DE69130122T2

DE69130122T2 - Verfahren zur Modulierung der Produktion von sekundären Metaboliten.

Info

Publication number: DE69130122T2
Application number: DE69130122T
Authority: DE
Inventors: Roelof Ary Lans Nl-3062 Zd Rotterdam Bovenberg; Walraven Henry Nl-3317 Jk Dordrecht Muller; Lucia Helena Marie Nl-2611 Ns Delft Van Der Voort; Adrianus Johannes Nl-3438 Ql Nieuwegein Verkley
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1990-03-23
Filing date: 1991-03-25
Publication date: 1999-02-18
Anticipated expiration: 2011-03-26
Also published as: ATE166392T1; PT97116A; EP0448180A2; JPH05199897A; IE910956A1; EP0448180B1; PT97116B; EP0448180A3; DE69130122D1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modulation der Bildung von sekundären Metaboliten, für die Penicilline und Cephalosporine Beispiele sind.

Hintergrund

β-Lactam-Antibiotika sind eine große Familie von sekundären Metaboliten, die in der Natur von Mikroorganismen gebildet werden. Sekundäre Metaboliten sind Metaboliten, die keine bekannte essentielle metabolische Funktion für den sie bildenden Organismus aufweisen. Die wichtigsten Klassen der β-Lactam-Antibiotika sind sowohl in klinischer als auch in wirtschaftlicher Hinsicht die Penicilline (Penam) und Cephalosporine (Cephem). Ihre Biosynthese verläuft über einen komplexen Stoffwechselweg von enzymatischen Stufen; die Aufklärung dieses Stoffwechselwegs ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen während der letzten Jahrzehnte. Die beiden ersten Stufen in den Biosynthesewegen der Penam- und Cephemklassen der β-Lactam-Antibiotika sind identisch. Anschließend weichen die Biosynthesewege für die Penicilline und Cephalosporine voneinander ab (Fig. 1).
Die erste Stufe in der Biosynthese von Penicillin-, Cephalosporin- und Cephamycin-Antibiotika ist die Kondensation der L-Isomeren der drei -Aminosäuren L-α-Aminoadipinsäure (A), L-Cystein (C) und L-Valin (V) zu einem Tripeptid, nämlich δ-(L-α-Aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin oder ACV. In der zweiten Stufe wird das Tripeptid ACV oxidativ durch die Einwirkung von Isopenicillin N-Synthase (nachstehend als IPNS bezeichnet) oder Cyclase cyclisiert. Das Produkt dieser Reaktion ist Isopenicillin N; diese Verbindung enthält die typischen β-Lactam- und Thiazolidinringstrukturen und besitzt antibakterielle Aktivität. Aus Isopenicillin N werden die Penicilline G oder V durch Austausch der hydrophilen α-AAA- Seitenkette gegen eine hydrophobe Seitenkette gebildet. Die Seitenketten, die bei großtechnischen Verfahren üblicherweise verwendet werden, sind Phenylessigsäure (PA), was Penicillin G ergibt, oder Phenoxyessigsäure (POA), was Penicillin V ergibt. In vitro muß die Seitenkettenvorstufe aktiviert werden, bevor die Transacylierung auftritt; es ist vorgeschlagen worden, daß in vivo diese Aktivierung durch eine PAA-Coenzym A-Ligase ka talysiert wird. Die Austauschreaktion wird durch das Enzym Acyltransferase (nachstehend als AT bezeichnet) katalysiert.
Ausgehend von Isopenicillin N führt der Weg zu Cephalosporin und den Cephamycinen über die Racemisierung der α-AAA-Seitenkette zur Bildung von Penicillin N. Diese Reaktion wird durch ein Enzym katalysiert, das als Epimerase oder Racemase bezeichnet wird. Der 5-gliedrige Ring in Penicillin N wird zu einem 6-gliedrigen Ring durch die Einwirkung des Enzyms Deacetoxycephalosporin C-Synthase oder Expandase erweitert. Es wurde gezeigt, daß das Pilzenzym auch die nächste Reaktion auf dem Stoffwechselweg, die Hydroxylierung der Methylgruppe in der 3'-Position des 6- gliedrigen Rings unter Bildung von Deacetylcephalosporin C, katalysiert. In Streptomyceten wird diese letztgenannte Enzymaktivität von einem getrennten Gen kodiert. Aus Deacetylcephalosporin C wird Cephalosporin C durch Acetylierung der 3'-Position gebildet. Die Cephamycine werden aus Deacetylcephalosporin C in mehreren enzymatischen Stufen gebildet.
Die meisten Enzyme, die an der Biosynthese von β-Lactamen beteiligt sind, sind inzwischen charakterisiert worden. Die Gene für ACVS, IPNS und AT sind kloniert worden und können in Programmen zur Stammverbesserung verwendet werden. Es ist jedoch wenig über die weiteren Aspekte der Penicillinbiosynthese, wie über die Lokalisierung der Enzyme und den Transport von Zwischenprodukten und Produkten des Stoffwechselwegs, bekannt. In der vorliegenden Patentanmeldung beschreiben wir die Lokalisierung von AT in mycelialen Zellen. Auf der Basis der Lokalisierung der Enzyme werden Verfahren angegeben, die die Modulation der Bildung von sekundären Metaboliten, wie Penam- und Cephemverbindungen, erlauben.

