KR20030081371A - 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서 이형 단백질을생산하는 방법 - Google Patents

소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서 이형 단백질을생산하는 방법 Download PDF

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게르드 겔리센
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Abstract

본 발명은 사상 진균에서 이형 단백질을 생산하는 방법 및 이에 적합한 프로모터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이형 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터, 숙주세포와 킷트 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 (a) 소르다리아시애 과 진균에서 활성을 갖는 프로모터, 소르다리아시애 과 진균에서 활성을 갖는 터미네이터 및 이형 유전자를 포함하는 발현벡터를 포함하는 소르다리아시애 과 자웅동체 진균을 배양하는 단계 및 (b) 유전적으로 알려진 방법을 수행하여 생산되는 단백질을 수득하는 단계를 포함하여 소르다리아시애 과 사상 진균으로부터 이형 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서 이형 단백질을 생산하는 방법{Method for producing heterologous proteins in a homothallic fungus of the Sordariaceae family}
유전 공학적 방법은 재조합 단백질을 생산하기 위한 발현 시스템을 구축하는데 사용된다. 약 20년 동안의 전통적인 유전 공학 기술에 있어서, 다양한 미생물 또는 세포주가 숙주 시스템으로 개발되었다. 숙주를 결정하는 것은 사용의 용이성, 생산 과정에 있어서의 경제성, 적용 범위 및 생산하고자 하는 단백질의 특성에 따라 결정된다. 다양한 그람-양성 박테리아, 동물 세포 및 효모와 사상 진균을 포함한 다양한 진균이 사용되었으며, 발현 시스템으로도 사용되었다.
특히 경제적으로 중요한 점은 동물 단백질의 생산, 특히 약학적 산물로 사용되는 인간 단백질을 생산한다는 것이다. 대장균(E.coli)과 같은 박테리아 발현 시스템은 복잡한 글리코실레이션 패턴을 포함하는 단백질을 생산하는데는 용이하게 사용할 수 없다. 왜냐하면 박테리아는 상기와 같은 단백질을 분비할 수 없거나 글리코실레이션과 같은 고등 동물(진핵생물)의 분비 과정에 관여하는 폴리펩타이드의 변형을 수행할 수 없기 때문이다. 인클루전 바디(inclusion body)에 재조합 산물이 존재하게 되면 불용성 산물을 형성하게 되며 생물학적으로 불안정한 단백질이 침전되게 된다. 따라서, 외래 생성물은 강력한 변성 및 재생 방법을 통해 생물학적으로 활성의 형태를 띄는 형태로 전환되어야 한다.
즉, 동물에서의 복잡한 글리코실레이션을 필요로하는 단백질을 생산하기 위해 동물 세포가 주로 사용되었지만 동물세포 시스템은 매우 고가이며, 더불어 동물 세포는 잠재적으로 병원성 바이러스의 타겟(target)이었다. 그러나, 효모 및 사상 진균(filamentous fungi)은 동물의 복잡한 글리코실레이션 형태와는 다른 형태를 가지고 있지만 다양한 산물을 생산하는데 사용될 수 있으며, 진핵 미생물과 같이 분비를 용이하게 할 수 있고, 박테리아와 같이 높은 세포 농도에서도 값싼 배지로 발효시킬 수 있다. 따라서, 효모 및 사상 진균은 혈청 또는 다른 잠재적 부산물(contaminant)을 포함하지 않는 배양 배지를 사용하더라도 이형의 단백질을 손쉽고 값싸게 수득할 수 있다. 잘 구축된 발현 시스템의 예로는 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae)와 같은 효모 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 같은 메틸트로픽(methylotrophic) 효모가 있다.
우수한 "분비자"라고 여겨지는 사상 진균의 군 중에서 아스퍼질러스(Aspergillus) 종 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)는 이형 유전자를 발현하는데 주로 사용되었다. 그러나, 이러한 진균은 배양시에 많은 양이 생성되고 제거하기 힘든 증식형의 스포어를 갖고 있으며, 이러한 스포어가 없는 상태로 제조하기 위해서는 많은 비용이 들기 때문에 약학적 산물을 생산하는데에는 용이하게 사용하지 못하여 대부분이 기술적 효소(technical enzyme)를 산업적으로 생산하는데 사용되었다. 이에, 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)는 유성생식(sexually)(자낭홀씨(ascospore)에 의해) 및 일차적으로 무성생식(asexually)(분생홀씨(conidiospore)에 의해)을 할 수 있다.
사상 진균에서 이형 단백질을 생산하는데 있어서의 다른 문제점으로는 이형의 DNA가 진균의 게놈상에 효과적으로 삽입되기 위해서 이형 DNA를 불활성화하는 시스템이 필요하다는 것이다. 유전자를 불활성화시키는 방법에 대해서는 잘 알려져 있는데 예를 들어 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 또는 아스코볼루스 이머서스(Ascobolus immersus)의 경우 전사적 또는 후-전사적 레벨이 다른 수준으로 나타난다는 것이다. 또한, 이와 비슷한 현상은 형질전환 식물에서도 잘 나타나 있다(Cogoni and Macino (1999)).
뉴로스포라 크라사의 경우 소위 RIP라 불리는 현상이 DNA 형질전환 이후에나타나며(Singer et al., 1995; Selker, 1997), 점돌연변이 또는 메틸레이션과 같은 DNA 변형에 의해 다중 카피의 외래 DNA가 불활성화 된다. 결과적으로, 뉴로스포라 크라사에서는 이형 유전자가 감수분열 교배 후에 효과적으로 발현될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 증식형 스포어의 오염없이 이형 단백질을 효과적으로 생산할 수 있는 사상 진균에서 이형 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 사상 진균에서 이형 단백질을 생산하는 방법 및 이에 용이하게 사용될 수 있는 프로모터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벡터, 숙주 생물 뿐만 아니라 킷트 및 이들의 용도에 관한 것이다.
도 1은 노던 혼성화외 자가 방사선 사진을 나타낸다. 소르다리아 마크로스포라의 mRNA 5 ㎍이 각 레인에 로딩되어 있으며 야생형 균주의 것은 홀수 레인에, 불임의 돌연변이체inf의 것은 짝수 레인에 있다.
acl1유전자(레인 1, 레인 2),cpc2유전자(레인 3, 레인 4),ndk1유전자(레인 5, 레인 6) 및ppg1유전자(레인 7, 레인 8)가 프로브로 사용되었다. 2.7 kbacl1전사체는 레인 1 및 레인 2에서 확인할 수 있고, 1.7 kbcpc2전사체는 레인 3 및 레인 4에서 확인할 수 있으며, 1.5 kbndk1전사체는 레인 5 및 레인 6에서 0.65 kbppg1전사체는 레인 7 및 레인 8에서 확인할 수 있다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 약 1.4 kb 크기의 프로모터 부위를 포함하는 소르다리아 마크로스포라의ndk1유전자의 뉴클레오타이드 서열(부분 절편)을 나타낸다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c는 소르다리아 마크로스포라의cpc2유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 상기 염기서열로부터 유래된 아미노산 서열을 나타낸 서열도이다. 인트론 서열(4)은 밑줄로 특정화되고, 프로모터는 뉴클레오타이드 1번에서 뉴클레오타이드 2611번까지에 위치하며, 터미네이터 서열은 뉴클레오타이드 4258번에서 뉴클레오타이드 4539번의 사이 부위에서 확인할 수 있다.
도 4는 pMN110 발현 벡터의 클로닝 과정을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 pMN110 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열(프로모터 및 터미네이터)을 나타낸다. 이 서열은 소르다리아 마크로스포라의acd1유전자로부터 유래한다.
도 6은 pMN112 발현 벡터의 클로닝 과정을 나타낸다.
도 7은 pMN112 플라스미드의 물리적-유전자 맵(map)을 나타낸다.
도 8은 pSMY1-1 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 9는 pSMY1 플라스미드의lacZ유전자에 있는 ATG 시작코돈의 부위에 있는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 10은 pSMY4-1 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 11은 pSMY3 발현 벡터의 클로닝 과정이다.
도 12는 pPROM1 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 13은 pTERM1 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 14는 pSMY2 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 15는 pSMY3 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 pSMY3 플라스미드의 삽입 절편의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 17은 pSE40-6 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 18은 pSE43-2 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 19는 SE40-6 또는 pSE43-2 플라스미드를 가지고 있는 소르다리아 마크로스포라 형질전환 균주(T1p40-6, T1p43-2)의 현미경 사진을 나타낸다. (a) 간섭 현미경 사진 및 (b) 형광 현미경 사진.
도 20은 pSMY5-1 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 21은 GV-MCS 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 22는 GV-ndk1-MCS-acl1 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 23은 GC-cpc2-MCS-acl1 플라스미드의 물리적-유전자 맵을 나타낸다.
도 24는 pSM1 및 pSM2 플라스미드를 클로닝하는데 시작 플라스미드로 사용하는 pEGFP/gpd/tel 플라스미드를 나타낸다.
도 25는 pSM1 플라스미드의 클로닝하는 과정을 나타낸다.
도 26은 pSM2 플라스미드의 클로닝하는 과정을 나타낸다.
도 27은 pEGFP/gpd/tel 플라스미드를 포함하는 소르다리아 마크로스포라 형질전환체로부터 형성된 자낭홀씨(ascospores)를 가진 자낭의 형광 현미경 분석을 나타낸다. 이미지로 나타난 균주는 T-EG2로 형질전환된 소르다리아 마크로스포라 형질전환체와 스포어가 색깔을 띄는 소르다리아 마크로스포라 FUS1을 교배하여 생성된 균주이다. 후자의 균주는gfp유전자를 포함하지 않는다. 형광 현미경 사진(아래)의 판단을 위해 상응하는 가시광 현미경 사진이 위쪽에 나타나 있다.
도 28은ndk1프로모터의 조절아래 EGFP 유전자를 발현하는 소르다리아 마크로스포라 형질전환체의 현미경 사진을 나타낸다. (a) 간섭 현미경 사진 및 (b) 형광 현미경 사진.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기능적 조합에 의해 하기 요소를 포함하는 발현 카세트를 포함하고 있는 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균을 배양하는 단계;
- 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 프로모터,
- 이형 유전자 및
- 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 터미네이터
및 유전적으로 알려진 방식에 의해 생산된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 사상진균에서 이형 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "이형 유전자"는 발현 카세트에 포함되어 있는 프로모터의 다른 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 코딩하는 것을 의미한다.
소르다리아시애 과의 자웅이체 속 또는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 또는 포도스포라 안세리나(Podospora anserina)와 같은 다른 사상 진균과는 달리 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균은 유성생식을 하기 때문에 거대분생포자(macroconidia)나 최소분생포자(microconidia)를 형성하지 않는다. 또한, 하이파(hyphae)의 붕괴에 의해 형성되는 분절홀씨(arthrospore)도 생성되지 않는다. 따라서, 단백질이 증식형 스포어로 오염되게 되면 약학적으로 사용가능한 단백질을 생산하는데 큰 문제가 있기 때문에 증식형 스포어를 생산하는 사상 진균의 사용은 피해야 한다.
