DE69120315T2 - Rekombinante DNA-Expressionsvektoren und DNA-Zusammensetzungen, die Isopenizillin N-Epimerase-Aktivität kodieren - Google Patents
Rekombinante DNA-Expressionsvektoren und DNA-Zusammensetzungen, die Isopenizillin N-Epimerase-Aktivität kodierenInfo
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Description
- Die Schwefel-enthaltenden β-Lactamantibiotika sind klinisch die bedeutendsten und die Isolierung neuer β-Lactamverbindungen dauert seit fäst sechs Jahrzehnten seit der Entdeckung des Penicillins durch Elemming an. Das gemeinsame Strukturmerkmal der Penicilline und Cephalosporine (einschließlich der Cephamycine) ist der β-Lactamring.
- Diese Antibiotika werden von einer Vielzahl an Prokaryonten und niederen Eukaryonten gebildet. Die durch die Verbindungen Penicillin G (Benzylpenicillin) oder Penicillin V beispielhaft dargestellten Penicilline werden durch filamentöse Pilze gebildet, vor allem von Penicillium chrysogenum. Die Cephalosporine, die zuerst als Produkt von einem niederen Eukaryonten, nämlich Cephalosporium acremonium (Synonym Acremonium chrysogenum) isoliert wurden, sind auch Metaboliten von vielen Prokaryonten, speziell Streptomyces clavuligerus, S. lipmanii und S. cattleya, die auch Cephamycine und andere β-Lactame bilden, wie Oxypename (Clavulansäure) und Carbapeneme (Thienamycin).
- Die Entwicklung von zellfreien Systemen aus β-Lactam-bildenden Organismen erlaubte die Entwicklung der Biosyntheseschritte im Stoffwechselweg der Schwefel-enthaltenden β-Lactame (Penicilline und Cephalosporine).
- Die anfänglichen Schritte bei der Bildung der Penicilline in filamentösen Pilzen (beispielsweise P.chrysogenum) und der sowohl von Prokaryonten als auch niederen Eukaryonten gebildeten Cephalosporine sind identisch. Die ACV Synthetase katalysiert die Kondensation der Aminosäurevorläufer L-α-Aminoadipat, L-Cystein und L-Valin zum Tripeptid LLD-ACV. Der nächste Schritt bildet das erste β-Lactam im Stoffwechselweg durch die Cyclisierung des Tripeptids unter Bildung von Isopenicillin N (IPN), dem Vorläufer aller Penicilline, Cephalosporine und Cephamycine.
- Nach der Synthese von IPN gehen die Stoffwechselwege der Cephalosporine und der Penicilline auseinander. Bei Penicillium chrysogenum kann beispielsweise die α-Aminoadipylseitenkette von IPN gegen eine von vielen (bis heute fast 100) hydrophoben Seitenketten ausgetauscht werden, die aus dem entsprechenden Acyl-CoA stammen. Eines der bekanntesten Beispiele ist die Bildung von Penicillin G (Benzylpenicillin) aus Phenylacetyl-CoA und IPN. Im Pilz C. acremonium wird jedoch die α-Aminoadipylseitenkette unter Bildung von Penicillin N isomerisiert. Der fünfgliedrige Thiazolidinring des Penicillins wird dann zum sechsgliedrigen Dihydrothiazinring erweitert, der für die Cephalosporine charakteristisch ist. Diese Reaktion wird durch die Desacetoxycepholosporin-C-Synthetase (DAOCS) katalysiert und bildet das erste Cephalosporin im Stoffwechselweg, nämlich Desacetoxycephalosporin C (DAOC).
- Zwei Ziele der β-Lactamantibiotikumforschung sind die Steigerung der Produktion von bekannten Antibiotika und die Erzeugung von neuen brauchbaren Antibiotika. Die Klonierung der Gene, die die Enzyme in diesem Stoffwechselweg kodieren, liefern grundlegende Werkzeuge, die zur Erreichung dieser Ziele brauchbar sind. Die vorliegende Erfindung liefert DNA Sequenzen, die das Enzym Isopenicillin-N-Epimerase kodieren.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt DNA Sequenzen, die die Isopenicillin-N-Epimerase (Epimerase) Aktivität von Streptomyces lipmanii kodieren. Die neu isolierte DNA Sequenz, die hierin bereitgestellt wird, kann zur Herstellung der Epimeraseaktivitat m großen Mengen in rekombinanten Wirtszellen verwendet werden. Die Isopenicillin-N-Epimerase katalysiert die Reaktion, in der Penicillin N aus Isopenicillin N gebildet wird. Das Enzym wandelt die L-α- Aminoadipylseitenkette von Isopenicillin N in eine D-α-Aminoadipylseitenkette um. Das Enzym ist sehr instabil, aber die katalysierte Reaktion ist ein entscheidender Schritt bei der Biosynthese von wichtigen Antibiotika, wie Cephalosporine von Cephalosporium acremonium und 7-α- Methoxycephalosporine oder Cephamycine von Streptomyces lipmanii und S. clavuligerus. Daher ist es ziemlich wichtig, die Aktivität in großen Mengen herstellen zu können.
- Die DNA Verbindungen der vorliegenden Erfindung kodieren die Epimeraseaktivität in einem einzelnen offenen Leserahmen. Die Transkription dieses offenen Leserahmens führt gefolgt von der Translation der entstehenden mRNA zu einer einzelnen Polypeptidkette, die Epimeraseaktivität aufweist. Die DNA Verbindung, die die Epimeraseaktivität kodiert, wird aus genomischer DNA von Streptomyces lipmanii isoliert und zur Konstruktion von rekombinanten DNA Expressionsvektoren verwendet. Vier Typen dieser Expressionsvektoren sind besonders brauchbar: Der Erste steuert eine starke Expression der Epimeraseaktivität in E. coli, der Zweite in Cephalosporium, der Dritte in Penicillium und der Vierte in Streptomyces.
- Die die Epimeraseaktivität kodierenden DNA Verbindungen werden leicht zur Konstruktion von Expressionsvektoren modiiziert, die die Effizienz und die Ausbeute von Fermentationen erhöhen, die andere Organismen miteinbeziehen, wie Paecilomyces und Streptomyces. Obwohl die für die Epimeraseaktivität kodierende DNA der vorliegenden Erfindung von S. lipmanii isoliert wurde, kann diese DNA zur Expression von Vektoren verwendet werden, die die Expression der Epimeraseaktivität in einer großen Vielzahl an Wirtszellen steuern, wie dies durch die hierin beschriebenen E. coli Expressionsvektoren beispielhaft dargestellt ist. Die Konstruktionsprotokolle, die für die erfindungsgemäßen E. coli Cephalosporium und Penicillium Vektoren verwendet wurden, können zur Konstruktion von analogen Vektoren für andere Organismen befolgt werden, indem man erforderlichenfalls lediglich die geeigneten regulatorischen Elemente austauscht. Die erfindungsgemäßen für Epimeraseaktivität kodierenden DNA Verbindungen können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die zur Verbesserung der Effizienz und der Ausbeute von Fermentationen brauchbar sind, welche eine große Vielzahl an Penicillin- und Cephalosporin-bildenden Organismen betreffen.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt DNA Verbindungen, die eine DNA Sequenz enthalten, welche die Epimeraseaktivität von Streptomyces lipmanii kodiert. Eine solche Sequenz enthält das 3,5 kb EcoRI Restriktionsfragment von Plasmid mOGO292. Ebenfalls beansprucht werden rekombinante DNA Vektoren, einschließlich Expressionsvektoren, die in Wirtsorganismen brauchbar sind, wie E. coli, Aspergillus, Cephalosporium, Penicillium und Streptomyces. Spezifische Vektoren, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, sind die Plasmide mOGO292, mOGO297 und pOGO299. Die Vektoren sind in einem Verfahren zur Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle brauchbar, die zur Expression der Epimeraseaktivität in einer rekombinanten Wirtszelle fähig sind, wobei dieses Verfahren gekennzeichnet ist durch: Transformation dieser Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Expressionsvektor, der enthält:
- (a) Einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, die in dieser Wirtszelle funktionsfähig sind, und
- (b) eine DNA Sequenz, die die Epimeraseaktivität kodiert und zur Expression von diesem Promotor und dieser Translationsaktivierungssequenz positioniert ist.
- Ein weiteres brauchbares Verfahren führt zur Expression der Epimeraseaktivität in einer rekombinanten Wirtszelle über die Kultivierung von Mikroorganismen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert sind.
- Der folgende Abschnitt liefert eine detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung. Zum Zweck der Klarheit und als Verständnishilfe der Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird, werden die folgenden Begriffe definiert.
- amdS - ein Acetamidasegen, wird ebenfalls in den Figuren verwendet, um das Acetamidasegen aus Aspergillus nidulans zu bezeichnen.
- amdSp - der Promotor des amdS Gens.
- AmR - das Apramycinresistenz-verleihende Gen, wird auch zur Bezeichnung des Apramycin-resistenten Phänotyps verwendet.
- Antibiotikum - eine Substanz, die von einem Mikroorganismus gebildet wird, die entweder naturlich oder mit begrenzter chemischer Modifizierung das Wachstum eines anderen Mikroorganismus oder einer anderen eukaryontischen Zelle hemmt oder diese tötet.
- Antibiotikumbiosynthesegen - ein DNA Segment, das eine Aktivität kodiert, die für eine enzymatische Reaktion im Umwandlungsverfahren von Primärmetaboliten zu Antibiotika oder zur Umwandlung einer antibiotischen Verbindung in eine unterschiedliche antibiotische Verbindung notwendig ist.
- Antibiotikum-bildender Organismus - jeder Organismus, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Streptomyces, Bacillus, Flavobacterium, Monospora, Cephalosporium, Paecilomyces Podospora, Penicillium und Nocardia, der entweder ein Antibiotikum bildet, oder Gene enthält, die bei einer Expression ein Antibiotikum bilden würden.
- Antibiotikumresistenz-verleihendes Gen - ein DNA Segment, das eine Aktivität kodiert, welche Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht.
- ApR - das Ampicillinresistenz-verleihende Gen, wird ebenfalls zur Bezeichnung des Ampicillin-resistenten Phänotyps verwendet.
- bp - ein Basenpaar einer doppelsträngigen DNA.
- CAT - das Chloramphenicolresistenz-verleihende Gen, das eine Acyltransferase kodiert.
- cI857 - ein Gen, das einen Temperatur-empfindlichen Repressor des λpL Promotors kodiert.
- cIPS - Isopenicillin-N-Synthetase oder für Isopenicillin-N-Synthetase kodierende DNA aus Cephalosporium acremonium.
- Klonieren - das Verfahren des Einbaus eines DNA Segments in einen rekombinanten DNA Klonierungsvektor.
- Kodierende Sequenz - die DNA Sequenz in einem Gell, die entweder die Aminosäuresequenz des durch das Gen exprimierten Proteins kodiert oder im Fall von rRNA oder tRNA Genen die RNA Sequenz der durch das Gen exprimierten rRNA oder tRNA.
