PT775211E - Enzimas para a desintoxicacao provocada pelas fumonisinas - Google Patents

Description

Descrição “Enzimas para a desintoxicação provocada pelas fúmonisinas” A presente invenção é uma continuação parcial do anterior pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente com o número de série 08/289 595 depositado a 12 de Agosto de 1994.

Campo Técnico A presente invenção refere-se genericamente à detecção e ao isolamento de organismos resistentes à fumonisina e às composições e métodos para a desintoxicação ou para a degradação in vivo da fumonisina. Este método tem uma grande aplicação em biotecnologia agrícola, na agricultura de plantas produtivas e na melhoria da qualidade alimentar dos cereais.

Antecedentes da invenção

As doenças fúngicas são problemas frequentes na agricultura de plantas produtivas. Foram já dados passos largos no combate às doenças das plantas, conforme exemplificado pela utilização de plantas híbridas, pesticidas e melhores práticas agrícolas. No entanto, conforme qualquer agricultor ou jardineiro pode confirmar, os problemas relacionados com as doenças fúngicas das plantas continuam a impor dificuldades à criação de plantas. Assim, há uma necessidade permanente de novos métodos e materiais para resolver os problemas provocados pelas doenças fúngicas das plantas. Estes problemas podem ser atacados de diversas maneiras. Por exemplo, é possível controlar os organismos infecciosos graças à utilização de agentes que sejam selectivamente biocidas para os agentes patogénicos. Outro método consiste em interferir com o mecanismo segundo o qual o agente patogénico invade a planta produtiva hospedeira. Um outro método, no caso dos agentes patogénicos que provocam a perda de colheitas, é a interferência com o mecanismo segundo o qual o agente patogénico provoca lesões à planta produtiva hospedeira. Há ainda um outro método, no caso dos agentes patogénicos produtores de toxinas indesejáveis para os mamíferos ou para outros animais que se alimentem com as referidas plantas produtivas, que consiste em interferir com a produção, com a armazenagem ou com a actividade da toxina. A presente invenção insere-se no domínio destas duas últimas categorias.

Desde que foram descobertas e explicada a sua estrutura em 1988 (Bezuidenhout S., Gelderblom W., Gorst-Allman C., Horak R., Marasas W., Spiteller B., Vleggaar R. (1988) “Structure elucidation of the fumonisins, mycotoxins ffom Fusarium mortiliforme” Journal Chem. Soc., Chem. Commun. 1988: 743-745), as fumonisinas têm sido consideradas como um problema potencialmente grave na alimentação de animais com milho. As fumonisinas estão relacionadas com diversas toxicoses dos animais, incluindo a leucoencefalomalacia (Marasas WFO, Kellerman TS, Gelderblom WCA, Coetzer JAW, Thiel P (1988) “Leuko-encephalomalacia in a horse induced by fumonisin B-l isolated ffom Fusarium moniliforme” Onderstepoort Journal of Veterinary Research 55: 197-204; Wilson TM, Ledet AE, Owens DL, Rice LG, Nelson HA (1990) “Experimental liver disease in ponies associated with the ingestion of a com-based ration naturally contaminated with fumonisin B,’\ American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians: Abstracts 33rd Annual Meeting, Denver, Colorado, 7-9 de Outubro de 1990, Madison, Wisconsin, E.U.A.) e com o edema pulmonar dos suínos (Colvin BM, Harrison LR (1992) “Fumonisin-lnduced

Pulmonary Edema and Hydrothorax in Swine” Mycopathologia 117: 79-82), admitindo-se também que possam ser agentes carcinogénicos (Geary W (1971) Coord Chem Rev 7: 81; Gelderblom WCA, Kriek NPJ, Marasas WFO, Thiel PG (1991) “Toxicity and Carcinogenicity of the Fusarium-Moniliforme Metabolite, Fumonisin-Bl, in Rats” Carcinogenesis 12: 1247-1251; Gelderblom WCA, Semple E. Marasas WFO, Farber E (1992) “The Cancer-Initiating Potential of the Fumonisin-B Mycotoxins” Carcinogenesis 13: 433-437). Os isolados de Fusarium no capítulo Liseola produzem fumonisinas em cultura segundo níveis que vão desde 2 até >4000 ppm (Leslie J, Plattner R. Desjardins A. Klittich C (1992) “Fumonisin BI production by strains from different mating populations of Gibberella fujikoroi {Fusarium section Liseola)” Phytopathology 82: 341-345). Os isolados obtidos a partir de milho (predominantemente a população A na fase de acasalamento) estão entre os produtores mais importantes (Leslie et ai, supra). Os níveis de fumonisina detectados no milho produzido em searas flutuaram dentro de limites bastante amplos, consoante o local da plantação e a estação do ano, mas tanto os levantamentos realizados antes das colheitas como os realizados após as colheitas do milho das searas indicaram a existência de elevados níveis potenciais de fumonisinas (Murphy PA, Rice LG, Ross PF (1993) “Fumonisin-Bl, Fumonisin-B2 and Fumonisin-B3 content of Iowa, Wisconsin and Illinois com and com screenings” J. Agr. Food Chem. 41: 263-266). Estudos realizados com alimentos e produtos alimentares permitiram detectar também a existência de fumonisinas (Holcomb M, Thompson HC Jr., Hankins LJ (1993) “Analysis of fumonisin B-l in rodent feed by gradient elution HPLC using precolumn derivation with FMOC and fluorescence detection” J. Agr. Food Chem. 41: 764-767; Hopmans EC, Murphy PA (1993) “Detection of Fumonisin B(l), Fumonisin-B(2) and Fumonisin-B(3) and hydrolyzed Fumonisin-B(l) in Com-Containing foods'5 J. Agr. Food Chem. 41: 1655- -1658; Sydenham EW, Shepard GS, Thiel PG, Marasas WFO, Stockenstrom S (1991) “Fumonisin Contamination of Commercial Com-Based Human Foodstuffs” J. Agr. Food Chem. 39: 2014-2018). A etiologia do fungo Fusarium das espigas ainda não está perfeitamente explicada, embora se saiba que as lesões físicas das espigas e determinadas condições ambientais possam contribuir para a sua ocorrência (Nelson PE (1992) “Taxonomy and Biology of Fusarium moniliformé” Mycopathologia 117: 29-36). O Fusarium pode ser isolado a partir da maior parte dos tipos de milho das searas, mesmo quando não houver nenhum fungo visível. A relação entre as infecções das plantas jovens e os talos e as doenças das espigas provocadas pelo Fusarium não é evidente. Foi já detectada resistência genética aos fungos visíveis nos grãos (GendloffE, Rossman E, Casale W, Isleib T, Hart P (1986) “Components of resistance to Fusarium ear rot in field com” Phytopathology 76: 684-688; Holley RN, Hamilton PB, Goodman MM (1989) “Evaluation of tropical maize germplasm for resistance to kemel colonization by Fusarium moniliformé” Plant Dis. 73: 578-580), mas ainda não foi esclarecida a relação entre os fungos visíveis e a produção de fumonisina.

Comprovou-se já que as fumonisinas, em estudos efectuados com células de mamíferos in vitro, inibem a biossíntese dos esfmgolípidos, graças à inibição da enzima esfinganina-acil--transferase (Norred WP, Wang E. Yoo H, Riley RT, Merrill .AH (1992) “In vitro toxicology of fumonisins and the mechanistic implications” Mycopathologia 117: 73-78; Wang E, Norred W, Bacon C, Riley R, Merrill A Jr. (1991) “Inhibition of sphingolipid biosynthesis by fumonisins: implications for diseases associated with Fusarium monilifòrme’' J. Biol. Chem. 266: 14486; Yoo HS, Norred WP, Wang E, Merrill AH, Riley RT (1992) “Fumonisin Inhibition of de Novo Sphingolipid Biosynthesis and Cytotoxicity Are Correlated in LLP-PK1 Cells” Toxicol. Appl. Pharmacol. 114: 9-15), dando origem a acumulação da esfmganina precursora. É provável que a inibição deste circuito seja responsável pelo menos por alguma da toxicidade das fumonisinas, havendo fundamentos para tal conclusão, resultantes de medições das proporções de esfinganina: esfingosina em animais alimentados com fumonisinas purificadas (Wang E, Ross PF, Wilson TM, Riley RT, Merrill AH (1992) “Increases in Serum Sphingosine and Sphinganine and Decreases in Complex Sphingolipids in Ponies Given Feed Containing Fumonisins, Mycotoxins Produced by Fusarium moniliforme” J. Nutr. 122: 1706-1716). As fumonisinas também afectam o crescimento das células das plantas (Abbas HK, Boyette CD (1992) “Phytotoxicity of fumonisin B| on weed and crop species” Weed Technol. 6: 548-552; Vanasch MAJ, Rijkenberg FHJ, Coutinho TA (1992) “Phytotoxicity of fumonisin B1, moniliformin and t-2 toxin to com callus cultures” Phytopathology 82: 1330-1332; Vesonder RF, Peterson RE, Labeda D, Abbas HK (1992) “Comparative phytotoxicity of the fumonisins, AAL-Toxin and yeast sphingolipids in Lemna minor L. (Duckweed)” Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23: 464-467). Kuti et al. “Effect of fumonisin BI on virulence of Fusarium species isolated from tomato plants” (Abstract, Annual Meeting American Phytopathological SOciety, Memphis, TN: APS Press 1993) descreveram a capacidade das fumonisinas acrescentadas por via exógena para acelerarem o desenvolvimento de doenças e para aumentar a espomlação do Fusarium moniliforme e do F Oxysporum no tomate. A toxicidade das fumonisinas e o seu potencial de disseminação nos alimentos e rações faz com seja imprescindível desenvolver estratégias de desintoxicação ou de eliminação para remover o composto da cadeia alimentar.

Descrição da Invenção A presente invenção baseia-se na descoberta de organismos com capacidade para degradar a micotoxina fumonisina. Numa pesquisa sobre meios biológicos para a desintoxicação 6 i .·' J' /*1 provocada pelas fumonisinas, isolámos a partir de grãos de milho das searas diversos hipo-micetes dematiáceos capazes de crescerem em fumonisina Bi ou B2 (FBi ou FB2) enquanto fonte única de carbono, degradando-a parcial ou totalmente no processo. Uma espécie, identificada como sendo Exophiala spinifera, uma “levedura negra”, foi recuperada a partir de sementes de milho oriundo de diversos locais do sudeste e da região meridional central dos Estados Unidos da América do Norte. Isolou-se uma espécie congénere, Rhinocladiella atrovirens, a partir de sementes provenientes dos estados de Iowa e Georgia. Também isolámos uma bactéria, eventualmente pertencente a uma das espécies de Xanlhomonas ou Sphingomonas, que recebeu a designação de isolado 2412.1, a partir de amostras de talos de milho das searas da região de Johnston, Iowa. Também se comprovou que esta bactéria crescia em FBI enquanto fonte única de carbono; uma vez que a sua taxonomia não está perfeitamente esclarecida, depositámos esta estirpe na Colecção Americana de Culturas Tipo “American Type Culture Collection (ATCC)” e doravante identificá-la-emos aqui pelo número 55552 com que foi depositada na ATCC. Também depositámos estirpes de Exophiala spinifera (ATCC 74269) e de Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74270) enzimaticamente activas.

Todos os isolados revelaram capacidade para degradar a FBI numa cultura em meio líquido. O termo “degradai” significa simplesmente que a enzima é capaz de utilizar a fumonisina como substrato e convertê-lo numa estrutura química diferente. No entanto, os nossos estudos comprovam que os compostos resultantes são menos tóxicos do que as próprias fumonisinas.

Em termos gerais, apenas 16 das 70 amostras independentes de sementes que foram testadas continham os agentes degradativos. No entanto, comprovou-se também que diversos isolados de E. spinifera, obtidos fora dos Estados Unidos da .América do Norte, a partir de outras tontes diferentes do milho, metabolizavam as fumonisinas. Verificou-se que havia 7 isolados representativos de outras espécies de Exophiala que foram testados (E. jeanselmi, E. salmonis, E. piscifera) que não degradavam as fumonisinas, nem tampouco os isolados de Rhinocladiella, incluindo R. atrovirens e R anceps, nem os fungos associados às doenças das espigas, incluindo Fusarium moniliforme, F. graminearum, Aspergillus fla\nis e Diphdia maydis. Descobriu-se que as leveduras negras que metabolizam as fumonisinas possuem uma acti-vidade hidrolase induzivel que cliva os ésteres tricarbilato de FBi, conforme comprovado por cromatografia de camada fina (CCF) em Qg e pela detecção de aminas pela fluorescência. A identidade do composto aminoalcoolado resultante, designado por APi, foi verificada por espectroscopia de massa por bombardeamento atómico rápido (EM-BAR). Este último composto é útil como indicador químico do metabolismo das fumonisinas. As culturas de E. Spinifera metabolizaram ainda mais o produto APi, dando origem a compostos de identidade desconhecida que não foram detectáveis pelos reagentes aminados na CCF. Em câmaras de cultura perfeitamente fechadas, a E. spinifera a crescer em 14C-FB, enquanto fonte única de carbono, libertou 14CC>2 que foi detectado em fitas de papel de filtro saturado com KOH IN, atingindo em 48 horas uma percentagem do marcador acrescentado. As culturas aniquiladas termicamente, incubadas de modo idêntico, não libertaram quantidades apreciáveis de l4CC>2. Assim sendo, há pelo menos uma fracção da fumonisina que é totalmente metabolizada por este fungo. Os filtrados das culturas impuras, isentas de células, do isolado de E. Spinifera designado por 2141.10, continham uma actividade de hidrolase sensível às proteases, termicamente instável, atribuída a uma enzima caracterizada empiricamente como sendo uma esterase com especificidade para os ésteres tricarbalilato de fumonisinas e moléculas semelhantes, tais como a toxina AAL de Alternaria altemata lycopersici. Admite-se que esta esterase purificada seja uma nova entidade química, na medida em que nenhuma das esterases comercialmente

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disponíveis entretanto testadas foram capazes de hidrolisar os ésteres tricarbalilato de FBI; sugerindo tal facto a existência de uma nova especificidade enzimática produzida por estes fungos. Os extractos do isolado 2141.10 de E. Spinifera, isentos de células, também continham uma APrcatabolase capaz de converter a substância AP[ num composto ao qual falta um grupo amina livre, possivelmente um aldeído. Estas enzimas e genes que codificam tais enzimas, estando implicados na degradação da fumonisina, são úteis para desintoxicar sementes de milho antes ou após as colheitas.

Descrição abreviada dos desenhos A figura 1 é uma sequência nucleotídica que contém o quadro de leitura ininterrupta que codifica o gene da esterase bacteriana (bases 94 a 1683). A figura 2 é uma sequência hipotética de aminoácidos do polipeptido codificado pelas bases 94 a 1683 da sequência nucleotídica da figura 1. Os resíduos 1-38 representam a sequência de sinal putativa. O polipeptido que contém a sequência de sinal possui um peso molecular calculado igual a 55026,68 (529 resíduos) com um valor pi calculado igual a 8,70. O polipeptido sem a sequência de sinal putativa tem um peso molecular calculado igual a 51495,63 (491 resíduos) com um valor pl calculado igual a 8,19.

Descrição minuciosa da invenção A presente invenção proporciona enzimas recentemente descobertas, capazes de degradarem as fúmonisinas e de realizaram a desintoxicação por elas provocada, sendo tais enzimas produzidas por fermentação de um ou vários dos microrganismos Exophiala spinifera, ATCC 74269 e Rhinocladiella airovirem. ATCC 74270, ou pela bactéria com o número ATCC 55552. A invenção proporciona também métodos para a produção de enzimas capazes de realizarem js ^ & a desintoxicação provocada pelas fumonisinas, os quais compreendem o passo que consiste em criar um ou vários microrganismos seleccionados entre Exophiala spinifera, ATCC 74269 e Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74270, ou a bactéria com o número ATCC 55552, na presença de uma fumonisina ou do metabolito produzido por acção da enzima sobre uma fúmonisina. A presente invenção proporciona ainda métodos para realizar a desintoxicação provocada pelas fumonisinas, os quais compreendem o passo que consiste em fazer reagir as fumonisinas com uma enzima obtida a partir de Exophiala spinifera, ATCC 74269 e Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74270, ou com a bactéria com o número ATCC 55552.