게다가, 놀랍게도 뉴로스포라 크라사 및 다른 사상 진균에서 나타나는 DNA 형질전환 후의 RIP 현상이 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균 특히 소르다리아 마크로스포라에서는 나타나지 않는다.또한, 소르다리아 마크로스포라는 메틸레이션 또는 점 돌연변이에 의한 불활성의 반복되는 서열의 유전적 매커니즘을 가지고 있지 않다. 결론적으로, 이형 DNA는 진균의 게놈상에 형질전환된 다음에 다중 카피로 존재하며 뉴로스포라 크라사 및 다른 사상 진균에서와는 달리 불활성화되지 않는다. 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서는 후-전사적 유전자 불활성화가 알려져 있지 않다.
소르다리아시애 과는 아스코마이세트(Ascomycetes)(sac fungi)에 속하며, 스트라스버거(Strasburger)(Lehrbuch der Botanik)에 따르면 스파에리알(Sphaeriales)(Sordariales)로 분류된다. 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균 예를 들어 소르다리아 마크로스포라의 생활 사이클은 하기와 같다; 이 진균은 배타적으로 유성생식을 하는 하플로 디카리오트(haplo dikaryote)이다. 증식형 스포어, 예를 들어 코니디오 스포어는 이 진균에서 생성되지 않는다. 이 진균은 교차의 복잡성을 가지지 않는 자웅동주(monoecious)를 가지고 있어 자가-수분(self-pollination)으로 유성생식할 수 있는 자웅동체이다(K. Esser, Cryptogamen I, 2000). 번식 과정은 자가수분(autogamous)으로 일컬어지는 유성 생식 과정을 거친다. 조낭(ascogon)에 위치하는 반수(haploid) 핵은 접합하여 분리되며, 이에 의해 이핵세포(dikaryotic)의 과정을 거치게 된다. 유성의 자낭홀씨는 자낭(asci)(sacs)에서 형성된다. 다수개(약 100개)의 자낭은 동시에 피자기(perithecia)라고 불리는 포자체(fruiting body)로 성숙된다. 이러한 포자체의 형태는 소르다리아시애의 생식에 있어서 전형적이다. 자낭홀씨가 성숙되고 난 다음에는 피자기로부터 능동적으로 배출된다. 자연계에서 자낭홀씨는 초식(herbivore)의 식품으로부터 섭취할 수 있으며, 위-장관을 거쳐 배출된다. 위-장관을 거치는 과정은 그 이후에 초식동물의 변에서 스포어가 발아하는데 필요하다.
본 발명의 방법에 사용되는 소르다리아 과의 자웅동체 진균은 소르다리아 속의 진균인 것이 바람직하며, 소르다리아 마크로스포라 또는 소르다리아 피미콜라인것이 더욱 바람직하다. 또한, 소르다리아 과와 유사한 다른 자웅동체 진균은 뉴로스포라 리노레아타(Neurospora linoleata), 뉴로스포라 아프리카나(Neurospora africana), 뉴로스포라 도드게이(Neurospora dodgei), 뉴로스포라 갈라파고센시스(Neurospora galapagosensis), 뉴로스포라 파노니카(Neurospora pannonica) 및 뉴로스포라 테리콜라(Neurospora terricola)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
소르다리아 마크로스포라는 소르다리아 피미콜라와 같이 초식동물의 변에서 자라는 기분성 사프로피트(coprophilous saphrophyte)이다. 균사 진균은 분류학 적으로 분열성 유미코타(eumycota)에 속하여 키틴 벽을 갖고 있는 고등의 진균에 속하게 된다. 소르다리아 마크로스포라의 완전한 생활 사이클은 실험실적 조건아래 7일 내에 완성되었다. 따라서, 생활 사이클은 뉴로스포라 크라사가 4주의 생활 사이클을 갖는 것에 비해 매우 짧음을 알 수 있다. 따라서, 분자 생물학적 연구를 수행하는데 있어서 소르다리아 마크로스포라를 이용하면 훨씬 더 적은 시간이 소비됨을 알 수 있다.
소르다리아 마크로스포라에 대한 일반적인 유전학적 및 분자 유전학적 연구는 잘 정립되어 있다.일반적인 유전학적 분석에 사용하는데 있어서, 자가 수분 자낭을 형성하지 않지만 서로 다른 결함을 갖고 있는 두 개의 돌연변이 균주가 교배에 있어서 유성적으로 번식할 수 있는 소르다리아 마크로스포라의 불임의 돌연변이 균주를 사용하는 것이 잘 알려져 있다. 즉, 소위 자낭 균사라고 불리는 곳에서 감수분열이 일어나며, 그 결과 4분체를 형성하여 8개의 직선상으로 정렬되며 각 쌍이 유전적으로 동일한 스포어를 가지는 자낭을 형성하게 된다. 스포어의 크기는 18 x 28 ㎛이며, 직선상으로 정렬된 것은 제공되는 4분체가 단순한 유전성을 가지게 한다. 게다가, 돌연변이의 다수성은 진균의 생리적 및 형태학적 특징 모두와 관계한다(Esser and Straub, 1958; Nowrousian et al., 1999; Masloff et al., 1999; Le Chevanton and Leblon, 1989). 목록화되어 있는 코스미드 유전자 은행은 소르다리아 마크로스포라로부터 유전자를 분리하는데 유용하게 사용할 수 있다(Poggeler et al., 1997).
숙주 생물에서 사용되는 코돈은 이형 유전자의 최적 발현을 결정한다. 표 1에 있는 단백질 코딩 유전자 내에서의 공통된 아미노산 코돈의 리스트로부터 소르다리아 마크로스포라, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 및 영장류의 아미노산 코돈 사이에는 가장 공통적으로 사용되는 아미노산 코돈이 있음을 확인할 수 있다. 이와는 반대로 대장균 또는 사카로마이세스 세레비시애에 있어서는 매우 차이점이 있음을 확인할 수 있다. 이러한 코돈 사용의 유사성의 결과, 소르다리아 마크로스포라는 인간을 원천으로 하는 이형 단백질을 생산하는데 있어서 매우 훌륭한 숙주 시스템이다.
소르다리아시애 과의 자웅동체 진균은 실험실적 배양에서 간단하고 값싸게배양할 수 있다. 또한, 진핵 미생물로서 상기 진균은 재조합 진핵세포 단백질을 후-전사적으로 변형하는 과정을 수행할 수 있다. 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균을 사용하는 또다른 생물공학적 이점은 인간-, 동물- 또는 식물-병원체 생물이 관계하지 않는다는 것이다. 게다가, 소르다리아 마크로스포라의 재조합 균주는 전통적인 교배와 혼합한 유전 공학적 방법을 통해서도 생산될 수 있어 아스퍼질러스 속의 자웅이진균(imperfect fungi)에 대해서도 이점이 있다.
소르다리아시애 과의 자웅동체 진균 특히 소르다리아 마크로스포라 및 소르다리아 피미콜라에서 형성되는 스포어는 자낭홀씨라고도 불리며 유성생식 과정에서 포자체 및 피자기에서 나타난다. 이러한 자낭홀씨는 분생홀씨보다 매우 크고 무거우며 상당히 많은 숫자로 형성된다. 따라서, 이들은 매우 낮은 파종 능력을 가지게 된다. 일반적으로 침지 배양 또는 진탕 배양에서는 자낭홀씨가 형성되지 않는다. 따라서, 만약 이형 단백질이 생산된다면 이는 절대적으로 스포어가 없는 상태가 되어야 하기 때문에 본 발명의 이형 단백질을 생산하는 방법에 있어서 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균의 불임 돌연변이체를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 돌연변이 균주는 원형질체에 EMS를 처리하거나 또는 UV 빛으로 조사함으로써 돌연변이를 유발해 수득할 수 있으며 그 결과, 돌연변이 균주는 생식능력을 가지지 않게 되고 분생포자를 생성하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 이형 단백질을 생산하는 방법에서는 소르다리아 마크로스포라의 불임 돌연변이체를 사용할 수 있다(Esser and Straub, 1958; Masloff et al., 1999; Nowrousian et al.,1999).
이형 단백질을 생산하는데 있어서 자웅동체 진균의 배양은 27 ±2℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 성장의 최적은 30℃ 이상에서 자라는 뉴로스포라 크라사보다 훨씬 낮은 온도인 것이 바람직하다. 소르다리아 마크로스포라는 32℃ 이상의 온도에서 죽기 때문에 이를 유념하여야 한다.
본 발명의 상세한 설명에 따르면, 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 프로모터는 사상 진균으로부터 유래하며 이는 이형 유전자의 발현을 조절한다. 이러한 프로모터는 예를들어 아스퍼질러스 니둘란스로부터 유래된gpd프로모터가 될 수 있으며, 소르다리아 마크로스포라로부터 유래된 프로모터인 것이 바람직하다. 또한, 소르다리아 마크로스포라로부터 유래된cpc2프로모터,ndk1프로모터,acl1프로모터 또는ppg1프로모터인 것이 더욱 바람직하다.소르다리아 마크로스포라로부터 유래된cpc2프로모터 및ndk1프로모터는 하기 실시예에서 기재한 대로 얻을 수 있다. 소르다리아 마크로스포라의acl1유전자는 노우로시안 등(Nowrousian et al., 1999)의 방법에 의해 수득할 수 있으며, 소르다리아 마크로스포라의ppg1유전자는 포겔러 등(Poggeler, 2000)에 의해 기재되었다.
소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 터미네이터는 사상 진균에서 유래하는 것이 바람직하다. 예를 들어 터미네이터는 아스퍼질러스 니둘란스로부터유래되는trpC터미네이터(Mullaney et al., 1985) 또는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는 터미네이터가 될 수 있다. 상기 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는 터미네이터는acl1터미네이터(Nowrousian et al., 1999) 및ppg1터미네이터(Poggeler, 2000)인 것이 더욱 바람직하다.
이형 유전자는 진핵세포에서 발현되고 난뒤 글리코실레이션되는 단백질을 코딩하는 것이 바람직하다. 예를 들어 이형 유전자는 하기 단백질들 중 하나를 코딩한다: G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL1ra, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 글루코아밀라제(glucoamylase), 응고 인자 Ⅷ(clotting factor Ⅷ), 응고 인자 ⅩⅡ, 응고 인자 ⅩⅢ , 인간 혈청 알부민.
본 발명의 방법에 있어서, 이형 유전자가 포함된 리딩 프레임에 존재하는 프로모터와 이형 유전자 사이에는 소르다리아시애 과의 진균에서 작용을 하는 신호 서열을 코딩하는 서열이 배열된다. 신호 서열은 사상 진균으로부터 유래되는 신호 서열인 것이 바람직하고, 그 예로 아스퍼질러스 나이거로부터 유래되는 글루코아밀라제의 신호서열이 있다(Gordon et al. 2000; Gouka et al. 1997). 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는 신호서열은 그 예로 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는 유전자의 신호서열인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 목적은 이형 단백질을 생산하기 위한 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 프로모터를 제공하는 것이다.
