DE69431960T2 - Alpha1,4-glukan lyase aus einer pilzinfizierten alge, ihre reinigung, genklonierung und expression in mikroorganismen - Google Patents
Alpha1,4-glukan lyase aus einer pilzinfizierten alge, ihre reinigung, genklonierung und expression in mikroorganismenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, speziell α-1,4-Glucanlyase ("GL"). Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Extrahieren derselben. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Nukleotidsequenz bzw. Nukleotidsequenzen, welche diese codieren.
- Die FR-A-2617502 und Baute et al., Phytochemistry [1988], Band 27, Nr. 11, S. 3401-3403, beschreiben die Herstellung von 1,5-D-Anhydrofructose ("AF") in Morchella vulgaris durch eine scheinbare enzymatische Reaktion. Die Ausbeute der Herstellung von AF ist ziemlich gering. Trotz eines Verweises auf eine mögliche enzymatische Reaktion, zeigt keines dieser zwei Dokumente irgendwelche Aminosäuresequenzdaten für irgendein Enzym, ganz zu schweigen von irgendwelcher Nukleotidsequenzinformation. Diese Dokumente sagen, daß AF ein Vorläufer für die Herstellung des Antibiotikums Pyronmicrothecin sein kann.
- Yu et al., Biochimica et Biophysica Acta [1993], Band 1156, S. 313-320, berichten über die Herstellung von GL aus rotem Seegras und dessen Verwendung für den Abbau von α-1,4-Glucan zur Herstellung von AF. Die Ausbeute der Herstellung von AF ist ziemlich gering. Trotz eines Verweises auf das Enzym GL zeigt dieses Dokument keine Aminosäuresequenzdaten für dieses Enzym, ganz zu schweigen von irgendwelcher Nukleotidsequenzinformation, welche dieses codiert. Dieses Dokument schlägt auch vor, daß die Quelle für GL lediglich Algen sind.
- Yu et al. (Planta [1993] 191: 137-142) und WO 94/09122 berichten über ein GL aus der Rotalge Gracilariopsis lemaneiformis. Teilaminosäuresequenzen der Algenlyase mit einer Gesamtlänge von 100 Aminosäureresten wurden erhalten.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms α-1,4- Glucanlyase (GL), welches die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 enthält, bereitgestellt, bei dem man das Enzym aus einer pilzinfizierten Alge isoliert.
- Vorzugsweise wird das Enzym unter Verwendung eines Gels, das durch das Enzym nicht abgebaut wird, isoliert und/oder weiter gereinigt.
- Vorzugsweise basiert das Gel auf Dextrin, bevorzugt beta-Cyclodextrin, oder Derivaten davon, bevorzugt einem Cyclodextrin, besonders bevorzugt beta-Cyclodextrin.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein GL-Enzym bereitgestellt, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 enthält.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch eine Nukleotidsequenz bereitgestellt, welche das Enzym α-1,4-Glucanlyase codiert, wobei die Sequenz eine Sequenz enthält, die SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 ist und wobei sich die Sequenz vorzugsweise nicht in ihrer natürlichen Umgebung befindet (d. h. sie bildet nicht Teil des natürlichen Genoms eines zellulären Organismus, der das Enzym exprimiert).
- Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz eine DNA-Sequenz.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms α-1,4- Glucanlyase bereitgestellt, welches das Exprimieren der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfaßt.
- Vorzugsweise liegt die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in isolierter Form vor.
- Ein wesentlicher Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß GL aus einer pilzinfizierten Alge erhalten wird. Dies ist das erste Mal, daß die Aminosäuresequenz von GL zusätzlich zu der Bestimmung der Nukleinsäuresequenzen, welche GL codieren, bestimmt wurde. Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist daher, daß GL nun z. B. mittels rekombinanter DNA- Techniken in großen Mengen hergestellt werden kann und damit ermöglicht, Verbindungen, wie das Antibiotikum Microthecin, einfach und in größeren Mengen herzustellen.
- Das Enzym sollte vorzugsweise ausgeschieden werden, um seine Reinigung zu erleichtern. Um dies zu verwirklichen, wird die DNA, welche das reife Enzym codiert, mit einer Signalsequenz, einem Promotor und einem Terminator aus dem ausgewählten Wirt fusioniert.
- Für eine Expression in Aspergillus niger wird die gpdA-Promotor- und -Signalsequenz (aus dem Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenasegen von Aspergillus nidulans) mit dem 5'-Ende der DNA fusioniert, welche die reife Lyase codiert, wie SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4. Die Terminatorsequenz aus dem A. niger-trpC-Gen wird 3' des Gens angeordnet (Punt, P. J. et al. (1991): J. Biotech. 17, 19-34). Dieser Aufbau wird in einen Vektor eingesetzt, der einen Replikationsursprung und einen Selektionsursprung für E. coli und einen Selektionsmarker für A. niger enthält. Beispiele für Selektionsmarker für A. niger sind das amdS-Gen, das argB-Gen, das pyrG-Gen, das hygB-Gen und das BmIR-Gen, welche alle für eine Selektion von Transformanden verwendet wurden. Dieses Plasmid kann in A. niger transformiert und die reife Lyase aus dem Kulturmedium der Transformanden gewonnen werden.
- Der Aufbau kann in einen bezüglich Protease defizienten Stamm transformiert werden, um den proteolytischen Abbau der Lyase in dem Kulturmedium zu vermindern (Archer, D. B. et al. (1992): Biotechnol. Lett. 14, 357-362).
- Weitere Vorteile werden vor dem Hintergrund der nachfolgenden Beschreibung deutlich.
- Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Isolierung des Enzyms α-1,4-Glucanlyase aus einer pilzinfizierten Alge - vorzugsweise einer pilzinfizierten Rotalge, wie dem Typ, den man in China sammeln kann - wie Gracilariopsis lemaneiformis. Ein Beispiel einer pilzinfizierten Alge wurde gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt (siehe unten).
- Durch Verwendung von in situ Hybridisierungstechnik wurde es ermöglicht, daß das Enzym GL in der pilzinfizierten Rotalge Gracilariopsis lemaneiformis festgestellt wurde. Ein weiterer Nachweis, der diese Beobachtung stützt, wurde durch die Ergebnisse von Southern-Hybridisierungsexperimenten geliefert. Somit kann GL-Enzymaktivität eher aus pilzinfizierten Algen als nur aus den Algen erhalten werden, wie man es ursprünglich dachte.
- Von besonderem Interesse ist die Erkenntnis, daß es zwei natürliche DNA-Sequenzen gibt, von denen jede ein Enzym mit GL-Eigenschaften codiert. Diese DNA-Nukleinsäuresequenzen wurden sequenziert, und sie sind als SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 (welche später diskutiert werden und angegeben sind) gezeigt.