Efectuámos o isolamento e a sequenciação do gene que codifica a enzima que degrada as fumonisinas, a partir de um destes organismos, e apresentamos aqui a sequência de amino-ácidos dessa enzima. Sabe-se que os genes que codificam as proteínas pretendidas podem ser identificados, isolados, clonados e expressos em organismos transgénicos, incluindo diversas plantas importantes de culturas produtivas. O método vulgaimente utilizado para a transferência de genes em plantas implica a utilização de uma forma desarmada do plasmídeo Ti da bactéria Agrobacterium tumefaciens existente nos solos. A bactéria A. tumefaciens é um agente pato-génico das plantas que provoca os tumores cecidianos das copas das plantas infectadas. Plasmídeos grandes, conhecidos pela designação de plasmídeos Ti, ou indutores de tumores, são responsáveis pela oncogenicidade das bactérias e também pela transferência de ADN exógeno para a planta. De igual modo, o microrganismo A. rhizogenes contém plasmídeos Ri, também designados por indutores das raízes, que induzem o crescimento das raízes. Qualquer destes tipos de plasmídeos possui uma região vir, ou de virulência, que tem de ser funcional para que haja uma transformação das células de tipo natural em células tumorais. A transformação tem como consequência a integração de outra parcela plasmídica. designada por ADN-T ou ADN de transferência, no genoma nuclear das células transformadas. Os plasmídeos Ri e Ti podem ser manipulados de modo a permitirem a inserção de ADN exógeno, que codifica uma proteína desejada, dentro da região ADN-T (o mesmo que T--DNA). O ADN exógeno pode ser transferido quer através de um vector que transporte simultaneamente o gene vir e o gene exógeno, quer por meio de um sistema vectorial binário constituído por dois plasmídeos, um deles contendo o gene vir e o outro transportando o gene exógeno. Ver, v.g., a patente de invenção norte-americana n° 4 658 082. As células vegetais transformadas podem ser depois regeneradas para produzirem variedades portadoras do gene inserido. A produção de plantas transgénicas resistentes à fumonisina irá constituir uma forma útil e nova de resolver o problema do combate às doenças das plantas induzidas pelo Fusarium. A presente invenção proporciona também um mecanismo para a selecção de transfor-mantes: o crescimento das células vegetais na presença de um tipo de Fusarium ou da sua micotoxina favorece a sobrevivência das células vegetais que tenham sido transformadas de modo a exprimirem a sequência codificante que codifica a enzima da presente invenção e que degrada a toxina. Assim sendo, é possível utilizar a própria sequência codificante que codifica a enzima da presente invenção como um marcador seleccionável ou como um marcador mensurável, através da medição da formação do metabolito aminoalcoolado.

Outra variante da presente invenção visa um arquétipo de ADN que compreende uma cassete de expressão constituída por: a) uma sequência de ADN codificante de um polipeptido capaz de degradar uma fumonisina; e b) as sequências de controlo que estão funcionalmente ligadas à sequência codificante, pelo que a sequência codificante pode ser transcrita e traduzida numa célula hospedeira. S·"; 11 sendo pelo menos uma das sequências de ADN codificantes ou uma das sequências de controlo heteróloga relativamente à célula hospedeira.

Os casos preferidos da presente invenção são aqueles em que uma célula hospedeira é estavelmente transformada por um arquétipo de ADN. conforme descrito antes; e um método para a produção de um polipeptido de um gene recombinante, o qual compreende os passos seguintes: a) obter uma população de tais células hospedeiras; e b) criar a população de células em condições que levem à expressão do polipeptido codificado pela sequência codificante da cassete de expressão.

Ainda, de acordo com outra variante, a presente invenção visa uma planta transgénica capaz de degradar uma fumonisina. Segundo outra variante, a planta transgénica é uma planta de milho capaz de degradar uma fumonisina. Ainda de acordo com uma outra variante da presente invenção, esta proporciona um método para conferir a uma planta resistência às fumonisinas, em que tal planta praticamente não possui tal resistência, consistindo tal método em transferir para a planta um gene expressável que codifique um polipeptido capaz de degradar essas fumonisinas.

Assim, um ADN que codifique uma proteína capaz de inactivar uma fumonisina pode ser isolado e clonado num vector adequado e inserido num organismo normalmente sensível ao Fusarium ou às suas toxinas. Os organismos que exprimam o gene podem ser identificados facilmente pela sua capacidade para degradarem as fumonisinas. A proteína capaz de degradar uma fumonisina pode ser isolada e caracterizada utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade. Além disso, o gene que confere resistência às fumonisinas pode ser transferido para um plasmídeo conveniente, por exemplo, para dentro de uma região ADN-T de qualquer 12 fTt dos plasmídeos Ti ou Ri das bactérias existentes no solo, respectivamente Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Os tecidos das plantas podem ser inoculados com a bactéria transformada. Em complemento, os tecidos de plantas que tenham sido cultivados conjuntamente com Agrobacterium spp. podem ser incubados na presença de uma fumonisina para efeitos de selecção das plantas transgénicas que degradam as fumonisinas, isto é, o gene para a degradação das fumonisinas pode servir de marcador seleccionável. Posto isto, o tecido inoculado é regenerado para produzir plantas transgénicas que degradam as fumonisinas.

Além do mais, a presente invenção diz respeito a microrganismos que tenham sido concebidos por técnicas da engenharia genética com os genes que conferem resistência às fumonisinas. Tais microrganismos ruminais, concebidos por técnicas da engenharia genética, podem ser então acrescentados às rações que irão ser consumidas por animais sensíveis às fumonisinas e às micotoxinas estruturalmente afins.

Aplicabilidade industrial

Na prática da presente invenção utilizar-se-á, salvo quando especificado de outro modo, técnicas convencionais da botânica, da microbiologia, da cultura de tecidos, da biologia molecular, da química, da bioquímica e da tecnologia do ADN recombinante, sendo todas estas matérias do conhecimento dos técnicos especialistas. Tais técnicas vêm completamente explicadas na literatura (ver v.g. J. H. Langenheim e K. V. Thimann, Botany: Plant Biology and Its relation to Human Affairs (1982) John Wiley; Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 1 (I. K. Vasil, ed. 1984); R. V. Stanier, J. L. Ingraham, M. L.

Wheelis e P. R. Painter, The Microbial World (1986) 5a Ed., Prentice-Hall; O. D. Dhringra e J. B. Sinclair. Basic Plant Pathology Methods, (1985) CRC Press; Maniatis. Fritsch & gs' 13

Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Vols. I e II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nuclek Acid Hybrídization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); e a série Methods in Enzyrnology (S. Colowick e N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.).

Na memória descritiva da presente invenção são utilizados os termos adiante indicados e que correspondem às definições aqui explicitadas. O termo “micróbio” designa qualquer microrganismo (incluindo tanto os microrganismos eucarióticos como os procarióticos), tais como fungos, leveduras, bactérias, actinomicetes, algas e protozoários, e bem assim outras estruturas unicelulares que possam ser criadas em cultura. A expressão “micróbio produtor de fumonisina” designa qualquer micróbio capaz de produzir a micotoxina fumonisina ou os seus análogos. Tais micróbios são geralmente membros do género fúngico Fusarhim, e bem assim os organismos obtidos por via recombinante que tenham sido alterados geneticamente de modo a serem capazes de produzir fumonisina ou os seus análogos. A expressão “que degrada a fumonisina” significa qualquer modificação da molécula da fumonisina que tenha como consequência uma diminuição ou uma perda da sua actividade tóxica. Tal alteração pode compreender a clivagem de qualquer das diversas ligações, uma oxidação, uma redução, a adição ou a supressão de um radical químico ou qualquer outra modificação que afecte a actividade da molécula. De acordo com uma variante preferencial, a modificação em causa compreende a hidrólise da ligação éster existente na molécula, num primeiro passo.

Ademais, uma fumonisina alterada por via química pode ser isolada a partir de culturas V /<.

S 14 de micróbios que produzam uma enzima da presente invenção, por exemplo, criando tais organismos em meios que contenham íumonisina marcada radioactivamente, seguindo o curso do marcador e isolando a toxina degradada para estudo posterior. A íumonisina degradada pode ser comparada com o composto activo em termos da sua fítotoxicidade ou da sua toxicidade em mamíferos de espécies sensíveis conhecidas, por exemplo, suínos e equinos. Os ensaios de toxicidade são conhecidos na especialidade. Por exemplo, no caso das plantas é possível realizar um bioensaio com folhas inteiras, segundo o qual as soluções do composto activo e do composto inactivo são aplicadas sobre as folhas das plantas sensíveis. As folhas podem ser tratadas in situ ou, em alternativa, também é possível utilizar folhas excisadas. É possível avaliar a toxicidade relativa dos compostos estabelecendo uma escala gradual de classificação das lesões provocadas nos tecidos das plantas e medindo então o tamanho das lesões formadas num determinado intervalo de tempo. É possível realizar outros ensaios conhecidos, ao nível celular, utilizando para tal metodologias convencionais de cultura de tecidos, v.g. recorrendo a culturas de células em suspensão. A expressão “micotoxina estruturalmente afim” designa qualquer micotoxina que tenha uma estrutura química congénere da estrutura de uma íumonisina, tal como a fumonisina Bl, por exemplo, a toxina AAL, a fumonisina B2, a fumonisina B3, a fumonisina B4, a fumonisina Cl, as fumonisinas AI e A2 e seus análogos e bem assim outras micotoxinas que possuam estruturas químicas semelhantes para as quais se preveja que possa ter lugar a correspondente desintoxicação pela actividade das enzimas degradativas das fumonisinas, produzidas por Exophiala spinifera, ATCC 74269 e Rhinocladiella atrovirem, ATCC 74270 ou pela bactéria com o número ATCC 55552. A expressão “cereais colhidos” refere-se a qualquer tipo de cereal que tenha sido de alguma forma retirado do ambiente onde foi gerado e produzido. Por exemplo, os cereais colhidos podem ser uma espiga de milho ou os grãos de milho retirados da espiga ou podem ser as plantas de trigo cortadas ou os grãos de cevada ou de arroz e não só. Os cereais colhidos podem estar guardados em celeiros ou podem estar a ser transformados industrialmente. A expressão “cereais transformados industrialmente,, designa os cereais que tenham experimentado qualquer forma de transformação industrial e que venham a ser utilizados para a produção de alimentos para o consumo humano ou que venham a ser utilizados como rações para animais. A expressão “planta transgénica” designa qualquer planta ou célula vegetal que tenha sido transformada pela introdução ou incorporação estável e hereditária, na planta ou célula vegetal em causa, de ADN exógeno, isto é, ADN que codifique uma proteína que normalmente não existe nessa espécie vegetal. O termo “plântula” designa uma planta suficientemente desenvolvida para ter um rebento e uma raiz e que seja assexualmente reproduzida por cultura celular. O termo “explante” designa uma secção ou uma parcela de um tecido, retirada de qualquer parte de uma planta para cultura. O termo “hormona” designa qualquer agente regulador do crescimento das plantas que afecte o crescimento ou a diferenciação das células vegetais. Como exemplos de tais hormonas refere-se as seleccionadas entre citoquininas, auxinas e giberelinas e também outras substâncias capazes de afectarem as células vegetais.

Os termos “calo” e o seu plural “calos” referem-se a um grupo desorganizado de células formadas em resposta a um corte, maus tratos ou qualquer outro tipo de lesão de que tenha sido alvo o tecido da planta. As parcelas excisadas do tecido da planta e as células isoladas podem ser induzidas de modo a formarem um calo em condições de cultura adequadas. 16 O calo pode ser mantido em cultura durante um período considerável, transferindo, ou criando em subcultura, partes desse calo para um meio renovado a intervalos regulares. A transferência do calo para um meio líquido leva à dispersão do tecido e à formação de uma cultura de células vegetais em suspensão. O calo pode ser induzido a experimentar o desenvolvimento organizado para formar rebentos e raízes. O termo “embrióide” designa uma estrutura de aspecto semelhante ao de um embrião zigótico da planta.

As expressões “híbrido somático” e “hibridação somática” referem-se genericamente à combinação estável de material celular, quer se trate de combinações de tipo protoplasto/ /protoplasto ou protoplasto/citoplasto, e compreende os termos ‘cíbrido’ e ‘cíbridação’. O termo “replicão” designa qualquer elemento genético (y.g. um plasmídeo, um cromossoma ou um vírus) que funcione como uma unidade autónoma de replicação de ADN in vivo, isto é, capaz de replicação sob o seu próprio controlo. O termo “vector” designa um replicão, tal como um plasmídeo, um bacteriofago ou um cosmídeo, ao qual é possível acoplar outro segmento de ADN por forma a realizar a replicação do segmento acoplado.

Tal como aqui utilizada, a expressão “sequência nucleotídica” designa uma sequência ou molécula de ADN ou de ARN e pode compreender, por exemplo, uma sequência de ADNc, de ADN genómico ou de ADN sintético, um gene estrutural ou um seu fragmento ou uma sequência de ARNm que codifique um polipeptido activo ou funcional. A expressão “sequência de ADN codificante” designa uma sequência de ADN que é transcrita e traduzida dentro de um polipeptido in vivo quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras adequadas. As fronteiras da sequência codificante são determinadas T7 por um codão de arranque no terminal 5’ (terminal amino) e por um codão de paragem da tradução no terminal 3’ (terminal carboxi). Uma sequência codificante pode compreender, sem que isso constitua nenhuma limitação, sequências procarióticas, sequências de ADNc provenientes de ARNm eucariótico, sequências de ADN genómico provenientes de ADN eucariótico (v.g. de mamíferos) e também sequências de ADN sintético. Um sinal de poli-adenilação e uma sequência de terminação da transcrição irão estar normalmente localizados para 3’ relativamente à sequência codificante. A expressão “sequência promotora” designa uma região de ADN reguladora que é capaz de ligar a polimerase do ARN numa célula e iniciar a transcrição de uma sequência codificante para jusante (no sentido de 3’). Para efeitos de definição da presente invenção, a sequência promotora está ligada no seu terminal 3’ pelo codão de arranque da tradução (ATG) de uma sequência codificante e prolonga-se para montante (no sentido de 5’) para incluir o número mínimo de bases ou de elementos necessários para iniciar a transcrição. Dentro da sequência promotora encontrar-se-á um local de início da transcrição e também os domínios de ligação proteicos responsáveis pela ligação da polimerase do ARN.

Frequentemente, mas não sempre, os promotores eucarióticos irão conter segmentos “TATA” e “CAT”. Os promotores procarióticos contêm sequências de Shine-Dalgamo A expressão “sequências de ADN de controlo” designa de forma colectiva as sequências promotoras, os locais de ligação ribossómicos, os sinais de poliadenilação, as sequências de terminação da transcrição, os domínios reguladores a montante, intensificadores e não só, que permitem, de forma colectiva, a transcrição e a tradução de uma sequência codificante numa célula hospedeira.

Uma sequência codificante está “funcionalmente ligada às” ou “sob o controlo das"' sequências de controlo numa célula quando a polimerase do ARN se ligar à sequência promotora e transcrever a sequência codificante dentro do ARNm, que é então traduzida num polipeptido codificado pela sequência codificante. A expressão “célula hospedeira” designa uma célula que tenha sido transformada, ou que seja capaz de experimentar uma transformação, por acção de uma sequência de ADN exógeno.

Diz-se que uma célula foi “transformada” por ADN exógeno quando tal ADN exógeno tiver sido introduzido dentro da membrana da célula. O ADN exógeno pode ou não ser integrado (ligado de forma covalente) dentro do ADN cromossómico que constitui o genoma da célula transformada. Por exemplo, nos organismos procariotas e nas leveduras, o -ADN exógeno pode ser mantido num elemento epissómico, tal como um plasmídeo. No que diz respeito às células eucarióticas, designa-se por célula estavelmente transformada aquela em que o ADN exógeno tenha sido integrado dentro do cromossoma por forma a ser herdado pelas células da descendência através da replicação dos cromossomas. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade que as células eucarióticas têm para estabelecerem linhagens celulares ou clones que compreendem uma população de células da descendência que contêm o ADN exógeno. O termo “clone” designa uma população de células obtidas a partir de uma única célula ou a partir de um antepassado comum, por mitose. A expressão “linhagem de células” designa um clone de uma célula primária capaz de crescer de forma estável in vitro durante muitas gerações.