상기 목적은
(1) 하기 핵산들로부터 선택되는, 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서 활성을 띄는 프로모터:
(a) 서열번호 1로 기재되는 서열을 가지는 핵산;
(b) 서열번호 2로 기재되는 서열을 가지는 핵산;
(c) (a) 또는 (b)에 기재된 서열중 하나와 적어도 50%의 상동성을 나타내는 서열을 가지는 핵산;
(d) (a) 또는 (b)에 기재된 서열의 반대쪽 가닥과 혼성화되는 핵산,
(e) (a) 또는 (b)에 기재된 핵산의 하나 또는 복수의 뉴클레오티드의 치환, 첨가 및/또는 제거에 의해 얻어진 유도체;
(f) 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 기능을 유지하는 (a) 내지 (e)로 특정되는 한 핵산의 단편;
(g) (a) 내지 (f)로 특정되는 핵산들의 복수의 조합으로써, 상기 핵산들의 서열은 동일하거나 또는 다를 수 있는 것을 특징으로 하는 조합;
또는
(2) (a) 내지 (g)로 특정되는 어느 한 핵산의 서열과 상보적인 서열을 가지는 핵산을 포함하는 핵산 분자에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 "% 상동성"은 잘 알려져 있는 방법 예를 들어 컴퓨터 서열 비교 방법(Altschul et al., 1990)에 의해 측정될 수 있는 DNA 수준의 상동성을 의미한다.
또한, 본 발명에서 "상동성"이란 서열 사이의 매치에 의해 판단할 수 있는 두 개 또는 그 이상의 DNA 분자 사이의 관계 정도를 의미하며 이는 당업자에게 있어서 자명하다. "상동성"의 퍼센트는 두 개 또는 그 이상의 서열에서 갭(gap) 또는 서열의 특징을 포함하여 동일한 부위의 퍼센트를 의미한다.
서로 관계 있는 DNA 분자에서의 상동성은 잘 알려진 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 특별한 요구가 있을때에는 알고리즘을 가진 특정 컴퓨터 프로그램이 종종 사용된다. 상동성을 확인하는 기존의 방법은 이미 분석된 서열과 가장 많이 매치하는 것을 상동성이 있다고 판단하는 것이다. 두 개의 서열간 상동성을 확인하는데에는 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있으며, 이러한 프로그램은 GAP(Devereux et al., 1984; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul et al., 1990)을 포함하는 GCG 프로그램 패키지에만 한정되는 것은 아니다. BLAST X 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)로부터 얻을 수 있으며 다른 원천(BLAST Handbook, Altschul S. et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul et al., 1990)으로부터 얻을수도 있다. 잘 알려진 스미스 워터맨(Smith Waterman )의 알고리즘 또한 상동성을 확인하는데 사용될 수 있다.
서열을 비교하기 위한 파라미터로는 하기 기재된 것을 포함하는 것이 바람직하다:
알고리즘:Needleman and Wunsch,J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970)
콤패리전 매트릭스(Comparison matrix): 매치= +10, 미스매치=0
갭 패널티(Gap penalty): 15
갭 길이 패널티(Gap length penalty):1
GAP 프로그램은 상기 기재된 파라미터와 사용하는데 적당하다. 상기 파라미터는 염기 서열 비교를 위한 디폴트(default) 파라미터이다.
또한, 다른 사용 가능한 알고리즘, 오프닝 패널티(gap opening penalty), 갭 익스텐션 패널티(gap extension penalty), 콤패리전 매트릭스 및 프로그램 지침서(Wisconsin Package, Version 9, September 1997)이 사용될 수도 있다. 상기 인자들을 선택하는 것은 비교하고자 하는 대상에 따라 달라질 수 있으며, 비교하고자 하는 대상이 서열 쌍인 경우 GAP 또는 Best Fit를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 서열과 포괄적인 서열 데이터 사이에서 비교하는 것은 FASTA 또는 BLAST를 선택하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서 "(a) 또는 (b)로부터의 서열의 반대쪽 가닥 서열과 혼성화하는 서열"은 (a) 또는 (b)의 서열과 비슷한 특성을 가지고 있는 서열과 엄격한(stringent) 조건 하에서 혼성화할 수 있는 서열을 말한다. 예를 들어 혼성화는 2 ×SSC 용액에서 68℃에서 수행될 수 있다. 또한, 엄격한 조건에 대한 예는 삼부르크 등이 발표한 내용에 잘 나타나 있다(Sambrook et. al., 1989).
서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 서열은 소르다리아 마크로스포라로부터 분리된ndk1또는cpc2유전자의 프로모터 서열에 상응한다.또한, (c)로 기재되는 핵산 서열은 (a) 또는 (b)에 기재된 서열과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%의 상동성을 가지는 것이 바람직하며, 상기 서열 중 어느 하나와 95%이상의 상동성을 가지는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 하나 및 다른 하나와의 기능적 조합에 의해 하기 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균의 형질전환용 벡터를 제공한다:
- 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 프로모터,
- 이형 유전자,
- 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 터미네이터 및
- 선별 마커.
본 발명에서 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 프로모터는 아스퍼질러스 니둘란스로부터 유래된gpd프로모터가 될 수 있다. 그러나, 프로모터는 상기 (1)에 기재된 핵산인 것이 바람직하다. 또한, 프로모터는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는acl1프로모터 및ppg1프로모터인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 벡터에 포함되어 있는 터미네이터는 아스퍼질러스 니둘란스로부터 유래된trpC터미네이터가 될 수 있으며, 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는cpc2터미네이터,ndk1터미네이터,acl1터미네이터 또는ppg1터미네이터인 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 선택 마커의 예로는 소르다리아 마크로스포라(Le Chevanton and Leblon, 1989) 또는 포도스포라 안세리나(Turcq and Begueret, 1987)로부터 유래된ura5유전자가 있으며, 하이그로마이신 B-저항성 유전자를 사용하는 것이 바람직하다(실시예 참조, Kaster et al., 1983).
또한, 본 발명은 숙주 생물을 제공한다. 상기 숙주 생물은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균이다. 상기 숙주 생물은 소르다리아 속에 속하는 것이 바람직하며, 소르다리아 마크로스포라 또는 소르다리아 피미콜라인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 숙주 생물은 무성생식 마이토스포어(mitospore) 또는 유성생식 메이오스포어(meiospore)를 형성하지 않는 불임의 균주인 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 킷트를 제공한다:
(a) 본 발명에 따른 벡터 및
(b) 이형 단백질의 생산에 적합한 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균.
본 발명에 따른 핵산 분자, 벡터, 숙주 생물 및 킷트는 프로모터의 조절아래 이형 유전자를 발현하는데 사용되거나 하나 또는 복수의 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
분자 생물학적, 미생물학적 실험은 종래 기술(예를 들어 Sambrook et al., 1989)에 따른 기본적인 방법을 사용하여 수행하였다.
A.소르다리아 마크로스포라( S. macrospora) 의 배양
1)영양 배지
- BMM(fructification medium): 0.8% 바이오말트(biomalt)를 포함하는 콘밀 익스트렉트(corn meal extract), pH 6.5
- BMM + NaAc(spore germination medium): BBB + 0.5% NaAc, pH 6.0
- CCM: 0.3% 사카로즈, 0.05% NaCl, 0.5% K2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.001% FeSO4, 0.5% 트립틱 소이 브로스, 0.1% 효모 추출물, 0.1% 소고기 추출물, 1.5% 덱스트린, pH 7.0
- GM(minimal medium): 2% 글루코스, 0.7% 박토 이스트 나이트로젠 베이스(Bacto Yeast Nitrogen Base), 0.4 μM 바이오틴, 25 ㎕/ℓ 미네랄 콘센트레이트(5% 아스코빅산, 5% ZnSO4×7H2O, 1% Fe(NH4)2(SO4)2× 6H2O, 0.25% CuSO4×5H2O, 0.05% MnSO4×1H2O, 0.05% H3BO4, 0.05% Na2MoO4, 1% 클로로포름, pH 6.0)
- GMU: 10 mM 유리딘(uridine)을 포함하는 GM
- GMS: 10% 사카로즈를 포함하는 GM
- LB: 1% 박토 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, pH 7.2
- CM: 0.15% KH2PO4, 0.05% KCl, 0.05% MgSO4, 0.37% NH4Cl, 1% 글루코스, 0.2% 트립톤, 0.2% 효모 추출물, 트레이스 엘리먼트, pH 6.4-6.6
- CMS: 10.8% 사카로즈를 포함하는 CM 미디엄
- MM(minimal medium): 55.5 mM 글루코스, 1.8 mM KH2PO4, 1.7 mM K2HPO4, 8.3 mM 유레아, 1 mM MgSO4, 5 μM 바이오틴, 0.1 ㎖/ℓ 미네랄 콘센트레이트
- MMU: 10 mM 유리딘을 포함하는 MM
- 고체 미디어: 1.5% 아가, GM 탑아가, 0.4% 아가
2)배양 조건
배양은 대부분 27℃에서 수행하였다. 소르다리아 마크로스포라를 프럭트화하기 위해 고체 배지에서 배양하였으며 프럭트화의 확인은 7일 동안 배양한 뒤에 관찰하였다. 소르다리아 마크로스포라로부터 핵산을 준비하기 위해 펀배치 플라스크에서 액체 배지로 정지 배양하였다.
B.소르다리아 마크로스포라 균주의 준비
1)UV 돌연변이
UV 돌연변이를 일으키기 위해 소르다리아 마크로스포라 야생형 균주(ATCC MYA-334)의 원생동물(protoplast) 서스펜션(원생동물 버퍼 ㎖당 1.5 ×108원생동물)을 준비하였다. 상기 서스펜션은 약하게 흔들어 주면서 10분 및 20분 사이의 간격으로 UV(0.05 μW/㎝2)를 쪼여주었다. UV를 쪼인 원생동물을 CMS 고체 배지(0.15% KH2PO4, 0.05% KCl, 0.05% MgSO4, 0.37% NH4Cl, 1% 글루코스, 0.2% 트립톤, 0.2% 효모 추출물, 트레이스 엘리먼트, 10.8% 사카로즈, 1.5% 아가, pH 6.4-6.6)에 도말한 후 27℃에서 약 48시간 동안 배양하였다. 상기 고체 배지에서 다시 자란 원생동물을 MB 고체 배지(0.8% 바이오말트를 포함하는 콘밀 추출물, pH 6.5, 1.5% 아가)에 접종하였다. 1-4주 후, 변형된 포자체를 형성하는 표현형을 나타내는 클론을 돌연변이로 선별하였다. 다른 클론으로부터 돌연변이체를 구별하기 위해 균주를 MB 배지에 접종함으로써 균주의 유사분열 안정성(mitotic stability)을 테스트하였다. 마이셀리움(mycelium)이 약 7 ㎝ 정도 자랐을 때 새로운 영양 배지로 옮겨 주었으며, 이러한 과정을 3회 수행하였다. 유사분열 안정성을 위한 상기 테스트를 수행하여 얻은 균주는 자낭포자(ascospores)를 선별하기 위한 교배실험에서 유전학적으로 테스트하였다. 그 결과, 호모카리오틱(homokaryotic) 균주를 생산할 수 있었다.