- Eine anfängliche Enzymreinigung kann nach dem Verfahren, wie es von Yu et al. (ebenda) beschrieben wird, durchgeführt werden. Jedoch ist es bevorzugt, wenn die anfängliche Enzymreinigung die Verwendung eines festen Trägers umfaßt, der sich bei der Reinigungsstufe nicht zersetzt. Dieser Gelträger hat den Vorteil, daß er mit Standardlaborproteinreinigungsausstattung kompatibel ist. Die Details dieses bevorzugten Reinigungsverfahrens werden später angegeben. Die Reinigung wird durch bekannte Standardtechniken für die Proteinreinigung abgeschlossen. Die Reinheit des Enzyms wurde unter Verwendung komplementärer Elektroforesetechniken festgestellt.
- Die gereinigte Lyase wurde hinsichtlich pl-Wert, Temperatur- und pH-Wert-Optima charakterisiert. In diesem Zusammenhang wurde herausgefunden, daß das Enzym die folgenden Eigenschaften besitzt: eine optimale Substratspezifität und ein pH-Wert-Optimum bei 3,5-7,5, wenn Amylopektin verwendet wird, und ein Temperaturoptimum bei 50ºC und einen pl-Wert von 3,9.
- Wie es oben erwähnt ist, wurden die Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung (zum Teil durch Aminosäuresequenzierungstechniken) bestimmt, und ihre Aminosäuresequenzen sind später angegeben. In ähnlicher Weise wurden die Nukleotidsequenzen, welche das Enzym der vorliegenden Erfindung (d. h. GL) codieren, sequenziert, und die DNA-Sequenzen werden später angegeben.
- Die folgenden Proben wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, Vereinigtes Königreich, AB2 1RY, am 20. Juni 1994 hinterlegt:
- E. coli, enthaltend das Plasmid pGL1 (NCIMB 40652) - [Ref. DHSalpha-pGL1] und
- E. coli, enthaltend das Plasmid pGL2 (NCIMB 40653) - [Ref. DHSalpha-pGL2].
- Die folgende Probe wurde als eine Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Dunstaffnage Marine Laboratory, Postfach 3, Oban, Argyll, Schottland, Vereinigtes Königreich, PA34 4AD, am 11. Oktober 1994 angenommen:
- Pilzinfizierte Gracilariopsis lemaneiformis (CCAP 1373/1) - [Ref. GLQ-1 (Qingdao)].
- Somit umfassen besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein GL- Enyzm, erhältlich aus der Expression der GL-codierenden Sequenzen, die in Plasmiden vorhanden sind, welche Gegenstand entweder der Hinterlegung NCIMB 40652 oder der Hinterlegung NCIMB 40653 sind, und ein GL-Enzym, erhältlich aus der pilzinfizierten Alge, die Gegenstand der Hinterlegung CCAP 1373/1 ist.
- Die vorliegende Erfindung wird nun nur beispielhaft beschrieben werden.
- In den nachfolgenden Beispielen wird auf die anhängenden Figuren Bezug genommen.
- Fig. 1 zeigt gefärbte pilzinfizierte Algen.
- Fig. 2 zeigt gefärbte pilzinfizierte Algen.
- Fig. 3 zeigt Schnitte von Pilzhyphen.
- Fig. 4 zeigt Schnitte von pilzinfizierten Algen.
- Fig. 5 zeigt einen Schnitt von pilzinfizierten Algen.
- Fig. 6 zeigt eine Plasmidkarte von pGL1.
- Fig. 7 zeigt eine Plasmidkarte von pGL2.
- Fig. 8 zeigt die Aminosäuresequenz, die als SEQ ID Nr. 3 angegeben ist, wobei die Positionen der Peptidfragmente, die sequenziert wurden, gezeigt sind.
- Fig. 9 zeigt die Ausrichtung von SEQ ID Nr. 1 an SEQ ID Nr. 2.
- Fig. 10 ist eine Mikrofotografie.
- Im Detail zeigt Fig. 1 Calcofluor-White-Färbungen, welche Pilze im oberen Teil und im unteren Teil von Gracilariopsis lemaneiformis offenbaren (108· und 294·).
- Fig. 2 zeigt eine PAS/Anilinblau-Schwarz-Färbung von Gracilariopsis lemaneiformis mit Pilzen. Die Pilze haben einen signifikant höheren Gehalt an Kohlenhydraten.
- Fig. 3 ist eine Mikrofotografie, welche in Längsrichtung verlaufende und abtragende Schnitte von zwei dünnwandigen Pilzhyphen (f), die zwischen dicken Wänden (w) von Algenzellen wachsen, zeigen. Man beachte Thylacoidmembrane im Algenchloroplast (Pfeile).
- Fig. 4 zeigt, daß die Antisense-Detektionen mit Klon 2-Sonde (obere Reihe) auf die Pilze beschränkt zu sein scheint, was durch Calcofluor-White-Färbung des nachfolgenden Schnittes (untere Reihe) verdeutlicht wird (46· und 108·).
- Fig. 5 zeigt, daß man deutliche Antisense-Detektionen mit Klon 2-Sonde bei den Pilzen in Gracilariopsis lemaneiformis findet (294·).
- Fig. 6 zeigt eine Karte des Plasmides pGL1 - welches ein p Bluescript II KS ist, der ein 3,8 kb- Fragment enthält, welches aus der genomischen Bibliothek isoliert wurde, die aus pilzinfiziertem Gracilariopsis lemaneiformis aufgebaut wurde. Das Fragment enthält ein Gen, welches alpha-1,4- Glucanlyase codiert.
- Fig. 7 zeigt eine Karte des Plasmides pGL2 - welches ein p Bluescript II SK ist, der ein 3,6 kb- Fragment enthält, welches aus einer genomischen Bibliothek isoliert wurde, die aus pilzinfiziertem Gracilariopsis lemaneiformis aufgebaut wurde. Das Fragment enthält ein Gen, welches alpha-1,4- Glucanlyase codiert.
- Fig. 9 zeigt die Ausrichtung von SEQ ID Nr. 1 (GL1) an SEQ ID Nr. 2 (GL2). Die Gesamtzahl an Resten von GL1 ist 1088, und die Gesamtzahl an Resten von GL2 ist 1091. Bei der Durchführung des Vergleichs wurde eine strukturgenetische Matrix verwendet (Open gap cost: 10; Unit gap cost: 2). In Fig. 9 ist ":" das Zeichen, welches angibt, daß zwei ausgerichtete Reste identisch sind, und "." das Zeichen, welches angibt, daß zwei Reste ähnlich sind. Aminosäuren, die als "ähnlich" bezeichnet werden, sind: A, S, T; D, E; N, Q; R, K; I, L, M; F, Y, W. Insgesamt liegt eine Identität von 845 Aminosäuren vor (d. h. 77,67%) und eine Ähnlichkeit von 60 Aminosäuren (5,51%). Die Anzahl an Lücken, die in GL1 eingesetzt sind, ist 3, und die Anzahl an Lücken, die in GL2 eingesetzt sind, ist 2.