Diz-se que duas sequências de ADN, ARN ou polipeptídicas são “praticamente homólogas” quando houver pelo menos cerca de 85% (de preferência houver pelo menos 19'" *- 90% e mais preferencialmente houver pelo menos cerca de 95%) dos nucleótidos ou dos aminoácidos a condizer ao longo de um comprimento definido da molécula. As sequências de ADN consideradas praticamente homólogas podem ser identificadas por meio de uma experiência de hibridação à Southern, por exemplo, sob condições rigorosas, conforme definido para tal sistema particular. A definição das condições adequadas de hibridação é da competência dos especialistas na matéria. Ver, v.g., Maniatis et ai, supra; DNA Cloning, Vols. I e II, supra:; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Uma região “heteróloga” de um arquétipo de ADN é um segmento identificável de ADN contido noutra molécula de ADN ou a ela acoplado e que não se encontra em associação com essa outra molécula na natureza. Assim sendo, no caso de uma região heteróloga codificar um gene bacteriano, esse gene será normalmente flanqueado pelo ADN que não flanqueia o gene bacteriano no genoma da fonte bacteriana. Outro exemplo de uma sequência codificante heteróloga é um arquétipo em que a própria sequência codificante não existe na natureza (v.g. as sequências sintéticas que contenham codões diferentes dos existentes no gene natural). A expressão “ADN heterólogo” designa também um ADN que não existe dentro da célula hospedeira na natureza. Uma variação alélica ou fenómenos mutacionais que ocorram naturalmente não dão origem a uma região heteróloga de ADN, no sentido em que estes termos são aqui utilizados. O termo “polipeptido” é aqui utilizado no seu sentido mais amplo, isto é, designa qualquer polímero de aminoácidos (um dipeptido ou de ordem superior) ligado através de pontes peptídicas. Assim, o termo “polipeptido” engloba proteínas, oligopeptidos, fragmentos de proteínas, análogos proteicos, muteínas, proteínas de fusão e não só. O termo também compreende os polímeros de aminoácidos, conforme descrito antes, que contenham radicais 20 complementares que não sejam aminoácidos. Posto isto, o teimo “polipeptido” engloba proteínas, lipoproteínas, fosfoproteínas, metaloproteínas, nucleoproteínas e bem assim outras proteínas conjugadas. O termo “polipeptido” também diz respeito aos polipeptidos, tal como definidos antes, que sejam produzidos pela via recombinante, isolados a partir de uma fonte adequada ou então sintetizados. A presente invenção pode ser melhor compreendida tomando como referência os exemplos seguintes não limitativos. Chama-se à atenção dos especialistas na matéria para o facto de ser possível conceber outras variantes da invenção sem que haja afastamento do espírito e do âmbito da invenção tal como aqui descrita e reivindicada.

Exemplo 1

Produtos químicos e reagentes. Todos os produtos químicos utilizados tinham a qualidade de reagentes, ou melhor, salvo quando indicado de outro modo. As fumonisinas B] e B2 foram obtidas na empresa Sigma Chemical Co.. As fumonisinas parcialmente purificadas (o eluído da coluna em C8) foram fornecidos pelo Dr. Pat Murphy (Universidade do Estado do Iowa). A toxina AAL (isómero TA) foi uma oferta do Dr. David Gilchrist (Universidade de Califomia-Davis).

Amostras dos tecidos vegetais. Os grãos de milho das searas, já maduros, foram obtidos nos terrenos de produção da empresa ‘Pioneer Hi-Bred IntemationaT nas regiões do sudeste, centro-oeste e centro-sul dos Estados Unidos da América do Norte. Os grãos de milho foram guardados à temperatura ambiente em embalagens individuais.

Isolados fúngicos e bacterianos. Isolou-se Exophiala e Rhinocladiella a partir de milho, conforme descrito adiante. Outros isolados foram fornecidos por: Dr. C. J. Wang (Svracuse, 21^ NI), Dr. Michael McGinnis (Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio) e na Colecção Americana de Culturas Tipo (Bethesda, MD). As espécies Fusarium graminearum [Gibberelia zeae (Schw.) Petsch], Diplodia maydis e Fusarium moniliforme Sheld. foram obtidas a partir da colecção de culturas microbianas da empresa ‘Pioneer Hi-Bred International, Inc.\ O isolado CP22 de Aspergillus flavus (Schw.) Petsch foi fornecido por Don Sumner da Universidade da Georgia (Tifton, GA). A espécie de Xanthomonas foi isolada a partir de tecidos dos caules do milho, conforme adiante descrito. Métodos de isolamento. Cada um dos grãos, quer intacto quer dividido em dois com uma lâmina estéril, foi enxaguado durante 1 hora em 5 mL de água estéril sob agitação. Acrescentou-se entre 1 e 5 pL do fluído de enxaguamento a 100 pL de meio estéril de sais minerais sem carbono + FB[ (MS-FBj) (NH3S04 na concentração de 1 g/L, K2HP04 na concentração de 1 g/L, NaCl na concentração de 1 g/L, MgS04*7H20 na concentração de 0,2 g/L, pH 7,0) contendo FB] (Sigma Chemical Co.) numa concentração entre 0,5 e 1,0 mg/mL). O pH do meio era de aproximadamente 6,0 após a adição de FBj. Decorridas 1 a 2 semanas de incubação a 28°C ao abrigo da luz, procedeu-se à realização de uma diluição sequencial à razão de 1 para 10 em dH20 estéril, tendo sido retiradas aliquotas que foram colocadas sobre placas de ‘bactoagarose’ a 1,2% contendo 0,1% de extracto de levedura, 1% de ‘bactopeptona’ e 0,1% de dextrose (ágar ‘YPD’). As colónias fúngicas e bacterianas que apareceram sobre a agarose foram transferidas para placas recentes e para cada uma das colónias procedeu-se a uma avaliação respeitante à capacidade metabolizante da fiimonisina, inoculando-as em meio MS-FBi recente. As perdas de fumonisina a partir do meio foram verificadas periodicamente, aplicando pingos correspondentes a aliquotas entre 0,5 e 1 pL de sobrenadante de cultura 22" sobre placas de gel de sílica 08 que secaram depois ao ar e foram reveladas conforme adiante se descreve (ver o parágrafo 'Análise das fumonisinas e dos produtos do metabolismo’). O isolamento directo das leveduras negras a partir das sementes foi realizado aplicando 100 pL do fluído de lavagem das sementes sobre placas de agarose de tipo ‘YPD’ ou ‘Sabourau’ enriquecida com ciclo-heximida (500 mg/L) e cloranfenicol (50 mg/L). Efectuou--se a incubação das placas à temperatura ambiente durante 7 a 14 dias e em cada uma das colónias pigmentadas que apareceu efectuou-se uma contagem, tendo essas colónias sido criadas em cultura para efeitos de análise da capacidade de degradação da fiimonisina, conforme descrito antes.

Para os isolamentos a partir dos talos, procedeu-se ao corte de amostras maduras de talos com as dimensões de 0,5 x 0,5 x 2 cm a partir de uma linhagem congénita de milho de tipo austral plantado em Johnston, Iowa pela empresa ‘Pioneer Hi-Bred International, Inc.’, que é produtora de sementes, no ano de 1993. Efectuou-se o corte de secções de uma polegada do centro (medula) ou do lado de fora dos talos de superfícies não esterilizadas, tendo tais secções sido colocadas em 10 mL de água estéril num pequeno tubo esterilizado. Agitou--se os tubos durante 1 hora e depois retirou-se 2 pL do produto de lavagem que foi utilizado para inocular 100 pL de meio MS-FBi numa placa de microtitulação. Os passossubsequentes foram os já descritos antes.

Análise das fumonisinas e dos produtos do metabolismo. Realizou-se a cromatografía analítica de camada fina sobre placas de sílica C18 silanizadas a 100% (Sigma™ #T-7020; 10x10 cm; 0,1 mm de espessura) por uma modificação do método publicado de Rottinghaus. As pistas para as amostras foram previamente molhadas com metanol para facilitar a aplicação de cada amostra. Após a aplicação de 0,1 a 2 pL de amostra aquosa deixou-se as placas 23 secar ao ar e foram então reveladas em MeOH:KCl a 4% (3:2) ou MeOH:KOH 0,2M (3:2), tendo sido depois aspergidas sucessivamente com borato de sódio 0.1M (pH 9,5) e fluorescamina (0,4 mg/mL em acetonitrilo). As placas secaram então ao ar e foram observadas sob uma luz UV de onda longa.

Hidrólise alcalina da FBj originando APi. Com a FBi ou com o material da fiimo-nisina impura em C8 preparou-se uma suspensão em água à razão de 10-100 mg/mL e juntou--se a um volume igual de NaOH 4N num tubo de tampa roscada. Fechou-se o tubo muito bem e efectuou-se a incubação a 60°C durante 1 hora. Deixou-se o hidrolisado obtido arrefecer para a temperatura ambiente (TA) e misturou-se com igual volume de acetato de etilo, centrifugou-se a 1000 RCF durante 5 minutos e recuperou-se a camada orgânica (superior). As camadas reunidas de acetato de etilo resultantes de duas extracções sucessivas foram então secas sob uma atmosfera de azoto e novamente colocadas em suspensão em dH20. Analisou--se por CCF (o mesmo que TLC) o material resultante (o aminopentol de FB| ou “APi”).

Os quadros 1 e 2 ilustram os resultados das experiências para isolar uma enzima que degrada as fiimonisinas, a partir de uma grande variedade de fontes. Conforme indicado, os isolados de E. spinifera retirados de grãos de milho de diversos locais foram sempre capazes de produzir uma enzima que degrada as fumonisinas quando criada sobre uma fumonisina enquanto única fonte de carbono (quadro 1), o mesmo sucedendo com os isolados de £ spinifera obtidos a partir de outras fontes obtidas em todo o mundo (quadro 2). Algumas amostras de Rhinodadiella atrovirens obtidas a partir de grãos de milho também foram capazes de produzir esta enzima (quadro 1). Outras espécies de Exophiala e outras fontes e outras espécies de Rhinodadiella foram normalmente incapazes de produzir a enzima, mesmo quando isoladas a partir de fontes relacionadas com a planta (quadro 2). 24

Quadro 1: Fungos dematiáceos, isolados a partir de grãos de milho, que degradam as fumonisinas

Modificação dos substratos

Isolado# Espécie Local de origem Isolado a partir dc Aspecto FB, AP, 2369.E7 Exophiala spinifera Tifton GA Grão de milho (3293) limpo + + 2369.G5 Exophiala spinifera Tifton, GA Grão dc milho (3379) limpo + + 2174.A4 Exophiala spinifera Tifton GA Grão de milho (linhagem congénita) bolorento + + 2369.F7 Exophiala spinifera Winteiville. NC Grão de milho (3170) bolorento + + 2369.H9 Exophiala spinifera Winterville, NC Grão de milho (3379) bolorento -r T 2141.10 Exophiala spinifera Winterville, NC Grão de milho (desc.) bolorento + + 2174.C6 Exophiala spinifera Winterville. NC Grão de milho (desc.) bolorento 4* T 2170.2 Exophiala spinifera Winterville, NC Grão de milho (linhagem congénita) bolorento + + 2174.A4 Exophiala spinifera Union City. TN Grão de milho (linhagem congénita) bolorento? + + 2219.H5 Exophiala spinifera Union City. TN Grão de milho (linhagem congénita) bolorento + + 2363.1 Exophiala spinifera Weslaco. TX Grão de milho (linhagem congénita) bolorento + + 2363.3 Exophiala spinifera Weslaco. TX Grão de milho (linhagem congénita) bolorento + + 2363.3 Exophiala spinifera Weslaco. TX Grão de milho (linhagem congénita) bolorento +~ + 2363.8 Exophiala spinifera Weslaco. TX Grão de milho (linhagem congénita) bolorento + + 2363.10 Exophiala spinifera Weslaco. TX Grão dc milho (linhagem congénita) bolorento nt 2369.F11 Rhinoclailiella atrovirens Johnston IA Grão de milho (linhagem congénita) limpo + 1 “bolorento” significa que houve uma descoloração visível do pericarpo da semente, partindo-se ou dividindo-se; “limpo” significa que não havia sinais visíveis de infecção na semente. 2 Avaliado por análise por CCF dos sobrenadantes da cultura, conforme aqui descrito nt = não testado

Quadro 2: Outros isolados fúngicos testados para efeitos da pesquisa da degradação da fumonisina BI em cultura em meio líquido

Isolado Espécie Fonte Local de origem Isolado a partir de Modificação dos substratos FB, AP! 26089 Exophiala ATCC - Leveduras negras - Uruguai tronco ± palmeira + + 26090 spinifera Exophiala ATCC Uruguai fruto da palmeira + + 26091 spinifera Exophiala ATCC Uruguai ninho de ave + + 26092 spinifera Exophiala ATCC Uruguai ninho de ave 4- + 48173 spinifera Exophiala ATCC Granuloma nasal + + 56567 spinifera Exophiala ATCC O + + 18218 spinifera Exophiala ATCC Granuloma nasal + + 58092 spinifera Exophiala ATCC Seres humanos + + 66775 32288 spinifera Exophiala monileae Exophiala ATCC ATCC desconhecido Cama de folhas - nt nt 26438 salmonis Exophiala ATCC Austrália Zona da raiz do nt 26272 pisdphila Exophiala ATCC Canadá trigo Lamas actnadas _ nt P-154 jeanselmi Rhinoclaáella C. J. Wang Chester NJ Estaca de pinheiro _ nt P-330 atrovirens Rhinoclaáella C. J. Wang Binghamtnon, NI austral Estaca de pinheiro _ nt P-Ó4Ó atrovirens Rhinoclaáella C. J. Wang Virgínia austral Estaca de pinheiro _ nt P-1492 atrovirens Rhinoclaáella C. J. Wang Chester, NJ austral Estaca de pinheiro nt ED-43 atrovirens Rhinoclaáella C. J. Wang desconhecido austral Estaca de abeto de _ nt atrovirens Douglas

Quadro 2 (cont)

Modificação dos substratos

Isolado Espécie Fonte Local de origem Isolado a partir de FB, APt - Leveduras negras - ED-124 Rhinocladiella atrovirens C. J. Wang desconhecido Estaca de abeto de Douglas “ nt 28220 Rhinocladiella anceps ATCC Maiyland - Bolores das espigas - Erva nt FMOOOI Fusarium moniíijòmte PHI desconhecido Milho “ nt FGR001 Fusarium graminearum PHI desconhecido Milho “ nt CP22 Aspergi llus flavtts PHI desconhecido Milho nt DMA001 Diplodia maydis PHI desconhecido Milho nt * Testado tanto com FB], enquanto fonte única de carbono, como com FBi enriquecido com 1% de sacarose.

Quadro 3: Frequência do isolamento dos isolados das leveduras negras que degradam as fumonisinas, obtidas a partir de grãos de milho

Local de nu de amostras nu de amostras % que contém a levedura Espécies identificadas origem testadas positivas negra que degrada as FB] Weslaco. TX 8 6 75.0 Exophiala spinifera Winterville, NC 19 4 47,5 Exophiala spinifera Rhinocladiella atrovirens Tifton, GA 8 3 37.5 Exophiala spinifera Union Cit>. TN 7 2 28,2 Exophiala spinifera Johnston, LA 7 1 14.3 Rhinocladiella atrovirens Shelbyville. IL 3 0 0 nenhuma Macomb, IL 4 0 0 - Champuign. IL 3 0 0 - Yale. IN 3 0 0 - Califórnia 8 0 0 -

Total 70 16 22.8 27 É possível fazer uma análise aos microrganismos para investigar a sua capacidade para degradarem as fumonisinas, utilizando os métodos da presente invenção. Para o efeito, faz-se uma análise às amostras de plantas, solo, água do mar e água doce e aos microrganismos aí isolados que sejam capazes de degradar as fumonisinas. Em alternativa, é possível pesquisar estirpes microbianas que tenham sido já isoladas e para as quais se admita que possuam tal capacidade. As bactérias presumivelmente resistentes às fumonisinas são as bactérias associadas às espécies vegetais sensíveis às infecções de Fusarium. Por exemplo, prevê-se que as bactérias associadas às infecções de tomateiros e de pimenteiros com Fusarium, e bem assim de outras espécies vegetais sensíveis, possam degradar as fumonisinas. Além disso, os membros dos géneros bacterianos conhecidos pela sua versatilidade no que diz respeito ao seu catabolismo de moléculas orgânicas complexas, tais como os membros do género Pseudomonas, podem degradar as fumonisinas.

