DE69518924T2

DE69518924T2 - Fumonisin entgiftende enzyme

Info

Publication number: DE69518924T2
Application number: DE69518924T
Authority: DE
Inventors: Jonathan Duvick; Joyce Rose Maddox; A. Rood; Xun Wang
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 2001-01-18
Anticipated expiration: 2015-08-12
Also published as: MX9701092A; US5716820A; EP0775211B1; AU697831B2; DE69518924D1; CA2195784C; EP0981953A3; US5792931A; CA2195784A1; AU3491095A; WO1996006175A2; ES2151965T3; ZA956531B; ATE196504T1; GR3035020T3; PT775211E; DK0775211T3; JP2001521362A; WO1996006175A3; EP0775211A1

Description

Dies ist eine Teilfortführungsanmeldung der früheren noch anhängigen U. S. Anmeldung mit der Nr. 08/289 595, eingereicht 12. August 1994.

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen den Nachweis und die Isolierung von Fumonisin-resistenten Organismen und Zusammensetzungen und Verfahren zur in-vivo- Entgiftung oder zum in-vivo-Abbau von Fumonisin. Dieses Verfahren besitzt einen breiten Anwendungsbereich in der landwirtschaftlichen Biotechnologie und im Feldfrüchteanbau sowie bei der Verbesserung der Nahrungsmittel-Getreide-Qualität.

Hintergrund der Erfindung

Pilzerkrankungen stellen verbreitete Probleme beim Anbau von Feldfrüchten dar. Es wurden viele Fortschritte gegenüber Pflanzenkrankheiten erzielt, wie beispielsweise durch die Verwendung von Hybridpflanzen, Pestiziden und von verbesserten Anbautechniken. Wie jedoch jeder Züchter oder Heimgärtner bestätigen kann, verursachen die Probleme der Pilzerkrankungen von Pflanzen weiterhin Schwierigkeiten bei der Pflanzenkultivierung. Es gibt daher einen fortwährenden Bedarf für neue Verfahren und Materialien, die die Probleme, die durch Pilzerkrankungen von Pflanzen bewirkt werden, lösen. Diesen Problemen kann durch eine Reihe von Ansätzen begegnet werden. Beispielsweise können die infektiösen Organismen durch die Verwendung von Mitteln, die selektiv biozid für diese Pathogene sind, bekämpft werden. Ein weiteres Verfahren ist die Störung des Mechanismus, durch den das Pathogen die Wirtsnutzpflanze befällt. Im Falle von Pathogenen, die Verluste an Feldfrüchten verursachen, ist es ein anderes Verfahren, den Mechanismus zu stören, durch den das Pathogen die Verletzung der Wirtsnutzpflanze bewirkt. Ein weiteres Verfahren im Falle von Pathogenen, die Toxine produzieren, die für Säugetiere oder andere Tiere, die mit diesen Nutzpflanzen gefüttert werden, unerwünscht sind, ist die Störung der Toxinproduktion, -lagerung oder -aktivität. Diese Erfindung betrifft die zwei letztgenannten Kategorien.
Seit ihrer Entdeckung und strukturellen Aufklärung 1988 (Bezuidenhout S., Gelderblom W., Gorst-Aliman C., Horak R., Marasas W., Spiteller B. Vleggaar R. (1988) "Structure elucidation of the fumonisins, mycotoxins from Fusariüm moniliforme." Journal Cbem. Soc., Chem. Commun. 1988: 743-745) wurden Fumonisine als ein möglicherweise ernsthaftes Problem für Vieh, das mit Mais gefüttert wird, erkannt. Sie werden mit verschiedenen tierischen Toxicosen einschließlich Leukoencephalomalazie (Marasas WFO, Kellermann TS, Gelderblom WCA, Coetzer JAW, Thiel P (1988) "Leukoencephalomalacia in a horse induced by fumonisin B-1 isolated from Fusarium moniliforme." Onderstepoort Journal of Veterinary Research 55: 197-204; Wilson TM, Ledet AE, Owens, DL, Rice LG, Nelson HA (1990) "Experimental liver disease in ponies associated with the ingestion of a corn-based ration naturally contaminated with fumonisin B&sub1;", American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians: Abstracts 33rd Annual Meeting, Denver, Colorado, Oktober 7-9, 1990, Madison, Wisconsin, USA) und dem Lungenödem bei Schweinen (Colvin BM, Harrison LR (1992) "Fumonisin- Induced Pulmonary Edema and Hydrothorax in Swine." Mycopathologia 117: 79-82) in Verbindung gebracht, und es wird ebenso angenommen, dass sie carcinogen wirken (Geary W. (1971), Coord Chem. Rev. 7: 81; Gelderblom WCA, Kriek NPJ, Marasas WFO, Thiel PG (1991) "Toxicity and Carcinogenicity of the Fusarium-Moniliforme Metabolite, Fumonisin-B1, in Rats." Carcinogenesis 12: 1247-1251; Gelderblom WCA, Semple E., Marasas WFO, Farber E. (1992) "The Cancer-Initiating Potential of the Fumonisin-B Mycotoxins." Carcinogenesis 13: 433-437). Fusarium-Isolate in Schnitten von Liseola produzieren in Kultur Fumonisine in Spiegeln von 2 bis > 4000 ppm (Leslie J., Plattner R., Desjardins A., Klittich C (1992) "Fumonisin B1 production by strains from different mating populations of Gibberella fujikorol (Fusarium section Liseola)." Phytopathology 82: 341-345). Isolate aus Mais (überwiegend paarende Population A) sind unter den stärksten Produzenten. (Leslie et al., a. a. O.). Die Fumonisinspiegel, die in auf dem Feld gezüchtetem Mais nachgewiesen wurden, variieren, abhängig vom Ort und der Wachstumszeit, in weitem Umfang, aber sowohl vor als auch nach der Ernte von Feldmais durchgetbhrte Untersuchungen haben gezeigt, dass das Potential für hohe Fumonisinspiegel besteht (Murphy PA, Rice LG, Ross PF (1993) "Fumonisin-B1, Fumonisin-B2 and Fumonisin-B3 content of Iowa, Wisconsin und Illinois corn and corn screenings." J. Agr. Food Chem. 41: 263-266). Auch in Untersuchungen von Nahrungsmittel- und Futtermittelprodukten wurde Fumonisin nachgewiesen (Holcomb M., Thompson HC Jr., Hankins LJ (1993) "Analysis of fumonisin B-1 in rodent feed by gradient elution HPLC using precolumn derivation with FMOC und fluorescence detection." J: Agr. Food Chem. 41: 764-767; Hopmans EC, Murphy PA (1993) "Detection of Fumonisin-B(I), Fumonisin-B(2) and Fumonisin-B(3) and hydrolyzed Fumonisin- B(1) in Corn-Containing foods." J. Agr. Food Chem. 41: 1655-1658; Sydenham EW, Shephard GS, Thiel PG, Marasas WFO, Stockenstrom 5 (1991) "Fumonisin Contamination of Commercial Corn-Based Human Foodstuffs." J. Agr. Food Chem. 39: 2014-2018). Die Etiologie des Fusarium-Ährenschimmels ist nur wenig verstanden, obwohl eine physikalische Schädigung der Ähre und gewisse Umweltbedingungen zu dessen Auftreten beitragen können (Nelson PE (1992) "Taxonomy and Biology of Fusarium moniliforme." Mycopathologia 117: 29-36). Fusarium kann aus den meisten auf dem Feld gezüchteten Maispflanzen isoliert werden, selbst wenn kein sichtbarer Schimmel vorhanden ist. Die Beziehung zwischen der Infektion des Sämlings und Erkrankungen von Stengel und Ähre, die durch Fusarium bewirkt werden, ist nicht geklärt. Eine genetische Resistenz gegenüber von sichtbarem Kornschimmel wurde nachgewiesen (Gendloff E., Rossmann E., Casale W., Isleib T., Hart P (1986) "Components of resistance to Fusarium ear rot in field corn." Pythopathology 76: 684-688; Holley RN, Hamilton PB, Goodman mm (1989) "Evaluation of tropical maize germplasm for resistance to kernel colonization by Fusari um moniliforme." Plant Dis 73: 578-580), aber die Beziehung von sichtbarem Schimmel und Fumonisinproduktion muss noch weiter untersucht werden.
Es wurde in in-vitro-Säugerzell-Studien gezeigt, dass Fumonisine die Sphingolipid- Biosynthese durch Inhibition des Enzyms Sphinganinacyltransferase inhibieren (Norred WP., Wang E., Yoo H., Riley RT; Merrill AH (1992) "In vitro toxicology of flimonisins and the mechanistic implications.". Mycopathologia 117: 73-78; Wang E., Norred W., Bacon C., Riley R, Mernll A. Jr. (1991) "Inhibition of sphingolipid biosynthesis by fumonisins: implications for diseases associated with Fusarium moniliforme." J. Biol. Chem. 266: 14486; Yoo HS, Norred WP, Wang E., Merrill AH, Riley RT (1992) "Fumonisin Inhibition of de Novo Sphingolipid Biosynthesis and Cytotoxicity Are Correlated in LLC-PK1 Cells." Toxicol Appl. PharmacoL 114: 9-15), woraus die Anreicherung des Vorläufers Sphinganin resultiert. Es ist wahrscheinlich, dass die Inhibition dieses Stoffwechselweges zumindest zu einem Teil der Toxizität von Fumonisin beiträgt, was auch durch Messungen der Sphinganin: Sphingosin-Verhältnisse bei Tieren, die mit gereinigtem Fumonisin gefüttert wurden, unterstützt wird (Wang E., Ross PF, Wilson TM, Riley RT, Merrill AH (1992) "Increases in Serum Sphingosin and Sphinganin and Decreases in Complex Spingolipids in Ponies Given Feed Containing Fumonisins, Mycotoxins Produced by Fusarium moniliforme." J. Nutr. 122: 1706-1716). Fumonisine beeinflussen auch das Zellwachstum (Abbas HK, Boyette CD (1992) "Phytotoxicity of fumonisin B&sub1; on weed and crop series.". Weed Technol. 6: 548-552; Vanasch MAJ, Rijkenberg FHJ, Coutinho TA (1992) "Phytoxicity of fumonisin B1, moniliformin, and t-2 toxin to corn callus cultures." Phytopathology 82: 1330- 1332; Vesonder RF, Peterson RE, Labeda D., Abbas HK (1992) "Comparative phytotoxicity of the fumonisins, AAL-Toxin and yeast sphingolipids in Lemna minor L. (Duckweed).". Argh Environ Contam Toxicol 23: 464-467). Kuti et al. "Effeet of fumonisin B1 on virulence of Fusarium species isolated from tomato plants." (Abstract, Annual Meeting American Phytopathology Society, Memphis, TN: APS Press 1993) berichten über die Fähigkeit von exogen zugefügten Fumonisinen, die Krankheitsentwicklung zu beschleunigen und die Sporenbildung von Fusarium moniliforme und F. oxysporum auf Tomaten zu verstärken.
Die Toxizität der Fumonisine und deren potentiell weitverbreitetes Auftreten auf Nahrungs- und Futtermitteln macht es unabdingbar, Entgiftungs- oder Eliminierungsstrategien zu finden, um diese Verbindungen aus der Nahrungsmittelkette zu entfernen.

