CN102079785A - 一种胸腺生成素-ⅱ突变体 - Google Patents
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Abstract
利用基因工程手段对天然胸腺生成素-II进行改造，制备出的胸腺生成素-II突变体，在体外具有更高的稳定性，为其作为免疫增强药物的开发研究打下了基础。
Description
一.技术领域
本发明涉及基因工程重组蛋白领域，其中该基因工程蛋白是一种胸腺生成素-II突变体。通过对天然蛋白的分子设计与基因工程改造，得到了具有更高稳定性的胸腺生成素-II突变体。
二.背景技术
免疫系统是人体的防御系统。参与免疫反应的主要细胞有T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。而胸腺是T淋巴细胞发育、分化的免疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子(或胸腺激素)是T淋巴细胞发育分化所需的一系列必需物质，其中最为重要的两种免疫增强因子是胸腺素α1(Tα1)和胸腺生成素-II。
胸腺素α1的结构和功能目前已经研究得非常清楚，并且已经作为药品(如日达仙)在市场上进行销售。相对来说，对胸腺生成素-I I的研究较少。从机体免疫系统的复杂性和协同性来讲，胸腺生成素-II作为另一种重要的免疫增强因子，值得进行深入的研究。
胸腺生成素-II是最早Goldstein等从小牛胸腺分离出的一种多肽，是一种49个氨基酸的多肽，由13种氨基酸组成的。相对分子质量为4818Da。胸腺生成素-II具有调节神经肌肉传导的作用和免疫激活作用，能够促进胸腺细胞和外周T细胞及B细胞分化发育，并且能够双向调节机体失衡的免疫功能，具有独特的生物学作用，是一种重要的免疫调节剂，其32-36位氨基酸称为胸腺五肽，是胸腺生成素-I I重要的功能活性部分。
通过研究发现了胸腺生成素-I I在体外酸性状态下(pH5)不够稳定，容易水解，水解的位置发生在序列中6-7位的Asp-Pro肽键处，并且文献表明，蛋白中的Asp-Pro序列在酸性条件下易发生水解(Acid-catalyzed peptide bond hydrolysis of recombinant human interleukin 11.Pharmaceutical Res.1994.Vol.11.NO1，72-74)，影响其分子稳定性。所以本发明通过对胸腺生成素-II 6位的氨基酸位点改造，从原来的Asp同源替换为Glu，解决了分子在体外不稳定的问题，为其作为免疫增强药物的开发研究打下了基础。
三.发明内容
本发明的一个方面，涉及一种胸腺生成素-II突变体，其为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员知晓，所述胸腺生成素-II突变体可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本发明中，所述胸腺生成素-II突变体是通过基因工程重组表达的方法获得的。
在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体，包括如下步骤：
1)表达载体的构建
依据已知胸腺生成素-II氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体(SEQ ID NO：2)DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之5’端和3’端加上限制性酶切位点，加入EK酶酶切位点，得到编码胸腺生成素-II突变体的核酸序列。
再分别将如上述制备的胸腺生成素-II序列和胸腺生成素-II突变体以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。
用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的Pharmacia公司质粒pGEX连接，经筛选得到正确的重组子pGEX-T2.