De um modo geral, os meios utilizados para criar os microrganismos enumerados antes devem conter uma quantidade conhecida de uma fumonisina, isto é, entre 0,1 mg e 3 mg de fumonisina por cada mL de meio, mais vulgarmente entre 0,25 mg e 2 mg por cada mL de meio e preferencialmente entre 0,5 mg e 1 mg de fumonisina por cada mL de meio.

Realizou-se um estudo complementar para determinar se poderia ser utilizada a morfologia das colónias para tirar conclusões sobre as estirpes destas espécies que pudessem produzir uma enzima que degradasse as fumonisinas. Os resultados apresentados no Quadro 4 indicam que as colónias de E. spinifera e R. atrovirens que possuam diferentes morfologias poderiam, não obstante, produzir a enzima de degradação das fumonisinas. 28-'

Quadro 4: Leveduras negras recuperadas a partir de uma única semente, mediante a aplicação directa das soluções de lavagem de sementes sobre placas de YPD + ciclo-heximida + cloranfenicol1

Isolado Tipo de colónia sobre gelose YPD Espécie n° de colónias nu de FB, degr. 2403.5 castanho claro, lustroso Exophiala spinifera 33 33 2403.25 castanho escuro, lustroso Exophiala spinifera 1 1 2403.12 castanho, aveludado RhinoclacSella atrovirens 4 4 2403.2 cinzento, aveludado Rhinocladiella atrovirens 1 1 Totais 39 39 1 Fonte das sementes: Tifton, Georgia. Dividiu-se a semente e lavou-se com 5 mL de água estéril e depois aplicou-se 100 pL da solução de lavagem sobre gelose YPD contendo ciclo-heximida (500 mg/L) e cloranfenicol (50 mg/L). A partir destes resultados concluiu-se que o desenvolvimento sobre fumonisina, enquanto fonte única de carbono, é o indicador mais fiável sobre a capacidade para produzir a esterase que degrada as ftunonisinas. A esterase isolada a partir de E. spinifera foi então submetida a outros tratamentos, incluindo o ataque com proteases, para se determinar quando e como a enzima iria funcionar em diversos ambientes. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 5. 29

//

Quadro 5: Efeitos de diversos tratamentos sobre a modificação da FBi

Tratamento Condições Actividade de hidrulase na FB|* Contraprova dc controlo 16 horas. 37°C.pH5.2 +++ Banho dc água a ferver 100°C. 30 min.. pH 5.2 - ProteascK 0,01 mg/mL. 16 horas. 37°C, pH 5,2 + PronaseE 0,01 mg/mL, 16 horas, 37°C, pH 5,2 ++ Quimotripsina 0,01 mgfaiL. 16 horas, 37°C, pH 5,2 -H- Tripsina 0,01 mginL. 16 horas, 37°C, pH 5,2 +++ EDTA 50 mM -H- DTT 25 mM -H-r or 50 mM +-H- 50 mM -H-+ PMSF 10 mM +++ * Concentrada 10 vezes, filtrados de culturas de 11 a 15 dias tratados conforme descrito e incubados depois com FBi (concentração final de 0,5 mg/mL), de um dia para o outro a 37°C. A análise por CCF em C18/aspersão com fluorescamina a que se seguiu a incubação de um dia para o outro a 37°C com fumonisina na concentração de 1 mg/mL. ausência de hidrólise ± vestígios de hidrólise + hidrólise incompleta ++ hidrólise incompleta +++ hidrólise completa A seguir avaliou-se o intervalo de variação do pH para a actividade da esterase da fu-monisina, medindo a degradação da fumonisina na presença de tampões citrato e citrato-fosfato para diversos valores de pH. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 6. A partir daqui foi possível concluir que o intervalo de variação dos valores do pH para a enzima é bastante amplo e que a enzima irá ser activa para os valores internos do pH das plantas e das células vegetais.

Quadro 6: Efeito do pH do tampão sobre a hidrólise da fumonisina Bi por acção do filtrado da cultura de E. spinifera

Tampão pH Actividade da hidrolasc em FBt* citrato 0.1M 3.0 +++ citrato-fosfato 0.1M 4.0 +++ citrato-fosfato 0,1M 5,0 ++ citrato-fosfato 0.1M 6,0 ++ fosfato 0.1M 7,0 ± fosfato 0.1 M 8,0 - * as reacções foram efectuadas a 37°C de um dia para o outro e a avaliação foi feita por CCF. * Análise por CCF em C 18/aspersão com fluorescamina, seguindo-se a incubação de um dia para o outro a 37°C com fiimonisina na concentração de 1 mg/mL. = ausência de hidrólise ± = vestígios de hidrólise + = hidrólise incompleta ++ = hidrólise incompleta -H-+ = hidrólise completa

Efectuou-se uma comparação da esterase da fumonisina, isolada a partir de E. spinifera, com outras esterases conhecidas obtidas a partir de diversas fontes, tal como adquiridas nos circuitos comerciais. Os resultados agrupados no quadro 7 indicam que a esterase da fumonisina é uma enzima única que é altamente específica no que diz respeito à sua actividade e não possui uma actividade generalizada de esterase comparável à de qualquer outra das enzimas conhecidas que foram testadas.

Quadro 7: Hidrólise da fumonisina Bi por acção das hidrolases e esterases comerciais

Enzima Código Fonte, pureza Unidades/ /mg prot Unidades por rxn Ensaio pH Hidrólise erti FBi Esterase. EC 3.1.1.1 coelho 100 8.0 - não específica Esterase. fígado de porco 200 7.5 - não específica

Lipasc candida cilínrica 35 7,7 - Butiril-colinesterase soro dc cavalo altamente purificado 500 15 8,9 Acetil-colinestcrase soro de bovino parcialmentc puro 0,33 0.15 8.0 ' Estcrasc do colesterol soro de bovino parcialmentc puro 0.5 0.15 8,0 Esterase do colesterol soro de suíno parcialmentc puro 0.15 8.0 ' Esterase do colesterol Pseuclomunasfluorescens 12 1-5 7,0 - Esterase do colesterol Pseuclomonas spp. 200 15 7.0 ± Acetil-esterase casca dc laranja parcialmentc pura 4 0.15 6.5 - Pectincstcnisc casca de laranja parcialmente pura 100 1.5 7.5 ” Fectinase Rhizopits natural 0,5 1,5 4.0 - Fectinasc Aspergillus parcialmente puro 5 0,1 4.0 - Esterase da fumonisina Exophiala spinifera natural desc. desc. 5,2 +++ * Análise por CCF em C 18/aspersão com fluorescamina, seguindo-se a incubação de um dia para o outro a 37°C com fiimonisina na concentração de 1 mg/mL. = ausência de hidrólise ± = vestígios de hidrólise + = hidrólise incompleta -η- = hidrólise incompleta +-H- = hidrólise completa

Fez-se uma avaliação da enzima da presente invenção para pesquisar a sua indutibilidade, criando para tal uma cultura de Exophiala sobre diversas fontes de carbono com graus variáveis de similitude estrutural com a fumonisina. Os resultados agrupados no quadro 8 demonstram que tanto a forma original de fumonisina como o seu metabolito são capazes de induzir a produção da enzima, mas que essa indutibilidade da enzima é também bastante específica.

Quadro 8: Capacidade das diversas fontes de carbono para suportarem o crescimento e/ou a indução da actividade hidrolítica da FBt. Actividade da cultura de Exophiala

Fonte de carbono Concentração Crescimento Actividade da hidrolase cm FBt* FB, 0,1% + + FB| hidrolisada em meio alcalino (AP,) 0.1% + + Na + tncarbalilato 0,1% ± - Esíingosina 0,1% - - Filosfingosina 0,1% - - Na + citrato 0,1% + - Sacarose 0,1% + - Glicose 0.1% T -

Avaliou-se também a capacidade da esterase das fumonisinas para clivar outros ésteres carboxílicos orgânicos, por comparação com a sua capacidade para hidrolisar as fumonisinas. Os resultados agrupados no Quadro 8 revelam também que a enzima hidrolisou os tricarbalilatos de outros álcoois aminados congéneres, tais como a FB2 e a toxina AAL.

Quadro 9: Hidrólise dos ésteres carboxílicos orgânicos por acção do filtrado concentrado da cultura de

Exophiala natural

Substrato Condições Método de ensaio Hidrólise |>or acção do filtrado da cultura de Exophiala FB, pH 5,2:37°C, 1 hr CCFcmCIS: fluorcscamina + FB; pH 5,2; 37°C. 1 hr CCFemCi8: fluorcscamina + Toxina AAL pH 5,2; 37°C, 1 hr CCFemC18: fluorcscamina -j-

Actividade enzimática do filtrado da cultura e dos micélios. Deixou-se crescer o isolado 2141.10 de Exophiala spinifera sobre gelose YPD durante uma semana e efectuou-se a colheita dos conídios que foram colocados em suspensão em água estéril, tendo sido 33 utilizados 105 conídios por mL para inocular um meio estéril de sais minerais de Fries que continha FB! purificada na concentração de 1 mg/mL (Sigma Chemical Co.)· Ao fim de 2 semanas de incubação a 28°C, ao abrigo da luz, procedeu-se à filtração das culturas através de filtros de acetato de celulose de 0,45 pm e enxaguou-se com a solução de sais minerais de Fries. Com os micélios fúngicos preparou-se uma suspensão em 15 mL de 0,1 MC-FBi, pH 5,2 + EDTA lmiVl + Pepstatina A a 3 pg/mL + leupeptina a 1,5 pg/mL, tendo sido sujeitos a uma acção destrutiva num aparelho ‘Bead Beater™’ em que foram utilizadas esférulas de 0,5 mm e um regime descontínuo com períodos activos de 1 minuto, sob arrefecimento com gelo. Os fragmentos das hifas foram recolhidos por filtração através de ‘Spin X’ (0,22 pm) e realizou--se uma análise do sobrenadante dos micélios e dos filtrados da cultura original para pesquisar as modificações ocorridas na fumonisina, em conformidade com os métodos mencionados antes.

Preparação do filtrado da cultura natural. Foram utilizadas culturas sobre gelose, criadas conforme descrito antes, para inocular culturas em caldo de YPD (500 mL) em balões cónicos com uma concentração final de 105 células por mL de meio de cultura. Efectuou-se a incubação das culturas durante 5 dias a 28°C, sem agitação, tendo os micélios sido colhidos por filtração através de filtros de 0,45 pm, sob vácuo. Deitou-se fora o filtrado e lavou-se o emaranhado de micélios que foi depois colocado novamente em suspensão em meio estéril de baixo teor em sais minerais e isento de carbono (NH3NO4 à razão de 1 g/L; NaH2P04 à razão de 1 g/L; MgCl2 à razão de 0,5 g/L; NaCl à razão de 0,1 g/L; CaCl2 à razão de 0,13 g/L; FeS04*7H20 à razão de 0,02 gL, pH 4,5) contendo a FBI natural hidrolisada em meio alcalino à razão de 0,5 mg/mL. Decorridos 3 a 5 dias a 28°C, ao abrigo da luz e sem agitação, procedeu--se à filtração das culturas através de filtros de 0,45 pm de fraca ligação proteica para assim 34 recuperar o filtrado da cultura. Acrescentou-se fluoreto de fenil-metil-sulfonilo (FPMS) até se atingir uma concentração de 2,5 mM e concentrou-se o filtrado da cultura utilizando para tal uma membrana ‘Amicon™’ num vaso agitado à temperatura ambiente e colocou-se novamente em suspensão em acetato de sódio 50 mM a pH 5,2 contendo CaCl2 10 mM. Guardou-se a -20°C o filtrado da cultura natural (concentrado aproximadamente 200 vezes).

Para se obter quantidades preparatórias de fumonisina hidrolisada pela enzima dissolveu-se 10 mg de FBi (Sigma) em 20 mL de acetato de sódio 50 mM a pH 5,2 contendo CaCl2 10 mM e acrescentou-se 0,25 mL de filtrado da cultura natural de 2141.10 concentrado 200 vezes. Realizou-se a incubação da solução a 37°C durante 14 horas e depois deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente. Ajustou-se o pH da mistura de reacção para um valor aproximado de 9,5 por adição de 0,4 mL de KOH 4N e extraiu-se a mistura duas vezes com 10 mL de acetato de etilo. Efectuou-se a secagem das camadas orgânicas combinadas sob LN2 e colocou-se novamente em suspensão em dH20. Realizou-se uma análise de 2,5 mg do material orgânico extraído, por espectrometria de massa por bombardeamento atómico rápido (EM-BAR). O espectro de massa resultante revelou a existência de um ião principal a M/2 = 406 unidades de massa, indicando isso que o produto principal da hidrólise enzimática era o APi com um peso molecular calculado de 406,63.

Caracterização complementar das esterases das fumonisinas a partir de Exophiala spinifera e de espécies bacterianas gram-negativas. Realizou-se a cromatografia dos filtrados concentrados das culturas (induzidas pela actividade da esterase da FB|), obtidos a partir do isolado 2141.10 de E. Spinifera e do isolado de Xanihomonas sp.2412.1. numa coluna de exclusão dimensional de tipo ‘Pharmacia® Superdex 75’ e realizou-se a eluição com fosfato de sódio 50 mM a pH 6,0 contendo NaCl 0,2 M. Procedeu-se à colheita de fracções de 1 mL e pesquisou-se a actividade da esterase da FBi em conformidade com os métodos descritos supra. Os tempos de retenção observados para as esterases da FB] dos isolados de 2141.10 e 2412.1 permitiram obter os pesos moleculares calculados respectivamente de 44,5 e 28,7 kDa.

De um modo idêntico, injectou-se os filtrados concentrados das culturas naturais em sulfato de amónio 1,7 M numa coluna de cromatografia de permuta aniónia fraca (CPAF, o mesmo que FPLC) de tipo ‘Pharmacia5' Phenyl Sepharose’ equilibrada com sulfato de amónio 1,7 M em fosfato de sódio 50 miM a pH 6,0 (tampão A). Aplicou-se 30 mL de um gradiente linear de tampão A em água destilada, seguindo-se uma lavagem com Triton X-100 a 0,1% em fosfato de sódio 50 mM a pH 6,0. Realizou-se a colheita de fracções de 1 mL nas quais se pesquisou tanto a existência da esterase da FB] como da esterase não específica (conforme medido pela hidrólise do acetato de naftilo, utilizando para tal o método de Daiy et al. (1990) “Microplate adaptation of GomorTs assay for quantitative determination”. Journal of Economic Entomology 832187-2192. As figuras 2a e 2b mostram os tempso de retenção para a actividade espcífica (isto é, FB!) comparativamente com a actividade não específica (isto é, esterase do acetato de naftilo). A eluição, tanto da actividade da esterase fúngica como da esterase bacteriana FBt, teve lugar para a concentração aproximada de sulfato de amónio 0,4 M. Detectou-se actividade da estrase do acetato de naftilo tanto na cultura fúngica como na bacteriana, mas não houve eluição conjunta desta actividade com a actividade da esterase da FB]. Assim, as esterases fúngica e bacteriana da FB] não são idênticas às esterases não específicas detectáveis nos filtrados das culturas destes microganismos. 36

Exemplo 2

Clonagem de genes que codificam a esterase das fiunonisinas E possível utilizar os microrganismos que revelam possuir resistência à fumonisina para criar uma biblioteca genómica por meio de técnicas convencionais bem conhecidas na especialidade. Assim sendo, é possível utilizar enzimas de restrição para gerar fragmentos de ADN que podem ser, por sua vez, inseridos num número qualquer de vectores de clonagem adequados. Os especialistas na matéria conhecem já inúmeros vectores de clonagem e a selecção de um vector de clonagem adequado é uma questão arbitrária Como requisito apenas é necessário que o vector de clonagem seja capaz de transformar uma célula hospedeira incapaz de degradar uma fumonisina. Como exemplos de vectores de ADN recombinante para a clonagem e como exemplos de células hospedeiras que tais vectores podem transformar, indicados entre parêntesis, refere-se os seleccionados entre bacteriófago lambda (E. Colí), pBR322 (E. Colí), pACYC177 (E. Colí), pKT230 (bactéria gram-negativa), pGV1106 (bactéria gram-negativa), pLAFRI (bactéria gram-negativa), pME290 (bactéria gram-negativa de tipo não E. Colí), pU61 (Streptomyces), pUC6 (Sírepíomyces), YIp5 {Saccharomyces) e YCpl9 (Saccharomyces). Ver genericamente ‘DNA Cloning’, Vols. I e H, supra e Maniatis et ai, supra. Considera-se particularmente útil um vector de clonagem capaz de transformar E. colí.