Relevante Literatur

Sekundärer Metabolismus bezieht sich auf die Bildung von Metaboliten, die keine essentielle metabolische Funktion in dem sie bildenden Organismus aufweisen. Für eine weitere Definition und einen Übersichtsartikel vgl. Industrial Aspects of Biochemistry, Bd. 30, Teil 1, J. D. Bu'lock (1974), S. 335, B. Spencer (Hrsg.), North Holland/American Elsevier, Holland; und L. C. Vining, Biotechnology, a comprehensive treatise in eight volumes, Bd. 4, S. 20-38, H. J. Rehm und G. Reed (Hrsg.), 1986, VCH, Weinheim, Deutschland.
Hinweise auf die Biosynthesewege von β-Lactamen finden sich in Ingolia und Queener, Med. Res. Rev., Bd. 9 (1989), S. 245-264.
Die Biosynthese der meisten zellulären Proteine beginnt im Cytoplasma. Auf der Basis des Vorhandenseins von spezifischen Aminosäuresequenzen werden sie in verschiedene Kompartimente der Zelle transportiert. Die Hauptwege des Proteinverkehrs werden in Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., (Hrsg.), 1989, Garland Publ. Inc., New York, beschrieben.
Die Enzyme ACVS, IPNS und AT sind gereinigt worden. ACVS ist ein großes multifunktionelles Enzym mit einem scheinbaren Molekulargewicht von mehr als 250 Kilodalton (kDa) (Van Liempt et al., J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 3680-3684). Das scheinbare Molekulargewicht von IPNS beträgt 39 kDa (Ramos et al., Antimicrobial Agents and Chemother., Bd. 27 (1985), S. 380-387). Gereinigte Enzymzubereitungen von AT enthalten zwei Polypeptide mit scheinbaren Molekulargewichten von 29 und 10 kDa (vgl. EP-A-336446). Die Gene für ACVS, IPNS und AT sind kloniert worden (Carr et al., Gene, Bd. 48 (1986), S. 41-75; EP-A-320272; EP-A-354624; Barredo et al., Gene, Bd. 83 (1989), S. 291-300). Die Clusterbildung dieser drei Gene ist in EP-A-320727 und in EP-A-357119 beschrieben. Die PAA-Coenzym A-Ligase ist von Brunner und Röhr, Methods in Enzymology, Bd. 53 (1975), S. 476-481 beschrieben worden.
Es gibt folgende Hinweise auf die zelluläre Lokalisierung von Enzymen, die an der Penicillinbiosynthese beteiligt sind. Kurylowicz et al. haben vorgeschlagen, daß die Bildung von Penicillin in den Vesikeln des Golgi-Apparats stattfindet (Kurylowicz et al., Zbl. Bakt. II Abt., Bd. 134 (1979), S. 706-720; Atlas of Ultrastructure of Penicillium chrysogenum in Course of Biosynthesis of Penicillin, Kurylowicz et al. (Hrsg.), 1980, Chemia Publ. Office, Warschau; Kurylowicz et al., Archivum Immunologiae et Therapeae Experimentalis, Bd. 35 (1987), S. 699-724). Kurylowicz et al. (1987, a.a.O.) haben vorgeschlagen, daß Penicillin in 40-200 nm Golgi-Vesikeln gebildet wird, wobei Penicillin anschließend zur Plasmamembran durch 40 nm-Vesikel transportiert wird. Diese Vesikel verschmelzen sodann mit der Plasmamembran und setzen ihren Inhalt in die Fermentationsbrühe frei. Diese Hypothese basiert auf der elektronenmikroskopischen Beobachtung, daß Penicillin G im Innern von Substrukturen, die aus kleinen Vesikeln bestehen, oder in einzelnen Vesikeln im Mycelium eines Stammes mit hoher Ausbeute angereichert wird. Ferner beschreiben Kurylowicz et al. (1987, a.a.O.) Zellfraktionierungsexperimente, aus denen sie ableiten, daß ACVS, IPNS, PAA-CoA-Ligase und AT-Aktivitäten in Golgi-Vesikeln mit einer Größe im Bereich von 40-200 nm vorhanden sind. Nach Immobilisierung von Vesikeln von 40-200 nm wurde die zellfreie Biosynthese von Penicillin gezeigt. Beweise und Interpretation im Hinblick auf die Lokalisierung von Enzymen für die Penicillinbiosynthese in Vesikeln des Golgi-Apparats sind jedoch nicht sehr überzeugend, da (1) das klassische Dünnschnittverfahren, das sie zur Herstellung von Proben für die Elektronenmikroskopie angewandt haben, leicht Artefakte in Ultra struktur und Lokalisierung einführen kann (Cryotechniques in Biological Electron Microscopy, Knoll et al., S. 258-271, R. A. Steinbrecht und K. Zierold (Hrsg.), 1987, Springer Verlag, Berlin; und Plattner und Zingsheim, Subcellular Biochemistry, Bd. 9, S. 1-236, D. B. Roodyn (Hrsg.), 1983, Plenum Press, New York) und (2) bei den Zellfraktionierungsexperimenten erhaltende Fraktionen nicht durch Markerenzyme und Elektronenmikroskopie charakterisiert wurden.
Die Lokalisierung von Enzymen der Penicillinbiosynthese ist von einigen anderen Gruppen von Forschern untersucht worden. Es ist berichtet worden, daß ACVS ausschließlich mit einer teilchenförmigen Fraktion des rohen Homogenisats von Mycelium assoziiert ist (Fawcett und Abraham, Methods Enzymol., Bd. 43 (1975), S. 471-473; Fawcett und Abraham, Biosynthesis, Bd. 4 (1976), S. 248-265), was zeigt, daß sie möglicherweise mit zellulären Membranen assoziiert ist. Es gibt kontroverse Daten hinsichtlich der Lokalisierung von IPNS in Cephalosporium. Abraham et al. (Recent Advances in the Chemistry of β-Lactam Antibiotics, S. 125-134, G. I. Gregory (Hrsg.), 1981, Royal Society of Chemistry, London) beschreiben sie als ein Zytosolenzym, da sie bei der Hochgeschwindigkeitszentrifugation nicht als Niederschlag erhalten wurde. Sawada et al., Antimicrobial Agents Chemother., Bd. 18 (1980), S. 465-470 haben jedoch gezeigt, daß IPNS-Aktivität durch Beschallung und Zugabe von Detergens aktiviert wird, was darauf hinweist, daß das Enzym in Vesikeln eingeschlossen ist. Luengo et al. haben (in einer Arbeit, die beim 2. Eur. Congr. Biotechnol., Eastbourne, England, 1981 vorgelegt wurde) angegeben, daß die Seitenkettenaustauschreaktion auf den periplasmatischen Raum beschränkt ist. Dies ist bis jetzt nicht bestätigt worden. Die Lokalisierung von Enzymen der Cephalosporinbiosynthese ist nicht mit irgendwelchen Einzelheiten beschrieben worden.
Für einen Überblick über die Ultrastruktur von Pilzmycelien vgl. The Filamentous Fungi, Bd. 1-4, Smith und Berry (Hrsg.), 1979, Academic Press, London. Andere Druckschriften, die Kompartimente innerhalb von Pilzmycelien betreffen, umfassen die folgenden: Markham und Collinge, FEMS Microbiology Reviews, Bd. 46 (1987), S. 1-11; Head et al., Experimental Mycology, Bd. 13 (1989), S. 203-211; Smith und Berry, a.a.O.; Gooday in: Fungal Differentiation, a Contemporary Synthesis, Mycology series, S. 315-365 (1983), J. E. Smith und P. A. Lenke (Hrsg.), Marcel Dekker, New York.
Für Übersichtsartikel über Vacuolen vgl. Molecular Biology of the Cell (a.a.O.) und Kurylowicz et al. (1980, a.a.O.). Organellen, die in allen Typen von eukaryontischen Zellen unter Einschluß von Pilzen gefun den werden, sind Kerne, Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum, der Golgi-Apparat und Mikrokörperchen; für eine Übersicht vgl. Molecular Biology of the Cell (a.a.O.) und Smith und Berry (a.a.O.). Mikrokörperchen sind Organellen mit einer einzelnen Membran. Beispiele für Enzyme, die in Mikrokörperchen enthalten sind, umfassen die, die an der β-Oxidation der Fettsäuren beteiligt sind (Borst, Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 1008 (1989), S. 1-13). Mikrokörperchen können Katalase enthalten. In diesem Fall werden sie oft als Peroxysomen bezeichnet. Mikrokörperchen können auch Enzyme des Glyoxylat-Zyklus enthalten. Sie werden dann oft als Glyoxysomen bezeichnet. Mikrokörperchen können sich Änderungen der metabolischen Bedingungen durch Änderungen des Enzymgehalts anpassen. In Pilzzellen variiert ihre Größe zwischen 0,2 und 2,6 um (Maxwell et al., Planta, Bd. 124 (1975), S. 109-123). Hinweise auf Zielsignale für Proteine zu Mikrokörperchen finden sich in Gould et al., J. Cell. Biol., Bd. 108 (1989), S. 1657-1664.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung dabei werden zur Modulation der Bildung von sekundären Metaboliten bereitgestellt. Die Verfahren umfassen Stufen der Modulation der zellulären Lokalisierung wenigstens eines Proteins, das gegebenenfalls von einem weiteren Mikroorganismus abgeleitet ist und direkt oder indirekt an der Bildung des sekundären Metaboliten beteiligt ist, indem man eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für ein oder mehrere Zielsignale in dem Gen oder den Genen von einem oder mehreren dieser Proteine kodieren, addiert, deletiert oder verändert. Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung auf die Modulation der Bildung von Penicillinen und Cephalosporinen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt schematisch den Biosyntheseweg zu β-Lactam-Antibiotika.
Fig. 2 zeigt den Nachweis von AT durch Immunogoldmarkierung in einer Organelle im Cytoplasma von Wisconsin 54-1255-Zellen.
Fig. 3 zeigt (a) eine junge hyphale Zelle mit goldmarkierten Mikrokörperchen (Pfeilspitzen); eine stärkere Vergrößerung der Mikrokörperchen ist auf der rechten Seite gezeigt; (b) eine alte hyphale Zelle, die eine große Vacuole, einen Kern und ein goldmarkiertes Mikrokörperchen (Pfeilspitze) aufweist; eine stärkere Vergrößerung des Mikrokörperchens ist darunter gezeigt.
Fig. 4 zeigt Immunoblots von Zellfraktionen, die mit Antiseren gegen ACVS, IPNS und AT kontrastiert sind; Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite angegeben; die Banden, die ACVS, IPNS und AT entsprechen, sind mit einem Pfeil bezeichnet.
Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung von pMA-AT.
Fig. 6 zeigt eine schematische Darstellung von pMC-AT.
Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung der Mutationen, die in das penDE-Gen eingeführt wurden. Die Nucleotidsequenzen der Oligonucleotide S (Oli S) und D (Oli D) und eine partielle Nucleotidsequenz von penDE sowie die Aminosäuresequenzen (im Einbuchstabencode), die von den DNA-Sequenzen abgeleitet sind, sind gezeigt.