2)胸腺生成素-II和重组胸腺生成素-II突变体的表达及分离纯化
将如上述所得重组子转化到表达宿主菌BL21，经表达筛选出高表达基因工程菌pGEX-T2/BL21，然后经发酵，离心收集目的蛋白高表达的菌体。高压均质机破碎菌体并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用EK酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，使得最终目的蛋白纯度大于95％。
3)重组胸腺生成素-II突变体的体外生物活性测定
用E玫瑰花结实验对样品进行生物活力测试：首先分离健康人外周血单核细胞，使用小牛血清调整细胞数至2×106/ml。各取200μl细胞液加入EP管中，再分别加入测试样品胸腺生成素-II突变体(100ug/mL)与胸腺生成素-II(100ug/mL)，37℃水浴90分钟，每支EP管中加入200μl绵羊红细胞(2×106/ml)，4℃放置3小时，涂片、染色后放于高倍镜下计数200个，淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3个或以上的为一个玫瑰花结)。计算玫瑰药形成细胞的百分数。按以下公式计算增殖率。
增殖率＝样品管药结百分比-对照药结百分比
经测试，本发明生产的胸腺生成素-II突变体的体外生物活性优于胸腺生成素-II。
4)重组胸腺生成素-II突变体的体外稳定性测定
经过测试，经过改造后分子的体外稳定性大大提高。
5)重组胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体的体内生物活性测定
7周大的雌性Balb/C小鼠(每组6只)连续10d腹膜内分别注射0.2mL生理盐水，以及30μg/kg的胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体，10d后取血做流式细胞仪分析。
经测试，本发明生产的胸腺生成素-II突变体体内生物活性大于胸腺生成素-II。
从上述结果可以看出，本发明的胸腺生成素-II突变体提高了分子稳定性，从而提高了其体内生物活性。
四.具体实施方式
1.胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体前体蛋白表达质粒的构建与工程菌的获得
表达载体的构建
依据已知胸腺生成素-I I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体(SEQ ID NO：2)的DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之5’端和3’端加上限制性酶切位点，加入EK酶酶切位点，得到编码胸腺生成素-II突变体的核酸序列。
GGA TCC 
TCT CAA TTT CTT GAA GAG CCT TCC GTT CTT ACT
BanHI EK酶切位点
AAA GAA AAG TTA AAA TCT GAA TTG GTC GCT AAT AAC GTC ACC TTACCT GCC GGT GAA CAA CGT AAA GAT GTT TAT GTC CAG TTG TAC TTA CAAACT TTG ACT GCT GTT A从CGT TAA TGA GAA TTC
EcoRI
目的片段经BamH I、EcoR I双酶切后分别回收小片段，质粒PGEX经BamH I、EcoR I双酶切后回收大片段，14℃在T4连接酶体系中两段目的基因片段进行连接，经筛选得到的重组质粒命名为PGEX-T2。然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LA中培养至OD600为0.6-0.8时加入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE电泳时出现一条30KD左右的蛋白带，表达量为菌体可溶性蛋白的35％。所获得的高效表达前体蛋白的工程菌分别命名为PGEX-T2/BL21.
2.胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体的发酵
1).摇瓶表达：含胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体前体蛋白基因的PGEX-T2/BL21，在含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺生成素-I I和胸腺生成素-II突变体的前体蛋白(30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体可溶性蛋白的40％。
2)发酵工艺：
a.培养基：
a)种子液培养基(LA)：
胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、氨苄青霉素：100微克/毫升。
b)培养基(15升)：
磷酸氢二钠：375克、磷酸二氢钾：80克、 氯化钠：10.克、
氯化铵：45克、 胰蛋白胨：50克。
以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁：15克、 葡萄糖：150克、
补料(500克/升)：葡萄糖
b.发酵过程：
(a)种子培养：
从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角瓶)LA中，37度、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LA中，36度、200转/分，过夜。
(b)发酵过程：
将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，37度、150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时，加入终浓度0.3mM的IPTG诱导(五小时)。
3.胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体的纯化：
(1)亲和层析
采用GST Fast Flow层析介质(GE公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，菌体经过破碎并离心取上清，上样平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱，平衡后用含10mM还原型谷胱甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。
(2)酶解
上一步的洗脱液加入EK酶(5NIHU/mL)37℃酶切20小时。
(3)阴离子交换层析
采用Source30Q层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上一步得到的样品用水稀释1倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7，0-1M NaCl，20个柱体积的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
4.检测
