CN107022032A - 用于调节铁稳态的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及血幼素‑IgG Fc结构域融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物，以及利用这些融合蛋白调节铁稳态和治疗铁稳态相关疾病的方法。

Description

用于调节铁稳态的组合物及其使用方法

本申请是申请日为2012年1月19日、申请人为菲卢马克斯制药公司、通用医疗公司，发明名称为“用于调节铁稳态的组合物及其使用方法”的中国专利申请201280013021.6的分案申请。

相关申请

本申请要求2011年1月19日提交的美国临时专利申请号61/434,405的优先权，该临时专利申请的全文通过引用纳入本文。

技术领域

本公开总体涉及铁稳态紊乱的治疗、预防和改善，尤其与贫血的管理相关。本公开更具体地涉及血幼素(hemojuvelin)-免疫球蛋白Fc结构域融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物以及利用这些组合物改变人体内的血清铁、血清血红蛋白和/或血细胞比容水平的方法。

背景技术

铁是几乎每种有机体的生长和生存所需要的必需元素。红血球(RBC)含有血红蛋白(Hb)，一种红色的、富含铁的蛋白，其从肺部携带氧气至身体的所有肌肉和器官，在这些肌肉和器官中血红蛋白反应以提供身体正常活动所需的能量。当红血球数目或它们含有的血红蛋白数量降至低于正常水平时，身体接收到比其发挥正常功能所需更少的氧气、产生更少的能量。这种情况通常称为贫血。婴儿和儿童贫血的常见原因是铁缺乏。美国多达20％的儿童以及发展中国家中80％的儿童在18岁以前的某个时间会患有贫血。Martin,P.L.等，The Anemias,Principles and Practices of Pediatrics(儿科贫血、原理与实践),1657(Lippincott 1994，第二版)。

哺乳动物中，铁平衡主要在十二指肠吸收膳食中的铁这个水平调节。在人类中，遗传性血色素沉着病(HH)是由膳食铁过量吸收引起的一种常见的常染色体隐性遗传疾病，导致血浆和多个器官(尤其包括胰腺、肝脏、和皮肤)中铁超负荷，并由于铁沉积而引起这些器官和组织的损伤。

青少年血色素沉着病是一种由编码主要的铁调节激素铁调素(HAMP)和血幼素(HFE2)的基因突变而引起的铁超负荷紊乱(Roetto,A.,等.2003.Nut.Genet.33:21-22；Papanikolaou,G.,等2004.Nut.Genet.36:77-82.)。已证明血幼素是骨形态发生蛋白(BMP)的辅助受体，血幼素介导的BMP信号调节铁调素表达和铁代谢(Babitt,J.L.,等2006.Nat.Genet.38:531-539；Babitt,J.L.,等.2007.J Clin Invest.117:1933-1939.)。然而，铁调素在体内的内源BMP调节子是未知的。

血幼素(也称为RGMc)是排斥导向分子(Repulsive Guidance Molecules)蛋白家族的成员，该家族包括RGMa和DRAGON(RGMb)，它们有50-60％的氨基酸同一性(Samad,T.A.,等2004.J.Neurosci.24:2027-2036.)。

需要一种成本有效的、高效的方法来调节铁调素表达和铁代谢。

发明内容

本公开提供血幼素(“HJV”)-免疫球蛋白Fc结构域融合蛋白。本公开还提供利用这些蛋白治疗铁稳态紊乱的方法。HJV可以是哺乳动物HJV。更具体地，HJV可以是小鼠或人HJV。

本公开还提供组合物，该组合物含有与SEQ ID NO:9的序列95％相同的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物。一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的经尺寸排阻色谱确定的纯度至少为98％。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物是糖基化的。某些实施方式中，SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.9的天冬酰胺83、天冬酰胺178和天冬酰胺337是N-糖基化位点。在该实施方式的一个方面，糖基化模式是哺乳动物糖基化模式。具体而言，糖基化模式来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的N-末端氨基酸是谷氨酰胺。在该实施方式的一个方面，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的N-末端是QCKILRCNAE(SEQ ID NO:10)。另一种实施方式中，N-末端片段可以是来自SEQ ID NO:1或9的头150个氨基酸的任何片段。

另一种实施方式中，组合物是基本无热原的。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的血清半衰期是至少10小时。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物以K_D至少为10^-7M结合骨形态发生蛋白-6(“BMP-6”)，并抑制BMP-6信号转导。另一种实施方式中，将组合物给予对象时组合物增加对象的血细胞比容。另一种实施方式中，将组合物给予贫血对象一个月或更长时间时，组合物增加贫血对象的血细胞比容至至少正常水平。

另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物形成同型二聚体。在该实施方式的一个方面，同型二聚体在Fc铰链区内形成。更具体而言，同型二聚体通过SEQ ID NO:9中的半胱氨酸373、380和/或383之间的化学相互作用而形成。具体而言，化学相互作用是二硫键。

本公开还提供了编码所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的核酸分子。一种实施方式中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:11的序列95％相同的序列。

本公开还提供哺乳动物细胞，所述细胞包含编码所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的核酸分子。一种实施方式中，所述细胞是CHO细胞。

本公开还提供治疗对象中导致贫血的铁稳态紊乱的方法，该方法通过给予有需要的对象治疗有效量的上述组合物，从而治疗铁稳态紊乱并改善贫血。

本公开还提供组合物，其包含融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物包含N-末端多肽和C-末端多肽，其中所述N-末端多肽包含与SEQ ID NO:1的序列95％相同的序列，并且其中所述C-末端多肽包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6和7的序列95％相同的序列。一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的经尺寸排阻色谱确定的纯度至少为98％。

另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物是糖基化的。在该实施方式的一个方面，糖基化模式是哺乳动物糖基化模式。具体而言，糖基化模式来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸是谷氨酰胺。在该实施方式的一个方面，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端是QCKILRCNAE(SEQ ID NO:10)。

另一种实施方式中，所述组合物是基本无热原的。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的血清半衰期是至少10小时。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物以K_D至少为10^-7M结合骨形态发生蛋白-6(“BMP-6”)，并抑制BMP-6信号转导。另一种实施方式中，将组合物给予对象时组合物增加对象的血细胞比容。另一种实施方式中，将组合物给予贫血对象一个月或更长时间时，组合物增加贫血对象的血细胞比容至至少正常水平。

本公开还提供编码所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的核酸分子。一种实施方式中，所述核酸序列包含SEQ ID NO:11。

本公开还提供哺乳动物细胞，所述细胞包含编码所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的核酸序列。一种实施方式中，所述细胞是CHO细胞。

本公开还提供治疗有需要的对象的铁稳态紊乱和/或改善贫血的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的上述组合物，从而治疗铁稳态紊乱和/或改善贫血。

本公开还提供治疗有需要的对象的癌症的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的上述组合物，从而治疗癌症。

附图说明

图1表示SEQ ID NO 3-7的氨基酸序列的比对。

图2表示HJV.Fc二聚体的结构示意。

图3是高剂量HJV.Fc处理的ACD大鼠PG-APS模型中的血红蛋白的线型图，表示与对照大鼠比较，给予了20mg/kg HJV.Fc的贫血大鼠中血清血红蛋白的水平。HJV.Fc高＝20mg/kg HJV.Fc每周两次x 4周，HJV.Fc高对ACD，P-值＝0.0305(第3周)，0.0176(第4周)。

图4是HJV.Fc处理的ACD大鼠PG-APS模型中的血红蛋白的线型图，表示与对照大鼠比较，给予了2或20mg/kg HJV.Fc的贫血大鼠中血清血红蛋白的水平。高和低剂量HJV.Fc处理(均为2mg/kg和20mg/kg)HJV.Fc每周两次x 4周。HJV.Fc处理对ACD，P-值＝0.0273(第3周)，P-值＝0.0054(第4周)。

图5是HJV.Fc处理的ACD大鼠PG-APS模型中的血细胞比容的柱状图，表示与对照大鼠比较，给予了20mg/kg HJV.Fc的贫血大鼠中血细胞比容的水平。高＝20mg/kg HJV.Fc每日两次x 4周，ACD高对ACD，P-值＝0.0012(第3周)，0.0229(第4周)。

图6是HJV.Fc处理的贫血大鼠PG-APS模型中的血清铁的柱状图，表示与对照大鼠比较，给予了20mg/kg HJV.Fc的贫血大鼠中的血清铁。ACD高(n＝9)对对照(n＝6)，p-值＝0.123，ACD高(n＝9)对对照(n＝10)，p-值＝0.019。