Offenbarung der Erflndung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von Organismen mit der Fähigkeit, das Mycotoxin Fumonisin abzubauen. Auf der Suche nach biologischen Mitteln, Fumonisine zu entgiften, haben wir aus Körnern von feldgezüchtetem Mais verschiedene dematiazöse Fadenpilze, die fähig sind, auf Fumonisin-B&sub1; oder -B&sub2; (FB&sub1; oder FB&sub2;) als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, wobei dieses während dieses Prozesses partiell oder vollständig abgebaut wird, isoliert. Eine Art, die als Exophiala spinifera identifiziert wurde, eine "schwarze Hefe", wurde von Maissamen von verschiedenen Orten in den südöstlichen und zentralen südlichen Vereinigten Staaten erhalten. Eine verwandte Art, Rhinocladiella atrovirens, wurde aus Saatgut, das sowohl aus Iowa als auch aus Georgia stammte, isoliert. Wir haben außerdem ein Bakterium, von dem wir annehmen, dass es eine Xanthomonas- oder Sphingomonas-Art ist, und welches wir Isolat 2412.1 benennen, aus einer Stengelprobe von auf dem Feld gezüchtetem Mais aus Johnston, Iowa, isoliert. Dieses Bakterium zeigte ebenso ein Wachstum auf FB&sub1; als einzige Kohlenstoffquelle, und da dessen Taxonomie nicht sicher ist, haben wir den Stamm bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und auf dieses Bakterium wird hier durch seine ATCC- Hinterlegungsnummer 55552 Bezug genommen. Wir haben ebenso enzymatisch aktive Stämme von Exophiala spinifera (ATCC 74269) und Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) hinterlegt.
Alte Isolate zeigten die Fähigkeit, FB&sub1; in Flüssigkultur abzubauen. Mit "Abbauen" ist einfach gemeint, dass das Enzym fähig ist, Fumonisin als ein Substrat zu verwenden und es in eine andere chemische Struktur umzuwandeln. Unsere Studien zeigen jedoch, dass die resultierenden Verbindungen weniger toxisch sind als die Fumonisine selbst.
Insgesamt ergaben nur 16 der 70 unabhängig voneinander untersuchten Samenproben abbauende Stämme. Es wurde jedoch gefunden, dass verschiedene E. spinifera-Isolate, die außerhalb der USA aus anderen Quellen als Mais gesammelt wurden, ebenso Fumonisine metabolisieren. Weitere repräsentative Isolate anderer Exophiala-Arten, die getestet wurden (E. jeanselmi, E. salmonis, E. piscifera), noch Rhinocladiella-Isolate aus anderen als Maisquellen einschließlich R. atrovirens und R. anceps, noch Pilze, die mit Ahrenschimmeln assoziiert sind, einschließlich Fusarium moniliforme, F. graminearum, Aspergillus flavus und Diplodia maydis bauten Fumonisine ab. Es wurde gefunden, dass Fumonisin-metabolisierende schwarze Hefen eine induzierbare Hydrolaseaktivität besitzen, die die Tricarballylatester von FB&sub1; spaltet, was durch C&sub1;&sub8;-Dünnschichtchromatographie (TLC) und Fluoreszensnachweis von Ammen gezeigt wurde. Die Identität der resultierenden Aminoalkoholverbindung, mit AP&sub1; bezeichnet, wurde durch FAB-Massenspektroskopie bestätigt. Die letztere Verbindung kann als ein chemischer Indikator des Fumonisin-Stoffwechsels Verwendung finden. E. spinifera-Kulturen metabolisierten API weiter zu unbekannten Verbindungen, die mittels Aminreagentien in der TLC nicht nachweisbar waren. In verschlossenen Kulturgefäßen setzte auf ¹&sup4;C-FB als einziger Kohlenstoffquelle gezüchteter E. spinifera ¹&sup4;CO&sub2; frei, welches auf 1N KOH-gesättigten Filterpapierstreifen nachgewiesen wurde, wobei der gesamte Prozentsatz von hinzugefügter Markierung während 48 Stunden gezählt wurde. Durch Hitze getötete Kulturen, die in gleicher Weise inkubiert wurden, setzten ¹&sup4;CO&sub2; nicht in nennenswertem Umfang frei. Daher wird zumindest ein Teil des Fumonisins durch den Pilz vollständig metabolisiert. Rohe zellfreie Kulturfiltrate des E. spinifera- Isolats, das als 2141.10 gekennzeichnet wurde, enthielten eine hitzelabile, Protease-sensitive Hydrolaseaktivität, die einem Enzym zugeschrieben wurde, welches vorläufig als eine Esterase mit Spezifität für die Tricarballylatester der Fumonisine und ähnlicher Moleküle, wie beispielsweise des AAL-Toxins von Alternaria alternata lycopersici, gekennzeichnet wurde. Es wird angenommen, dass diese gereinigte Esterase ein neues chemisches Molekül ist, da von den untersuchten kommerziell erhältlichen Esterasen keine fähig war, die Tricarballylatester von FB&sub1; zu hydrolysieren, was den Schluss nahelegt, dass von diesen Pilzen eine neue Enzymspezifität produziert wird. Zellfreie Extrakte von E. spinifera-Isolat 2141.10 enthalten weiterhin eine AP1- Katabolase, die fähig ist, AP1 in eine Verbindung umzuwandeln, der eine freie Amingruppe fehlt, möglicherweise in einen Aldehyd. Diese Enzyme und Gene, die für diese Enzyme codieren, die an dem Fumonisin-Abbau beteiligt sind, können für die Entgiftung von Maissamen vor oder nach der Ernte verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt die Nukleotidsequenz einschließlich des offenen Leserahmens, welcher für das bakterielle Esterasegen codiert, dar (Basen 94 bis 1683).
Fig. 2 stellt die hypothetische Aminosäuresequenz des Polypeptids dar, welches von den Basen 94 bis 1683 der Nukleotidsequenz aus Fig. 1 codiert wird. Die Reste 1 bis 38 stellen die angenommene Signalsequenz dar. Das Polypeptid einschließlich der Signalsequenz hat ein errechnetes Molekulargewicht von 55.026,68 (529 Reste) und einen errechneten pI von 8,70. Das Polypeptid ohne die angenommende Signalsequenz besitzt ein errechnetes Molekulargewicht von 51.495, 63 (491 Reste) mit einem errechneten PL von 8,19.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung stellt neuentdeckte Enzyme, die fähig sind, Fumonisine abzubauen und zu entgiften, bereit, wobei diese Enzyme durch Fermentation von entweder einem oder mehreren von Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74270, oder des Bakteriums mit der Hinterlegungsnummer ATCC 55552 hergestellt werden. Die Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zur Herstellung von Enzymen, die fähig sind, Fumonisine zu entgiften, umfassend die Stufe des Züchtens von einem oder mehreren von Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74270, oder des Bakteriums mit der Hinterlegungsnummer ATCC 55552 in Gegenwart eines Fumonisins oder des durch die Wirkung des Enzyms auf ein Fumonisin hergestellten Metaboliten. Diese Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Entgiftung von Fumonisinen bereit umfassend die Stufe ihrer Umsetzung mit einem Enzym, welches aus Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovireas, ATCC 74270 oder dem Bakterium mit der Hinterlegungsnummer ATCC 55552 erhalten wurde.
Wir haben das Gen, das für das Fumonisin-abbauende Enzym aus einem dieser Organismen codiert, isoliert und sequenziert, und stellen hier die Aminosäuresequenz dieses Enzyms zur Verfügung. Es ist bekannt, dass Gene, die gewünschte Proteine codieren, identifiziert, isoliert, cloniert und in transgenen Organismen, einschließlich einiger wichtiger Nutzpflanzen, exprimiert werden können. Eine weitverbreitet verwendete Methode des Gentransfers in Pflanzen beinhaltet die Verwendung einer unschädlichen Form des Ti-Plasmids des Bodenbakteriums Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens ist ein Pflanzenpathogen, das sogenannte Wurzelhalsgallentumore in infizierten Pflanzen verursacht. Große Plasmide, genannt Ti- oder tumorinduzierende Plasmide, sind für die tumorerzeugende Eigenschaft des Bakteriums ebenso wie für den Transfer der Fremd-DNA in die Pflanze verantwortlich. In ähnlicher Weise enthält A. rhizogenes Ri- oder wurzelinduzierende Plasmide, die das Wurzelwachstum anregen. Beide Plasmidarten beinhalten eine vir- oder Virulenzregion, die intakt sein muss, um Wildtyp-Zellen zu Tumorzellen zu transformieren.
Die Transformation resultiert in der Integration eines anderen Plasmidanteils, genannt die T- oder Transfer-DNA, in das Kerngenom der transformierten Zellen. Ri- und Ti-Plasmide können manipuliert werden, um den Einbau von Fremd-DNA, welche ein gewünschtes Protein codiert, in die T-DNA-Region zu ermöglichen. Die Fremd-DNA kann entweder über einen Vektor, der sowohl das vir-Gen als auch das Fremdgen trägt, oder durch ein binäres Vektorssystem, welches aus zwei Plasmiden besteht, wobei eines das vir-Gen trägt und das andere das Fremdgen trägt, transferiert werden. Siehe z. B. U.S. Pat. Nr. 4 658 082.
Transformierte Pflanzenzellen können dann regeneriert werden, um Varietäten herzustellen, die das eingefügte Gen tragen. Die Herstellung von transgenen, Fumonisin-resistenten Pflanzen wird einen nützlichen und neuartigen Ansatz zur Bekämpfung von Fusarium-induzierten Pflanzenerkrankungen darstellen.
Diese Erfindung stellt ebenso einen Mechanismus für die Selektion von Transformanten bereit: die Züchtung der Pflanzenzellen in Gegenwart einer Fusarium-Art oder ihres Mycotoxins begünstigt das Überleben von Pflanzenzellen, die transformiert wurden, um die codierende Sequenz, die für das Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, zu exprimieren und das Toxin abbauen. Daher kann die codierende Sequenz, die für das Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, selbst als Selektionsmarker verwendet werden oder als ein nachweisbarer Marker durch die Messung der Bildung des Aminoalkoholmetaboliten.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein DNA- Konstrukt, umfassend eine Expressionskassette, bestehend aus:
a) einer ein Polypeptid, das fähig ist, Fumonisin abzubauen, codierenden DNA-Sequenz; und
b) Kontrollsequenzen, die funktional mit der codierenden Sequenz verbunden sind, wodurch dis codierende Sequenz in einer Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann und wobei mindestens eine der codierenden DNA-Sequenzen oder Kontrollsequenzen in Bezug auf die Wirtszelle heterolog ist.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Wirtszelle, die mit einem DNA-Konstrukt wie oben beschrieben stabil transformiert ist; und ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids eines rekombinanten Gens, umfassend:
a) Bereitstellen einer Population dieser Wirtszellen; und
b) Züchten dieser Population von Zellen unter Bedingungen, bei denen das Polypeptid, welches durch die codierende Sequenz der Expresssionskassette codiert wird, exprimiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanze, die fähig ist, Fumonisin abzubauen. In einer weiteren Ausführungsform ist die transgene Pflanze eine Maispflanze, die fähig ist, Fumonisin abzubauen.
Eine andere Ausführungsform für die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Übertragung von Fumonisinresistenz auf eine Pflanze, die im wesentlichen eine solche Resistenz nicht aufweist, umfassend das Übertragen eines exprimierbaren Gens, welches für ein Polypeptid codiert, das fähig ist, Fumonisin abzubauen, auf die Pflanze. Daher kann DNA, welche für ein Protein, das fähig ist, Fumonisin zu inaktivieren, codiert, isoliert werden und in einen geeigneten Vektor cloniert werden, und dann in einen Organismus, der normalerweise gegenüber Fusarium oder dessen Toxin empfindlich ist, eingebaut werden. Organismen, die dieses Gen exprimieren, können einfach aufgrund ihrer Fähigkeit, Fumonisin abzubauen, identifiziert werden. Das Protein, welches fähig ist, Fumonisin abzubauen, kann unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind, isoliert und charakterisiert werden. Weiterhin kann das Gen, welches diese Fumonisinresistenz verleiht, in ein geeignetes Plasmid, wie in die T-DNA-Region des Ti- oder Ri-Plasmids der Bodenbakterien Agrobacterium tumefaciens bzw. Agrobacterium rhizogenes, überführt werden. Pflanzengewebe kann mit den transformierten Bakterien infiziert werden. Zusätzlich können Pflanzengewebe, die mit Agrobacterium spp. co-kultiviert worden sind, in Gegenwart des Fumonisins inkubiert werden, um Fumonisin-abbauende transgene Pflanzen zu selektieren, d. h. das Gen für den Fumonisinabbau kann als Selektionsmarker dienen. Daher wird das infizierte Gewebe regeneriert, um Fumonisin-abbauende transgene Pflanzen zu produzieren.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ruminale Mikroorganismen, die mit den Genen, die Fumonisinresistenz verleihen, gentechnisch verändert wurden. Diese veränderten ruminalen Mikroorganismen können dann dem Futtermittel, welches für den Verbrauch durch Tiere vorgesehen ist, die gegenüber von Fumonisin und strukturell verwandten Mycotoxinen empfindlich sind, hinzugefügt werden.

