプ
ロテアーゼの全てが、分泌経路を通過させるようにする
シグナルペプチドをもっている。後期ゴルジの中で、空
胞タンパク質の分泌タンパク質から種分けられ、そして
最終的に空胞へと運ばれる。シグナルペプチドに加え
て、空胞タンパク質のほとんどはプロペプチドももって
おり、それは空胞への輸送により切断され、成熟活性酵
素となる。空胞へのターゲッティングに必要とされてPr
A及びCPYにおけるアミノ酸情報はプロペプチド内にある
ことが実証されている（Johnsonら、Cell 48:875−885,
1987;Rothmanら、PNAS USA 83:3248−3252,1989;Valls
ら、Cell 48:887−897,1989;Vallsら、J.Cell Biol.11
1:361−368。1987）。CPYに関し、４個のアミノ酸残基
の鎖（QRPL）が空胞への局在化にとって必要であること
が示されている（Vallsら、J.Cell Biol.111:361−368,
1990）。空胞へと運ばれると、プロテアーゼＡ（pep4）
はCPY及びPrBのプロペプチドを切断し、プロテアーゼの
活性化をもたらす（AmmererらMol.Cell.Biol.６:2490−
2499,1986;Woolfordら、Mol.Cell.Biol.６:2500−2510,
1986）。
S.セレビジエ（S.cerevisiae）において、空胞タンパ
ク質を誤って局在化又は誤って種分けする３つの突然変
異クラスが同定されている（Bankaitisら、PNAS USA 8
3:9075−9079,1986;Robinsonら、Mol.Cell.Biol.,8:493
6−4948,1988;Rothmanら、EMBO J.８:2057−2065,1989;
Rothman and Stevens,Cell 47:1041−1051,1986）。こ
れらの突然変異体はvps又は空胞タンパク質種分け突然
変異体と呼ばれている。これらの突然変異のうちのいく
種かは、プラスミドに基づく高コピー数による空胞タン
パク質の過剰発現は空胞プロテアーゼの分泌をもたらし
てしまうという所見を基礎とする選別を利用して、単離
されている（Stevensら、J.Cell Biol.102:1551−1557,
1986;Rothmanら、PNAS USA 83:3248−3242,1986）。こ
のことは、種分け機構を後期ゴルジの中に集中させるこ
とが可能であることを示唆する。
ク質を誤って局在化又は誤って種分けする３つの突然変
異クラスが同定されている（Bankaitisら、PNAS USA 8
3:9075−9079,1986;Robinsonら、Mol.Cell.Biol.,8:493
6−4948,1988;Rothmanら、EMBO J.８:2057−2065,1989;
Rothman and Stevens,Cell 47:1041−1051,1986）。こ
れらの突然変異体はvps又は空胞タンパク質種分け突然
変異体と呼ばれている。これらの突然変異のうちのいく
種かは、プラスミドに基づく高コピー数による空胞タン
パク質の過剰発現は空胞プロテアーゼの分泌をもたらし
てしまうという所見を基礎とする選別を利用して、単離
されている（Stevensら、J.Cell Biol.102:1551−1557,
1986;Rothmanら、PNAS USA 83:3248−3242,1986）。こ
のことは、種分け機構を後期ゴルジの中に集中させるこ
とが可能であることを示唆する。
S.セレビジエにおいて、PEP4、CPY及びPrBを欠く株
は、所望の生成物のタンパク質分解能を低下に基づき外
来タンパク質を高レベルで産生することも示されてい
る。従って、この空胞プロテアーゼは商業的観点から重
要であり、その理由は、それを産生する菌類の多くが、
外来タンパク質の組換的製造に利用されているからであ
る発酵の際のこれらのプロテアーゼの存在は、それらが
対象のタンパク質を分解しうることがあり、それ故収率
を著しく下げてしまう点で望ましくない。任意の一定の
プロテアーゼの機能の排除は、それをコードする遺伝子
の中断又は欠失により助長される。しかしながら、それ
を成し遂げるにはまず対象の宿主の中の対応の遺伝子の
同定及び単離を必要とする。前記の通り、種々の酵母株
から若干のかかる遺伝子が単離されている。しかしなが
ら、糸状子嚢菌類又は不完全菌類の空胞プロテアーゼを
コードする遺伝子はあまりよく知られていない。例え
ば、アスペルギニス・ニガー（A.niger）由来の２種類
のその他の空胞プロテアーゼをコードするPEPC（Freder
ickら、Gene 125:57−64,1993）及びPEPE（Jaraiら、Ge
ne 145:171−178,1994）遺伝子が単離されている。PEPC
はプロテイナーゼＢ（PrB）相同体をコードし、そしてP
EPEはプロテイナーゼＡ相同体をコードする。PrA相同体
をコードするニューロスポラ・クラッサ（Neurospora c
rassa）由来の遺伝子PEP4もクローニングされている（B
owman,第17回菌類遺伝子学会、1993）。糸状子嚢菌類又
は不完全菌類からの空胞CPYをコードする遺伝子につい
て述べているのは本明細書が始めてである。
は、所望の生成物のタンパク質分解能を低下に基づき外
来タンパク質を高レベルで産生することも示されてい
る。従って、この空胞プロテアーゼは商業的観点から重
要であり、その理由は、それを産生する菌類の多くが、
外来タンパク質の組換的製造に利用されているからであ
る発酵の際のこれらのプロテアーゼの存在は、それらが
対象のタンパク質を分解しうることがあり、それ故収率
を著しく下げてしまう点で望ましくない。任意の一定の
プロテアーゼの機能の排除は、それをコードする遺伝子
の中断又は欠失により助長される。しかしながら、それ
を成し遂げるにはまず対象の宿主の中の対応の遺伝子の
同定及び単離を必要とする。前記の通り、種々の酵母株
から若干のかかる遺伝子が単離されている。しかしなが
ら、糸状子嚢菌類又は不完全菌類の空胞プロテアーゼを
コードする遺伝子はあまりよく知られていない。例え
ば、アスペルギニス・ニガー（A.niger）由来の２種類
のその他の空胞プロテアーゼをコードするPEPC（Freder
ickら、Gene 125:57−64,1993）及びPEPE（Jaraiら、Ge
ne 145:171−178,1994）遺伝子が単離されている。PEPC
はプロテイナーゼＢ（PrB）相同体をコードし、そしてP
EPEはプロテイナーゼＡ相同体をコードする。PrA相同体
をコードするニューロスポラ・クラッサ（Neurospora c
rassa）由来の遺伝子PEP4もクローニングされている（B
owman,第17回菌類遺伝子学会、1993）。糸状子嚢菌類又
は不完全菌類からの空胞CPYをコードする遺伝子につい
て述べているのは本明細書が始めてである。
発明の概要 本発明は糸状子嚢菌類又は不完全菌類をコードする配
列を含んで成る核酸構築体、及びそれによりコードされ
る組換的に製造されたタンパク質に関する。本明細書で
用いている「核酸構築体」とは、cDNA、ゲノムDNA、合
成DNA又はRNA起源の任意の核酸分子を示すことを意図し
ている。「構築体」なる語は核酸を示すことを意図し、
それは一本鎖でも二本鎖でもよく、そして天然遺伝子か
ら完全もしくは部分形態で単離されたものでよく、又は
天然にはない状況で組合されて並んだDNAセグメントを
含むように改変されたものであってもよい。この構築体
は任意的にその他の核酸セグメントを含んでよい。好適
な態様において、この配列はアスペルギルス属のカルボ
キシペプチダーゼをコードする。本発明はまた、カルボ
キシペプチダーゼ非生産性糸状子嚢菌類又は不完全菌類
細胞を作成するそのための方法も提供し、この方法は、
カルボキシペプチダーゼ遺伝子を機能性酵素の発現が阻
止されるように中断もしくは欠失させるか、又はこの遺
伝子を物理的もしくは化学的処理を利用する伝統的な突
然変異誘発により処理してCPYを産生する能力の低下さ
せたもしくはそれを失わせた細胞を作成することを含ん
で成る。更に、本発明は機能性のカルボキシペプチダー
ゼ酵素を産生できない、又は野生型の株により産生され
る量と比べて少ない量でカルボキシペプチダーゼを産生
する糸状子嚢菌類又は不完全菌類も包括する。かかる生
物は改善された組換タンパク質製造方法のための基礎を
提供し、それにおいてはカルボキシペプチダーゼ欠陥微
生物を対象のタンパク質をコードする核酸構築体で形質
転換させ、次いでそのタンパク質の発現を誘導する条件
下で培養する。
列を含んで成る核酸構築体、及びそれによりコードされ
る組換的に製造されたタンパク質に関する。本明細書で
用いている「核酸構築体」とは、cDNA、ゲノムDNA、合
成DNA又はRNA起源の任意の核酸分子を示すことを意図し
ている。「構築体」なる語は核酸を示すことを意図し、
それは一本鎖でも二本鎖でもよく、そして天然遺伝子か
ら完全もしくは部分形態で単離されたものでよく、又は
天然にはない状況で組合されて並んだDNAセグメントを
含むように改変されたものであってもよい。この構築体
は任意的にその他の核酸セグメントを含んでよい。好適
な態様において、この配列はアスペルギルス属のカルボ
キシペプチダーゼをコードする。本発明はまた、カルボ
キシペプチダーゼ非生産性糸状子嚢菌類又は不完全菌類
細胞を作成するそのための方法も提供し、この方法は、
カルボキシペプチダーゼ遺伝子を機能性酵素の発現が阻
止されるように中断もしくは欠失させるか、又はこの遺
伝子を物理的もしくは化学的処理を利用する伝統的な突
然変異誘発により処理してCPYを産生する能力の低下さ
せたもしくはそれを失わせた細胞を作成することを含ん
で成る。更に、本発明は機能性のカルボキシペプチダー
ゼ酵素を産生できない、又は野生型の株により産生され
る量と比べて少ない量でカルボキシペプチダーゼを産生
する糸状子嚢菌類又は不完全菌類も包括する。かかる生
物は改善された組換タンパク質製造方法のための基礎を
提供し、それにおいてはカルボキシペプチダーゼ欠陥微
生物を対象のタンパク質をコードする核酸構築体で形質
転換させ、次いでそのタンパク質の発現を誘導する条件
下で培養する。
図面の簡単な説明 図１はA.ニガーBo−１ゲノムCPYクローンのDNA配列及