图7A的图用来自Biacore结合试验的数据表示HJV.His(同型二聚体)对BMP6的亲和力。

图7B的图用来自Biacore结合试验的数据表示HJV.His(同型二聚体)对BMP6的亲和力。

图8显示在基于细胞的生物抑制试验中HJV.Fc有效抑制BMP6活性。

图9显示通过HPLC分析，纯度>95％的同型二聚体HJV.Fc的单体的制备物。

具体实施方式

发明人发现了用于治疗贫血的新的治疗组合物。这些组合物是包含血幼素(“HJV”)和IgG Fc区的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物。本公开提供融合蛋白，该融合蛋白包含肽，所述肽包含融合于IgG Fc区或其衍生物的至少一部分HJV氨基酸序列。某些实施方式中，融合蛋白的HJV部分是融合蛋白的N-末端部分，融合蛋白的IgGFc部分是C-末端部分。其它实施方式中，融合蛋白的HJV部分是融合蛋白的C-末端部分，融合蛋白的IgG Fc部分是N-末端部分。

某些实施方式中，融合蛋白的N-末端和C-末端部分以连接子连接。具体实施方式中，连接子是长度为1至50个氨基酸的多肽。更具体的实施方式中，连接子的长度为2至25个氨基酸。更具体的实施方式中，连接子的长度为3至15个氨基酸。更具体的实施方式中，连接子的长度是4、5、6、7、8或9个氨基酸。一种优选的实施方式中，连接子的长度是5个氨基酸。某些实施方式中，连接子可富含甘氨酸和脯氨酸残基，并可例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列或苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸(例如TG)的重复序列。某些实施方式中，可在连接子(如果有)和或Fc蛋白中产生突变以改变蛋白的半衰期。

给予本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物导致铁调素表达下降。本文描述的组合物可用于治疗铁代谢紊乱和增加血清血红蛋白和血细胞比容。

HJV部分

本文描述的融合蛋白的人血幼素(“HJV”)部分含有HJV的可溶性部分，该可溶性部分能够增加铁的动员(mobilization)和/或治疗或改善与铁代谢疾病相关的至少一种症状。某些实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分与SEQ ID NO:1的一部分至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同。

HJV的氨基酸序列示于下表1：

某些实施方式中，本文描述的融合蛋白的HJV部分是SEQ ID NO:1的任意片段，其可溶于水溶液并能够动员(mobilize)铁和/或治疗或改善与铁代谢疾病相关的至少一种症状。组成本公开融合蛋白的HJV部分的SEQ ID NO:1片段包含SEQ ID NO:1的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350或360个氨基酸的片段。这些片段可包含SEQ ID NO:1的任何范围的氨基酸。某些具体实施方式中，片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-150的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸。某些实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分与SEQ ID NO:1片段的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％，其中所述片段包含SEQ ID NO:1的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350或360个氨基酸。

组成本公开融合蛋白的HJV部分的SEQ ID NO:1片段包含SEQ ID NO:1的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350或360个连续氨基酸的片段。某些实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分与SEQ ID NO:1片段的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％，其中所述片段包含SEQ ID NO:1的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350或360个连续氨基酸。

某些实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分是全长的或者是片段并且与SEQ IDNO:1的同一性大于75％。其它实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分是全长的或者是片段并且与SEQ ID NO:1的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％。某些具体实施方式中，SEQID NO:1和本公开融合蛋白的HJV部分的差异是保守氨基酸改变，如下所述。

IgG Fc部分

本公开融合蛋白的IgG Fc部分包含免疫球蛋白Fc区的至少一部分或其衍生物，当与本公开融合蛋白的HJV部分融合时，能够动员铁和/或治疗或改善与铁代谢疾病相关的至少一种症状。当给予对象时，本公开融合蛋白的IgG Fc部分稳定融合蛋白。具体实施方式中，连接IgG Fc或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物使得血清蛋白的血清半衰期大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、60、72、84、或96小时。有几个序列与本公开的融合蛋白相容。

某些实施方式中，IgG Fc结构域包含CH2和CH3结构域以及铰链区。其它实施方式中，IgG Fc还包含CH1区的至少一部分。具体实施方式中，融合蛋白的HJV部分直接连接于铰链区。其它实施方式中，Fc结构域包含来自CH1结构域的在铰链区N-末端的序列，该序列连接于融合蛋白的HJV部分。其它实施方式中，连接子连接于Fc结构域的铰链区或CH1结构域。更具体的实施方式中，铰链区包含4个氨基酸，共有序列为X₁-P-X₂-X₃(SEQ ID NO:2)，其中X₁为半胱氨酸或丝氨酸，X₂为亮氨酸或脯氨酸，X₃为半胱氨酸或丝氨酸。完整免疫球蛋白的铰链区为蛋白提供了充分的柔性以进行有效的抗原-抗体结合。本公开的某些实施方式中，将铰链区包括在本公开融合蛋白的IgG Fc部分中以维持其柔性，尤其是当融合蛋白为二聚体形式时。

某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分与SEQ ID NO:3的一部分至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同。

某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分是SEQ ID NO:3的任意片段，当与本公开融合蛋白的HJV部分融合时，其可溶于水溶液并能够动员铁和/或治疗或改善与铁代谢疾病相关的至少一种症状。组成本公开融合蛋白的IgG Fc部分的SEQ ID NO:3片段包含SEQ ID NO:3的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220或230个氨基酸的片段。某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分与SEQ ID NO:3片段的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％，其中所述片段包括SEQ IDNO:3的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、或230个氨基酸。

组成本公开融合蛋白的IgG Fc部分的SEQ ID NO:3片段包含SEQ ID NO:3的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220或230个连续氨基酸的片段。某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分与SEQ ID NO:3片段的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％，其中所述片段包含SEQ ID NO:3的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、或230个连续氨基酸。

某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分是全长的或者是片段并且与SEQID NO:3的同一性大于75％。其它实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分是全长的或者是片段并且与SEQ ID NO:3的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％。某些具体实施方式中，SEQ ID NO:3和本公开融合蛋白的IgG Fc部分的差异是保守氨基酸改变，如下所述。

其衍生物的其它序列或片段适合用作本公开融合蛋白的IgG Fc部分。IgG Fc衍生物(SEQ ID NO:3)、人IgG1Fc(SEQ ID NO:4)、Regeneron开发的VEGFR-Fc融合物的Fc区(SEQID NO:5)、Bristol Myers Squibb开发的CTLA4-Fc融合物(ORENCIA^TM或阿巴西普(abatacept))的Fc区(SEQ ID NO:6)、Regeneron开发的IL1R-Fc融合物(ARCALYST^TM或利洛纳塞(rilonacept))的Fc区(SEQ ID NO:7)和(阿达木单抗(adaluminab))的比对。

某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分是SEQ ID NO:4、5、6或7的任意片段，当与本公开融合蛋白的HJV部分融合时，其可溶于水溶液并能够动员铁和/或治疗或改善与铁代谢疾病相关的至少一种症状。组成本公开融合蛋白的IgG Fc部分的SEQ ID NO:4、5、6或7片段包含SEQ ID NO:4、5、6或7的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220或230个氨基酸的片段。某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分与SEQ ID NO:3片段的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％，其中所述片段包含SEQ ID NO:4、5、6或7的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、或230个氨基酸。

组成本公开融合蛋白的IgG Fc部分的SEQ ID NO:4、5、6或7片段包含SEQ ID NO:4、5、6或7的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220或230个连续氨基酸的片段。某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分与SEQ ID NO:3片段的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％，其中所述片段包含SEQ IDNO:4、5、6或7的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、或230个连续氨基酸。

某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分是全长的或者是片段并且与SEQID NO:4、5、6或7的同一性大于75％。其它实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fc部分是全长的或者是片段并且与SEQ ID NO:4、5、6或7的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99％。某些具体实施方式中，SEQ ID NO:4、5、6或7和本公开融合蛋白的IgG Fc部分的差异是保守氨基酸改变，如下所述。

连接子

某些实施方式中，本公开的融合蛋白包含连接融合蛋白的HJV部分和IgG Fc部分的连接子。优选实施方式中，连接子是肽。可选实施方式中，所述肽的长度可以为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个氨基酸。某些实施方式中，组成连接子的氨基酸是各位置的甘氨酸或丝氨酸。一种优选实施方式中，连接子的序列为GGGGG(SEQ ID NO:8)。

某些实施方式中，连接子可富含甘氨酸和脯氨酸残基，并可例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列或苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸(例如TG)的重复序列。

某些实施方式中，可在连接子(如果有)和或Fc蛋白中产生突变以改变蛋白的半衰期。

二聚化

某些实施方式中，融合蛋白为二聚体形式，包含两个相同的多肽亚基。图2示意图所示的实施方式中，各多肽亚基，从N-末端至C-末端，包括SEQ ID NO:9的多肽序列，如下所示。

两个多肽亚基通过各自的铰链区之间的二硫键连接在一起形成二聚体结构。可在Fc铰链区中形成同型二聚体。更具体而言，可通过SEQ ID NO:9中的半胱氨酸373、380和/或383之间的化学相互作用形成同型二聚体。