Kurze Darstellung der speziellen Ausführungsformen

Erfindungsgemäß werden Verfahren und Zusammensetzungen bereitgestellt, die die Modulation der Bildung von sekundären Metaboliten erlauben. Die Verfahren basieren auf der Kenntnis der Lokalisierung von Proteinen, die an der Bildung von sekundären Metaboliten beteiligt sind. Der Ausdruck Modulierung erstreckt sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung auf alle denkbaren Arten der Änderung, d. h. Verstärkung, Erzeugung, Verringerung oder Zerstörung. Lokalisierung erstreckt sich sowohl auf eine spezifische Lokalisierung als auch auf ein Verfahren des Leitens zu einer spezifischen Lokalisierung innerhalb der Zelle.
Verfahren zur Modulation der Bildung von sekundären Metaboliten umfassen die Modulation der zellulären Lokalisierung von einem oder mehreren Proteinen, die direkt oder indirekt an der Bildung eines speziellen sekundären Metaboliten beteiligt sind, durch Addition, Deletion oder Änderung der DNA-Sequenz, die ein Zielsignal/Zielsignale eines oder mehrerer der Proteine kodiert. Ein Zielsignal ist hier als eine Aminosäuresequenz in einem Polypeptid definiert, die bewirkt, daß das Polypeptid in einer der Zellorganellen lokalisiert wird. Diese Definition umfaßt auch Retentionssignale, z. B. Aminosäuresequenzen, die bewirken, daß das Protein im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert wird.
Die Proteine können direkt oder indirekt an der Bildung der sekundären Metaboliten beteiligt sein. Proteine, die direkt beteiligt sind, sind Enzyme, die essentiell für den Biosyntheseweg zu den sekundären Metaboliten sind, wie beispielsweise Enzyme der Penicillinbiosynthese. Proteine, die indirekt an der Bildung der sekundären Metaboliten beteiligt sind, sind diejenigen Proteine, deren Expression und/oder Aktivität einen Einfluß auf die Bildung der sekundären Metaboliten hat. Derartige Proteine sind z. B. daran beteiligt, die Bedingungen aufrechtzuerhalten, die für die Bildung des sekundären Metaboliten geeignet sind, wie pH-Wert und Verfügbarkeit von ATP, oder sie sind am Transport von Proteinen oder Substraten und Produkten, die zum Biosyntheseweg gehören, beteiligt.
Die Vorteile, die mit diesen Verfahren verbunden sind, bestehen in folgendem. Die Verbesserung der Bildung der sekundären Metaboliten durch Änderung des Biosynthesewegs auf solche Weise, daß Zwischenprodukte nicht von einem zellulären Ort zu einem anderen transportiert werden müssen. Dies wird durch Colokalisierung von zwei oder mehr Enzymen erreicht, die an der Bildung eines sekundären Metaboliten beteiligt sind, und zwar im Cytoplasma oder in einer speziellen Organelle. Ein weiterer Vorteil ist die Erzeugung eines Stoffwechselwegs, der zu einem speziellen sekundären Metaboliten führt, wobei der Weg natürlicherweise in einem speziellen Mikroorganismus nicht vorhanden ist. Dies kann erreicht werden, indem ein oder mehrere Proteine, die direkt oder indirekt an der Biosynthese des sekundären Metaboliten beteiligt sind, wobei die Proteine natürlicherweise nicht in dem Organismus vorhanden sind, mit einem Zielsignal für Organellen, die Substrat für eines der Enzyme, die an der Bildung des sekundären Metaboliten beteiligt sind, ausgestattet werden und diese Proteine in den Mikroorganismus kloniert werden. Die Bildung eines sekundären Metaboliten kann auch durch Verwendung eines Organismus, der natürlicherweise nicht imstande ist, diesen Metaboliten zu bilden, verbessert oder erleichtert werden. Dies kann erreicht werden, indem ein oder mehrere Proteine, die direkt oder indirekt an der Bildung des sekundären Metaboliten beteiligt sind, mit einem Zielsignal für eine spezielle Organelle ausgestattet werden und diese Proteine in den Mikroorganismus kloniert werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der Verwendung von Genen, die Enzyme kodieren, die keine Zielsignale aufweisen, wie beispielsweise bakterielle Enzyme für die Stammverbesserung von eukaryontischen Mikroorganismen, die an der Bildung eines speziellen sekundären Metaboliten beteiligt sind, indem diese Enzyme mit einem Zielsignal für eine Organelle ausgestattet werden, die an der Bildung des sekundären Metaboliten beteiligt ist, und das geänderte Gen in den Mikroorganismus kloniert wird. Weitere Vorteile sind die Verbesserung der Bildung eines sekundären Metaboliten, indem Proteine, die direkt oder indirekt an dessen Biosynthese beteiligt sind, mit einem veränderten Zielsignal ausgestattet werden, was zu einer verbesserten oder verringerten Menge an Protein in der/den an der Bildung beteiligten Organelle(n) führt. Die Verbesserung der Bildung eines sekundären Metaboliten kann auch durch Entfernung oder Addition eines Zielsignals von einem oder mehreren Proteinen oder an ein oder mehrere Proteine, die direkt oder indirekt an der Bildung des sekundären Metaboliten beteiligt sind, erzielt werden, um das Protein aus einer Organelle, die an der Bildung des sekundären Metaboliten beteiligt ist, zu entfernen, oder es einer derartigen Organelle zuzuführen. Sekundäre Meta boliten umfassen Metaboliten, wie diejenigen, die von Sacchariden abgeleitet sind, z. B. Kojisäure, diejenigen, die von Aminosäuren abgeleitet sind, wie β-Lactamverbindungen und Alkaloide, diejenigen, die von Acylvorstufen abgeleitet sind, wie Carotinoide und Polyketide, diejenigen mit einer Beziehung zu Nucleinsäuren und diejenigen mit einer gemischten Biogenese, wie die Prodigiosinfamilie von Pigmenten und Fluoressigsäuren.
Um die zelluläre Lokalisierung von Proteinen, die in Beziehung zur Bildung eines sekundären Metaboliten von Interesse stehen, zu bestimmen, wird die Ultrastruktur einer Zelle, die den sekundären Metaboliten synthetisiert, auf einer mikroskopischen Ebene, vorzugsweise auf einer elektronenmikroskopischen Ebene, visualisiert. Die Technik, die zur Herstellung der Proben herangezogen wird, sollte für eine optimale Konservierung der nativen Zellstrukturen für den Dünnschnitt sorgen, wie es z. B. durch Schnellgefrieren und Gefriersubstitution erzielt wird; für einen Überblick vgl. Immunogold Labelling in Cell Biology, A. J. Verkley und J. L. M. Leunissen (Hrsg.) CRC Press, Boca Raton, Florida (1989). Proteine werden z. B. durch zytochemische Verfahren, vorzugsweise jedoch durch immunzytochemische Verfahren, z. B. durch das Protein A/Goldmarkierungsverfahren, lokalisiert. Ein Verfahren, das die zelluläre Lokalisierung von Proteinen bestätigen kann, ist die Zellfraktionierung. Für eine Beschreibung dieser Verfahren vgl. Cell Biology, a Molecular Approach, R. D. Dyson, 1978; und Biological Membranes, a Practical Approach, Findlay und Evans (Hrsg.), 1987, IRL Press, Oxford. Organellen können teilweise durch Zellfraktionierexperimente getrennt werden. Die Zellen werden vorsichtig aufgebrochen, und das Homogenisat wird Zentrifugationsstufen mit steigender Geschwindigkeit unterworfen. Die Organellen weisen unterschiedliche Sedimentationsgeschwindigkeiten auf. Bei typischen Experimenten mit tierischen Zellen sedimentieren Kerne und nicht aufgebrochene Zellen bei 6 · 10² g · 10 min. Mitochondrien, Mikrokörperchen und Lyposomen sedimentieren bei 15 · 10³ g · 5 min. und das endoplasmatische Retikulum sedimentiert bei 100 · 10³ g · 60 min. Der verbleibende Überstand ist der lösliche Anteil des Cytoplasmas, das Cytosol (Cell Biology, A Molecular Approach, a.a.O.). Die erfolgreiche Fraktionierung von Organellen hängt sehr stark vom vorsichtigen Aufbrechen der Zellen ab. Insbesondere die Integrität der Mikrokörperchen wird stark durch die Lyse der Zellen beeinflußt (Kionka et al., J. Bacteriology, Bd. 161 (1985), S. 153-157). Das Vorhandensein der Proteine von Interesse kann, z. B. wenn das Protein ein Enzym ist, durch einen Assay auf die Aktivität oder durch Immunoblotverfahren bestimmt werden. Die zelluläre Lokalisierung der Enzyme, die in Beziehung zur Bildung der sekundären Metaboliten von Interesse stehen, kann auch aus der Anordnung der Nucleotidsequenzen des Gens, das das Enzym kodiert, in bezug auf Consensussequenzen der Zielsignale abgeleitet werden.
Der Wirtsorganismus kann selektiv durch Techniken manipuliert werden, die Änderungen in der Lokalisierung der Proteine hin zu oder aus einer Organelle bewirken. Die Techniken werden im Hinblick auf die Veränderung des zellulären Orts hin zu oder aus einem Mikrokörperchen beschrieben; dies kann jedoch durch eine beliebige Organelle ersetzt werden. Die Lokalisierung der Proteine, die direkt oder indirekt an der Bildung von sekundären Metaboliten beteiligt sind, kann entweder ausgehend vom natürlichen Ort im Mikrokörperchen hin zu einem anderen Ort in der Zelle oder ausgehend vom natürlichen Ort anderer Teile der Zelle, die von Mikrokörperchen verschieden sind, hin zum Mikrokörperchen durch Addition, Deletion oder Änderung der DNA-Sequenzen, die das Mikrokörperchenzielsignal des Proteins kodieren, geändert werden.
Zielsignale für Mikrokörperchen sind z. B. die konservierte Tripeptidsequenz, die von Gould (a.a.O.) beschrieben wurde. Die Verfahren gelten auch für andere Aminosäuresequenzen, die an der Zielrichtung von Proteinen zu Mikrokörperchen beteiligt sind. Sequenzen, die an der Zielrichtung beteiligt sind, können z. B. nach den Verfahren, die von Gould (a.a.O.) beschrieben wurden, oder durch Vergleich von Aminosäuresequenzen von Genen mit Consensussequenzen für Zielsignale identifiziert werden.