び翻訳を示している。
び翻訳を示している。
図２はA.ニガーSFAG2CPY cDNAのDNA配列及び翻訳を示
している。シグナルペプチダーゼ切断にとっての推定部
位及び成熟CPYのＮ−末端を示す。
している。シグナルペプチダーゼ切断にとっての推定部
位及び成熟CPYのＮ−末端を示す。
図３はCPYの中断に用いられる構築体を示す。
発明の詳細な説明 アスペルギルス・カルボキシペプチダーゼＹを単離す
るための試みは、S.セレビジエCPY、ペニシリウム・ジ
ャンチネルム（Penicillium janthinellum）・カルボキ
シペプチダーゼSI（Svedsenら、FEBS 333:39−43,199
3）及び麦芽カルボキシペプチダーゼ−M III（Ｓrens
enら、Carlsberg Res.Commun.54:193−202,1993）の配
列を利用しての、一連の縮重オリゴヌクレオチドのデザ
インにより開始する。オリゴヌクレオチドの配列は以降
の実施例において紹介する。これらの配列は、鋳型とし
てアスペルギルス・ニガー株Bo−１ゲノムDNAを利用す
るPCR反応において、様々に組合せたプライマーとして
用いる。２通りの反応（プライマー１−１及び２−1;並
びに１−２及び２−２による）は1100bpの増幅生成物を
生み出し、それはサブミクローニング及び配列決定した
ところ、しかしどのサブクローンも対象の遺伝子として
同定されるほどにCPYに対して有意義な相同性を有しな
かった。
るための試みは、S.セレビジエCPY、ペニシリウム・ジ
ャンチネルム（Penicillium janthinellum）・カルボキ
シペプチダーゼSI（Svedsenら、FEBS 333:39−43,199
3）及び麦芽カルボキシペプチダーゼ−M III（Ｓrens
enら、Carlsberg Res.Commun.54:193−202,1993）の配
列を利用しての、一連の縮重オリゴヌクレオチドのデザ
インにより開始する。オリゴヌクレオチドの配列は以降
の実施例において紹介する。これらの配列は、鋳型とし
てアスペルギルス・ニガー株Bo−１ゲノムDNAを利用す
るPCR反応において、様々に組合せたプライマーとして
用いる。２通りの反応（プライマー１−１及び２−1;並
びに１−２及び２−２による）は1100bpの増幅生成物を
生み出し、それはサブミクローニング及び配列決定した
ところ、しかしどのサブクローンも対象の遺伝子として
同定されるほどにCPYに対して有意義な相同性を有しな
かった。
従ってプライマー３−1,3−2,4−1,4−2,2−１及び２
−２による更なるPCR反応を行った。２通りの反応にお
いて（プライマー４−１及び２−2;並びに４−２及び２
−１）、600bpの増幅生成物が得られた。この生成物を
サブクローニングし、そしてサブクローンのうちの11を
配列決定した。これらのサブクローンのうちの９つは同
一であり、そしてその他の起源に由来するカルボキシペ
プチダーゼＹ遺伝子との相同性を有していた。そのサブ
クローンのうちの１つ由来のインサートをA.ニガーゲノ
ムDNAをプロービングするために用いた。単独バンドと
のハイブリダイゼーションがBamH Iにより観察された。
Hind III及びSal I消化は、単属のCPY遺伝子がA.ニガー
の中に存在していることを示唆する。ハイブリダイゼー
ションは1.5XのSSPE、1.0％のSDS、0.5％の無脂ミルク
及び200μg/mlのサケ精子DNAの中で65℃で行った。
−２による更なるPCR反応を行った。２通りの反応にお
いて（プライマー４−１及び２−2;並びに４−２及び２
−１）、600bpの増幅生成物が得られた。この生成物を
サブクローニングし、そしてサブクローンのうちの11を
配列決定した。これらのサブクローンのうちの９つは同
一であり、そしてその他の起源に由来するカルボキシペ
プチダーゼＹ遺伝子との相同性を有していた。そのサブ
クローンのうちの１つ由来のインサートをA.ニガーゲノ
ムDNAをプロービングするために用いた。単独バンドと
のハイブリダイゼーションがBamH Iにより観察された。
Hind III及びSal I消化は、単属のCPY遺伝子がA.ニガー
の中に存在していることを示唆する。ハイブリダイゼー
ションは1.5XのSSPE、1.0％のSDS、0.5％の無脂ミルク
及び200μg/mlのサケ精子DNAの中で65℃で行った。
EMBL4中のA.ニガーゲノムDNAバンクを調製し、そして
PCR CPY由来の遺伝子フラグメント（32P−ラベル化）に
よりプロービングし、全長遺伝子を単離した。約28,000
プラークのうち、11の陽性体が拾える。そのうちの９つ
は精製後もプローブとハイブリダイズし続けた。これら
のクローンの大半に共通の5.5Hind IIIフラグメントが
A.ニガーCPY遺伝子として同定された。このフラグメン
トをサブクローニング及び配列決定した。CPYコード領
域及び推定のアミノ産を含むこのフラグメントの配列を
図１において紹介する。
PCR CPY由来の遺伝子フラグメント（32P−ラベル化）に
よりプロービングし、全長遺伝子を単離した。約28,000
プラークのうち、11の陽性体が拾える。そのうちの９つ
は精製後もプローブとハイブリダイズし続けた。これら
のクローンの大半に共通の5.5Hind IIIフラグメントが
A.ニガーCPY遺伝子として同定された。このフラグメン
トをサブクローニング及び配列決定した。CPYコード領
域及び推定のアミノ産を含むこのフラグメントの配列を
図１において紹介する。
次に、種々のA.ニガー株由来のcDNAがバンクもスクリ
ーニングした。少なくとも１の全長クローンを同様にし
てこのライブラリーから同定する。このクローンを配列
決定し、そしてその配列を図２に示す。両DNA配列は長
さ557のアミノ酸のCPY前駆体を推定せしめる。S.セレビ
ジエ由来の相同性遺伝子との対比に基づき、A.ニガー由
来のCPYは137又は138個のアミノ酸のプレ−プロペプチ
ドを有しているようであった。この遺伝子は61塩基対の
一本のイントロンを含む。２種類のA.ニガー配列の対比
はアミノ酸配列において多少の相異を示すであろう。そ
れはおそらくゲノム及びcDNAクローンを単離せしめる種
々の株を反映する。S.セレビジエ及びC.アルビカンス
（C.albicans）のアミノ酸配列対比はそれぞれ65％及び
66％の同一性を示す。
ーニングした。少なくとも１の全長クローンを同様にし
てこのライブラリーから同定する。このクローンを配列
決定し、そしてその配列を図２に示す。両DNA配列は長
さ557のアミノ酸のCPY前駆体を推定せしめる。S.セレビ
ジエ由来の相同性遺伝子との対比に基づき、A.ニガー由
来のCPYは137又は138個のアミノ酸のプレ−プロペプチ
ドを有しているようであった。この遺伝子は61塩基対の
一本のイントロンを含む。２種類のA.ニガー配列の対比
はアミノ酸配列において多少の相異を示すであろう。そ
れはおそらくゲノム及びcDNAクローンを単離せしめる種
々の株を反映する。S.セレビジエ及びC.アルビカンス
（C.albicans）のアミノ酸配列対比はそれぞれ65％及び
66％の同一性を示す。
本発明は図１及び２に開示の配列の利用は限定されな
い。第１に、本発明は図１又は２に示すものと同じアミ
ノ酸配列を産生するが、遺伝子コードの縮重性により相
違するヌクレオチド配列も包括する。更に、同じ種の２
種類の株について示しているアミノ産配列の相違は、単
一の種の配列内の変動は寛容され、そして本明細書に記
載の技術を利用し、かかる変異体は簡単に同定できうる
ことを示す。従って、本文において「A.ニガー」と言及
しているとき、それはかかる変異体の全てを包括するも
のと理解されるであろう。特に、本発明は任意の変異ヌ
クレオチド配列、及びそれによりコードされるタンパク
質も包括し、そのタンパク質は図１又は２に示すアミノ
酸配列と少なくとも約80％、好ましくは約85％そして最
も好ましくは少なくとも約90％〜95％の相同性を保持し
ており、そしてそれは本明細書に記載の配列の活性を質
的に保持している。上記で定着したカテゴリー内の有用
な変異体には、例えば、保存的アミノ酸置換が施され、
その置換がタンパク質の活性に有意義な影響を及ぼさな
いものが含まれる。保存的置換とは、同じクラスのアミ
ノ酸がそのクラスの別のものにより置換されていること
があることを意味している。例えば、非極性脂肪族残基
のAla,Val,Leu及びIleは、塩基性残基のLys及びArg、又
は酸性残基のAsp及びGluと同様に、相互交換してよい。
同様に、Ser及びThrは、Asn及びGlyと同様、互いとの保
存置換体である。
い。第１に、本発明は図１又は２に示すものと同じアミ
ノ酸配列を産生するが、遺伝子コードの縮重性により相
違するヌクレオチド配列も包括する。更に、同じ種の２
種類の株について示しているアミノ産配列の相違は、単
一の種の配列内の変動は寛容され、そして本明細書に記
載の技術を利用し、かかる変異体は簡単に同定できうる
ことを示す。従って、本文において「A.ニガー」と言及
しているとき、それはかかる変異体の全てを包括するも
のと理解されるであろう。特に、本発明は任意の変異ヌ
クレオチド配列、及びそれによりコードされるタンパク
質も包括し、そのタンパク質は図１又は２に示すアミノ
酸配列と少なくとも約80％、好ましくは約85％そして最
も好ましくは少なくとも約90％〜95％の相同性を保持し
ており、そしてそれは本明細書に記載の配列の活性を質
的に保持している。上記で定着したカテゴリー内の有用
な変異体には、例えば、保存的アミノ酸置換が施され、
その置換がタンパク質の活性に有意義な影響を及ぼさな
いものが含まれる。保存的置換とは、同じクラスのアミ
ノ酸がそのクラスの別のものにより置換されていること
があることを意味している。例えば、非極性脂肪族残基
のAla,Val,Leu及びIleは、塩基性残基のLys及びArg、又
は酸性残基のAsp及びGluと同様に、相互交換してよい。
同様に、Ser及びThrは、Asn及びGlyと同様、互いとの保
存置換体である。
更に、単離遺伝子は、その他の糸状子嚢菌類又は不完
全菌類、例えばその他のアスペルギルス種、例えばA.オ
リガ（A.oryzae）、A.フェチドゥス（A.foetidus）、A.
