CN110878291B - 一种源于黑曲霉菌的高产特异性功能低聚肽的酶及其工程菌 - Google Patents
一种源于黑曲霉菌的高产特异性功能低聚肽的酶及其工程菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程领域，提供了一种源于黑曲霉菌M00988的高产特异性功能低聚肽的酶及其工程菌。本发明通过基因改造获得能够高产低F值寡肽的羧肽酶及生产该酶的工程菌。通过对特殊位点的改造，提高了羧肽酶切除芳香族氨基酸的效率，能够有利于提高产品F值，降低酶法生产成本，减少后期纯化过程中的能耗，降低环境污染，实现高效制备高F值低聚肽的工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种黑曲霉菌（Aspergillus niger）的高产特异性功能低聚肽的酶及其工程菌。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，人们的消费观念、饮食习惯、营养要求等都发生了巨大的转变，从简单的吃饱吃好到营养健康甚至防病治病。长期以来，人们普遍认为食物中主要起营养作用的蛋白质必须在消化道中分解成游离的必需氨基酸或非必需氨基酸才能被机体吸收和利用。近年的研究表明蛋白质不仅以氨基酸形式被人体吸收，而且还存在其它的吸收方式。现代营养学研究表明，肽除了与蛋白质和氨基酸一样能提供人体营养物质外，许多有独特序列或氨基酸组成的肽，还具有特殊的生理功能，特别是一些低分子量的活性低聚肽已经成为当前食品科学界研究最为热门的课题之一。其中高F值低聚肽是一种具有高支链氨基酸含量和低芳香族氨基酸含量组成的小肽体系。由于它具有独特的氨基酸组成和生理功能，已经受到食品和医药界的高度关注。
高F值低聚肽主要是由2到10个氨基酸组成的混合小肽体系，其F值（支链氨基酸与芳香族氨基酸含量的摩尔数比值）一般大于20。由于其独特的氨基酸组成，使高F值低聚肽具有多种生理功效。它除了具有抗氧化、防衰老，良好保肝护肝，辅助治疗肝性脑病和治疗治疗苯丙酮尿症的生理功效外。对“慢性疲劳综合征”的亚健康状态也具有很好的调理功效。目前，由于酶解法制备生物活性肽具有生产条件温和、获得的活性肽安全性高，且具有良好溶解性、稳定性及功能特异性等优点，成为了生产活性肽常采用的方法。酶法制备高F值低聚肽时，需要基于原料中蛋白质的氨基酸序列及其酶切位点来进行分析判断，并研究优化制备工艺条件。因此，每种酶体系水解制备高F值低聚肽的方法局限性较大，只能适用于特定的蛋白质原料。同时酶解过程中，长链烷基氨基或芳香族氨基酸的疏水基团的暴露，容易使酶解液呈现苦味，导致后续的分离纯化及脱苦等处理工序繁琐、纯化成本较高，纯化吸附过程中氨基酸和多肽损失较大，再生困难等诸多问题。因此酶法制备高F值低聚肽中提高酶切特异性，有效切除芳香族氨基酸，提高F值是亟待解决的一关键问题。提高酶法生产高F值低聚肽过程中的酶切特异性将有利于提升产品F值，降低酶法生产成本，减少后期纯化过程中的能耗，降低环境污染，实现高效制备高F值低聚肽的工业化生产应用。
发明内容
针对酶法制备高F值低聚肽时存在的问题，本发明提供一种源于黑曲霉菌的高产特异性功能低聚肽的工程菌，能高效获得高F值低聚肽。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种羧肽酶，氨基酸序列为SEQ ID NO: 1-3任一所示。其中SEQ ID NO: 2为SEQID NO: 1所示序列206位酪氨酸突变为丝氨酸，SEQ ID NO: 3为SEQ ID NO: 1所示序列135位的丝氨酸突变为甘氨酸。
所述羧肽酶来源于黑曲霉（Aspergillus niger）M00988，其保藏编号为CGMCC No.18828。
一种氨基酸序列为SEQ ID NO: 1-3任一所示羧肽酶的核苷酸序列。优选的，SEQID NO: 1-3序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示。
一种包含上述羧肽酶核苷酸序列的质粒或工程菌。
一种上述工程菌在制备羧肽酶中的应用。
一种上述羧肽酶在制备高F值低聚肽中的应用。
本发明具有以下优点：
本发明提供了一种基因改造的羧肽酶及生产该酶的工程菌。通过对特殊位点的改造，提高了羧肽酶切除多肽底物中芳香族氨基酸的效率，能够有利于提高产品F值，降低酶法生产成本，减少后期纯化过程中的能耗，降低环境污染，实现高效制备高F值低聚肽的工业化生产应用。
生物保藏信息
黑曲霉（Aspergillus niger），于2019年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 18828。
附图说明
图1为CPA基因PCR产物凝胶电泳图片；
图2为构建Y206S和S135G突变体过程的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为重组酶粗酶液SDS-PAGE电泳图；
图4为低聚肽产物中氨基酸含量；
图5为不同酶处理产物低聚肽F值。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 M00988 CPA突变体的构建
1.黑曲霉M00988 CPA的克隆与表达载体的构建
根据NCBI黑曲霉源的羧肽酶基因序列，设计了两对引物CPA-F/CPA-R，序列见表1。
表1 羧肽酶基因克隆引物序列
以所得目的基因片段CPA为模板，以加酶切位点的引物CPA-Nde I-F/CPA-Eco I-R（见表2）进行PCR扩增，获得加酶切位点目的基因片段CPA，将其与克隆载体PMD18-T连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。将重组质粒命名为T-CPA，送至华大基因公司进行测序，将测序结果在NCBI上比对。经测序验证正确的重组质粒T- CPA，用Nde I和EcoI双酶切后连接到经相同酶切的Pcold TF上，构建表达载体Pcold TF- CPA。
表2 带酶切位点羧肽酶基因克隆引物序列
2. M00988CPA突变体的构建