- Fig. 10 ist eine Mikrofotografie einer Pilzhyphe (f), welche zwischen den Algenwänden (w) wächst. Man beachte Körner von Florideen-Stärke (s) und Thylacoide (Pfeile) in der Algenzelle.
- Die nachfolgende Sequenzinformation wurde dazu verwendet, Primer für die PCR-Reaktionen, welche nachfolgend erwähnt werden, zu generieren und die Aminosäuresequenz, welche durch die entsprechenden Nukleotidsequenzen erzeugt wurde, zu überprüfen. Aminosäuresequenz, zusammengestellt von Peptiden aus pilzinfizierter Gracilariopsis lemaneiformis Die Aminosäuresequenz (27-34), welche zur Generierung der Primer A und B verwendet wurde (Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val) Primer A Primer B Die Aminosäuresequenz (45-50), die zur Generierung von Primer C verwendet wurde (Gly Gly His Asp Gly Tyr) Primer C
- [Die Sequenz entspricht dem komplementären Strang.] Die Aminosäuresequenz (74-79), die zur Generierung von Primer E verwendet wurde (Gln Trp Tvr Lys Phe Gly) Primer E
- [Die Sequenz entspricht dem komplementären Strang.] Die Aminosäuresequenz (1-6), die zur Generierung der Primer F1 und F2 verwendet wurde (Tyr Arg Trp Gln Glu Val) Primer F1 Primer F2 Die aus der ersten PCR-Vervielfältigung erhaltene Sequenz (Klon 1) Die aus der zweiten PCR-Vervielfältigung erhaltene Sequenz (Klon 1) Die aus der dritten PCR-Vervielfältigung erhaltene Seauenz (Klon 2)
- Schnitte von Gracilariopsis lemaneiformis, welche in China gesammelt wurde, wurden entweder von Hand oder von in Paraffin eingebettetem Material geschnitten. Das geschnittene Material wurde vorsichtig durch Lichtmikroskopie untersucht. Pilzhyphen wurden in Gracilariopsis lemaneiformis deutlich festgestellt.
- Die Thalli der Gracilariopsis lemaneiformis sind aus Zellen zusammengesetzt, die in einer hochgradig geordneten und fast symmetrischen Art und Weise erscheinen. Der röhrenförmige Thallus von G. lemaneiformis besteht aus großen, farblosen zentralen Zellen, die von länglichen, schlanken, elliptischen Zellen und kleinen, runden, rot pigmentierten peripheren Zellen umgeben sind. Alle Algenzelltypen sind durch dicke Zellwände gekennzeichnet. Die meisten der Pilzhyphen findet man an der Zwischenphase zwischen der zentralen Lage aus großen Zellen und der peripheren Lage. Diese Zellen können deutlich von den Algenzellen unterschieden werden, da sie lang und zylindrisch sind. Das Wachstum der Hyphen beobachtet man als Unregelmäßigkeiten zwischen den hochgradig geordneten Algenzellen. Die häufigste Orientierung der Hyphe ist entlang der Hauptachse des Algenthallus. In einigen Fällen stellt man Seitenäste in Richtung der Mitte und der Peripherie fest. Die Hyphe kann nicht mit der endo-/epiphytischen zweiten Generation der Algen verwechselt werden.
- Calcofluor-White färbt bekanntermaßen Chitin und zellulosehaltiges Gewebe. Die Reaktion mit Chitin erfordert vier kovalent gebundene terminale n-Acetylglucosaminreste. Es ist allgemein anerkannt, daß Zellulose fast nur auf höhere Pflanzen beschränkt ist, obwohl sie in geringen Mengen in einigen Algen vorkommen kann. Es ist weiterhin bekannt, daß in Gracilaria Chitin nicht vorhanden ist.
- Es wurde herausgefunden, daß Calcofluor-White Domänen färbt, die Pilzhyphenzellwänden in geschnittenem Gracilariopsis lemaneiformis-Material entsprechen.
- Die Hyphe erscheint klarweiß gegen einen schwachblauen Hintergrund von Gracilaria-Gewebe, wenn man sie unter UV-Licht betrachtet - siehe Fig. 1. Chitin ist der Hauptzellwandbestandteil in den meisten Pilzen, fehlt aber in Gracilaria. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen schließen wir, daß die untersuchte Alge von einem Pilz infiziert ist. Von 40% der unteren Teile der untersuchten Gracilariopsis lemaneiformis-Schnitte wurde gefunden, daß sie mit Pilzhyphen infiziert sind. Es wurde gefunden, daß in den Algenspitzen 25% der untersuchten Gracilariopsis lemaneiformis-Schnitte infiziert sind.
- Färbung von geschnittener Gracilariopsis lemaneiformis mit Periodsäure/Schiff (PAS) und Anilinblau-Schwarz offenbarte einen signifikant höheren Gehalt an Kohlenhydraten innerhalb der Pilzzellen, verglichen mit den Algenzellen - siehe Fig. 2. Safranin O und Malachitgrün zeigten die gleiche Farbreaktion von Pilzzellen, wie man sie in höheren Pflanzen, die mit Pilzen infiziert sind, findet.
- Eine Acridinorange-Reaktion mit geschnittener Gracilariopsis lemaneiformis zeigte deutlich das unregelmäßige Wachstum des Pilzes.
- Objektträger mit 15 um dicken Schnitten, wo der Pilz mit Calcofluor-White detektiert worden war, wurden in 2% OsO&sub4; fixiert, in Wasser gewaschen und in Dimethoxypropan und absolutem Alkohol dehydratisiert. Ein Tropfen eines 1 : 1-Gemisches von Aceton und Spurr-Harz wurden über jeden Schnitt auf dem Glasobjektträger gegeben und nach einer Stunde durch einen Tropfen aus reinem Harz ersetzt. Eine gelatineeinbettende Kapsel, die mit Harz gefüllt war, wurde mit der Vorderseite nach unten über dem Schnitt plaziert und über Nacht bei 4ºC belassen. Nach der Polymerisation bei 55ºC für 8 h konnten die dicken Schnitte, die an den Harzblöcken hafteten, durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff von dem Objektträger getrennt werden.