- Cosmid - ein rekombinanter DNA Klonierungsvektor, der in einer Wirtszelle auf dieselbe Weise replizieren kann, wie ein Plasmid, aber auch Phagenverpackungsmechanismen verwenden kann.
- Epimeraseaktivität - eine Enzymaktivität, die die Umwandlung von Isopenicillin N zu Penicillin N und umgekehrt katalysiert und durch das erfindungsgemäße Gen oder durch DNA kodiert wird, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gens als Sonde identifiziert werden kann.
- Gen - ein DNA Segment, das einen Promotor, eine Translationsaktivierungssequenz, eine kodierende Sequenz und 3'-regulatorische Sequenzen enthält, die zur Expressionssteuerung des Genprodukts, entweder eines Proteins, (und daher notwendigerweise einer mRNA), tRNA oder rRNA positioniert ist.
- Genbank - ein Satz von rekombinanten DNA Klonierungsvektoren, in die DNA Segmente kloniert wurden, die im wesentlichen das gesamte Genom eines bestimmten Organismus darstellen.
- Hybridisierung - das Verfahren zur Anelierung von zwei einzelstrangigen DNA und/oder RNA Molekülen unter Bildung eines doppelsträngigen Moleküls, das vollständig oder nicht vollständig basengepaart sem kann.
- IPS oder IPNS - Isopenicillin-N-Synthetase.
- Isopenicillin N - hat die im folgenden gezeigte Struktur:
- Isopenicillin-N-Synthetase - ein Enzym, ebenfalls als Cyclase bekannt, das die Bildung von Isopenicillin N aus δ-(L-α-Aminoadipyl)-L-Cysteinyl-D-Valin katalysiert.
- Isolierte DNA Verbindung - Jede DNA Sequenz, wie auch immer konstruiert oder synthetisiert, die örtlich von der genomischen DNA des Organismus getrennt ist, in welchem die Sequenz vorkommt.
- KmR - das Kanamycinresistenz-verleihende Gen, ebenfalls zur Bezeichnung des Kanamycm-resistenten Phänotyps verwendet.
- lacI - das E. coli lacI Gen.
- lacZα - der Promotor und das β-Galactosidase ( Z) α-Fragment, das aus dem E. coli lac Operon stammt.
- M13 ORI - der Replikationsursprung des Phagen M13.
- MCS - Polylinker.
- mRNA - Botenribonukleinsäure.
- ORI - ein Replikationsursprung für ein Plasmid oder einen Vektor, die DNA Sequenz, die als Anheftungsstelle oder Startstelle für die DNA Polymerase dient.
- Pen DNA - DNA von Penicillium chrysogenum.
- Penicillin N - hat die im folgenden gezeigte Struktur:
- pIPS - das IPS Gen oder die für IPS kodierende Sequenz von Penicillium chrysogenum.
- pIPSp - der Promotor des IPS Gens von Penicillium chrysogenum.
- pIPSt - der Transkriptionsterminator des IPS Gens von Penicillium chrysogenum.
- pL - der linksseitige Promotor des Bakteriophagen Lambda.
- Promotor - eine DNA Sequenz, die die Transkription steuert oder initüert.
- Rekombinanter DNA Klonierungsvektor - jedes autonom replizierende oder integrierende Agens, einschließlich aber nicht beschränkt auf Plasmide, das ein DNA Molekül enthält, zu dem ein oder mehrere zusätzliche DNA Moleküle hinzugefügt werden können oder wurden.
- Rekombinanter DNA Expressionsvektor - jedes autonom replizierende oder integrierende Agens, einschließlich aber nicht beschränkt auf Plasmide, das einen Promotor und andere Regulationssequenzen enthält, die zur Expressionssteuerung eines DNA Segments positioniert sind, das ein Polypeptid oder eine RNA kodiert.
- Rekombinante DNA Sequenz - jede DNA Sequenz ausschließlich des Wirtschromosoms, von dem die DNA Sequenz stammt, die eine DNA Sequenz umfaßt, welche isoliert, synthetisiert oder teilweise synthetisiert wurde.
- Rekombinanter DNA Vektor - jeder rekombinante DNA Klonierungs- oder Expressionsvektor.
- Restriktionsfragment - jedes lineare DNA Molekül, das durch die Wirkung von einem oder mehreren Enzymen erzeugt wurde.
- rRNA - ribosomale Ribonukleinsäure.
- Empfindliche Wirtszelle - eine Wirtszelle, die nicht in Gegenwart eines gegebenen Antibiotikums ohne einem DNA Segment, das dagegen Resistenz verleiht, wachsen kann oder deren Wachstum gehemmt ist.
- TcR- das Tetracyclinresistenz-verleihende Gen, ebenfalls zur Bezeichnung des Tetracyclinresistenten Phänotyps verwendet.
- Transkriptionsterminator - eine DNA Sequenz, die die Termination der Transkription von DNA durch RNA Polymerase anzeigt.
- Transfektand - eine Empfängerwirtszelle, die einer Transformation durch Phagen DNA oder durch DNA unterzogen wurde, die in einen Phagenpartikel verpackt war.
- Transformand - eine Empfängerwirtszelle, die einer Transformation unterzogen wurde.
- Transformation - die Einführung von DNA in eine Empfangerwirtszelle, die den Genotyp verändert und zu einer Veränderung in der Empfängerzelle führt.
- Translationsaktivierungssequenz - eine regulatorische DNA Sequenz, die bei einer Transkription in mRNA die Translation der mRNA in Protein fördert.
- tRNA - Transfer-Ribonukleinsäure.
- trp - der Promotor und die Translationsaktivierungssequenz des Tryptophanoperons von E. coli.
- Die in den Zeichnungen gezeigten Restriktions- und Funktionskarten sind ungefähre Darstellungen der hierin diskutierten rekombinanten DNA Vektoren. Die Restriktionsinformation ist nicht erschöpfend und daher können mehrere Restriktionsschnittstellen eines gegebenen Typs im Vektor vorhanden sein, als tatsächlich auf der Karte gezeigt sind.
- Figur 1 - Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid mOGO292.
- Figur 2 - Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pCZR 111.
- Figur 3- Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pOGO299.
- Figur 4- Eine Darstellung des β-Lactambiosynthesewegs.
- Figur 5- Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pMLC 12.
- Figur 6- Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLC2.
- Figur 7- Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid p3SR2.
- Figur 8- Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pUT715.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt isolierte DNA Verbindungen und rekombinante DNA Klonierungs- und Expressionsvektoren, die die Epimeraseaktivität von Streptomyces lipmanii kodieren. Die Sequenz der für die Streptomyces lipmanii Epimerase-kodierenden DNA ist im folgenden gezeigt. In der Darstellung ist nur der kodierende Strang des doppelsträngigen DNA Moleküls gezeigt und die DNA ist von links nach rechts in der 5' T 3' Orientierung gezeigt. Die Nukleotidsequenz ist nummeriert und die Nummern sind links neben der DNA Sequenz angegeben. Die Aminosäuresequenz der durch die DNA kodierten Epimeraseaktivität ist nach der DNA Sequenz von links nach rechts in der Aminoterminus T Carboxyterminus Richtung angegeben.
- worin A ein Desoxyadenykest ist, G ein Desoxyguanykest ist, C ein Desoxycytidylrest ist und T ein Thymidykest ist.
- Im folgenden ist die Aminosäuresequenz gezeigt, die durch die vorangehende DNA Sequenz kodiert wird.
- worin Ala für einen Alaninrest steht, Arg für einen Argininrest steht, Asn für einen Asparaginrest steht, Asp für einen Asparaginsäurerest steht, Cys für einen Cysteinrest steht, GIN für einen Glutarninrest steht, Glu für einen GlutaminsIurerest steht, Gly für einen Glycinrest steht, His für einen Histidinrest steht, Ile für einen Isoleucinrest steht, Leu für einen Leucinrest steht, Lys für einen Lysinrest steht, Met für einen Methioninrest steht, Phe für einen Phenylalaninrest steht, Pro für einen Prolinrest steht, Ser für einen Serinrest steht, Thr für einen Threoninrest steht, Trp für einen Tryptophanrest steht, Tyr für einen Tyrosinrest steht und Val für einen Valinrest steht.
- Der Fachmann erkennt, daß die oben gezeigte DNA Sequenz ein wichtiger Teil der vorliegenden Erfindung ist. Die obige Sequenz kann herkömmlich durch das modifizierte Phosphotriesterverfahren unter Verwendung von vollkommen geschützten Desoxyribonukleotidbausteinen synthetisiert werden. Solche synthetischen Verfahren sind in der Technik gut bekannt und können im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Itakura et al., 1977, Science 198:1056 und Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:5765 ausgeführt werden. Zusätzlich ist ein besonders bevorzugtes Verfahren in Hsiung et al., 1983, Nucleic Acid Research 11:3227 und Narang et al., 1980, Methods in Enzymology 68:90 beschrieben. Zusätzlich zu den oben erwähnten manuellen Verfahren kann die DNA Sequenz mittels automatisierter DNA Synthesegeräte synthetisiert werden, wie dem ABS 380A DNA Synthesegerät (Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404). Die DNA Sequenz kann auch durch die Polymerasekettenreaktion erzeugt werden. Siehe beispielsweise US-A 4 800 159 und US-A 4 683 202 und EP-A 0 258 017.
- Die oben gezeigte Aminosäuresequenz des Epimeraseenzyms kann durch eine Vielzahl an unterschiedlichen DNA Sequenzen kodiert werden, da die meisten Aminosäurereste von mehr als einem DNA-Triplett kodiert werden. Da diese alternativen DNA Sequenzen dieselbe erfindungsgemäße Aminosäuresequenz kodieren wurden, umfaßt die vorliegende Erfindung diese alternativen Sequenzen.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt DNA Verbindungen und rekombinante DNA Klonierungs- und Expressionsvektoren, die die Epimeraseaktivität von Streptomyces lipmanii kodieren. Die Verbindungen können zur Verwendung in jedem Organismus angepaßt werden, in dem die Herstellung des Enzyms erwünscht ist. Man muß nur eine für Epimerase kodierende DNA Sequenz so in einen geeigneten Vektor inserieren, daß die kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines Promotors und einer Translationsaktivierungssequenz steht, die in dem Organismus fünktioniert. Eine für Epimeraseaktivität kodierende DNA Verbindung der vorliegenden Erfindung wird aus einem Stamm von Streptomyces lipmanii isoliert. Es wird eine Genbank der gesamten genomischen DNA des S. lipmanii Stamms konstruiert und auf das Vorkommen von Sequenzen untersucht, die zur Desoxyribooligonukleotidsonde homolog sind. Diese Sonde wird anhand der Information, die über die aminoterminale Sequenz der S. clavuligerus Epimerase erhalten wurde, und mit Kenntnis des genetischen Codes und der Codonpräferenzen von Streptomyces, und einer potentiellen Kreuzhybridisierung zwischen Genen konstruiert, die die Epimeraseenzyme von verwandten Organismen kodieren. Die DNA Sequenzierung ergab den offenen Leserahmen der S. lipmanii Epimerase.