用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:9的蛋白的载体的核酸序列如下所示。

SEQ ID NO:11的核酸14-250形成SV40聚腺苷。核酸643-1297形成复制起点。核酸1438-2413编码β-内酰胺酶。核酸2932-3706形成CMV启动子。核酸3722-3826编码HJV前导序列。核酸3827-4918编码人HJV。核酸4919-4933编码甘氨酸间隔子。核酸4934-5629编码IgGFc。SEQ ID NO:11示意性示于图中。

根据某些实施方式，本公开的融合蛋白必须形成二聚体。某些实施方式中，融合蛋白形成二聚体但不形成更高级别的聚合体如四聚体、六聚体、八聚体等。这些更高级别的聚合可影响融合蛋白的可溶性及其治疗有效性。

定义

除非另有定义，本公开上下文所用的科技术语应具有本领域一般技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。一般而言，涉及到本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、及蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交时所用的命名以及技术是本领域公知和常用的那些。用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成、和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)。酶学反应和纯化技术根据生产商说明书或者如本领域通常完成的那样或如本文所述来进行。本文描述的组合物和方法的实施，除非另有具体的相反说明，将采用病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，这些方法在本领域技术范围内，并且出于阐释的目的，下文描述了其中的很多方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，例如，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版，1989)；Maniatis等，《分子克隆：实验室手册》(1982)；《DNA克隆：实用方法》(DNA Cloning:A Practical Approach)，vol.I&II(D.Glover,编辑)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.Hames&S.Higgins编辑，1985)；《转录和翻译》(Transcription and Translation)(B.Hames&S.Higgins编辑，1984)；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)(R.Freshney编辑，1986)；Perbal,《分子克隆实用指导》(APractical Guide to Molecular Cloning)(1984)。

涉及到本文所述的分析化学、合成有机化学、和医药化学所用的命名以及实验程序和技术是本领域公知和常用的那些。用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配方、和递送、以及患者治疗。

以下术语对于理解本公开是有用的：

为治疗感染的目的，“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物、或宠物，诸如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选地，哺乳动物是人。

“治疗”或“改善”既指治疗性治疗也指预防性或防止性措施；其中目的是预防或减缓(减少)目的病理状况或疾病。需要治疗的包括已经患有疾病的以及易于患有疾病的或要预防疾病的那些。如果在根据本公开方法接受治疗量的抗体之后，对象或哺乳动物显示出以下一种或多种的可观察到的和/或可检测到的减少或消失，则该患者的感染被成功“治疗”：感染的细胞数目的减少或感染的细胞的消失；被感染的总细胞的百分比的减少；和/或与特定感染相关的一种或多种症状在某种程度上的缓解；发病率和死亡率的减少，以及生命问题质量的改善。用于评价成功治疗和疾病改善的上述参数可容易地用医师熟悉的常规方法检测。

术语“治疗有效量”指组合物的量能够有效“治疗”对象或哺乳动物的疾病或紊乱。参见前述“治疗”的定义。

“慢性”给药指以连续的方式给予(一种或多种)药物而非以急性的方式给药，从而使初始的治疗效果(活性)维持较长的时间。“间歇”给药是指治疗不是没有间断的连续进行，而是具有周期性的特点。

本文所用的“载体”包括药学上可接受的载体、辅料、或稳定剂，它们在所用的剂量和浓度对暴露于它们的细胞或哺乳动物没有毒性。通常，生理学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化物包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其他的糖类包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM聚乙二醇(PEG)，和PLURONICS^TM。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可交换使用，指单链或双链RNA、DNA、PNA、或混合聚合物。多核苷酸可包括基因组序列、额外的基因组(extra-genomic)序列和质粒序列，以及表达或可能经改变而表达多肽的更小的工程化基因片段。

“分离的核酸”是与在自然状态下与天然序列相伴的其它基因组DNA序列以及蛋白或复合体诸如核糖体和聚合酶基本分离的核酸。该术语包括已从其自然存在环境移出的核酸序列，并包括重组或克隆的DNA分离物以及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这是指最初分离的核酸，不排除后面人工添加到分离的核酸的基因或序列。

术语“多肽”以其通常含义使用，即，以氨基酸序列的形式使用。多肽不限于特定长度的产物。肽、寡肽、和蛋白包括在多肽的定义内，除非另有具体说明，这些术语在本文可互换使用。同样，该术语不涉及或不排除多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域所知的其它修饰，不管是自然存在的还是非自然存在的。多肽可以是整个蛋白或者它的亚序列。本公开上下文中感兴趣的特定多肽是包含CDR并能够结合抗原或A型流感感染的细胞的氨基酸亚序列。

“分离的多肽”是已经被鉴定并从其自然环境的成分分离和/或回收的多肽。优选实施方式中，分离的多肽将(1)被纯化至按多肽重量计大于95％(由Lowry法测定)，最优选按重量计大于99％，(2)被纯化至使用旋转杯测序仪(spinning cup sequenator)足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过SDS-PAGE用考马斯蓝或优选银染在还原或非还原条件下被纯化至同质。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为多肽自然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常而言通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。

“天然序列”多核苷酸是具有与来源于自然界的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是具有与来源于自然界(例如，来自任何物种)的多肽(例如，抗体)相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列多核苷酸和多肽可以从自然界中分离，或可以通过重组或合成手段制备。

作为本文中使用的术语，多核苷酸“变体”是典型地与本文具体公开的多核苷酸的差别在于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入的多核苷酸。这种变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰本公开的多核苷酸序列中的一个或多个并且如本文所述和/或使用本领域中公知的多种技术的任一种来评价所编码的多肽的一种或多种生物活性。

作为本文中使用的术语，多肽“变体”是典型地与本文具体公开的多肽的差别在于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入的多肽。这种变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰本公开的上述多肽序列中的一个或多个并且如本文所述和/或使用本领域中公知的多种技术的任一种来评价多肽的一种或多种生物活性。

修饰可以在本公开的多核苷酸和多肽的结构中作出，并且仍然获得功能分子，所述功能分子编码具有所需特性的变体或衍生物多肽。当需要改变多肽的氨基酸序列以产生本公开的多肽的等价(甚或改进)变体或一部分时，本领域技术人员将典型地改变编码DNA序列的一个或多个密码子。

例如，在其结合其他多肽(例如，抗原)或细胞的能力没有显著损失的条件下，蛋白结构中的某些氨基酸可以被置换为其他氨基酸。由于是蛋白的结合能力和特性确定该蛋白的生物功能活性，因此某些氨基酸序列置换可以在蛋白序列中并且当然可以在其相关的DNA编码序列中作出，并且仍然获得具有类似特性的蛋白。因此考虑在其生物效用或活性没有明显损失的条件下，可以在公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中作出多种改变。

在许多情况下，多肽变体将含有一个或多个保守置换。“保守置换”是其中一个氨基酸被置换为具有类似特性的另一个氨基酸，使得肽化学领域中的技术人员能够预期基本上不会改变多肽的二级结构和亲疏水性(hydropathic nature)。

本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲疏水性指数或评分的其他氨基酸置换并且仍然产生具有类似生物活性的蛋白，即，仍然获得生物功能等价蛋白。在作出这些改变时，优选其亲疏水性指数在±2内的氨基酸的置换，特别优选在±1内的那些，并且甚至更优选在±0.5内的那些。在本领域中还能够理解，可以基于亲水性有效地作出类似氨基酸的置换。美国专利4,554,101描述，蛋白的最大局部平均亲水性(受其邻近氨基酸的亲水性支配)与蛋白的生物特性相关。

如上所概述，因此氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等等。将一种或者多种前述特征考虑在内的示例性置换是本领域技术人员所公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

氨基酸置换可以进一步基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来作出。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；含有不带电荷的极性头基并具有相似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守改变的其他组的氨基酸包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还可以，或备选地，包含非保守改变。优选实施方式中，变体多肽与天然序列的差别在于5个氨基酸或更少的置换、缺失或添加。变体还可以(或备选地)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构和亲疏水性质影响极小的氨基酸的缺失或添加来修饰。

多肽可以包含蛋白质的N末端处的信号(或前导)序列，其共翻译时或在翻译后引导蛋白的迁移。多肽还可以与连接子或其他序列缀合以易于多肽合成、纯化或鉴定(例如，聚His)，或增强多肽与固相载体的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区缀合。

用于比较的序列最优比对可以使用生物信息学软件的Lasergene套件(Lasergenesuite of bioinformatics software)(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序使用缺省参数来进行。此程序体现了下列参考文献中所述的几种比对方案：Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detectingdistant relationships(蛋白进化变化模型-用于检测疏远关系的矩阵)。Dayhoff，M.O.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白序列和结构图集)，NationalBiomedical Research Foundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，345-358页；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes(比对和种系发生的统一方法)626-645页，Methods in Enzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor 11：105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)Numerical Taxonomy-thePrinciples and Practice of Numerical Taxonomy(数值分类学-数值分类学的原理和实践)，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.，Sci.USA 80：726-730。