- Blöcke wurden zurechtgeschnitten, und 100 nm dicke Schnitte wurden unter Verwendung eines Diamantmessers auf einem Mikrotom geschnitten. Die Schnitte wurden in wäßrigem Uranylacetat und in Bleicitrat gefärbt. Die Schnitte wurden unter einem Elektronenmikroskop bei 80 kV untersucht.
- Die Untersuchung bestätigte die lichtmikroskopischen Beobachtungen und lieferte weiteren Beweis, daß der lyaseproduzierende, chinesische Stamm von G. lemaneiformis mit einem Pilzparasiten oder -symbionten infiziert ist.
- Pilzhyphen sind aus röhrenförmigen Zellen von 50-100 um Länge und nur wenigen Mikrometern im Durchmesser aufgebaut. Die Zellen sind in Reihe angeordnet mit Scheidewänden zwischen den benachbarten Zellen. Man sieht auch gelegentliche Verzweigungen. Die Hyphen wachsen zwischen den dicken Zellwänden von Algenthallus, ohne in die Wand einzudringen oder die Zelle zu beschädigen. Es ist bekannt, daß solch ein symbiotischer Zusammenschluß, den man Mycophycobiose nennt, zwischen einigen filamentösen Meerespilzen und großen Meeresalgen stattfindet (Dank und Bruning, 1992 - Ökologie von Wasserpilzen in und auf Algen, in Reisser, W. (ed.): Algae and Symbiosis: Plants, Animals, Fungi, Viruses, Interactions Explored; Biopress Ltd., Bristol).
- Bei Untersuchung der Mikrofotografie in Fig. 10 kann man mehrere Unterschiede zwischen Algen- und Pilzzellen feststellen. Im Gegensatz zu den mehrere Mikrometer dicken Wänden der Alge, sind die Pilzwände nur 100-200 nm dick. Pflanzentypische Organellen, wie Chloroplasten, mit Thylacoidmembranen sowie Florideenstärkekörner kann man in Algenzellen sehen, aber nicht in dem Pilz.
- Interzelluläre Verbindungen von Rotalgen sind durch spezifische Strukturen gekennzeichnet, die als Tüpfelpropfen oder Tüpfelverbindungen bezeichnet werden. Die Strukturen sind hervortretende, elektronendichte Kerne, und sie sind wichtige Merkmale in der Algentaxonomie (Pueschel, C. M.: An expanded survey of the ultrastructure of red algal pit plugs, J. Phycol. 25, 625 (1989)). In unserem Material wurden solche Verbindungen häufig in dem Algenthallus beobachtet, aber niemals zwischen den Zellen des Pilzes.
- In situ-Hybridisierungstechnik basiert auf dem Prinzip der Hybridisierung einer Antisense- Ribonukleotidsequenz mit der mRNA. Die Technik wird dazu verwendet, Bereiche in mikroskopischen Schnitten sichtbar zu machen, wo die mRNA vorhanden ist. In diesem speziellen Fall wird die Technik dazu verwendet, das Enzym α-1,4-Glucanlyase in Schnitten von Gracilariopsis lemaneiformis zu lokalisieren.
- Ein 238 Basenpaare langes PCR-Fragment aus einer dritten PCR-Vervielfältigung - bezeichnet als Klon 2 (siehe oben) - wurde in den Vektor pGEM-3Zf(+) (Promega) kloniert. Die Transkription der Antisense-RNA wurde durch den SP6-Promotor und diejenige der Sense-RNA durch den T7- Promotor gesteuert. Das Ribonuklease-Schutz-Assaykit (Ambion) wurde mit den nachfolgenden Modifikationen verwendet. Die Transkripte wurden auf einem 6%-igen Sequenzgel laufen gelassen, um die nicht inkorporierten Nukleotide zu entfernen, und mit dem Elutionspuffer eluiert, der mit dem T7-RNA-Polymerase in vitro-Transkriptionskit (Ambion) geliefert wurde. Das Antisense-Transkript enthielt 23 nicht codierende Nukleotide, wogegen das Sense-Transkript 39 enthielt. Zur Hybridisierung wurden 10&sup7; cpm/ml der ³&sup5;S-markierten Sonde verwendet.
- In situ-Hybridisierung wurde im wesentlichen durchgeführt, wie es von Langedale et al. (1988) beschrieben wird. Es wurde herausgefunden, daß die Hybridisierungstemperatur bei 45ºC optimal ist. Nach dem Waschen bei 45ºC wurden die Schnitte mit fotografischer Emulsion Kodak K-5 bedeckt und für 3 Tage bei 5ºC in der Dunkelheit belassen (Ref.: Langedale, J. A, Rothermel, B. A. und Nelson, T. (1988), Genes and development 2: 106-115, Cold Spring Harbor Laboratory).
- Die in situ-Hybridisierungsexperimente mit Ribosonden gegen die mRNA von α-1,4-Glucanlyase zeigen starke Hybridisierungen über und um die Hyphe des in Gracilariopsis lemaneiformis festgestellten Pilzes - siehe Fig. 4 und 5. Dies wird als ein starkes Anzeichen dafür angesehen, daß die α-1,4-Glucanlyase produziert wird. Schwache zufällige Hintergrundreaktionen wurden in dem Algengewebe beider Gracilariopsis lemaneiformis festgestellt. Diese Reaktion wurde sowohl mit den Sense- als auch den Antisense-Sonden beobachtet. Intensive Färbung über der Pilzhyphe wurde nur mit Antisense-Sonden erhalten.
- Diese Ergebnisse wurden unter Standardhybridisierungsbedingungen bei 45ºC in den Hybridisierungs- und Waschschritten erhalten. Bei 50ºC wurde keine Färbung über den Pilzen beobachtet, wogegen die Hintergrundfärbung die gleiche blieb. Eine Anhebung der Temperatur auf 55ºC reduzierte die Hintergrundfärbung sowohl mit Sense- als auch Antisense-Sonden erheblich und in gleichem Maße.
- Auf der Grundlage der zytologischen Untersuchungen unter Verwendung komplementärer Färbeverfahren wird geschlußfolgert, daß Gracilariopsis lemaneiformis pilzinfiziert ist. Die Infektionen sind in den unteren Teilen des Algengewebes am stärksten ausgeprägt.
- In geschnittenem Gracilariopsis lemaneiformis-Material zeigen in situ-Hybridisierungsergebnisse deutlich, daß Hybridisierung auf Bereiche beschränkt ist, wo man Pilzinfektionen findet - siehe Fig. 4. Die Ergebnisse zeigen, daß α-1,4-Glucanlyase-mRNA auf pilzinfizierte Bereiche in Gracilariopsis lemaneiformis beschränkt zu sein scheint.