Logo que o vector de clonagem tenha sido inserido numa célula hospedeira adequada, deixa-se as células crescer num meio que contenha fumonisina e realiza-se uma análise para pesquisar a sua capacidade para degradar a fumonisina, conforme descrito antes. Os fragmentos intercalares de ADN plasmídico obtidos a partir de colónias que degradam as fumonisinas são caracterizados por subclonagem, marcação do transposão com um identificador e análise da sequência do ADN, sendo tudo isto assuntos conhecidos pelos especialistas na matéria (ver 37 v.g. Napoli, C. e Staskawicz, B. (1987) J. Bact. 7(59:572-578). Uma vez determinada uma sequência de codificação, é possível produzir as moléculas proteicas recombinantes capazes de degradar uma fumonisina, em conformidade com a presente invenção, construindo uma cassete de expressão e transformando com ela uma célula hospedeira para proporcionar uma linhagem ou uma cultura celular capaz de exprimir a proteína desejada que está codificada dentro da cassete de expressão.

As sequências que codificam a enzima de degradação das fumonisinas podem ser preparadas quer directamente, por métodos de síntese com base na sequência determinada, ou então utilizando a sequência para arquitectar sondas oligonucleotídicas para clonar a sequência codificante natural, utilizando para tal técnicas conhecidas. As sondas nucleotídicas podem ser preparadas e utilizadas para pesquisar uma biblioteca de ADN obtida a partir de um organismo, capaz de degradar uma fumonisina, conforme determinado supra. As estratégias básicas para a preparação das sondas oligonucleotídicas e das bibliotecas de ADN, e também para a sua pesquisa por hibridação do ácido nucleico, são bem conhecidas pelos especialistas na matéria (ver v.g. ‘DNA Cloning\ Vol. I, supra-, ‘Nucleic Acid Hybridization’, supra; Oligonucleotide Synthesis’, supra; JVlaniatis et ai, supra. A sequência codificante pode ser constituída totalmente pela sequência codificante assim obtida, ou tais sequências podem ser fundidas com outras sequências (v.g. sequências líderes), por forma a que seja codificada uma proteína de fusão. Ver v.g. as patentes de invenção norte-americanas n~ 4 431 739, 4 425 437 e 4 338 397 cujos conteúdos se considera aqui incorporados por referência. Uma vez preparada ou isolada uma sequência codificante adequada para a enzima que degrada uma fumonisina, pode então ser clonada em qualquer vector ou replicão adequado, conforme é sabidao na especialidade. Tais vectores foram já 38 descritos antes, sendo o microrganismo E. coli a bactéria hospedeira particularmente preferida.

Para completar a construção das cassetes de expressão liga-se a sequência de codificação funcionalmente às sequências de controlo, tais como um promotor, um local de ligação ribossómico (para a expressão bacteriana) e facultativamente um operador, por forma a que a sequência de ADN que codifica a proteína seja transcrita num ARN mensageiro na célula hospedeira transformada pelo vector que contém o arquétipo de expressão. E matéria da competência de especialistas ligar funcionalmente a sequência de codificação da enzima que degrada as fumonisinas às sequências adequadas de controlo para realizar a transcrição e a tradução. De um modo geral, a sequência de codificação irá estar a jusante da sequência promotora e de quaisquer regiões reguladoras da expressão, tais como as sequências dos intensificadores ou dos operadores. Se a sequência de codificação estiver ligada a uma sequência heteróloga de codificação, ou a um codão de arranque, então é importante colocar a sequência de codificação no quadro de leitura conjuntamente com aquela. Se o hospedeiro de expressão pretendido for procariótico, então será necessário incluir também um local ribossómico de ligação entre as sequências de controlo a montante. As sequências de controlo a jusante, ligadas funcio-.nalmente, irão conter normalmente uma sequência de terminação da transcrição. O arquétipo obtido pode ser depois inserido num vector de expressão adequado. São já conhecidos na especialidade diversos vectores de expressão procarióticos e eucarióticos. Os vectores preferidos são os vectores de expressão procarióticos. Um hospedeiro particularmente preferido para tais vectores é o microrganismo E. coli. A enzima de degradação das fumonisinas é então produzida criando as células hospedeiras transformadas pela cassete de expressão em condições que levem à expressão da proteína biologicamente activa, conforme indicado pela capacidade das células hospedeiras para degradarem as fumonisinas no meio onde estão ‘39 a crescer, conforme descrito antes. A proteína em causa pode ser isolada a partir das células hospedeiras e purificada para estudo posterior. No caso de a proteína não ter sido segregada, pode eventualmente ser necessário destruir as células hospedeiras e purificar a proteína a partir do lisado celular. Para o efeito são já conhecidas diversas técnicas de purificação, tais como a CLER (o mesmo que HPLC), a cromatografia de exclusão dimensional, a electroforese e a cromatografia por imunoafínidade, sendo a selecção do método adequado de purificação e do método de recuperação da competência dos especialistas na matéria.

De igual modo, é possível inserir um gene dentro da região ADN-T de um plasmídeo Ti ou Ri obtido a partir respectivamente de A. tumefaeiens ou A., rhizogenes. Assim, é possível construir cassetes de expressão, conforme indicado antes, utilizando estes plasmídeos. São já conhecidas diversas sequências de controlo que ao serem acopladas a uma sequência heteróloga de codificação e transformadas dentro de um organismo hospedeiro demonstram fidelidade na expressão génica no que diz respeito à especificidade tecidual/orgânica da sequência de codificação original. Ver v.g. Benfey, P. N. e Chua, N. H. 81989) Science 244:174-181. As sequências de controlo particularmente convenientes para utilização nestes plasmídeos são os promotores para a expressão do gene, específico das folhas constitutivas, nas diversas plantas relevantes. Outras sequências de controlo úteis compreendem um promotor e um ter-minador obtidos a partir do gene da nopalina-.sintase (NOS). O terminador e o promotor NOS encontram-se presentes no plasmídeo pARC2 que pode ser obtido na Coiecção Americana de Culturas Tipo, designado por ATCC 67238. No caso de se utilizar tal sistema, o gene da virulência (v/>), tanto proveniente do plasmídeo Ti como do plasmídeo Ri, também deve estar presente, quer conjuntamente com a parcela de ADN-T, quer através de um sistema binário em que o gene vir esteja presente num vector independente. Tais sistemas, vectores aqui 40 utilizáveis e métodos para a transformação de células de plantas, estão descritos na patente de invenção norte-americana n° 4 658 082; no pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 913 914 depositado a 1 de Outubro de 1986, tal como referenciado na patente de invenção norte-americana n° 5 262 306 concedida a 16 de Novembro de 1993 a Robeson et ai; e na obra de Simpson, R.B. et al. (1986) Plant MoL BioL 6:403-415 (também referenciada na patente de invenção norte-americana n° 5 262 306). considerando-se todos estes trabalhos aqui totalmente incorporados por referência.

Uma vez construídos, estes plasmídeos podem ser colocados dentro de A. rhizogenes ou A. tumefaciens e estes vectores podem ser utilizados para transformar células de espécies vegetais que normalmente são sensíveis às infecções provocadas por Fusarium ou Alternaria. Por exemplo, as variedades de tomateiro não resistentes {Lycopersicon esculentiim) são muitas vezes atingidas por tais infecções, sendo possível desenvolver novas variedades resistentes que aguentem as doenças induzidas por Alternaria nas culturas de tomateiros acabados de nascer, fazendo-se observar, contudo, que se admite que o emurchecimento dos tomateiros provocado pelo Fusarium seja causado por F. oxysoporum e não por F. monicliforium, tendo em conta que aparentemente o F. oxysoporum não produz fumonisina. Há outras plantas; trans-génicas também contempladas pela presente invenção, incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, as seleccionadas entre soja, milho, sorgo, alfalfa, arroz, trevo, couves, bananeiras, cafeeiros, aipo, tabaco, feijão-frade, algodoeiros, melões e pimenteiros. A selecção de A. tumefaciens ou de A. rhizogenes irá depender da planta que se pretenda transformar. De um modo geral, o organismo preferido para transformação é A. tumefaciens. A maior parte das espécies dicotiledóneas, algumas gimnospérmicas e umas tantas monocotiledóneas (v.g. determinados elementos das famílias Lil tales e A rales) são sensíveis à infecção com A. 41

Tumefaciens. 0 organismo A. rhizogenes também tem uma grande variedade de hospedeiros, salientando-se a maior parte das dicotiledóneas e algumas gmmospérmicas, aí estando incluídos elementos das famílias Leguminosae, Compositae e Chenopodiaceae. As técnicas alternativas que demonstraram ser eficazes para a transformação de plantas por via genética compreendem o bombardeamento com partículas e a electroporação. Ver v.g. Rhodes. C. A. et al. (1988) Science 240, 204-207; Shigekawa, K. e Dower, W. J. (1988) BioTechniques 6, 742-751; Sanford, J. C. et al. 81987) Particulate Science & Technology 5:27-37; e McCabe, D. E. (1988) BioTechnology 6:923-926.

Uma vez transformadas, estas células podem ser utilizadas para regenerar plantas trans-génicas capazes de degradar a fumonisina. Por exemplo, é possível infectar plantas intactas com estes vectores lesionando a planta e introduzindo então o vector no local da lesão. A lesão pode ser provocada em qualquer parte da planta, incluindo as folhas, os caules e as raízes. Em alternativa, é possível utilizar tecidos da planta, sob a forma de um explante. tais como tecidos dos cotilédones ou discos de folhas, sendo esses tecidos inoculados com tais vectores e criados em cultura em condições que favoreçam a regeneração da planta. As raízes ou os rebentos transformados por inoculação de tecido vegetal com A. rhizogenes ou A. tumefaciens, contendo o gene que codifica a enzima de degradação da fumonisina, podem ser utilizados como fontes de tecido vegetal para regenerar plantas transgénicas resistentes à fumonisina, tanto por organogénese como por embriogénese somática. Há exemplos de tais métodos para regenerar tecidos de plantas que foram descritos por Shahin, E. A. (1985) Theor. AppL Genet 69:235-240; na patente de invenção norte-americana n° 4 658 082; por Simpson, R.B. et al.( 1986) em Plant Mol. Biol. 6:403-415; e nos pedidos de patentes de invenção norte-americanas com os números de série 913 913 e 913 914, ambos depositados a 1 de 42

Outubro de 1986. conforme referenciado na patente de invenção norte-americana n° 5 262 306 concedida a 16 de Novembro de 1993 a Robeson et al., considerando-se os textos destas obras aqui incorporados por referência.

Tais células transformadas também podem ser utilizadas para regenerar plantas trans-génicas capazes de exprimir, em tecidos específicos ou de forma constitutiva, consoante o tipo de promotor utilizado, quer as enzimas que degradam as fumonisinas, produzidas por Exophiala spinifera, ATCC 74269 e Rhinocladiella atrovirem, ATCC 74270 ou pela bactéria com o número ATCC 55552, quer a APrcatabolase produzida por tais estirpes. Essas plantas transgénicas podem ser colhidas e os tecidos adequados (por exemplo, de sementes, se for utilizado como promotor um tecido específico de uma semente) podem ser submetidos a técnicas de extracção e purificação proteica em grande escala, podendo as enzimas que degradam as íúmonisinas ou as APi-catabolases ser isoladas para utilização nos processos de desintoxicação originados pelas fumonisinas e pelos produtos da hidrólise das fumonisinas. Há determinadas esterases que estão classificadas como sendo pertencentes à família que tem por elementos comuns a sequência primária e a estrutura global (Cygler M, Schrag JD, Sussman JL, Harel M, Silman I, Gentry MK, Doctor BP (1993) “Relationship between sequence conservation and 3-Dimensional structure in a large family of esterases, lipases and related proteins” Protein Sei 2:366-382). Os iniciadores da RCP foram concebidos com base nas regiões fortemente conservadas desta família de esterases e graças à utilização destes iniciadores foi possível obter um clone de ADNc resultante do isolado 2141.10 de Exophiala spinifera que demonstrou possuir uma homologia significativa com as esterases conhecidas e que foi especificamente induzido pela fumonisina e por outros indutores. Esta esterase pode ser expressa em E. coli e a sua actividade enzimática pode ser medida por meio do ensaio de 43 CCF descrito supra. Se não for obtida nenhuma actividade em E. coli. então a expressão pode ser medida numa levedura ou noutro sistema eucariótico.

Também é possível utilizar outros métodos para clonar o gene. A purificação da proteína e a sequenciação do terminal N permitem conceber sondas hibridantes de um ADN específico; gerar anticorpos a partir da proteína purificada e pesquisar uma biblioteca de expressão; utilizar métodos de enriquecimento de ARN para se obter os ADNc específicos para a cultura induzida. Uma vez confirmado que o gene corresponde à esterase das fumonisinas, é possível então introduzir facilmente o clone de ADNc em vectores de expressão adequados para a expressão da enzima em células de culturas de tecidos de milho, em milho transgénico e também no próprio microrganismo Fusarium moniliforme que é útil para o estudo dos mecanismos de patogénese associados ao fungo e à sua toxina. É possível efectuar então uma avaliação das células de culturas de tecido de milho de expressão transformada ou transitória para pesquisar a resistência às fumonisinas, comparativamente com um tecido transformado de contraprova, podendo as fumonisinas ser realmente utilizadas como um agente de selecção para isolai' células transformadas a partir da cultura de tecidos.

Clonagem do gene da esterase de XanthomonasISphingomonas

Efectuou-se a clonagem do gene da esterase de Xanthomonas numa_biblioteca de expressão que exprime um lambda ZAP, obtida a partir de ADN bacteriano (com um tamanho de 4-8 kb, seleccionado a partir de ATCC 55552) parcialmente digerido com Sau3 A. Foram realizados testes com os agregados de lisados lambda para a experiência com a esterase das fumonisinas por CCF, utilizando como substrato fiimonisina pura, e para os clones positivos efectuou-se o enriquecimento das subamostras dos agregados positivos. Com cada uma das placas preparou-se nova suspensão e analisou-se a actividade no lisado. Purificou-se um clone 44 positivo, cortou-se ao meio com um fago e preparou-se o ADN para sequenciação. Efectuou--se a sequenciação de um fragmento de ADN de 4 kb que continha a actividade da esterase das fumonisinas e descobriu-se que continha uma região de 1589 pares de bases contendo um quadro de leitura ininterrupta de 529 aminoácidos de elevada homologia com os membros da superfamília de tipo B da carboxil-esterase da serina. O quadro de leitura ininterrupta codifica uma proteína hipotética (designada por BEST1) com um péptido de sinal putativo desde o aminoácido 1 até ao 38, proporcionando uma proteína madura com um peso molecular calculado de 51495,63 Dalton e um índice pl de 8,19. Este quadro de leitura ininterrupta revelou uma semelhança de 52,5% e uma identidade de 34% com a sequência de aminoácidos de uma colinesterase do coelho (P37176). Com outras colinesterases foram obtidos valores semelhantes de homologia. A sequência da proteína hipotética BEST1 também tinha uma semelhança de 53,5% e uma identidade de 36,4% com a paranitrilobenzil-esterase (P04058) do Bacilhis subtilis. O quadro de leitura ininterrupta revelou também uma semelhança de 54,6% e uma identidade de 34,9% com a esterase das fumonisinas (Espl) da Exophiala spinifera. Além da sua semelhança global com outras carboxil-esterases de tipo B, as Espl e BEST1 partilham dois domínios curtos de aminoácidos que não foram encontrados noutras esterases conhecidas deste tipo:

Proteína Seauência Desde Até ESP1 ATLM 292 295 BEST1 ATLM 286 289 ESP1 TNI 175 177 BEST1 TNI 172 174

Estes domínios podem estar implicados na especificidade do substrato destas enzimas 45 - (Cygler M, Schrag JD, Sussman JL, Harel M, Silman I, Gentry MK, Doctor BP (1993) “Relationship between sequence conservation and 3-Dimensional structure in a large family of esterases, lipases and related proteins” Protein Scí 2:366-382).