Industrielle Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung wird - soweit nicht anderweitig angezeigt - unter Verwendung von konventionellen Techniken aus der Botanik, Mikrobiologie, Gewebekultur, Molekularbiologie, Chemie, Biochemie und der rekombinanten DNA-Technologie, welche dem Stand der Technik entsprechen, praktiziert. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erläutert. Siehe z. B. J. H. Langenheim und K. V. Thimann, Botany: Plant Biology and Its Relation to Human Affairs (1982) John Wiley; Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Bd. 1 (I. K. Vasil, Hrsg. 1984); R V. Stanier, J. L. Ingraham, M. L. Wheelis, und P. R. Painter, The Microbial World, (1986) 5. Aufl.; Prentice-Hall; O. D. Dhringra und J. B. Sinclair, Basic Plant Pathology Methods, (1985) CRC Press; Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Bd. I und Bd. II (D. N. Glover Hrsg. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Hrsg. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); und die Reihe Methods in Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan, Hrsg., Academic Press, Inc.).
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet werden und sollen dabei wie im weiteren definiert verstanden werden.
Durch den Ausdruck "Mikrobe" ist jeder Mikroorganismus gemeint (einschließlich sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Mikroorganismen), wie beispielsweise Pilze, Hefen, Bakterien, Actinomyzeten, Algen und Protozoen und auch andere unicellulare Strukturen, die fähig sind, in Kultur zu wachsen.
Eine "Fumonisin-produzierende Mikrobe" ist jede Mikrobe, die fähig ist, das Mycotoxin- Fumonisin oder Analoge davon herzustellen. Solche Mikroben sind im allgemeinen Mitglieder des Pilzstammes Fusarium ebenso wie rekombinant hergestellte Organismen, die genetisch verändert wurden, um ihnen die Fähigkeit, Fumonisin oder Analoge davon herzustellen, zu verleihen.
Durch den Ausdruck "Abbauen von Fumonisin" wird jede Modifikation des Fumonisin- Moleküls angesprochen, welche eine Abnahme oder einen Verlust von dessen toxischer Aktivität bewirkt. Eine solche Veränderung kann eine Spaltung jeder der verschiedenen Bindungen, eine Oxidation, eine Reduktion, die Addition oder die Deletion eines chemischen Rests oder irgendeine andere Veränderung, die die Aktivität des Moleküls beeinträchtigt, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Modifikation als erste Stufe die Hydrolyse der Esterbindung in dem Molekül.
Weiterhin kann chemisch verändertes Fumonisin aus Kulturen von Mikroben, die ein erfindungsgemäßes Enzym herstellen, isoliert werden, wie beispielsweise durch Züchten der Organismen auf einem Medium, welches radioaktiv markiertes Fumonisin enthält, Nachweisen der Markierung und Isolieren des abgebauten Toxins zur weiteren Untersuchung. Das abgebaute Fumonisin kann mit der aktiven Verbindung hinsichtlich seiner Phytotoxizität oder seiner Säugertoxizität in bekannten empfindlichen Arten, wie beispielsweise Schweinen und Pferden, verglichen werden. Solche Toxizitätstests sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann bei Pflanzen ein Gesamtblatt-Biotest durchgeführt werden, bei dem Lösungen der aktiven und inaktiven Verbindung auf die Blätter von sensitiven Pflanzen aufgebracht werden. Die Blätter können in situ behandelt werden, oder es können alternativ abgeschnittene Blätter behandelt werden. Die relative Toxizität der Verbindungen kann durch Einstufen der nachfolgenden Schädigung der Pflanzengewebe und durch Messen der Größe von innerhalb einer bestimmten Zeiteinheit gebildeten Läsionen abgeschätzt werden. Andere bekannte Tests können auf cellulärer Ebene, unter Verwendung von Standardgewebe-Kulturverfahren, z. B. unter Verwendung von Zellsuspensionskulturen, durchgeführt werden.
Mit dem Begriff "strukturell verwandtes Mycotoxin" ist jedes Mycotoxin gemeint, welches eine chemische Struktur besitzt, die einem Fumonisin wie Fumonisin B1 verwandt ist, beispielsweise das AAL-Toxin, das Fumonisin B2, das Fumonisin B3, das Fumonisin B4, das Fu monisin C1, Fumonisin A1 und A2 und deren Analoge, ebenso wie andere Mycotoxine, die ähnliche chemische Strukturen aufweisen und von denen erwartet werden würde, dass sie durch die Aktivität der Fumonisin-abbauenden Enzyme, die durch Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovirens, ATCC 742701, oder das Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 hergestellt werden, entgiftet werden würden.
Mit dem Ausdruck "geerntetes Getreide" ist jede Form von Getreide gemeint, die irgendwie aus der Umgebung, in welcher das Getreide gezüchtet worden war, entfernt wurde. Beispielsweise könnte geerntetes Getreide aus Getreideähren, aus Getreidekörnern, weiche aus der Ähre entfernt wurden, geschnittenen Weizenhalmen oder Gerste- oder Reiskörnern oder ähnlichem bestehen. Geerntetes Getreide kann gelagert oder verarbeitet sein. "Verarbeitetes Getreide" ist Getreide, das in irgendeiner Art und Weise verarbeitet worden ist, und für die Herstellung von Nahrungsmitteln für den menschlichen Verbrauch oder als tierisches Futtermittel verwendet werden wird.
Durch den Ausdruck "transgene Pflanze" ist jede Pflanze oder Pflanzenzelle gemeint, die durch die Einführung, den stabilen und vererbbaren Einbau einer Fremd-DNA, d. h. einer DNA, die für ein Protein codiert, welches normalerweise in dieser Pflanzenspezies nicht gefunden wird, in eine Zielpflanze oder Zielpflanzenzelle transformiert wurde.
Der Ausdruck "Setzling" bezieht sich auf eine Pflanze, die soweit entwickelt ist, dass sie einen Schössling und eine Wurzel aufweist, und die asexuell durch Zellkultur reproduziert wird.
Der Ausdruck "Explantat" betrifft einen Abschnitt oder ein Stück eines Gewebes von irgendeinem Teil einer Pflanze für die Kultivierung.
Mit dem Ausdruck "Hormon" ist jeder Pflanzenwachstumsregulator gemeint, der das Wachstum oder die Differenzierung von Pflanzenzellen beeinflusst. Solche Hormone umfassen Cytokinine, Auxine und Gibberelline ebenso wie andere Substanzen, die die Fähigkeit besitzen Pflanzenzellen zu beeinflussen.
Der Ausdruck "Callus" und dessen Plural "Calli" betrifft eine nichtorganisierte Gruppe von Zellen, die sich als Antwort auf das Schneiden, das Abtrennen oder eine andere auf Pflanzengewebe einwirkende Verletzung bildet. Aus Pflanzengewebe ausgeschnittene Stücke und isolierte Zellen können unter geeigneten Kulturbedingungen induziert werden, einen Callus zu bilden. Ein Callus kann für eine beträchtliche Zeit durch Überführen oder Subkultivieren von Teilen des Callus in frisches bzw. in frischem Medium in regelmäßigen Abständen in Kultur gehalten werden. Der Transfer des Callus in flüssiges Medium führt zur Dispersion des Gewebes und zur Bildung einer Pflanzenzellsuspensionskultur. Ein Callus kann induziert werden, eine organisierte Entwicklung unter Bildung von Keimen und Wurzeln einzuschlagen.
Der Begriff "embryoid" betrifft eine Struktur, die in ihrer Erscheinung einem Pflanzenzygotenembryo ähnlich ist.
Die Begriffe "somatisches Hybrid" und "somatische Hybridisierung" betreffen im allgemeinen stabile Kombinationen aus cellulärem Material, seien es Protoplasten/Protoplasten- oder Protoplasten/Cytoplasten-Kombinationen und umfassen Cybride und Cybridisierung.
Ein "Replikon" ist jedes genetische Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo wirkt; d. h. fähig ist, sich unter seiner eigenen Kontrolle zu replizieren.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie beispielsweise ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment angefügt werden kann, um auf diese Weise die Replikation des angehefteten Segmentes zu ermöglichen.
In der hier vorliegenden Verwendung bedeutet der Ausdruck "Nukleotidsequenz" ein DNA- oder RNA-Molekül oder eine DNA- oder RNA-Sequenz und kann beispielsweise eine cDNA, eine genomische DNA oder eine synthetische DNA-Sequenz, ein strukturelles Gen oder ein Fragment davon oder eine mRNA-Sequenz umfassen, die ein aktives oder funktionales Polypeptid codiert.
Eine "codierende Sequenz" aus DNA ist eine DNA-Sequenz, welche transkribiert wird und in ein Polypeptid in vivo translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Startcodon an dem 5'(Amino)-Ende und ein Translationsstoppcodon an dem 3'(Carboxy)-Ende bestimmt. Eine codierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryotischer (z. B. Säuger)-DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen umfassen, ist aber nicht hierauf begrenzt. Normalerweise wird ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz in 3'-Richtung zu der codierenden Sequenz angeordnet sein.
Eine "Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, die fähig ist, in einer Zelle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription der stromabwärts folgenden (in 3'-Richtung) codierenden Sequenz zu initiieren. Zum Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung stellt die Promotorsequenz die Sequenz dar, die an ihrem 3'-Ende an das Translationsstartcodon (ATG) einer codierenden Sequenz gebunden ist und sich stromaufwärts (in 5'-Richtung) so weit erstreckt, dass die minimale Anzahl von Basen oder Elementen umfasst wird, die nötig sind, die Transkription zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz wird eine Transkriptionsinitiationsstelle zu finden sein, ebenso wie Proteinbindedomänen, die für das Binden der RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren werden oft, aber nicht immer "TATA"- und "CAT"-Boxen enthalten. Prokaryotische Promotoren enthalten Shine-Dalgarno-Sequenzen.
"Kontrollsequenzen" aus DNA beziehen sich insgesamt auf Promotorsequenzen, Ribosomenbindestellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptionsterminationssequenzen, stromaufwärts gelegene regulatorische Domänen, Verstärker (Enhancer) und ähnliches, welche zusammen für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle verantwortlich sind.
Eine codierende Sequenz ist "funktionsfähig verbunden mit" oder "unter der Kontrolle von" Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase an die Promotorsequenz binden und die codierende Sequenz in mRNA umschreiben wird, welche dann in das Polypeptid, für das die codierende Sequenz codiert, translatiert wird.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, welche durch eine exogene DNA Sequenz transformiert worden ist oder fähig ist, transformiert zu werden.
Eine Zelle wurde "transformiert" durch exogene DNA, wenn eine solche exogene DNA nach Innen gegenüber der Zellmembran gebracht wurde. Die exogene DNA kann oder kann nicht in die chromosomale DNA, die das Genom der transformierten Zelle ausmacht, integriert sein (covalent verbunden sein). Beispielsweise kann die exogene DNA bei Prokaryoten und Hefen auf einem episomalen Element, wie beispielsweise einem Plasmid, verbleiben. Bei eukaryotischen Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine solche, bei der die exogene DNA in das Chromosom integriert wurde, so dass sie durch Chromosomenreplikation auf Tochterzellen vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle, Zellinien oder Clone zu etablieren, demonstriert, wobei eine Population der Tochterzellen die exogene DNA enthält.
Ein "Clon" ist eine Population von Zeilen, die ausgehend von einer einzelnen Zelle oder einem allgemeinen Vorläufer durch Mitose erhalten wurde. Eine "Zellinie" ist ein Clon einer primären Zelle, der fähig ist, in vitro für viele Generationen stabil zu wachsen.
Zwei DNA, RNA- oder Polypeptidsequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 85% (vorzugsweise mindestens etwa 90% und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 95%) der Nukleotide oder der Aminosäuren über eine definierte Länge des Moleküls sich entsprechen. DNA-Sequenzen, die im wesentlichen homolog sind, können durch ein Southern Hybridisierungsexperiment unter beispielsweise stringenten Bedingungen, wie sie für dieses besondere System definiert sind, identifiziert werden. Das Definieren geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist im Fachgebiet gut bekannt. Siehe z. B. Maniatis et al., a. a. O; DNA Cloning, Bd. I und Bd. II, a. a. O; Nucleic Acid Hybridization, a. a. O.
Eine "heterologe" Region eines DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb eines anderen DNA-Moleküls oder angefügt an ein anderes DNA Molekül, das in der Natur nicht assoziiert mit diesem anderen Molekül gefunden wird. Falls die heterologe Region ein bakterielles Gen codiert, wird dieses Gen daher normalerweise von DNA flankiert, die dieses bakterielle Gen im Genom des Ausgangsbakteriums nicht flankiert. Ein anderes Beispiel für eine heterologe codierende Sequenz ist ein Konstrukt, dessen codierende Sequenz selbst natürlicherweise nicht vorkommt (z. B. synthetische Sequenzen, die Codons aufweisen, die zu dem nativen Gen verschieden sind). "Heterologe" DNA bezieht sich ebenso auf DNA, die nicht innerhalb der Wirtszelle natürlicherweise gefunden wird. Eine allelische Variation oder natürlicherweise auftretende Mutationen werden im hier verwendeten Sinne nicht als heterologe DNA Regionen bezeichnet.
Der Begriff "Polypeptid" wird hier in seinem weitesten Sinne verwendet, d. h. für jedes Polymer aus Aminosäuren, welche durch Peptidbindungen verbunden sind (Dipeptide oder größere Moleküle). Die Bezeichnung "Polypeptid" umfasst daher Proteine, Oligopeptide, Proteinfragmente, Analoge, Muteine, Fusionsproteine und ähnliches. Der Begriff umfasst ebenso Aminosäurepolymere wie oben beschrieben, die zusätzliche Nicht-Aminosäurereste beinhalten. Der Begriff "Polypeptid" umfasst daher auch Glykoproteine, Lipoproteine, Phosphoproteine, Metalloproteine, Nukleoproteine sowie auch andere konjugierte Proteine. Der Begriff "Polypeptid" betrifft auch Polypeptide wie oben beschrieben, die rekombinant produziert wurden, aus einer geeigneten Quelle isoliert wurden oder synthetisiert wurden.
Die vorliegende Erfindung kann besser verstanden werden unter Bezugnahme auf die folgenden, nichtbegrenzenden Beispiele. Personen mit Erfahrung auf dem Fachgebiet werden erkennen, dass andere Ausführungsformen der Erfindung durchgeführt werden können, ohne die Zielrichtung und den Umfang der Erfindung, wie hier offenbart und beansprucht, zu verlassen.