- Ein 3,5 kb EcoRI Restriktionsfragment eines Lambda EMBL3 Klons aus der S. lipmanii Genbank (als 1OGO2 bezeichnet) enthält das Epimerasegen. Das Fragment wird in einen im Handel erhältlichen doppelsträngigen mp 19 (mit EcoRI verdaut, Bethesda Research Laboratories, Inc. P.O. Box 577 Gaithersburg, MD 20760) unter Bildung von Plasmid mOGO292 inseriert, das dann in E. coli K12 JM109 Wirtszellen transformiert wird. Die E. coli K12 JM109/mOGO292 Transformanden wurden hinterlegt und so zum Bestandteil der Stammsammlung der Northern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, W 61604 unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18511 (Hinterlegungsdatum: 19. Juni 1989) gemacht. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid mOGO292 ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt.
- Das Plasmid mOG0292 dient als brauchbares Ausgangsmaterial zur Konstruktion von anderen erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. Diese Vektoren sind besonders brauchbar in einem Verfahren zur Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle, die zur Expression der Epimeraseaktivität fähig ist, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: Transformation dieser Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Expressionsvektor, der enthält: (a) Einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz und (b) eine DNA Sequenz, die die Epimeraseaktivität kodiert und zur Expression von diesem Promotor und dieser Translationsaktivierungssequenz positioniert ist. Die Vektoren sind ebenfalls in einem Verfahren zur Expression der Epimeraseaktivität in einer rekombinanten Wirtszelle brauchbar, wobei dieses Verfahren gekennzeichnet ist durch: Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem zur Expression der Epimeraseaktivität fähigen rekombinanten DNA Expressionsvektor transformiert ist, unter Bedingungen, die die Expression dieser Epimeraseaktivität erlauben. Falls die Gewinnung des Enzyms gewunscht wird, kann die Reinigung des Proteins durch Verfahren erreicht werden, die in der Technik gut bekannt sind.
- Das Plasmid mOGO292 kann aus E. coli K12 JM109/mOGO292 durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren isoliert werden. Das Plasmid mOGO292 enthält das intakte Epimerasegen von Streptomyces lipmanii, das beispielsweise vom Plasmid auf einem 3,5 kb EcoRI Restriktionsfragment isoliert werden kann. Das Plasmid mOGO292 wird zur Konstruktion eines als pOGO299 bezeichneten Plasmids als Ausgangsmaterial verwendet, das eine Expression der Epimeraseaktivität in hohem Ausmaß in E. coli steuert. Um die Manipulation der für S. lipmanii Epimerase-kodierenden Sequenz zu vereinfachen, wurde eine NcoI Restriktionsschnittstelle an der Position -2 bis +4 der S. lipmanii Epimerase kodierenden DNA Sequenz in Plasmid pOGO299 geschaffen.
- Die Schaffung dieser NcoI Stelle wurde durch M13 ortsspezifische Mutagenesetechniken ausgeführt. Die DNA Basen, die das Startcodon des Epimerasegens umgeben, werden von AAATGG zu CCATGG verändert. Ein Fachmann erkennt, daß DNA Mutagenesetechniken herkömmlich zur Einführung von Restriktionsschnittstellen in DNA Sequenzen verwendet werden. In diesem Fall wird die kodierte Aminosäuresequenz nicht verändert. Die Mutagenese und die Zwischenkonstrukte sind ausführlicher in Beispiel 2 beschrieben.
- Das Plasmid pOGO299 kann durch Insertion der für die Streptomyces calvuligerus Epimerase kodierende Sequenz in Plasmid pCZR111 (erheltlich Voll den NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18249, Hinterlegungsdatum: 11. August 1987) konstruiert werden, ein Expressionsvektor, der den Lambda PL (λPL) Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, das cI857 temperaturemplindliche Repressorgen, ein Tetracyclinresistenz-verleihendes Gen und DNA Sequenzen umfaßt, die Vektorreplikationsfunktionen kodieren. Fur eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von pOGO299 siehe Beispiel 2. Der von λPL stammende Promotor von Plasmid pCZR111 ist zur Expressionssteuerung des Epimerasegens positioniert. Bei niedrigen Temperaturen von etwa 30ºC ist das auf Plasmid pCZR111 oder einem Derivat hiervon kodierte cI857 Protein aktiv und zur Reprimierung der Aktivität des Lambda PL Promotors fähig, aber wenn die Temperatur auf etwa 42ºC erhöht wird, wird das cI857 Protein inaktiviert und der Lambda PL Promotor steuert die Transkription von großen mRNA Mengen, die das interessierende Genprodukt kodieren. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pCZR111 ist in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt.
- Das Plasmid pOGO299 enthält dasselbe cI857 Gen, den λPL Promotor und die Translationsaktivierungssequenz, wie Plasmid pCZR111, enthält aber ferner die kodierende Sequenz des Epimerasegens von Plasmid mOGO292 zur Expression ausgehend vom λPL Promotor positioniert. Das 3,5 kb EcoRI Restriktionsfragment von Plasmid mOGO292 enthält die gesamte kodierende Sequenz für die Epimerase. Das Plasmid pOGO299 wurde so konstruiert, daß der λPL Promotor und die Translationsaktivierungssequenz von Plasmid pCZR111 zur Expressionssteuerung der Epimeraseaktivität-kodierenden DNA positioniert sind. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pOGO299 ist in Figur 3 der Zeichnungen dargestellt.
- Bei Temperaturen von etwa 42ºC exprimiert E. coli K12 JM109/pOGO299 eine Epimeraseaktivität in hohem Ausmaß, das 5 % des Gesamtzellproteins erreicht. Rohe Zellextrakte von diesen E. coli K12 JM109/pOGO299 Transformanden sind fähig, die Umwandlung von Isopenicillin N in Penicillin N zu katalysieren, während Zellextrakte von nicht-transformierten E. coli K12 JM109 Zellen diese Umwandlung nicht katalysieren können. Das Testverfahren und die Ergebnisse des Tests für die Umwandlungsreaktion sind in Beispiel 4 gezeigt.
- Das Plasmid pOGO299 liefert ein effektives Mittel zur Bildung großer Mengen an Epimeraseaktivität in E. coli. Da die Kultivierung von E. coli weniger komplex ist, als die Kultivierung von anderen Organismen, die natürlicherweise Epimerase bilden, können E. coli/pOGO299 Transformanden zur Herstellung von rekombinanter Epimerase effizienter und ökonomischer verwendet werden, als nicht-rekombinante oder "natürliche" Epimerasebildner.
- Das Epimeraseenzym kann zur Herstellung von Penicillin N aus Isopenicillin N in einem zellfreien System verwendet werden, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Penicillin N ist nicht nur em brauchbares Antibiotikum, sondern kann auch als Ausgangsmaterial zur Herstellung von wichtigen Antibiotika, wie Cephalexin oder anderen Cephalosporinen verwendet werden (siehe US-A 4 307 192). Die vielleicht bedeutendste Verwendung der Epimerase ist die Verwendung des Enyzms zur Umwandlung von anderen Penicillinen als Isopenicillin N in neue Antibiotikaderivate. Beispielsweise könnte man Cephamycin C als Substrat für die Epimerase verwenden, was die Reaktion in die entgegengesetzte Richtung zu der in naturlichen Biosynthesewegen katalysiert, um ein L-Aminoadipoylderivat zu erzeugen, das dann als Substrat zur Bildung von 7- Aminocephalosporansäure dienen könnte, einem Ausgangsmaterial für semisynthetische Cephalosporine.
- Zellfreie Extrakte von Penicillin- und Cephalosporin-bildenden Organismen können zur Synthese von unnatürlichen (nicht in der Natur gebildeten) β-Lactamen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen E. coli Expressionsvektoren liefern ein gunstiges und effizientes Verfahren zur Erlangung von Epimeraseaktivität, die in vitro zur Modifizierung von Penicillinen unter Bildung neuer Antibiotika oder Antibiotikakernstrukturen verwendet werden kann.
- Das Plasmid pOGO299 ist zur Expressionssteuerung der Epimeraseaktivität in E. coli nicht nur wegen der hohen Expressionsmengen, die erreicht werden, wenn das Plasmid verwendet wird, sondern auch aufgrund des auf dem Plasmid vorhandenen Selektionsmarkers besonders bevorzugt. Viele rekombinante DNA Vektoren kodieren eine β-Lactamase, so daß die den Vektor enthaltenden Zellen in Gegenwart von bestimmten β-Lactamantibiotika, wie Ampicillin, wachsen können. Falls man jedoch einen zellfreien, Epimeraseaktivität enthakenden Extrakt zu Konstruktionszwecken von β-Lactamen verwenden will, will man nicht, daß der Extrakt eine β- Lactamaseaktivität enthält. Daher kodiert das Plasmid pOGO299 keine β-Lactamase als Selektionsmarker, sondern verwendet ein Tetracyclinresistenz verleihendes Gen, das ein Protein kodiert, welches nicht mit β-Lactamen reagiert.
- Die erfindungsgemäßen Epimeraseexpressionsvektoren sind jedoch nicht auf einen bestimmten Selektionsmarker beschränkt. Der Fachmann erkennt, daß viele Selektionsmarker zur Verwendung auf den Epimeraseexpressionsvektoren geeignet sind. Solche Selektionsmarker sind beispielsweise Gene, die Kanamycinresistenz verleihen, Gene, die Chloramphenicolresistenz verleihen, oder andere Antibiotikumresistenz-verleihende Gene.
- Der Fachmann erkennt, daß es einem die vorliegende Erfindung erlaubt, die Codons für das Epimerasegen nach Belieben zu verändern. Mit der gegebenen DNA Sequenz für das Epimerasegen werden dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet, um mutierte Epimeraseenzyme herzustellen, die sich vom natürlichen Epimeraseenzym an jeder Position der Aminosäurereste unterscheiden. Solche mutierten Enzyme wurden durch die mutierten für Epimerase kodierenden Sequenzen kodiert werden, einschließlich Sequenzen, m denen Aminosäurecodons bezüglich der natürlichen für Epimerase kodierenden Sequenz deletiert oder inseriert wurden. Solche mutierten Enzyme liegen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, da man sogar bei absolut unmöglicher Vorhersage, ob eine gegebene Mutation die Aktivität der kodierten Epimerase zerstören wird, nur die mutierte Sequenz durch hierin bereitgestellte Verfahren exprimieren muß, um die Wirkung auf die Epimeraseaktivität zu überprüfen.
- Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die hierin beispielhaft dargestellten bestimmten Vektoren beschränkt. Statt dessen umfaßt die vorliegende Erfindung DNA Verbindungen, die die Epimeraseaktivität von Streptomyces lipmanii kodieren. Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die die Expression der Epüneraseaktivität in jeder Wirtszelle steuern, in der der Expressionsvektor repliziert oder integriert und in der der Promotor und die Translationsaktivierungssequenz funktionsfähig sind.