Exemplo 3

Preparação do micélio induzido por AP] e não induzido

Deixou-se crescer o isolado 2141.10 de Exophiala spinifera em caldo de ‘YPD’ durante 5 dias a 28°C, efectuou-se a colheita dos micélios sobre filtros de acetato de celulose de 0,5 μηι e transferiu-se o produto obtido para meio recente constituído por sais minerais de Fries (Gilchrist DG, Grogan RG (1976) “Production and nature of a host-specific toxin from Alternaria alternata f.sp. lycopersicf Phytopathology 66:165-171) corrigido com fumonisina B1 hidrolisada (AP1) (0,5 mg/mL) ou ácido δ-aminobutírico (δ-ΑΒΑ) (1 mg/mL) enquanto fonte única de carbono. Efectuou-se a incubação das culturas ao abrigo da luz durante 48 horas e à temperatura de 28°C e depois removeu-se os sobrenadantes das culturas por filtração através de um filtro de acetato de celulose de 0,5 pm. O emaranhado micelial remanescente foi então lavado com uma solução estéril de sais minerais de Fries e depois foi congelado em azoto líquido e assim foi guardado.

Exemplo 4

Isolamento do ARN de Exophiala spinifera

Os emaranhados miceliais descritos antes (~1 g) foram esmagados e triturados em azoto líquido numa unidade de almofariz e pilão após a adição de 10 mL de “TRIREAGENT” (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) na presença de 0,2 volumes de clorofórmio. Centrifugou-se a massa triturada obtida e fez-se precipitai' com isopropanol o sobrenadante 46 resultante. Extraiu-se o agregado resultante com fenol, fez-se precipitar com etanol e guardou-se à temperatura de -80°C.

Enriqueceu-se a dispersão aquosa de A RN (0,4 mL) para què fosse maior a concentração de ARNm que contém poli-A, utilizando para tal biotina-oligo(dT) e um sistema de esférulas magnéticas com estreptavidina (Promega), em conformidade com as instruções do fabricante. O ARN enriquecido em poliA(+) foi guardado à temperatura de -80°C.

Em primeiro lugar, efectuou-se a síntese da cadeia de ADNc a partir do ARN enriquecido em poliA(+), utilizando a transcriptase reversa M-MLV (37°C, 1 hora). A mistura de reacção foi extraída com fenol e clorofórmio. Foram retiradas aliquotas para a reacção em cadeia com polimerase (RCP), utilizando para tal os iniciadores degenerados identificados nas SEQUÊNCIAS I.D. NOS. la 4: ESP5’-OL 1 GGGGAATTCGARGAYTGNYTNTAYNTNAAYRT (SEQUÊNCIA I.D. NO. 1) ESP5’-OL2 GGGGAATTCMCNGT7\NTNVTNTGGATNYAYGGNGGNG (SEQUÊNCLA I.D. NO. 2) ESP3’-OLl GGGAAGCTTGGRTYNCCNCCRAANKBNGCDATRTT (SEQUÊNCIA I.D. NO. 3) ESP3’-OL2 GGGAAGCTTCNCCNGCNSWYTCNCCRAANADNGTNA (SEQUÊNCIA I.D. NO. 4) A maior parte das bases designadas por “N” eram inosinas.

As condições de reacção no dispositivo que executa os ciclos térmicos foram as seguintes: 1. 94°C, 2 minutos 2. 94°C, 30 segundos 47 3. 45°C, 2 minutos 4. 72°C, 1 minuto

5. repetir os passos 2-4 para 35 X 6. 72°C, 5 minutos.

Realizou-se a electroforese dos produtos da RCP sobre geles de agarose num plano horizontal. Efectuou-se a excisão das faixas que apenas estavam presentes nas pistas induzidas e realizou-se a eluição do ADN. Fez-se digerir o ADN recuperado, utilizando para tal HindIII e EcoRI, e introduziu-se em pBluescript SK+. Recuperou-se efectuou-se a sequenciação de um clone recombinante obtido a partir dos produtos amplificados, utilizando ESP5'-OL2 e ESP3’--OL2 (ESP26-1). A região clonada contém um quadro de leitura ininterrupta com a proteína inicial ou com a sequência parcial de aminoácidos seguinte: ...SFHLYDGASFAANQDVIWTINYRTNTLGFPAAPQLPITQRMLGFLDQRFALDWVQ RNIAAFGGDPRKVT FFGESA... (SEQUÊNCIA I.D. NO. 5). A sequência de aminoácidos indicada supra, obtida a partir do fragmento de ADN de ESP26-1, revelou uma homologia significativa com uma família de proteínas que inclui coli-nesterases, acetilcolinesterases, carboxil-esterases e determinadas lipases (Cygler M, Schrag JD, Sussman JL, Harel M, Silman I, Gentry MK, Doctor BP (1993)-“Relationship between sequence conservation and 3-Dimensional structure in a large family of esterases, lipases and related proteins” Protein Sei 2:366-382).

Exemplos 5-6

Comparação da sequência deduzida de aminoácidos com sequências conhecidas

Em comparação com a sequência publicada por Arpagaus, M, Chatonnet, A., Masson. & 48 . ' J: P., Newton, M., Vaughan, T.A., Bartels, C.F., Nogueira, C.P., La Du, B.N. e Lockridge, O. em J. BioL Chem. 266, 6966-6974 (1991), 43 dos 76 aminoácidos de ESP26-1 eram idênticos a uma colinesterase pancreática do cão.

Numa outra comparação, 32 de 62 aminoácidos de ESP26-1 eram idênticos a uma lipase fúngica, conforme publicado por Lotti, M., Grandori, R., Fusetti, F., Longhi, S., Brocca, S., Tramontano, A. e Alberghina, L., Gene 124, 45-55 (1993).

Exemplo 7

Análise pelas autorradiografias de Northern de Exophiala spinifera induzida e não induzida

Realizou-se a electroforese do ARN total extraído de culturas de Exophiala spinifera, conforme descrito nos exemplos anteriores, sobre geles de agarose que continham formaldeído, transferiu-se para nitrocelulose e hibridou-se com o ADNc de ESP26-1 marcado com j2P e iniciado aleatoriamente. A sonda hibridou com um ARN com um tamanho aproximado de 2,0 kb na pista induzida, mas não na pista não induzida (ver a figura 1).

Exemplo 8

Isolamento do ADNc de comprimento completo de ESP26-1 de Exophiala spinifera Para se obter a extremidade 3’ do ADNc que codifica a esterase putativa recorreu-se a um protocolo de amplificação rápida das extremidades 3’ do ADNc (3’-RACE) (Frohman, M.A.,

Dush, M.K.. e Martin, G.R. 1988 “Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer” Proc. Natl. Acad. Sei. 85:8998-9002). Como matriz para a reacção de transcrição reversa utilizou-se 5 pg de ARN total isolado a partir de micélios de Exophiala spinifera induzida com AP|. A reacção de 49 transcrição reversa e a subsequente amplificação por RCP foram realizadas com um estojo de tipo 3’-RACE (Gibco BRL). O iniciador (ESP3M: GCTAGTTTCGCAGCCAATCA-GGA) (SEQUÊNCIA I.D. NO. 6) específico do gene foi engendrado com base na sequência de ESP26-1.

As condições para a RCP foram as seguintes: 1. 94°C, 4 minutos 2. 94°C, 45 segundos 3. 60°C, 25 segundos 4. 72°C, 3 minutos

5. repetir os passos 2-4 para 40 X 6. 72°C, 10 minutos.

Transferiu-se para nitrocelulose um fragmento resultante de ADN de 1.5 kb e hibridou--se com o ADNc de ESP26-1 sob condições fortemente rigorosas de hibridação e lavagem (última lavagem: 0,1 X SSC. 0,5% de DSS (o mesmo que SDS), a 65°C durante 30 minutos). O fragmento de ADN foi isolado em gel e introduzido num vector pGEM-T (Promega) e transformado dentro de DH5oc (Gibco BRL). Efectuou-se a sequenciação do ADN do plas-mídeo resultante (p3RC-2), utilizando para tal o iniciador universal M13. A comparação das sequências de 3RC-2 e ESP26-1 indicou que o ESP26-1 estava sobreposto a 100% com a extremidade 5’ da sequência do 3RC-2.

Para se obter a sequência do terminal amino recorreu-se a uma estratégia de 5’-RACE (Frohman et aL, supra). Efectuou-se a transcrição reversa de 5 pg de ARN total isolado a partir de micélios de Exophiala spinifera induzida com AP|, utilizando para a transcrição a transcriptase reversa Superscript I RNase H’ (Gibco BRL) com recurso a um iniciador anti-sentido construído 50

em oposição à sequência de ESP26-1 (ESP5’-1: AAAGGCTGCGATGTTCCGCTGTA) (SEQUÊNCIA I.D. NO. 7). Terminou-se o ADNc com um apêndice de dATP, utilizando trans-ferase terminal (Promega), e utilizou-se como matriz para a amplificação sequenciada utilizando um segundo iniciador anti-sentido (ESP5’-2: TCGCTGTGTTATTGGCAGCTGAG (SEQUÊNCIA I.D. NO. 8) específico do gene. C era uma mutação passiva de A. com a finalidade de se criar um local de restrição Pvu II) e utilizando ainda um iniciador poli-T de extremidades bloqueadas (BamT17V: CGCGGATCCGTTTTTTTTTTTTTTTTTV) (SEQUÊNCIA I.D. NO. 9).

As condições para a RCP foram as seguintes: 1. 94°C, 4 minutos 2. 94°C, 45 segundos 3. 40°C, 45 segundos 4. 60°C, 25 segundos 5. 72°C, 3 minutos

6. repetir os passos 2-4 para 41 X 7. 72°C, 10 minutos.

Os produtos da RCP foram ffaccionados sobre um gel de agarose a 1,5%. O produto amplificado foi isolado em gel, introduzido em pGEM-T (Promega) e transformado dentro de DH5 (Gibco BRL). O produto resultante do protocolo 5’-RACE foi sequenciado e comprovou-se que ficava sobreposto, conforme previsto, com o produto do protocolo 3’-RACE e que continha um quadro de leitura ininterrupta de homologia significativa com os membros da super-família da esterase/lipase da serina descrita por Sygler et al. (supra). Efectuou-se a combinação das sequências em sobreposição obtidas pelos protocolos 3;-RACE e 5’-RACE para se obter 51 uma sequência de ADNc correspondente ao quadro completo de leitura ininterrupta. O clone de ADNc de comprimento completo com 1937 pb obtido a partir do isolado 2141.10 de Exuphiala spinifera (abreviadamente ESP1) contém um quadro de leitura ininterrupta de 537 aminoácidos, conforme adiante se indica (SEQUÊNCIA I.D. NO. 10).

MPSRYILSWLLTCFLG1AFGSRCGSSAPTVK1DAGMVVGTTTTVPGTTATVSEFLGVPF AASPTRFAPPTRPVPWSTPLQATAYGPACPQQFNYPEELREITMAWFNTPPPSAGESED CLNLNIY VPGTENTNKAVMVWIY GGALEY GWNSFHLYDGASFAANQDVIVVTINYRT

NILGFPAAPQLPITQRNLGFLDQRFALDWVQRNIAAFGGDPRKVTIFGQSAGGRSVTDV

LLTSMPHNPPFRAAIMESGVANYNFPKGDLSEPWNTTVQALNCTTSIDILSCMRRVDL

ATLMNTIEQLGLGFEYTLDNVTWYRSETARTTGDIARVPVLVGTVANDGLLFVLGEN

DTQAYLEEAIPNQPDLYQTLLGAYPIGSPGIGSPQDQ1AAIETEVRFQCPSAIVAQDSKN

RGEPSWRYYYNÀrFENLELFPGSEVYHSSEVGMVFGTYPVASATALEAQTSKYMQGA

WAAFAKNPMNGPGWKQVPNVAALGSPGKA1QVDVSPATIDQRCALYTHYYTELGT1A

PRTF

Este quadro de leitura ininterrupta (QLI, o mesmo que ORF) mostra uma certa homologia com os membros da superfamília da esterase/lipase da serina descrita por Cygler et al. (supra). A homologia mais intensa corresponde a uma identidade de 35,9% de 320 aminoácidos sobrepostos com a butiril-colinesterase de Oryctolagus cuniculus (coelho). A proteína deduzida Espl contém um péptido de sinal putativo que é provavelmente clivado na posição 26/27, dando origem a uma proteína madura com um peso molecular (PM) calculado de 54953,781 e um índice pi calculado de 4,5. Estes valores calculados são consistentes com os valores LM (o mesmo que MR) e pi da actividade da esterase das fumonisinas, conforme descrito antes.

Uma comparação das regiões de consenso do quadro de leitura ininterrupta da proteína Espl na superfamília das esterases (Cygler et al., supra) revela inúmeras particularidades conservadas, significando que a Espl pode codificar uma esterase da serina. A proteína Esp 52 tem um consenso potencial em 223-228 do local activo da serina; um consenso putativo em 335-341 no local activo do aspartato que é típico da esterases do colesterol e da Drosophila 6 e das proteínas P [a maior parte dos membros desta superfamília, incluindo as carboxil-esterases e as lipases fúngicas, possui glutamato no local activo em vez de aspartato]; e um local activo putativo da histidina que é diferente de qualquer dos membros da família, contendo outros aminoácidos entre G e Η. A proteína madura putativa Esp possui um total de 6 cisteínas, para 3 possíveis pontes dissulfureto, o que é consistente pelo menos com um subconjunto das esterases da superfamília descrita por Cygler et al., supra.

Assim, o QLI da Esp possui a maior parte das marcas características de um membro genuíno da superfamília das lipases/esterases, incluindo uma tríade de locais activos putativos e outros aminoácidos conservados. As regiões de conservação não são consistentes com nenhum subgrupo de substratos (isto é, lipase, colinesterase. carboxil-esterase ou colesterol-esterase), mas parece que contêm algumas das particularidades de alguns destes substratos e parece que a Esp é única entre as esterases conhecidas na sua sequência de consenso His do local activo putativo.