Mikrokörperchenzielsequenzen können geändert, von Proteinen entfernt oder zu Proteinen hinzugefügt werden, und zwar durch gerichtete Mutagenese des Gens, das das Protein von Interesse kodiert. Techniken und Strategien für die gerichtete Mutagenese sind allgemein verfügbar, bekannt und gut dokumentiert (Smith, Annual Review of Genetics, Bd. 19 (1985), S. 423-462; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Maniatis et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor; M. A. Innes, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky und T. J. White (Hrsg.), PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, San Diego). Zwei Hauptansätze werden vorzugsweise angewandt. Ein Ansatz wendet im wesentlichen die Isolierung von einzelsträngiger (ss) DNA aus einem Plasmid, das das Gen von Interesse enthält, die Anellierung dieser ss DNA mit einem synthetischen Oligonucleotid, das die Mutation enthält, und die in vitro-Synthese (eines Teils) des komplementären Strangs an. Die Duplex-DNA wird in E. coli transformiert, und doppelsträngige (ds) mutierte Plasmidmoleküle werden selektiert, und zwar typischerweise durch Hybridisierung mit dem mutierten Oligonucleotid. Ein anderer Hauptansatz wendet die Polymerasekettenreaktion (PCR) an. Bei diesem Ansatz werden die gewünschten Mutationen ebenfalls in synthetischen Oligonucleotiden entwickelt; im Gegensatz zum ersten Ansatz ist es jedoch nicht erforderlich, das Gen von Interesse zunächst zu klonieren.
Das Signal kann am C-terminalen Teil des Polypeptids oder in den inneren Regionen bereitgestellt werden. Manipulationen umfassen die Entfernung eines Zielsignals/von Zielsignalen aus einem Protein für Organellen, die von Mikrokörperchen verschieden sind, und die Addition eines Zielsignals/von Zielsignalen für Mikrokörperchen; die Addition eines Mikrokörperchenzielsignals an ein Protein, das keine anderen Zielsignale aufweist; die Entfernung, Änderung oder Zerstörung eines Mikrokörperchenzielsignals; oder den Austausch eines Mikrokörperchenzielsignals gegen ein anderes.
Beispielhaft für die Anwendung der vorstehenden Verfahren bei der Herstellung von β-Lactamverbindungen ist folgendes.
Die Lokalisierung von AT wurde durch Immunoelektronenmikroskopie untersucht. AT war in Einzelmembranvesikeln mit einem Durchmesser im Bereich von 200-800 nm vorhanden. Vesikel, die AT enthielten, waren in jungen Zellen und in älteren Kompartimenten der Hyphae vorhanden. Auf der Basis von Morphologie, Größe und Verteilung in den Hyphae können diese Vesikel als Mikrokörperchen klassifiziert werden. Bei Zellfraktionierungsexperimenten sedimentierte AT-Aktivität bei 15 · 10³ g · 30 min zusammen mit Enzymaktivitäten der Mitochondrien und der Vacuole. Katalaseaktivität wurde in dieser Fraktion ebenfalls gefunden. IPNS-Aktivität ist in einer Fraktion lokalisiert, die zytosolischen Enzymen entspricht. Diese Ergebnisse wurden durch Immunoblotexperimente bestätigt. Ferner wurde in diesen Experimenten gezeigt, daß ACVS in einer weiteren zellulären Fraktion lokalisiert ist, die bei 100 · 10³ g · 60 min sedimentiert. Dies zeigt, daß eine der Stufen der Penicillinbiosynthese in Mikrokörperchen lokalisiert ist. Durch Vergleich von Stämmen, die im Hinblick auf die Bildung von Penicillin eine hohe Ausbeute oder eine geringe Ausbeute aufweisen, wurde gezeigt, daß eine klare Korrelation zwischen der Anzahl der Mikrokörperchen, die AT enthalten, und der Menge an Penicillin besteht. Ferner wurde die Anzahl der Mikrokörperchen, die AT enthalten, in Stämme mit hoher Ausbeute unter nicht zur Penicillinbildung führenden Bedingungen verringert. Diese Beispiele zeigen, daß die Modulation der Anzahl und/oder Größe der Mikrokörperchen, die AT enthalten, eine wichtige Maßnahme zur. Verbesserung der Penicillinbildung ist.
Unsere Lokalisierungsexperimente zeigen weiter, daß IPNS nicht in den Mikrokörperchen vorhanden ist. Dies bedeutet, daß Substrate und Produkte von Enzymen, die an der Bildung von β-Lactamverbindungen beteiligt und in Mikrokörperchen lokalisiert sind, z. B. Substrate für das Enzym AT, wie Isopenicillin N und PAA oder aktiviertes PAA, sowie Produkte, wie Penicillin G und α-Aminoadipinsäure, in die Mikrokörperchen importiert bzw. aus den Mikrokörperchen exportiert werden müssen. Diese Import- und Exportsysteme bilden einen Teil der Mikrokörperchen, die an der Penicillinbildung beteiligt sind. Sie sind auch ein integraler Teil des Penicillinbiosynthesewegs und können daher für die geschwindigkeitsbestimmende Stufe innerhalb des Biosynthesewegs verantwortlich sein. Durch Manipulation der Expression dieser Systeme, z. B. durch Einführung von zusätzlichen Kopien der Gene, die diese Systeme kodieren, wird der Wirkungsgrad der Bildung von Penicillin verbessert.
Beispielhaft für die Möglichkeit, die Bildung von β-Lactamantibiotika durch Änderung der Lokalisierung eines oder mehrerer Proteine, die an der β-Lactambiosynthese beteiligt sind, zu beeinflussen, ist die Änderung der Lokalisierung von AT. AT enthält die C-terminale Aminosäuresequenz ARL (A = Alanin, R = Arginin und L = Leucin; ARL ist eine der von Gould (a.a.O.) erwähnten Mikrokörperchenzielsequenzen). Das ARL-Zielsignal wurde aus dem Gen, das AT kodiert, entfernt, woran sich die Klonierung des veränderten Gens in P. chrysogenum anschloß. AT wurde in den Transformanten exprimiert, und zellfreie Extrakte, die aus den Transformanten hergestellt wurden, waren im AT-Aktivitätsassay aktiv. Die Transformanten bilden kein Penicillin in nachweisbaren Mengen, was beweist, daß es möglich ist, die Bildung von β-Lactamantibiotika durch Änderung der Lokalisierung von AT zu beeinflussen. Unter diesen experimentellen Bedingungen wurden die Enzyme, die an der Aktivierung der Seitenkettenvorstufe beteiligt sind, nicht relokalisiert, was erklären kann, warum die Colokalisierung von IPNS und AT nicht zu einer verbesserten Bildung führte.
Ein weiteres Beispiel für die Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Addition eines Zielsignals für eine spezielle Organelle an Enzyme der β-Lactambiosynthese aus prokaryontischen Organismen. Diese Enzyme können eine bessere Stabilität oder eine höhere Aktivität oder einen breiteren Substratbereich als die Enzyme mit einer ähnlichen Aktivität aus eukaryontischen Organismen aufweisen. Prokaryontische Gene kodieren im allgemeinen keine Zielsignale für eukaryontische Organellen. Durch Addition eines Zielsignals an das prokaryontische Enzym kann dieses Enzym zu einem gewünschten Ort in der Zelle geleitet werden. Die Enzyme können aus prokaryontischen Mikroorganismen, vorzugsweise aus Streptomyces-, Nocardia- und Flavobacterium-Spezies, erhalten werden.
Ein weiteres Beispiel ist die Bildung von β-Lactamverbindungen, die nicht natürlicherweise in dem speziellen Organismus gebildet werden, die jedoch nach Einführung von Genen, die die Proteine, die an der Biosynthese der β-Lactamverbindungen beteiligt sind, kodieren, gebildet werden. Zum Beispiel sind die Gene für die Biosynthese von Cephalosporin in Penicillium-Stämmen nicht vorhanden. Die Bildung von Cephalosporinen (wie von Cephalosporin C, ferner Deacetyl- oder Deacetoxyderivaten, von 7-Aminocephalosporansäure, ihren Deacetyl- oder Deacetoxyderivaten, von Cephamycinen) in Penicillium mag von Vorteil sein, z. B. wenn Stämme verwendet werden, die große Mengen an Isopenicillin N bilden, oder wenn Stämme verwendet werden, die verbesserte Wachstums- oder Nachbearbeitungseigenschaften aufweisen. Der größte Teil des Isopenicillins N, das durch IPNS gebildet wird, wird zu den Mikrokörperchen transportiert. Epimerase, wobei es sich um ein Enzym handelt, das an der Biosynthese von Cephalosporin und dessen Zwischenprodukten beteiligt ist, hat Isopenicillin N als ein Substrat. Durch Verhinderung der Expression von AT in P. chrysogenum, z. B. durch Unterbrechen des penDE-Gens durch Anwendung der Antisense- Technik oder durch Verwendung von Mutanten, die keine AT exprimieren, und durch Lokalisierung von Epimerase und vorzugsweise anschließender Enzyme der Cephalosporinbiosynthese, wie Expandase und Hydroxylase, z. B. aus Acremonium chrysogenum oder aus Streptomyces-Stämmen, in den Mikrokörperchen wird der Wirkungsgrad der Bildung von Cephalosporin oder seiner Zwischenprodukte in P. chrysogenum verbessert.
Erfindungsgemäß werden auch Gene, die Proteine kodieren, wobei die DNA-Sequenz verändert wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, und DNA-Konstrukte, die die Gene umfassen, bereitgestellt.
Vorzugsweise wird die Bildung von sekundären Metaboliten entsprechend dem vorstehend angegebenen Verfahren der Modulation der zellulären Lokalisierung eines oder mehrerer der Proteine in eukaryontischen Mikroorganismen, insbesondere in Penicillium chrysogenum, Acremonium chrysogenum oder Aspergillus nidulans, durchgeführt. Die Bildung kann auch sehr gut in einem Mikroorganismus durchgeführt werden, der natürlicherweise nicht zur Bildung der sekundären Metaboliten imstande ist, z. B. die Bildung von Penicillinen durch Colokalisierung von AT, IPNS und ACVS in Mikrokörperchen des Mikroorganismus, wie Hefe.
Erfindungsgemäß wird ferner ein eukaryontischer Mikroorganismus, vorzugsweise P. chrysogenum, A. chrysogenum oder A. nidulans, wobei die zelluläre Lokalisierung eines oder mehrerer der Proteine durch beliebige der vorstehend angegebenen Verfahren moduliert worden ist, bereitgestellt. Diese Proteine können aus eukaryontischen Organismen, wie Penicillium-, Acremonium- und Aspergillus-Spezies, oder aus prokaryontischen Organismen, wie Streptomyces- und Flavobacterium-Spezies, stammen.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Experimenteller Teil