- Daher umfaßt die vorliegende Erfindung jedes E. coli Plasmid oder jeden Vektor, der die Expression der Epimeraseaktivität in E. coli steuert. Die vorliegende Erfindung umfaßt Vektoren, die die Expression der Epimeraseaktivität steuern und die ein in E. coli fünktionsfahiges Replikon verwenden wie beispielsweise ein Replikon von Plasmiden, wie pBR322, pACYC184, F, ColV- K94, R1, R6-5 oder R100. Die Erfindung ist nicht allein auf Plasmidvektoren beschränkt, sondern umfaßt ebenfalls Expressionsvektoren, die die Epinieraseaktivität exprimieren und Integration oder virale Replikation zur Gewährleistung der Replikation und des Erhalts in der Wirtszelle verwenden.
- Die vorliegende Erfindung ist nicht auf einen bestimmten Promotor oder eine bestimmte Translationsaktivierungssequenz beschränkt, die die Expression der für Epimeraseaktivität kodierenden DNA steuern. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung jedes Promotors und jeder Translationsaktivierungssequenz, die in E. coli funktionsfähig sind und zur Expression der Epimeraseaktivität in E. coli verwendet werden. Es sind viele Promotoren und Translationsaktivierungssequenzen bekannt, die in E. coli funktionsfähig sind und zur Expressionssteuerung der Epimeraseaktivität in E. coli geeignet sind. Solche Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen sind unter anderem der lpp, lac, trp, tac, λpL und λpR Promotor und Translationsaktivierungssequenzen.
- Zusätzlich können Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen von anderen Organismen mit den vorliegenden für Epimeraseaktivität kodierenden DNA Verbindungen unter Bildung von Expressionsvektoren ligiert werden, die die Expression der Isopenicillin-N- Epimeraseaktivität in Wirtszellen steuern, in denen die Aktivierungssequenz fünktionsfähig ist. Obwohl E. coli der am besten geeignete Wirt für die Epimerasebildung und die anschließende Reinigung für die in vitro Verwendung ist, sind Vektoren, die die Expression der Isopenicillin-N- Epimeraseaktivität in anderen Wirtszellen als E. coli steuern, ebenfalls brauchbar, insbesondere zum Zweck der Erhöhung der Antibiotikum-bildenden Fähigkeit und Effizienz eines gegebenen Organismus.
- Eine Vielzahl an Organismen bilden β-Lactamantibiotika. Die folgende Tabelle liefert eine nicht vollständige Liste der β-Lactamantibiotikum-bildenden Organismen. TABELLE I β-Lactamantibiotikum-bildende Organismen Organismus Antibiotikum Agrobacterium Arachnomyces minimus Anixiopsis peruviana Cephalosporium acremonium purpurascens polyaleurum chrysogenum curtipes Chromobacterium Emericellopsis terricola minima synnematicola glabra mirabilis salmosynnemata Flavobacterium Gluconobacter Nocardia lactamadurans uniformis Paecilomyces carneus persicinus Penicillium chrysogenum Serratia Spiroidium fuscum verschiedene β-Lactame Penicilline und Cephalosporine Cephamycin C Nocardicin verschiedene Penicilline und andere β-Lactame Fortstetzung Tabelle I Organismus Antibiotikiim Streptomyces antibioticus argenteolus cattleya chartreusis cinnamonensis lipmanii fimbriatus flavovirens flavus fulvoviridis griseus halstedi heteromorphus hygroscopicus lipmanii olivaceus panayensis pluracidomyceticus rochei sioyaensis tokunomensis viridochromogenes wadayamensis Clavulansäure Asparenomycin A, MM 4550 und MM 13902 Thienamycin SF 1623 und Cephamycin A und B Cephamycin A und B PA-32413-I, Cephamycin C, A16886A, Penicilline, Cephalosporine, Clayulansäure und andere Clavame Cephamycin A und B und Carpetimycin A und B C208 1X und Cephamycin A und B Desacetoxycephalosporin C Cephamycin, Penicillin N, 7-Methoxycephalosporin C, A16884, MM4550, MM 13902 Epithienamycin F, MM 4550 und MM 13902 Pluracidomycin A Carpetimycin A Asparenomycin A
- Die Antibiotikum-bildende Fähigkeit dieser Organismen kann durch Erhöhung der intrazellulären Konzentration der Antibiotikumbiosyntheseenzyme wahrend der Fermentation gesteigert und effizienter gemacht werden. Die für Epimeraseaktivität kodierenden DNA Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die bei einer Transformation in eine geeignete Wirtszelle die intrazelluläre Konzentration der Epimeraseaktivität der transformierten Wirtszelle erhöhen und damit die Antibiotikum-bildende Fähigkeit und Effizienz dieser Zelle steigern, unter der Voraussetzung, daß die Wirtszelle ein β-Lactamantibiotikum über eine Zwischenreaktion bildet, die die Epimeraseaktivität miteinbezieht. Eine bevorzugte Verwendung der Verbindungen ist die Steigerung der Ausbeute eines Antibiotikums mit industrieller Bedeutung.
- Ein Vektor, der die intrazelluläre Konzentration der Epimeraseaktivitat einer gegebenen Wirtszelle erhöht, in die der Vektor transformiert wurde, benötigt die folgenden Elemente: 1) Eine für Epimeraseaktivität kodierende DNA Verbindung der vorliegenden Erfindung und 2) einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, die nicht nur in der zu transformierenden Wirtszelle fünktionieren, sondern in der korrekten Orientierung und Position zur Steuerung der Expression der für Epimeraseaktivität kodierenden DNA positioniert sind. Naturlich können stabile Transformanden nur erhalten werden, wenn der Vektor entweder als extrachromosomales Element oder in die genomische DNA integriert, in der Wirtszelle repliziert. Daher enthält ein bevorzugter Vektor Sequenzen, die spezifisch die Replikation oder Integration des Vektors in der Wirtszelle steuern. Jedoch ist das Vorkommen solcher spezifischer Replikations- oder Integrationssequenzen nicht absolut erforderlich, da eine nicht-spezifische Integration auftreten kann, wenn die DNA in die Wirtszelle eingeführt wird. Ein Epimeraseexpressionsvektor könnte auch ein Antibiotikumresistenz-verleihendes Gen oder ein anderes Element enthalten, das ein Mittel zur Selektion auf Wirtszellen liefert, die den Vektor enthalten, aber solche selektierbaren Elemente sind weder notwendig noch erwünscht, wenn der Vektor in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert.
- Durch das Bereitstellen der kodierenden Sequenz des Epimerasegens von Streptomyces lipmanii liefert die vorliegende Erfindung Epimeraseexpressionsvektoren für jeden Organismus, der für eine Transformation zugänglich ist. Die oben beschriebenen E. coli Epimeraseexpressionsvektoren verdeutlichen die große Vielzahl an erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. Jedoch sind viele der bevorzugten erfindungsgemäßen Vektoren entwickelt worden, um die Expression der Epimerase in einer β-Lactamantibiotikum bildenden Zelle zu steuern.
- Die erfindungsgemäßen Penicillium Vektoren sind für die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Vektoren beispielsgemäß, die verwendet werden können, um die Antibiotikumausbeute einer solchen β-Lactamantibiotikum-bildenden Zelle zu steigern oder um das Antibiotikum zu verändern, das normalerweise von der Zelle gebildet wird. Epimeraseexpressionsvektoren, die das Acetamidasegen oder das Phleomycinresistenzgen enthaften, sind besonders als Vektoren zur Insertion von Genen in Penicillium chrysogenum brauchbar, da kein spezieller Empfängerstamm, wie ein auxotropher Stamm, aufgrund der natürlichen Unfähigkeit von P. chrysogenum konstruiert werden muß, auf Acetamid als alleiniger Stickstoffquelle oder in Gegenwart von Phleomycin zu wachsen. Die auf die Komplementation von auxotrophen Markern durch ein Gen im transformierenden Plasmid basierenden Transformationssysteme haben diesen Vorteil nicht. Oft sind pleiotrope Mutationen mit der Einführung eines auxotrophen Markers in einen P. chrysogenum Stamm verbunden, der für die Penicillinbildung hoch entwickelt ist. Solche Mutationen führen gewöhnlich zu einer geringeren Penicillinbildung (MacDonald et al., 1963, J. Gen. Microbiol. 33: 365-374).
- Die EP-A 0 231 391 beschreibt die 5' und 3' regulatorischen Signale des Cephalosporium acremonium Expandase-Hydroxylase-Gens. Die Signale können mit der für Epimerase kodierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung unter Bildung von erfindungsgemäßen Epimeraseexpressionsvektoren kombiniert werden, die zur Verwendung in Cephalosporium besonders geeignet sind. Die US-A 4 885 251 beschreibt die Transkriptions- und Translationsakivierungssequenzen des Cephalosporium acremonium IPNS Gens, das mit der erfindungsgemäßen für Epimerase kodierenden Sequenz von Streptomyces lipmanii unter Bildung eines rekombinanten Epimerasegens kombiniert werden kann, das die Expression (wenn es in einen Expressionsvektor eingebaut wird und der Vektor in Cephalosporium eingeführt wird) der für Epimerase kodierenden Sequenz von S.lipmanii in Cephalosporium steuert. Die oben und in den Beispielen beschriebenen Vektoren sind nur für die große Vielzahl an Epimeraseexpressionsvektoren beispielsgemäß, die von der Erfindung bereitgestellt werden.
- Die erfindungsgemäßen Epimeraseexpressionsvektoren sind zur Steigerung der intrazellulären Konzentration der Epimeraseaktivität in vielen Zellen brauchbar, speziell in β-Lactamantibiotikum-bildenden Zellen. Das Plasmid mOGO292 enthält die kodierende Sequenz des Epimerasegens von Streptomyces lipmanii, so daß das Plasmid mOGO292 zur Konstruktion von Vektoren zur Steigerung der Kopiezahl des Epimerasegens und so zur Steigerung der intrazellulären Konzentration des Enzyms verwendet werden kann. Da die erfindungsgemäße für Epimerase kodierende Sequenz aus einer Streptomyces Wirtszelle isoliert wurde, ist die für Epimerase kodierende Sequenz besonders gut zur Verwendung in Expressionsvektoren geeignet, die zur Steuerung einer hohen Expression der Epimeraseaktivität in Streptomyces Wirtszellen entwickelt werden. Die Literatur ist voll mit Techniken zur Konstruktion von Streptomyces Expressionsvektoren und zur Transformation von Streptomyces Wirtszellen. Siehe beispielsweise Garcia-Dominguez et al., 1987, Applied and Environmental Microbiology 53(6): 1376-1381. Die erfindungsgemäße für Epimerase kodierende Sequenz kann leicht in einen Expressionsvektor eingebaut werden, der einen Streptomyces Promotor und ein Replikon enthält. Es sind viele bekannte Streptomyces Promotoren und Replikons für eine solche Verwendung erhältlich. Die Tabelle II ist eine veranschaulichende aber keine vollständige Liste von Streptomyces Plasmiden, aus denen Streptomyces Replikons erhalten werden können. Der Fachmann erkennt, daß so lange die Replikationsfunktion nicht zerstört wird, die gesamten in der Tabelle aufgeführten Plasmide oder Teile davon zur Konstruktion von Vektoren verwendet werden können, die das erfindungsgemäße Epimerasegen enthalten. Der Plasmid- enthaltende Wirt und die Hinterlegungsnummer sind ebenfalls in der Tabelle II aufgeführt. Tabelle II Streptomyces Plasmide Plasmid Wirt Hinterlegungsnummer Streptomyces coelicolor A3(2) Streptomyces coelicolor M110 Streptomyces ambofaciens/pEL7 Streptomyces espinosus Streptomyces 3022A Streptomyces lividans Streptomyces virginiae Streptomyces granuloruber A399 12.13/pEL103 Streptomyces lividans ¹ National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Post Office Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB98DG, Scotland, United Kingdom. ²American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852.