得到的胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突变体通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度均大于95％。
5.体外活性检测
E玫瑰药结实验对样品进行生物活力测试：
基础细胞培养液：1640基础培养基10.0g，NaHCO3 2.2g，Hepes5.9g，丙酸钠0.11g，0.05M巯基乙醇2.0ml，ddH2O 1000ml；细胞培养基：基础细胞培养基90ml，小牛血清10ml，双抗(青霉素+链霉素)100U/ml，谷胱甘肽0.03g/ml；
测活培养基：基础培养基95ml小牛血清5.0ml，双抗及谷胱甘肽浓度与上相同。过滤灭菌；裂解液：SDS 10g，，DMSO 25ml，ddH2O 19ml，调PH＝4.7。
方法：首先分离健康人外周血单核细胞，使用小牛血清调整细胞数至2×106/ml。各取200μl细胞液加入EP管中，再分别加入测试样品胸腺生成素-I I突变体(100ug/mL)与胸腺生成素-II(100ug/mL)，37℃水浴90分钟，每支EP管中加入200μl，绵羊红细胞(2×106/ml)，4℃放置3小时，涂片、染色后放于高倍镜下计数200个，淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3个或以上的为一个玫瑰花结)。计算玫瑰药形成细胞的百分数。
按以下公式计算激活率。
激活率＝样品管药结百分比-对照药结百分比
样品对E玫瑰花结形成率的影响
| E玫瑰花结形成数 | 增殖率 | |
| 阴性对照 | 26.2％ | 0 |
| 胸腺生成素-II(100ug/ml) | 40.3％ | 14.1％ |
| 胸腺生成素-II突变体(100ug/ml) | 47.7％ | 21.5％ |
由上表可知，本发明生产的胸腺生成素-II突变体的体外生物活性优于胸腺生成素-II。
6.重组胸腺生成素-II和重组胸腺生成素-II突变体的体外稳定性测定
通过上表可以看到，重组胸腺生成素-I I突变体分子的体外稳定性与重组胸腺生成素-II相比大大提高。
7.体内活性检测
动物模型的建立：
7周大的雌性Balb/C小鼠(每组6只)连续10d腹膜内分别注射0.2mL生理盐水，以及30μg/kg的胸腺生成素-II以及胸腺生成素-II突变体，10天后分离胸腺细胞做流式细胞仪分析CD4+、CD8+细胞数。
流式细胞仪分析
新分离的胸腺细胞中加入抗CD4、CD8抗体，阴性选择获得的CD4-CD8-细胞中加入羊抗鼠抗体，用FACScan流式细胞仪分析，Cell Quest软件。
结果：
| CD4+CD8+细胞群比例 | |
| 生理盐水组 | 1.5％±0.42 |
| 胸腺生成素-II组 | 30.2％±1.10 |
| 胸腺生成素-II突变体组 | 52.3％±0.63 |
从上表可以看出，本发明的胸腺生成素-II突变体体内生物活性大于胸腺生成素-II，推测是由于分子改造后其稳定性增强所造成的体内活性提高。
序列表
<110>汪晓东
<120>一种胸腺生成素-II突变体
<160>2
<210>1
<211>49
<212>PRT
<213>SEQ ID NO：1
<400>1
Ser Gln Phe Leu Glu Asp Pro Ser Val Leu
1 5 10
Thr Lys Glu Lys Leu Lys Ser Glu Leu Val
15 20
Ala Asn Asn Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu
25 30
Gln Arg Lys Asp Val Tyr Val Gln Leu Tyr
35 40
Leu Gln Thr Leu Thr Ala Val Lys Arg
45 49
<210>2
<211>49
<212>PRT
<213>SEQ ID NO：2
<400>2
Ser Gln Phe Leu Glu Glu Pro Ser Val Leu
1 5 10
Thr Lys Glu Lys Leu Lys Ser Glu Leu Val
15 20
Ala Asn Asn Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu
25 30
Gln Arg Lys Asp Val Tyr Val Gln Leu Tyr
35 40
Leu Gln Thr Leu Thr Ala Val Lys Arg
45 49
Claims (5)
1.一种胸腺生成素-II突变体(SEQ ID NO：2)，其氨基酸序列为：
Ser Gln Phe Leu Glu Glu Pro Ser Val Leu Thr Lys Glu Lys Leu Lys Ser Glu Leu Val Ala Asn Asn Val Thr Leu ProAla Gly Glu Gln Arg Lys Asp Val Tyr Gln Leu TyrLeu Gln Thr Leu Thr Ala Val Lys Arg。
2.一种多核苷酸序列，其编码权利要求1所述的胸腺生成素-II突变体。
3.权利要求1中的胸腺生成素-II突变体，使用大肠杆菌为宿主细胞，应用基因工程的方法进行表达。
4.一种治疗受试对象中免疫力低下的方法以及疫苗辅助增强的方法，包括向所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1中所述的胸腺生成素-II突变体。
5.权利要求4中的方法，其中所述受试对象是哺乳动物。
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| CN2009102501884A CN102079785A (zh) | 2009-11-30 | 2009-11-30 | 一种胸腺生成素-ⅱ突变体 |
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|---|---|---|---|---|
| CN1137293A (zh) * | 1994-09-20 | 1996-12-04 | 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 | 编码黑曲霉羧肽酶的基因 |
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2009
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| CN1137293A (zh) * | 1994-09-20 | 1996-12-04 | 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 | 编码黑曲霉羧肽酶的基因 |
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| GENBANK: "Genbank accession：753035A", 《GENBANK》 * |
| 方宏清: "多肤类药物制剂研究现状", 《生物技术通讯》 * |
| 方宏清: "多肽类药物制剂研究现状", 《药学进展》 * |
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