Mikrobiologische Hinterlegungen

Die mutierten Stämme npe6 und npe10, die beide aus Wisconsin 54- 1255 erhalten wurden, wurden beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, Niederlande, hinterlegt. Der Stamm npe10 wurde am 13. März 1990 unter der Zugangsnummer CBS 143.90 hinterlegt. Der Stamm npe6 wurde am 19. Februar 1991 unter der Zugangsnummer CBS 117.91 hinterlegt.

Allgemeine Verfahren

A. Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen AT, ACVS und IPNS

Antikörper gegen AT

Die Reinigung von Acyltransferase erfolgte im wesentlichen, wie es von Alvarez beschrieben wurde, und zwar mit geringfügigen Modifikationen (Alvarez (1987), a.a.O.). Penicillium chrysogenum wurde auf einem Produktionsmedium gezüchtet, wie es in EP-A-354 624 beschrieben ist. Das Mycelium wurde durch Gefrieren in flüssigem Stickstoff und anschließendes Mörsern aufgebrochen. Die 0-45% Ammoniumsulfat-Fraktion wurde für die weitere Reinigung verwendet.
Nach der Reinigung wurde ein Präparat erhalten, das zwei Hauptpolypeptide mit scheinbaren Molekulargewichten von 29 kDa und 10 kDa enthielt. Beide Polypeptide sind Produkte des AT-Gens, was durch Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenz der Banden mit der Nucleotidsequenz des Gens nach den gleichen Verfahren, wie sie von Barredo et al. (1989, a.a.O.) beschrieben wurden, festgestellt wurde. Um reine Polypeptide für Immunisierungszwecke zu erhalten, wurde eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt, wie es von Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680 beschrieben wurde. Die Bande von 29 kDa wurde aus dem SDS-PA-Gel ausgeschnitten und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wurde gemörsert und anschließend in 0,9% NaCl resuspendiert. Die Suspension wurde mit Adjuvanssystem (Ribi Immunochem Research, Hamilton, Montana, USA) gemischt. Kaninchen wurden subkutan und intramuskulär immunisiert, wobei Auffrischungen nach 2, 4 und 6 Wochen erfolgten. Für jedes Kaninchen wurde ungefähr 1 mg gereinigtes Polypeptid bei dem gesamten Immunisierungsverfahren verwendet.
Blut wurde aus den immunisierten Kaninchen erhalten, und eine IgG- Fraktion wurde aus dem Serum durch Protein G-Sepharose-Affinitätschromatographie hergestellt. Um Immunglobuline zu entfernen, die möglicherweise nicht-spezifisch an Zellwandkomponenten haften, wurde die IgG-Fraktion einer Absorption mit intaktem Mycelium unterzogen. Zu diesem Zweck wurde P. chrysogenum für 4 Tage gezüchtet. Das Mycelium wurde 3 mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. 0,4 g (Naßgewicht) Mycelium wurden in 20 ml PBS resuspendiert. Die IgG-Fraktion wurde mit dem gewaschenen Mycelium gemischt (1 : 4) und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Mycelium wurde durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit entfernt.
Um die Spezifität der Antikörper zu untersuchen, wurde die Reaktivität der IgG-Fraktion mit zellfreien Extrakten von Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) und npe10, einer Mutante davon, der der gesamte Penicillinbiosynthesecluster fehlt, durch Immunoblot analysiert. Zellfreie Extrakte von npe10 wurden wie folgt hergestellt. Mycelium wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, und die Zellen wurden durch Mörsern des gefrorenen Myceliums aufgebrochen. Das gemörserte Material wurde in PED-Puffer (50 mM K&sub2;HPO&sub4;, 5 mM EDTA, 5 mM DTT und 1 mM PMSF (pH-Wert: 7,5) bei 4ºC; 10 g Pulver/50 ml PED-Puffer) resuspendiert. DNA wurde mit Protaminsulfat (0,4%) gefällt. Nach 30 min bei 4ºC wurde der Niederschlag durch Zentrifugation bei 10 · 10³ · g für 15 min entfernt. Der Immunnoblot wurde wie folgt durchgeführt. Polypeptide wurden durch SDS-PAGE in 13,3% (Gew./ Vol.) Acrylamid-Trenngelen (Mini PROTEAN II, BioRad) getrennt. 20 ug zellfreier Extrakt wurden pro Spur aufgetragen. Die Polypeptide wurden elektrophoretisch von der Gelplatte auf Nitrocelluloselagen unter Verwendung eines Blotgeräts Multiphor II Nova (LKB) entsprechend dem Verfahren, das vom Hersteller angegeben wird, übertragen. Die Immunokontrastierung erfolgte mit dem Proto-Blot Western Blot AP-System (Promega) entsprechend den Angaben des Herstellers. IgG-Fraktionen wurden in Blockierungspuffer verdünnt.
Die IgG-Fraktion reagiert spezifisch mit einer 29 kDa-Bande, die in zellfreien Extrakten vorhanden ist, die aus dem Stamm Wisconsin 54-1255 erhalten wurden. Keine Kontrastierung wurde bei Extrakten aus dem mutierten Stamm npe10 beobachtet.

Antikörper gegen ACVS und IPNS

Antiserum gegen ACVS wurde in Kaninchen gegen natives ACVS erzeugt, das aus Aspergillus nidulans isoliert wurde (Van Liempt et al., a.a.O.). IPNS wurde gereinigt, wie es von Ramos et al. (1985, a.a.O.) beschrieben wurde. Die Analyse durch SDS-PAGE zeigte das Vorhandensein einer Hauptbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 39 kDa. Diese Bande wurde ausgeschnitten und für die Immunisierung von Kaninchen entsprechend dem für AT beschriebenen Protokoll verwendet.
IgG-Antikörper aus den anti-ACVS- und anti-IPNS-Antiseren wurden isoliert, wie es vorstehend beschrieben wurde. Um nicht-spezifische Antikörper zu entfernen, wurden die IgG-Fraktionen einer Absorption mit Extrakt aus npe10-Mycelium unterzogen. 100 mg des gefriergetrockneten und gemörserten Myceliums wurden in 250 ul 50 mM Tris/HCl, pH-Wert: 7,5, resuspendiert. Diese Suspension wurde zu 500 ul IgG gegeben. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden Zellbruchstücke durch Zentrifugation für 15 min bei 12 · 10³ · g entfernt.
Die Spezifität der Antiseren wurde durch Immunoblot untersucht. Um ACVS durch Immunoblot nachzuweisen, wurden zellfreie Extrakte wie folgt hergestellt. Mycelium wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, und die Zellen wurden durch Mörsern des gefrorenen Myceliums aufgebrochen. Das gemörserte Material wurde in Puffer B (50 mM Tris/HC1, pH-Wert: 7,5, 1 mM Dithioerythrit, 0,1 mM EDTA und 9% (Gew./Vol.) Glycerin) resuspendiert. DNA wurde mit Polymin B (0,1%) gefällt. Nach 30 min bei 4ºC wurde der Niederschlag durch Zentrifugation bei 10 · 10³ · g für 15 min entfernt. Zu dem Überstand wurde gesättigte Ammoniumsulfatlösung als Gradient gegeben. Die Proteinfraktion, die zwischen 0 und 45% Sättigung gefällt wurde, wurde in Puffer B aufgenommen. Dieses Material wurde durch Zugabe von 1 Volumen 20% (Gew./Vol.) Trichloressigsäure gefällt. Nach 60 min bei 4ºC wurde der Niederschlag durch Zentrifugation bei 10 · 10³ · g für 15 min gesammelt. Da ACVS ein scheinbares Molekulargewicht von 260 kDa hat, wurden 5%ige (Gew./Vol.) Acrylamidgele verwendet. Die Immunokontrastierung wurde durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde, wobei 20 ug zellfreier Extrakt pro Spur aufgetragen wurden.
Die der Absorption unterzogene IgG-Fraktion gegen IPNS reagierte mit einem 39 kDa-Polypeptid in zellfreien Extrakten aus Wisconsin 54- 1255, während keine Kontrastierung bei Extrakten, die aus npe10 erhalten wurden, beobachtet wurde.
Die der Absorption unterzogene IgG-Fraktion gegen ACVS reagierte mit einem 260 kDa-Polypeptid in zellfreien Extrakten aus Wisconsin 54- 1255, während keine Kontrastierung bei Extrakten, die aus npe10 erhalten wurden, beobachtet wurde.

B. Elektronenmikroskopische Verfahren

Klassischer Dünnschnitt

Tauchkulturen von Penicillium chrysogenum wurden mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH-Wert: 7,4) gewaschen. Das Mycelium wurde chemisch mit 2% Paraformaldehyd, 0,5% Glutaraldehyd, 0,1% DMSO und 2% Tanninsäure in 0,1 M PBS für 48 Stunden bei 4ºC fixiert. Nach Spü len mit PBS wurde das myceliale Material einer Nachfixierung mit 1% wäßriger OsO&sub4;-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur unterzogen.
Das chemisch fixierte myceliale Material wurde mit 50% Aceton gespült und in eine 70%ige Acetonlösung für 16 Stunden bei 4ºC übertragen. Eine Blockkontrastierung erfolgte mit einer Lösung von Uranylacetat (1%) in 70% Aceton bei Raumtemperatur für 30 min. Das Material wurde in einer abgestuften Acetonreihe entwässert und mit Araldit (Merck) entsprechend folgendem Schema infiltriert: 33%, 50% (jeweils 1 Stunde), 66% (16 Stunden), 75% (1 Stunde) und 100% Araldit (2 · 3 Stunden). Infiltriertes Material wurde in Eppendorf-Röhrchen gegeben. Das flüssige, einbettende Araldit wurde unmittelbar zu dem Mycelium gegeben. Das Einbettungsmedium wurde durch Inkubation bei 70ºC für 48 Stunden gehärtet. Dünnschnitte (100 nm) wurden mit einem Diamantmesser an einem Reichert-Jung-Ultramikrotom geschnitten.