或者，用于比较的序列最优比对可以通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math2：482的局部同一性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同一性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件包，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，WI中的GAP，BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)，或通过目测来进行。

适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别记载在Altschul等(1977)Nucl.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。可以使用BLAST和BLAST 2.0，例如采用本文所述的参数，来确定本公开的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。公众可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)获得用于进行BLAST分析的软件。

“同源性”是指在比对序列和引入空位(如果需要)来达到最大百分比同源性后，多核苷酸或多肽序列变体中与非变体序列相同的残基百分比。具体实施方式中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的多核苷酸或多肽同源性。

“载体”包括穿梭和表达载体。典型地，质粒构建体还包含分别用于细菌中质粒的复制和选择的复制起点(例如，ColE1复制起点)和选择标记(例如，氨苄青霉素或四环素抗性)。“表达载体”是指含有用于在细菌或真核细胞中表达抗体(包括本公开的抗体片段)的必需控制序列或调控元件的载体。下文公开了合适的载体。

术语“变体”指其中与蛋白或肽的氨基酸序列相比存在一个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入的蛋白或多肽，其包括蛋白或肽的自然存在的等位基因变体或可变剪接变体。术语“变体”包括用类似的或相似的氨基酸(一个或多个)或非类似氨基酸(一个或多个)置换肽序列中的一个或多个氨基酸。优选的变体包含在一个或多个氨基酸位置的丙氨酸置换。其他优选的置换包括对蛋白的总净电荷、极性或疏水性影响很小或无影响的保守置换。上文说明了保守置换。

其他变体可由保守性更小的氨基酸置换组成，如选择在对维持以下方面的作用上差别更显著的残基：(a)置换区域的多肽骨架的结构，例如以片层或螺旋构象形式，(b)分子在目标位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。通常预期对功能具有更显著影响的置换为：(a)其中甘氨酸和/或脯氨酸被另一氨基酸置换，或缺失或被插入；(b)亲水性残基(例如，丝氨酰或苏氨酰)置换(或被置换为)疏水性残基(例如，亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰)；(c)半胱氨酸残基置换(或被置换为)任何其他残基；(d)具有正电侧链的残基(例如，赖氨酰、精氨酰、或组氨酰)置换(或被置换为)带负电的残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)；或(e)侧链体积较大的残基(例如，苯丙氨酸)置换(或被置换为)不具有这样侧链的残基(例如甘氨酸)。其他变体包括设计为产生新的糖基化和/或磷酸化位点(一个或多个)或设计为使已有的糖基化和/或磷酸化位点(一个或多个)缺失的那些变体。变体包括在糖基化位点、蛋白水解断裂位点和/或半胱氨酸位点的至少一个氨基酸置换。变体还包括在蛋白或肽氨基酸序列之前或之后在连接子肽上具有另外的氨基酸残基的蛋白和肽。术语“变体”还涵盖具有本公开的蛋白/肽的氨基酸序列并在该氨基酸序列的3'或5'末端或两个末端侧接有至少一个和至多25个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20)另外的氨基酸的多肽。

术语“变体”还指氨基酸序列与本公开的蛋白的氨基酸序列至少60％至99％(例如，包括60、65、70、75、80、85、90、95、98、99、或100％)相同的蛋白，通过通常用于比较两个多肽的氨基酸位置相似性的标准方法确定。可用已知方法容易地计算两个蛋白之间的相似性或同一性程度。确定同一性的优选方法被设计用于给出所测试序列之间的最大配对。用于确定同一性和相似性的方法已被编程为公众可获得的计算机程序。视具体情况，与比较蛋白或多肽相比，变体通常具有一个或多个(例如，2、3、4、5、等)氨基酸置换、缺失和/或插入。

本公开中所公开的融合蛋白的“成熟”形式是自然存在的多肽或前体形式或前体蛋白(proprotein)的产物。自然存在的多肽、前体或前体蛋白包括，但不限于，相应基因编码的全长基因产物。或者，其可定义为本文所述的开放阅读框编码的多肽、前体或前体蛋白。产物“成熟”形式的形成是由于，但不限于，在产生基因产物的细胞(例如，宿主细胞)内可能发生的一种或多种自然存在的加工步骤的结果。产生多肽或蛋白的“成熟”形式的这种加工步骤的例子包括由ORF的起始密码子编码的N末端甲硫氨酸残基的断裂，或信号肽或前导序列的蛋白水解断裂。另外如本文所用的，多肽或蛋白的“成熟”形式可由于翻译后修饰步骤而非蛋白水解断裂事件而产生。这种另外的加工包括，但不限于，糖基化、豆蔻酰化或磷酸化。一般而言，成熟的多肽或蛋白可由于运行这些加工中的仅仅一种而生成，或者由于运行任意这些加工的组合而生成。

术语“衍生物”指化学修饰的蛋白或多肽，其已通过自然过程(诸如加工和其他翻译后修饰)和/或化学修饰技术而被化学修饰，所述化学修饰技术为例如添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸和/或其他此类分子，其中所述一个或多个分子天然情况下不与野生型蛋白连接。衍生物包括盐。这些化学修饰在基础教科书中有很多描述，在专著中有更详细的描述，在诸多的研究文献中也有描述，而且这些化学修饰是本领域技术人员熟知的。应理解，在给定的蛋白或多肽中可在几个位点存在相同或不同程度的同一类型的修饰。另外，给定的蛋白或多肽可包含多种类型的修饰。修饰可发生在蛋白或多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链、以及氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价连接，血红素部分的共价连接，核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接，脂质或脂质衍生物的共价连接，磷脂酰肌醇的共价连接，交联，环化，二硫键形成，脱甲基化，形成共价交链，形成半胱氨酸，形成焦谷氨酸，甲酰化，γ-羧基化，糖基化，形成GPI锚定，羟基化，碘化，甲基化，豆蔻酰化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊烯化，外消旋化，糖基化，脂质连接，硫酸化，谷氨酸残基γ-羧基化，羟基化和ADP-核糖基化，硒化，硫酸化，转运RNA介导的向蛋白添加氨基酸，如精氨酸化，和泛素化。

术语“衍生物”包括导致蛋白或多肽变为分支或环状的(有或没有分支)化学修饰。环状、分支的和分支环状蛋白或多肽可产生于翻译后自然加工，也可完全由合成方法制备。此类衍生物的例子包括：(i)氨基末端或另一游离氨基基团的N-酰基衍生物，其中所述酰基基团可以是烷酰基(例如，乙酰基、己酰基、辛酰基)，芳酰基(例如，苯甲酰基)或保护基团诸如F-moc(芴基甲基-O--CO--)；(ii)羧基末端或另一游离羧基或羟基基团的酯；(iii)羧基末端或另一游离羧基的酰胺，通过与氨或与合适的胺反应而产生；(iv)磷酸化衍生物；(v)与抗体或其他生物配体缀合的衍生物以及其他类型的衍生物。

术语“衍生物”包括导致蛋白或多肽变为分支或环状的(有或没有分支)化学修饰。环状、分支的和分支环状蛋白或多肽可产生于翻译后自然加工，也可完全由合成方法制备。可通过常规的固相合成同时在选择用于环化的位置(诸如氨基和羧基末端)掺入合适的S被保护的半胱氨酸或高半胱氨酸残基来制备含有分子内二硫键的环状衍生物。链组装完成之后，可通过以下(1)或(2)来进行环化：(1)选择性地去除S保护基，随后在载体上氧化相应的两个游离SH官能团，以形成S--S键，然后从载体上常规地取下产物，并进行合适的纯化程序；或(2)从载体上取下肽，并进行完全的侧链脱保护，然后在高度稀释的水溶液中氧化游离的SH官能团。

可通过常规的固相合成同时在选择用于环化的位置掺入合适的氨基和羧基侧链被保护的氨基酸衍生物来制备含有分子内酰胺键的环状衍生物。可通过常规的固相合成同时在选择用于环化的位置掺入具有合适的氨基被保护的侧链的氨基酸残基以及合适的S保护的半胱氨酸或高半胱氨酸残基来制备含有分子内--S--烷基键的环状衍生物。

可用相同类型的D-氨基酸系统性置换共有序列的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸置换L-赖氨酸)以产生更稳定的肽。因此，本公开的肽衍生物或拟肽(peptidomimetic)可以为全L肽、全D肽或为混合型D,L肽。优选实施方式中，肽由全部D-氨基酸组成。N-末端或C-末端的D-氨基酸的存在增加了肽的体内稳定性，因为肽酶不能利用D-氨基酸作为底物。