ヤポニカス（A.japonicas）、A.アキュレアトゥス（A.a
culeatus）又はA.ニドゥランス（A.nidulans）から相同
遺伝子を単離するための手段を担う。その他の非アスペ
ルギルス糸状子嚢菌類種には、フサリウム（Fusarium）
種、例えばF.グラミネアルム（F.graminearum）、F.オ
キシスポルム（F.oxysporum）、F.ソラニ（F.solan
i）、F.カルモルム（F.culmorum）（又は対応のテレオ
モルフ）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora cra
ssa）、トリコデルマ・リージー（Trichoderme reese
i）、T.ビリデ（T.vividac）、T.ハージアスム（T.harz
ianum）、T.ロンジブランチアトウム（T.longibranchia
tum）、ペニシリウム．ジャンチネルム、P.ノタトゥム
（P.notatum）、P.クリソゲノム（P.chrysogenum）、P.
カメンベルチ（P.camemberti）、P.ロケフォルチ（P.ro
queforti）、ヒュミコラ・インソレン（Humicola insol
en）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora
thermophila）及びチエラビア・テレストリス（Thiela
via terrestris）が含まれる。この遺伝子、又はそれを
基礎とするオリゴヌクレオチドは、このようなその他の
種の相同遺伝子を単離するサザンハイブリダイゼーショ
ンにおけるプローブとして使用されうる。特に、かかる
プローブは、対象の種のゲノム又はcDNAとのハイブリダ
イゼーション用の低ストリンジェンシーから高ストリン
ジエンシー（例えば、42℃で5XのSSPE、0.3％のSDS、20
0μg/mlの剪断、変性サケ精子DNA、並びに高、中及び低
ストンジエンシーのための50,35又は25％のホルムアル
デヒドそれぞれの中でのプレハイブリダイゼーション及
びハイブリダイゼーション）のもとで使用でき、次いで
標準のサザンブロッティング手順にかけて、その中の対
応のCPY遺伝子が同定及び単離できる。本明細書記載の
縮重プローブ及び糸状菌類由来のゲノムDNA又は第一鎖c
DNAを利用するPCR反応も、対応のゲノム又はcDNAをクロ
ーニングするためのプローブとして利用できうるCPY特
異的生成物を生み出す。
全菌類、例えばその他のアスペルギルス種、例えばA.オ
リガ（A.oryzae）、A.フェチドゥス（A.foetidus）、A.
ヤポニカス（A.japonicas）、A.アキュレアトゥス（A.a
culeatus）又はA.ニドゥランス（A.nidulans）から相同
遺伝子を単離するための手段を担う。その他の非アスペ
ルギルス糸状子嚢菌類種には、フサリウム（Fusarium）
種、例えばF.グラミネアルム（F.graminearum）、F.オ
キシスポルム（F.oxysporum）、F.ソラニ（F.solan
i）、F.カルモルム（F.culmorum）（又は対応のテレオ
モルフ）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora cra
ssa）、トリコデルマ・リージー（Trichoderme reese
i）、T.ビリデ（T.vividac）、T.ハージアスム（T.harz
ianum）、T.ロンジブランチアトウム（T.longibranchia
tum）、ペニシリウム．ジャンチネルム、P.ノタトゥム
（P.notatum）、P.クリソゲノム（P.chrysogenum）、P.
カメンベルチ（P.camemberti）、P.ロケフォルチ（P.ro
queforti）、ヒュミコラ・インソレン（Humicola insol
en）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora
thermophila）及びチエラビア・テレストリス（Thiela
via terrestris）が含まれる。この遺伝子、又はそれを
基礎とするオリゴヌクレオチドは、このようなその他の
種の相同遺伝子を単離するサザンハイブリダイゼーショ
ンにおけるプローブとして使用されうる。特に、かかる
プローブは、対象の種のゲノム又はcDNAとのハイブリダ
イゼーション用の低ストリンジェンシーから高ストリン
ジエンシー（例えば、42℃で5XのSSPE、0.3％のSDS、20
0μg/mlの剪断、変性サケ精子DNA、並びに高、中及び低
ストンジエンシーのための50,35又は25％のホルムアル
デヒドそれぞれの中でのプレハイブリダイゼーション及
びハイブリダイゼーション）のもとで使用でき、次いで
標準のサザンブロッティング手順にかけて、その中の対
応のCPY遺伝子が同定及び単離できる。本明細書記載の
縮重プローブ及び糸状菌類由来のゲノムDNA又は第一鎖c
DNAを利用するPCR反応も、対応のゲノム又はcDNAをクロ
ーニングするためのプローブとして利用できうるCPY特
異的生成物を生み出す。
本遺伝子はアスペルギルスの如くの糸状子嚢菌類のカ
ルボキシペプチダーゼ欠陥突然変異体の作成において極
めて有用である。これは様々な方法で達し得る。この方
法においては、以下に更に詳しく説明する通り、選択マ
ーカーをCPY遺伝子の中間にクローニングする。次い
で、中断したフラグメントを制限酵素を用いて親プラス
ミドから遊離させる。線形化したDNAフラグメントを選
定の宿主細胞を形質転換するのに用いる。宿主細胞にお
いて、その相同性末端は宿主細胞の染色体と対合し、そ
して相同的組換は染色体の遺伝子の交換をもたらす。菌
類細胞宿主に利用するのに有用な選択マーカーにはamd
S,pryG,argB,niaD,sC及びhygBが含まれる。他方、二方
式（two−way）選択マーカーを利用して二段式工程を採
用できる。かかる工程においては、トランケーション型
CPY遺伝子及び選択マーカー遺伝子を含むプラスミド
を、CPY遺伝子内の一箇所を切断する制限酵素により消
化し、形質転換の際のCPY遺伝子座への組込みをターゲ
ッティングする。次にこの形質転換体を、選択マーカー
遺伝子の消失について選択するであろう培地上で増殖さ
せる。例えばマーカーがpyrGであるとき、その培地は５
−フルオロオチン酸（５−fluorootic acid）と含みう
る。選択マーカー遺伝子の消失は通常、野生型CPYと導
入されたトランケーション型CPY遺伝子との間での組換
により生ずる。得られる株の約50％は、トランケーショ
ン型CPY遺伝子のみを含むべきであり、一方他の50％は
野生型遺伝子のみを含むであろう。かかる方法は、Roth
stein,Meth.Enzymol.194,281−301,1991に記載されてい
る。
ルボキシペプチダーゼ欠陥突然変異体の作成において極
めて有用である。これは様々な方法で達し得る。この方
法においては、以下に更に詳しく説明する通り、選択マ
ーカーをCPY遺伝子の中間にクローニングする。次い
で、中断したフラグメントを制限酵素を用いて親プラス
ミドから遊離させる。線形化したDNAフラグメントを選
定の宿主細胞を形質転換するのに用いる。宿主細胞にお
いて、その相同性末端は宿主細胞の染色体と対合し、そ
して相同的組換は染色体の遺伝子の交換をもたらす。菌
類細胞宿主に利用するのに有用な選択マーカーにはamd
S,pryG,argB,niaD,sC及びhygBが含まれる。他方、二方
式（two−way）選択マーカーを利用して二段式工程を採
用できる。かかる工程においては、トランケーション型
CPY遺伝子及び選択マーカー遺伝子を含むプラスミド
を、CPY遺伝子内の一箇所を切断する制限酵素により消
化し、形質転換の際のCPY遺伝子座への組込みをターゲ
ッティングする。次にこの形質転換体を、選択マーカー
遺伝子の消失について選択するであろう培地上で増殖さ
せる。例えばマーカーがpyrGであるとき、その培地は５
−フルオロオチン酸（５−fluorootic acid）と含みう
る。選択マーカー遺伝子の消失は通常、野生型CPYと導
入されたトランケーション型CPY遺伝子との間での組換
により生ずる。得られる株の約50％は、トランケーショ
ン型CPY遺伝子のみを含むべきであり、一方他の50％は
野生型遺伝子のみを含むであろう。かかる方法は、Roth
stein,Meth.Enzymol.194,281−301,1991に記載されてい
る。
このようにして作成したCPY欠陥突然変異体は異種タ
ンパク質の発現において極めて有用である。本明細書に
おける「異種タンパク質」とは、その宿主細胞にとって
は天然でないタンパク質、天然タンパク質であってその
天然配列を改変するように修飾が施されているタンパク
質、又は天然タンパク質であってその発現が組換DNA技
術による宿主細胞の操作の結果として量的に改変されて
いるタンパク質を意味する。また、この用語に包括され
るのは、天然タンパク質であって、突然変異体における
その発現が、宿主細胞にとって天然でない遺伝子要素の
利用を含むもの、又は宿主細胞においては通常認められ
ない方式で機能するように操作された天然要素の利用を
含むものである。
ンパク質の発現において極めて有用である。本明細書に
おける「異種タンパク質」とは、その宿主細胞にとって
は天然でないタンパク質、天然タンパク質であってその
天然配列を改変するように修飾が施されているタンパク
質、又は天然タンパク質であってその発現が組換DNA技
術による宿主細胞の操作の結果として量的に改変されて
いるタンパク質を意味する。また、この用語に包括され
るのは、天然タンパク質であって、突然変異体における
その発現が、宿主細胞にとって天然でない遺伝子要素の