Beispiel 1

Chemikalien und Reagentien. Die Qualität der Chemikalien war mindestens analysenrein oder besser, falls nicht anders angezeigt. Fumonisin B&sub1; und B&sub2; wurden von Sigma Chemical Co. erhalten. Partiell gereinigte Fumonisine (Eluat von einer C8-Säule) wurden von Dr. Pat Murphy (Iowa State University) erhalten. Das AAL-Toxin (TA-Isomer) war ein Geschenk von Dr. David Gilchrist (University of California-Davis).
Pflanzengewebeproben. Reifer, auf dem Feld gezogener Maissamen wurde aus Maiszuchtstationen von Pioneer Hi-Bred International, Inc. in Regionen des Südostens, des Mittleren Westens und des zentralen Südens der Vereinigten Staaten erhalten. Samen wurden bei Raumtemperatur in einzelnen Paketen gelagert.
Isolate von Pilzen und Bakterien. Exophiala- und Rhinocladiella-Isolate aus Mais wurden wie unten beschrieben isoliert. Andere Isolate wurden von Dr. C. J. Wang (Syracuse, NY), Dr. Michael McGinnis (Case Western Reserve University, Cleveland, OH) und von der Amerikanischen Stammkultursammlung "American Type Culture Collection" (Bethesda, MD) erhalten. Fusarium graminearum [Gibberella zeae (Schw.) Petsch], Diplodia maydis und Fusarium moniliforme Sheld. wurden von der mikrobiellen Stammsammlung von Pioneer Hi- Bred International, Inc. erhalten. Aspergillus flavus (Schw.) Petsch, Isolat CP22, wurde von Don Sumner an der University of Georgia (Tifion, GA) erhalten. Xanthomonas sp. 2412.1 wurde aus Maisstengelgewebe, wie unten beschrieben, isoliert.
Isolierungsverfahren. Einzelne Körner, entweder intakt oder mit einer sterilen Rasierklinge zweigeteilt, wurden 1 h in 5 ml sterilem Wasser unter Schütteln gespült. Zwischen 1 bis 5 ul der Spülflüssigkeit wurde zu 100 ul sterilem, kohlenstofffreiem Mineralsalzmedium + FB&sub1; (MS-FB&sub1;) hinzugefügt (1 g/Liter NH&sub3;SO&sub4;, 1 g/Liter K&sub2;PO&sub4;, 1 g/Liter NaCl, 0,2 g/Liter MgSO&sub4;·7H&sub2;O, pH 7,0), welches FB&sub1; (Sigma Chemical Co.) in einer Konzentration von 0,5 bis 1,0 mg/ml enthielt. Der pH-Wert des Mediums betrug nach Zugabe von FB&sub1; etwa 6,0. Nach 1 bis 2 Wochen Inkubation bei 28ºC in Dunkelheit wurden serielle 10fache Verdünnungen in sterilem dH&sub2;O durchgeführt, und Aliquote wurden auf 1,2% Bacto-Agar, welcher 0,1% Hefeextrakt, 1% Bacto-Pepton und 0,1% Dextose enthielt (YPD-Agar) ausplattiert. Pilz- und Bakterienkolonien, die auf dem Agar erschienen, wurden auf frische Platten übertragen, und individuelle Kolonien wurden hinsichtlich ihrer Fumonisinmetabolisierungsfähigkeit durch Übertragen in frisches MS-FB&sub1; untersucht. Das Verschwinden von Fumonisin aus dem Medium wurde in regelmäßigen Zeitabständen durch Auftropfen von 0,5 bis 1 Mikroliter-Aliquoten des Kulturüberstands auf C&sub1;&sub8;-Silicagelplatten, die dann luftgetrocknet und wie unten beschrieben entwickelt wurden, überprüft. (siehe Analyse von Fumonisinen und Metabolismusprodukten).
Die direkte Isolierung von schwarzen Hefen aus Samen wurde durch Ausplattieren von 100 Mikrolitern der Samenwaschflüssigkeit auf YPD oder Sabouraud-Agar bewerkstelligt, wobei Cycloheximid (500 mg/Liter) und Chloramphenicol (50 mg/Liter) dem Agar zugesetzt wurden. Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 7-14 Tage inkubiert, und einzelne pigmentierte Kolonien, die darauf wuchsen, wurden gezählt und zur Analyse der Fumonisin-abbauenden Fähigkeit, wie oben beschrieben, kultiviert.
Für Stengelisolierungen wurden reife Stengelproben 0,5 · 0,5 · 2 cm von Maisinzüchtungen des Südlichen Typs, gezüchtet in Johnston, Iowa, von Pioneer Hi-Bred International Inc., einer Saatzuchtfirm, 1993 genommen. 2,54 cm-Abschnitte aus dem Zentrum (Mark) oder von der Oberfläche von nicht an der Oberfläche sterilisierten Stengeln wurden geschnitten und in 10 ml steriles Wasser in ein kleines, sterilisiertes Röhrchen überführt. Die Röhrchen wurden 1 Stunde geschüttelt, und dann wurden 2 ul der Waschlösung entnommen und dazu verwendet, 100 ul MS-FB&sub1; in einer Mikrotiterplatte zu inokulieren. Die nachfolgenden Schritte waren wie oben beschrieben.
Analyse von Fumonisinen und Metabolismusprodukten. Die analytische Dünnschichtchromatographie wurde auf 100% silanisierten C&sub1;&sub8;-Silicaplatten ausgeführt (SigmaTM #T- 7020; 10 · 10 cm; 0,1 mm dick), wobei eine Modifikation der von Rottinghaus publizierten Methode eingeführt wurde. Die Probenspuren wurden mit Methanol angefeuchtet, um die Probenauftragung zu erleichtern. Nach Auftragung von zwischen 0,1 bis 2 ul der wässrigen Probe wurden die Platten luftgetrocknet und in MeOH : 4% KCl (3 : 2) oder MeOH : 0,2M KOH (3 : 2) entwickelt und dann nacheinander mit 0,1 M Natriumborat (pH 9,5) und Fluorescamin (0,4 mg/ml in Acetonitril) besprüht. Die Platten wurden luftgetrocknet und unter langwelligem UV- Licht betrachtet.
Alkalische Hydrolyse von FB&sub1; zu AP&sub1;. FB&sub1; oder rohes Fumonisin-C&sub8;-Material wurde in Wasser in einer Konzentration von 10 bis 100 mg/ml suspendiert und zu einem gleichen Volumen 4 N NaOH in einem Schraubdeckelröhrchen zugefügt. Das Röhrchen wurde geschlossen und 1 h bei 60ºC inkubiert. Das Hydrolysat wurde auf RT gekühlt und mit einem gleichen Volumen Ethylacetat gemischt, bei 1000 RCF 5 Minuten zentrifugiert, und die organische (obere) Schicht entnommen. Die vereinigten Ethylacetatschichten aus zwei aufeinanderfolgenden Ex traktionen wurden unter N&sub2; getrocknet und in dH&sub2;O resuspendiert. Das resultierende Material (das Aminopentol des FB&sub1; bzw. des "AP&sub1;") wurde mittels TLC analysiert.
Die Tabellen 1 und 2 zeigen die Resultate der Bemühungen, Fumonisin-abbauende Enzyme aus einem weiten Spektrum von Quellen zu isolieren. Wie gezeigt, waren E. spinifera- Isolate aus Maissamen von verschiedenen Orten immer fähig, ein Fumonisin-abbauendes Enzym zu produzieren, wenn sie auf Fumonisin als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet wurden (Tabelle 1), genau wie andere E. spinifera-Isolate von anderen Quellen auf der ganzen Welt (Tabelle 2). Einige Proben von Rhinocladiella atrovirens aus Maissamen waren auch fähig, dieses Enzym herzustellen (Tabelle 1). Andere Exophiala-Arten und andere Rhiaocladiella-Arten bzw. -Quellen waren routinemäßig unfähig, das Enzym zu produzieren, selbst wenn sie von Pflanzenverwandten Quellen isoliert wurden (Tabelle 2). Tabelle 1: Dematiazöse Pilze, isoliert von Maissamen, die Fumonisin abbauen
¹ "schimmlig" bedeutet eine sichtbare Verfärbung des Kornperikarps, ein Zerbrechen oder Zersplittern: "sauber" bedeutet keine sichtbaren Zeichen einer Infektion des Korns
² Bestimmt durch TLC-Analyse des Kulturüberstands, wie hier beschrieben.
nt = nicht getestet Tabelle 2: Andere Pilzisolate, getestet auf den Abbau von Fumonisin B1 in Flüssigkultur
* Getestet sowohl mit FB&sub1; als einziger Kohlenstoffquelle und mit FB&sub1; unter Zusatz von 1% Saccharose. Tabelle 3. Häufigkeit der Isolierung von Fumonisin-abbauenden schwarze Hefeisolaten aus Maissamen
Unter Verwendung der vorliegenden Verfahren können Organismen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Fumonisin abzubauen, durchgemustert werden. Auf diese Weise können Proben aus Pflanzen, Boden und aus See- und Süßwasser durchgemustert werden und die daraus untersuchten Organismen, die fähig sind, Fumonisin abzubauen, isoliert werden. Alternativ können bereits isolierte mikrobielle Stämme, von denen angenommen wird, dass sie diese Fähigkeit besitzen, durchgemustert werden. Vermutlich Fumonisin-resistente Bakterien schließen solche Bakterien ein, die mit Pflanzenarien assoziiert sind, die anfällig sind ihr eine Fusarium-Infektion. Beispielsweise kann von Bakterien, die mit Fusarium-inflzierten Tomaten und Pfeffer oder auch mit anderen empfindlichen Pflanzenarten assoziiert sind, erwartet werden, dass sie Fumonisin abbauen. Darüberhinaus könnten Mitglieder von Bakterienklassen, von denen bekannt ist, dass sie hinsichtlich ihres Stoffwechsels von komplexen organischen Molekülen flexibel sind, wie beispielsweise Mitglieder des Genus Pseusomonas Fumonisin abbauen.
Im allgemeinen werden Medien, die verwendet werden, um die oben genannten Mikroben zu kultivieren, eine bekannte Menge Fumonisin enthalten, d. h. von 0,1 bis 3 mg Fumonisin pro ml Medium, normalerweise von 0,25 bis 2 mg pro ml Medium und bevorzugt von 0,5 bis 1 mg Fumonisin pro ml Medium.
Es wurde eine weitere Untersuchung durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Morphologie der Kolonie verwendet werden kann, um zu bestimmen, welche Stämme dieser Arten ein Fumonisin-abbauendes Enzym produzieren. Die in Tabelle 4 gezeigten Resultate wiesen darauf hin, dass E. spinifera- und R. atrovirens-Kolonien, die unterschiedliche Morphologien aufweisen, dennoch das Fumonisin-abbauende Enzym produzieren. º Tabelle 4: Schwarze Hefen, isoliert von einem einzigen Korn durch direktes Ausplattieren der Samenwaschlösung auf YPD + Cycloheximid + Chloramphenicol ¹
¹Korn-Quelle: Titton, Georgia. Der Samen wurde gespalten, mit 5 ml sterilem Wasser gewaschen und es wurden dann 100 ul auf YPD-Agar, enthaltend Cycloheximid (500 mg/l) und Chloramphenicol (50 mg/l) ausplattiert.
Ausgehend von diesen Resultaten wurde geschlossen, dass ein Wachstum auf Fumonisin als einziger Koblenstoffquelle der am meisten vertrauenswürdige Indikator für die Fähigkeit, Fumonisin-abbauende Esterase zu produzieren, ist.
Die aus E. spinifera isolierte Esterase wurde dann anderen Behandlungen unterzogen einschließlich Protease-Behandlungen, um zu bestimmen, ob und wie das Enzym in unterschiedlichen Umgebungen funktionieren würde. Die Resultate sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5: Effekt von verschiedenen Behandlungen auf die Modifikation von FB&sub1;
* 10fach konzentriert, Filtrate von 11. bis 15. Tag der Kultivierung, behandelt wie beschrieben, und dann mit FB&sub1; (0,5 mg/ml Endkonzentration) über Nacht bei 37ºC inkubiert. Analyse durch C&sub1;&sub8;-TLC/Fluorescaminspray nach über Nacht Inkubation bei 37ºC mit 1 mg/ml Fumonisin
- = keine Hydrolyse
± = Spuren von Hydrolyse
+ = unvollständige Hydrolyse
++ = unvollständige Hydrolyse
+++ = vollständige Hydrolyse
Es wurde dann der pH-Bereich der Aktivität der Fumonisinesterase durch Messung des Fumonisinabbaus in Gegenwart von Citrat- und Citrat-Phosphat-Puffern bei unterschiedlichen pH-Werten gemessen. Die Resultate sind in Tabelle 6 gezeigt. Hiervon wurde geschlossen, dass das Enzym einen relativ weiten pH-Bereich aufweist und dass das Enzym bei den internen pH- Werten von Pflanzen und Pflanzenzellen funktional sein würde. Tabelle 6: Effekt des Puffer-pH-Werts auf die Hydrolyse von Fumonisin B&sub1; durch E. spinifera-Kulturfiltrate
* Die Reaktionen wurden bei 37ºC über Nacht durchgeführt und mittels TLC ausgewertet
* Analyse durch C&sub1;&sub8;-TLC/Fluorescaminspray nach über Nacht Inkubation bei 37ºC mit 1 mg/ml Fumonisin
- = keine Hydrolyse
± = Spuren von Hydrolyse
+ = unvollständige Hydrolyse
++ = unvollständige Hydrolyse
+++ = vollständige Hydrolyse
Die aus E. spinifera und R. atrovirens isolierte Fumonisinesterase wurde mit anderen bekannten Esterasen aus verschiedenen Quellen, die von kommerziellen Vertreibern geliefert wurden, verglichen. Die in Tabelle 7 gezeigten Resultate zeigen, dass die Fumonisinesterase ein einzigartiges Enzym ist, das eine hochspezifische Aktivität aufweist und das keine allgemeine Esteraseaktivität besitzt, die vergleichbar wäre mit irgendeinem der untersuchten bekannten En zyme. Tabelle 7: Hydrolyse von Fumonisin B&sub1; durch kommerzielle Esterasen und Hydrolasen
* Analyse durch C&sub1;&sub8;-TLC/Fluorescaminspray nach über Nacht Inkubation bei 37ºC mit 1 mg/ml Fumonisin
- = keine Hydrolyse
± = Spuren von Hydrolyse
+ = unvollständige Hydrolyse
++ = unvollständige Hydrolyse
+++ = vollständige Hydrolyse
Die Induzierbarkeit des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde durch Züchten von Exophiala-Kulturen auf verschiedenen Kohlenstoffquellen mit unterschiedlichen Abstufungen struktureller Ähnlichkeit zu Fumonisin untersucht. Die in Tabelle 8 gezeigten Resultate zeigen, dass sowohl die Originalform des Fumonisins und dessen Metabolit fähig sind, die Enzymherstellung zu induzieren, die Induzierbarkeit des Enzyms ist aber ebenso recht spezifisch. Tabelle 8: Fähigkeit verschiedener Kohlenstoffquellen zur Unterstützung des Wachstums und/oder der Induktion der FB1-hydrolytischen Aktivität von Exophiala-Kulturen
Die Fähigkeit der Fumonisinesterase, andere organische Carboxylester zu spalten, wurde ebenso im Vergleich mit ihrer Fähigkeit, Fumonisin zu hydrolysieren, untersucht. Die in Tabelle 8 gezeigten Resultate zeigen auch, dass das Enzym die Tricarballylate anderer verwandter Aminoalkohole, wie FB&sub2; und dem AAL-Toxin, hydrolysiert. Tabelle 9: Hydrolyse organischer Carbogylester durch rohes, konzentriertes Exophiala-Kulturfiltrate
Enzymatische Aktivität des Kulturfiltrats und des Myzels. Das Exophiala spinifera- Isolat 2141.10 wurde auf YPD-Agar 1 Woche gezogen, die Konidien wurden geerntet, in sterilem Wasser suspendiert und in einer Konzentration von 105 Konidien pro ml verwendet, um steriles Fries-Mineralsalzmedium zu beimpfen, welches 1 mg/ml gereinigtes FB&sub1; (Sigma Chemical Co.) enthielt. Nach 2 Wochen Inkubation bei 28ºC im Dunkeln wurden die Kulturen durch 0,45 Mikron-Celluloseacetatfilter gefiltert und mit Fries-Mineralsalzen gespült. Das Pilzmyzel wurde in 15 ml 0,1 MC-FB&sub1;, pH 5,2 + 1 mM EDTA + 3 ug/ml Pepstatin A + 1,5 ug/ml Leupeptin suspendiert und in einem Bead-BeaterTM unter Verwendung von 0,5 mm Kügelchen und einminütigen Pulsen unter Kühlen mit Eis zerrissen. Hyphenstückchen wurden durch Filtration durch Spin X (0,22 um) gesammelt, und sowohl der Myzelüberstand und die Originalkulturfiltrate wurden mittels der oben beschriebenen Verfahren auf Fumonisinmodifikation hin untersucht.
Herstellung von rohen Kulturfiltraten. Wie oben gezüchtete Agarkulturen wurden verwendet, um YPD-Flüssigkulturen (500 ml) in konischen Flaschen in einer Endkonzentration von 105 Zellen pro ml Kultur anzuimpfen. Die Kulturen wurden 5 Tage bei 28ºC ohne Schütteln inkubiert, und die Myzelien wurden durch Filtration durch 0,45 Mikron-Filter unter Vakuum geerntet. Das Filtrat wurde verworfen, und die myzeliale Filterschicht wurde gewaschen und in sterilem kohlenstofffreiem, Niedrigmineralsalzmedium (1 g/Liter NH&sub3;NO&sub4; · 1 g/Liter NaH&sub2;PO&sub4;; 0,5 g/Liter MgCl&sub2;; 0,1 g/Liter NaCl; 0,13 g/Liter CaCl&sub2;; 0,02 g/Liter FeSO&sub4; · 7H&sub2;O, pH 4,5) gelöst, welches 0,5 mg/ml alkalisch hydrolysiertes rohes FB&sub1; enthielt. Nach 3 bis 5 Tagen bei 28ºC in Dunkelheit ohne Schütteln wurden die Kulturen durch 0,45 Mikron-Filter mit niedriger Proteinbindung gefiltert, um das Kulturflitrat zu gewinnen. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wurde auf eine Konzentration von 2,5 mM eingestellt, und das Kulturfiltrat wurde unter Verwendung einer AmiconTM YM10-Membran in einer Rührzelle bei Raumtemperatur konzentriert und in 50 mM Natriumacetat, pH 5,2, enthaltend 10 mM CaCl&sub2;, resuspendiert. Das rohe Kulturfiltrat (etwa 200fach konzentriert) wurde bei -20ºC gelagert.
Um präparative Mengen von enzymhydrolysiertem Fumonisin zu erhalten, wurden 10 mg FB&sub1; (Sigma) in 20 ml 50 mM Natriumacetat, pH 5,2, + 10 mM CaCl&sub2; gelöst, und 0,25 ml 200fach konzentriertes rohes Kulturfiltrat von 2141.10 wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde bei 37ºC 14 Stunden inkubiert und dann auf Raumtemperatur gekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Hinzufügen von 0,4 ml 4 N KOH auf annähernd pH 9,5 eingestellt, und das Gemisch wurde zweimal mit 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden umer N&sub2; getrocknet und in H&sub2;O resuspendiert. 2,5 Milligramm des organisch extrahierten Materials wurden mittels Fast Atom Bombardment (FAB) Massenspektrometrie analysiert. Das resultierende Massenspektrum zeigte ein Hauption bei M/2 = 406 Masseneinheiten, was darauf hinwies, dass das Hauptprodukt der enzymatischen Hydrolyse AP&sub1; ist, welches ein berechnetes Molekulargewicht von 406,63 aufweist.
Zusätzliche Charakterisierung von Fumonisinesterasen aus Exophiala spinifera und gramnegativen Bakterienarten. Rohe, konzentrierte Kulturfiltrate (mit induzierter FB&sub1;- Esteraseaktivität) aus E. spinifera-Isolat 2141.10 und Xanthomonas sp. 2412.1 wurden auf einer Pharmacia® Superdex 75-Größenausschlusssäule chromatographiert und mit 50 mM Natriumphosphat, pH 6,0, enthaltend 0,2 M NaCl, eluiert. 1-ml-Fraktionen wurden gesammelt und auf FB1-Esteraseaktivität durch die oben beschriebenen Verfahren untersucht. Die Retentionszeiten für die 2141.10 und 2412.1-FB&sub1;-Esterasen resultierten in geschätzten Molekulargewichten von 44,5 bzw. 28,7 Kilodalton.
In gleicher Weise wurden rohe konzentrierte Kulturfiltrate in 1,7 M Ammoniumsulfat auf eine Pharmacia®-Phenyl-Sepharose-FPLC-Säule aufgetragen, welche mit 1,7 M Ammoniumsulfat in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,0, (Puffer A) äquilibriert worden war. Ein 30 ml linearer Gradient von Puffer A gegen destilliertes Wasser wurde aufgetragen, gefolgt von einem Waschschritt mit 0,1% Triton X-100 in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,0. 1-ml-Fraktionen wurden gesammelt und sowohl auf FB&sub1;-Esterase und auf nichtspezifische Esterase hin untersucht (unspezifische Esterase, gemessen durch Naphthylacetathydrolyse unter Verwendung des Verfahrens von Dary et al. (1990) "Microplate adaption of Gormori's assay for quantitative determination", Journal of Economic Entomology 83: 2187-2192. Fig. 2a und b zeigen die Retentionszeiten für die spezifischen (d. h. FB&sub1;) gegenüber den nichtspezifischen (d. h. Naphthylacetatesterase) Aktivitäten. Sowohl die Pilz- oder als auch die Baktieren-FB&sub1;-Esteraseaktivität eluierte bei etwa 0,4 M Ammoniumsulfat. Naphthylacetatesteraseaktivität wurde sowohl in Pilz- als auch Bakterienkulturen nachgewiesen, diese Aktivität coeluierte jedoch nicht zusammen mit der FB&sub1;- Esteraseaktivität. Die Pilz- und Bakterien-FB&sub1;-Esterasen sind daher nicht identisch mit den nichtspezifischen Esterasen, die in den Kulturfiltraten dieser Mikroben nachweisbar sind.