Rasches Einfrieren, Gefriersubstitution und Tieftemperatureinbettung

Mycelium wurde zum raschen Einfrieren in Stickstoff-vorgekühltem flüssigem Propan mit einer Reichert-Jung KF 80-Vorrichtung vorbereitet (H. Sitte et al., 1985, in: The science of biological specimen preparation of microscopy and microanalysis, S. 103-118, M. Muller, R. P. Bekker, A. Boyde, J. J. Wolosewich, S. A. Batho (Hrsg.), 5. E. M. Inc., Chicago).
Gefriersubstitution und Tieftemperatureinbettung wurden in der Reichert-Jung CS-Auto-Substitutionskammer bei -90ºC durchgeführt. Während der Übertragung in die Kammer wurde dafür gesorgt, daß das gefrorene Material bei einer Temperatur unter -90ºC gehalten wurde. Die gefrorenen Proben wurden in 0,5% Uranylacetat in reinem Methanol bei -90ºC gegeben. Nach 2 Tagen wurde die Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 5ºC pro Stunde auf -45ºC erhöht. Die Proben wurden anschließend mit wasserfreiem Methanol gespült und mit Lowicryl HM20 in drei Stufen mit zunehmender Konzentration von 50%, 66% und 100% Lowicryl HM20 infiltriert, wobei jede Stufe 2 Stunden dauerte. Nach 16 Stunden wurden die Proben in eine Einbettungsform übertragen, die mit Lowicryl HM20 bei -45ºC gefüllt war. Die Polymerisation erfolgte für 48 Stunden bei -45ºC in der CS-Autovorrichtung, woran sich die Polymerisation bei Raumtemperatur für 48 Stunden in der CS-Autovorrichtung durch eine UV-Lichtquelle (360 nm) anschloß.
Die die Proben enthaltenden Lowicryl HM20-Blöcke wurden aus der Einbettungsform entnommen und senkrecht oder in Längsrichtung mit einem Reichert-Jung-Ultramikrotom geschnitten.

Herstellung und Untersuchung von Dünnschnitten

Nach dem klassischen Dünnschnittverfahren und durch Gefriersubstitution bei niedriger Temperatur hergestellte Schnitte wurden auf 0,7% Formvar-beschichteten Kohlenstoff-bedampften Gittern mit einer Öffnung angeordnet, mit 4% wäßrigem Uranylacetat für 15 min und Bleicitrat oder mit 1% wäßrigem KMnO&sub4; für 10 min kontrastiert. Dünnschnitte wurden mit einem Philips EM420-Mikroskop bei 80 kV untersucht.

Gefrierbrechen

Die Hyphae wurden in einer Vorrichtung Balzers BAF300 gefriergebrochen. Die Proben wurden bei -105ºC gebrochen und anschließend mit Platin/Kohlenstoff und Kohlenstoff (Pt/C in einem Winkel von 45º und 90º) versehen. Nach Entfernung aus der Vorrichtung BAF300 und Auftauen wurden die Repliken mit 3% Cr/10% H&sub2;SO&sub4; über Nacht gereinigt und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Die gereinigten Repliken wurden auf ein nicht-beschichtetes EM-Gitter mit 400 mesh gegeben und in einem Philips EM420-Mikroskop bei 80 kV untersucht.

Immunogoldmarkierung

Die Immunokontrastierung von Dünnschnitten wurde durchgeführt, wie es von P. M. P. von Bergen en Henegouwen et al. (Histochemistry, Bd. 85 (1986), S. 81-87) beschrieben wurde. Kurz gesagt wurden Dünnschnitte mit Antikörpern gegen AT inkubiert. Die Herstellung von IgG-Antikörpern und die Absorption erfolgten, wie es beim allgemeinen Verfahren A beschrieben wurde, wobei eine Verdünnung 1 : 1000 der der Absorption unterzogenen IgG- Fraktion verwendet wurde. Nach Waschen wurden die Dünnschnitte mit Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörpern inkubiert, an denen Goldteilchen mit einem Durchmesser von 10 nm angebracht waren (Janssen Pharmaceuticals, Beerse, Belgien).

Schnellas Gefrieren im Vergleich mit chemischer Fixierung

Die Ultrastruktur von nicht-fixierten und chemisch fixierten Mycelien wurde nach Gefrierbrechen verglichen. Während die nicht-fixierten hyphalen Zellen glatte Vacuolen- und Plasmamembranen mit homogen verteilten Intramembranpartikeln aufweisen, zeigen die chemisch fixierten Zellen wellenförmige Vacuolen- und Plasmamembranen mit Intramembranpartikelsegregation. Bei Vergleich von Dünnschnitten von chemisch fixierten Hyphae mit Dünnschnitten von Hyphae, die durch schnelles Gefrieren und Gefriersubstitution bei niedriger Temperatur hergestellt wurden, wurde ein auffallendes Zusammenfallen von Vacuolen in Dünnschnitten beobachtet, die nach dem erstgenannten Verfahren hergestellt wurden. Dies stimmt mit der allgemeinen Erkenntnis überein, daß das schnelle Gefrieren strukturelle Änderungen verhindert (Knoll, a.a.O.).
Ferner war eine Immunogoldmarkierung mit Antikörpern gegen AT nicht möglich bei Dünnschnitten von chemisch fixierten Hyphae, während eine positive Kontrastierung bei Dünnschnitten beobachtet wurde, die durch eine Kombination von schnellem Gefrieren und Gefriersubstitution hergestellt wurden. Sehr wahrscheinlich wurde die antigene Beschaffenheit der Polypeptide durch das erstgenannte Verfahren zerstört, was häufig von anderen auf diesem Gebiet beobachtet wurde (Immunogold labelling in Cell Biology, a.a.O.).

Beispiel 1

Lokalisierung von AT in speziellen Organellen von Penicillium chrysogenum

Die P. chrysogenum-Stämme Wisconsin 54-1255 und npe10 wurden in Schüttelkolben auf Produktionsmedium (EP-A-354624) gezüchtet. Dünnschnitte wurden durch eine Kombination von schnellem Gefrieren und Gefriersubstitution hergestellt, wie es beim allgemeinen Verfahren B beschrieben wurde. Die Immunokontrastierung wurde mit Antikörpern gegen AT (vgl. allgemeines Verfahren A) durchgeführt, wie es beim allgemeinen Verfahren B beschrieben wurde.
Bei Dünnschnitten, die von npe10 hergestellt wurden, wobei diesem Stamm der Penicillinbiosynthese-Gencluster fehlt, konnte keine Markierung festgestellt werden. Bei Dünnschnitten, die aus Wisconsin 54-1255 hergestellt wurden, wurden jedoch Goldteilchen hauptsächlich in Einzelmembranorganellen mit einem Durchmesser im Bereich von 200-800 nm festgestellt. Im Gegensatz zu Vacuolen weisen diese Organellen einen elektronendichten Inhalt auf. Die Organellen fanden sich in der gesamten Zelle. Gelegentlich wurden kleinere Organellen in Assoziation mit dem Kern oder mit dem endoplasmatischen Retikulum gefunden. Eine markierte Organelle ist in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 2

Vorhandensein von Organellen, die AT enthalten, in den gesamten Hyphae

P. chrysogenum-Sporen wurden zwischen aufgeschnittenen Dialyseschläuchen auf Agarplatten, die Produktionsmedium enthielten, gezüchtet. Nach 6 Tagen wurden die Dialyseschläuche, die Kolonien enthielten, von der Platte entfernt und auf einen Objektträger gegeben. Die Dialyseschläuche wurden mit einer feinen Pinzette aufgefaltet. Die Kolonie und der sie tragende Dialyseschlauch wurden mit einem Rasiermesser in Quadrate geschnitten, und die Quadrate wurden auf eine Agarplatte für 15 min gegeben. Die Quadrate wurden einem schnellen Einfrieren unterzogen, wie es beim allgemeinen Verfahren B beschrieben wurde.
Das Wachstum von P. chrysogenum-Kolonien tritt rasch und zentrifugal in allen Richtungen auf. Die jüngeren Zellen befinden sich in der Peripherie und die älteren im Zentrum der Kolonie. Spezielle Teile der Kolonie wurden durch longitudinale Aufteilung untersucht. Die apikale Zelle weist viele Ribosomen, Mitochondrien und Vesikel im ersten Drittel der Zelle auf. Neben diesen Organellen enthält das zweite Drittel dieser Zelle auch Kerne. Das letzte Drittel der apikalen Zelle enthält weniger Kerne und eine Vielzahl von kleinen Vacuolen. Die Größe dieser Vacuolen nimmt zum Septum hin zu. Die Vacuolen in den subapikalen Zellen sind größer als die Vacuolen in der Zelle an der Spitze, wobei jedoch die Anzahl der Vacuolen geringer ist. In älteren Zellen finden sich sehr große Vacuolen, die fast das gesamte Zellvolumen einnehmen, was zu einem Rand aus Cytoplasma zwischen der Vacuolenmembran und der Plasmamembran führt. Die Immunokontrastierung wurde für longitudinal geschnittene Dünnschnitte junger Zellen sowie älterer Zellen durchgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde. Goldmarkierte Organellen wurden in den gesamten Hyphae nachgewiesen. Die Anzahl der Organellen, die pro Quadratoberfläche des Zellbereiches nachgewiesen wurde, unterschied sich nicht auffällig bei jüngeren und älteren Zellen, sofern nicht eine ältere hyphale Zelle völlig von einer großen Vacuole eingenommen wurde. Beispiele für markierte Organellen in jüngeren und älteren Zellen sind in Fig. 3 gezeigt. Auf der Basis von Morphologie, Größe und Verteilung in den Hyphae wurden diese Organellen als Mikrokörperchen klassifiziert.