在肽的亚序列中用非天然氨基酸置换天然氨基酸也可赋予对蛋白水解的抗性。例如，这种置换可赋予对作用于N-末端的外肽酶(exopeptidases)蛋白水解的抗性。对此类置换已有描述，这些置换不影响生物活性。非天然存在的氨基酸的例子包括α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、C-α-甲基氨基酸、和β-甲基氨基酸。可用于本公开的氨基酸类似物可包括但不限于β-丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、4-氨基丁酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、环己基丙氨酸、2-氨基异丁酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、邻-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸和其他非常规氨基酸。而且，带有非天然氨基酸的肽的合成在本领域是常规的和已知的。

赋予对作用于肽的N-末端或C-末端残基的肽酶的抗性的另一种有效方式是在肽末端添加化学基团，从而经修饰的肽不再是肽酶的底物。一种此类化学修饰是在肽的一个或两个末端的糖基化。某些化学修饰，尤其是N-末端糖基化，已显示会增加肽在人血清中的稳定性。增加血清稳定性的其他化学修饰包括但不限于添加由1至20个碳的低级烷基组成的N-末端烷基基团，如乙酰基，和/或添加C-末端酰胺或取代的酰胺基。具体地，本公开包括由带有N-末端乙酰基和/或C-末端酰胺基的肽组成的修饰的肽。

术语“肽模拟物”或“模拟物”指模仿了肽或蛋白的生物活性但其化学性质不再具有肽性(即，它们不再含有任何肽键(即，氨基酸之间的酰胺键))的生物活性化合物。本文中，术语肽模拟物以其较广的含义使用，包括性质上不再完全是肽性的分子，诸如伪肽、半肽和类肽。这种较广含义上的肽模拟物的例子(其中肽的一部分被缺少肽键的结构置换)描述于下文。不管是完全非肽还是部分非肽，根据本公开实施方式的肽模拟物都提供了反应性化学部分的空间排列，该空间排列非常类似于作为肽模拟物的基础的肽中的活性基团的三维排列。由于这种类似的活性位点几何学，肽模拟物对生物系统的作用与肽的生物活性类似。

肽模拟物包括反向-D肽，反向-D肽含有相对于含有L-氨基酸的肽以反向顺序排列的D-氨基酸。例如，L-氨基酸肽的C-末端残基变为D-氨基酸肽的N-末端，等等。理想地，反向-D肽保持了与L-氨基酸肽同样的三级构象，并因此保持了同样的活性，但是理想地对体外和体内的酶降解更加稳定，并可因此具有比原始的肽更大的疗效(Brady and Dodson,Nature 368:692-693,1994；Jameson and McDonnel,Nature 368:744-746,1994)。肽模拟物因此包括反向-L肽，其含有相对于母肽以反向顺序排列的L-氨基酸。母肽的C-末端残基变为反向-L肽的N-末端，等等。

实施方式中的肽模拟物优选在三维形状和生物活性上与本文描述的肽基本类似。本领域已知的在结构上修饰肽以产生肽模拟物的方法的例子包括导致D-氨基酸残基结构的骨架手性中心的反转，这可(尤其在N-末端)导致对蛋白水解降解的稳定性增强，而对活性没有不利影响。第二种方法是为了稳定而改变环状结构，诸如N到C链间酰亚胺和内酰胺。这种改变的一个例子见于构象受限制的(conformationally restricted)胸腺喷丁(thymopentin)类化合物，诸如美国专利4,457,489公开的那些，该专利的公开内容通过引用以其全文纳入本文。第三种方法是用伪肽键置换肽中的肽键，伪肽键赋予了对蛋白水解的抗性。

肽模拟物可包含在模拟物的一个或两个末端的保护基团，或包含一个或多个肽键的非肽键置换，这样的肽模拟物相对于肽本身对蛋白水解断裂更不敏感。例如，可用替代类型的共价键(例如碳--碳键或酰基键)置换一个或多个肽键。肽模拟物也可包含氨基末端或羧基末端保护基团，诸如叔丁氧羰基、乙酰基、烷基、琥珀酰基、甲氧基琥珀酰基、环庚基、己二酰基、壬二酰基(azelayl)、丹酰基、苄氧羰基、芴甲氧羰基、甲氧基壬二酰基、甲氧基己二酰基、甲氧基环庚基、和2,4-二硝基苯基，从而使模拟物对蛋白水解更不敏感。非肽键和羧基或氨基末端保护基团可单独使用或组合使用以使模拟物比相应的肽对蛋白水解更不敏感。此外，可用D-氨基酸置换一般的L-立体异构体，例如，以增加分子的半衰期。因此，肽模拟物包括具有一个或多个以下修饰的肽：所述肽中一个或多个肽[--C(O)NR--]键合(键)已经被非肽键合置换，所述非肽键合诸如--CH₂–氨基甲酸酯键合[--CH₂--OC(O)NR--]、膦酸酯键合、--CH₂–磺酰胺[--CH₂--S(O)₂NR--]键合、脲[--NHC(O)NH--]键合、--CH₂–仲胺键合、或烷基化的肽键合[--C(O)NR⁶–其中R⁶是低级烷基]；所述肽中N-末端衍生为--NRR¹基团，衍生为--NRC(O)R基团、衍生为--NRC(O)OR基团、衍生为--NRS(O)₂R基团、衍生为--NHC(O)NHR基团，其中是R和R¹是氢或低级烷基，条件是R和R¹不都是氢；所述肽中N-末端衍生为琥珀酰亚胺基团、衍生为苄氧羰基-NH--(CBZ--CH--)基团，或衍生为在苯环上有1至3个取代基的苄氧羰基-NE--基团，所述取代基选自低级烷基、低级烷氧基、氯和溴；或肽中的C末端衍生为--C(O)R²，其中R²选自低级烷氧基和--NR³R⁴，其中R³和R⁴独立地选自氢和低级烷基。

优选的模拟物中，肽的零个至所有的--C(O)NH--键合被选自以下的键合置换：--CR₂OC(O)NR--键合；膦酸酯键合；--CH₂S(O)₂NR--键合；--CH₂NR--键合；--C(O)NR⁶--键合，--NHC(O)NH--键合，其中R是氢或低级烷基，R⁶是低级烷基，并且其中模拟物的N-末端选自：--NRR¹基团；--NRC(O)R基团；--NRC(O)OR基团；--NRS(O)₂R基团；--NHC(O)NHR基团；琥珀酰亚胺基团；苄氧羰基-NH--基团；以及在苯环上有1至3个取代基的苄氧羰基-NH--基团，所述取代基选自低级烷基、低级烷氧基、氯和溴，其中R和R¹独立地选自氢和低级烷基，并且其中模拟物的C-末端具有式--C(O)R²，其中R²选自羟基、低级烷氧基和--NR³R⁴，其中R³和R⁴独立地选自氢和低级烷基，并且其中--NR³R⁴基团的氮原子可任选地为肽N末端的胺基团从而形成环肽，以及它们生理学上可接受的盐。

术语“片段”或“亚序列”指由蛋白或肽的氨基酸序列的连续亚序列组成的蛋白或多肽，包括天然存在的片段如剪接变体和由天然发生的体内蛋白酶活性产生的片段。这些片段可在氨基末端、羧基末端、和/或内部(如通过自然剪接)被截断。这些片段可制备为具有或不具有氨基末端甲硫氨酸。术语“片段”包括来自同一蛋白或肽的片段，它们可以相同或不同，具有或不具有共同的连续氨基酸序列，被直接连接在一起或通过连接子连接在一起。这些片段可包含至少3个与本公开的氨基酸序列相同的连续氨基酸。

词组“药学上可接受的”或“治疗上可接受的”指生理学上耐受的分子实体和组合物，优选当给予人时通常不产生变态或类似的不利反应，如胃部不适、头晕等。优选地，对于在动物以及更具体地在人中的使用，如本文所用，术语“药学上可接受的”表示得到了联邦或州政府管理部门的批准或列在《美国药典》(U.S.Pharmacopeia)或其他通常认可的药典(例如，《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences))中。

当词语“a/an(一)”在权利要求和/或说明书中与“包含”结合使用时，可表示“一”，但也与“一或多”、“至少一”、和“一或多于一”的含义一致。

贯穿本申请，术语“约”用于表示，数值包含用于测定该数值的装置或方法的误差标准偏差(the standard deviation of error)。

铁代谢疾病

可用本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物治疗和/或预防的状况包括与铁代谢中的扰动(perturbations)相关的任何疾病、紊乱、或症状。铁代谢中的扰动可与铁摄入、铁吸收、铁转运、铁存贮、铁加工、铁动员、和铁利用中的一种或多种中的扰乱有关。一般，铁代谢中的扰动导致铁超负荷、铁分布不均或铁缺乏。