2)EMS 돌연변이
EMS 돌연변이를 수행하기 위해 에틸 메틸 설포네이트(Ethyl methyl sulfonate, 이하 "EMS"라 약칭함)를 돌연변이 유발제로 사용하였다. 전체 부피를 500 ㎕로 하여 소르다리아 마크로스포라 야생형 균주 5 ×108개에 EMS(σM-0880)를 34.1 ㎎/㎖ 농도로 처리한 후 27℃에서 45분 동안 돌연변이를 유발하였다. 돌연변이 유발된 균주는 상기 실험예 1에서 사용한 CMS 고체 배지에 도말한 뒤 동일한 방법을 거쳐 균주를 생산하였다.
이렇게 생산된 균주를"inf"(infertile)이라 명명하였다.
C.소르다리아 마크로스포라 균주의 형질전환
소르다리아 마크로스포라 돌연변이 균주의 형질전환은 왈츠와 쿡의 방법에의해 수행하였다(Walz and Kuck (1995)). 상기 균주의 진균 마이셀리움을 CM 액체 배지(0.15% KH2PO4, 0.05% KCl, 0.05% MgSO4, 0.37% NH4Cl, 1% 글루코스, 0.2% 트립톤, 0.2% 효모 추출물, 트레이스 엘리먼트, pH 6.4-6.6, 10.8% 사카로즈, 1.5% 아가)로 27℃에서 2일 동안 정지 배양함으로써 형질전환시켰다. 형질전환된 마이셀리움은 원생동물 버퍼(13 mM Na2HPO4, 45 mM KH2PO4, 600 mM KCL, pH 6.0)를 사용하여 세척한 후 여과를 하여 노보자임 용액(10 ㎎ Novozym 234(Novo Nordisk)/㎖ 원생동물 버퍼)으로 마이셀리움을 최종 수득하였다. 상기 수득된 마이셀리움을 27℃, 100 rpm으로 45분 동안 반응시킨 뒤 글래스 프리트(포어 사이즈 1, Schott)를 사용해 남아있는 마이셀리움으로부터 원생동물을 분리하였다. 상기 분리된 원생동물을 원심분리하여 펠렛을 만든 후 세포를 원생동물 버퍼로 2회 세척하였다. 상기 원생동물을 형질전환 버퍼(1 M 소르비트, 80 mM CaCl2, pH 7.5)에 넣어 2 ×108세포수/㎖이 되도록 하였다. 형질전환을 하기 위해 2 ×108세포수/㎖의 원생동물을 각각 20 ㎍의 플라스미드 DNA 또는 20 ㎕의 코스미드 DNA로 각각 혼합하여 얼음에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 후 형질전환 버퍼에 들어 있는 25% PEG 200 ㎕를 넣어 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 곧바로 각 용기에 들어 있는 100-200 ㎕의 형질전환체를 CMS 배지에 도말하였다. 27℃에서 최대 12시간 동안 배양한 뒤 새로 형성된 원생동물을 하이그로마이신 B를 포함하는 탑아가(0.8 M NaCl, 0.8% 아가)로 코팅하였다. 형질전환체를 선별하기 위한 탑아가에 들어있는 하이그로마이신 B는전체 배지에 대해 최종농도가 110 U/㎖이 되도록 하였다. 2 내지 4일 후에 형질전환체가 형성되었으며, 이를 100 U/㎖의 하이그로마이신 B를 포함하는 BMM 배지(0.8% 바이오말트를 포함하는 콘 밀 추출물, pH 6.5)에 접종하였다. 형질전환체의 표현형 연구는 선별 마커를 포함하지 않는 BMM 배지에서 수행하였다.
D.소르다리아 마크로스포라에서의 이형 유전자의 발현
야생형 균주 대조군과 함께 존재하는 소르다리아 마크로스포라 형질전환체에 이형 유전자가 발현하는지 여부를 확인하기 위해 상기 두 균주를 CM 배지에 옮겨 27℃에서 배양하였다. 배지 또는 진균 마이셀리움은 원심분리 또는 여과를 통해 수득하였다.
<실시예 1> 소르다리아 마크로스포라에 있는 ndk1, cpc2, pppg1 및 acl1 유전자의 전사적 발현의 비교
소르다리아 마크로스포라(Sordaria macrospora)의ndk1,cpc2, ppg1및acl1유전자의 전사적 발현을 비교하기 위해, 노던 혼성화를 이용해 다양한 균주에 대한 전사적 빈도(frequencies)를 확인하였다. 이를 위해 야생형 균주 또는inf돌연변이 균주로부터 수득한 5 ㎍의 mRNA를 로딩한 뒤 상기 언급된 유전자에 특이적인 각각의 프로브를 사용하여 혼성화하였다. 도 1에 나타난 자가 방사선 사진(autoradiogram)에서 보는 바와 같이ppg1유전자는 가장 약한 신호를 나타내었으나 소위 말하는 "하우스 키핑" 유전자(예를 들어 α 또는 β 튜불린 유전자)와 비교하였을때 매우 강한 신호를 나타내었다.ac1l유전자의 신호는 훨씬 더 강하게 나왔으며cpc2유전자 및ndk1유전자에서 가장 강한 신호를 나타내었다. 상기 자가 방사선 사진을 통해 네 개의 유전자는 발현이 높았기 때문에 발현 벡터를 제조하는데 적당함을 알 수 있었다.
<실시예 2> 소르다리아 마크로스포라의 cpc2 및 ndk1 유전자의 조절 서열 클로닝
소르다리아 마크로스포라의cpc2및ndk1유전자를 클로닝하기 위해 올리고뉴클레오타이드 세트(표 2 참조)를 합성하였으며 이는 PCR 증폭에 사용하였다. 소르다리아 마크로스포라의 게노믹 DNA를 사용하여cpc2유전자를 증폭하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머 1095 및 1096을 사용하고,ndk1유전자를 증폭하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머 1265 및 1266을 사용하였다. 증폭된 산물 655 Bp(cpc2) 또는 594 Bp(ndk1)은 DNA 서열분석에 사용하였다.ndk1유전자의 DNA 서열은 ATG 시작코돈 바로앞의 1.4 Kb의 프로모터 부위를 포함하고 있었으며 이를 도 2a, 도 2b 및 도 2c에 나타내었다. ATG 시작 코돈은 이 서열에서 1284-1386 위치에 있었다. 소르다리아 마크로스포라의cpc2유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 도 3a, 도 3b 및 도 3c에 나타내었다.
유전자 절편은 소르다리아 마크로스포라의 다른 유전자와 혼성화 반응을 비교하기 위해 소위 노던 혼성화(Northern hybridizations)라고 불리는 방법을 수행하는데 사용하였다. 그리고 난뒤 10개의 다른 소르다리아 마크로스포라 유전자 프로브를 사용하여 혼성화를 비교한 결과, 소르다리아 마크로스포라의cpc2유전자 또는ndk1유전자가 매우 높은 전사적 레벨을 갖고 있었다. 이러한 레벨은 다른 프로브를 사용한 혼성화 신호에 비해 매우 높았다. 이러한 유전자를 발현벡터의 구성으로 사용하기 위해 소르다리아 마크로스포라의 게노믹 코스미드 유전자 은행(Poggeler et al. 1997)으로부터 상기 두가지 유전자의 완전한 게노믹 카피를 얻었다. 또한 스크리닝 결과 코스미드 클론 VIG10(cpc2) 및 VIIG10(ndk1)을 수득할 수 있었다. 상기 두가지 코스미드 클론의 부분 절편 서열은 조절 서열을 단일로 확인하기 위해 서열분석하였다.
<실시예 3> cpc2 프로모터의 서브 클로닝
cpc2프로모터를 서브 클로닝하기 위해 상응하는 코스미드 클론은 EcoRV로 절단되었다. 3.0 kb 절편은cpc2프로모터를 가지는 것으로 밝혀졌다. 상기 절편은 전기충격 형질도입 방법(shotgun experiment)을 통해 EcoRV로 선형화된 pBCKS+(Stratagene, La Jolla, California) 벡터에 삽입시켰다. 상기 재조합 벡터를E. coli에 형질전환한 뒤 콜로니 필터 혼성화를 통해 형질전환 여부를 분석하였다. 그 결과, 수개의 양성 클론은 약 600개의E. coli형질전환 균주임을 확인하였다. 최종적으로 재조합 플라스미드 pSE36-5를 포함하고 있는 단일 클론을 분리하였다. 상기 클론의 DNA 서열을 분석한 결과, 상기 재조합 플라스미드는cpc2유전자를 포함하고 있으며 도 3a, 도 3b 및 도 3c에서 보는 바와 같이 뉴클레오타이드 1번부터 2981번까지에 위치함을 알 수 있었다.
올리고뉴클레오타이드 쌍cpc9/cpc11및cpc10/cpc12는 플라스미드 pSE36-5로부터cpc2프로모터를 부분 증폭하는데 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드 쌍cpc9/cpc11은 1359bp 앰플리콘(도 3a 및 도 3b의 1250번째에서 2609번째 위치의 뉴클레오타이드)을 증폭하는데 사용하였으며, 그 결과 올리고뉴클레오타이드 서열은 양쪽 말단에NcoI오버행을 포함하였다. 올리고뉴클레오타이드 쌍cpc10/cpc12는 1359bp 크기의 절편을 증폭하는데 사용하였으며, 절편 양쪽 끝에 EcoRV 인식 서열을 갖도록 하였다. 상기 증폭 결과 수득된 절편의 서열은 도 3a 및 도 3b에서 보는 바와 같이 뉴클레오타이드 위치가 1250번째부터 2609번째 위치의 뉴클레오타이드 서열과 상응하였다.
상기에서 수득된 증폭 산물은 pDrive(Qiagen, Hilden, GERMANY) 벡터에 서브클로닝되었다. 상기 서브 클로닝된 것을 라이게이션한 뒤E. coli로 형질전환시켰으며, 재조합 균주는 DNA 혼성화를 통해 확인하였다. 그 결과, 두 개의 재조합 플라스미드는 하기 명시된 것을 가지고 있었다:
a) pSE38-16은 pDrive 벡터에 약 1.4 kb 크기의 EcoRV 절편을 포함한다;
b) pSE39-14는 pDrive 벡터에 약 1.4 kb 크기의 NcoI 절편을 포함한다.
<실시예 4> 소르다리아 마크로스포라의 acl1 유전자의 조절 부위를 포함하는 발현벡터의 제조
동물 및 진균에서 ATP 사이트레이트 라이에이즈(ACL)는 사이토졸에 위치하고 있으나 반면 식물에 있는 동형 단백질은 엽록체에 위치하고 있다. 상기 세가지 생물(organisms) 시스템의 ACL은 지방산 및 스테롤을 생합성하는데 최초로 사용되는 아세틸 CoA를 생산한다. 진균에서 상기 효소는 크로모좀 DNA(Nowrousian et al. 2000)에 위치하고 있는 두 개의 개별 유전자(acl1, acl2)로 코딩되는 두 개의 서브유닛으로 구성되어 있다. 이와는 반대로 동물에 있는 연속된 폴리펩타이드는 한 개의 유전자에 의해 코딩된다.