Beispiel 3

Zellfraktionierung von Penicillium chrysogenum Verteilung von ACVS, IPNS und AT

Der P. chrysogenum-Stamm P2 (ATCC 48271) wurde 72 Stunden nach der Animpfung geerntet. Das Mycelium wurde einmal mit 0,9% NaCl gewaschen. 20 g (Naßgewicht) wurden in 100 ml Puffer A (2 g/l Citronensäure, pH-Wert: 6,4, 60 g KCl/l) resuspendiert. Anschließend wurden 500 mg Novozyme (Novo Biolabs, Bagsvaerd, Dänemark) zugegeben. Die Suspension wurde für 4 Stunden bei 25ºC mit 100 U/min geschüttelt. Protoplasten wurden 3 mal mit Puffer B (0,1 M 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES), pH-Wert: 7,5, mit einem Gehalt an 60 g KCl/l) gewaschen. Die Protoplasten wurden in Puffer C (0,1 M MES, pH-Wert: 7,5, 5 mM DTT, 1 mM EDTA mit einem Gehalt an 25 g/l NaCl) resuspendiert und weiter durch 5 Durchgänge mit einem Potter lysiert.
Die Suspension wurde von Bruchstücken durch Zentrifugation bei 1 · 10³ · g für 15 min bei 4ºC befreit. Der Überstand (1KS) wurde in ein Pellet (14KP) und ein Überstand (14KS) durch Zentrifugation bei 14 · 10³ · g für 30 min bei 4ºC fraktioniert. Schließlich wurde der 14KS-Überstand bei 100 · 10³ · g für 1 Stunde bei 4ºC fraktioniert, wobei man die 100KS und 100KP-Fraktionen erhielt.
Die Polypeptide in den Fraktionen 1KS, 14KS, 14KP, 100KS und 100KP wurden durch SDS-PAGE getrennt und anschließend auf Nitrocellulose übertragen, wie es beim allgemeinen Verfahren A beschrieben wurde. Protein wurde bestimmt, wie es von Peterson, Analytical Biochem., Bd. 83 (1977), S. 346-356 beschrieben wurde, wobei 20 ug pro Spur aufgetragen wurden. Die Immunokontrastierung wurde mit der Absorption unterzogenen IgG-Fraktionen durchgeführt, die hergestellt wurden, wie es beim allgemeinen Verfahren A beschrieben wurde.
Die Immunokontrastierung mit Antikörpern gegen AT zeigte, daß AT in allen Fraktionen mit Ausnahme von 100KP vorhanden war. Die Immunokontrastierung mit Antikörpern gegen IPNS zeigte, daß IPNS in 1KS, 14KS und 100KS, nicht jedoch in 14KP und 100KP vorhanden war. Die Immunokontrastierung mit Antikörpern gegen ACVS zeigte, daß ACVS in 1KS, 14KS und 100KP vorhanden war. Diese Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
Aus diesen Experimenten wird geschlossen, daß die drei Enzyme in verschiedenen zellulären Fraktionen vorhanden sind. IPNS verhält sich als ein zytosolisches Enzym. Das Enzym ACVS ist mit der Fraktion assoziiert, die dem endoplasmatischen Retikulum oder anderen kleinen Membranvesikeln entspricht. AT ist in Organellen mit einer Sedimentationsgeschwindigkeit, die Mitochondrien, Vacuolen und Mikrokörperchen entspricht, lokalisiert. Das Fehlen von AT in 100KP deutet darauf hin, daß AT nicht mit kleinen Membranvesikeln assoziiert ist. Das Vorhandensein von AT in allen Fraktionen mit Ausnahme von 100KP wird durch Lyse von Mikrokörperchen während der Zellfraktionierung erklärt. Um zu bestätigen, daß AT in Mikrokörperchen in der 14KP-Fraktion lokalisiert ist, wurden die Bestandteile der 14KP-Fraktion durch Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht. Ultradünnschnitte wurden durch eine Kombination von schnellem Gefrieren und Gefriersubstitution hergestellt, wie es beim allgemeinen Verfahren B beschrieben wurde. Das Pellet enthielt Mitochondrien und zahlreiche Vesikel unterschiedlicher Größen. Einige dieser Vesikel enthielten elektronendichtes Material. Durch Immunokontrastierung von 14KP mit der IgG-Fraktion gegen AT wurde gezeigt, daß viele dieser Vesikel AT enthalten. Die Größe dieser Vesikel lag im Bereich von 200-800 nm. Vesikel, die AT enthielten, waren in jungen Zellen und in älteren Kompartimenten der Hyphae vorhanden. Auf der Basis von Morphologie, Größe und Verteilung in den Hyphae können diese Vesikel als Mikrokörperchen und nicht als Golgi-Vesikel klassifiziert werden.

Beispiel 4

Zellfraktionierungsexperimente mit Penicillium chrysogenum Verteilung von Markerenzymaktivitäten und Aktivitäten von IPNS und AT

Protoplasten von P. chrysogenum wurden fraktioniert, wie es in Beispiel 3 beschrieben wurde. Die folgenden Markerenzyme wurden verwendet: ATPase-Aktivität, bestimmt bei einem pH-Wert von 6,0, als ein Marker für die Plasmamembran wurde bestimmt, wie es von Navarette et al. (Navarette, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 728 (1983), S. 403-408) beschrieben wurde; 5'-Nucleotidase-Aktivität als ein Marker für die Plasmamembran wurde bestimmt, wie es von Onishi et al., Anal. Biochem., Bd. 69 (1975), S. 261- 267 beschrieben wurde. Thiaminpyrophosphatase-Aktivität als ein Marker für den Golgi-Apparat wurde bestimmt, wie es von Morre (Meth. Enzymol., Bd. 22 (1971), S. 138-139) beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß das Volumen des Reaktionsgemisches 0,5 ml betrug. Glucose-6-phosphatase-Aktivität als ein Marker für das endoplasmatische Retikulum wurde bestimmt, wie es von Morre (a.a.O.) beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß das Volumen des Reaktionsgemisches 0,5 ml betrug. Malatdehydrogenase-Aktivität als ein Marker für Mitochondrien wurde bestimmt, wie es von Gross, Phytochem., Bd. 16 (1977), S. 319-321 beschrieben wurde. α-Mannosidase- Aktivität als ein Marker für Vacuolen wurde bestimmt, wie es von von der Wilden, Naturforschung, Bd. 28 (1973), S. 416-421 beschrieben wurde. Katalaseaktivität als ein Marker für Peroxysomen wurde bestimmt, wie es von Cohen et al., J. Anal. Biochem., Bd. 34 (1970), S. 30-38 beschrieben wurde.
AT-Aktivität wurde bestimmt, wie es von Alvarez, a.a.O., beschrieben wurde, und IPNS-Aktivität wurde bestimmt, wie es von Ramos, a.a.O., beschrieben wurde.
Die Aktivität der Enzyme pro mg Protein in den Fraktionen 14KP, 100KS und 100KP wurde als der Bruchteil der Aktivität ausgedrückt, die pro mg Protein in der 1KS-Fraktion festgestellt wird. Proteine wurden bestimmt, wie es von Peterson, a.a.O., beschrieben wurde.
Die Verteilung der Markerenzyme über die Fraktionen 14KP, 100KS und 100KP variierte in verschiedenen Experimenten; im allgemeinen war jedoch die 14KP-Fraktion angereichert mit den Markerenzymen Malatdehydrogenase, α-Mannosidase und Katalase. Die Aktivität von Thiaminpyrophosphatase wurde in 14KP sowie in 100KP festgestellt. Die höchsten AT-Aktivitäten wurden im allgemeinen in der 14KP-Fraktion festgestellt; in einigen Experimenten wurde die AT-Aktivität jedoch vorwiegend in der 100KS-Fraktion gefunden. Dies mag mit der Lyse der Mikrokörperchen während der Lyse der Protoplasten im Zusammenhang stehen. Die höchste Aktivität an IPNS wurde stets in der 100KS-Fraktion festgestellt.
Die Verteilung der Markerenzyme in einem typischen Experiment ist beispielhaft in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

Beispiel 5

Entfernung des Mikrokörperchenzielsignals von AT durch gerichtete Mutagenese des penDE-Gens beendet die Penicillinbildung