与铁超负荷相关的状况包括原发性和继发性铁超负荷疾病、症状或紊乱，包括但不限于遗传性血色素沉着病、迟发性皮肤卟啉症、遗传性球形红细胞增多症、低色素性贫血、高促红细胞生成素性贫血(hypererythropoietic anemia)(CDAI)、面生殖发育异常(faciogenital dysplasia)(FGDY)、奥斯科格(Aarskog)综合征、缺转铁球蛋白血症、铁粒幼细胞性贫血(SA)、吡哆醇反应性铁粒幼细胞性贫血、以及血红蛋白病如地中海贫血和镰状细胞。一些研究表明了铁代谢紊乱(如地中海贫血和血色素沉着病)与多种疾病状态(如II型(非胰岛素依赖型)糖尿病和动脉粥样硬化)之间的关联(A.J.Matthews等,J.Surg.Res.,1997,73:3540；T.P.Tuomainen等,Diabetes Care,1997,20:426-428)。

与铁缺乏和/或铁分布不均相关的疾病包括但不限于，慢性疾病贫血、炎症性贫血、缺铁性贫血、功能性铁缺乏、和小细胞性贫血。术语“慢性疾病贫血”或“炎症性贫血”指由于长期感染、炎症、肿瘤疾病等而引起的任何贫血。这种引起的贫血通常特征为红血球生命期缩短以及铁在巨噬细胞中的隔离(sequestration)，导致可用于制造新的红血球的铁数量减少。与慢性疾病贫血或炎症性贫血相关的状况包括但不限于慢性肾脏疾病、终末期肾脏病、肿瘤疾病、慢性细菌性心内膜炎、骨髓炎、风湿热、和溃疡性结肠炎。其他状况包括与感染、炎症、和肿瘤相关的其他疾病和紊乱，例如炎症感染(例如，肺脓肿、肺结核等)，炎症性非感染疾病(例如，类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病、肝炎、炎症性肠疾病等)，以及各种癌症、肿瘤、和恶性肿瘤(例如，癌、肉瘤、淋巴瘤等)。可导致缺铁性贫血的状况如怀孕、月经、婴儿和儿童、由于伤害导致失血等。

也已表明铁代谢在多种其他疾病状态中发挥作用，所述其他疾病状态包括心血管疾病(例如充血性心力衰竭)、阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、和某些类型的结直肠癌(参见，例如P.Tuomainen等,Circulation,1997,97:1461-1466；J.M.McCord,Circulation,1991,83:1112-1114；J.L.Sullivan,J.Clin.Epidemiol.,1996,49:1345-1352；M.A.Smith等,Proc.Nat.Acad.Sci.,1997,94:9866-9868；P.Riederer等,J.Neurochem.,1989,512:515-520；P.Knekt等,Int.J.Cancer,1994,56:379-382)。

癌症

已显示，>800个妇女的乳腺癌基因表达谱表明，降低的膜铁转运蛋白(ferroportin)基因表达与无转移的、疾病特异性存活的显著下降相关，所述存活独立于其他乳腺癌风险因子。(Pinnix等Science Translational Medicine 2(43):1-10(August2010))。膜铁转运蛋白高表达和铁调素(hepcidin)基因低表达鉴别了一组情况非常有利的乳腺癌患者，他们的10年存活率>90％。因此，给予HJV.Fc以在癌症患者包括但不限于乳腺癌患者中降低BMP信号转导并因此降低铁调素基因表达并提高膜铁转运蛋白水平，应该获得无转移的、疾病特异性存活的显著下降。

药物组合物

本公开涉及用于治疗、预防和改善铁稳态疾病的方法。本公开的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物可用于治疗与铁稳态相关的状况或疾病。

因此，本公开的方法包括给予有需要的对象或处于有需要的风险中的对象有效量的一种或多种本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物，或包含本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物的一种或多种的组合物，以动员铁并增加血清血红蛋白和/或血细胞比容水平。一种实施方式中，将有效量的包含本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物中的一种或多种以及合适的药学载体的治疗组合物给予对象，以动员铁并增加血清血红蛋白和/或血细胞比容水平，以预防或改善与铁稳态相关的症状或治疗与铁稳态相关的紊乱、疾病或状况。一种实施方式中，所述对象是动物。另一种实施方式中，所述对象是哺乳动物，优选人。

本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物用于治疗、预防或改善任何疾病状况或紊乱中的症状，其中所述疾病状况或紊乱中动员铁和增加血清血红蛋白和/或血细胞比容水平可能是有益的。

本公开范围内的组合物应包含活性物质(例如本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物中的一种或多种)，所述活性物质的量可有效实现所需的治疗效果而避免不良副作用。活性物质的药学上可接受的制备物和盐在本公开范围内并且是本领域公知的。对于施用多肽拮抗剂等，应选择给药的量以避免不良副作用。有效治疗特定疾病、紊乱或状况的治疗组合物或药物组合物的量将取决于疾病的性质、严重程度、作用的靶位点、患者体重、患者遵守的特别食谱、同时应用的药物、给药途径和本领域技术人员认可的其他因素。剂量将由临床医生根据常规因素诸如疾病程度和该患者的不同参数来调整。通常，将给予对象0.001至100mg/kg，每周两次。优选地，给予对象10至30mg/kg，每周两次。一种具体实施方式中，给予对象20mg/kg，每周两次。可由来自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推算有效剂量。例如，为了基于由大鼠研究产生的数据而获得用于人的有效mg/kg剂量，将大鼠中的有效mg/kg剂量除以六。

已知多种递送系统，它们可用于本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物或含有这些融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物的药物组合物的给药。本公开的药物组合物可用任何合适的途径给药，包括静脉或肌内注射、脑室内或鞘内注射(用于中枢神经系统给药)、口服、局部、皮下、结膜下、或通过鼻内、皮内、舌下、阴道、直肠或硬膜外途径。优选给药途径是静脉给药。

可用本领域公知的其他递送系统来递送本公开的药物组合物，例如通过水溶液、封装在微粒中、或微囊。

在仍然另一种实施方式中，本公开的药物组合物可在控释系统中递送。一种实施方式中，可使用聚合物材料，另一种实施方式中，可使用泵。

如上所述，本公开的药物组合物包含一种或多种本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物并组合有药学上可接受的载体。术语载体指稀释剂、佐剂和/或辅料如填充剂，粘合剂、崩解剂、润滑剂、二氧化硅流动调节剂、稳定剂或运载体，肽、肽衍生物或拟肽与所述载体一起给药。这些药学载体包括无菌液体，例如水和油包括矿物油、植物油(例如，花生油、大豆油、芝麻油、和油菜籽油)，动物油或合成来源的油。甘油水溶液和葡萄糖水溶液以及盐水溶液也可用作本公开的药物组合物的液体载体。当然，载体的选择取决于肽、肽衍生物或拟肽的性质、其溶解度和其他生理学特性以及递送和施用的靶位点。合适的药物载体的例子描述于《雷明顿：药物科学和实践》(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro,2003,第21版，Mack Publishing Company。

可掺入本公开的药物制剂的其他药学上合适的材料包括吸收促进剂、pH调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、增稠剂、软化剂、分散剂、矫味剂、着色剂和润湿剂。

合适的药物辅料的例子包括、水、葡萄糖、蔗糖、乳糖、丙二醇、乙醇、甘油单硬脂酸酯、明胶、大米、淀粉、面粉、白垩、硬脂酸钠、麦芽、氯化钠等。本公开的药物组合物可以采用溶液、胶囊、片剂、霜剂、凝胶剂、粉剂、缓释制剂等等的形式。组合物可以与传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂(参见《雷明顿：药物科学和实践》、Alfonso R.Gennaro,2003,第21版、Mack Publishing Company)。这些组合物包含治疗有效量的治疗组合物，以及适量的载体以提供适于对对象给药的形式。设计配方以使其适合给药方式和作用的靶位点(例如，特定的器官或细胞类型)。

本公开的药物组合物可配方为中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括那些与游离氨基基团形成的盐以及那些与游离羧基基团反应的盐。

制药工业中常用的无毒的碱金属、碱土金属和铵的盐，包括钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵、和鱼精蛋白锌的盐，用本领域公知方法制备。该术语还包括无毒的酸加成盐，通常是通过将本公开的化合物与合适的有机酸或无机酸反应来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、戊酸盐、草酸盐、油酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、乙酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐(tysolate)、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、萘磺酸盐等。

可根据本公开使用的填充剂或粘合剂的例子包括阿拉伯胶、藻酸、磷酸钙(二碱价)、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、糊精、葡萄糖酸(dextrates)、蔗糖、tylose、预胶化淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、膨润土、麦芽糖、山梨醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸钠、聚乙烯醇、明胶、葡萄糖、瓜尔胶、液体葡萄糖、可压缩糖、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、藻酸钠、黄蓍胶、微晶纤维素、淀粉、玉米醇溶蛋白(zein)。另一个最优选的填充剂或粘合剂包括微晶纤维素。