- Die erfindungsgemäße für Epimerase kodierende Sequenz von Streptomyces lipmanii kann auch unter die Kontrolle der Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen gestellt werden, die von anderen Streptomyces Stämmen stammen, wie auch von Penicillium, Cephalosporium oder anderen Wirtszellen, um ein rekombinantes Epimerasegen zu konstruieren, das für den gegebenen Organismus verwendet werden kann.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, sollen ihren Schutzumfang aber nicht beschränken.
- Lyophilisierte E. coli K12 JM109/mOGO292 können von den Northern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, IL 61604 unter der Hinterlegungsutmimer NRRL B-18511 erhalten werden (Hinterlegungsdatum: 19. Juni 1989) und direkt als "Kultur" im anschließend beschriebenen Verfähren verwendet werden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid mOGO292 ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt. Zehn ml TY Medium (10g Trypton, 5 g NaCl und 5 g Hefeextrakt pro Liter) werden mit einer Kultur von E. coli K12 JM109/mOGO292 beimpft und unter Belüftung bei 37ºC über Nacht (15-18 Stunden) inkubiert. Die entstehende Kultur wird als Quelle für Plasmid mOGO292 verwendet.
- Es wird eine Reihe an 1:10 Verdünnungen der Kultur in 2fach TY Medium hergestellt. Einhundert µl jeder Verdünnung werden in ein einzeln verschlossenes 5 ml Röhrchen gegeben. Zu jedem Röhrchen werden 200 µl E. coli JM109, der bis zur Sättigung angezogen wurde, und 3 ml Überschichtungsagar (TY Medium + 0,6 % Agar, der bei 45ºC geschmolzen gehalten wird) gegeben. Die Röhrchen werden schnell zweimal gekippt und der Inhalt wird auf TY Agarplatten (TY Medium + 1,5 % Agar) gegossen, die auf 37ºC vorgewärmt wurden. Der Überschichtungsagar kann für 10 Minuten bei Raumtemperatur aushärten. Dann werden die Platten über Nacht bei 37ºC inkubiert.
- Die Plaques werden von der Plattenüberschichtung mit einer Pasteurpipette in 3 ml TY Medium pro Plaque ausgestochen. Die Kulturen werden zwischen 6 bis 18 Stunden bei 37ºC unter Belüftung inkubiert. Nach dieser Inkubation werden 1,5 ml jeder Kultur in getrennte 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße dekantiert. Die Überstände werden in frische Reaktionsgefäße dekantiert und bei 4ºC gelagert, um als Quelle für das Phageninokulum zu dienen.
- Das von M13 stammende Plasmid mOGO292 wird zur Konstruktion des als Zwischenstufe benötigten Plasmids mOGO297 verwendet. Es wird eine ortsspezifische Mutagenese verwendet, um eine NcoI Schnittstelle am 5'-Ende der für Epimerase kodierenden Sequenz von S.lipmanii zu erzeugen, was zu Plasmid mOGO297 führt. Die kodierende Sequenz und die 3' untranslatierte Region wird dann isoliert und mit dem Vektorrückgrat von Plasmid pCZR111 unter Bildung des E.coli Expressionsplasmids pOGO299 ligiert.
- Eine 10 ml Kultur von E. coli K12 JM109 wird in der frühen logarithmischen Wachstumsphase mit 200 µl mOGO292 Phagenstammlösung (hergestellt in Beispiel 1) beimpft und 18 Stunden bei 37ºC mit Belüftung inkubiert. Die Kultur wird durch Zentrifugation bei 5200 Upm in einem Sorvall GSA Rotor (DuPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CT 06470) für 10 Minuten bei 4ºC pelletiert und der entstehende Überstand wird in ein neues Röhrchen über, und erneut zentrifugiert. Der Überstand wird erneut in ein frisches Röhrchen dekantiert. Ein ml einer Lösung aus 25 % Polyethylenglycol (Molekulargewicht etwa 3 350) in 3 M NaCl wird zum Überstand gegeben, der dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Das entstehende Gemisch wird für 30 Minuten bei 10 000 U/min in einem Sorvall 5534 Rotor zentrifugiert. Das durch die Zentrifugation erhaltene Pellet enthält das einzelsträngige Plasmid mOGO292 und wird in 400 µl TE Puffer resuspendiert. TE Puffer ist 10 mM Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid), pH = 7,5 und 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure). Die Lösung wird zuerst mit CHCl&sub3; und dann mit TE-gesättigtem Phenol extrahiert. Das Phenol läßt man mit der wäßrigen Phase für 15 Minuten in Kontakt. Die Lösung wird dann zweimal init einem Gemisch aus TE-gesättigtem Phenol : CHCl&sub3; (1:1, V/V) und zweimal mit CHCl&sub3; alleine extrahiert. Die DNA wird dann aus 0,3 M Natriumacetat in 70 % Ethanol gefällt, durch Zentrigation gewonnen und das entstehende Pellet wird in 100 µl 0,1fächem TE Puffer resuspendiert. Diese Lösung besteht aus 5 µg einzeisträngiger Plasmid mOGO292 DNA.
- Die bei der Mutagenese (und den anschließenden Hybridisierungen zur Detektion der gewunschten Phagen) verwendeten einzelsträngigen DNA Fragmente werden mit Ausnahme des M13 Universalprimers (ein 15-mer), der von BRL Bethesda Research Laboratories, Inc. P.O. Box 577, Gaithersburg, MD 20760) bezogen wird, auf einem automatisierten DNA Synthesegerät, wie dem ABS 380A Synthesegerät (Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404) synthetisiert. Die Mutagenesefragmente werden folgendermaßen bezeichnet: (1) RACE- 10, eine 39 Nukleotide lange einzeisträngige DNA, die zur Epimerase-kodierenden Sequenz im Plasmid mOGO292 bis auf zwei Basen homolog ist, wobei die Fehlbasenpaarung (unterstrichen) eine NcoI Restriktionsschnittstelle etwa bei Position 1 der für Epimerase kodierenden Sequenz, mit folgender DNA Sequenz bildet:
- (2) RACE-11, eine 17 Nukleotide lange einzelsträngige DNA, die lediglich ein Unterabschnitt von RACE-10 mit folgender DNA Sequenz ist:
- Die 5'-Enden von etwa 100 pmol von RACE-10 werden in einem Reaktionsgemisch phosphoryliert, das enthält 4 µl einzelsträngige DNA in einer Endkonzentration von 1 pmol/µl, 10 µl 10fach Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 und 100 mM MgCl&sub2;), 10 µl 0,1 mM Adenosintriphosphat (ATP), 10 µl 0,1 M DTT, 65 µl Glas-destilliertes Wasser und 1 µl (10 Richardson- Einheiten) der T4 Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim Biochemicals, (BMB) 7941 Castleway Drive, P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250). Das Reaktionsgemisch wird bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert, wonach zusätzlich 1 µl Enzym zugegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird dann für weitere 30 Minuten bei 37ºC inknbiert. Die 5'-Enden von etwa 40 pmol M13 Universalprimer werden in einem analogen Reaktionsgemisch von 40 µl phosphoryliert, das dieselbe Enzymmenge enthält.
- Die einzelsträngige Plasmid mOGO292 DNA wird im wesentlichen gemäß der Beschreibung der US-A 4 885 251, die hiermit eingeführt ist, mutagenisiert, wie dies später beschrieben ist. Die Anelierungsreaktion wird ausgeführt durch Zugabe von 500 Nanogramm (in 15 µl 0,1 fachem TE Puffer) einzelsträngiger Plasmid mOGO292 DNA zu 4 µl Puffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA und 500 mM NaCl), 6 µl (6 pmol) phosphoryliertem RACE-10, 4 µl (4 pmol) phosphoryliertem M13 Universalsequenzierungsprimer und 18 µl Wasser und einer Inkubation des Gemisches bei 90ºC für 2 Minuten, dann bei 55ºC für 5 Minuten und schließlich bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
- Die Extensionsreaktion wird durch Zugabe von 60 µl des folgenden Gemisches zur Lösung anelierter DNA ausgeführt: 6 µl Klenow-Ligase-Puffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA und 500 mM NaCl), 6 µl 0,1 M DTT, 6 µl einer Lösung von jeweils 6,25 mM dGTP, dATP, TTP und dCTP, 6 µl 5 mM ATP, 36 µl Wasser, 3 µl (3 Weisseinheiten, BMB) Ligase und 2 µl (10 Einheiten) Klenowenzym (BMB). Das Extensionsreaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde, dann bei 37ºC für 4 Stunden und schließlich bei 14ºC für 18 Stunden inkubiert.
- Das Extensionsreaktionsgemisch wird einmal mit CHCl&sub3; extrahiert und die DNA wird mit Ethanol und Natriumacetat gefällt und durch Zentrigation gewonnen. Das DNA Pellet wird in 40 µl S1 Puffer (0,3 M NaCl und 3 mM Zinkacetat) und 1 µl (400 Einheiten) S1 Nuklease (BMB) resuspendiert. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt, mdem man zuerst 5-10 µg tRNA zum Reaktionsgemisch als Träger gibt und dann mit einem TE-gesättigtem Phenol extrahiert. Die wäßrige Phase wird dann erneut mit CHCl3 extrahiert. Die DNA in der wäßrigen Phase wird durch Ethanolfällung konzentriert und durch Zentrifugation gewonnen. Das DNA Pellet wird in 20 µl Wasser resuspendiert.
- Kompetente E. coli K12 JM109 ("Epicurean Coli ") werden von Stratagene (3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121) bezogen und mit 10 µl der entstehenden S1-behandelten DNA Lösungen transformiert. Die ligierte DNA wird mit 100 µl Zellen gemischt, für eine Stunde auf Eis inkubiert und dann für eine Minute auf 42ºC inkubiert. Die Zellen werden dann in 1, 10, 20, 40 und 50 µl Proben auf 13 x 100 mm sterilen Glasröhrchen verteilt, die 0,25 ml pro Röhrchen E. coli K12 JM109 in der logarithmischen Wachstumsphase enthalten. Zu diesen Röhrchen werden 3 ml Überschichtungsagar gegeben. Das Überschichtungsagargemisch wird dann auf TY- Agarplatten plattiert und die Platten werden über Nacht bei 37ºC inkubiert. (Für detailliertere Beschreibungen und Erklärungen der M13 Verfahren siehe M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual, Bethesda Research Laboratories (BRL), Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD 20877.)