소르다리아 마크로스포라(Nowrousian et al. 1999)의acl1유전자의 프로모터는 pMN110 발현 플라스미드(도 4)를 제조하는데 사용하였다. 소르다리아 마크로스포라의 게노믹 DNA를 주형으로 사용하고 올리고뉴클레오타이드 1197 및 올리고뉴클레오타이드 1199(표 2)를 사용하여 프로모터 서열을 증폭하였다. 예상된 2.3 Kb 크기의 증폭된 절편을 pMON 38201(Borovkov and Rivkin, 1997) 플라스미드에 클로닝하였다. 이렇게 제조된 플라스미드를 "pMN95"라 명명하였다. 다음으로,acl1유전자의 터미네이터 서열을 증폭하고 클로닝하였다. 또한 이 경우에는 소르다리아 마크로스포라의 게노믹 DNA를 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오타이드 1194 및 올리고뉴클레오타이드 1200을 사용해 PCR 반응하여 0.6 Kb의 절편을 증폭하였다. 상기 증폭하여 제조된 플라스미드를 "pMN102"라 명명하였다. 상기에서 제조한 pMN102 플라스미드에 포함된 터미네이터 서열을 pKS+(Stratagene, La Jolla, California) 벡터에 다시 클로닝하였다. 이를 위해 pMN102 플라스미드를NotI 및SacI 제한효소로 절단하였다.절단하여 제조된 0.6 Kb 절편을NotI및 SacI으로 절단된 pKS+ 벡터로 라이게이션하였으며, 이렇게 제조된 플라스미드를 "pMN109"라 명명하였다. 상기 플라스미드를 제한효소HindIII 및NotI으로 절단하고 2.3 Kb의 pMN95 플라스미드 절편과 함께 라이게이션하였다. 이렇게 제조된 플라스미드를 "pMN110"이라 명명하고 이후의 클로닝에 사용하였다. 클로닝하는 과정은 도 4에 나타난 과정으로 수행하였고 pMN110 플라스미드에 삽입된 DNA 서열은 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
소르다리아 마크로스포라 및E. coli의 형질전환에 적합하게 사용하기 위해 pMN112 플라스미드는 하기의 클로닝 단계로 제조하였다(도 6). 이를 위해 pBCHygro(Silar, 1995) 플라스미드를NotI으로 절단하고 제한효소로 절단된 말단은 클레나우 폴리머레라제(Klenow polymerase)를 사용하여 채웠다. 상기 과정으로 제조된NotI 말단을 갖는 선형의 플라스미드는ClaI 제한효소로 절단하였다.그 결과 제조된 선형의 벡터 분자는 "블런트" 말단 또는ClaI 절단으로 터미네이션되었다. 상기 처리된 벡터 분자는 pMN110 플라스미드로부터 수득된 2.9 Kb 절편에 라이게이션하는데 사용하였다. 상기 절편은 pMN110 플라스미드를HindIII로 절단함으로써 선형화하였다. 오버행 절단 말단은 블런트 말단을 형성하기 위해 클레나우 폴리머레이즈로 채웠다. 상기 처리된 절단 절편은 제한효소ClaI으로 절단하여 젤전기영동을 하였으며 상기에 언급된 라이게이션을 하는데 사용하기 위해 용출하였다. 클로닝 과정은 도 6에 나타난 바와 같으며 제조된 pMN112 플라스미드는 도 7에 나타낸 바와 같다. 이렇게 제조된 전체 크기는 9.605 Kb였다.
pMN112 발현 플라스미드는 소르다리아 마크로스포라에서 이형 단백질을 생산하는데 사용하였다. 상기 플라스미드에서acl1프로모터는NotI으로 절단한 뒤acl1터미네이터에 연결하였다. 이러한 단일의NotI 제한효소 절단은 이형의 DNA를 삽입하는데 적합하며acl1프로모터의 조절하에 발현된다.
<실시예 5> acl1 프로모터의 조절하에서 소르다리아 마크로스포라에 있는 박테리아 β갈락토시다제의 생산
소르다리아 마크로스포라에서 β갈락토시다제 유전자(lacZ)를 발현시키기 위해 pSMY1-1 플라스미드를 제조하였다. pSMY1-1 플라스미드는 pMN112 플라스미드의 단일NotI 제한효소 위치에lacZ유전자를 삽입함으로써 제조하였다. ThelacZ유전자는 pS18.8(Menne et al., 1994) 플라스미드로부터 PCR 증폭을 통해 제조되었다. 말단에NotI 제한효소를 인식하는 서열을 포함하고 있는 올리고뉴클레오타이드 1206 및 올리고뉴클레오타이드 1215(표 2)를 PCR 증폭에 사용하였다. 증폭 산물은 3.0 Kb의 크기를 가지고 있었으며 pMON 38201(Borovkov and Rivkin, 1997) 플라스미드에 단일로 존재하는 제한효소 위치에 삽입하였다. 제조된 플라스미드는 pMN104 플라스미드를 포함하고 있었으며NotI으로 혼성화하였다.제조된 3.0 KbNotI 절편은NotI으로 선형화된 pMN112 플라스미드에 삽입하였다(도 7). 제조된 pSMY1-1 플라스미드(도 8) 및 pSMY1-2 플라스미드는lacZ유전자의 방향이 각각 달랐다. pSMY1-1 플라스미드에 있는lacZ유전자는acl1프로모터의 조절하에 있었다. pSMY1-2 플라스미드에는 pSMY1-1 플라스미드에 있는lacZ유전자의 방향과 반대로 존재하여lacZ유전자의 발현은acl1프로모터의 조절을 받지 못하였다. 따라서, pSMY1-2 플라스미드는 유전자 발현 실험에 있어서 대조군으로 사용할 수 있다. 상기 제조된 모든 발현벡터는 DNA 서열 분석을 통해 방향성을 확인하였다. pSMY101 플라스미드에 있는 ATG 시작 코돈의 서열은 도 9에 나타내었다.
소르다리아 마크로스포라를 pSMY1-1 및 pSMY1-2 발현 벡터로 형질전환한 후 형질전환체는 하이그로마이신 선별과 이형 유전자 산물인 β갈락토시다제를 생성하는지 여부를 확인함으로써 수득하였다. 이를 위해 진균 마이셀리움을 글래스 비드와 추출버퍼(2.5 mM tris-HCl(pH 8), 125 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 12 mM β머캅토에탄올(pH 7.5), 2 mM 4-메틸엄벨리페릴 β-D-갈락토피라노사이드, 10%(v/v) DMF)로 혼합한 뒤 강하게 볼텍싱하여 분해하였다. 상기 분해물(detritus)은 원심분리하여분리하였다. pSMY1-1 단백질 추출물에 있는 β갈락토시다제 활성은 4-메틸엄벨리페릴 β-D-갈락토피라노사이드로부터 분비되는 플루오렌싱 4-메틸엄벨리페릴을 측정함으로써 측정하였다. pSMY1-1 형질전환체의 추출물에서 확인한 β갈락토시다제 활성과는 반대로lacZ유전자가 반대 방향으로 포함되어 있는 발현벡터로 형질전환된 pSMY1-2 추출물에서는 β갈락토시다제 활성이 측정되지 않았다.
<실시예 6> 소르다리아 마크로스포라의 acl1 프로모터 조절하에서 인간 혈청 알부민의 전구-단백질 생산
소르다리아 마크로스포라에서 인간 혈청 알부민(human serum albumin, 이하 "HSA"라 약칭함)의 전구-단백질을 생산하기 위해hsa유전자(pPreHSA 플라스미드로부터 수득, Rhein Biotech GmbH, Dusseldorf, Germany)를 pMN112 발현 벡터에 클로닝하였다. 이를 위해 인간 혈청 알부민의 전구-단백질(pre-protein of human serum albumin, 이하 "PreHsa"라 약칭함) 유전자를 PCR 증폭을 통해 수득하였다. pPreHsa 플라스미드를 주형 DNA로 사용하고 hsa1 및 hsa2 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증폭하였다. 1.8 Kb 증폭산물은 말단에NotI 제한효소 부위를 포함하고 있다. 상기 PCR 절편은 라이게이션을 통해Xcml으로 제한효소 절단된 pMON 38201(Borovkov and Rivkin, 1997) 벡터에 삽입하였다. 상기 제조된 플라스미드를 "pMON-HSa"라 명명하였다. pMON-HSA 플라스미드의 PCR 증폭 산물 삽입 여부는 서열분석을 통해 확인하였다. 상기 확인된 플라스미드는NotI 제한효소로 절단하여1.8 Kb 절편을 만들었으며 이를NotI으로 절단된 pMN112 벡터로 삽입하였다. 상기 삽입되어 제조된 플라스미드를 "pSMY4-1"라 명명하였다(도 10). 또한, Pre-Hsa 유전자를 반대 방향으로 포함하도록 클로닝하여 제조된 벡터 pSMY4-2는 대조군으로 사용하였다. 상기 제조된 모든 발현벡터는 DNA 서열 분석을 통해 확인하였다.
소르다리아 마크로스포라를 pSMY4-1 및 pSMY4-2 발현 플라스미드로 형질전환한 뒤 하이그로마이신에서 선별된 형질전환체가 이형 유전자 산물 HSA를 형성하는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 진균 마이셀리움을 글래스 비드와 추출버퍼(2.5 mM tris-HCl(pH 8), 125 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 12 mM β머캅토에탄올(pH 7.5), 2 mM 4-메틸엄벨리페릴 β-D-갈락토피라노사이드, 10%(v/v) DMF)로 혼합한 뒤 강하게 볼텍싱하여 분해하였다. 분해 산물을 원심분리로 분리하였다. 단백질 raw 추출물에 있는 HSA가 있는지 여부는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 확인하였다. 전체 단백질 추출물을 마이크로타이터 플레이트(MaxoSorp, Nunc)의 각 웰에 넣은 뒤 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 0.05% 트윈®20이 포함된 PBS 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 14 mM KH2PO4, pH 7.4)로 3회 세척한 뒤 PBS 버퍼에 녹여진 0.2% 트윈®20을 사용하여 1시간 동안 자유 결합 부위(free binding site)를 차단하였다. 다시 3회 세척한 뒤 퍼옥시다제(BioTrend, Cologne, GERMANY; 0.05% 트윈®20을 포함하는 PBS 버퍼로1:1000배 희석)로 링크시킨 HSA 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. ELISA 반응은 제조사(Pierce, Helsingbirg)의 방침에 따라 과산화수소의 존재하에서 퍼옥시다제 기질 3,3',5,5' 테트라메틸 벤지딘(TMB)의 발색반응으로 수행하였다. SMY4-1 형질전환체의 raw 추출물에서 HSA가 있음을 확인하였고, 대조군인 야생형 균주와 SMY4-2 형질전환체에서는 HSA가 확인되지 않았다.
<실시예 7> 소르다리아 마크로스포라의 ppg1 유전자의 조절 부위를 포함하는 발현 벡터의 제조
소르다리아 마크로스포라의 성 페로몬ppg1유전자는 227 아미노산의 전구단백질(preproprotein)을 코딩한다. 또한, 여기에는 16 아미노산으로 구성된 리더 펩타이드(Poggeler, 2000)를 포함하여 단백질 분비를 위한 신호 서열로 사용될 수 있다.
ppg1유전자의 프로모터 서열, 리더-펩타이드 코딩 서열 및 터미네이터 서열은 pSMY3 발현 플라스미드를 제조하는데 사용하였다(도 11).