可以使用的崩解剂的例子包括藻酸、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素(低取代度)、微晶纤维素、粉状纤维素、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、甲基纤维素、波拉克林钾(polacrilin potassium)、聚维酮、藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠、淀粉、偏重亚硫酸钠(disodium disulfite)、乙二胺四乙酸二钠(disodium edathamil)、乙二胺四乙酸二钠(disodium edetate)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)交联的聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、羧甲基淀粉、羧甲基淀粉钠和微晶纤维素。

润滑剂的例子包括硬脂酸钙、油菜籽油、硬脂酸棕榈酸甘油酯、氢化植物油(I型)、氧化镁、硬脂酸镁、矿物油、泊洛沙姆、聚乙二醇、月桂基硫酸钠、硬脂富马酸钠、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸锌、behapate甘油酯(glyceryl behapate)、月桂基硫酸镁、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、苯甲酸钠/醋酸钠(组合)和DL亮氨酸。

二氧化硅流动调节剂的例子包括胶体二氧化硅、硅酸镁铝、和瓜耳胶。另一个最优选的二氧化硅流动调节剂包含二氧化硅。

稳定剂的例子包括阿拉伯胶、白蛋白、聚乙烯醇、藻酸、膨润土、磷酸二钙、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、胶体二氧化硅、环糊精、单硬脂酸甘油酯、羟丙基甲基纤维素、三硅酸镁、硅酸镁铝、丙二醇、藻酸丙二醇酯、藻酸钠、巴西棕榈蜡、黄原胶、淀粉、硬脂酸酯(类)、硬脂酸、硬脂酸单甘油酯、和硬脂醇。

本公开还提供肽或肽衍生物的修饰从而它们一旦给予对象后会更加稳定(即，一旦给药后与未修饰形式相比具有更长的半衰期或更长的有效时间)。这些修饰是本公开相关领域的技术人员熟知的(例如聚乙二醇衍生又名PEG化、微胶囊化等)。

筛选方法

本公开提供筛选化合物(例如，HJV-IgG融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物)的方法，所述化合物改变哺乳动物对象的血清铁、血清血红蛋白和/或血细胞比容水平。根据一些实施方式，提供筛选化合物的方法，所述化合物在哺乳动物对象中动员铁和血清血红蛋白和/或血细胞比容水平(例如，增加或减少)。

另一种实施方式中，本公开提供筛选化合物的方法，其中筛选能够特异性结合BMP-6的化合物。具体实施方式中，筛选能够以K_D至少10^-5、10^-6、10^-7、10^-8 10^-9、10^-10、10^-11或10^-12M结合BMP-6的本公开组合物。另一种实施方式中，本公开提供筛选化合物的方法，其中筛选能够抑制BMP-6信号转导的化合物。具体实施方式中，筛选能够将BMP-6信号转导抑制至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、97、99或100％的组合物。

重组表达载体和宿主细胞

本公开的另一方面涉及载体，优选表达载体，所述载体含有编码本公开的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物的核酸。如本文所用，术语“载体”指能够运输其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指线性或环状的双链DNA环，其中连接了另外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA片段连接入病毒基因组。某些载体能够在其进入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型(episomal)哺乳动物载体)。其他载体(非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合入宿主细胞基因组，因此随着宿主基因组复制。而且，某些载体能够指导与其可操作性连接的基因的表达。这些载体在本文称为“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体常为质粒的形式。本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本公开意欲包括发挥等同功能的其他形式的表达载体诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本公开的重组表达载体包含本公开的核酸，载体的形式适于在宿主细胞中表达所述核酸，即重组表达载体包含一个或多个调控序列(根据用于表达的宿主细胞来选择)，所述调控序列可操作性连接于要表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作性连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达的形式(例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)连接于调控序列(一个或多个)。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于例如Goeddel；《基因表达技术：酶学方法185》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODSIN ENZYMOLOGY 185),Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。调控序列包括指导核苷酸序列在多种类型的宿主细胞中组成型表达的那些以及仅指导核苷酸序列在某些宿主细胞中表达的那些(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员理解，表达载体的设计可取决于诸如所选的将转化的宿主细胞、所需的蛋白表达水平等因素。本公开的表达载体可引入宿主细胞中，从而产生由本文所述的核酸编码的本公开的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物。

可设计本公开的重组表达载体以在原核或真核细胞中表达本公开的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物。例如，可在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达本公开的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物。在Goeddel，《基因表达技术：酶学方法185》,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中对合适的宿主细胞有进一步的讨论。或者，可在体外转录和翻译重组表达载体，例如用T7调控序列和T7聚合酶体外转录和翻译重组表达载体。

原核生物中蛋白的表达最常在大肠杆菌中使用含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体进行。融合载体将若干氨基酸添加到在其中编码的蛋白上，通常添加到重组蛋白的氨基末端。这种融合载体通常实现三个目的：(1)增加重组蛋白的表达；(2)增加重组蛋白的溶解性；和(3)通过作为亲和纯化中的配体来辅助重组蛋白纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的结合处引入蛋白水解断裂位点以使融合蛋白在纯化后重组蛋白能够与融合部分分离。此类酶以及它们的同源识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶(enterokinase)。典型的融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotech Inc；Smith and Johnson(1988)Gene 67:31 40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，它们分别将谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A融合至靶重组蛋白。

合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amrann等,(1988)Gene69:301 315)和pET 11d(Studier等,《基因表达技术：酶学方法185》，Academic Press,SanDiego,Calif.(1990)60 89)。

使大肠杆菌中重组蛋白表达最大的一个策略是，在对重组蛋白的蛋白水解断裂能力弱化的宿主细菌中表达蛋白。参见，Gottesman,《基因表达技术：酶学方法185》,AcademicPress,San Diego,Calif.(1990)119 128。另一个策略是改变待插入到表达载体中的核酸的核酸序列，从而每个氨基酸的各密码子是大肠杆菌中优先使用的那些(Wada等,(1992)Nucleic Acids Res.20:211:1-7,10-13、19-34、45-53、58-85、111-113、120、130、132-134和13518)。本公开中核酸序列的这种改变可通过标准的DNA合成技术来进行。

另一种实施方式中，用于本公开的组合物的表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari,等,(1987)EMBO J 6:229 234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz,(1982)Cell 30:933943)、pJRY88(Schultz等,(1987)Gene 54:113 123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)、和picZ(InVitrogen Corp,San Diego,Calif.)。

或者，可在昆虫细胞中用杆状病毒表达载体表达本公开组合物。用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol CellBiol 3:2156 2165)和pVL系列(Lucklow and Summers(1989)Virology 170:31 39)。

在仍然另一种实施方式中，在哺乳动物细胞中用哺乳动物表达载体表达本公开的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329:840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J 6:187 195)。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的控制功能通常由病毒调控元件提供。例如，通常使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猴病毒40。用于原核和真核细胞的其他合适的表达系统，参见例如Sambrook等,《分子克隆：实验手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.,1989，第16和17章。

另一种实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸在特定细胞类型中优先表达(例如，组织特异性调控元件用于表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性例子包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等(1987)Genes Dev 1:268 277)、淋巴特异性启动子(Calame and Eaton(1988)Adv Immunol 43:235 275)、尤其是T细胞受体(Winoto and Baltimore(1989)EMBO J 8:729 733)和免疫球蛋白(Banerji等(1983)Cell33:729 740；Queen and Baltimore(1983)Cell 33:741 748)的启动子、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne and Ruddle(1989)PNAS 86:5473 5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等(1985)Science 230:912 916)、和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲专利申请公开号264,166)。还涵盖发育调控的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel and Gruss(1990)Science 249:374 379)和α-胎蛋白启动子(Campes and Tilghman(1989)Genes Dev 3:537546)。

本公开还提供重组表达载体，所述重组表达载体包含以反义方向克隆入表达载体的本公开DNA分子。即，该DNA分子以允许RNA分子表达(通过DNA分子转录)的方式可操作性连接于调控序列，所述RNA分子与本公开融合蛋白的mRNA是反义的。可以选择指导反义RNA分子在多种细胞类型中的连续表达的可操作性连接于以反义方向克隆的核酸的调控序列，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异型或细胞类型特异型表达的调控序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或弱化病毒的形式，其中反义核酸在高效调控区的控制下产生，该高效调控区的活性可由引入该载体的细胞的类型决定。对于用反义基因进行基因表达调控的讨论，参见Weintraub等，“反义RNA作为遗传分析的分子工具(Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis)”，《综述：遗传学进展》(Reviews:Trends in Genetics)，Vol.1(1)1986。

本公开另一方面涉及已引入了本公开重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。应理解，这些术语不仅指特定的对象细胞，而且指此细胞的后代或可能的后代。由于突变和环境影响，某些改变可能在以后的世代中发生，因此这些后代实际上可能与母细胞不同，但这些后代仍然包括在本文所用术语的范围内。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，可在细菌细胞诸如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达本公开的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。优选实施方式中，本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物在CHO细胞中表达。