Beispiel 2

Clonieren von Genen, die für Fumonisinesterase codieren

Mikroorganismen, die Fumonisin-Resistenz zeigen, können verwendet werden, um genomische Bibliotheken unter Verwendung von Standardtechniken anzulegen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. So können unter Verwendung von Restriktionsenzymen DNA- Fragmente gebildet werden, die dann in beliebige geeignete Cloniervektoren insertiert werden können. Zahlreiche Cloniervektoren sind den Fachleuten bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Cloniervektors ist eine Geschmackssache. Der Cloniervektor muss nur fähig sein, eine Wirtszelle zu transformieren, die unfähig ist, Fumonisin abzubauen. Beispiele für rekombinante DNA Vektoren zum Clonieren oder Beispiele für Wirtszellen, welche diese Vektoren transformieren können, gezeigt in Klammern, umfassen den Bakteriophagen lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC 177 (E. coli), pKT23 0 (gramnegative Bakterien), pGV1106 (gramnegative Bakterien), pLAFRI (gramnegative Bakterien), pME290 (gramnegative Bakterien außer E. coli), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces) und YCp19 (Saccharomyces). Siehe ganz allgemein: DNA Cloning, Bd. I und Bd. 11, a. a. O. und Maniatis et al., a. a. O. Besonders nützlich sind Cloniervektoren, die fähig sind, E. coli zu transformieren.
Soweit der Cloniervektor in eine geeignete Wirtszelle insertiert wurde, werden die Zellen auf Fumonisin-enthaltendem Medium gezüchtet und auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Fumonisin abzubauen, wie oben beschrieben. Plasmid-DNA-insertionen aus Kolonien, die Fumonisin abbauen, werden durch Subclonieren, Transposon-Markieren und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert, alles Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (siehe z. B. Napoli, C. und Staskawicz, B. (1987) J. Bact. 169: 572-578). Sobald eine codierende Sequenz bestimmt wurde, können entsprechend der vorliegenden Erfindung rekombinante Proteinmoleküle, die fähig sind, Fumonisin abzubauen, durch Konstruktion einer Expressionskassette und Transformieren einer Wirtszelle damit, hergestellt werden, um eine Zellinie oder Zellkultur bereitzustellen, die fähig ist, das gewünschte Protein, das innerhalb der Expresssionskassette codiert wird, zu exprimieren.
Sequenzen, die für das Fumonisin-abbauende Enzym codieren, können entweder direkt durch synthetische Methoden, die auf der bestimmten Sequenz basieren, hergestellt werden oder durch Verwendung der Sequenz, um Oligonukleotidsonden zu entwerfen, um die native codierende Sequenz unter Verwendung bekannter Techniken zu clonieren. Die Oligonukleotidsonden können hergestellt und verwendet werden, um eine DNA Bibliothek aus einem Organismus, der fähig ist, Fumonisin abzubauen, was wie oben beschrieben bestimmt wurde, durchzumustern. Die Basisstrategien zur Herstellung von Oligonukleotidsonden und DNA Bibliotheken, wie auch deren Durchmustern durch Nukleinsäurehybridisierung sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Siehe z. B. DNA Cloning, Bd. L, a. a. O; Nucleic Acid Hybridization, a. a. O; Oligonudeotide Synthesis, a. a. O; Maniatis et al., a. a. O.
Die codierende Sequenz kann vollständig aus der so erhaltenen codierenden Sequenz bestehen, oder diese Sequenzen können an andere Sequenzen fusioniert vorliegen (z. B. Leadersequenzen), so dass ein Fusionsprotein codiert wird. Siehe z. B. die U. S. Patent Nrn. 4 431 739, 4 425 437 und 4 338 397. Sobald eine geeignete, für das Fumonisin-abbauende Enzym codierende Sequenz hergestellt oder isoliert wurde, kann sie in irgendeinen geeigneten Vektor oder in irgendein geeignetes Replikon cloniert werden, was ebenfalls auf dem Fachgebiet gut bekannt ist. Diese Vektoren sind oben beschrieben, wobei E. coli das Wirtsbakterium ist, welches besonders bevorzugt wird.
Um die Konstruktion der Expressionskassetten zu vervollständigen, wird die codierende Sequenz dann funktional mit Kontrollsequenzen, wie beispielsweise einem Promotor, einer Ribosomenbindestelle (bei bakterieller Expression) und optional einer Operatorsequenz verbunden, so dass die DNA-Sequenz, welche für das Protein codiert, in der Wirtszelle, welche durch den Vektor, der das Expressionskonstrukt enthält, transformiert wurde, in Boten-RNA umgeschrieben wird. Es liegt innerhalb der Sachkunde auf dem Fachgebiet, die das Fumonisin-abbauende Enzym codierende Sequenz operabel mit geeigneten Kontrollsequenzen zu verbinden, um Transkription und Translation zu bewirken. Im allgemeinen wird die codierende Sequenz stromabwärts von der Promotorsequenz und allen expresssionregulatorischen Regionen, wie Enhancern oder Operatorsequenzen, liegen. Falls die codierende Sequenz mit einer heterologen codierenden Sequenz oder einem heterologen Startcodon verbunden ist, ist es wichtig, die codierende Sequenz im richtigen Leseraster bezogen auf letztere zu platzieren. Falls der angestrebte Expressionswirt ein prokaryotischer Wirt ist, wird es ebenso notwendig sein, eine Ribosomenbindestelle zu den stromaufwärts liegenden Kontrollsequenzen hinzuzufügen. Stromabwärts liegende operabel verbundene Kontrollsequenzen werden normalerweise eine Transkriptions-Terminations- Sequenz umfassen.
Das Konstrukt kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden. Eine Reihe von prokaryotischen und eukaryotischen Expresssionsvektoren sind im Fachgebiet bekannt. Bevorzugte Vektoren sind prokaryotische Expressionsvektoren. Ein besonders bevorzugter Wirt für solche Vektoren ist E. coli. Das Fumonisin-abbauende Enzym wird dann hergestellt, indem die Wirtszellen, die mit der Expressionskassette transformiert wurden, unter Bedingungen kultiviert werden, welche die Expression des biologisch aktiven Proteins bewirken, was durch die Fähigkeit der Wirtszellen gezeigt wird, Fumonisin in dem Medium, in dem sie kultiviert werden, abzubauen, wie oben beschrieben. Das Protein kann aus den Wirtszellen isoliert werden und für weitere Untersuchungen gereinigt werden. Wird das Protein nicht sekretiert, kann es notwendig sein, die Wirtszellen aufzubrechen und das Protein aus dem Zelllysat zu reinigen. Verschiedene Reinigungstechniken, wie z. B. HPLC, Größenausschlusschromatographie, Elektrophorese und Immunaffinitätschromatographie, sind bekannt, und die Auswahl der geeigneten Reinigungs- und Gewinnungsmethode ist im Fachgebiet bekannt.
In gleicher Weise kann das Gen in die T-DNA-Region eines Ti- oder Ri-Plasmids aus A. tumefaciens bzw. A. rhizogenes insertiert werden. Unter Verwendung dieser Plasmide können somit Expressionskassetten wie oben beschrieben konstruiert werden. Es sind viele Kontrollsequenzen bekannt, die, wenn sie mit einer heterologen codierenden Sequenz verbunden und in einen Wirtsorganismus transformiert sind, ein exaktes Verhalten bezüglich der Genexpression und der Gewebe/Organspezifität der ursprünglichen codierenden Sequenz zeigen. Siehe z. B. Benfey, P. N., und Chua, N. H. (1989), Science 244: 174-181. Besonders geeignete Kontrollsequenzen zur Verwendung in diesen Plasmiden sind Promotoren zur konstitutiven blattspezifischen Expression des Gens in den verschiedenen Zielpflanzen. Andere verwendbare Kontrollsequenzen umfassen einen Promotor und Terminator des Nopalin-Synthase-Gens (NOS). Der NOS-Promotor und der NOS-Terminator liegen in dem von der American Type Culture Collection erhältlichen, mit der Bezeichnung ATCC 67238 versehenen Plasmid pARC2 vor. Wenn ein solches System verwendet wird, muss das Virulenz(vir-)Gen entweder des Ti- oder des Ri- Plasmids ebenso vorliegen, entweder zusammen mit dem T-DNA-Anteil oder mittels eines binären Systems, bei dem das vir-Gen auf einem separaten Vektor vorliegt. Solche Systeme, Vektoren für eine solche Verwendung und Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen sind in U.S. Pat. Nr. 4 658 082; U.S.-Anmeldung Nr. 913 914, angemeldet 1. Oktober 1986, welches als Referenz in U. S. Patent 5 262 306, erteilt 16. November 1993 an Robeson et al., genannt wird; und in Simpson, R. B. et al. (1986), Plant Mol. Biol. 6: 403-41S (auf das auch im '306- Patent Bezug genommen wird), beschrieben, die alle in ihrer Gesamheit durch den Bezug darauf hierin eingeschlossen werden.
Sobald konstruiert, können diese Plasmide in A. rhizogenes oder A. tumefaciens verbracht werden, und diese Vektoren können verwendet werden, um Zellen von Pflanzenarten, welche gewöhnlicherweise anfällig sind für die Fusarium- oder Altentaira-Infektion, zu transformieren. Beispielsweise werden nichtresistente Varietäten der Tomate (Lycopersicon esculentum) oft von solchen Infektionen heimgesucht, und neue resistente Varietäten könnten entwickelt werden, um Alternaira-induzierten Erkrankungen bei sich entwickelnden Tomatensetzlingen entgegenzuwirken, obwohl bemerkt werden muss, dass angenommen wird, dass die Fusarium- Welke-Krankheit bei der Tomate durch F. oxysporum, nicht durch F.monicliformium verursacht wird, und dass F. oxysoporum scheinbar Fumonisin nicht produziert. Verschiedene andere transgene Pflanzen werden durch die vorliegende Erfindung ebenso ins Auge gefasst, als nichtbegrenzende Beispiele können hier genannt werden: Sojabohne, Mais, Sorghum, Alfalfa, Reis, Klee, Kohl, Banane, Kaffee, Sellerie, Tabak, Lammbohne, Baumwolle, Melone und Pfeffer. Die Wahl, ob A. tumefaciens oder A. rhizogenes verwendet wird, wird von der damit transformierten Pflanze abhängen. Im allgemeinen ist A. tumefaciens der für die Transformation bevorzugte Organismus. Die meisten Dicotyledonen, manche Gymnospermen und einige wenige Monocotyledonen (beispielsweise bestimmte Mitglieder der Liliales und Arales) sind anfällig für eine Infektion durch A. tumefaciens. A. rhizogenes besitzt ebenfalls ein weites Wirtsspektrum, umfassend die meisten Dicoten und manche Gymnospermen, welche Mitglieder der Leguminosae, Compositae und Chenopodiaceae umfassen. Alternative Techniken, von denen gezeigt wurde, dass sie bei der genetischen Transformation von Pflanzen effektiv sind, beinhalten das Partikelbombardement und die Elektroporation. Siehe z. B. Rhodes, CA., et al. (1988), Science 240, 204-207; Shigekawa, K. und Dower, W. J. (1988) Bio Techniques 6, 742-751; Sanford, J. C., et al. (1987), Particulate Science & Technology 5: 27-37; und McCabe, D. E. (1988) Bio Technology 6: 923- 926.
Sobald transformiert, können diese Zellen verwendet werden, um transgene Pflanzen zu regenerieren, die fähig sind, Fumonisin abzubauen. Beispielsweise können vollständige Pflanzen mit diesen Vektoren infiziert werden, indem man die Pflanze verletzt und dann den Vektor in die Stelle der Verletzung einbringt. Es kann jeder Teil der Pflanze verletzt werden einschließlich der Blätter, der Stengel und der Wurzeln. Alternativ kann Pflanzengewebe in Form eines Explantats, wie beispielsweise cotyledones Gewebe oder Blattscheiben mit diesen Vektoren beimpft und unter Bedingungen kultiviert werden, welche die Pflanzenregeneration unterstützen. Wurzeln oder Schösslinge, die durch Beimpfung von Pflanzengewebe mit A. rhizogenes oder A. tumefaciens transformiert wurden, und das Gen, welches für das Fumonisin-abbauende Enzym codiert, enthalten, können als Quelle von Pflanzengewebe verwendet werden, um Fumonisin- resistente transgene Pflanzen, entweder über somatische Embryogenese oder über Organogenese zu regenerieren. Beispiele für solche Verfahren zur Regeneration von Pflanzengewebe sind be schrieben in Shahin, E. A. (1985); Theor. Appl. Genet. 69: 235-240; U.S. Fat. Nr. 4 658 082; Simpson, R. B. et al. (1986), Plant Mol. Biol. 6: 403-415; und U.S. Patentanmeldungen Nrn. 913 913 und 913 914, beide angemeldet 1. Oktober 1986, und als Referenz genannt in U.S. Patent 5 262 306, erteilt 16. November 1993 an Robeson et al.; die vollständigen Offenbarungen darin sind hierin durch Bezugnahme darauf aufgenommen.
Die so transformierten Zellen können auch verwendet werden, um transgene Pflanzen zu regenerieren, die fähig sind, in spezifischen Geweben oder konstitutiv, abhängig von der Art des gewählten Promotors, entweder das Fumonisin-abbauende Enzym zu exprimieren, welches von Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74270 oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 gebildet wird, oder die AP&sub1;-Katabolase zu exprimieren, welche durch diese Stämme gebildet wird. Solche transgenen Pflanzen können geerntet werden, und die geeigneten Gewebe (beispielsweise Samen, falls ein samenspezifischer Promotor verwendet wurde) können im Großmaßstab Proteinextraktions- und -reinigungs-techniken unterworfen werden, und die Fumonisin-abbauenden Enzyme oder AP&sub1;-Katabolasen können zur Verwendung bei Fumonisin und Fumonisinhydrolyse-Produkt-entgiftungsverfahren isoliert werden.
Bestimmte Esterasen gehören zu einer Familie, die aufgrund ihrer Primärsequenz und ihrer Gesamtstruktur verwandt sind (Cygler M., Schrag ID, Sussman JL, Harel M., Silman I., Gentry MK, Doctor BP (1993) "Relationship between sequence conservation and 3-Dimensional structure in a large family of esterases, lipases, and related proteins." Protein Sci. 2: 366-382). Es wurden PCR Primer aus hochkonservierten Regionen dieser Esterasefamille abgeleitet, und unter Verwendung dieser Primer konnte aus Exophiala spinfera-Isolat 2141.10 ein cDNA-Clon erhalten werden, der signifikante Homologie zu bekannten Esterasen aufwies, und spezifisch mit Fumonisin und anderen Induktoren induziert wurde. Diese Esterase kann in E. coli exprimiert werden und dessen Enzymaktivität kann mit Hilfe des oben beschriebenen TLC-Tests gemessen werden. Falls in E. coli keine Aktivität erhalten wird, kann die Expression in Hefe oder einem anderen eukaryotischen System gemessen werden.
Andere Verfahren können ebenso verwendet werden, um das Gen zu clonieren. Die Reinigung des Proteins und die N-terminale Sequenzierung erlauben es, spezifische DNA-Sonden abzuleiten; sowie die Herstellung von Antikörpern aus gereinigtem Protein und das Durchmustern einer Expressionsbibliothek, Verwendung von RNA-Anreicherungsverfahren, um eDNAs zu erhalten, die in der induzierten Kultur spezifisch vorkommen. Sobald bestätigt wurde, dass das Gen mit der Fumonisinesterase korrespondiert, kann der cDNA-Clon in einfacher Weise in geeignete Expressionsvektoren zur Expression des Enzyms in Maisgewebekulturzellen, transgenen Mais und auch in Fusarium moniliforme selbst ligiert werden, was nützlich ist für die Untersuchung der Mechanismen der Pathogenese, welche mit dem Pilz und dessen Toxin assoziiert ist. Transformierte oder transient exprimierende Maisgewebekulturzellen können dann hinsichtlich ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber Fumonisinen relativ zu transformierten Kontrollgewebe bewertet werden, und Fumonisin kann als Selektionsmittel verwendet werden, um transformierte Zellen aus der Gewebekultur zu isolieren.