Exenplo 9

Efeito de FBi e APt sobre os coleóptilos do milho

Efectuou-se a excisão de coleóptilos do milho, obtidos a partir de grãos de milho germinados ao fim de 4 dias, ao abrigo da luz, acima do ponto de crescimento, tendo sido colocados em placas de microtitulação de 96 cavidades na presença de 60 pL de água destilada estéril contendo FB| ou AP| nas concentrações aproximadamente equimolares de 1,5, 0,5, 0.15, 0,05. 0,015, 0,005, 0,0015 ou 0,0005 mM, conjuntamente com as contraprovas aquosas. 53

Decorridos 2 dias ao abrigo da luz e a 28°C colocou-se os coleóptilos em presença de luz e realizou-se a incubação durante mais 3 dias. A existência de lesões ou a sua falta foi avaliada do modo seguinte: 0 0,0005 0,0015 0,005 0,015 0,05 0,15 0,5 1,5 mM FB, - +/- + + -r T AP, - - - - - + + = descoloração necrótica castanha do coleóptilo - = ausência de sintomas (o mesmo da contraprova aquosa)

Os resultados (ver o quadro supra) indicam que há pelo menos uma diferença de 30 vezes na toxicidade entre FBi e AP| para os coleóptilos do milho deste genótipo. Isto condiz, de um modo geral, com outros estudos em que a toxicidade dos dois compostos foi comparada em diversos tecidos vegetais: em tecidos de Lemna, a substância APi foi aproximadamente 40 vezes menos tóxica (Vesonder RF, Peterson RE. Labeda D, Abbas HK (1992) “Comparative phytotoxicity of the fumonisins, AAL-toxin and yeast sphingolipids in Lemna minor L (Duckweed)” Arch. Environ. Contam. ToxicoL 23:464-467). Estudos efectuados no tomateiro com a toxina AAL e com a substância FBi indicaram também que a versão hidrolisada da molécula é muito menos tóxica (Gilchrist DG. Ward B, Moussato V, Mirocha CJ (1992) “Genetic and Physiological Response to Fumonisin and AAL-Toxin by Intact Tissue of a Higjer Plant” Mycopathologia 177:57-64). Num estudo recente, Lamprecht et al. confirmaram também uma redução aproximada de 100 vezes na toxicidade da substância .AP] comparativamente com a substância FB] no tomateiro (Lamprecht S, Marasas W. Alberts J, Cawood M, Gelderblom W, Shepard G, Thiel P, Calitz J (1994) “Phytotoxicity of fumonisins and TA--toxin to com and tomato” Phvtopathology #7:383-391). 54

Exemplo 10

Efeito de FBI e AP1 sobre células de tecido de milho criadas em cultura (‘Black JVfexican

Sweet’, BMS)

Acrescentou-se FBi ou APi, em diversas concentrações, a suspensões de células de BMS a crescerem num meio líquido de cultura em placas de polistireno de 96 cavidades. Decorrida 1 semana observou-se a densidade das células nas cavidades, com um fraco poder de amplificação, e comparou-se o crescimento nas cavidades tratadas com a toxina com as cavidades de contraprova que apenas tinham recebido água. O crescimento das células de BMS foi inibido de forma significativa para a concentração de FB] 0,4 μΜ, mas não se observou nenhuma inibição até se atingir uma concentração de AP| 40 μΜ. Isto representa uma diferença aproximada de 100 vezes no que diz respeito à toxicidade para as células dos tecidos de milho criadas em cultura. De igual modo, Van Asch et al. (Vanasch MAJ, Rijkenberg FHJ, Coutinho TA (1992) “Phytotoxicity of fumonisin bl, moniliformin and t-2 toxin to com callus cultures” Phytopathology 82:1330-1332) observaram uma inibição significativa do crescimento do calo do milho num meio sólido para uma concentração de 1,4 μΜ. No entanto, a substância APi não foi experimentada neste estudo.

Exemplo 11

Actividade da catabolase da AP]

Obteve-se um extracto isento de células, que continha a actividade de catabolase, submetendo as células de Exophiala spinifèra, induzidas pelo substrato, a um fenómeno de destruição, utilizando para tal uma batedeira de esférulas em tampão de acetato de sódio a pH 5,2 e recuperando o sobrenadante isento de células por centrifugação e filtração através de um filtro de 0.45 μπι. Testou-se a actividade catabólica fazendo a incubação dos extractos com AP| (estrutura da fumonisina Bt hidrolisada) ou incubando o extracto marcado com I4C e fazendo uma avaliação por CCF sobre sílica C18. O produto APrN[ tem um valor Rf inferior ao do produto AP1? que é detectado quer por varrimento radioactivo do marcador quer por pulve-rização/chamuscagem com H2SO4 da placa de CCF. O produto APrN| não reage com 0 reagente aminado fluorescamina que é vulgarmente utilizado para detectar 0 produto AP| nas placas de CCF, sugerindo tal facto que 0 grupo amina não está presente ou que foi modificado quimicamente. A actividade é maior a 37°C do que à temperatura ambiente, mas a seguir a 30 minutos a 65°C ou a 100°C (não havia nenhuma actividade catabólica de AP,). A actividade é máxima para valores de pH até 9. A pH 9 teve lugar a conversão completa em APj-Ni em 30 minutos. A actividade é retida por uma membrana com um valor crítico de corte com o peso molecular de 30 000 Dalton, mas apenas é retida parcialmente por uma membrana com um valor crítico de corte com um peso molecular de 100 000 Dalton. Foram testados ainda outros substratos que continham aminas para pesquisar a modificação ocasionada pelo extracto impuro. A fumonisina (com ácidos tricarboxílicos acoplados) não é modificada pelo extracto, indicando tal facto que a hidrólise tem de ocorrer em primeiro lugar para que a catabolase seja activa. Há outras bases de cadeia comprida (esfingosina, esfinganina, fitosfin-gosina) que aparentemente não são modificadas pela catabolase impura, sugerindo tal facto que a enzima (ou enzimas) é específica para a estrutura da fumonisina. Também foram purificadas quantidades preparatórias do produto, experimentalmente designado por AP1-N1, tendo sido analisado por RMN-bC. Os resultados obtidos indicam que ao produto APrNi lhe falta um átomo de azoto no grupo amino e que provavelmente contém uma função ceto. Isto pode indicar eventualmente quer a presença de uma amino-oxidase quer a presença de uma enzima 56 liase da amónia. Não se prevê que o produto de qualquer das enzimas venha a revelar qualquer toxicidade significativa (apesar de não terem sido feitas experiências).

Exemplo 12

Demonstração da actividade funcional da esterase

Demonstrou-se a actividade da esterase realizando a expressão do ADNc de E. spinifera em dois sistemas heterólogos (um sistema de expressão de baculovírus/células de insectos e em milho transgénico obtido por bombardeamento com microprojécteis) e detectando depois a actividade da esterase da fumonisina no tecido transformado. Realizou-se o bombardeamento de 44 calos de milho (Hi de tipo Π) com o gene da esterase fundido com o promotor da ubiquitina mais um plasmídeo marcador seleccionável (PAT). Recorrendo à análise por cro-matografia de camada fma verificou-se que 38 linhagens eram positivas para a hidrólise da fumonisina com base na presença de uma mancha sem ácido carboxílico nas placas de CCF. Em 4 calos de contraprova negativa não houve tais manchas. Foram obtidos resultados semelhantes em células de insectos infectadas com um vector de expressão de baculovíms que continha apenas a esterase. A actividade da esterase também foi detectada nos tecidos de folhas de plantas de milho regeneradas TO. Com um punção foram retiradas 10 amostras de folhas (com um diâmetro de 4 mm) correspondentes à sexta folha de plantas regeneradas com a mesma idade (fase de desenvolvimento de 7 folhas), representando quatro classes de transformantes: apenas o marcador seleccionável (Bar), expressor fraco de esterase (+). expressor médio de esterase (++) e expressor elevado de esterase (+++) (com base nos dados recolhidos a partir dos calos). Foram obtidas amostras de quatro plantas representando diferentes fenómenos em cada classe. As amostras 57 obtidas com os punções foram colocadas em suspensão em 200 pL de tampão de acetato de sódio 50 mM a pH 5,2 que continha leupeptina e pepstatina para inibir as proteinases, tendo a homogeneização sido executada por agitação rápida com esférulas de aço de 5/32”, duas vezes durante 30 segundos. Centrifugou-se os homogenados a 4000 r.p.m. durante 10 minutos e a 4°C e recuperou-se 150 pL de sobrenadante. Procedeu-se a uma análise das amostras para pesquisar a concentração proteica (experiência de Bradford) e ajustou-se para a mesma concentração proteica e depois efectuou-se uma análise para pesquisar a actividade da esterase da fumonisina utilizando como substrato l4C-FBl. Os produtos das reacções ao fim de 30 minutos ou ao fhn de 4 horas foram aplicados sobre placas de CCF (Cl8), tendo a revelação sido realizada com MeOH:4% KC1 (3:2). Efectuou-se o varrimento das placas com um aparelho de leitura radiométrico (AMB1S) e estabeleceu-se uma classificação para a actividade da esterase da fumonisina num produto, ++ (até 50% de conversão em produto) e +++ (entre 90%-100% de conversão em produto).

Os resultados obtidos foram os seguintes: AMOSTRA CLASSIFICAÇÃO DOS CALOS (30 MINUTOS) CLASSIFICAÇÃO DAS FOLHAS (30 MINUTOS) CLASSIFICAÇÃO DAS FOLHAS (4 HORAS) AI -r - - Contraprova B1 - - - Cl ++ - - Dl - -5- Contraprova EI - - - F1 +++ + ++ G1 + +++ Hl -r+ + A2 -1_ - - Contraprova B2 - - - 58 AMOSTRA CLASSIFICAÇÃO DOS CALOS (30 MINUTOS) CLASSIFICAÇÃO DAS FOLHAS (30 MINUTOS) CLASSIFICAÇÃO DAS FOLHAS (4 HORAS) Contraprova C2 - - - D2 +++ +++ +-f E2 4+ + +-Γ F2 - - - G2 +++ + -H-+ H2 +++ + +++

Em suma, 8 ou 12 expressores de calos foram positivos no que diz respeito à expressão das folhas. Todas as contraprovas negativas mais 4 expressores de calos foram negativos. Dos quatro expressores de calos “+++”. apenas um (D2) revelou o mesmo nível elevado (experiência de 30 minutos), mas todos foram positivos.

Exemplo 13

Desintoxicação dos cereais colhidos A presente invenção também se refere a um método para efectuar a desintoxicação provocada por uma fumonisina ou por uma micotoxina estruturalmente congénere com uma enzima que tenha a estrutura das enzimas que degradam as fumonisinas ou da catabolase da AP! produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou RhinocladieUa atrovirem. ATCC 74210 ou pela bactéria com a referência ATCC 55552 durante a transformação de cereais para a produção de alimentos para consumo animal ou humano. Uma vez que a amomação atmosférica dos cereais demonstrou ser um método ineficaz de desintoxicação (ver B. Fitch Haumann, “Eradicating Mycotoxin in Food and Feeds”, INFORM 6:248-257 (1995), tal metodologia é particularmente crítica quando a desintoxicação transgénica não for aplicável.

No caso vertente, a enzima de degradação da fumonisina e/ou a catabolase da AP| 59 /

produzida por Exophiala spimfera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirem, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552 são colocadas nos cereais durante o procedimento industrial de transformação, em fases adequadas do processo e em quantidades eficazes para a desintoxicação provocada pelas fumonisinas ou pelas micotoxinas estruturalmente congéneres. A desintoxicação segundo este método pode ocorrer não só durante a transformação industrial dos cereais mas também em qualquer momento antes de se alimentar os animais com os cereais ou antes de se incorporar os cereais num produto alimentar para consumo humano.

As enzimas pode ser introduzidas durante a transformação industrial, por métodos convenientes, por exemplo, por lavagem ou pulverização, ou sob uma forma seca ou liofilizada ou ainda sob a forma de um pó, dependendo isso da natureza do processo de trituração e/ou da fase de transformação industrial em que tem lugar o tratamento enzimático. Para um conhecimento geral ver Hoseney, R.C., Principies of cereal Science and Technology. ‘American Assn. of Cereal Chemists, Inc.’, 1990 (especialmente os capítulos 5, 6 e 7); Jones, J.M., Food Safety, Eagan Press, St. Paul, MN, 1992 (especialmente os capítulos 7 e 9); e Jelen, P., Introduction to Food Processing, Restan Publ. Co., Reston, VA, 1985. Os cereais transformados industrialmente, destinados a rações animais, podem ser tratados com uma quantidade eficaz das enzimas sob a forma de um inoculante ou de um aditivo probiótico, por exemplo, ou em qualquer forma reconhecida pelos especialistas no domínio da produção de alimentos para animais. Prevê-se que as enzimas da presente invenção sejam particularmente úteis na desintoxicação durante a transformação industrial e/ou na alimentação de animais, antes da sua utilização, uma vez que tais enzimas têm actividade dentro de limites bastante amplos de variação do pH. A esterase da Exuphilia spmifera, ATCC 74269, demonstrou que -77 60 tinha actividade para valores de pH compreendidos entre cerca de 3 e cerca de 6 e a esterase produzida pela bactéria com a designação ATCC 55552 revelou um domínio de actividade para valores de pH compreendidos entre cerca de 6 e cerca de 9.

Exemplo 14

Produção de microrganismos ruminais por técnicas da engenharia genética É possível produzir microrganismos ruminais por técnicas da engenharia genética de modo a conterem e a exprimirem tanto as enzimas que degradam as fumonisinas como a catabolase da APi produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552, ou uma combinação de tais enzimas. A produção de microrganismos por técnicas da engenharia genética é agora uma especialidade consagrada e os microrganismos ruminais assim concebidos podem ser acrescentados aos alimentos por qualquer meio convencional, por exemplo, como aditivo probiótico ou inoculante. Além disso, os microrganismos capazes de trabalharem como biorreactores podem ser produzidos artificialmente de modo a serem capazes de produzir em grande escala tanto as enzimas de degradação das fumonisinas como a catabolase da APi produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552.

ENUMERAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Duvick, Jon

Rood, Tracy A. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Enzimas para a desintoxicação provocada pelas fumonisinas” (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Pioneer Hi Bred International (B) RUA: 700 Capital Square, 400 Locust Street (C) CIDADE: Des Moines

(D) ESTADO. IA (E) PAIS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 50309 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR. CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Microsoft Windows 3.1- Notepad (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO:

(A) NUMERO DO PEDIDO (B) DATA DE DEPÓSITO. (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Roth, Michael J. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 29 342

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: 0272 US (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: ÍA) TELEFONE: 515-248-4895 (B) TELEFAX: 515-248-4934 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: sonda

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GGGGAATTCG ARGAYTGNYT NTAYNTNAAY RT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: sonda

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: GGGGAATTCM CNGTNNTNVT NTGGATNYAY GGNGGNG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 bases

63 (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: sonda

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

GGGAAGCTTG GRTYNCCNCC RAANKBNGCD ATRTT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: sonda

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: GGGAAGCTTC NCCNGCNSWY TCNCCRAANA DNGTNA 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 76 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (parcial)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Ala Asn Gin .Asp 15

Ser Phe His Leu Tir Asp Gi Ala Ser Phe Ala 5 10

Vai fe Vai Vi Tlr 20 Piro Ala Ala Piro Gin 35 Leu Asp Gin Arg Phe 50 Ala Phe GE GE Asp 65 Ala fc Asi Tir Arg Thr 25 Leu Prro De Thr Gin 40 Ala Leu Asp Tip Vai 55 Piro Aig Lis Vai Thr 70

Asn fls Leu CS Fhc 30

Arg Asn Leu GE Phe 45

Qn Arg Asn De

Phe Phe GE Gu 75 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUENCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: sonda

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: GCTAGTTTCG CAGCCAATCA GGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUENCIA ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: sonda

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

AAAGGCTGCG ATGTTTCCGCT GTA 65 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: sonda

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: TCGCTGTGTT ATTGGCAGCT GAG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: sonda

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: CGCGGATCCG ΤΤΊΓΤΊΤΠΤΤ TTTTTTTV 28 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 527 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: ΝΑΟ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Met Pro Ser Oi Dc Ala Lis Ile Asp Gli Thr Thr Ala Ser Pro Ser Thr Pro Gin Phe Asn Phe Asn Thr Asn Leu Asn Vai Met Vai Ser Phe His Vai Ile Vai Pro Ala Ala Lai Asp Gin Ala Phe Gli Ala Gli Gli Asn Pro Pro Tir Asn Phe

Aig Tir 5 De Phe Oi 20 Ser Ala Gli 35 Met Ala Thr 50 Vai Thr Arg 65 Phe Leu Gin 80 Ala Tir Pro 95 Glu Pro Pro 110 Pro De Tir 125 Vai Tip De 140 Tir Leu Tir 155 Asp Vai Thr 170 De Pro Gin 185 Leu Arg Phe 200 Ala Gli Asp 215 Pro Arg Ser 230 Vai Phe Arg 245 Ala Pro Lis 260 Gli

Leu Ser Tip Arg Cis Gli Vai Vai GD Ser Glu Phe Ala Pro Pro Thr Ala Tir Glu Leu Arg Ser Ala GD Pro Gli Thr Gli Gli Ala Gli Ala Ser Asn Tir Arg Pro De Thr Leu Asp Τφ Arg Lis Vai Asp Vai Lai Ala De Met Asp Leu Ser