올리고뉴클레오타이드 ppg1-1 및 ppg1-2는 리더-펩타이드 코딩 서열과 함께 프로모터 서열을 클로닝하는데 사용하였다. 상기 두가지 올리고뉴클레오타이드는 절단 엔도뉴클레아제 서열을 포함하고 있다(표 2).SacI 제한효소 인식부위는 올리고뉴클레오타이드 ppg1-1에 사용되었고,NotI 제한효소 인식부위는 올리고뉴클레오타이드 ppg1-2에 사용되었다. 소르다리아 마크로스포라의 게노믹 DNA는 상기 두가지 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증폭하는데 사용하였다. 증폭된 산물은 1.8 Kb 크기의 절편이었다.
ppg1유전자의 터미네이터 서열은 상응하는 서열을 사용하여 증폭함으로서 획득할 수 있었다. 이를 위해 올리고뉴클레오타이드 ppg1-3 및 ppg1-4를 사용하였다. 또한, 상기 두가지 올리고뉴클레오타이드는 제한효소NotI(ppg1-3) 또는 제한효소BamHI(ppg1-4)을 연장하기 위한 서열을 포함하고 있다. 소르다리아 마크로스포라의 게노믹 DNA와 상기 두가지 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증폭해 880 bp DNA 절편을 수득하였다.
상기 수득된 프로모터와 터미네이터 증폭 산물은 상기에 기재된 방법과 동일하게 수행하여Xcml으로 절단하여 선형화된 pMON38201 벡터에 삽입하였다. 클로닝하여 제조된 플라스미드를 "pPROM1(프로모터 부위를 포함)" 또는 "pPROM1(터미네이터 서열을 포함)"이라 명명하였다. 플라스미드 pPROM1 및 pTERM1의 물리적-유전자 맵은 각각 도 12 및 도 13에 나타내었다.
프로모터 서열을 다시 형질전환 벡터 pCB1004(Carroll et al., 1994)로 다시 클로닝하였다. 이를 위해 pPROM1 플라스미드를SacI 및NotI으로 절단한 뒤SacI/NotI으로 절단한 pCB1004 벡터로 삽입하였다. 이렇게 제조된 발현벡터를 "pSMY2"라 명명하였다(도 14). 상기 제조된 pSMY2 플라스미드를NotI 및BamHI 제한효소로 절단한 뒤 여기에 pTERM1 플라스미드를NotI 및BamHI제한효소로 절단하여 제조한 절편을 삽입하였다. 이렇게 제조되어ppg1유전자의 리더 펩타이드 코딩 서열 및 터미네이이터 서열을 포함하고 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드를 "pSMY3"이라 명명하였다(도 15). 프로모터 서열은NotI 제한효소 절단에 의해 터미네이터 서열에 연결하였다. 이러한 제한효소 절단 부위는 플라스미드 pSMY3에서 단일로 존재하며 이형 DNA를 삽입하는데 사용될 수 있다. 플라스미드 pSMY3에 삽입한 DNA 서열은 도 16a 및 도 16b에 나타내었다.
<실시예 8> 소르다리아 마크로스포라의 cpc2 유전자의 조절 부위를 포함하는 발현 벡터의 제조
cpc2유전자의 조절 부위를 포함하는 발현 벡터는 하기에 기재된 pSM2 벡터에 기초하여 제조하였다. pSM2 벡터(실시예 13 참조, 도 26)는egfp유전자를 포함하고 있으며 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)의 TtrpC 터미네이터와 결합되어 있다. egfp유전자의 상류(Upstream)는 폴리링커 부위에 위치하고 있어서 치환된(shifted) 절편으로 클로닝하는데 적합하다.
첫 번째 벡터에 있어서 상기 실시예 3에 기재된EcoRV절편은 pSE38-16 플라스미드로부터 pSM2/EcoRV 벡터로 라이게이션함으로서 제조되었다. 제조된 재조합 플라스미드를 "pSE40-6"라 명명하였다(도 17). 프로모터 절편의 방향성은 제한효소 절단으로 확인하였다. 두 번째 벡터에 있어서 pSE39-4 플라스미드로부터NcoI으로 절단한 1.4 Kb의 절편(실시예 3 참고)은NcoI으로 절단하여 선형화한 pSM3 벡터(실시예 13 참조, 도 26)로 삽입하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를 "pSE42-9"라 명명하였다. 상기 제조된 pSE42-9 플라스미드를SalI으로 절단하여 선형화하였다. 상기SalI으로 절단한 절편은SalI으로 절단한 1.4 kb 크기의 pCB1004 플라스미드에 라이게이션 하였다. 상기SalI 절편은 하이그로마이신 B 유전자를 포함하고 있기 때문에 진균 돌연변이체를 선별하는데 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를 "pSE43-2"라 명명하였다(도 18).
야생형 소르다리아 마크로스포라 균주를 pSE40-6 및 pSE43-2 재조합 플라스미드로 각각 형질전환하였다. 형질전환된 균주를 하이그로마이신 B로 선별한 뒤 각 플라스미드 형질전환에 대햐 약 20개의 형질전환체를 획득할 수 있었다. 이후의 확인 과정은 형광 현미경 실험을 통해 소르다리아 마크로스포라 균주에서egfp단백질이 생산됨을 확인하였다.도 19에서 보는 바와 같이 T1 p40-6- 및 T1 P43-2- 형질전환체는 재조합 플라스미드 pSE40-6 또는 pSE43-2를 포함하고 있었다. 형광 현미경 사진에서 나타난 형광은 단일로 확실하게 나타났으며 형질전환되지 않은 대조 균주는 형광이 완전히 나타나지 않았다(보이지 않았음). 후자의 경우 페놀릭 기질을 사용한 실험을 통해 배경(background) 형광이 나타나지 않음을 확인하였다.
<실시예 9> 기본 플라스미드 pGC-MCS의 제조
프로모터, 터미네이터 부위 및 선별 마커를 서로 교환 가능하고 멀티 클로닝 서열(MCS)을 포함하는 발현 벡터를 제조하기 위해 시작 벡터로 pSMY5-1(도 20)을BssHII으로 절단하였으며 약 4.6 Kb 크기의 절편을 젤 용출을 통해 수득하였다. 상기 절편을 합성 폴리링커 절편으로 연장하고 다시 라이게이션하였다. 합성 절편의 제조는 하기 기재된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 혼성화 함으로써 제조하였으며 올리고뉴클레오타이드 및 이의 제한효소 부위는 하기와 같다.BssHII 서열은 밑줄로 표시하였다.
링커 1(서열번호 24)
5'-TCGACGCGCGCCTCGAGAGGCCTACTAGTGAATTCAGATCTGGATCCGCGGCCGCATCGATTCGCGA GGTACCGCGCGCA
링커 2(서열번호 25)
5'-GCGCGCGGAGCTCTCCGGATGATCACTTAAGTCTAGACCTAGGCGCCGGCGTAGCTAAGCGCTCC ATGGCGCGCGTTCGA
합성 클로닝 부위에 있는 제한효소 절단 부위의 서열은 하기에 나타낸 바와같다: BssHII-AvaI-XhoI-StuI-SpeI-EcoRI-BglII-BamHI-SacII-NotI-SacII-NotI-ClaI -NruI-Acc65I-KpnI-BssHII. 이렇게 제조된 p-GV-MCS(도 21) 벡터는 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
<실시예 10> 기본 플라스미드 pGV-MCS에 ndk1 또는 cpc2 프로모터를 포함하는 발현 벡터의 제조
다음의 클로닝 단계에서 여러 가지 프로모터 및 터미네이터를 pGV-MCS 벡터에 삽입하였다. 프로모터 부위는 MCS의 여러 가지 부위로 삽입하였다. 이를 위해ndk1 프로모터(도 2에서 뉴클레오타이드 6-1383에 위치)를 포함하는 1378 bp 절편,cpc2 프로모터(도 3에서 뉴클레오타이드 1281-2611에 위치)를 포함하는 1331 bp 절편 및acl1유전자의 터미네이터 부위(도 5a 및 도 5b에서 뉴클레오타이드 2338-2860에 위치)는 적당한 제한효소 절단을 통해 전구 플라스미드로부터 수득하거나 PCR 방법을 사용하여 말단 인식 부위를 증폭해 발현 벡터로 클로닝 하였다.
올리고뉴클레오타이드 ndk5-(SpeI) 및 ndk-(EcoRI)(표 2 참조)는 말단에SpeI 및EcoRI 제한효소 부위를 포함하도록ndk1프로모터를 증폭하는 PCR에 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드 cpc2-(AvaI) 및 cpc2-(SpeI)(표 2 참조)은 말단에SpeI 및AvaI 제한효소 부위를 포함하도록cpc2프로모터를 증폭하는 PCR에 사용하였다.
다음 단계로acl1 터미네이터를 벡터에 삽입하였다. 터미네이터 부위는 플라스미드 pSMY1-2(실시예 5 참조)로부터 PCR로 증폭함으로써 수득하였으며 말단에NotI/ClaI 부위를 포함하게 하였다. 올리고뉴클레오타이드 acl1-(NotI) 및 acl1-(ClaI)(표 2 참조)를 증폭하는데 사용하였다.
그 결과, 재조합 코딩 서열을 삽입하기 용이하도록 MCS에 단일의 제한효소 부위EcoRI/BglII/BamHI/NotI을 포함하는 발현 벡터를 수득하여 이를 "pGV-ndk1-MCS-acl1"(도 22) 및 "pGV-cpc2-MCS-acl1"(도 23)이라 명명하였다.
<실시예 11> cpc2 또는 ndk1 프로모터의 조절아래 소르다리아 마크로스포라에서의 파이타제의 생산
아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 파이타제(phytase)(Pasamontes et al., 1997)는 분비된 이형 유전자 산물의 생산을 확인하는데 사용하였다. 파이타제 유전자의 코딩 부위인 1403 bp의EcoRI 절편을 플라스미드 pGV-ndk1-MCS-acl1(도 22)에 삽입하여ndk1프로모터의 하류에 위치하도록 하고, 플라스미드 pGV-cpc2-MCS-acl1(도 23)에 삽입하여cpc2프로모터의 하류에 위치하도록 하였다. 이렇게 제조된 발현 플라스미드는 그의 강도로 확인하였으며 소르다리아 마크로스포라에 형질전환하는데 사용하였다.수일동안 상기 형질전환 균주를 배양한 뒤 상등액을 수득하여 분비된 파이타제의 활성을 측정하는데 사용하였다. 각각의 상등액을 5M NaAc 25 ㎕ 및 4-니트로페닐포스페이트(4-nitrophenylphosphate) 50 ㎕와 혼합한 후 37℃에서 60분동안 반응시켰다. 15% 트리클로로아세틱산 100 ㎕를 첨가하여 효소반응을 중단시켰다. 1 M NaOH 100 ㎕를 첨가한 후 배양 상등액이 양성 반응을 나타낸 것은 밝은 노란색을 띄었다. 노란색 생성된 것은 분광기를 사용하여 흡광도 405 nm에서 측정하였다.