Clonieren des Xanthomonas/Sphingomonas-Esterasegens:

Das Xanthomonas-Esterasegen wurde in einer lambda-Expressionsbibliothek, ausgehend von mit Sau3A partiell verdauter bakterieller DNA (4-8 kb Größe, ausgewählt aus ATCC 55552) cloniert. Vereinigte lambda-Lysate wurden auf Fumonisin-Esteraseaktivität durch TLC unter Verwendung von reinem Fumonisin als Substrat untersucht, und die Positiven daraus wurden weiter unterteilt, um positive Clone anzureichern. Individuelle Plaques wurden resuspendiert und die Aktivität in dem Lysat getestet. Ein positiver Clon wurde gereinigt, das Phagemid ausgeschnitten und die DNA zur Sequenzierung hergestellt. Ein 4-kb-DNA Fragment, welches die Fumonisin-Esteraseaktivität enthielt, wurde sequenziert, und es wurde gefunden, dass eine 1589 Basenpaarregion enthalten ist, enthaltend einen 529 Aminosäuren umfassenden offenen Leserahmen mit hoher Homologie zu Mitgliedern der Serincarboxylesterase-Typ-B-Superfamilie. Der offene Leserahmen codiert für ein hypothetisches Protein (genannt BEST 1) mit einem angenommenen Signalpeptid von Aminosäure 1 bis 38, resultierend in einem reifen Protein mit einem errechneten Molekulargewicht von 51.495,63 Dalton und einem pI von 8,19. Dieser offene Leserahmen zeigte 52,5% Ähnlichkeit und 34% Identität mit der Aminosäuresequenz einer Kaninchen-Cholinesterase (P37176). Andere Cholinesterasen zeigten ähnliche Homologie-Werte. Die BEST1-Sequenz war ebenfalls zu 53,0% ähnlich und zu 36,4% identisch zu einer para- Nitrobenzylesterase (P04058) aus Bacillus subtilis. Der offene Leserahmen zeigte ebenso eine 54,6%ige Ähnlichkeit und eine 34,9%ige Identität mit Exophiala spinifera-Fumonisinesterase (Esp 1). Neben der allgemeinen Ähnlichkeit zu anderen Typ-B-Carboxylesterasen teilen Esp 1 und BEST1 zwei kurze Aminosäuredomänen, die in anderen bekannten Esterasen dieses Typs nicht gefunden werden:
Diese Domänen könnten eine Rolle für die Substratspezifität dieser Enzyme spielen (Cygler M., Schrag, J. D., Sussman, J. L. Harel, M., Silman L, Gentry, M. K. Doctor, B. P. (1993). Relationship between sequence conservation and 3-Dimensional structure in a large family of esterases, lipases, and related proteins. Protein Sci. 2: 366-382).

Beispiel 3

Herstellung von AP1-induziertem und nichtinduziertem Myzel

Exophiala spinifera-Isolat 2141.10 wurde in YPD-Medium 5 Tage bei 28ºC gezüchtet. Das Myzel wurde auf 0,5 Mikron-Celluloseacetatfiltern geerntet und in frisches Medium überführt, bestehend aus Fries-Mineralsalzen (Gilchrist DG, Grogan RG (1976) "Production and nature of a host-specific toxin from Alternaria alternata f. sp. lycopersici." Phytopathology 66: 165-171), supplementiert mit hydrolysiertem Fumonisin B1 (AP1) (0,5 mg/nil) oder delta- Aminobuttersäure (δ-ABA) (1 mg/ml) als einziger Kohlenstoffquelle. Die Kulturen wurden im Dunkeln 48 Stunden bei 28ºC inkubiert, und die Kulturüberstände wurden durch Filtration durch 0,5 Mikron-Celluloseacetat entfernt. Das verbleibende Myzelgeflecht wurde mit sterilem Fries- Mineralsalz-Medium gewaschen und dann für die Lagerung in flüssigem Stickstofftiefgefroren.

Beispiel 4

RNA-Isolation aus Exophiala spinifera

Die oben beschriebenen Myzeliageflechte (~ 1 Gramm) wurden unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser gemahlen, und es wurde dann 10 ml "TRIREAGENT" (Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH) in Gegenwart von 0,2 Volumen Chloroform hinzugefügt. Das Mahlgut wurde zentrifugiert und der resultierende Überstand mit Isopropanol präzipitiert. Das resultierende Pellet wurde mit Phenol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und bei -80ºC gelagert.
poly-A enthaltende mRNA wurde aus der in Wasser (0,4 ml) gelösten RNA unter Verwendung von biotinyliertem oligo(dT) und einem Streptavidin-System mit magnetischen Kügelchen (Promega) unter Beachtung der Herstellerangaben angereichert. Die polyA(+)- angereicherte RNA wurde bei -80ºC gelagert.
Die Erststrang-cDNA-Synthese aus polyA(+)-angereicherter RNA wurde unter Verwendung von M-MLV reverser Transkriptase (37ºC, 1h) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert. Aliquote wurden für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der degenerierten Primer entnommen, die aus den Sequenzen mit der jeweiligen Sequenz ID NO. 1 bis 4 abgeleitet wurden:
ESP5'-OL1 GGGAATTCGARGAYTGNYTNTAYNTNTAYNTNAAYRT (SEQUENZ ID NO. 1)
ESP5'-OL2 GGGAÄJTCMCNGTNNTNVTNTGGATNYAYGGNGGNG (SEQUENZ ID NO. 2)
ESP3'-OL1 GGGAAGCTTGGRTYNCCNCCRAANKBNGCDATRTT (SEQUENZ ID NO. 3)
ESP3'-OL2 GGGAAGCTTCNCCNGCNSWYTCNCCRAANADNGTNA (SEQUENZ ID NO. 4)
Die meisten mit "N" bezeichneten Basen waren Inosine.
Die Thermocycler-Reaktionsbedingungen waren:
1. 94ºC 2 min
2. 94ºC 30 s
3. 45ºC 2 min
4. 72ºC 1 min
5. Wiederholung der Schritte 2 bis 4 35mal
6. 72ºC 5 min
Es wurde eine Elektrophorese der PCR-Reaktionsprodukte in horizontalen Agarosegelen durchgeführt. DNA Banden die nur in induzierten Agarosegelspuren vorhanden waren, wurden ausgeschnitten, und die DNA wurde eluiert. Die erhaltene DNA wurde mit Hindill und EcoRI verdaut und in pBluescript SK+ ligiert.
Ein rekombinanter Clon, der aus Produkten stammte, die unter Verwendung von ESP5'- OL2 und ESP3'-OL2 (ESP26-1) amplifiziert wurden, wurde isoliert und sequenziert. Die clonierte Region enthält einen offenen Leserahmen mit der partiellen Protein- bzw. Aminosäuresequenz:
...SFHLYDGASFAANQD ViVVTINYRTMLGFPAAPQLPITQRNLGFLDQRFALDWVQR NIAAFGGDPRKVT FFGESN.. (SEQUENZ ID NO. 5)
Die obige, aus dem DNA-Fragment ESP26-1 abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte eine signifikante Homologie zu einer Familie von Proteinen, die Cholinesterasen, Acetylcholinesterasen, Carboxylesterasen und bestimmte Lipasen umfassen (Cygler M., Schrag ID, Sussman JL, Harel M., Silman L, Gentry MK, Doctor BP (1993) "Relationship between sequence conservation and 3-Dimensional structure in a large fainily of esterases, lipases and related proteins." Protein Sci 2: 366-382.)

Beispiele 5 bis 6

Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit bekannten Sequenzen

Verglichen mit einer von Arpagaus, M, Chatonnet, A., Masson, P., Newton, M., Vaughan, T. A., Bartels, C. F., Nogueira, C. P., La Du, B. N., und Lockridge, O. J. Biol. Chem. 266, 6966-6974 (1991) veröffentlichten Sequenz waren 43 der 76 Aminosäuren von ESP26-1 identisch mit einer Cholinesterase aus Hundepankreas.
Ein weiterer Vergleich zeigte, dass 32 von 62 Aminosäuren aus ESP26-1 mit denen einer Pilzlipase übereinstimmten, publiziert von Lotti, M., Grandori, R., Fusetti, F., Longhi, S., Brocca, S., Tramontano, A. und Alberghina, L., Gene 124, 45-55 (1993).

Beispiel 7

Northern-Blot-Analyse von induziertem und nichtinduziertem Exophiala spinifera:

Gesamt-RNA, die aus Exophiala spinifera-Kulturen extrahiert wurde, wie in den vorherstehenden Beispielen beschrieben, wurde auf Formaldehyd-enthaltenden Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen, auf Nitrocellulose geblottet und mit Hilfe einer durch Random- Priming erhaltenen 32P-markierten ESP26-1-cDNA-Sonde analysiert. Die Sonde hybridisierte mit einer RNA von etwa 2,0 Kb Größe in der induzierten Spur, aber nicht in der nichtinduzierten Spur (siehe Fig. 1)

Beispiel 8

Isolierung der cDNA in voller Länge von ESP26-1 aus Exophiala spinifera

Um das 3'-Ende der cDNA, die für die angenommene Esterase codiert, zu erhalten, wurde eine Methode zur 3'-schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (3'-RACE) angewandt (Frohman, M. A., Dush, M. K. und Martin, G. R., 1988 "Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. "Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8998-9002). 5 ug Gesamt-RNA, isoliert aus APl-induziertem Exophiala spinifera-Myzel, wurde als Matrize für eine reverse Transkriptionsreaktion verwendet. Die reverse Transkriptionsreaktion und die nachfolgende PCR Amplifikation wurden mit einem 3'- RACE-Kit (Gibco BRL) durchgeführt. Der genspezifische Primer (ESP3'-1:
GCTAGTTTCGCAGCCAATCA-GGA) (SEQUENZ ID NO. 6) wurde aus der ESP26- 1-Sequenz abgeleitet.

Die PCR-Reaktionsbedingungen waren:

1. 94ºC 4 min
2. 94ºC 45 s
3. 60ºC 25 s
4. 72ºC 3 min
5. wiederhole Schritte 2 bis 4 40mal
6. 72ºC 10 min
Ein resultierendes 1,5-Kb-DNA-Fragment wurde auf Nitrocellulose geblottet und mit der cDNA-ESP26-1 unter hochstringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen hybridisiert (letzter Waschschritt: 0,1 · SSC, 0,5% SDS, 65ºC 30 min). Das DNA-Fragment wurde aus dem Gel isoliert, in einen pGEM-T-Vektor (Promega) ligiert und in DH5α (Gibco BRL) transformiert. Die resultierende Plasmid-DNA (p3RC-2) wurde unter Verwendung des M13- Universal-Primers sequenziert. Der Sequenzvergleich zwischen 3RC-2 und ESP21-1 zeigte, dass ESP26-1 zu 100% mit dem 5'-Ende der 3RC-2-Sequenz überlappte.
Um die aminoterminale Sequenz zu erhalten, wurde eine 5'-RACE-Strategie angewandt (Frohman, et al., a. a. O.). 5 ug Gesamt-RNA, isoliert aus AP1-induzierten Exophiala spinifera- Myzelien wurde mit SuperScript-I-RNase H-reverse-Transkriptase (Gibco BRL) unter Verwendung eines Antisense-Primers, konstruiert gegen die ESP26-1-Sequenz (ESP5'-1), revers transkribiert: AAAGGCTGCGATGTTCCGCTGTA) (SEQUENZ ID NO. 7). Der cDNA wurde unter Verwendung der terminalen Transferase (Promega) und dATP ein A-Schwanz angefügt, und sie wurde als Matrize für eine benachbarte Amplifikation unter Verwendung eines zweiten genspezifischen Antisenseprimers (ESPS'-2: TCGCTGTGTTATTGGGAGCTGAG. (SEQUENZ ID N0. 8) verwendet. Das C ist eine stille Mutation (Austausch für A), um eine PvuII- Restriktionsschnittstelle zu erzeugen) und ein am Ende blockierter polyl-Primer (BamT17V: CGCGGATCCGTTTTTTTTTTTTTTTTTV (SEQUENZ ID NO. 9).
Die PCR-Reaktionsbedingungen waren:
1. 94ºC 4 min
2. 94ºC 45 s
3. 40ºC 45 s
4. 60ºC 25 s
5. 72ºC 3 min
6. wiederhole Schritte 2 bis 5 41mal
7. 72ºC 10 min
Die PCR-Produkte wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel größenfraktioniert. Das amplifizierte Produkt wurde aus dem Gel isoliert, in pGEM-T (Promega) ligiert und in DH5 (Gibco BRL) transformiert. Das resultierende 5'-RACE-Produkt wurde sequenziert, und es wurde gezeigt, dass es wie erwartet mit dem 3'-RACE-Produkt überlappt und einen offenen Leserahmen enthält, der signifikante Homologie zu Mitgliedern der von Cygler et al. (a. a. O.) beschriebenen Serinesterase/Lipase-Superfamilie aufweist. Die durch 3'-RACE und 5'-RACE erhaltenen überlappenden Sequenzen wurden kombiniert, und es wurde so eine cDNA Sequenz erhalten, die dem vollständigen offenen Leserahmen entspricht. Der Volllängen-1937-bp-cDNA-Clon aus Exophiala spinifera 2141.10 (abgekürzt ESPl) enthält einen offenen Leserahmen von 537 Aminosäuren, der unten gezeigt ist (SEQUENZ ID NO. 10).
Dieser offene Leserahmen (ORF) zeigt eine gewisse Homologie zu Mitgliedern der von Cygler et al. (a. a. O.) beschriebenen Serinesterase/Lipase-Superfamilie. Die größte Homologie ist eine 35,9%ige Identität in einem 320 Aminosäuren großen Überlappungsbereich, verglichen mit der Butyrylcholin-esterase aus Oryctolagus cuniculus (Kaninchen).
Das abgeleitete Esp1 Protein enthält ein angenommenes Signalpeptid, welches wahrscheinlich an der Position 26/27 abgespalten wird, wodurch ein reifes Protein mit einem errechneten Molekulargewicht von 54953.781 und einem errechneten pl von 4,5 erhalten wird. Diese errechneten Werte stimmen mit dem geschätzten MR und pI der Fumonisin-Esteraseaktivität wie oben beschrieben überein.
Ein Vergleich des Esp1-offenen Leserahmens mit Konsensusregionen der Esterase- Superfamilie (Cygler et al., a. a. O.) zeigt zahlreiche konservierte Merkmale, die darauf hinweisen, dass Esp1 für eine Serinesterase codieren könnte. Das Esp-Protein besitzt ein potentielle Kon sensusstelle, die ein aktives Serin enthält, an der Position 223 bis 228; eine angenommene Konsensusstelle, die ein aktives Aspartat enthält an Position 335 bis 341, die typisch ist für Cholesterinesterasen und Drosophila 6 und P-Proteine [die Mehrzahl der Mitglieder dieser Superfamilie einschließlich Pilzlipasen und Pilzcarboxylesterasen besitzen anstelle des Aspartats Glutamat im aktiven Zentrum]; und eine angenommene Stelle, die ein aktives Histidin besitzt, die unterschiedlich ist von allen Mitgliedern der Familie, wobei zusätzliche Aminosäuren zwischen G und H liegen. Das angenommende reife Esp-Protein hat insgesamt 6 Cysteine, wodurch 3 Disulfidbrücken möglich werden, was zumindest mit einer Untergruppe der Esterasen in der von Cygler et al., a. a. O., beschrieben Superfamilie übereinstimmt.
Der Esp-ORF besitzt daher die meisten Merkmale eines als sicher angenommenen Mitglieds dieser Lipase/Esterase-Superfamilie, umfassend eine angenommene Aktivitätsstellentriade und andere konservierte Aminosäuren. Die Orte der Konservierung stimmen nicht mit irgendeiner Substratsubgruppe überein (d. h. Lipase, Cholinesterase, Carboxylesterase oder Cholesterinesterase), scheinen aber einige Eigenschaften von diesen zu enthalten, und es scheint so zu sein, dass Esp einzigartig unter den bekannten Esterasen, hinsichtlich seiner angenommenen Konsensussequenzstelle mit einem aktiven His ist.