利用を含むもの、又は宿主細胞においては通常認められ
ない方式で機能するように操作された天然要素の利用を
含むものである。
前述の通り、選定宿主細胞を介するプロテアーゼの製
造は、所望のタンパク質の収量を生成物の回収前でのそ
の分解により、著しく制約させてしまいうる。従って、
宿主により生成されるCPYの消失又は量の低下は任意の
一定のタンパク質の収量を実質的に増大でき、そしてこ
のようにしなければ商業的に不適切な宿主細胞を組換タ
ンパク質の製造にとって商業的に有用なものにしうる。
好適な態様において、CPY欠陥細胞は、対応の野生型株
に比べ、少なくとも25％低く、好ましくは少なくとも50
％低く、そして最も好ましくは少なくとも70％低く、最
大でCPYの機能の完全消失を供する。
造は、所望のタンパク質の収量を生成物の回収前でのそ
の分解により、著しく制約させてしまいうる。従って、
宿主により生成されるCPYの消失又は量の低下は任意の
一定のタンパク質の収量を実質的に増大でき、そしてこ
のようにしなければ商業的に不適切な宿主細胞を組換タ
ンパク質の製造にとって商業的に有用なものにしうる。
好適な態様において、CPY欠陥細胞は、対応の野生型株
に比べ、少なくとも25％低く、好ましくは少なくとも50
％低く、そして最も好ましくは少なくとも70％低く、最
大でCPYの機能の完全消失を供する。
本発明の突然変異菌類細胞は野生型株と同じようにし
て細胞タンパク質の製造に利用できる。当業者は上記の
株にこの方法的知見を適応するうえで有用である本明細
書記載の特性の態様からルーチン的な変更を容易に認識
することができるであろう。対象の遺伝子は発現ベクタ
ーを利用して活性形態で発現させることができる。有用
な発現ベクターは、宿主ゲノムへのベクターの安定組込
みを可能とする。又は宿主細胞のゲノムと独立して宿主
細胞の中でのベクターの自己複製を可能とする要素、そ
して好ましくは形質転換宿主細胞の容易な選択を可能と
する１もしくは複数の表現型マーカーを含む。この発現
ベクターは、プロモーター、リボソーム結合性部位、翻
訳開始シグナルをコードするコントロール配列、及び任
意的にレプレッター遺伝子又は様々なアクチベーター遺
伝子も含みうる。発現したタンパク質の分泌を可能にす
るため、シグナル配列をコードするヌクレオチドを遺伝
子コード配列の前に挿入してよい。コントロール配列の
指令下での発現のため、本発明に従って用いる遺伝子は
適正のリーディングフレームの中のコントロール配列に
作動可能的に連結されている。
て細胞タンパク質の製造に利用できる。当業者は上記の
株にこの方法的知見を適応するうえで有用である本明細
書記載の特性の態様からルーチン的な変更を容易に認識
することができるであろう。対象の遺伝子は発現ベクタ
ーを利用して活性形態で発現させることができる。有用
な発現ベクターは、宿主ゲノムへのベクターの安定組込
みを可能とする。又は宿主細胞のゲノムと独立して宿主
細胞の中でのベクターの自己複製を可能とする要素、そ
して好ましくは形質転換宿主細胞の容易な選択を可能と
する１もしくは複数の表現型マーカーを含む。この発現
ベクターは、プロモーター、リボソーム結合性部位、翻
訳開始シグナルをコードするコントロール配列、及び任
意的にレプレッター遺伝子又は様々なアクチベーター遺
伝子も含みうる。発現したタンパク質の分泌を可能にす
るため、シグナル配列をコードするヌクレオチドを遺伝
子コード配列の前に挿入してよい。コントロール配列の
指令下での発現のため、本発明に従って用いる遺伝子は
適正のリーディングフレームの中のコントロール配列に
作動可能的に連結されている。
発現ベクターは組換DNA手順に簡単に委ねることので
きうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの
選択は一般にそれを導入せしめる宿主細胞は依存するで
あろう。本発明の好適な態様において、その宿主細胞は
アスペルギルス属の株である。この場合、ベクターは自
己複製式ベクター、即ち、染色体外因子として存在して
いるベクターであって、その複製が染色体の複製と独立
しているもの、例えばプラスミド、又は染色体外要素、
ミチ染色体又は人工染色体とする。他方、このベクター
は、宿主細胞の中に導入したときに、宿主細胞のゲノム
の中に組込まれ、そしえそれが組込まれた染色体と一緒
に複製されるものであってもい。
きうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの
選択は一般にそれを導入せしめる宿主細胞は依存するで
あろう。本発明の好適な態様において、その宿主細胞は
アスペルギルス属の株である。この場合、ベクターは自
己複製式ベクター、即ち、染色体外因子として存在して
いるベクターであって、その複製が染色体の複製と独立
しているもの、例えばプラスミド、又は染色体外要素、
ミチ染色体又は人工染色体とする。他方、このベクター
は、宿主細胞の中に導入したときに、宿主細胞のゲノム
の中に組込まれ、そしえそれが組込まれた染色体と一緒
に複製されるものであってもい。
ベクターの中で、対象の遺伝子の配列は適当なプロモ
ーター配列に作動可能的に連結されているべきである。
このプロモーターは選定の宿主細胞の中で転写活性を示
す任意のDNA配列であってよく、そしてそれは宿主細胞
に対して同種又は異種のいづれかのタンパク質をコード
する遺伝子に由来しうる。菌類宿主の中での転写にとっ
て、有用なプロモーターの例は、A.オリザTAKAアミラー
ゼ・リゾミコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）ア
スパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニガー中性α−アミラ
ーゼ、A.ニガー酸安定性α−アミラーゼ、A.ニガーもし
くはA.アワモリ（A.awamori）グルコアミラーゼ（gla
A）、リゾムコール・ミーヘイ・リパーゼ、A.オリザ・
アルカリ性プロテアーゼ、A.オリザ・トリオースリン酸
イソメラーゼ又はA.ニドゥランス・アセトアミダーゼを
コードする遺伝子に由来するものである。好ましいのは
TAKA−アミラーゼ又はglaAプロモーターである。
ーター配列に作動可能的に連結されているべきである。
このプロモーターは選定の宿主細胞の中で転写活性を示
す任意のDNA配列であってよく、そしてそれは宿主細胞
に対して同種又は異種のいづれかのタンパク質をコード
する遺伝子に由来しうる。菌類宿主の中での転写にとっ
て、有用なプロモーターの例は、A.オリザTAKAアミラー
ゼ・リゾミコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）ア
スパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニガー中性α−アミラ
ーゼ、A.ニガー酸安定性α−アミラーゼ、A.ニガーもし
くはA.アワモリ（A.awamori）グルコアミラーゼ（gla
A）、リゾムコール・ミーヘイ・リパーゼ、A.オリザ・
アルカリ性プロテアーゼ、A.オリザ・トリオースリン酸
イソメラーゼ又はA.ニドゥランス・アセトアミダーゼを
コードする遺伝子に由来するものである。好ましいのは
TAKA−アミラーゼ又はglaAプロモーターである。
本発明の発現ベクターは、適当な転写ターミネータ
ー、更には真核細胞においては、異種遺伝子配列をコー
ドするDNA配列に作動可能的に連結されたポリアデニル
化配列を含みうる。ターミネーション及びポリアデニル
化配列はプロモーターと同じ起源に由来するのが好適で
ありうる。このベクターは更に対象の宿主細胞の中でベ
クターが複製することを可能にするDNA配列を含んで成
りうる。かかる配列の例は、プラスミドpUC19,pACY177,
pUB110,pE194,pAMB1及びpIJ702の複製起点である。
ー、更には真核細胞においては、異種遺伝子配列をコー
ドするDNA配列に作動可能的に連結されたポリアデニル
化配列を含みうる。ターミネーション及びポリアデニル
化配列はプロモーターと同じ起源に由来するのが好適で
ありうる。このベクターは更に対象の宿主細胞の中でベ
クターが複製することを可能にするDNA配列を含んで成
りうる。かかる配列の例は、プラスミドpUC19,pACY177,
pUB110,pE194,pAMB1及びpIJ702の複製起点である。
このベクターは更に、選択マーカー、例えば宿主細胞
の欠陥を補完する生成物の遺伝子、又はアンピシリン、
カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサ
イクリン耐性の如くの前生物質耐性を抜ける生成物の遺
伝子も含んで成りうる。アスペルギルス選択マーカーの
例には、amdS,pyrG,argB,niaD,sC及びhygB（ヒグロマイ
シン耐性を供するマーカー）が含まれる。アスペルギル
ス宿主細胞の中での利用にとって好適なのは、A.ニドゥ
ランス又はA.オリザのsmdS及びpyrGマーカーである。更
に、選択は例えばWO91/17243号に記載の如く、共形質転
換により行ってよい。
の欠陥を補完する生成物の遺伝子、又はアンピシリン、
カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサ
イクリン耐性の如くの前生物質耐性を抜ける生成物の遺
伝子も含んで成りうる。アスペルギルス選択マーカーの
例には、amdS,pyrG,argB,niaD,sC及びhygB（ヒグロマイ
シン耐性を供するマーカー）が含まれる。アスペルギル
ス宿主細胞の中での利用にとって好適なのは、A.ニドゥ
ランス又はA.オリザのsmdS及びpyrGマーカーである。更