Die Isolierung und Charakterisierung des AT-kodierenden penDE-Gens von P. chrysogenum wurde ausführlich beschrieben (EP-A-357119; Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Veenstra et al., S. 262-269, 1989, American Society for Microbiology, Washington; Barredo et al., a.a.O.). Das gesamte penDE-Gen ist in dem 2, 3 Kilobasen (kb) umfassenden HindIII-SalI-Restriktionsfragment des Plasmids pGJ02 (EP-A-357119) enthalten. Dieses Fragment wurde aus pGJ02 durch Verdau mit den Restriktionsenzymen HindIII und SalI und Agarosegelelektrophorese isoliert und in pMA- und pMC-Vektoren, die ebenfalls mit den Restriktionsenzymen HindIII und SalI verdaut worden waren, ligiert. Die erhaltenen Plasmide wurden als pMA-AT und pMC-AT bezeichnet (Fig. 5 bzw. Fig. 6).
Die pMA- und pMC-Vektoren sind Plasmide, die insbesondere für eine wirksame in vitro-Mutagenese entwickelt wurden (Stanssens et al., Nucl. Acids Res., Bd. 17 (1989), S. 4441-4453). Der E. coli-Stamm WK6 (R. Zell und H. J. Fritz, EMBO Journal, Bd. 6 (1987), S. 1809-1815) wurde für die Vermehrung der Plasmide verwendet. Die angewandten Standardtechniken für rekombinante DNA sind ausreichend in Maniatis et al. (1989, a.a.O.) beschrieben.
Die gerichtete Mutagenese des penDE-Gens wurde unter Verwendung von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden (Applied Biosystems, CA, USA), die die gewünschten Mutationen enthielten, erzielt. Die Sequenz der Oligonucleotide basierte auf der veröffentlichten Nucleotidsequenz des P. chrysogenum-penDE-Gens (Barredo et al., a.a.O.).
Oligonucleotid S, 5'-GG TCT GCG CTC AAC TGA AGG CTT TGA AGG-3', wurde verwendet, um das Alanin (A) kodierende Codon GCC in der Sequenz A- R-L-Ende in TGA zu ändern, wobei es sich um das authentische Stoppcodon des penDE-Gens handelt. Das Oligonucleotid D, 5'-GG TCT GCG CTC AAC TGA AGG CTC TTC-3', wurde verwendet, um die carboxyterminalen Codons GCC AGG CTT, die A-R-L kodieren, aus dem penDE-Gen zu deletieren.
Die in das penDE-Gen eingeführten Mutationen sind zwar verschieden, wenn Oligonucleotid S oder Oligonucleotid D verwendet werden; die Konsequenzen der Mutationen für die Struktur von AT sind jedoch identisch. Die Translation der mutierten penDE-mRNA endet in beiden Fällen bei Asparagin (N), womit ein Enzym verbleibt, dem das C-terminale ARL-Mikrokörperchenzielsignal fehlt (Fig. 7).
Ein Duplex mit einer Lücke wurde durch Annelieren der einzelsträngigen (ss) DNA, die aus pMA-AT abgeleitet wurde, mit dem ungefähr 4,8 kb umfassenden SacI-NsiI-Restriktionsfragment, das aus pMC-AT isoliert wurde, erhalten. Die Größe der Lücke in dem Duplex mit der Lücke beträgt ungefähr 320 Basenpaare (bp). Oligonucleotid S oder Oligonucleotid D wurden anschließend an diesen Duplex mit der Lücke anneliert. Die experimentellen Bedingungen und Verfahren zur Einführung der Mutationen wurden genau gemäß Stanssens et al. (a.a.O.) nachgearbeitet. E. coli WK6-Zellen, die mutierte penDE-Gene enthielten, wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des spezifischen Oligonucleotids, das für die Mutagenese verwendet wurde, als Sonde identifiziert. Die korrekte Einführung der gewünschten Mutationen in das penDE-Gen wurde durch Nucleotidsequenzanalysen bestätigt. Beide Oligonucleotide S und D wurden erfolgreich zur Erzeugung von mutierten penDE-Genen verwendet, die als penDE-S (Oligonucleotid S) bzw. penDE-D (Oligonucleotid D) bezeichnet wurden.
Die Gene penDE-S. penDE-D und penDE (als positive Kontrolle) wurden in den P. chrysogenum-Stamm npe6 als lineare 2,3 kb umfassende HindIII- SalI-Restriktionsfragmente, die aus pMA-AT-Vektorsequenzen isoliert wurden, durch Cotransformation mit dem Plasmid pPS47, das das S. hindustanus-Phleomycin-Resistenzgen als Pilzselektionsmarker enthält (EP-A- 357119), unter Anwendung eines Standardverfahrens zur Transformation von P. chrysogenum (EP-A-357119) eingeführt. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß andere Selektionsmarker, und zwar homologe oder hetero loge, in Gegenwart oder Abwesenheit von Vektorsequenzen, physikalisch verknüpft oder nicht mit der nicht-selektierbaren DNA, zur Selektion von Transformanten verwendet werden können.
Der P. chrysogenum-Stamm npe6 ist ein nicht-bildendes Derivat des Stamms Wisconsin 54-1255, das durch das Fehlen von AT aus dem Mycelium charakterisiert ist, was durch AT-Antikörperanalysen von zellfreien Extrakten auf Western-Blots und durch elektronenmikroskopische Analysen von npe6 mit AT-Antikörpern, wie sie bei den allgemeinen Verfahren A und B und in Beispiel 1 beschrieben wurden, gezeigt wurde.
Transformanten wurden zuerst auf Resistenz gegen Phleomycin selektiert, gereinigt und dann auf Cotransformation von penDE-Genen unter Anwendung eines Bioassays, wie er in EP-A-357119 und Veenestra et al., a.a.O., beschrieben ist, getestet.
Die Penicillinbildung konnte leicht in npe6 unter Verwendung des Wildtyp-penDE-Gens wiederhergestellt werden; die Wiederherstellung der Penicillinbildung wurde jedoch nicht beobachtet, wenn die penDE-S- und penDE-D-Gene verwendet wurden. Die penDE-S- und penDE-D-Gene wurden jedoch cotransformiert und in einigen der Transformanten exprimiert, was durch Western-Blot-Analysen mit AT-Antikörpern und AT-Aktivitätsassays mit zellfreien Extrakten bestätigt wurde. Die Lokalisierung von AT in diesen Transformanten wurde durch Elektronenmikroskopie untersucht. Spezifische Markierung wurde nicht in Organellen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu zeigten Dünnschnitte von penDE-Transformanten spezifische Markierung in Organellen. Die Intensität und das Muster der Markierung in diesen Transformanten waren identisch zu denen, die für den Ausgangsstamm Wisconsin 54-1255 beobachtet wurden.
Aus diesen Experimenten wird geschlossen, daß die Zielrichtung von AT zu Mikrokörperchen durch die C-terminale Sequenz ARL vermittelt wird. Die Entfernung der ARL-Sequenz aus AT führt zu einer fehlerhaften Lokalisierung des Enzyms und einem damit verbundenen Verlust der Penicillinbildung. Dieses Beispiel zeigt, daß die Manipulation des Mikrokörperchenzielsignals ein leistungsfähiges Verfahren zur Beeinflussung der Bildung von sekundären Metaboliten ist.
Es wurde hier die Lokalisierung von Enzymen der Penicillinbiosynthese zum ersten Mal durch ein zuverlässiges elektronenmikroskopisches Präparationsverfahren in Kombination mit der Immunogoldmarkierung untersucht. Es wurde auch die Lokalisierung von AT, ACVS und IPNS durch Zellfraktionierungsexperimente untersucht. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß AT, das letzte Enzym des Penicillinbiosynthesewegs, in Mikrokörperchen lokalisiert ist. Dies ist das erste Mal, daß festgestellt wurde, daß ein Enzym, das an der Bildung von sekundären Metaboliten beteiligt ist, in Mikrokörperchen lokalisiert ist.
Es werden Verfahren, wie die Manipulation des Mikrokörperchenzielsignals, bereitgestellt, die die Modulation der Bildung von sekundären Metaboliten, wie β-Lactamverbindungen, ermöglichen.
Die vorstehende Erfindung wurde zwar ausführlich durch Erläuterung und Beispiele für die Zwecke der Klarheit und Verständlichkeit erläutert; für den Fachmann ist jedoch im Licht der Lehre der vorliegenden Erfindung ohne weiteres klar, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Geist und Umfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Gist-brocades N. V., Niederlande
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zur Modulation der Bildung von sekundären Metaboliten
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG: WordPerfect 5.0
(v) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: 91200684.8
(B) ANMELDETAG: 25. März 1991
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: PenDE Oli S
(B) Lage: 1726..1737
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: Penicillium chrysogenum
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: penDE
(B) LAGE: 1726..1746
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(H) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: penDE Oli D
(B) LAGE: 1726..1737
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

Claims

1. Verfahren zur Modulation der Bildung von sekundären Metaboliten in einem Mikroorganismus, umfassend die Verwendung eines Wirtsmikroorganismus, wobei die zelluläre Lokalisation mindestens eines Proteins, das gegebenenfalls von einem weiteren Mikroorganismus abgeleitet ist und direkt oder indirekt an der Bildung des sekundären Metaboliten beteiligt ist, moduliert wird, indem man eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für ein oder mehrere Zielsignale für eine zelluläre Organelle in dem oder den Genen von einem oder mehreren dieser Proteine kodieren, addiert, deletiert oder verändert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zelluläre Organelle ein Mikrokörperchen umfaßt.

3. Verfahren zur Verstärkung der Bildung von sekundären Metaboliten in einem Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, umfassend eine Co-Lokalisation von zwei oder mehr Enzymen, die an biosynthetischen Wegen zu unterschiedlichen sekundären Metaboliten beteiligt sind und die eine oder mehrere Reaktionsstufen gemeinsam haben, in Mikrokörperchen.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei den sekundären Metaboliten um β-Lactamverbindungen und vorzugsweise um Penicilline oder Cephalosporine handelt.

6. Gen, das für ein Enzym kodiert, das bei der Bildung von sekundären Metaboliten in einem Mikroorganismus beteiligt ist, wobei das Gen durch Addieren, Deletieren oder Verändern von einer oder mehreren DNA-Sequenzen, die für ein oder mehrere Zielsignale kodieren, modifiziert worden ist.

7. DNA-Konstrukt, umfassend ein Gen nach Anspruch 6.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Verwendung von Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans oder Acremonium chrysogenum als Mikroorganismus, der die sekundären Metaboliten bildet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Verwendung eines Mikroorganismus, der von Natur aus nicht zur Bildung der sekundären Metaboliten befähigt ist.

10. Transformiertes Penicillium chrysogenum, Acremonium chrysogenum oder Aspergillus nidulans, wobei die zelluläre Lokalisation von mindestens einem Protein, das gegebenenfalls von einem weiteren Mikroorganismus abgeleitet ist und direkt oder indirekt an der Bildung des sekundären Metaboliten beteiligt ist, moduliert wird, indem man eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für ein oder mehrere Zielsignale in dem oder den Genen von einem oder mehreren dieser Proteine kodieren, addiert, deletiert oder verändert.