Beispiel 9

Effekt von FR&sub1; und AP1 auf Maiskeimblätter

Maiskeimblätter von 4 Tage im Dunkeln gezogenen gekeimten Maissamen wurden oberhalb des Wachstumspunktes abgeschnitten und in 96-Loch-Mikrotiterplatten in Gegenwart von 60 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser, enthaltend FB&sub1; oder AP1 in annähernd äquimolaren Konzentrationen von 1,5, 0,5, 0,15, 0,05, 0,015, 0,005, 0,0015 bzw. 0,0005 millimolar zusammen mit Wasserkontrollen verbracht. Nach 2 Tagen im Dunkeln bei 28ºC wurden die Keimblätter in Licht überführt und weitere 3 Tage inkubiert. Eine Beschädigung bzw. deren Fehlen wurde wie folgt gezeigt:
+ = braune nekrotische Verfärbung des Keimblattes
- = keine Symptome (identisch zur Wasserkontrolle)
Die Resultate (siehe obige Tabelle) zeigen, dass es einen mindestens 30fachen Unterschied hinsichtlich der Toxizität von FB&sub1; bzw. AP&sub1; für Maiskeimblätter dieses Genotyps gibt. Dies ist in allgemeiner Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen, bei denen die Toxizität dieser zwei Verbindungen auf Pflanzengewebe verglichen wurde: bei Geweben aus Lemna war AP&sub1; etwa 40fach weniger toxisch (Vesonder RF, Peterson RE, Labeda D., Abbas HK (1992) "Comparative phytotoxicity of the fumonisins, AAL-Toxin and yeast sphingolipids in Lemna minor L (Duckweed)." Argh Environ Contam Toxicol 23: 464-467). Untersuchungen sowohl mit dem AAL-Toxin als auch FB&sub1; bei Tomate zeigten ebenso, dass die hydrolysierte Version des Moleküls wesentlich weniger toxisch ist (Gilchrist DG, Ward B, Moussato V, Mirocha CJ (1992) "Genetic and Physiological Response to Fumonisin and AAL-Toxin by Intact Tissue of a Higher Plant." Mycopathologia 117: 57-64). In einem jüngst veröffentlichten Bericht beobachteten Lamprecht et al. ebenso eine etwa 100fach verringerte Toxizität von AP&sub1; gegenüber FB&sub1; (Lamprecht S., Marasas W., Alberts J., Cawood M., Gelderblom W., Shephard G., Thiel P., Calitz J, (1994) Phytotoxicity of fumonisins and TA-toxin to corn and tomato. Phytopathology 84: 383391).

Beispiel 10

Wirkung von FB&sub1; und AP&sub1; auf kultivierte Maisgewebezellen (Schwarzer Mexikanischer Süßmais, BMS)

FB&sub1; bzw. AP&sub1; wurden in verschiedenen Konzentrationen zu Suspensionen von BMS- Zellen gegeben, die in dem flüssigen Kulturmedium in 96-Loch-Polystyrol-Platten gezüchtet wurden. Nach 1 Woche wurde die Zelldichte in den Vertiefungen in geringer Vergrößerung ausgewertet, und das Wachstum der toxinbehandelten Vertiefungen wurde mit den Kontrollvertiefungen, die Wasser enthielten, verglichen. Das Wachstum der BMS-Zellen war bei 0,4 mikromolar FB&sub1; signifikant inhibiert, es wurde bis zu 40 mikromolar AP&sub1; jedoch keine Inhibition beobachtet. Dies zeigt eine etwa 100fache Differenz der Toxizität gegenüber kultivierten Maisgewebezellen. In ähnlicher Weise beobachteten Van Asch et al. (Vanasch MAJ, Rijkenberg FHJ, Coutinho TA (1992) "Phytotoxicity of fumonisin bl, moniliformin und t-2-toxin to corn callus cultures." Phytopathology 82: 1330-1332) eine signifikante Inhibition des Maiscallus, gezüchtet auf Festmedium bei 1,4 uM. AP&sub1; wurde in dieser Untersuchung jedoch nicht untersucht.

Beispiel 11

AP&sub1;-Katabolaseaktivität

Ein zellfreier Extrakt, der die Katabolaseaktivität enthält, wurde erhalten, indem substratinduzierte Exophiala spinifera-Zellen unter Verwendung eines Kügelchenschlägers (bead beater) in Natriumacetatpuffer, pH 5,2, zerrissen wurden und der zellfreie Überstand durch Zentrifugation und 0,45 Mikron-Filtration gewonnen wurde. Die katabolische Aktivität wird durch Inkubieren der Extrakte mit AP&sub1; (hydrolysieres Fumonisin-B&sub1;-Rückgrat) oder 14C-Markieren mit dem Extrakt, und Bewerten durch TLC auf C18-Silicagel untersucht. Das Produkt AP&sub1;-N1 weist einen niedrigeren Rf-Wert als AP&sub1; auf und wird entweder durch Abtasten der radioaktiven Markierung oder durch H&sub2;SO&sub4;-Sprühen/Verkohlen der TLC-Platte nachgewiesen. AP&sub1;-N&sub1; reagiert nicht mit dem Aminreagens Fluorescamin, das routinemäßig verwendet wird, um AP&sub1; auf TLC-Platten nachzuweisen, wodurch es nahegelegt wird, dass die Amingruppe fehlt oder chemisch modifiziert ist. Die Aktivität ist bei 37ºC größer als bei Raumtemperatur, jedoch nach 30 Minuten bei 65ºC oder 100ºC (keine AP&sub1;-katabolische Aktivität verbleibt). Die Aktivität ist am größten bei einem pH-Wert von 9. Bei pH 9 trat die vollständige Umsetzung zu AP&sub1;-N&sub1; in 30 Minuten auf. Die Aktivität wird von 30 Kd Molekulargewichtsausschlussmembranen, jedoch nur teilweise von 100 Kd Molekulargewichtsausschlussmembranen zurückgehalten. Auch andere Amingruppen-enthaltende Substrate wurden hinsichtlich ihrer Modifikation durch den Rohextrakt untersucht. Fumonisin (mit angefügten Tricarboxylsäuren) wird durch den Extrakt nicht modifiziert, wodurch gezeigt wird, dass die Hydrolyse zuerst geschehen muss, damit die Katabolase aktiv wird. Andere langkettige Basen (Sphingosin, Sphinganin, Phytosphingosin) werden scheinbar durch die rohe Katabolase nicht modifiziert, wodurch es nahegelegt wird, dass das Enzym (die Enzyme) spezifisch für das Fumonisingerüst ist (sind). Präparative Mengen des Produkts, vorläufig AP&sub1;-N1 genannt, wurden ebenso gereinigt und durch C13-NMR analysiert. Die Resultate zeigen, dass AP&sub1;-N1 kein Aminostickstoff besitzt und dass es wahrscheinlich eine Ketofunktion enthält. Dies weist entweder auf eine Aminoxidase oder ein Ammoniaklyaseenzym hin. Es würde nicht erwartet werden, dass ein Produkt eines dieser Enzyme eine signifikante Toxizität aufweisen würde (obwohl dies nicht getestet wurde).

Beispiel 12

Nachweis funktionaler Esteraseaktivität

Die Esteraseaktivität wurde durch Exprimieren der E. spinifera-cDNA in zwei heterologen Systemen (einem Insektenzellen/Bakulovirus-Expressionssystem und transgenem Mais, der erhalten wurde durch Mikroprojektilbombardierung) und nachfolgendes Detektieren der Fumonisin-Esteraseaktivität in dem transformiertem Gewebe gezeigt. 44 Maiscalli (Hi-Typ II) wurden mit dem Esterasegen, fusioniert an das um einen selektierbareren Marker erweiterten Ubiquitinpromotor-(PAT)-Plasmid, bombardiert. Unter Verwendung der Dünnschichtchromatographieanalyse wurden 38 Linien als positiv für die Fumonisinhydrolyse identifiziert, basierend auf dem Vorhandensein eines Flecks für eine freie Tricarboxylsäure auf den TLC-Platten. Vier negative Kontrollcalli wiesen einen solchen Fleck nicht auf Ähnliche Resultate wurden mit Insektenzellen, die mit einem Bakulovirus-Expressionsvektor, der den Esteraseclon enthielt, infiziert wurden, erhalten.
Die Esteraseaktivität wurde auch in Blattgewebe aus regenerierten T0-Maispflanzen nachgewiesen. Zehn Blattstanzungen (4 mm Durchmesser) wurden aus dem 6. Blatt regenerierter Pflanzen ungefähr desselben Alters (7 Blattstadium) entnommen, welche vier Klassen von Transformanten repräsentierten: nur selektierbarer Matter (-), geringe Esterase (+), mittlere Esterase (++) und hohe Esterase (+++)-exprimierende Zahlen (basierend auf Callusdaten). Jeweils vier Pflanzen, die unterschiedliche Ereignisse in jeder Masse repräsentierten, wurden gesammelt. Die Stanzungen wurden in 200 Mikroliter 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,2, suspendiert, welcher Leupeptin und Pepstatin enthielt, um Proteinasen zu inhibieren, und durch schnelles Schütteln mit einem 5/32"-Stahlkügelchen, zweimal je 30 s homogenisiert. Die Homogenate wurden bei 4000 UpM, 10 min bei 4ºC zentrifugiert und 150 Mikroliter Überstand entnommen. Die Proteinkonzentration der Proben wurde bestimmt (nach Bradford), und es wurde dieselbe Proteinkonzentration eingestellt und dann die Fumonisin-Esteraseaktivität unter Ver wendung von 14C-FB1 als Substrat untersucht. Nach 30 min bzw. 4 h wurden die Reaktionen auf TLC-Platten (C18) aufgetropft und mit MeOH : 4%KCl (3 : 2) entwickelt. Die Platten wurden mit einem radiometrischen Abtastgerät (AMBIS) abgetastet und hinsichtlich des Vorliegens von Fumonisin-Esteraseaktivität auf einem Produkt bewertet, ++ (bis zu 50% Umsetzung zum Produkt) und +++ (zwischen 90 bis 100% Umsetzung zum Produkt):
Zusammenfassend wiesen 8 oder 12 exprimierende Calli eine Blattexpression auf. Alle Negativkontrollen und vier exprimierende Calli waren negativ. Von den vier "+++"- exprimierenden Calli hatte nur einer (D2) denselben hohen Spiegel (30 min Test), es waren aber alle positiv.

Beispiel 13

Entgiftung von geerntetem Getreide

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Entgiftung von Fumonisin oder einem strukturell verwandten Mykotoxin mit einem Enzym, welches die Struktur der Fumonisin-abbauende Enzyme oder der AP1-Katabolase aufweist, die durch Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 oder das Bakterium mit der Hinterlegungsnummer ATCC 55552 gebildet werden, während des Verarbeitens von Getreide für den Verbrauch als tierisches Futter oder menschliches Nahrungsmittel. Da die atmosphärische Ammoniakbehandlung von Getreide sich als ineffektives Verfahren zur Entgiftung herausgestellt hat (siehe B. Fitch Haumann, "Eradicating Mycotoxin in Food and Feeds", LNFORM 6: 248-257 (1995)), ist eine solche Methodologie besonders wichtig, falls transgene Detoxifizierung nicht anwendbar ist.
Bei dieser Ausführungsform werden das Fumonisin-abbauende Enzym und/oder die AP&sub1;- Katabolase, die durch Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 oder das Bakterium mit der Hinterlegungsnummer ATCC 55552 gebildet werden, während der Verarbeitungsprozedur an dem Getreide, bei den geeigneten Stufen des Verfahrens und in Mengen, die wirksam sind, um Fumonisine und strukturell verwandte Mykotoxine zu entgiften, angewandt. Die Entgittung nach diesem Verfahren kann nicht nur während der Verarbeitung des Getreides angewandt werden, sondern auch zu jedem anderen Zeitpunkt vor dem Verfüttern des Getreides an ein Tier oder dem Verarbeiten des Getreides zu einem Nahrungsmittelprodukt für Menschen.
Die Enzyme können während der Verarbeitung in geeigneter Art und Weise eingeführt werden, beispielsweise als Waschlösung oder als Spray, oder in getrockneter oder lyophilisierter Form oder als Puder, abhängig von der Natur des Mühlenprozesses und/oder der Stufe der Verarbeitung, bei der die enzymatische Behandlung durchgeführt wird. Siehe allgemein Hoseney, R. C., Principles of Cereal Science and Technology, American Ass. of Cereal Chemists, Inc., 1990 (besonders Kapitel 5, 6 und 7); Jones, J. M., Food Safety, Eagan Press, St. Paul, MN, 1992 (besonders Kapitel 7 und 9); und Jelen, P., Introduction to Food Processing, Restan Publ. Co, Reston, VA, 1985. Verarbeitetes Getreide, welches als Tierfutter verwendet werden soll, kann mit einer wirksamen Menge der Enzyme in Form eines Animpfmittels oder eines probiotischen Zusatzstoffes, beispielsweise, oder in irgendeiner Form, die für die Verwendung bei Tierfuttermitteln auf dem Fachgebiet bekannt sind, behandelt werden. Es wird von den erfindungsgemäßen Enzymen erwartet, dass sie besonders nützlich sind bei der Entgiftung während des Verarbeitens und/oder bei Tierflitter vor dessen Verwendung, da die Enzyme ein relativ breites pH- Aktivitätsspektrum aufweisen. Die Esterase aus Exophiala spinifera, ATCC 74269, zeigte einen Aktivitätsbereich von etwa pH 3 bis etwa pH 6, und die Esterase aus dem Bakterium mit der Hinterlegungsnummer ATCC 55552 zeigte einen Aktivitätsbereich von etwa pH 6 bis etwa pH 9.