に、選択は例えばWO91/17243号に記載の如く、共形質転
換により行ってよい。
発現は、細胞外生成物をもたらすものが一般に好まし
い。対象のタンパク質は従って培養培地への発現タンパ
ク質の分泌で可能とするプレ領域を含んで成りうる。所
望するなら、このプレ領域は、本発明のタンパク質にと
って天然のものであるか、又は関連のプレ領域をコード
するDNA配列の置換により慣用的に行われる別のプレ領
域もしくはシグナル配列により置換されたものであって
よい。例えば、このプレ領域は、アスペルギルス種に由
来するグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、又
はアスペルギルス種に由来するアミラーゼ遺伝子、バチ
ルス種由来のアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミーヘ
イ由来のリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッ
カロマイセス・セレビジエ由来のα−因子、又は仔牛の
プレプロキモシン遺伝子に由来しうる。特に好ましく
は、その宿主が菌類細胞であるとき、A.オリガTAKAアミ
ラーゼ、A.ニガー中性アミラーゼ、マルトジュンアミラ
ーゼ型バチルスNCIB 11837、B.ステアロサーモフィルス
（B.stearothermophilus）α−アミラーゼ、又はバチル
ス・リシェニホルミス（B.licheniformis）ズワチリシ
ンについてのプレ領域である。有効なシグナル配列は、
A.オリガTAKAアミラーゼシグナル、リゾムコール・ミー
ヘイアスパラギン酸プロテイナーゼシグナル及びリゾム
コール・ミーヘイリパーゼシグナルである。
い。対象のタンパク質は従って培養培地への発現タンパ
ク質の分泌で可能とするプレ領域を含んで成りうる。所
望するなら、このプレ領域は、本発明のタンパク質にと
って天然のものであるか、又は関連のプレ領域をコード
するDNA配列の置換により慣用的に行われる別のプレ領
域もしくはシグナル配列により置換されたものであって
よい。例えば、このプレ領域は、アスペルギルス種に由
来するグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、又
はアスペルギルス種に由来するアミラーゼ遺伝子、バチ
ルス種由来のアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミーヘ
イ由来のリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッ
カロマイセス・セレビジエ由来のα−因子、又は仔牛の
プレプロキモシン遺伝子に由来しうる。特に好ましく
は、その宿主が菌類細胞であるとき、A.オリガTAKAアミ
ラーゼ、A.ニガー中性アミラーゼ、マルトジュンアミラ
ーゼ型バチルスNCIB 11837、B.ステアロサーモフィルス
（B.stearothermophilus）α−アミラーゼ、又はバチル
ス・リシェニホルミス（B.licheniformis）ズワチリシ
ンについてのプレ領域である。有効なシグナル配列は、
A.オリガTAKAアミラーゼシグナル、リゾムコール・ミー
ヘイアスパラギン酸プロテイナーゼシグナル及びリゾム
コール・ミーヘイリパーゼシグナルである。
本発明のDNA構築体、プロモーター、ターミネーター
及びその他の要素をそれぞれライゲーションするのに、
並びにそれらを複製にとって必須の情報を含む適当なベ
クターに挿入するのに利用する手順は当業者にとって公
知である（例えばSambrookら、Molecular Cloning,1989
を参照のこと）。
及びその他の要素をそれぞれライゲーションするのに、
並びにそれらを複製にとって必須の情報を含む適当なベ
クターに挿入するのに利用する手順は当業者にとって公
知である（例えばSambrookら、Molecular Cloning,1989
を参照のこと）。
CPY欠陥突然変異体は、任意の対象の原核及び真核系
タンパク質を発現させるのに利用でき、そして好ましく
は真核系タンパク質を発現するのに利用される。これら
の細胞に関して特に関心のもたれるのは、菌類酵素、例
えばカタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダー
ゼ、オキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、セルラー
ゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒド
ロローゼ、エステラーゼ、キュチナーゼ、プロテアーゼ
及びその他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダー
ゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、
ペクチナーゼ及びその他のペクチン分解酵素、アミラー
ゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インバーター
ゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナー
ゼ及びデオキシリボヌクレアーゼの発現におけるその利
用である。当業者にとって、用語「菌類酵素」は、天然
の菌類酵素のみならず、活性、熱的安定性、pH寛容性等
を高めるために施されることのあるアミノ酸置換、欠
失、付加又はその他の修飾により修飾された菌類酵素も
含むことを理解するであろう。これらの突然変異体は、
ホルモン、成長因子、レセプター等の如くの薬理学的に
関心のもたれる異種のタンパク失を発現させるのにも利
用されうる。
タンパク質を発現させるのに利用でき、そして好ましく
は真核系タンパク質を発現するのに利用される。これら
の細胞に関して特に関心のもたれるのは、菌類酵素、例
えばカタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダー
ゼ、オキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、セルラー
ゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒド
ロローゼ、エステラーゼ、キュチナーゼ、プロテアーゼ
及びその他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダー
ゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、
ペクチナーゼ及びその他のペクチン分解酵素、アミラー
ゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インバーター
ゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナー
ゼ及びデオキシリボヌクレアーゼの発現におけるその利
用である。当業者にとって、用語「菌類酵素」は、天然
の菌類酵素のみならず、活性、熱的安定性、pH寛容性等
を高めるために施されることのあるアミノ酸置換、欠
失、付加又はその他の修飾により修飾された菌類酵素も
含むことを理解するであろう。これらの突然変異体は、
ホルモン、成長因子、レセプター等の如くの薬理学的に
関心のもたれる異種のタンパク失を発現させるのにも利
用されうる。
本発明を以下の非限定的な実施例により更に説明す
る。
る。
実施例 I.アスペルギルス・ニガーCPY遺伝子の単離 A.材料と方法 i.株 下記の手順において以下の生物材料を使用するエッシ
ェリヒア・コリK802（ek4−nrca）、mcrB、hsdR2、galK
2、GalT22、supE44、metB1;E.コリSOLR（E14−（mcrA）
Δ（mcrCB−hsdSMR−mrr）177、sbcC、secB、recJ、uvr
C、umuC::Tn5（kanr）、lac、gyrA96、relAl、thi−
１、endAl、λＲ［Ｆ′ProABlacIq Z ΔM15］Su-、E.コ
リJM101supE、thi−１、Δ（lac−proAB）、［Ｆ′traD
36、proAB、lacIq Z ΔM15］、E.コリ XL−1 Blue rec
Al、endAl、gyrA96、thi−１、hsdR17、supE44、relA
l、lac、［Ｆ′proAB、lacIq Z ΔM15、Tn10（te
tR）］、アスペルギルス・ニガーBo−１、A.ニガーSFAG
−２。
ェリヒア・コリK802（ek4−nrca）、mcrB、hsdR2、galK
2、GalT22、supE44、metB1;E.コリSOLR（E14−（mcrA）
Δ（mcrCB−hsdSMR−mrr）177、sbcC、secB、recJ、uvr
C、umuC::Tn5（kanr）、lac、gyrA96、relAl、thi−
１、endAl、λＲ［Ｆ′ProABlacIq Z ΔM15］Su-、E.コ
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Al、endAl、gyrA96、thi−１、hsdR17、supE44、relA
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tR）］、アスペルギルス・ニガーBo−１、A.ニガーSFAG
−２。
ii.PCR増幅 PCR反応を標準のプロトコールを利用して行い、アニ
ーリング工程は45℃で行う。A.ニガーBo−１ゲノムDNA
を鋳型として用い、そして以下の縮重オリゴヌクレオチ
ドを使用する。