- Die gewünschten Mutanten werden durch Hybridisierung des radioaktiv markierten Oligonukleotids RACE-11 mit der Plasmid DNA identifiziert, die wie unten beschrieben auf Nitrocellulosefilter geblottet ist. Nach der Plaquebildung werden die Platten bei 4ºC für 1 Stunde inkubiert, um die Agarüberschichtung aushärten zu lassen. Die Nitrocellulosefilter werden auf den Rasen von jeweils vier Platten der 15 Minuten mit S1 behandelten Serie gelegt, die 50-200 Plaques enthalten. Der Kontakt zwischen dem Filter und der Rasenoberfläche wird für 1 Minute aufrechterhalten, wonach die Nitrocellulosefilter mittels gesättigten 3 MM Chr Filterpapieren (Whatman LabSales, Inc. P.O. Box 1359, Hillsboro, Oregon 97123-1359) mit 0,1 N NaOH-1,5 M NaCl für 5 Minuten und dann mit 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,0)-3 M NaCl für 5 Minuten behandelt werden. Die Nitrocellulosefilter werden luftgetrocknet und dann in einem Vakuumofen bei 80ºC für 30 Minuten eingebacken.
- Die Prähybridisierung wird durch Behandlung der Nitrocellulosefilter für 5 Minuten bei Raumtemperatur in einer Lösung aus 6fach SSC (20fach SSC ist 3 M NaCl und 0,3 M Natriumcitrat), 10fach Denhardt's Lösung (0,2 g Polyvinylpyrrolidon, 0,2 g Rinderserumalbumin und 0,2 g Ficoll pro 100 ml Wasser), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 0,1 % SDS (Natriumdodecylsulfat) und 10 µg/ml denaturierter chromosomaler E. coli DNA durchgeführt. Die Filter werden dann für 90 Minuten bei 56ºC in einer Lösung aus 6fach SSC, 10fach Denhardt's Lösung 0,1 % Natriumpyrophosphat und 1 pmol/5 ml ³²P-RACE-11 hybridisiert. Der ³²P-RACE-11 wird durch Phosphorylierung der 5'-Enden von 100 pmol RACE-11 im wesentlichen gemäß dem vorher in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren hergestellt, außer daß 120 pmol γ-³²P-ATP (New England Nuclear (NEN), 549 Albany Street, Boston, MA, 02118, Katalognummer NEG-002A) anstatt nicht radioaktivem ATP verwendet werden. Nach der Hybridisierung werden die Filter zweimal für 5 Minuten pro Waschschritt im Uberschuß mit 6fach SSC bei Raumtemperatur, dann bei 56ºC im Überschuß mit 6fach SSC für 30 Minuten gewaschen. Die Filter werden luftgetrocknet und für 18 Stunden bei -70ºC mit einem Quanta IIIR Verstärkerschirm (DuPont, Instrument Produkts, Biomedical Division, Newtown, CT 06470) autoradiographiert. Die gewünschten Mutanten (jene, die die zur Sequenz von RACE-11 komplementären Sequenzen enthalten) belichten den Film aufgrund der Bindung des radioaktiven Oligomers an die auf dem Filter gebundene M13 Phagen DNA. Die Identitat emer korrekten Mutante, als Plasmid MOGO297 bezeichnet, wird durch Restriktionsanalyse der DNA in der replikativen Form (RF) bestätigt, welche folgendermaßen hergestellt wird.
- Die Plaques werden von der Plattenüberschichtung mit einer Pasteurpipette in 3 ml pro Plaque TY Medium ausgestochen. Die Kulturen werden zwischen 6 bis 18 Stunden bei 37ºC unter Belüftung inkubiert. Nach dieser Inkubation werden 1,5 ml jeder Kultur in getrennte 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße dekantiert. Die Überstände werden in frische Reaktionsgefäße dekantiert und bei 4ºC gelagert, um als Quelle für das Phageninokulum zu dienen. Die replikative Form der DNA wird aus den Zellpellets im wesentlichen gemäß dem alkalischen Plasmidisolierungsverfahren von Birnboim und Doly, 1979, Nuc. Acid Res. 7(6): 1513-1523 mit folgenden Ausnahmen präpariert. Das Verfahren wird so erweitert, daß 1,5fache Volumina aller Lösungen verwendet werden und das klare Lysat einmal mit einem gleichen Volumen CHCl&sub3; extrahiert wird. Die DNA wird dann durch die Zugabe von 0,4 Volumina Isopropanol und einer Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten gefällt. Die DNA wird durch Zentrifügation gewonnen und dann mit 70 % Ethanol aus 0,3 M Natriumacetat gefällt. Die aus einzelnen Plaques isolierte DNA wird auf das Vorkommen der gewünschten Insertion durch einen NcoI-BamHI Restriktionsverdau analysiert.
- Die RF DNA von Plasmid mOGO297 enthält die für Epimerase kodierende Sequenz auf dem partiell NcoI-BamHI verdauten Restriktionsfragment, das in der Konstruktion des E. coli Expressionsplasmids pOGO299 verwendet wurde. Die DNA wird in der replikativen Form aus E. coli K12 JM109 Zellen, die mit dem Plasmid mOGO297 infiziert sind, im wesentlichen gemäß dem im folgenden beschriebenen Verfahren isoliert.
- Ein Liter TY Medium wird mit einer Kultur von E. coli K12 JM109/mOGO297 beimpft und unter Belüftung bei 37ºC über Nacht (15-18 Stunden) inkubiert. Die Kultur wird bei 5 200 U/min für 10 Minuten bei 4ºC in einem Sorvall GSA Rotor zentritügiert, um die Zellen zu pelletieren. Der entstehende Überstand wird verworfen. Das Zellpellet wird in 28 ml einer Lösung aus 25 % Saccharose und 50 mM EDTA resuspendiert. Etwa 1 ml einer Lösung aus 20 mg/ml Lysozym m 50 % Glycerin und 0,25 M Tris-HCl pH = 8,0 und etwa 1,5 ml 0,5 M EDTA pH = 8,0 werden zugegeben und mit der Zellsuspension vermischt. Das entstehende Gemisch wird für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Drei ml Lyselösung (hergestellt durch Mischen von 3 ml 10 % Triton X-100, 75 ml 0,25 M EDTA pH 8,0 und 7 ml Wasser) werden zu den Lysozym-behandelten Zellen unter sanftem Mischen gegeben. Die entstehende Lösung wird für weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert.
- Der Zelldebris wird durch Zentrifügation bei 17 000 U/min in einem Sorvall SS34 Rotor für etwa 45 Minuten bei 4ºC entfernt. Etwa 28,6 g CsCl und 1 ml einer 5 mg/ml Ethidiumbromidlösung werden zu den 30 ml Überstand gegeben. Dann wird das Volumen mit Wasser auf 40 ml eingestellt und die Lösung in ein Ultrazentrifügenröhrchen dekantiert. Das Röhrchen wird zugeschmolzen und die Lösung wird bei 49 500 U/min in einem Ti70 Rotor (Beckman, 7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, IL 60646) für 18 Stunden zentrifugiert. Die entstehende Plasmidbande, durch ultraviolettes Licht sichtbargemacht, wird isoliert, mit CsCl-gesättigtem Isopropanol unter Entfernung des Ethidiumbromids extrahiert und gegen dreimal gewechselten 20 Volumina TE Puffer (10 mM Tris-HCl pH = 7,5 und 1 mM EDTA) dialysiert. Das Dialysat wird gesammelt, dann werden zwei Volumina Ethanol und 0,05 Volumina 3 M Natriumacetatlösung zugegeben. Das Ethanolgemisch wird auf -20ºC abgekühlt und die Plasmid DNA wird durch Zentrifügation bei 10 000 U/min für 30 Minuten in einem 5534 Rotor bei -10ºC pelletiert. Das entstehende Pellet wird in 1 ml TE Puffer resuspendiert und dann mit einem gleichen Volumen eines Phenol: Chloroform Gemisches (1:1, V/V) extrahiert. Die DNA in der wäßrigen Phase wird durch die Zugabe von 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol, gefolgt von einer Inkubation bei -20ºC für 30 Minuten und einer Zentrifügation bei 15 000 U/min in einem SS34 Rotor für 20 Minuten gewonnen. Das entstehende DNA Pellet wird zuerst mit 70 % Ethanol und dann mit 100 % Ethanol gewaschen und getrocknet.
- Das durch dieses Verfahren erhaltene 1,0 mg an Plasmid mOGO297 DNA wird in 1,5 ml 0,1fachem TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert. Etwa 10 µg der RF DNA der Plasmid mOGO297 DNA werden partiell mit dem Restriktionsenzym NcoI ( 10 Einheiten) in einer Reaktion verdaut, die die DNA in NcoI Puffer (50 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl) enthält. Nach einer Inkubation für 2 Minuten bei 37ºC wird das Restriktionsenzym BamHI ( 25 Einheiten) zugegeben und die Inkubation wird bei 37ºC für 2 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol gefällt, einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und das 3,3 kb NcoI-BamHI Fragment aus dem Partialverdau wird unter Verwendung des Epigene D-Gel Elektroelutionsgeräts (EpiGene, P.O. Box 4817, Baltimore MD 21211) im wesentlichen gemäß den Anweiseungen des Herstellers isoliert.
- Das Plasmid pCZR111 ist aus E. coli K12 JM109 von der NRRL unter der Hinterlegungsnummer B-18249 erhältlich (Hinterlegungsdatum: 11. August 1987). Es kann im wesentlichen gemäß Beispiel 3A isoliert werden, außer daß 15 µg/ml Tetracyclin statt 100 µg/ml Ampicillin im Kulturmedium enthalten sind. Eine Restriktions- und Funktionskarte von pCZR111 ist in Figur 2 gezeigt.
- Der Vektor wird durch den Verdau des Plasmids pCZR111 mit XbaI und BamHI erzeugt. Etwa 1 µl XbaI (10 Einheiten) wird zu 10 µl Plasmid pCZR111 ( 10 µg) und 5 µl 10fach XbaI Puffer (500 mM Tris-HCl pH = 8,0, 100 mM MgCl&sub2; und 500 mM NaCl) gegeben. Nach einer Inkubation bei 37ºC für 90 Minuten werden 0,5 µl 5 M NaCl und 1 µl BamHI ( 10 Einheiten) zugegeben und die Inkubation wird für weitere 90 Minuten bei 37ºC fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann einer Agarosegelektrophorese unterzogen und das 5,75 kb XbaI-BamHI Vektorfragment wird im wesentlichen gemäß Beispiel 3A isoliert.