Beispiel 14

Gentechnisches Verändern ruminaler Mikroorganismen

Ruminale Mikroorganismen können gentechnisch verändert werden, so dass sie die Fumonisin-abbauenden Enzyme oder die AP&sub1;-Katabolase, die von Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovirens, ATCG 74270 oder dem Bakterium mit der Hinterlegungsnummer ATCC 55552 gebildet werden, oder eine Kombination dieser Enzyme enthalten und exprimieren. Das gentechnische Verändern von Mikroorganismen ist heutzutage eine bekannte Technik, und auf solche Weise veränderte ruminale Mikroorganismen können dem Futtermittel auf jede erdenkliche bekannte Weise zugesetzt werden, beispielsweise als ein probiotischer Zusatzstoff oder als ein Animpfmittel. Zusätzlich können Mikroorganismen, die als Bioreaktoren eingesetzt werden können, verändert werden, um auf diese Weise fähig zu sein, eine Massenherstellung entweder der Fumonisin-abbauenden Enzyme oder der AP&sub1;-Katabolase, die durch Exophiala spinifera, ATCC 74269, Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74270 oder dem Bakterium mit der Hinterlegungsnummer ATCC 55552 gebildet werden, durchzuführen.

(1) ALLGEMEINE ANGABEN

(i) ANMELDER: Duvick, Jon Rood, Tracy A.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN ZUR FUMONISINENTGIFTUNG
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Pioneer Hi-Bred International
(B) STRASSE: 700 Capital Square, 400 Locust Street
(C) STADT: Des Moines
(D) STAAT: IA
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 50309
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER Diskette
(B) COMPUTER IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS
(D) SOFTWARE: Microsoft Windows 3.1 - Notepad
(vi) ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) VERTRETER INFORMATION:
(A) NAME: Roth, Michael J.
(B) REGISTRIERUNGSNUMER: 29 342
(C) AKTENZEICHEN: 0272 U.S.
(ix) TELEKOMMUNIXATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 515-248-4895
(B) TELEFAX: 515-248-4934

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 32 Basen
(B) ART: Nukleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonde
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 37 Basen
(B) ART: Nukleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonde
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basen
(B) ART: Nukleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonde
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basen
(B) ART: Nukleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonde
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 76 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (teilweise)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basen
(B) ART: Nukleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGLE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonde
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basen
(B) ART: Nukleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonde
(iii) HYPOTHETISCH NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basen
(B) ART: Nukleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGlE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonde
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basen
(B) ART: Nukleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: Sonde
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 527 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID: 10:

Claims

1. Verfahren zur Entgiftung eines Fumonisins oder eines strukturell vewandten Mycotoxins, umfassend das Umsetzen des Fumonisins oder verwandten Mycotoxins mit einem von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC. 55552 produzierten, Fumonisin-abbauenden Enzym.

2. Verfahren zur Entgiftung eines Fumonisins, eines strukturell verwandten Mycotoxins, eines Fumonisinhydrolyseprodukts oder eines Hydrolyseprodukts eines strukturell verwandten Mycotoxins, umfassend das Umsetzen des Hydrolyseprodukts mit einer von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 produzierten AP&sub1;-Katabolase.

3. Verfahren zur Entgiftung eines Fumonisins oder eines strukturell verwandten Mycotoxins und zur Entgiftung eines Fumonisinhydrolyseprodukts oder eines Hydrolyseprodukts eines strukturell verwandten Mycotoxins, umfassend das Umsetzen des Fumonisins mit einem von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 produzierten, Fumonisin-abbauenden Enzym, und Umsetzen des Hydrolyseprodukts mit einer von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 produzierten AP&sub1;-Katabolase.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Fumonisin, das strukturell verwandte Mycotoxin, das Fumonisinhydrolyseprodukt oder das Hydrolyseprodukt eines strukturell verwandten Mycotoxins in geerntetem Getreide vorliegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Entgiftungsreaktion während der Lagerung des geernteten Getreides oder während der Verarbeitung des geernteten Getreides stattfindet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Enzym als ein Wasch- oder Sprühmittel angewendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Entgiftungsreaktion bei verarbeitetem Getreide stattfindet, welches als Tierfutter zu verwenden ist.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Getreide eine Getreideähre, Korn, welches von der Ähre entfernt wurde; geschnittene Weizenhalme; oder Gersten- oder Reiskörner ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das strukturell verwandte Mycotoxin AAL-Toxin ist und das Enzym das Fumonisin-abbauende Enzym ist, welches von Exophiala spinifera (ATCC 74269) produziert wird.

10. Verfahren zur Produktion eines von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 produzierten Fumonisin-abbauenden Enzyms, umfassend die Isolierung des Enzyms aus einer transgenen Pflanze, welche dieses exprimiert.

11. Verfahren zur Produktion einer von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 produzierten AP&sub1;-Kataboläse, umfassend die Isolierung des Enzyms aus einer transgenen Pflanze, welche dieses exprimiert.

12. Gentechnisch veränderter Mikroorganismus, umfassend einen zur Expression von Proteinen in Mikroorganismen fähigen Expressionsvektor, wobei dieser Vektor eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Fumonisin-abbauendes Enzym codiert, wie es von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 produziert wird.

13. Gentechnisch veränderter Mikroorganismus, umfassend einen zur Expression von Proteinen in Mikroorganismen fähigen Expressionsvektor, wobei dieser Vektor eine Nukleotidsequenz umfaßt, die die AP&sub1;-Katabolase codiert, wie sie von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 produziert wird.

14. Mikroorganismus nach Anspruch 12 oder 13, welcher ein ruminaler Mikroorganismus ist.

15. Eine probiotische Zusammensetzung oder eine Futtermittelanimpfzusammensetzung, umfassend einen gentechnisch veränderten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 12 bis 14.

16. Verfahren zur Identifizierung transformierter Pflanzenzellen unter Verwendung einer Fusarium-Spezies oder des Toxins, welches von Fusarium hergestellt wird, als phytotoxischen Marker, umfassend die Schritte:

(a) Züchten von Zellen oder Geweben aus einer ausgewählten Zielpflanze in einem Kulturmedium;

(b) Einführen in die Zellen der Kultur mindestens einer Kopie einer Expressionskassette, umfassend eine codierende Region, die ein Fumonisin-abbauendes Enzym codiert, wie es von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552 hergestellt wird, funktional verbunden mit Kontrollsequenzen, die es ermöglichen, die codierende Region in der Zelle zu transkribieren und zu translatieren;

(c) Einbringen des Fusarium oder des Toxins in das Kulturmedium; und

(d) Identifizieren der transformierten Zellen als die Zellen, die in der Kultur überleben.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Toxin Fumonisin ist oder ein strukturell verwandtes Mycotoxin.

18. Pilz, ausgewählt aus Exophiala spinifera (ATCC 74269) und Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270).

19. Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552.

20. Nukletoidsequenz, umfassend eine codierende Sequenz ausgewählt aus

(a) einer Sequenz, die codiert:

(i) die ESP1-Aminosäuresequenz aus SEQ ID No. 10; oder (ii) die BEST1-Aminosäuresequenz aus Fig. 2;

(b) eine Sequenz, welche mindestens 85% Homologie zu einer Sequenz aus (a) aufweist und ein Fumonisin- abbauendes Polypeptid codiert;

(c) eine Sequenz, welche fähig ist, mit einer Sequenz aus (a) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren und ein Fumonisin-abbauendes Polypeptid codiert; und

(d) ein Fragment einer Sequenz aus (a), (b) oder (c), wobei dieses Fragment ein Fumonisin-abbauendes Polypeptid codiert.

21. Nukleotidsequenz nach Anspruch 20, welche eine DNA- oder RNA-Sequenz ist.

22. Nukleotidsequenz nach Anspruch 20, wobei die Sequenz aus

(a) (ii) die DNA-Sequenz der Fig. 1 ist.

23. Polypeptid, codiert durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 20, 21 oder 22.

24. Expressionskassette umfassend (a) eine codierende Sequenz nach Anspruch 20, 21 oder 22; und (b) Kontrollsequenzen, die funktional mit der codierenden Sequenz verbunden sind und deren Transkription und Translation in einer Wirtszelle ermöglichen.

25. Expressionskassette nach Anspruch 24, umfassend einen Promotor, der fähig ist, die Expression entweder (a) konstitutiv in den Zellen einer Pflanze oder (b) in bestimmten Geweben einer Pflanze zu steuern.

26. Expressionsvektor, umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 24.

27. Durch einen Vektor nach Ansprüch 26 transformierte Wirtszelle.

28. Zelle nach Anspruch 27, welche eine Pflanzenzelle ist.

29. Zelle nach Anspruch 27, welche ein Baculovirus/Insektenzellenexpressionssystem ist, welches mit einem Vektor nach Anspruch 25 transformiert ist, wobei die Expressionskassette eine codierende Sequenz nach Anspruch 22 umfaßt:

30. Zelle nach Anspruch 28, welche eine Mais-, Tomaten-, Sojabohnen-, Alfalfa-, Reis-, Klee-, Kohl-, Bananen-, Kaffee-, Sellerie-, Tabak-, Langbohnen-, Baumwolle-, Melonen- oder Pfefferzelle ist.

31. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 23, umfassend das Züchten einer Zelle nach Anspruch 28, unter Bedingungen, bei denen das Polypeptid exprimiert wird.

32. Verfahren zur Entgiftung eines Fumonisins oder eines strukturell verwandten Mycotoxins, umfassend das Umsetzen des Fumonisins oder des verwandten Mycotoxins mit einem Polypeptid nach Anspruch 23.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Entgiftungsreaktion während der Lagerung des geernteten Getreides oder während der Verarbeitung des geernteten Getreides stattfindet.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Enzym als ein Wasch- oder Sprühmittel angewendet wird.

35. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, wobei die Entgiftungsreaktion bei verarbeitetem Getreide stattfindet, welches als tierisches Futter zu verwenden ist.

36. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das strukturell verwandte Mycotoxin AAL-Toxin ist und das Enzym ein Polypeptid ist, welches von der Nukleotidsequenz aus Fig. 1 codiert wird.

37. Zelle nach Anspruch 27, welche ein Mikroorganismus ist.

38. Zelle nach Anspruch 37, welche ein ruminaler Mikroorganismus ist.

39. Probiotische Zusammensetzung oder Futtermittelanimpfzusammensetzung, umfassend einen Mikroorganismus nach Anspruch 37 oder 38.

40. Verfahren zur Identifizierung einer transformierten Pflanzenzelle unter Verwendung einer Fusarium-Spezies oder des Toxins, das durch Fusarium hergestellt wird, als phytotoxischen Marker, umfassend die Schritte:

(a) Züchten der Pflanzenzelle nach Anspruch 28 oder 30 in einem Kulturmedium;

(b) Einbringen des Fusarium oder des Toxins in das Kulturmedium; und

(c) Identifizierung transformierter Zellen als die Zellen, welche in Kultur überleben.

41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Toxin ein Fumonisin oder ein strukturell verwandtes Mycotoxin ist.

42. Fumonisin-abbauendes Enzym, erhältlich von Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552.

43. Verfahren zur Herstellung eines Fumonisin-abbauenden Enzyms nach Anspruch 42 durch Isolieren dieses Enzyms aus Exophiala spinifera (ATCC 74269), Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) oder dem Bakterium mit der Stammnummer ATCC 55552.

44. Fumonisinesteraseenzym, enthaltend eine ATLM-Aminosäuredomäne und eine TNI-Aminosäuredomäne.

45. Verfahren zur Entgiftung eines Fumonisins oder strukturell verwandten Mycotoxins, umfassend das Umsetzen des Fumonisins oder des verwandten Mycotoxins mit einer Fumonisinesterase nach Anspruch 44.

46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei das Fumonisin, das strukturell verwandte Mycotoxin, das Fumonisinhydrolyseprodukt oder das Hydrolyseprodukt eines strukturell verwandten Mycotoxins in geerntetem Getreide vorliegt.

47. Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, wobei die Entgiftungsreaktion während der Lagerung des geernteten Getreides oder während der Verarbeitung des geernteten Getreides stattfindet.

48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei das Enzym als Wasch- oder Sprühmittel angewendet wird.

49. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 48, wobei das Getreide eine Getreideähre, Korn, welches aus der Ähre entfernt wurde; geschnittene Weizenhalme; oder Gersten- oder Reiskörner ist.

50. Mikroorganismus, umfassend einen Expressionsvektor, der zur Expression von Proteinen in Mikroorganismen fähig ist, wobei dieser Vektor eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Enzym nach Anspruch 42 codiert.

51. Mikroorganismus nach Anspruch 50, welcher ein ruminaler Mikroorganismus ist.

52. Probiotische Zusammensetzung oder Futtermittelanimpfzusammensetzung, umfassend einen Mikroorganismus nach Anspruch 50 oder 51.

53. Verfahren zur Identifizierung transformierter Pflanzenzellen unter Verwendung einer Fusarium-Spezies oder des Toxins, welches von Fusarium produziert wird, als phytotoxischen Marker, umfassend die Schritte:

(b) Einführen in die Zellen der Kultur mindestens einer Kopie einer Expressionskassette, umfassend eine codierende Region, die ein Enzym nach Anspruch 42 codiert, funktional verbunden mit Kontrollsequen zen, die es ermöglichen, daß die codierende Region in der Zelle transkribiert und translatiert wird;

(c) Einbringen des Fusarium oder des Toxins in das Kulturmedium; und

(d) Identifizieren transformierter Zellen als die Zellen, die in der Kultur überleben.

54. Nukleotidsequenz, umfassend eine codierende Sequenz, welche ein Enzym nach Anspruch 42 codiert.

55. Nukleotidsequenz nach Anspruch 54, welche eine DNA- oder RNA-Sequenz ist.

56. Expressionskassette, umfassend (a) eine codierende Sequenz nach Anspruch 54 oder 55; und (b) Kontrollsequenzen, die funktional mit der codierenden Sequenz verbunden sind und deren Transkription und Translation in der Wirtszelle ermöglichen.

57. Expressionskassette nach Anspruch 56, umfassend einen Promotor, der fähig ist, die Expression entweder (a) konstitutiv in den Zellen einer Pflanze, oder (b) in spezifischen Geweben einer Pflanze zu steuern.

58. Expressionsvektor, umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 57.

59. Wirtszelle, transformiert durch einen Vektor nach Anspruch 58.

60. Zelle nach Anspruch 59, welche eine Pflanzenzelle ist.

61. Zelle nach Anspruch 60, welche eine Mais-, Tomaten-, Sojabohnen-, Alfalfa-, Reis-, Klee-, Kohl-, Bananen-, Kaffee-, Sellerie-, Tabak-, Langbohnen-, Baumwolle-, Melonen- oder Pfefferzelle ist.

62. Verfahren zur Produktion eines Polypeptids nach Anspruch 42, umfassend das Züchten einer Zelle nach Anspruch 59 unter Bedingungen, bei denen das Polypeptid exprimiert wird.