ーリング工程は45℃で行う。A.ニガーBo−１ゲノムDNA
を鋳型として用い、そして以下の縮重オリゴヌクレオチ
ドを使用する。
上記のプライマーにおいて、Ｉはイノシン、ＹはＣ又
はＴ、ＲはＡ又はＧ、そしてＤはA,G又はＴを表わす。
はＴ、ＲはＡ又はＧ、そしてＤはA,G又はＴを表わす。
iii.PCR生成物のサブクローニング PCR生成物を、TA Cloning Kit（lnvitrogen）を利用
する。その製造者のプロトコールに従う配列決定のため
にサブクローニングする。
する。その製造者のプロトコールに従う配列決定のため
にサブクローニングする。
iv.ラムダZap IIからのin vivo切除 CPY cDNAラムダZapクローンから、Stratageneにより
供されたプロトコールに従うE.コリ株SOLRでの継代によ
り、pBluescript SK−ベクターの中のcDNAインサートを
含むプラスミドを取り出す。
供されたプロトコールに従うE.コリ株SOLRでの継代によ
り、pBluescript SK−ベクターの中のcDNAインサートを
含むプラスミドを取り出す。
v.DNA配列決定 ヌクレオチド配列決定は、蛍光ラベル化ヌクレオチド
によるTAQポリメラーゼサイクル配列決定を利用して決
定する。配列決定の反応体をApplied Bivsystems自動DN
Aシーケンサー（Model 363A、バージョン1,2,0）で電気
泳動させる。以下のCPY特異的プライマーをM13リバース
（−48）及びM13（−20）フォワードプライマーに加
え、利用する（Sangerら、J.Mol.Biol.143:163−17
8）： B.結果 鋳型としてA.ニガーBo−１ゲノムDNAを用い、CPY特異
的縮重オリゴヌクレオチドプライマー１−1,1−2,2−１
及び２−２（図１）の様々な組合せを利用してPCR反応
を行う。反応は全て、95℃で５分、45℃で１分及び72℃
で２分のサイクルを１回、次いで95℃で１分、45℃で１
分及び72℃で２分のサイクルを25回利用して行う。
によるTAQポリメラーゼサイクル配列決定を利用して決
定する。配列決定の反応体をApplied Bivsystems自動DN
Aシーケンサー（Model 363A、バージョン1,2,0）で電気
泳動させる。以下のCPY特異的プライマーをM13リバース
（−48）及びM13（−20）フォワードプライマーに加
え、利用する（Sangerら、J.Mol.Biol.143:163−17
8）： B.結果 鋳型としてA.ニガーBo−１ゲノムDNAを用い、CPY特異
的縮重オリゴヌクレオチドプライマー１−1,1−2,2−１
及び２−２（図１）の様々な組合せを利用してPCR反応
を行う。反応は全て、95℃で５分、45℃で１分及び72℃
で２分のサイクルを１回、次いで95℃で１分、45℃で１
分及び72℃で２分のサイクルを25回利用して行う。
反応物のアリコート（10μｌ）をアガロースゲル上で
電気泳動し、そして２通りの反応において、即ち一方は
プライマー１−２及び２−１による反応、そして他方は
プライマー１−２及び２−２による反応において、約11
00bpの増幅生成物が主要物質である。イントロンがない
と仮定して、これらのオリゴヌクレオチドの組合せを利
用しての生成物の推定サイズは900bpである。1100bp増
殖生成物をサブクローニングし、そしてフォワード及び
リバースプライマーを用いて配列決定する。７つのサブ
クローンが配列決定された。しかしながら、どれも相同
性をもってCPYをコードしなかった。
電気泳動し、そして２通りの反応において、即ち一方は
プライマー１−２及び２−１による反応、そして他方は
プライマー１−２及び２−２による反応において、約11
00bpの増幅生成物が主要物質である。イントロンがない
と仮定して、これらのオリゴヌクレオチドの組合せを利
用しての生成物の推定サイズは900bpである。1100bp増
殖生成物をサブクローニングし、そしてフォワード及び
リバースプライマーを用いて配列決定する。７つのサブ
クローンが配列決定された。しかしながら、どれも相同
性をもってCPYをコードしなかった。
プライマー３−1,3−2,4−1,4−2,2−１及び２−２の
様々な組合せを利用するPCR反応を上記と同じ条件を利
用して行う。アリコートをアガロースゲル上で電気泳動
にかけ、そして２通りの反応において、即ち、一方はプ
ライマー４−１及び２−１による反応において、そして
他方はプライマー４−２及び２−１による反応におい
て、約600bpの増殖生成物が主要物質となる。その他の
カルボキシペプチダーゼに対する相同性を基礎とした増
殖生成物の推定サイズは600bpである。この600bp増殖生
成物をサブクローニングし、そしてフォワード及びリバ
ースプライマーを用い、11のサブクローンについてのDN
A配列を決定する。11のサブクローンのうちの９つが、
S.セレビジエとの69％の同一性に基づき、A.ニガー由来
のCPYをコードする。この９つは全て互いと同一であ
り、A.ニガーの中にはカルボキシペプチダーゼについて
一種の遺伝子しかないことが示唆される。600bpのA.ニ
ガーCPY PCR生成物を含むサブクローンをpDSY17と命名
する。
様々な組合せを利用するPCR反応を上記と同じ条件を利
用して行う。アリコートをアガロースゲル上で電気泳動
にかけ、そして２通りの反応において、即ち、一方はプ
ライマー４−１及び２−１による反応において、そして
他方はプライマー４−２及び２−１による反応におい
て、約600bpの増殖生成物が主要物質となる。その他の
カルボキシペプチダーゼに対する相同性を基礎とした増
殖生成物の推定サイズは600bpである。この600bp増殖生
成物をサブクローニングし、そしてフォワード及びリバ
ースプライマーを用い、11のサブクローンについてのDN
A配列を決定する。11のサブクローンのうちの９つが、
S.セレビジエとの69％の同一性に基づき、A.ニガー由来
のCPYをコードする。この９つは全て互いと同一であ
り、A.ニガーの中にはカルボキシペプチダーゼについて
一種の遺伝子しかないことが示唆される。600bpのA.ニ
ガーCPY PCR生成物を含むサブクローンをpDSY17と命名
する。
A.ニガーBo−１ゲノムDNAのサザンブロットをpDSY17
由来のインサートによりプロービングする。プローブは
Gibco−BRLのニック・トランスレーションキットを用い
て放射性ラベルしておく。利用するハイブリダイゼーシ
ョン条件は1.5XのSSPE、１％のSDS、0.5％の無脂ミルク
及び200μg/mlのサケ精子DNAの中で60℃とする。このブ
ロットを0.2XのSSC、１％のSDS及び0.1％のNAピロリン
酸塩の中で65℃で洗う。BamH I、Hind III及びSALI消化
において、約10、5.5及び7kbの単独バンドがそれぞれCP
Yプローブとハイブリダイズする。
由来のインサートによりプロービングする。プローブは
Gibco−BRLのニック・トランスレーションキットを用い
て放射性ラベルしておく。利用するハイブリダイゼーシ
ョン条件は1.5XのSSPE、１％のSDS、0.5％の無脂ミルク
及び200μg/mlのサケ精子DNAの中で60℃とする。このブ
ロットを0.2XのSSC、１％のSDS及び0.1％のNAピロリン
酸塩の中で65℃で洗う。BamH I、Hind III及びSALI消化
において、約10、5.5及び7kbの単独バンドがそれぞれCP
Yプローブとハイブリダイズする。
CPYについて完全遺伝子を単離するため、約26,000の
組換体を含むA.ニガーBo−１のEMBL4のゲノムバンク
を、Gibco−BRLニック・トランスレーションキットで放
射性ラベルしておいたPCR由来のCPY遺伝子フラグメント
によりプロービングする。約28,000プラークをフィルタ
ーにリフトし、そしてプロービングする。これらのプレ
ートから11の陽性体が拾える。精製後、９つの一次クロ
ーンがCPYプローブとハイズリダイズし続いた。この９
つのクローンからDNAを単離し、そしてそれらを特性決
定するために制限消化を行う。制限パターンから、９つ
のうちの７つが同定される。他の２クローンは固有のも
のである。これらのクローンのサザン消化より、９つの
うち８つがCPYプローブとハイブリダイズする約5.5kbの
同一のHind IIIフアグメントを有することが決定され
る。このHind IIIフラグメントを含まないクローンは、
CPYプローブとハイブリダイズするもっと大きい（＞12k
b）Hind IIIフラグメントを含む。共通のHind IIIフラ
グメントをDNA配列決定のためにサブクローニングす
る。ゲノムDNA配列及び推定のアミノ酸配列を図１に示
す。
組換体を含むA.ニガーBo−１のEMBL4のゲノムバンク
を、Gibco−BRLニック・トランスレーションキットで放
射性ラベルしておいたPCR由来のCPY遺伝子フラグメント
によりプロービングする。約28,000プラークをフィルタ
ーにリフトし、そしてプロービングする。これらのプレ
ートから11の陽性体が拾える。精製後、９つの一次クロ
ーンがCPYプローブとハイズリダイズし続いた。この９
つのクローンからDNAを単離し、そしてそれらを特性決
定するために制限消化を行う。制限パターンから、９つ
のうちの７つが同定される。他の２クローンは固有のも
のである。これらのクローンのサザン消化より、９つの
うち８つがCPYプローブとハイブリダイズする約5.5kbの
同一のHind IIIフアグメントを有することが決定され
る。このHind IIIフラグメントを含まないクローンは、
CPYプローブとハイブリダイズするもっと大きい（＞12k
b）Hind IIIフラグメントを含む。共通のHind IIIフラ