- Auf der Grundlage dieser Beobachtungen schließen wir, daß α-1,4-Glucanlyase-Aktivität in pilzinfizierter Gracilariopsis lemaneiformis festgestellt wird.
- Reinigung von α-1,4-Glucanlyase aus pilzinfiziertem Gracilariopsis lemaneiformis-Material wurde wie folgt durchgeführt.
- Die Algen wurden durch Filtration geerntet und mit 0,9% NaCl gewaschen. Die Zellen wurden durch Homogenisierung, gefolgt von Sonifizierung auf Eis für 6 · 3 min in 50 mM Citrat-NaOH, pH 6,2 (Puffer A), aufgebrochen. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 25.000 · g für 40 min entfernt. Der bei diesem Verfahren erhaltene Überstand wurde als zellfreier Extrakt angesehen und zur Aktivitätsfärbung und zum Western-Blotten nach Auftrennung auf 8-25%-igen Gradientengelen verwendet.
- Der zellfreie Extrakt wurde direkt auf eine β-Cyclodextrin-Sepharose-Gel-4B-Säule (2,6 · 18 cm), die mit Puffer A vorequilibriert war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 3 Volumen Puffer A und 2 Volumen Puffer A, der 1 M NaCl enthielt, gewaschen. α-1,4-Glucanlyase wurde mit 2% Dextrinen in Puffer A eluiert. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und der Puffer auf 20 mM bis-tris-Propan-HCl (pH 7,0, Puffer B) gewechselt.
- Aktive Fraktionen wurden auf eine Mono-Q-HR-5/5-Säule, die mit Puffer B vorequilibriert war, aufgetragen. Die Pilzlyase wurde mit Puffer B in einem linearen Gradienten von 0,3 M NaCl eluiert.
- Die nach der β-Cyclodextrin-Sepharose-Chromatographie erhaltene Lyasepräparation wurde alternativ auf 150 ul konzentriert und auf eine Superose 12-Säule aufgetragen, die unter FPLC- Bedingungen betrieben wurde.
- Das Reaktionsgemisch für den Test der α-1,4-Glucanlyase-Aktivität enthielt 10 mg/ml Amylopektin und 25 mM Mes-NaOH (pH 6,0). Die Reaktion wurde bei 30ºC für 30 min durchgeführt und durch die Zugabe von 3,5-Dinitrosalicylsäure-Reagens gestoppt. Nach Stehen bei Raumtemperatur für 10 min wurde die optische Dichte bei 550 nm gemessen.
- Die Lyasen wurden entweder mit Endoproteinase Arg-C aus Clostridium histolyticum oder mit Endoproteinase Lys-C aus Lysobacter enzymogenes, beide von Sequenzierungsqualität und bezogen von Boehringer Mannheim, Deutschland, verdaut. Für den Verdau mit Endoproteinase Arg-C wurde gefriergetrocknete Lyase (0,1 mg) in 50 ul 10 M Harnstoff, 50 mM Methylamin, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6, gelöst. Nach Überschichtung mit N&sub2; und Zugabe von 10 ul 50 mM DTT und 5 mM EDTA wurde das Protein für 10 min bei 50ºC unter N&sub2; denaturiert und reduziert. Anschließend wurde 1 ug Endoproteinase Arg-C in 10 ul 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, hinzugegeben, N&sub2; wurde überschichtet, und der Verdau wurde für 6 h bei 37ºC durchgeführt. Für eine anschließende Cysteinderivatisierung wurden 12,5 ul 100 mM Iodacetamid hinzugefügt, und die Lösung wurde für 15 min bei Raumtemperatur in der Dunkelheit unter N&sub2; inkubiert.
- Für den Verdau mit Endoproteinase Lys-C wurde gefriergetrocknete Lyase (0,1 mg) in 50 ul 8 M Harnstoff, 0,4 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 8,4, gelöst. Nach Überschichtung mit N&sub2; und Zugabe von 5 ul 45 mM DTT wurde das Protein für 15 min bei 50ºC unter N&sub2; denaturiert und reduziert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 5 ul 100 mM Iodacetamid zur Derivatisierung der Cysteine für 15 min bei Raumtemperatur in der Dunkelheit unter N&sub2; hinzugefügt.
- Anschließend wurden 90 ul Wasser und 5 ug Endoproteinase Lys-C in 50 ul 50 mM Tricin und 10 mM EDTA, pH 8,0, hinzugefügt, und der Verdau wurde für 24 h bei 37ºC unter N&sub2; durchgeführt.
- Die erhaltenen Peptide wurden mittels Umkehrphasen-HPLC auf einer VYDAC C18-Säule (0,46 · 15 cm; 10 um; The Separations Group, Kalifornien) aufgetrennt, wobei Lösungsmittel A: 0,1% TFA in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1% TFA in Acetonitril verwendet wurden. Ausgewählte Peptide wurden erneuter Chromatographie auf einer Develosil C18-Säule (0,46 · 10 cm; 3 um; Dr. Ole Schou, Novo Nordisk, Dänemark) unterzogen, wobei das gleiche Lösungsmittelsystem verwendet wurde, vor einer Sequenzierung auf einem Applied Biosystems 476A-Sequenzierer und unter Anwendung von schnellen Zyklen mit gepulster Flüssigkeit.
- Die Aminosäuresequenzinformation des Enzyms, das aus pilzinfizierter Gracilariopsis lemaneiformis erhalten wurde, ist nachfolgend gezeigt, speziell SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2.
- Anzahl der Reste: 1088.
- Aminosäurezusammensetzung (einschließlich der Signalsequenz)
- Anzahl der Reste: 1091.
- Aminosäurezusammensetzung (einschließlich der Signalsequenz)
- Untersuchungen zeigten, daß die N-terminale Sequenz von nativer Glucanlyase 1 blockiert war. Aufhebung der Blockierung wurde erreicht durch Behandeln von Glucanlyase 1, die mit wasserfreier TFA für 30 min bei 40ºC auf eine PVDF-Membran geblottet war, im wesentlichen wie es von Le- Gendre et al. (1993) [Purification of Proteins and Peptides by SDS-PAGE; Matsudeira, P. (Ed.) A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing, 2. Aufl.; Academic Press Inc., San Diego, S. 74-101] beschrieben wird. Die erhaltene Sequenz war TALSDKQTA, welche mit der Sequenz übereinstimmt (Sequenzpositionen 51-59 von SEQ ID Nr. 1), die von dem Klon für Glucanlyase 1 erhalten wurde, und zeigt N-Acetylthreonin als N-terminalen Rest von Glucanlyase 1. Die Sequenzpositionen 1 bis 50 von SEQ ID Nr. 1 repräsentieren eine Signalsequenz.