选择M00988 CPA底物结合口袋上的几个位点进行定点突变，分别是206位的酪氨酸和135位的丝氨酸。利用重叠延伸PCR方法构建定点突变的突变体，分别设计了引物，见表3。
表3 重叠延伸PCR引物序列
以构建成功的Pcold TF-CPA质粒为突变的原材料，通过重叠延伸PCR经过两轮PCR进行定点突变。第一轮PCR以构建成功的Pcold TF-CPA质粒为模板，以CPA-Nde I-F，Y206S-R和Y206S-F，CPA-Eco I-R或CPA-Nde I-F，S135G-R和 S135G-F，CPA-Eco I-R为引物分别进行PCR得到包含突变位点的前段和后段序列。第二轮PCR以第一轮PCR得到的前段和后段产物为模板，以CPA-Nde I-F，CPA-Eco I-R为引物进行PCR得到突变体的全序列。
将206位的酪氨酸突变为丝氨酸或135位的丝氨酸突变为甘氨酸，构建Pcold TF-CPA-Y206S或Pcold TF-CPA-S135G突变体的表达载体。得到成功将206位的酪氨酸突变为丝氨酸或135位的丝氨酸突变为甘氨酸后的突变序列。图2为构建Y206S和S135G突变体过程的琼脂糖凝胶电泳图。图2（A）为Y206S突变体电泳图，其中1、2道为前段，3、4道为后段，5、6道为第二轮PCR产物；图2（B）为S135G突变体电泳图，其中1、2道为后段，3、4道为前段，5、6道为第二轮PCR产物。
分别对Pcold TF以及突变序列进行双酶切，之后采用T4 DNA连接酶将经过双酶切的突变序列和Pcold TF进行连接，并得到重组质粒Pcold TF-CPA-Y206S、Pcold TF-CPA-S135G，其目的基因核酸序列分别如SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示。
3. M00988 CPA及其突变体的原核表达
将构建好的Pcold TF-CPA及突变体的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中。在氨苄霉素抗性平板上筛选阳性重组子，并经菌落PCR验证后再测序验证。将经验证正确的Pcold TF-CPA/BL21及突变体重组菌接种至5mL含氨苄抗性的液体LB培养基，37℃过夜培养，然后以1%的接种量转接至100mL含氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃培养至OD600在0.6-0.8之间，再加入IPTG至终浓度为0.5mM，15℃培养18h。将发酵液于8000r/min、4℃离心10min，收集菌体。用0.2M的磷酸缓冲液（pH7.5）重悬菌体，采用超声波细胞破碎法破碎细胞，8000r/min、4℃离心10min，所得上清液即为粗酶液。粗酶液经SDS-PAGE电泳（图3）发现，在100kDa左右有蛋白条带，与预测的CPA蛋白量98kDa接近，说明构建的原核表达体系能够正确表达羧肽酶。M00988 CPA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，两突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
实施例2 高F值低聚肽制备应用
1. 小球藻蛋白提取
准确称量一定量的小球藻粉末，按1:48（m/V）的料液比加入去离子水，搅拌后于室温下振荡12小时溶胀。向小球藻悬液中加入5.37%的氢氧化钠固体，添加过程中注意缓慢添加，并不断搅拌。完成后，在43℃下超声处理60min。接着，用0.1mol/L氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH=7，在5000rpm 25℃下离心10min，取上清液，以1:4（V/V）的比例加入4℃的95%酒精溶液，搅拌1min，充分混合。再以5000rpm在25℃下离心10分钟，倒掉上清液。将所得沉淀用少量去离子水清洗，去表面酒精后，再用0.1mol/L pH=6的PBS溶液将沉淀溶解。
2. 第一步酶解
将提取的小球藻蛋白液的pH调至8，按80361.64U/mg小球藻蛋白的加酶量加入胰蛋白酶，在37℃水浴条件下酶解3.5h，煮沸5min灭酶活。
3. 第二步酶解
（1）M00988CPA及其突变体处理
将经第一步酶解处理后的样品调节pH至7.5，按4%的加酶量分别加入原核表达的原酶及实施例1获得两种突变体的粗酶液，分别记为CPA、Y206S、S135G。在40℃水浴条件下酶解4小时，然后煮沸5min灭酶活。
（2）风味蛋白酶处理
将经第一步酶解处理后的样品调节pH至7.0，按4%的加酶量加入风味蛋白酶，记为Fla。在45℃水浴条件下酶解4小时，然后煮沸5min灭酶活。
（3）木瓜蛋白酶处理
将经第一步酶解处理后的样品调节pH至6.5，按4%的加酶量加入木瓜蛋白酶，记为Pap。在60℃水浴条件下酶解4小时，然后煮沸5min灭酶活。
4. 活性炭吸附芳香族氨基酸
将经第二步酶解后的样品pH调至4.5，按固液比1:10的比例加入活性炭素，在25℃下吸附12小时。过滤除去活性炭素，得到高F值低聚肽产物溶液。用酸水解法将其水解为游离的氨基酸，用高效液相测定低聚肽溶液中其氨基酸组成及含量，如图4为液相测定低聚肽溶液中氨基酸组成色谱图，其中，1为酪氨酸、2为缬氨酸、3为苯丙氨酸、4为异亮氨酸、5为亮氨酸。
表4所示结果为通过分析得到低聚肽产物溶液中中芳香族氨基酸和支链氨基酸的含量：
表4 支链氨基酸与芳香族氨基酸含量
图5为小球藻蛋白经不同酶处理后生成的低聚肽产物溶液中的F值的柱形图。由试验结果可以看出，用黑曲霉菌株M00988来源的CPA原酶制得的样品其F值为13.11，未能达到高F值水平（F值>20）；用突变体Y206S和S135G制得的低聚肽的F值分别为34.33和33.42，相较于原酶来说，用突变体Y206S和S135G制得的低聚肽的F值分别显著提高了约2.62和2.55倍，达到的高F值的水平。同时采用特异性改造的酶突变体Y206S和S135G所制得的低聚肽产品的F值也明显优于目前市面上制备低聚肽普遍采用的风味蛋白酶和木瓜蛋白酶。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 一种源于黑曲霉菌的高产特异性功能低聚肽的酶及其工程菌