グメントをDNA配列決定のためにサブクローニングす
る。ゲノムDNA配列及び推定のアミノ酸配列を図１に示
す。
A.ニガーSFAG−２のラムダ2AP II（Stratagene）のcD
NAバンクもスクリーニングする。約42,000のプラークを
フィルターにリフトし、そして上記の通りにしてCPYプ
ローブでプロービングし、そしてこれらのプラークのう
ちの112が上記の緊縮条件下でハイブリダイズすること
が認められる。20の最初の陽性体を拾って再スクリーニ
ングし、そして精製後、18がまだCPYプローブとハイブ
リダイズする。４つの陽性クローンから、ラムダZapキ
ットに供されているin vivo切除プロトコールを用いてD
NAを単離する。取り出したプラスミドをE10R Iで消化
し、そしてアガロースゲル上で電気泳動してインサート
のサイズを決定する。２つのクローン（２−１及び３−
２）が、CPYについての全長cDNAを含むのに十分に大き
いインサートを有することが認められ、そしてそれぞれ
は約1700及び250bpの２つのE10R Iフラグメントを含ん
でいた。全長cDNAの推定サイズは約1600bpである。その
他の２つのcDNAクローン（２−２及び２−４）はもっと
小さいインサートを有する；しかしながら、それらは全
て250bpのE10R Iフラグメントを含む。クローン３−２
及び２−２の部分DNA配列を決定し、そして３−２は全
長cDNAを含み、一方クローン２−２は５′末端において
約200bpまで切除されていた。
NAバンクもスクリーニングする。約42,000のプラークを
フィルターにリフトし、そして上記の通りにしてCPYプ
ローブでプロービングし、そしてこれらのプラークのう
ちの112が上記の緊縮条件下でハイブリダイズすること
が認められる。20の最初の陽性体を拾って再スクリーニ
ングし、そして精製後、18がまだCPYプローブとハイブ
リダイズする。４つの陽性クローンから、ラムダZapキ
ットに供されているin vivo切除プロトコールを用いてD
NAを単離する。取り出したプラスミドをE10R Iで消化
し、そしてアガロースゲル上で電気泳動してインサート
のサイズを決定する。２つのクローン（２−１及び３−
２）が、CPYについての全長cDNAを含むのに十分に大き
いインサートを有することが認められ、そしてそれぞれ
は約1700及び250bpの２つのE10R Iフラグメントを含ん
でいた。全長cDNAの推定サイズは約1600bpである。その
他の２つのcDNAクローン（２−２及び２−４）はもっと
小さいインサートを有する；しかしながら、それらは全
て250bpのE10R Iフラグメントを含む。クローン３−２
及び２−２の部分DNA配列を決定し、そして３−２は全
長cDNAを含み、一方クローン２−２は５′末端において
約200bpまで切除されていた。
完全cDNA配列を双方の鎖に基づいて決定する（図
２）。そのcDNAは長さ557個のアミノ酸のCPY前駆体をコ
ードするものと推定される。今日まで、cDNA及びゲノム
クローンの間で見い出せるヌクレオチド相違のほとんど
はゆらぎの範囲に属し、それは驚くべきことでなく、な
ぜならそれらは２種類の異なるA.ニガー株に由来するか
らである。S.セレビジエに由来するCPYとの整合に基づ
き、A.ニガー由来のCPYはシグナルペプチド及びプロペ
プチドの双方を有することが認められ、そして成熟CPY
タンパク質は長さが419又は420個のアミノ酸のいづれか
である。A.ニガーCPYは酵母S.セレビジエ及びC.アルビ
カンスに由来するCPYとそれぞれ約65％及び約66％の同
一性を有する（Mukhtarら、Gene 121:173−177,199
2）。
２）。そのcDNAは長さ557個のアミノ酸のCPY前駆体をコ
ードするものと推定される。今日まで、cDNA及びゲノム
クローンの間で見い出せるヌクレオチド相違のほとんど
はゆらぎの範囲に属し、それは驚くべきことでなく、な
ぜならそれらは２種類の異なるA.ニガー株に由来するか
らである。S.セレビジエに由来するCPYとの整合に基づ
き、A.ニガー由来のCPYはシグナルペプチド及びプロペ
プチドの双方を有することが認められ、そして成熟CPY
タンパク質は長さが419又は420個のアミノ酸のいづれか
である。A.ニガーCPYは酵母S.セレビジエ及びC.アルビ
カンスに由来するCPYとそれぞれ約65％及び約66％の同
一性を有する（Mukhtarら、Gene 121:173−177,199
2）。
II.CPY欠陥突然変異体の調整 CPYの欠失したA.ニガー株を作るため、A.オリガpyrG
遺伝子がCPYのコード領域に挿入されている構築体を作
る（図３）。CPYの全遺伝子のほとんど及びこの遺伝子
の下流〜6kbを含む〜6.5kbのHind IIIフラグメントを、
Pst I部位が破壊されたpKS＋（Stratagene）誘導体にサ
ブクローニングする。得られる組換体をPst Iで消化し
てCPYコード領域から815bpのフラグメントを欠失させ、
そしてPst Iによる消化によって作られた突き出しをT4D
NAポリメラーゼ及び４種全てのdNTPの添加により接着末
端化する。得られる接着末端型ベクターを、Hind IIIに
よる消化、それに続くクレノウフラグメントを利用する
補完（fill）反応により得られた〜3.8kbの接着末端型
フラグメントにライゲーションさせる。CPY遺伝子が挿
入されたpyrGを有している最終構築体をHind IIIで消化
して線形フラグメントを作り上げ、それをA.ニガーpyrG
株を形質転換するのに用い、最少培地プレート上での増
殖で選択する。形質転換体をサザンブロッティングによ
りスクリーニングし、その株が中断したCPY遺伝子を含
むかを調べる。これらの形質転換体を更にウェスタンブ
ロッティングにより分析して細胞内でのCPYの欠如につ
いて調べる。CPYの中断を含むものとして株が同定でき
たら、異種タンパク質に基づく効果が決定される。
遺伝子がCPYのコード領域に挿入されている構築体を作
る（図３）。CPYの全遺伝子のほとんど及びこの遺伝子
の下流〜6kbを含む〜6.5kbのHind IIIフラグメントを、
Pst I部位が破壊されたpKS＋（Stratagene）誘導体にサ
ブクローニングする。得られる組換体をPst Iで消化し
てCPYコード領域から815bpのフラグメントを欠失させ、
そしてPst Iによる消化によって作られた突き出しをT4D
NAポリメラーゼ及び４種全てのdNTPの添加により接着末
端化する。得られる接着末端型ベクターを、Hind IIIに
よる消化、それに続くクレノウフラグメントを利用する
補完（fill）反応により得られた〜3.8kbの接着末端型
フラグメントにライゲーションさせる。CPY遺伝子が挿
入されたpyrGを有している最終構築体をHind IIIで消化
して線形フラグメントを作り上げ、それをA.ニガーpyrG
株を形質転換するのに用い、最少培地プレート上での増
殖で選択する。形質転換体をサザンブロッティングによ
りスクリーニングし、その株が中断したCPY遺伝子を含
むかを調べる。これらの形質転換体を更にウェスタンブ
ロッティングにより分析して細胞内でのCPYの欠如につ
いて調べる。CPYの中断を含むものとして株が同定でき
たら、異種タンパク質に基づく効果が決定される。
生物材料の寄託 以下の生物材料を1994年９月13日に、アグリカルチャ
ー・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション
（NRRL）1815−２、ユニバシティー（North Universit
y）通り、ペオリアア（Peoria）市、イリノイ州（Illin
ois）61604に寄託した。細胞表 受託番号 pDSY23含有E.コリ（Emcc ＃0120） NRRL B−21326
ー・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション
（NRRL）1815−２、ユニバシティー（North Universit
y）通り、ペオリアア（Peoria）市、イリノイ州（Illin
ois）61604に寄託した。細胞表 受託番号 pDSY23含有E.コリ（Emcc ＃0120） NRRL B−21326
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トンプソン，シェリル アン アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616， デイビス，コーウェル ブー ルバード 5207 (56)参考文献 Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ．，58［７］（1992）ｐ. 2144−2152 Ｇｅｎｅ，121（1992）ｐ．173−177 Ｃｅｌｌ，48（1987）ｐ．887−897 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 1/15 C12N 9/62 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (26)
- 【請求項１】糸状子嚢菌類又は不完全菌類のカルボキシ
ペプチダーゼＹをコードする核酸配列を含む核酸構築体
であって、ここで当該核酸配列は： （ａ）SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:4に記載のアミノ
酸配列をコードする核酸配列； （ｂ）SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列又はSUQ ID