각각의 파이타제 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체의 배양 상등액을 사용한 활성 측정은 대조 야생 균주 및 파이타제를 삽입하지 않은 발현벡터(mock transformand)의 활성과 비교하였다. 소르다리아 마크로스포라에서의 파이타제 유전자의 발현 및 배양 상등액에서의 외래 파이타제의 분비를 통해ndk1및cpc2프로모터가 유용한 프로모터임을 확인하였다.
ndk1프로모터에 의해 파이타제가 발현되면 190시간 이후에 OD405가 0.4를 나타내었으며, 이에 반해 대조 야생 균주 및 파이타제를 삽입하지 않은 발현벡터의 경우 OD405가 각각 0.136 및 0.09를 나타내었다. 또한,cpc2프로모터에 의해 파이타제가 발현되면 190시간 이후에 OD405가 0.37을 나타내었으며; 이에 반해 대조 야생 균주 및 파이타제를 삽입하지 않은 발현벡터의 경우 OD405가 각각 0.049 및 0.05를 나타내었다.
<실시예 12> ndk1 또는 cpc2 프로모터의 조절아래 소르다리아 마크로스포라에서의 인간 락토페린의 생산
인간 락토페린 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)의 N-말단 코딩 서열을 결합하여 pGV-ndk1-MCS-acl1 벡터의 3641 BpEcoRI 절편으로 클로닝하였다(도 22). 제한효소 절단, 절편의 분리 및 라이게이션은 표준 조건으로 수행하였다.cpc2 프로모터(pGV-cpc2-MCS-acl1, 도 23)를 포함하는 발현벡터에서 프로모터 서열은 추가적인EcoRI 부위를 포함하고 있으며,EcoRI 절편은BglⅡ/BamHI 부위로 클로닝되어 있다. 절편의 말단은 블런트 말단을 포함하고 있으며, 발현 벡터는 라이게이션하기 전에 클레나우로 처리하였다. 모든 과정은 표준 방법에 의해 수행되었다.
제조된 발현벡터로 형질전환하는 것은 상기에 언급한 바와 동일하게 수행하였다. 락토페린을 분비하는 형질전환체의 확인은 하기에 기재된 ELISA 방법에 따라 수행하였다
1. 마이크로타이터 플레이트(Nunc Maxisorp)를 샘플 웰당 항-인간락토페린(rabbit affinity-purified anti-hlactoferrin; ICN, Costa Mesa, California;2.4 ㎎/㎖)(pH 9.6의 0.1 M NaCO3로 1:2400배 희석) 100 ㎕를 첨가해 밤새 배양하여 코팅
2.200 ㎕의 PBS + 0.05% Tween®20 (3 ×)로 세척
3.200 ㎕의 PBS + 0.05% Tween®20 + 1% BSA로 실온에서 약하게 쉐이킹하면서 2시간동안 반응
4.상기 2의 용액으로 세척
5.각 웰당 100 ㎕의 인간 락토페린 표준물(ICN) 희석액을 넣어 실온에서 2시간동안 반응. 상기 희석액은 PBS(대조군)로 희석하거나 다양한 재조합 클론의 배양 상등액으로 희석.
6.상기 2의 용액으로 세척.
7.2차 항체를 넣어 실온에서 1시간 동안 반응. 2차 항체로는 퍼옥시다제로 컨쥬게이트된 항-인간 락토페린(rabbit affinity-purified; Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA)(0.8 ㎎/㎖ 용액을 PBS + 0.25% Tween20 + 0.25% BSA에 1:5000으로 희석한 것)을 사용.
8.상기 2의 용액으로 세척.
9.TMB 퍼옥시다제 기질을 발색 반응. TMB 퍼옥시다제 기질(Pierce, Helsingborg) 및 반응 용액(Pierce)을 1:1로 혼합한 뒤 샘플이 있는 각 웰에 100 ㎕씩 분주한다. 원하는 강도의 발색이 나타나면 2 M 설퍼릭산 용액 100 ㎕를 넣어 반응을 중단.
10.발색 강도는 ELISA 측정기에서 450 nm의 파장으로 측정. 배양 상등액 샘플의 농도 확인은 표준 곡선과 비교함으로써 수행.
각각의 락토페린 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체의 배양 상등액을 이용한 ELISA 측정 결과는 야생형 균주 및 락토페린을 삽입하지 않은 균주의 측정 결과와 각각 비교하였다. 소르다리아 마크로스포라에서의 락토페린 유전자의 발현과 배양 상등에서의 외래 락토페린의 분비는ndk1및cpc2프로모터에 대해 모두 측정하였다. 7일 동안 배양한 뒤ndk1프로모터에 의해 조절되어 발현된 락토페린의 측정값은 OD450이 1.375였으며, 소르다리아 야생형 균주 또는 락토페린을 포함하지 않는 형질전환체의 측정값은 각각 OD450이 0.2 및 0.24였다. 또한, 7일 동안 배양한 뒤cpc2프로모터에 의해 조절되어 발현된 락토페린의 측정값은 OD450이 1.95였으며, 소르다리아 야생형 균주 또는 락토페린을 포함하지 않는 형질전환체의 측정값은 각각 OD450이 0.273 및 0.236이었다.
<실시예 13> 아스퍼질러스 니둘란스의 gpd 프로모터의 조절하에 소르다리아 마크로스포라에서 녹색형광 단백질(GFP)을 포함하는 발현벡터의 제조 및 이로부터의 GFP의 생산
소르다리아 마크로스포라에서 외래gfp유전자(Clonetech, USA)를 발현하게하기 위해gfp유전자를 여러 가지 프로모터의 조절을 받게 하거나 프로모터의 조절을 받지 않도록 두 개의 발현 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pEGFP/gpd/tel을 시작 플라스미드로 사용하였다(Inglis et al., 1999)(도 24).
pSM1 플라스미드에서gfp유전자는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)의gpd프로모터에 의해 조절되며, 아스퍼질러스 니둘란스의trpC터미네이터에 의해 끝나게 된다. 게다가, 상기 플라스미드는 진균 형질전환체를 선별하는데 사용하는 하이그로마이신 B 저항성 유전자를 포함하고 있다. pSM1 플라스미드의 제조 과정은 도 25에 나타내었다. pSM1 플라스미드와는 달리 pSM2 플라스미드는gpd프로모터를 포함하고 있지 않다.gfp유전자의 앞에는 gfp 유전자의 발현을 조절하게 하는 이형 또는 동형의 프로모터 서열을 삽입하는 데 용이한 다양한 제한효소 서열이 있는 MCS가 위치한다. 플라스미드 pSM3의 제조는 도 26에 나타내었다.
소르다리아 마크로스포라 균주는 pEGFP/gpd/tel, pSM1 및 pSM3A 플라스미드로 각각 형질전환하였다. 하이그로마이신에 저항성을 띄는지 여부와 형광 현미경을 통한 분석을 통해 형질전환체를 수득하였다. 형광 현미경을 통한 분석은 420 nm 파장의 여기광(exciting light)을 사용하는 액시포트 자이스 현미경(Axiophot Zeiss microscope)을 사용하였다. GFP를 생산하는 클론은 야생형 균주 또는 다른 비교 균주에 대해 유전학적 분석을 하는데 사용하였다. 교배(crossing-over)를 통해 멜로즈(melose)에서 외래의 GFP 단백질이 더욱 안정적으로 유전되는지 확인하였고, GFP 유전자의 발현이 자손에서 안정적으로 유지되는지 확인하였다.
도 27에서 보는 바와 같이, 형질전환체의 증식형 마이셀리움(vegetative mycelium)과 자낭홀씨(ascospore)에서 GFP 유전자의 발현을 확인하였다. 8개의 스포어 자낭홀씨(4개의 스포어는 형광을 띄고, 4개의 스포어는 형광을 띄지 않음)를통해 1:1의 분리되는 것으로 예측되었다. 이러한 GFP 유전자의 발현을 통해된 감수분열 교배 후 소르다리아 마크로스포라에서 발현되는 외부 유전자는 불활성화 과정(예: RIP, MIP, Quelling)을 통해서도 파괴되지 않음을 알 수 있었다.
<실시예 14> cpc2 또는 ndk1 프로모터의 조절하에 소르다리아 마크로스포라에서 GFP의 생산
EGFP 유전자는 올리고뉴클레오타이드 EGFP5' 및 올리고뉴클레오타이드 EGFP3'(표 2)를 사용하여 pSM2 벡터로부터 PCR로 증폭하였다. 726 Bp 크기의EcoRI 절편인 증폭된 PCR 산물을 pGV-ndk1-MCS-acl1(도 22) 벡터에 삽입하여ndk1프로모터의 하류에 위치하도록 하거나 pGV-cpc2-MCS-acl1(도 23) 벡터에 삽입하여cpc2프로모터의 하류에 위치하도록 하였다. 이렇게 제조된 발현 플라스미드가 원형 그대로 보존되는지를 확인한 뒤 소르다리아 마크로스포라의 형질전환에 사용하였다.세포내에서의 EGFP 유전자의 발현은 실시예 13에 기재된 바와 동일하게 수행하였다.
일례로 도 28은ndk1프로모터의 조절을 받으며 EGFP 유전자를 포함하는 형질전환체를 나타내 준다. 형광 현미경 사진(아래)에서 형광을 띄고 있는 것과 대조군인 형질전환되지 않은 균주에서 형광을 띄지 않는 것을 통해 형광은 EGFP가 확실히 있음을 확인할 수 있게 하였다.
대장균, 사카로마이세스 세레비시애(S.c.), 소르다리아 마크로스포라(S.m.), 드로소필라 멜라노가스터(D.m.) 및 영장류(Prim.)에 사용되는 아미노산 코돈의 비교. 각 컬럼에서 소르다리아 마크로스포라와 가장 유사한 서열을 갖는 코돈은 밑줄로 표시.
aa 대장균 S.c. S.m. D.m. Prim.