可通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入到原核或真核细胞中。如本文所用，术语“转染”和“转化”意指多种本领域认可的将外源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等,(《分子克隆：实验手册》，第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.,1989)和其他实验室手册。

对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知，取决于所用的表达载体和转染技术，仅有一小部分细胞可将外源DNA整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，一般将编码选择标记(例如对抗生素的抗性)的基因和感兴趣的基因一起引入到宿主细胞中。各种选择标记包括赋予对药物如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的那些。可将编码选择标记的核酸与编码本公开组合物的核酸在同一载体上引入宿主细胞，或者将编码选择标记的核酸在不同的载体上引入宿主细胞。可通过药物选择来鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，掺入了选择标记基因的细胞将存活下来，而其他细胞将死亡)。

本公开的宿主细胞，如培养物中的原核或真核宿主细胞，可用于产生(或表达)一种或多种本公开的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物。因此，本公开还提供用本公开的宿主细胞来生产一种或多种本公开的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物的方法。一种实施方式中，所述方法包括在合适的培养基中培养本公开的宿主细胞(其中已引入了编码本公开组合物的重组表达载体)从而产生本公开的组合物。另一种实施方式中，所述方法还包括从培养基中或宿主细胞中分离本公开的组合物。

无需赘言，相信本领域技术人员能够使用上文描述来最大程度地利用本公开。以下实施例仅为阐释性的，无论如何不以任何方式限制本公开的其他部分。

实施例

实施例1.用血幼素-Fc融合蛋白处理的贫血大鼠中血细胞比容的增加

用一剂鼠李糖以15mg/kg注射大鼠。28天后，将出现了关节肿胀、贫血和显著的白细胞增多的大鼠随机分配到三个组中的一个组。第1组中，用HJV.Fc(SEQ ID NO:9)以2mg/kg静脉注射大鼠，每周两次，共4周。第2组中，用20mg/kg HJV.Fc静脉注射处理大鼠，每周两次，共4周。第3组的大鼠未处理。

每周检测血细胞比容和血红蛋白血清浓度。在4周的终末最终取血时，测定血细胞比容、血红蛋白、血清铁、脾铁蛋白和肝脏铁调素RNA。

如图3、5和6所示，给予了高剂量HJV.Fc的贫血大鼠比未给予HJV.Fc的贫血大鼠具有显著更高的血清血细胞比容和血清血红蛋白。在4周处理的终末，给予了HJV.Fc的贫血大鼠的血清血细胞比容和血红蛋白与非贫血大鼠类似。当将来自低剂量HJV.Fc的数据加到高剂量数据时，给予了HJV.Fc的大鼠比未给予HJV.Fc的贫血大鼠具有显著更高的血清血细胞比容和血清血红蛋白(图4)。同样，在4周处理的终末，给予了HJV.Fc的贫血大鼠的血清血细胞比容和血红蛋白与非贫血大鼠类似。

实施例2.单体HJV.His与BMP-6的亲和力低

图7a显示带有HIS-标签的可溶性人血幼素与用胺耦合方法(Halbrooks 2007)固定到CM5传感器芯片上的人BMP6的结合。使用单位点单价拟合模型，获得了约33nM的K_d。图7b显示可溶性HJV.Fc蛋白也可结合到固定的人BMP6，双位点二价配合模型(以说明HJV.Fc的双硫键键合的二聚体性质)获得了初步的约13pM的K_d，该亲和力相对于单体HJV.His蛋白要高得多。因此，如图7a所示，单体HJV.His对BMP6的亲和力低。图7b中，同型二聚体对BMP有显著更高的结合亲和力。

实施例3.HJV.Fc能够以剂量依赖性方式抑制BMP6活性

如图8所示，使用基于细胞的生物抑制荧光素酶测验，HJV.Fc能够以剂量依赖性方式抑制BMP6活性。在肝癌衍生的HepG2细胞中进行的铁调素启动子荧光素酶测验如前所述进行(Babitt 2007)。对于HJV.Fc抑制测验，将用铁调素启动子荧光素酶报告基因稳定转染的HepG2细胞(细胞系C33)血清饥饿6小时，然后与100ng/ml BMP-6配体(单独地或与0.5、5或10μg/ml的HJV.Fc一起)孵育16小时。“BRX3”和“A6”是两个不同批次的HJV.Fc蛋白。而且，如图9所示，HJV.Fc可制备为基本上纯的同型二聚体蛋白制备物，如HPLC分析所显示。该分析方法包括将HJV.Fc样品注入到BioSep S3000色谱柱(Phenomenex)上，运行缓冲液为100mM磷酸钠、200mM氯化钠，pH6.0。流速是1ml/min，在280nm波长进行检测。

本申请说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用纳入本文，如同各单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用纳入本文一样。

虽然为了能清楚地理解本公开，上文以阐释和举例的方式在一定程度上进行了详细描述，但对本领域一般技术人员显而易见的是，鉴于本公开的教导，可对本公开进行某些改变和变动而不脱离所附权利要求书的精神或范围。

Claims (42)

1.组合物，该组合物包含与SEQ ID NO:9的序列95％相同的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物。

2.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物经尺寸排阻色谱确定纯度为至少98％。

3.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物是糖基化的。

4.权利要求3的组合物，其中所述糖基化模式是哺乳动物糖基化模式。

5.权利要求4的组合物，其中天冬酰胺83、天冬酰胺178和/或天冬酰胺337是糖基化的。

6.权利要求4的组合物，其中所述糖基化模式来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

7.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸是谷氨酰胺。

8.权利要求7的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸的N-末端是QCKILRCNAE(SEQ ID NO:10)。

9.权利要求1的组合物，其中SEQ ID NO:9的片段包含SEQ ID NO:9的N-末端的150个氨基酸。

10.权利要求1的组合物，其中所述组合物基本无热原。

11.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的血清半衰期是至少10小时。

12.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物以K_D至少为10^-7M结合骨形态发生蛋白-6(“BMP-6”)，并抑制BMP-6信号转导。

13.权利要求1的组合物，其中当给予所述组合物时，所述组合物增加对象的血红蛋白和/或血细胞比容。

14.权利要求1的组合物，其中当将所述组合物给予贫血对象达一个月或更长时间时，所述组合物增加所述贫血对象的血红蛋白和/或血细胞比容至至少正常水平。

15.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白形成同型二聚体。

16.权利要求15的组合物，其中所述同型二聚体在Fc铰链区内形成。

17.权利要求16的组合物，其中所述同型二聚体在Fc铰链区内的半胱氨酸之间经二硫键形成。

18.编码权利要求1的融合多肽的核酸分子。

19.权利要求18的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:11的序列95％相同的序列。

20.包含权利要求19的核酸序列的哺乳动物细胞。

21.权利要求20的哺乳动物细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

22.治疗有需要的对象的铁稳态紊乱的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的权利要求1的组合物，从而治疗铁稳态紊乱。

23.组合物，其包含融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物包含N-末端多肽和C-末端多肽，其中所述N-末端多肽包含与SEQ ID NO:1的序列95％相同的序列，并且其中所述C-末端多肽包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6和7的序列95％相同的序列。

24.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物经尺寸排阻色谱确定纯度为至少98％。

25.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物是糖基化的。

26.权利要求25的组合物，其中所述糖基化模式是哺乳动物糖基化模式。

27.权利要求26的组合物，其中所述糖基化模式来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

28.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸是谷氨酰胺。

29.权利要求28的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸的N-末端是QCKILRCNAE(SEQ ID NO:10)。

30.权利要求23的组合物，其中所述组合物基本无热原。

31.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的血清半衰期是至少10小时。

32.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物以K_D至少为10^-7M结合骨形态发生蛋白-6(“BMP-6”)，并抑制BMP-6信号转导。

33.权利要求23的组合物，其中当给予所述组合物时，所述组合物增加对象的血细胞比容。

34.权利要求23的组合物，其中当将所述组合物给予贫血对象达一个月或更长时间时，所述组合物增加所述贫血对象的血细胞比容至至少正常水平。

35.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白形成同型二聚体。

36.编码权利要求23的融合多肽的核酸分子。

37.权利要求36的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO:11的核酸序列。

38.包含权利要求36的核酸序列的哺乳动物细胞。

39.权利要求38的哺乳动物细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

40.治疗有需要的对象的铁稳态紊乱和/或改善有需要的对象的贫血的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的权利要求21的组合物，从而治疗铁稳态紊乱和/或改善贫血。

41.治疗有需要的对象的癌症的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的权利要求1的组合物，从而治疗癌症疾病。

42.治疗有需要的对象的癌症的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的权利要求23的组合物，从而治疗癌症疾病。