- DNA wurde isoliert, wie es von Saunders (1993) beschrieben wird, mit der folgenden Modifikation: Die Polysaccharide wurden durch ELUTIP-d-Reinigung (Schleicher & Schuell) anstelle von Gelreinigung von der DNA entfernt. (Ref.: Saunders, G. W. (1993); Gel purification of red algal genomic DNA: An inexpensive and rapid method for the isolation of PCR-friendly DNA; Journal of Phycology 29(2): 251-254, und Schleicher & Schuell: ELUTIP-d; Rapid Method for Purification and Concentration of DNA).
- Die Präparation des relevanten DNA-Moleküls wurde unter Verwendung des Gene Amp-DNA- Vervielfältigungskits (Perkin Eimer Cetus, USA) und gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt mit der Ausnahme, daß die Taq-Polymerase später hinzugegeben wurde (siehe PCR- Zyklen) und die Temperaturzyklen wie folgt verändert wurden: PCR-Zyklen:
- PCR-Fragmente wurden in pT7Blue (von Novagen) gemäß den Anleitungen des Lieferanten kloniert.
- Doppelstrangige DNA wurde im wesentlichen nach der Didesoxy-Methode von Sanger et al. (1979) sequenziert, wobei das Auto Read-Sequenzierungskit (Pharmacia) und der Pharmacia LKB A. L. F: DNA-Sequenzierer verwendet wurden (Ref.: Sanger, F., Nicklen, S. und Coulson, A. R. (1979), DNA sequencing with chain-determinating inhibitors; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467).
- Die Sequenzen sind als SEQ ID Nr. 3 und 4 gezeigt, worin
- Gesamtzahl der Basen: 3367.
- DNA-Sequenzzusammensetzung: 850 A; 761 C; 871 G; 785 T
- Gesamtzahl der Basen: 3276.
- DNA-Sequenzzusammensetzung: 889 A; 702 C; 856 G; 829 T
- Durchmusterung der von Stratagene erhaltenen Lambda Zap-Bibliothek wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt mit der Ausnahme, daß die Vorhybridisierung und die Hybridisierung in 2 · SSC, 0,1% SDS, 10 · Denhardts und 100 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA durchgeführt wurde. Zu der Hybridisierungslösung wurde eine ³²P-markierte, denaturierte Sonde hinzugegeben. Hybridisierung wurde über Nacht bei 55ºC durchgeführt. Die Filter wurden zweimal in 2 · SSC, 0,1% SDS und zweimal in 1 · SSC, 0,1% SDS gewaschen.
- Die klonierten PCR-Fragmente wurden aus dem pT7Blue-Vektor durch Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen isoliert. Die Fragmente wurden durch Agarosegelelektroforese von dem Vektor getrennt, und die Fragmente wurden mittels Agarase (Boehringer Mannheim) von der Agarose gereinigt. Da die Fragmente nur 90-240 bp lang waren, wurden die isolierten Fragmente einer Ligationsreaktion ausgesetzt, bevor sie mit ³²P-dCTP markiert wurden, wobei entweder ein Prime-It Random Primer-Kit (Stratagene) oder ein Ready to Go DNA-Markierungskit (Pharmacia) verwendet wurde.
- Die Aminosäuresequenzen der drei überlappenden tryptischen Peptide von α-1,4-Glucanlyase wurden dazu verwendet, gemischte Oligonukleotide zu generieren, welche als PCR-Primer verwendet werden könnten (siehe die oben angegebenen Sequenzen).
- Bei der ersten PCR-Vervielfältigung wurden die Primer A/B (siehe oben) als stromaufwärts liegende Primer und Primer C (siehe oben) als stromabwärts liegender Primer verwendet. Die Größe des erwarteten PCR-Produktes betrug 71 Basenpaare.
- In der zweiten PCR-Vervielfältigung wurden Primer A/B als stromaufwärts liegende Primer und E als stromabwärts liegender Primer verwendet. Die Größe des erwarteten PCR-Produktes betrug 161 Basenpaare.
- In der dritten PCR-Vervielfältigung wurden die Primer F1 (siehe oben) und F2 (siehe oben) als stromaufwärts liegende Primer und E als stromabwärts liegender Primer verwendet. Die Größe des erwarteten PCR-Produktes betrug 238 Basenpaare. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2%-igen LMT-Agarosegel analysiert, und Fragmente der erwarteten Größen wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit Agarase (Boehringer Mannheim) behandelt und in den pT7Blue-Vektor (Novagen) kloniert und sequenziert.
- Die klonierten Fragmente aus der ersten und zweiten PCR-Vervielfältigung codierten Aminosäuren, die den sequenzierten Peptiden (siehe oben) entsprachen. Der Klon aus der dritten Vervielfältigung (siehe oben) war nur etwa 87% homolog zu den sequenzierten Peptiden.
- Durchmusterung der Bibliothek mit den oben genannten Klonen lieferte zwei Klone. Ein Klon enthielt die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 4 (Gen 2). Der andere Klon enthielt etwas der Sequenz von SEQ ID Nr. 3 (von Basenpaar 1065 abwärts) (Gen 1).
- Das 5'-Ende von SEQ ID Nr. 3 (d. h. von Basenpaar 1064 aufwärts) wurde durch das RACE- Verfahren (rapid amplification of cDNA ends; schnelle Vervielfältigung von cDNA-Enden) (Michael, A. F., Michael, K. D. & Martin, G. R. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002) unter Verwendung des 5'-RACE-Systems von Gibco BRL erhalten. Gesamt-RNA wurde gemäß Collinge et al. (Collinge, D. B., Milligan, D. E., Dow, J. M., Scofield, G. & Daniels, M. J. (1987), Plant Mol Biol 8: 405- 414) isoliert. Die 5'-RACE wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt, wobei 1 ug Gesamt-RNA verwendet wurde. Das PCR-Produkt aus der zweiten Vervielfältigung wurde in den pT7Blue-Vektor von Novagen nach dem Protokoll des Herstellers kloniert. Drei unabhängige PCR- Klone wurden sequenziert, um PCR-Fehler zu kompensieren.
- Eine zusätzliche PCR wurde durchgeführt, um den gerade beschriebenen Klon mit XbaI- und NdeI- Restriktionsstellen unmittelbar vor dem ATG-Startcodon zu ergänzen, wobei das nachfolgende Oligonukleotid als ein stromaufwärts liegender Primer verwendet wurde:
- und ein Primer, der die komplementäre Sequenz der Basenpaare 1573-1593 in der Sequenz GL1 (d. h. SEQ ID Nr. 3) enthielt, wurde als ein stromabwärts liegender Primer verwendet.