Phe TTT TTT TTC TTC TTC
Leu CTG TTG CTC CTG CTG
Ile ATT ATT ATC ATC ATC
Val GTG GTT GTC GTG GTG
Ser AGC TCT TCC TCC AGC
Pro CCG CCA CCC CCC CCC
Thr ACC ACT ACC ACC ACC
Ala GCG GCT GCC GCC GCC
Tyr TAT TAC TAC TAC TAC
His CAT GAT CAC CAC CAC
Gln CAG CAA CAG CAG CAG
Asn AAG AAT AAC AAC AAC
Lys AAA AAA AAG AAG AAG
Asp GAT GAT GAC GAT GAC
Glu GAA GAA GAG GAG GAG
Cys TGC TGT TGC TGC TGC
Trp TGG TGG TGG TGG TGG
Arg CGT AGA CGC CGC GCG
Gly GGC GGT GGC GGC GGC
Stop TAA TAA TAA TAA TGA
aa = 아미노산
사용된 올리고뉴클레오타이드
올리고No. 서열번호 서열(5'->3') 특징
1095 26 CGCCGTTTCGTCGGCCACACC cpc2 유전자
1096 27 CGCAGAGCCAGTAGCGGTTGG cpc2 유전자
cpc9 28 CCATGGTTGCAGTTCCTTTCTGGTTGATCA cpc2 프로모터 NcoI 오버행
cpc11 29 CCATGGAGCATGATTGTTAATGCGGAGAAG cpc2 프로모터 NcoI 오버행
cpc10 30 GATATCTTGCAGTTCCTTTCTGGTTGATCA cpc2 프로모터 EcoRV 오버행
cpc12 31 GATATCAGCATGATTGTTAATGCGGAGAAG cpc2 프로모터 EcoRV 오버행
1194 32 GAGCTCATCGATCTCTTGTGCACCGTCAAAGTCCGG acl1 터미네이터 ClaI/SacI 오버행
1197 33 GCGGCCGCTAGTTGCGGAAGGCATCTTC acl1 프로모터 NotI 오버행
1199 34 AAGCTTCTAGAATGGCTTGGGCTGCTTTGGCC acl1 프로모터 HindⅢ/XbaI 오버행
1200 35 GCGGCCGCAAGGGAATTATATAGGGATTAGGG acl1 터미네이터 NotI 오버행
1206 36 GCGGCCGCTTATTTTTGACACCAGACCAACTGG lacZ 유전자 NotI 오버행
1215 37 GCGGCCGCGTCGTTTTACAACTGCTGTACTGGG lacZ 유전자 NotI 오버행
1265 38 CCCCTCGGTTCTACCCGCC ndk1 유전자
1266 39 GAACCAGAGGGCAATCTCC ndk1 유전자
ppg1-1 40 GAGCTCGCGAATCCTCCCGAAACCCA ppg1 프로모터 SacI 오버행
ppg1-2 41 GCGGCCGCTAGCGATGGGCTGGGCAAC ppg1 프로모터 NotI 오버행
ppg1-3 42 GCGGCCGCAAGCGCTATGCCTCCCCCG ppg1 터미네이터 NotI 오버행
ppg1-4 43 GGATCCTCTTGATCGCTATCCCCTTCT ppg1 터미네이터 BamHI 오버행
hsa1 44 GCGGCCGCAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC hsa 유전자 NotI 오버행
hsa2 45 GCGGCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGA hsa 유전자 NotI 오버행
ndk-(SpeI) 46 ATATTACTAGTGTGGTGGTGCACCTCG ndk1 프로모터 SpeI 오버행
ndk-(EcoRI) 47 ATATTGAATTCTTTGATTATGGGTGGTTC ndk1 프로모터 EcoRI 오버행
cpc2-(AvaI) 48 GCTCGAGATCGGAAGGAGGTGGCGAG cpc2 프로모터 AvaI 오버행
cpc2-(SpeI) 49 CACTAGTCTTTGCAGTTCCTTTCTGGTTG cpc2 프로모터 SpeI 오버행
acl1-(NotI) 50 GCGGCCGCAAGGGAATTAT acl1 터미네이터 NotI 오버행
acl1-(ClaI) 51 ATCGATCTCTTGTGCACCGT acl1 터미네이터 ClaI 오버행
EGFP5' 52 CGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG EGFP 유전자 EcoRI 오버행
EGFP3' 53 CGAATTCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG EGFP 유전자 EcoRI 오버행
재조합 플라스미드
플라스미드 표시 구체적 특성
pSM1 박테리아 기본 벡터 pBluescriptⅡKS+에 아스퍼질러스 니둘란스의 Ptrpc 진균 프로모터의 조절을 받는 박테리아 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자(hPh),아스퍼질러스 니둘란스의 Pgpd 프로모터의 조절을 받는 클론텍사의 EGFP(enhanced green fluorescent protein gene)와 아스퍼질러스 니둘란스의 TrpC 터미네이터를 추가로 포함
pSM2 pSM1 발현벡터와 같지만 EGFP 유전자의 앞에 Pgpd 프로모터를 포함하지 않음
pSM3 pSM2 플라스미드와 같지만 hph 저항성 유전자를 포함하지 않음
pMN110 박테리아 기본 벡터 pMON38201에 acd1 프로모터 및 acl1 터미네이터가 삽입됨. 프로모터와 터미네이터는 NotI 절단에 의해 결합됨
pMN112 pBCHygro 벡터에 플라스미드 pMN110에 있는 acl1 프로모터와 acl1 터미네이터를삽입
pPROM1 박테리아 기본 벡터 pMON38201에 있는 SacI/NotI 제한효소 부위에 ppg1 프로모터를 삽입
pTERM1 박테리아 기본 벡터 pMON38201에 있는 NotI/BamHI 제한효소 부위에 ppg1 터미네이터를 삽입
pSMY1-1 플라스미드 pMN112에 acl1 프로모터의 조절을 받는 lacZ 리포터 유전자를 삽입
pSMY1-2 플라스미드 pSMY1-1에 lacZ 유전자가 반대 방향으로 삽입
pSMY2 셔틀 벡터 pCB1004에 있는 SacI/NotI 제한효소 부위에 ppg1 프로모터 서열을 삽입
pSMY3 pSMY2 벡터에 있는 NotI 제한효소 부위에 ppg1 프로모터 서열과 ppg1 터미네이터서열을 결합하여 삽입
pSMY4-1 pMN112에 acl1 프로모터의 조절을 받는 hsa 유전자를 포함
pSMY4-2 pSMY4-1에 hsa 유전자가 반대 방향으로 삽입
pSMY5-1 pSMY3에 ppg1 프로모터의 조절을 받는 lacZ 리포터 유전자를 포함
pSMY5-2 pSMY5-1에 lacZ 유전자가 반대 방향으로 삽입
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상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 이형 유전자를 효과적으로 생산할 수 있다.

Claims (33)

  1. 기능적 조합에 의해 하기 요소를 포함하는 발현 카세트를 포함하고 있는 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균을 배양하는 단계;
    - 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 프로모터,
    - 이형 유전자 및
    - 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 터미네이터
    및 유전적으로 알려진 방식에 의해 생산된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 사상진균에서 이형 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 자웅동체 진균은 소르다리아시애 속에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 자웅동체 진균은 소르다리아 마크로스포라(Sordaria macrospora) 또는 소르다리아 피미콜라(Sordaria fimicola)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 진균은 불임의(sterile) 돌연변이 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 자웅동체 진균의 배양은 27 ±2℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서 활성을 띄는 프로모터는 사상 진균으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 프로모터는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 프로모터는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는cpc2프로모터,ndk1프로모터,acl1프로모터 및ppg1프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서 활성을 띄는 터미네이터는 사상 진균으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 터미네이터는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는 터미테이터인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 터미네이터는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는cpc2터미네이터,ndk1터미네이터,acl1터미네이터 또는ppg1터미네이터인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 이형 유전자는 진핵세포에서 발현된 후에 글리코실레이션되는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 이형 유전자는 성장인자, 사이토카인, 응고 인자, 산업적으로 유용한 단백질 또는 기술적 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 이형 유전자는 하기 단백질들 중 하나를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법: G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL1ra, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 글루코아밀라제(glucoamylase), 응고 인자 Ⅷ(clotting factor Ⅷ), 응고 인자 ⅩⅡ, 응고 인자 ⅩⅢ , 인간 혈청 알부민.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 이형 유전자가 포함된 리딩프레임에 존재하는 프로모터와 이형 유전자 사이에 소르다리아시애 과의 진균에서 기능을 하는 신호 서열을 코딩하는 서열이 배열되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 신호 서열은 사상 진균으로부터 유래되는 신호 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 신호 서열은 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는 신호 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. (1) 하기 핵산들로부터 선택되는, 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서 활성을 띄는 프로모터:
    (a) 서열번호 1로 기재되는 서열을 가지는 핵산;
    (b) 서열번호 2로 기재되는 서열을 가지는 핵산;
    (c) (a) 또는 (b)에 기재된 서열중 하나와 적어도 50%의 상동성을 나타내는 서열을 가지는 핵산;
    (d) (a) 또는 (b)에 기재된 서열의 반대쪽 가닥과 혼성화되는 핵산,
    (e) (a) 또는 (b)에 기재된 핵산의 하나 또는 복수의 뉴클레오티드의 치환, 첨가 및/또는 제거에 의해 얻어진 유도체;
    (f) 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 기능을 유지하는 (a) 내지 (e)로 특정되는 한 핵산의 단편;
    (g) (a) 내지 (f)로 특정되는 핵산들의 복수의 조합으로써, 상기 핵산들의 서열은 동일하거나 또는 다를 수 있는 것을 특징으로 하는 조합;
    또는
    (2) (a) 내지 (g)로 특정되는 어느 한 핵산의 서열과 상보적인 서열을 가지는 핵산을 포함하는 핵산 분자.
  19. 제 18항에 있어서, (c)로 특정되는 핵산은 (a) 또는 (b)로 특정되는 어느 하나의 서열과 적어도 70%의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  20. 제 18항에 있어서, (c)로 특정되는 핵산은 (a) 또는 (b)로 특정되는 어느 하나의 서열과 적어도 90%의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  21. 제 18항에 있어서, (c)로 특정되는 핵산은 (a) 또는 (b)로 특정되는 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  22. 하나 및 다른 하나와의 기능적 조합에 의해 하기 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 소르다리애시애 과의 자웅동체 진균의 형질전환용 벡터:
    - 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 프로모터,
    - 이형 유전자,
    - 소르다리애시애과 진균에서 활성을 띄는 터미네이터 및
    - 선별 마커.
  23. 제 22항에 있어서, 소르다리아시애 과의 진균에서 활성을 띄는 프로모터는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래된acl1프로모터 또는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래된ppg1프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  24. 제 22항에 있어서, 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균에서 활성을 띄는 프로모터는 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 (1)에 따른 핵산인 것을 특징으로 하는 벡터.
  25. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 소르다리아시애 과에서 활성을 띄는 터미네이터는 소르다리아 마크로스포라로부터 유래되는cpc2터미네이터,ndk1터미네이터,acl1터미네이터 또는ppg1터미네이터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  26. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 마커는 하이그로마이신 B-저항 유전자인 것을 특징으로 하는 벡터.
  27. 제 22항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균의 숙주 생물.
  28. 제 27항에 있어서, 숙주 생물은 소르다리아 속에 속하는 것을 특징으로 하는 숙주 생물.
  29. 제 28항에 있어서, 숙주 생물은 소르다리아 마크로스포라 또는 소르다리아 피미콜라인 것을 특징으로 하는 숙주 생물.
  30. 제 27항, 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 숙주 생물은 불임의 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 생물.
  31. (a) 제 22항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 발현 벡터 및
    (b) 이형 단백질의 생산에 적합한 소르다리아시애 과의 자웅동체 진균을 포함하는 킷트.
  32. 프로모터의 조절하에서 이형 유전자를 발현시키기 위한 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제 22항 내지 제 26항 중 어느 한항의 발현 벡터 또는 제 31항의 킷트의 용도.
  33. 단백질들의 하나 또는 복수를 생산하기 위한 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제 22항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 발현 벡터 또는 제31항의 킷트의 용도.
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