- Das Plasmid pOGO299 kann erzeugt werden durch Ligation des 3,8 kb BamHI-NcoI Fragments von mOGO297, dem 5,75 kb XbaI-BamHI Vektorfragment von pCZR111 und einem doppelsträngigem XbaI-NcoI Restriktionsfragment, das durch das Phosphotriesterverfahren synthetisiert wurde, um das 9,1 kb Plasmid pOGO299 zu erhalten. Das doppelsträngige DNA Fragrnent, das die Translationsaktivierungssequenz für 2 Cistrons enthält, hat die folgende Struktur:
- Etwa 0,1 µg des 3,3 kb NcoI-BamHI Restriktionsfragments von Plasmid mOGO297 vom obigen Abschnitt D, 0,1 µg des 5,75 kb XbaI-BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pCZR111 vorn obigen Teil E und 1pmol des doppelsträngigen synthetischen XbaI-NcoI Restriktionsfragments werden in einer 20 µl Reaktion ligiert, die die DNA Fragmente, 2 µl 10fach Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 und 100 mM MgCl&sub2;), 2 µl 5 mM ATP, 1 µl 6 µg/ml Rinderserumalbumin (RSA), 1 µl T4 DNA Ligase (1 Weiss Einheit, BMB) und genug Wasser enthält, um das Reaktionsvolumen auf 20 µl zu bringen. Die Reaktion wird für etwa 18 Stunden bei 15ºC inkubiert. Die ligierte DNA enthält neben anderen Ligationsprodukten das gewünschte Plasmid pOGO299.
- Das Ligationsgemisch wird in E. coli K12 JM109 folgendermaßen transformiert. Kompetente E. coli K12 JM109 ("Epicurean Coli ") werden von Stratagene bezogen und mit einem Ligationsreaktionsgemisch transformiert, das das Plasmid pOGO299 enthält. Die ligierte DNA wird mit 100 µl kompetente JM109 Zellen gemischt, für eine Stunde auf Eis inkubiert, dann für eine Minute auf 42ºC inkubiert, dann mit 2 ml frischem TY Medium verdünnt und bei 37ºC für eine Stunde inkubiert.
- Aliquots des Transformationsgemisches werden auf TY-Agarplatten plattiert, die Tetracyclin (15 µg/ml) enthalten. Die Platten werden bei 37ºC für etwa 18 Stunden inkubiert. Die tetracyclinresistenten Transformanden werden weiter durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA gescreent, um die gewünschten Transformanden mit dem Plasmid pOGO299 zu identifizieren. Die Plasmid DNA wird aus 3 ml Kulturen im wesentlichen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren von Birnboim und Doly zur Herstellung der RF DNA aus E. coli K12 JM109 Zellpellets präpariert, die mit dem Phagen M13 infziert sind. Die Plasmid pOGO299 DNA von einem Transformanden wird im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 3A beschriebenen Verfahren zur Verwendung in anschließenden Konstruktionen präpariert.
- Ein E. coli K12 JM109/pOGO299 Transformand wird bei 30ºC über Nacht in 400 ml TY Medium (enthält 10 µg/ml Tetracyclin) in einem Schüttelinkubator angezogen. Die Zellen werden 1:10 durch Zugabe von 100 ml der Übernachtkultur zu 900 ml frischem Medium in einen 2,8 l Fernbachkolben gegeben, das 10 µg/ml Tetracyclin enthält. Die Temperatur des Luftschüttlers wird dann auf 42ºC angehoben und die Inkubation wird für weitere 6 Stunden fortgesetzt. Der cI857 temperaturempfindliche Repressor des Lambda pL Promotors, der zur Steuerung der Epimeraseexpression auf dem Plasmid pOGO299 positioniert ist, wird bei 42ºC inaktiviert und erlaubt somit die Expression der Epimerase. Nach der Induktion werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und als bevorzugte Quelle für die von E. coli gebildete Epimeraseaktivität verwendet.
- Fünf Gramm der induzierten, pelletierten E. coli werden mit 10 ml Aufschlußpuffer (10 mM Natriumpyrophosphat-HCl, pH = 8,0 in 5 M Harnstoff, 20 % Glycerin und 0,1 mM Dithiothreit (DTT)) gemischt. Falls die Menge an Zellen nach der Zentrifügation weniger als 5 Gramm beträgt, wird das Verhältnis von Zellen zu Puffer gehalten. Die Zellsuspension wird dann auf 2ºC in einem Eis-Ethanolbad gekühlt und bei voller Stärke für 20 Sekunden ultrabeschallt. Das Kühlen und Ultrabeschallen wird dreimal wiederholt. Der Zelldebris wird durch Zentrifugation bei 47 000 x g für 20 Minuten bei 4ºC entfernt. Der Überstand wird dann durch Glaswolle filtriert, wobei das Filtrat das Rohenzym ist.
- Das Enzym katalysiert die Umwandlung von Isopenicillin N zu Penicillin N und umgekehrt, wobei es einen Gleichgewichtszustand zwischen den zwei Molekülen erzeugt. Daher wird die Aktivität auf zwei Arten gemessen, einmal mit Isopenicillin N als Ausgangsmaterial und einmal mit Penicillin N als Ausgangsmaterial. Das Gesamtprotein wird durch das Verfahren von Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265 (1951) gemessen. Der Zellextrakt wird mit 1,4 mM Isopenicillin N oder Penicillin N, 0,2 mM Dithiothreit, 0,1 mM Pyridoxal-5'-phosphat (wie durch das Hydrazinverfahren gemessen (H. Wada und E. Snell, J. Biol. Chem. 236, 2089 (1961)), und 50 mM Pyrophosphat-HCl pH = 8,3 in einem Endvolumen von 0,5 ml gemischt. Das Reaktionsgemisch wird dann bei 37ºC für 20 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch zehnminütiges Kochen beendet. Sie wird dann durch ein 0,45 µm Filter geschickt.
- Penicillin N und Isopenicillin N sind schwierig durch HPLC zu trennen. Die Verbindungen müssen mit o-Phthaldialdehyd gemäß dem Verfahren von D.W. Aswad, Anal. Biochem. 137, 405 (1984) und J. Usher, M. Lewis und D.W. Hughes, Anal. Biochem. 149, 105 (1985) derivatisiert werden. Zwanzig µl des Filtrats werden mit 5 µl der Derivatisierungslösung gemischt (4 mg o- Phthaldialdehyd (Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Lonis, MO 63178) gelöst in 300 µl Methanol, 250 µl 0,4 M Natriumborat pH = 9,4, 390 µl H&sub2;O und 60 µl 1 M N-Acetyl-L-Cystein, mit NaOH auf pH 5-6 eingestellt). Die Reaktion kann bei Raumtemperatur für 2 Minuten stattfinden bevor sie mit 200 µl 50 mM Natriumacetat pH = 5,0 beendet wird. Fünfzig µl Aliquots werden durch HPLC mit einer Flußrate von 1 ml/min und einer Messung der Fluoreszenz bei 360 nm analysiert. Wenn Isopenicillin N in die Gemische gegeben wird, wandeln die die Epimeraseaktivität exprimierenden Zellextrakte Isopenicillin N zu Penicillin N um. Ähnlich wird Penicillin N in Gegenwart dieser Zellextrakte in Isopenicillin N umgewandelt. In jedem Fall wird ein Zustand erreicht, der dem Gleichgewicht nahekommt. Man beobachtet keine Umwandlung, wenn der Zellextrakt nicht zum Gemisch gegeben wird. Zusätzlich reagiert ein Antikörper gegen das gereinigte Epimeraseenzym mit einer 50 000 Dalton Bande in einem Western Blot. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß das klonierte Gen zu einem Protein führt, das eine Epimeraseaktivität aufweist.
- Ein Penicillium Stamm zur Transformation wird von der American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 9480 erhalten. Andere Penicillium chrysogenum Stämme oder andere kommerzielle durch Mutation, Selektion oder genetische Züchtung zum Zweck der verbesserten Bildung von Penicillin G oder Penicillin V von ATCC 9480 abstammende Stämme sind ebenfalls zur Verwendung bei der Herstellung von Transformanden mit den erfindungsgemäßen Vektoren und Plasmiden geeignet.
- Alle frei erhältlichen Vektoren, die zur Verwendung in Penicillium geeignet sind, wie das Plasmid pMLC12 (NRRL B-18097 (Hinterlegungsdatum: 8. August 1986) und Figur 5) können zur Nutzung des Epimerasegens von S. lipmanii in Penicillium verwendet werden. Das Gen kann unter die Kontrolle eines Promotors, wie dem Penicillium chrysogenum IPNS Promotor auf Plasmid pLC2 (ATCC 53334 und Figur 6) gestellt werden. Es ist nützlich, einen Vektor zu verwenden, der einen Selektionsmarker enthält,wie das Acetamidasegen (amdS) (erhältlich als 5,0 kb EcoRI-SalI Restriktionsfragment von Plasmid p3SR2 (NRRL B-18182 (Hinterlegungsdatum: 26. Februar 1987) und Figur 7). Alternativ dazu kann das Phleomycinresistenzgen (phlR) von Cayla, Avenue de Larrieu, 31094 Toulouse, Cedex, Franca auf Plasmid pUT715 (Figur 8) erhalten werden. Phleomycin ist ebenfalls von Cayla erhältlich. Das Antibiotikum sollte das Acetamid in diesem Beispiel in einer Konzentration von 1 mg/l ersetzen.
- Um Penicillium chrysogenum Zellen effizient zu transformieren, ist es notwendig, die Zellwände unter Bildung von stabilen Protoplasten zu entfernen. Bei der Herstellung solcher Protoplasten ist es vorteilhaft, mit einem einheitlichen Impfgut zu beglimen. Andererseits ist die Herstellung von Zellen in Kultur nicht reproduzierbar und man verliert bei Versuchen Zeit, P. chrysogenum Protoplasten aus ungeeigneten oder unpassenden Zellmengen zu präparieren.
- Eine entweder lyophilisierte oder aus Flüssigstickstofflagerung entnommene und bei Raumtemperatur aufgetaute Ampulle vegetativer Zellen ( 10&sup9; koloniebildende Einheiten in 1,0 ml Schutzflüssigkeit: 5 % Lactose, 10 % Glycerin und 0,1 % Tween 80) wird in 1 ml steriler Kochsalzlösung verdünnt. Etwa 0,1 ml dieser Suspension wird zum Beimpfen jedes der ungefähr 20 Schrägagarröhrchen mit Sporulationsmedium verwendet: Lactose 15,0 g/l, Maisquellwasser 2,5 g/l, Pepton 5,0 g/l, NaCl 4,0 g/l, MgSO&sub4; 7 H&sub2;O 0,5 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 0,6 g/l; FeCl&sub3; 6 H&sub2;O 0,005 g/l, CuSO&sub4; 5 H&sub2;O 0,002 g/l, Einstellen auf pH = 7,0, Agar 30,0 g/l und Autoklavieren für 20 Minuten bei 2 bar (120 psi).
- Jedes Schrägagarröhrchen [15 cm x 2,5 cm] enthält 25 ml verfestigtes Medium. Das gleichmäßig über die Schrägagaroberfläche verteilte Impfgut läßt man bei 25ºC wachsen, bis ein bedeckender Myzelrasen entsteht und sporuliert (1 Woche für die meisten Stämme). Der Bewuchs aus einem Schrägagarröhrchen wird in 10 ml sterilem flüssigem Kulturmedium suspendiert und die Suspension wird in 106 ml flüssiges Kulturmedium überführt. Der die suspendierten Zellen enthaltende Kolben wird auf einen Rundschüttler gestellt und bei 25ºC für 18 Stunden bei 285 U/min mit einem Ausschlag von 2,5 cm (1 Inch) inkubiert.