<130> 20191106
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 480
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 1
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gagaagggaa ttttgtatgt ggccacacgc tcggttattg aaatctttct ggctagtaat 1020
ggagaggggt tggtgaaaga gtcgtgggcc aagttgcagg cccttgccga ttcgcatttg 1080
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ttgacgggtc agcttcgcga ggggtatgag gcagatgtga ttgcgttgga ggagaatcca 1320
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aaactgttca aaggtccagg tattggtccg tggggagaag atgcacgtaa tccttttctg 1440
tag 1443
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<213> Aspergillus niger
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> CPA-Eco I-R
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cggaattcct acagaaaagg attacgtgca tctt 34
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<212> DNA
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<211> 33
<212> DNA
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<220>
<223> Y206S-R
<400> 12
ccagggcgtg ggttcattac tccagaactc ccc 33
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S135G-F
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<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S135G-R
<400> 14
accacgggct agtcgagcac ctcctgatgc 30
Claims (6)
1.一种羧肽酶，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO: 1-2任一所示。
2.一种氨基酸序列为SEQ ID NO: 1-2任一所示羧肽酶对应的编码核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的编码核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO:4-5任一所示。
4.一种如权利要求1所述的羧肽酶在以小球藻蛋白为原料制备高F值低聚肽中的应用。
5.一种包含如权利要求2所述的编码核苷酸序列的质粒或工程菌。
6.一种如权利要求5所述的工程菌在制备羧肽酶中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201911248953.9A CN110878291B (zh) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | 一种源于黑曲霉菌的高产特异性功能低聚肽的酶及其工程菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911248953.9A CN110878291B (zh) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | 一种源于黑曲霉菌的高产特异性功能低聚肽的酶及其工程菌 |
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ID=69730067
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN107760750A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-03-06 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种以玉米蛋白粉为原料同步制备高f值寡肽和淀粉糖的方法 |
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| CN108893515A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-11-27 | 江南大学 | 高f值寡肽及其制备方法 |
-
2019
- 2019-12-09 CN CN201911248953.9A patent/CN110878291B/zh active Active
Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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