NO:4に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個の
アミノ酸が欠失、挿入又は置換により修飾されたアミノ
酸配列をコードする核酸配列；及び （ｃ）高ストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:1又
はSEQ ID NO:3の核酸配列にハイブリダイズする核酸
配列； から成る群より選ばれるものであり、 ここで上記（ａ）、（ｂ）又（ｃ）によりコードされる
タンパク質はカルボキシペプチダーゼＹ活性を保持して
いる、核酸構築体。 - 【請求項２】前記糸状子嚢菌類又は不完全菌類が、アス
ペルギルス、フサリウム、ペニシリウム、ヒュミコラ、
トリコデルマ、シタリジウム、ミセリオフトラ及びチエ
ラビアから成る群より選ばれる、請求項１記載の構築
体。 - 【請求項３】前記カルボキシペプチダーゼＹがアスペル
ギルス・ニガーのカルボキシペプチダーゼＹである、請
求項１記載の構築体。 - 【請求項４】前記核酸配列が、SEQ ID NO:2に記載の
アミノ酸配列又はSEQ ID NO:4に記載のアミノ酸配列
において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入又は置
換により修飾されたアミノ酸配列をコードする核酸配列
である、請求項１記載の構築体。 - 【請求項５】前記核酸配列が高ストリンジェンシー条件
下でSEQ ID NO:1又はSEQ ID NO:3の核酸配列により
ハイブリダイズする核酸配列である、請求項１記載の構
築体。 - 【請求項６】選択マーカーが前記カルボキシペプチダー
ゼＹ配列の中に挿入されている、請求項１記載の構築
体。 - 【請求項７】前記選択マーカーがamdS,pyrG,argB,niaD,
sC又はhygBである、請求項６記載の構築体。 - 【請求項８】同一の条件下で培養したときに、対応の野
生型細胞にくらべ、少なくとも25％低いカルボキシペプ
チダーゼＹ活性を示す突然変異糸状子嚢菌類細胞であっ
て、その内因性カルボキシペプチダーゼＹ遺伝子が相同
組み換えにより （ａ）SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:4に記載のアミノ
酸配列をコードする核酸配列； （ｂ）SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列又はSEQ ID
NO:4に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個の
アミノ酸が欠失、挿入又は置換により修飾されたアミノ
酸配列をコードする核酸配列；及び （ｃ）高ストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:1又
はSEQ ID NO:3の核酸配列にハイブリダイズする核酸
配列； から成る群より選ばれる核酸配列で置換されており、 ここで当該核酸配列は中断されているものである、細
胞。 - 【請求項９】対応の野生型細胞よりも少なくとも50％低
いカルボキシペプチダーゼＹ活性を示す、請求項８記載
の細胞。 - 【請求項１０】対応の野生型細胞よりも少なくとも70％
低いカルボキシペプチダーゼＹ活性を示す、請求項８記
載の細胞。 - 【請求項１１】アスペルギルス、フサリウム、ペニシリ
ウム、ヒュミコラ、トリコデルマ、シタリジウム、ミセ
リオフトラ及びチュラビアから成る群より選ばれる、請
求項８記載の細胞。 - 【請求項１２】アスペルギルス・ニガーである、請求項
８記載の細胞。 - 【請求項１３】同一の条件下で培養したときに、対応の
野生型細胞よりも少なくとも25％低いカルボキシペプチ
ダーゼＹ活性を示す突然変異糸状子嚢菌類又は不完全菌
類細胞であって、その内因性カルボキシペプチダーゼＹ
遺伝子が相同組み換えにより （ａ）SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:4に記載のアミノ
酸配列をコードする核酸配列； （ｂ）SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列又はSEQ ID
NO:4に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個の
アミノ酸が欠失、挿入又は置換により修飾されたアミノ
酸配列をコードする核酸配列；及び （ｃ）高ストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:1又
はSEQ ID NO:3の核酸配列にハイブリダイズする核酸
配列； から成る群より選ばれる核酸配列で置換されており、 ここで当該核酸配列は中断されているものであり、そし
て当該細胞は異種タンパク質をコードする核酸配列を含
んで成る、細胞。 - 【請求項１４】選択マーカー遺伝子が前記核酸構築体の
前記カルボキシペプチダーゼＹをコードする核酸配列の
中に挿入されている、請求項１記載の核酸構築体を含ん
で成る突然変異糸状子嚢菌類又は不完全菌類。 - 【請求項１５】前記核酸構築体の核酸配列が非機能性糸
状子嚢菌類又は不完全菌類細胞のカルボキシペプチダー
ゼＹをコードするために改質されたものである、請求項
１記載の核酸構築体を含んで成る突然変異糸状子嚢菌類
又は不完全菌類。 - 【請求項１６】カルボキシペプチダーゼＹ非生産性糸状
子嚢菌類又は不完全菌類細胞を製造するための方法であ
って、 （ａ）その内因性カルボキシペプチダーゼＹ遺伝子が相
同組み換えにより （ｉ）SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:4に記載のアミノ
酸配列をコードする核酸配列； （ii）SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列又はSEQ ID
NO:4に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個の
アミノ酸が欠失、挿入又は置換により修飾されたアミノ
酸配列をコードする核酸配列；及び （iii）高ストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:1又
はSEQ ID NO:3の核酸配列にハイブリダイズする核酸
配列； から成る群より選ばれる核酸配列で置換する、 ここで当該核酸配列は中断されているものである、； （ｂ）段階（ａ）から野生型株よりも実質的に低いカル
ボキシペプチダーゼＹ活性を示す細胞を獲得する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項１７】対象のタンパク質の組換的製造方法であ
って、 （ａ）前記タンパク質の発現を誘導する条件下で請求項
13記載の細胞を培養する；そして （ｂ）前記培養物から前記タンパク質を回収する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項１８】下記の群から選ばれる核酸配列によりコ
ードされる単離されたカルボキシペプチダーゼY; （ａ）SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:4に記載のアミノ
酸配列をコードする核酸配列； （ｂ）SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列又はSEQ ID
NO:4に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個の
アミノ酸が欠失、挿入又は置換により修飾されたアミノ
酸配列をコードする核酸配列；及び （ｃ）高ストリンシェンシー条件下でSEQ ID NO:1又
はSEQ ID NO:3の核酸配列にハイブリダイズする核酸
配列。 - 【請求項１９】アスペルギルス・ニガーから単離された
の請求項18記載のカルボキシペプチダーゼＹ。 - 【請求項２０】前記核酸配列がアスペルギルス、フサリ
ウム、ペニシリウム、ヒュミコラ、トリコデルマ、シタ
リジウム、ミセリオフトラ又はチエラビアから獲得され
たものである、請求項19記載のカルボキシペプチダーゼ
Ｙ。 - 【請求項２１】前記核酸配列がアスペルギルスから獲得
されたものである、請求項20記載のカルボキシペプチダ
ーゼＹ。 - 【請求項２２】SEQ IN NO:2又はSEQ ID NO:4のアミ
ノ酸配列を有する、請求項19記載のカルボキシペプチダ
ーゼＹ。 - 【請求項２３】SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列又
はSEQ ID NO:4に記載のアミノ酸配列において、１又
は複数個のアミノ酸が欠失、挿入又は置換により修飾さ
れたアミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードさ
れた、請求項19記載のカルボキシペプチダーゼＹ。 - 【請求項２４】前記核酸配列がアスペルギルス、フサリ
ウム、ペニシリウム、ヒュミコラ、トリコデルマ、シタ
リジウム、ミセリオフトラ又はチエラビアから獲得され
たものである、請求項23記載のカルボキシペプチダーゼ
Ｙ。 - 【請求項２５】前記核酸配列がアスペルギルスから獲得
されたものである、請求項24記載のカルボキシペプチダ
ーゼＹ。 - 【請求項２６】5.5kbのHind IIIフラグメント上に全ア
スペルギルス・ニガーBo−１カルボキシペプチダーゼＹ
遺伝子を含むクローンに含まれている核酸配列によりコ
ードされる請求項18記載のカルボキシペプチダーゼＹ。
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