- Das wäßrige Kulturmedium wird folgendermaßen hergestellt:
- 100 ml Lösung A (36 g/l Saccharose, 7,5 g/l L-Asparagin, 15 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 21 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,75 g/l Na&sub2;SO&sub4;, 0,18 g/l MGSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,06 g/l CaCl&sub2;, 1 ml/l Salzelösung, neutraler pH) werden in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben. Salzelösung ist (pro Liter): 15 g Fe(NH&sub4;)(SO&sub4;)&sub2; x 6 H&sub2;O, 3 g MnSO4 x 4 H&sub2;O, 3 g ZnSO&sub4; x 7 H&sub2;O und 0,8 g CuSO&sub4; x 5 H&sub2;O. Der Kolben wird mit einem handelsüblichen Verschluß verschlossen und bei 121ºC für 20 Minuten autoklaviert. Zwei ml Lösung B (Glucose, 108 g/l) und 4 ml Lösung C (25 g/l Saccharose, 12,5 ml Maisquellwasser (4 % G/V Stickstoff), 5,5 g/l Ammoniumacetat, 5 g/l CaCO&sub3;, pH auf 6,5 mit KOH eingestellt und bei 121ºC für 20 Minuten autoklaviert) werden dann zur Lösung A gegeben, um das flüssige Kulturmedium herzustellen.
- Zellen einer 24 Stunden Kultur werden durch Unterdruckfiltration geerntet (Whatman Papier Nr. 1 in einer Nutsche) und in Puffer suspendiert (0,01 M Tris, 0,01 M MgSO&sub4;, 0,01 M DTT, 1,0 M KCl und pH = 7,0 mit HCl). Um eine Endkonzentration an Zellen von 1 g Zellmasse pro 50 ml Puffer zu erhalten, wird ausreichend Puffer zugegeben. Die Zellsuspension wird in einem 250 ml Schüttelkolben in ein Rundschüttlerwasserbad gestellt und bei 29-30ºC für 10 Minuten bei 140 Upm mit einem Ausschlag von 2,5 cm (1 Inch) inkubiert. Die Dithiothreit-behandelten Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 ml Enzymlösung (10 mg/ml Novozym 234, Novo Industri A/B Bagsvaerd, Dänemark, 0,01 M Tris, 0,01 M MgSO&sub4;, 0,01 M DTT, 1, M KCl und pH = 5,8 mit HCl) in einem 250 ml Schüttelkolben resuspendiert. Diese Zellsuspension wird dann in ein Rundschüttlerwasserbad bei 29-30ºC für 15 Minuten bei 140 Upm mit einem Ausschlag von 2,5 cm (1 Inch) gestellt. Die Enzym-behandelten Zellen werden dann bei 1240 x g für 6 Minuten zentrifugiert und das entstehende Pellet wird in Puffer (0,01 M Tris-HCl, 0,01 M MgSO&sub4;, 1,0 M KCl und pH = 7,0 mit HCl) resuspendiert. Die Suspension wird zuerst bei 950 x g für 6 Minuten zentrifugiert. Das entstehende Pellet wird im gleichen Puffer resuspendiert und die Suspension wird bei 700 x g für 6 Minuten zentrifugiert. Das entstehende Pellet wird in 5 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Diese Suspension enthält primär große Protoplasten und osmotisch empfindliche Zellen, die noch etwas Zellwandstruktur aufiveisen. Verglichen mit den kleinen Protoplasten, die durch das obige Verfahren entfernt werden, ist der Prozentsatz an Protoplasten, die zur Regenerierung von Zellwänden fähig sind, und der Prozentsatz an lebensfähigen osmotisch stabilen Zellen für die großen Protoplasten und osmotisch empfindlichen Zellen in der schließlichen Lösung höher. Die Zellsuspension wird mit Puffer auf eine Konzentration von 2 x 10&sup8; Zellen/ml verdünnt.
- Für jedes transformierende Plasmid werden 0,1 ml der Suspension an osmotisch empfindlichen Penicillium chrysogenum Zellen (etwa 2 x 10&sup7; Zellen) versetzt mit 10 µl 50 mM CaCl&sub2;, 25 µg Plasmid DNA in 5-15 µl TE Puffer und 0,9 ml einer Lösung aus frisch gelöstem Polyethylenglycol 4 000 (Baker, 40 % Gewicht/Volumen in osmotisch stabilisiertem Puffer). Das Gemisch wird gevortext, 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, bei 700 x g für 2 Minuten zentrifugiert und erneut gevortext. Zwei Aliquots mit jeweils 0,5 ml werden dann auf der Oberfläche von osmotisch stabilisiertem Acetamidmedium (1,7 gil Hefestickstoffquelle ohne Aminosäure und Ammoniumsulfat, 125 g/l Saccharose, 0,738 g/l Acetamid, 1,27 g/l CaCl&sub2; und 22 g/l Noble Agar) ausgebracht. Um die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen zu messen, die im Transformationsgemisch vorhanden sind, werden Aliquots des Transformationsgemisches auf Medium ausplattiert, in dem das Acetamid durch eine äquimolare Menge Aminoniumsulfat ersetzt ist. Sieben bis zehn Tage nach der Transformation sind die Transformandenkolonien mit einer ausreichenden Größe zur Subkultivierung auf dem Acetamidmedium vorhanden. Abortive Transformanden werden leicht von stabilen Transformanden unterschieden, da abortive Transformanden nicht nach der Subkultur auf frischem Acetamidmedium wachsen können. Zellen, die mit einem Plasmid transformiert sind, das das Acetamidasegen enthält, bilden nach vier bis fünf Tagen nach der Transformation sichtbare Kolonien.
- Penicillium Transformanden, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformiert sind, welche das amdS Gen enthalten, exprimieren eine Acetamidaseaktivität (das amdS Genprodukt), die nicht in Extrakten des untransformierten P. chrysogenum Empfängerstamms (beispielsweise ATCC 9480) detektiert werden kann. Diese Aktivität führt zur Fähigkeit der transformierten Stämme, unter Verwendung des durch die Acetamidhydrolyse freigesetzten Ammoniaks zu wachsen, wenn keine anderen Stickstoffquellen verfügbar sind. Die Penicillium Transformanden der Erfindung exprimieren ebenfalls die Epimeraseaktivität.
- Stabile Transformanden tragen die transformierende DNA in ihrer hochmolekularen DNA. Sonden, beispielsweise die für Epimerase kodierende Sequenz oder Fragmente der Aspergillus DNA, die das Acetamidasegen enthalten, hybridisieren mit der hochmolekularen DNA aus diesen Transformanden sogar nach mehreren Passagen auf nicht-selektivem Medium (Ammoniak als Stickstoffquelle). Der transformierende Phänotyp (Produktion von Epimerase und, falls ein amds Vektor verwendet wurde, die Fähigkeit auf Acetamid als einziger Stickstoffquelle zu wachsen) behalten die Transformanden auch nach Passagen auf nicht- selektivem Medium.
Claims (10)
1. Isolierte DNA Verbindung, die eine DNA Sequenz enthält, welche ein Streptomyces lipmanii
Protein mit der folgenden Aminosäuresequenz kodiert:
worin Ala für einen Alaninrest steht, Arg für einen Argininrest steht, Asn für einen
Asparaginrest steht, Asp für einen Asparaginsaurerest steht, Cys für einen Cysteinrest steht, Gln für
einen Glutaminrest steht, Glu für einen Glutaminsäurerest steht, Gly für einen Glycinrest steht,
His für einen Histidinrest steht, Ile für einen Isoleucinrest steht, Leu für einen Leucinrest steht,
Lys für einen Lysinrest steht, Met für einen Methioninrest steht, Phe für einen Phenylalaninrest
steht, Pro für einen Prolinrest steht, Ser für einen Serinrest steht, Thr für einen Threoninrest
steht, Trp für einen Tryptophanrest steht, Tyr für einen Tyrosinrest steht und Val für einen
Valinrest steht.
2. Isolierte DNA Verbindung nach Anspruch 1, worin der kodierende Strang die folgende DNA
Sequenz enthält
worin A ein Desoxyadenylrest ist, G ein Desoxyguanyfrest ist, C ein Desoxycytidylrest ist und
T ein Thymidylrest ist.
3. Rekombinanter DNA Vektor, der die DNA Sequenz nach Anspruch 1 enthält.
4. Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 3, der ferner einen Promotor enthält, der zur
Expressionssteuerung dieser Epimeraseaktivität-kodierenden DNA positioniert ist.
5. Rekombinanter DNA Expressionsvektor nach Anspruch 4, worin der Promotor in E. coli,
Aspergillus, Penicillium, Cephalosporium oder Streptomyces funktionsfähig ist.
6. Rekombinanter DNA Expressionsvektor nach Anspruch 5, worin dieser Promotor der ÄPL
Promotor oder der Promotor des Aspergillus nidulans amdS Gens ist.
7. Rekombinanter DNA Expressionsvektor nach Anspruch 6, der das Plasmid pOGO299 ist, das
erhalten wird, indem man mOGO292 (NRRL B-18511) einer ortsspezifischen Mutagenese
unter Bildung einer NcoI Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende der für die Epimerase von S.
lipmanii kodierenden Sequenz unterzieht, was zu Plasmid mOGO297 führt und das 3,8 kb
BamHI-NcoI Fragment von mOGO297, das 5,75 kb XbaI-BanIH Vektorfragment von
pCZR111 (NRRL B-18249) und ein doppelsträngiges XbaI-NcoI Restriktionsfragment, das
durch das Phosphotriesterverfahren hergestellt wurde, ligiert.
8. Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 3, der mOGO292 ist und von NRRL B-18511
erhalten werden kann.
9. Verfahren zur Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle, die zur Expression einer
Epimeraseaktivität fähig ist, gekennzeichnet durch
Transformation dieser Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Expressionsvektor, der
enthält:
(a) Einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, die in dieser Wirtszelle
fünktionsfähig sind, und
(b) eine DNA Sequenz, die die Epimeraseaktivität von Streptomyces lipmanii kodiert und zur
Expression von diesem Promotor und dieser Translationsaktivierungssequenz positioniert
ist.
10. Rekombinanter DNA Vektor, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus
mOGO292, erhältlich von NRRL B-18511
mOGO297, erhältlich, indem man mOGO292 einer ortsspezifischen Mutagenese unter Bildung
einer NcoI Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende der für Epimerase kodierenden Sequenz von
S. lipmanii unterzieht, und
pOGO299, erhältlich, indem man mOGO292 (NRRL B-18511) einer ortsspezifischen
Mutagenese unter Bildung einer NcoI Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende der für die Epimerase
von lipmanii kodierenden Sequenz unterzieht, was zu Plasmid mOGO297 führt, und das
3,8 kb BamHI-NcoI Fragment von mOGO297, das 5,75 kb Xbal-BamHI
Vektorfragment von pCZR111 (NRRL B-18249) und ein doppelsträngiges XbaI-NcoI
Restriktionsfragment, das durch das Phosphotriesterverfahren synthetisiert wurde, ligiert.
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