- Die vollständige Sequenz für Gen 1 (d. h. SEQ ID Nr. 3) wurde durch Klonieren des 3'-Endes des Gens als ein BamHI-HindIII-Fragment aus dem genomischen Klon in den pBluescript II KS+-Vektor von Stratagene und zusätzliches Klonieren des durch PCR hergestellten 5'-Endes des Gens als ein XbaI-BamHI-Fragment vor das 3'-Ende erzeugt.
- Gen 2 wurde als ein stumpfendiges Hindlll-Fragment in die EcoRV-Stelle von pBluescript SK+- Vektor von Stratagene kloniert. Ein Teil der 3'-untranslatierten Sequenz wurde durch einen SacI- Verdau, gefolgt von erneuter Ligation, entfernt. HindIII- und HpaI-Restriktionsstellen wurden unmittelbar vor den Start ATG durch Verdau mit HindIII und NarI und erneute Ligation in der Gegenwart der folgenden annealten Oligonukleotide eingeführt:
- In den sequenzierten Klonen wurden keine Introns gefunden.
- Der Klon 1-Typ (SEQ ID Nr. 3) kann an allen zehn Peptidsequenzen ausgerichtet werden (siehe Fig. 8) und zeigt 100% Identität. Ausrichtung der zwei Proteinsequenzen, die von den Genen codiert werden, die aus den pilzinfizierten Algen Gracilariopsis lemaneiformis isoliert wurden, zeigt etwa 78% Identität, was bedeutet, daß beide Gene α-1,4-Glucanlyase codieren.
- Die DNA-Sequenz, welche die GL codiert, wurde in Mikroorganismen eingebracht, um ein Enzym mit hoher spezifischer Aktivität und in großen Mengen zu produzieren.
- In diesem Zusammenhang wurde Gen 1 (d. h. SEQ ID Nr. 3) als ein stumpfendiges NotI-HindIII- Fragment (unter Verwendung des Kits zum Abstumpfen von DNA von Amersham International) in den Pichia-Expressionsvektor pHIL-D2 (der den AOX1-Promotor enthält), welcher mit EcoRI verdaut und stumpfendig gemacht wurde (unter Verwendung des Kits zum Abstumpfen von DNA von Amersham International), zur Expression in Pichia pastoris (gemäß dem Protokoll in dem Pichia- Expressionskit, das von Invitrogen geliefert wird) kloniert.
- In einer anderen Ausführungsform wurde das Gen 1 (d. h. SEQ ID Nr. 3) als ein stumpfendiges NotI- HindIII-Fragment (unter Verwendung des Kits zum Abstumpfen von DNA von Amersham International) in den Aspergillus-Expressionsvektor pBARMTE1 (der den Methyltryptophanresistenzpromotor aus Neuropera crassa enthält), welcher mit Smal verdaut war, für eine Expression in Aspergillus niger (Pall et al. (1993), Fungal Genet. Newslett., Band 40, S. 59-62) kloniert. Die Protoplasten wurden gemäß Daboussi et al. (Curr. Genet. (1989), Band 15, S. 453-456) unter Verwendung des lysierenden Enzyms Sigma L-2773 und der Lyticase Sigma L-8012 hergestellt. Die Transformation der Protoplasten erfolgte nach dem Protokoll, das bei Buxton et al. (Gene (1985), Band 37, S. 207-214) angegeben ist, mit der Ausnahme, daß für das Plattieren der transformierten Protoplasten dem bei Punt et al. (Methods in Enzymology (1992), Band 216, S. 447-457) angegebenen Protokoll gefolgt wurde, jedoch unter Verwendung von 0,6% osmotisch stabilisierter Top-Agarose.
- Die Ergebnisse zeigten, daß in den transformierten Pichia pastoris und Aspergillus niger Lyaseaktivität beobachtet wurde.
- Herstellung von zellfreien Extrakten.
- Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 9.000 U.p.M. für 5 min geerntet und mit 0,9% NaCl gewaschen und in dem Aufbrechpuffer resuspendiert (50 mM K-Phosphat, pH 7,5, welcher 1 mM ED- TA und 5% Glycerin enthielt). Die Zellen wurden unter Verwendung von Glasperlen und Vortex- Behandlung aufgebrochen. Der Aufbrechpuffer enthielt 1 mM PMSF (Proteaseinhibitor). Der Lyaseextrakt (Überstand) wurde nach Zentrifugation bei 9.000 U.p.M. für 5 min. gefolgt von einer Zentrifugation bei 20.000 · g für 5 min. erhalten.
- Ein Volumen Lyaseextrakt wurde mit einem gleichen Volumen 4%-iger Amylopektinlösung gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend bei einer kontrollierten Temperatur inkubiert, und Proben wurden in bestimmten Intervallen entnommen und auf AF analysiert.
- Die Lyaseaktivität wurde auch unter Anwendung eines radioaktiven Verfahrens analysiert.
- Das Reaktionsgemisch enthielt 10 ul ¹&sup4;C-Stärkelösung (1 uCi; Sigma Chemicals Co.) und 10 ul des Lyaseextraktes. Das Reaktionsgemisch wurde bei 25ºC über Nacht belassen und wurde anschließend in dem üblichen TLC-System analysiert. Die produzierte radioaktive AF wurde unter Verwendung eines Instant Imagers (Pachard Instrument Co., Inc., Meriden, CT) detektiert.
- SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 8-25% Gradientengelen und dem PhastSystem (Pharmacia) durchgeführt. Western-Blots wurden ebenfalls auf einer Semidry-Transfereinheit des PhastSystem laufengelassen.
- Primäre Antikörper, die gegen die Lyase gerichtet waren, welche aus dem bei Qingdao (China) gesammelten roten Seegras gereinigt worden war, wurden in einer Verdünnung von 1 : 100 eingesetzt. Schwein-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Dako A/S, Glostrup, Dänemark) wurden als sekundäre Antikörper und in einer Verdünnung von 1 : 1000 verwendet.
- 1. Lyaseaktivität wurde 5 Tage nach einer Induktion (gemäß der Anleitung) bestimmt und bestätigte, daß die Aktivität für alle Proben in der B-Reihe intrazellulär war.
- * Die spezifische Aktivität ist definiert als Nanomol AF, freigesetzt pro Minute und pro mg Protein in einem Reaktionsgemisch, das 2% (w/v) Glycogen, 1% (w/v) Glycerin in 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) enthält. Die Reaktionstemperatur betrug 45ºC, und die Reaktionszeit war 60 min.