Leu 10 Leu Thr Scr 25 Ser Ala Thr 40 Thr Thr Leu 55 GD Vai Thr 70 Arg Pro GD 85 Pro Ala Glu 100 De Thr Glu 115 Ser Glu Glu 130 Asn Thr Leu 145 Glu Tir Phe 160 Ala Ala Thr 175 Asn De Gin 190 Arg Asn Vai 205 Gin Arg Thr 220 De Phe Leu 235 Thr Ser Glu 250 Ser GD Glu 265 Pro Τφ

Cis Phe Leu 15 Pro Thr Vai 30 Thr Vai Pro 45 Pro Phe Ala 60 Vai Pro Τφ 75 Cis Pro Gin 90 Met Ala Trp 105 Asp Cis Leu 120 Asn Lis Ala 135 GD Trp Asn 150 Asn GDi Asp 165 Leu GD Phe 180 Leu GD PJie 195 Asn De Ala 210 GD Gin Ser 225 Met Pro His 240 Vai Ala Asn 255 Asn Thr Thr 270

Vai Gin Ala Leu Asn Cis Thr Thr Ser De Asp De Leu Ser Cis 275 280 285 Met Aig Arg Vai Asp Leu Ala Thr Leu Met Asn Thr De Glu Gin 290 295 300 Leu Gli Leu GU Phe Glu Tir Thr Leu Asp Asn Vai Thr Vai Vai 305 310 315 Tir Aig Ser Glu Thr Ala Aig Thr Thr GU Asp De Ala Aig Vai 320 325 330 Pro Vai Leu Vai GU Thr Vai Ala Asn Asp GU Leu Leu Phe Vai 335 340 345 Leu GU Glu Asn Asp Thr Gin Ala Tir Leu Glu Glu Ala De Pro 350 355 360 Asn Gin Pro Asp Leu Tir Gin Thr Leu Leu GU Ala Tir Pro De 365 370 375 GU Ser Pro GU De GU Ser Pro Gin Asp Gin De Ala Ala De 380 385 390 Glu Thr Glu Vai Arg Phe Gin Cis Pro Ser Ala De Vai Ala Gin 395 400 405 Asp Ser Arg Asn Arg GU lie Pro Ser Trp Arg Tir Tir Tir Asn 410 415 420 Ala Thr Phe Glu Asn Leu Glu Leu Phe Pro GU Ser Glu Vai Tir 425 430 435 His Ser Ser Glu Vai GU Met Vai Phe GU Thr Tir Pro Vai Ala 440 445 450 Ser Ala Thr Ala Lai Glu Ala Gin Thr Ser Lis Tir Ma Gin GU 455 460 465 Ala Trp Ala Ala Phe Ala Lis Asn Pro Ma Asn GU Pro GU Trp 470 475 480 Lis Gin Vai Pro Asn Vai Ala Ala Leu GU Ser Pro GU Lis Ala 485 490 495 lie Gin Vai Asp Vai Ser Pro Ala Thr De Asp Gin Arg Cis Ala 500 505 510 Leu Tir Thr His Tir Tir Thr Glu Leu GU Thr De Ala Pro Arg 515 520 525

Thr Phe

Claims (53)

1 Reivindicações 1. Método para a desintoxicação provocada pela fumonisina ou por uma micotoxina estruturalmente congénere, o qual consiste em fazer reagir a fumonisina ou a micotoxina congénere com uma enzima de degradação da fumonisina, tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirem, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552.

2. Método para efectuar a desintoxicação provocada por uma fumonisina, por uma micotoxina estruturalmente congénere, por um produto da hidrólise da fumonisina ou por um produto da hidrólise de uma micotoxina estruturalmente congénere, o qual consiste em fazer reagir o produto da hidrólise com uma catabolase da AP \ tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552.

3. Método para a desintoxicação provocada por uma fumonisina ou por uma micotoxina estruturalmente congénere e para realizar a desintoxicação provocada por um produto da hidrólise da fumonisina ou por um produto da hidrólise de uma micotoxina estruturalmente congénere, o qual consiste em fazer reagir a fumonisina com uma enzima de degradação da fumonisina tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552 e em fazer reagir o produto da hidrólise com uma catabolase da AP i tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, em que a fumonisina, a micotoxina estruturalmente congénere, o produto da hidrólise da fumonisina ou o produto da hidrólise de uma micotoxina estruturalmente congénere se encontra presente nos cereais colhidos. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4. em que a reacção de desintoxicação tem lugar durante a armazenagem dos cereais colhidos ou então durante a transformação industrial dos cereais colhidos. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a enzima é aplicada numa fase de lavagem ou por pulverização. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5. em que a reacção de desintoxicação tem lugar nos cereais transformados industrialmente que irão ser utilizados como alimentos para animais. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o cereal em causa é o milho nas espigas, o milho retirado das espigas, pés de trigo cortados ou grãos de cevada ou de arroz. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, em que a micotoxina estruturalmente congénere é a micotoxina AAL e a enzima em causa é a enzima que degrada as fumonisinas, tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269. 10.

3 Método para a produção de uma enzima que degrada as fumonisinas, tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552. o qual consiste em isolar a enzima a partir de uma planta transgénica que realize a sua expressão.

11. Método para a produção de uma catabolase de APi, tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552, o qual consiste em isolar a enzima a partir de uma planta transgénica que realize a sua expressão.

12. Microrganismo produzido por técnicas da engenharia genética, o qual compreende um vector de expressão capaz de exprimir proteínas em microrganismos, compreendendo o referido vector uma sequência nucleotídica que codifica uma enzima de degradação das fumonisinas, tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552.

13. Microrganismo produzido por técnicas da engenharia genética, o qual compreende um vector de expressão capaz de exprimir proteínas em microrganismos, compreendendo o referido vector uma sequência nucleotídica que codifica a catabolase de APi, tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552.

14. Microrganismo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 ou 13, o qual é um microrganismo ruminai. & - 4

15. Composição probiótica, ou uma composição inoculante alimentar, a qual compreende um microrganismo produzido por técnicas da engenharia genética de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 14.

16. Método para identificar células vegetais transformadas, utilizando para tal uma espécie de Fusarium ou a toxina produzida pelo Fusarium, enquanto marcador fítotóxico, o qual compreende os passos seguintes: (a) criar em cultura células ou tecidos retirados de uma planta relevante seleccionada num meio de cultura; (b) introduzir nas células da cultura pelo menos uma cópia de uma cassete de expressão que compreenda uma região codificante que codifique uma enzima de degradação das fumonisinas, tal como produzida por Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirem, ATCC 74210 ou pela bactéria com a designação ATCC 55552, ligada funcionalmente às sequências de controlo que permitem que a região de codificação seja transcrita e traduzida na célula; (c) introduzir o Fusarium ou a toxina no meio de cultura; e (d) identificar as células transformadas, enquanto células sobreviventes na cultura.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a toxina é uma fumonisina ou uma micotoxina estruturalmente congénere.

18. Fungo seleccionado entre Exophiala spinifera (ATCC 74269) e Rhinocladiella atrovirens (ATCC 74210).

19. Bactéria com a designação ATCC 55552.

20. Sequência nucleotídica que compreende uma sequência de codificação seleccionada entre: (a) uma sequência que codifica (i) a sequência de aminoácidos de ESP1 designada por SEQ. ID NO. 10; ou (ii) a sequência de aminoácidos de BEST1 identificada na figura 2; (b) uma sequência que possui pelo menos uma homologia de 85% com uma sequência de (a) e codifica um polipeptido que degrada uma fumonisina; (c) uma sequência capaz de hibridar com uma sequência de (a) sob condições rigorosas e que codifica um polipeptido que degrada uma fumonisina; e (d) um fragmento de uma sequência de (a), (b) ou (c), em que o referido fragmento codifica um polipeptido que degrada uma fumonisina.

21. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 20, a qual é uma sequência de ADN ou de ARN.

22. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 20, em que a sequência de (a)(ii) é a sequência de ADN identificada na figura 1.

23. Polipeptido codificado por uma sequência de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 20, 21 ou 22.

24. Cassete de expressão que compreende (a) uma sequência de codificação, tal como definida numa qualquer das reivindicações 20, 21 ou 22; e (b) sequências de controlo fim-cionalmente ligadas à sequência de codificação que permite a sua transcrição e a sua tradução numa célula hospedeira.

25. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 24, a qual compreende um promotor capaz de orientar a expressão ou (a) constitutivamente nas células de uma planta ou (b) em tecidos específicos de uma planta.

26. Vector de expressão que compreende uma cassete de expressão de acordo com a reivindicação 24.

27. Célula hospedeira transformada com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 26.

28. Célula de acordo com a reivindicação 27, a qual é uma célula de uma planta.

29. Célula de acordo com a reivindicação 27, a qual é um sistema de expressão de baculovírus/ /células de insectos, transformado por um vector de acordo com a reivindicação 25, em que a cassete de expressão contém uma sequência de codificação tal como definida na reivindicação 22.

30. Célula de acordo com a reivindicação 28, a qual é uma célula de milho, tomateiro, soja, alfalfa, arroz, trevo, couves, bananeira, cafeeiro, aipo, tabaco, feijão-frade, algodão, 7 melão ou pimenteiro.

31. Método para a produção de um polipeptido de acordo com a reivindicação 23, o qual consiste em criar em cultura uma célula de acordo com a reivindicação 28 em condições tais que permitam que tenha lugar a expressão do polipeptido.

32. Método para a desintoxicação provocada por uma fumonisina ou por uma micotoxina estruturalmente congénere, o qual consiste em fazer reagir a fumonisina ou a micotoxina estruturalmente congénere com um polipeptido de acordo com a reivindicação 23.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a reacção de desintoxicação tem lugar durante a armazenagem dos cereais colhidos ou então durante a transformação industrial dos cereais colhidos.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a enzima é aplicada numa fase de lavagem ou por aspersão.

35. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 32 ou 33, em que a reacção de desintoxicação tem lugar nos cereais transformados industrialmente que irão ser utilizados como alimentos para animais.

36. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a micotoxina estruturalmente congénere é a toxina AAL e a enzima é um polipeptido codificado pela sequência nucleotídica 8 identificada na figura 1.

37. Célula de acordo com a reivindicação 27, a qual é um microrganismo.

38. Célula de acordo com a reivindicação 37, a qual é um microrganismo ruminai.

39. Composição probiótica, ou uma composição inoculante alimentar, que contenha um microrganismo de acordo com uma qualquer das reivindicações 37 ou 38.

40. Método para identificar células vegetais transformadas, utilizando uma espécie de Fusarium ou a toxina produzida pelo Fusarium, enquanto marcador fitotóxico, o qual compreende os passos seguintes: (a) criar num meio de cultura células vegetais de acordo com uma qualquer das reivindicações 28 ou 30; (b) introduzir o Fusarium ou a toxina no meio de cultura: e (c) identificar as células transformadas, enquanto células sobreviventes na cultura.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a toxina é uma fumonisina ou uma micotoxina estruturalmente congénere.

42. Enzima que degrada uma fumonisina susceptível de ser obtida a partir de Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atrovirens, ATCC 74210 ou a partir da bactéria designada por ATCC 55552. >9 43. Método para a produção de uma enzima que degrada uma fumonisina de acordo com a reivindicação 42, isolando a referida enzima a partir de Exophiala spinifera, ATCC 74269 ou Rhinocladiella atmvirens, ATCC 74210 ou a partir da bactéria designada por ATCC 55552.

44. Enzima esterase da fiimonisina que contém um domínio amino ATLM e um domínio aminoácido TNT.

45. Método para realizar a desintoxicação provocada por uma fumonisina ou por uma micoto-xina estruturalmente congénere, o qual consiste em fazer reagir a fumonisina ou a mico-toxina congénere com uma esterase da fumonisina de acordo com a reivindicação 44.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a fumonisina, a micotoxina estruturalmente congénere, o produto da hidrólise da fumonisina ou o produto da hidrólise de uma micotoxina estruturalmente congénere se encontra presente nos cereais colhidos.

47. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 45 ou 46, em que a reacção de desintoxicação tem lugar durante a armazenagem dos cereais colhidos ou durante a transformação industrial dos cereais colhidos.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que a enzima é aplicada numa fase de lavagem ou por aspersão 49. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 45 a 48, em que o cereal em causa é o milho nas espigas, milho retirado das espigas, pés de trigo cortados ou grãos de cevada ou de arroz.

50. Microrganismo que compreende um vector de expressão capaz de exprimir proteínas em microrganismos, compreendendo o referido vector uma sequência nucleotídica que codifica uma enzima de acordo com a reivindicação 42.

51. Microrganismo de acordo com a reivindicação 50, o qual é um microrganismo ruminai.

52. Composição probiótica, ou uma composição inoculante alimentar, a qual compreende um microrganismo de acordo com uma qualquer das reivindicações 50 ou 51.

53. Método para identificar células vegetais transformadas, utilizando para tal uma espécie de Fusarium ou a toxina produzida pelo Fusarium, enquanto marcador fitotóxico, o qual compreende os passos seguintes: (a) criar em cultura células ou tecidos retirados de uma planta relevante seleccionada num meio de cultura; (b) introduzir nas células da cultura pelo menos uma cópia de uma cassete de expressão que compreenda uma região codificante que codifica uma enzima de acordo com a reivindicação 42, ligada funcionalmente às sequências de controlo que permitem que a região de codificação seja transcrita e traduzida na célula; (c) introduzir o Fusarium ou a toxina no meio de cultura; e (d) identificar as células transformadas, enquanto células sobreviventes na cultura. 11

54. Sequência nucleotídica que compreende uma sequência codifícante que codifica uma enzima de acordo com a reivindicação 42.

55. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 54, a qual é uma sequência de ADN ou de ARN.

56. Cassete de expressão que compreende (a) uma sequência codifícante tal como definida numa qualquer das reivindicações 54 ou 55; e (b) as sequências de controlo fimcionalmente ligadas a sequência codifícante que permite a sua transcrição e a sua tradução numa célula hospedeira.

57. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 56, a qual compreende um promotor capaz de orientar a expressão ou (a) constitutivamente nas células de uma planta ou (b) em tecidos específicos de uma planta.

58. Vector de expressão que compreende uma cassete de expressão de acordo com a reivindicação 57.

59. Célula hospedeira transformada por um vector de expressão de acordo com a reivindicação 58.

60. Célula de acordo com a reivindicação 59, a qual é uma célula de uma planta. 12

61. Célula de acordo com a reivindicação 60, a qual é uma célula de milho, tomateiro, soja, alfalfa, arroz, trevo, couves, bananeira, cafeeiro, aipo, tabaco, feijão-frade, algodão, melão ou pimenteiro.

62. Método para a produção de um polipeptido de acordo com a reivindicação 42, o qual consiste em criar em cultura uma célula de acordo com a reivindicação 59 em condições tais que permitam que tenha lugar a expressão do polipeptido. Lisboa, 25 de Setembro de 2000

Resumo F.nzimas para a desintoxicação provocada pelas fumonisinas” A invenção descreve métodos para identificar organismos capazes de degradarem as fumonisinas. As fumonisinas podem ser incorporadas num meio de cultura para a selecção de organismos resistentes às fumonisinas e/ou capazes de crescerem em fumonisinas, enquanto fonte única de carbono. Utilizando este método, foi possível identificar vários organismos. Tais organismos podem ser utilizados para isolar a enzima e o gene responsável que confere resistência às fumonisinas. O gene pode ser clonado e inserido num vector de expressão adequado, de modo a que a proteína possa ser melhor caracterizada. Além disso, o ADN que codifica a resistência às fumonisinas pode ser utilizado para transformar células de plantas normalmente sensíveis às infecções provocadas pelo Fusarium ou por outros fungos produtores de toxinas. As plantas podem ser regeneradas a partir das células vegetais transformadas. Assim sendo, é possível produzir uma planta transgénica com capacidade para degradar as fumonisinas e também com capacidade para produzir as enzimas degradativas. A invenção descreve também métodos para efectuar a desintoxicação durante a transformação industrial de cereais, nos alimentos para animais e nos microrganismos ruminais. Lisboa, 25 de Setembro de 2000