- Ein zeitlicher Verlauf der Probe B27 ist nachfolgend angegeben. Die Daten sind auch in Fig. 1 gezeigt.
- Die Testbedingungen waren wie oben mit der Ausnahme, daß die Zeit variiert wurde.
- 2. Western-Blot-Analyse
- Die CFE sämtlicher Proben zeigte Banden mit einem Molekulargewicht, welches der nativen Lyase entsprach.
- MC-Lyase, intrazellulär exprimiert in Pichia pastoris
- Name der Kultur Spezifische Aktivität*
- A18 10
- A20 32
- A21 8
- A22 8
- A24 6
- I. Lyaseaktivität wurde nach 5 Tagen Inkubation in Minimalmedium, welches 0,2% enzymatisches Hydrolysat von Casein enthielt, und Analyse mit dem alkalischen 3,5-Dinitrosalicylsäure- Reagens bestimmt.
- Unter 35 Kulturen, die mit 0,2% Amylopektin in dem Kulturmedium gezüchtet waren, war AF nur in zwei Kulturen feststellbar. Das Kulturmedium von 5.4+ und 5.9+ enthielt 0,13 g AF/Liter bzw. 0,44 g/Liter. Die Ergebnisse zeigten, daß aktive Lyase von den Zellen ausgeschieden worden war. Lyaseaktivität war auch in dem zellfreien Extrakt meßbar. 2) Lyaseaktivitätsanalyse in zellfreien Extrakten
- * Die spezifische Aktivität war definiert als Nanomol AF, produziert pro Minute und pro mg Protein bei 25ºC. "+" bedeutet, daß 0,2% Amylopektin hinzugegeben worden waren.
- Die Ergebnisse zeigen, daß Gen 1 von GL in A. niger intrazellulär exprimiert wurde.
- Experimente mit transformierten E. coli (unter Verwendung der Klonierungsvektoren pQE30 aus dem Qia-Expreß-Vektorkit von Qiagen) zeigten Expression von Enzym, das von Antikörper gegen das Enzym, das aus pilzinfizierter Gracilariopsis lemaneiformis gereinigt worden war, erkannt wurde.
- Anstelle von Aspergillus niger als Wirt könnten andere industriell wichtige Mikroorganismen, für welche gute Expressionssysteme bekannt sind, verwendet werden, wie: Aspergillus oryzae, Aspergillus sp., Trichoderma sp. Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichle sp., Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus sp., Streptomyces sp. oder E, coli.
- Andere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen jede der nachfolgenden: einen transformierten Wirtsorganismus mit der Fähigkeit, AF infolge der Einbringung einer DNA-Sequenz, wie sie hierin beschrieben ist, zu produzieren; solch einen transformierten Wirtsorganismus, welcher ein Mikroorganismus ist, wobei vorzugsweise der Wirtsorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien, Schimmelpilzen, Pilzen und Hefe besteht; vorzugsweise ist der Wirtsorganismus aus der Gruppe ausgewählt, die aus Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Trichoderma, Hansenula, Pichia, Bacillus Streptomyces, Escherichia, wie Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Escherichia coli, besteht; ein Verfahren zur Herstellung des Zuckers 1,5-D-Anhydrofructose, bei dem man ein Alpha- 1,4-Glucan (z. B. Stärke) mit dem Enzym α-1,4-Glucanlyase, das von einem transformierten Wirtsorganismus exprimiert wird, der eine dieselbe codierende Nukleotidsequenz enthält, in Kontakt bringt, wobei die Nukleotidsequenz vorzugsweise eine DNA-Sequenz ist und wobei die DNA-Sequenz vorzugsweise eine der hierin beschriebenen Sequenzen ist; ein Vektor, der eine Nukleotidsequenz, wie sie hierin zuvor beschrieben ist, enthält, wobei der Vektor vorzugsweise ein Replikationsvektor ist und wobei der Vektor vorzugsweise ein Expressionsvektor ist, der die Nukleotidsequenz stromabwärts von einer Promotorsequenz enthält, und der Vektor vorzugsweise einen Marker (wie einen Resistenzmarker) enthält; einen zellulären Organismus oder eine Zellinie, der bzw. die mit solch einem Vektor transformiert ist; ein Verfahren zur Herstellung des Produktes α-1,4-Glucanlyase oder einer Nukleotidsequenz oder eines Teils davon, welche dieselbe codiert, wobei das Verfahren die Kultivierung solch eines Organismus (oder solcher Zellen von einer Zellinie), der/die mit solch einem Vektor transfiziert ist/sind, umfaßt und Gewinnung des Produkts.
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: Danisco A/S
- (B) STRASSE: Langebrogade 1
- (C) ORT: Kopenhagen
- (D) BUNDESLAND: Kopenhagen K
- (E) LAND: Dänemark
- (F) POSTLEITZAHL: DK-1001
- (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Enzym
- (iii)ANZAHL DER SEQUENZEN: 20
- (iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
- (A) DATENTRÄGER: Diskette
- (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version 41.25 (EPO)
- (v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
- (A) ANMELDENUMMER: WO PCT/EP94/03399
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 1088 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 1091 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 3267 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelt
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 3276 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: doppelt
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 90 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
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- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
- (ix) EIGENSCHAFTEN:
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
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- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 71 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzeln
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- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
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- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 160 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 54 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 238 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 79 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 28 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 36 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 34 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20: ANGABEN BEZÜGLICH EINES HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT Regel 13/bis) ANGABEN BEZÜGLICH EINES HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT Regel 13/bis) ANGABEN BEZÜGLICH EINES HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT Regel 13/bis)
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung des Enzyms α-1,4-Glucanlyase (GL), welches die
Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 enthält, bei dem man das Enzym aus einer pilzinfizierten
Alge isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym unter Verwendung eines Gels, das durch das
Enzym nicht abgebaut wird, isoliert und/oder weiter gereinigt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Gel auf Dextrin oder Derivaten davon basiert.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Dextrin ein Cyclodextrin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Cyclodextrin beta-Cyclodextrin ist.
6. GL-Enzym, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr 2 enthält.
7. Nukleotidsequenz, welche für das Enzym α-1,4-Glucanlyase codiert, wobei die Sequenz eine
Sequenz enthält, die SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 entspricht.
8. Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, wobei die Sequenz eine DNA-Sequenz ist.
9. Verfahren zur Herstellung des Enzyms α-1,4-Glucanlyase, welches das Exprimieren der
Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 7 oder 8 umfaßt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Alge Gracilariopsis lemaneiformis
ist.
11. Nukleotidsequenz, wobei die DNA-Sequenz eine Sequenz enthält, die SEQ ID Nr. 3 oder
SEQ ID Nr. 4 entspricht.
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