MXPA01000449A

MXPA01000449A - Polinucleotidos de amino poliol amina oxidasa y polipeptidos relacionados y metodos de uso.

Info

Publication number: MXPA01000449A
Application number: MXPA01000449A
Authority: MX
Inventors: Joyce R Maddox
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2002-11-29
Also published as: CA2333085C; BR9912076A; US6211434B1; HUP0202659A3; AR021163A1; HUP0202659A2; CA2333085A1; WO2000004159A1; AU4976999A; EP1095151A1; JP2002520058A

Abstract

La presente invencion proporciona polinucleotidos y polipeptidos relacionados de la enzima APAO aislada de la Exophiala spinifera y Rhinocladiella atrovirens. Adicionalmente, los polinucleotidos que codifican la enzima APAO pueden ser usados para tranformar celulas vegetales normalmente susceptibles al Fusarium u otra infeccion de hongos productores de toxinas. Las plantas pueden ser regeneradas a partir de las celulas vegetales transformadas. Adicionalmente, la presente invencion se proporciona para la expresion tanto de la APAO como de una fumonisina esterasa en una planta transgenica. En esta forma, una planta transgenica puede ser producida con la capacidad de degradar la fumonisina, asi como con la capacidad de producir las enzimas de degradacion. Ademas, la presente invencion proporciona metodos para producir la enzima APAO en ambos sistemas, procarioticos y eucarioticos no vegetales. Tambien se describen metodos para la desintoxicacion en granos, procesamiento de granos, ensilaje, cultivo de alimentos y en alimentacion de animales y en microbios de rumiantes.

Description

POLINUCLEOTIDQS DE A INO POLIOL AMINA QXIDASA Y POLIPEPTIDOS RELACIONADOS Y MÉTODOS DE USO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a la 5 detección y aislamiento de fumonisina y enzimas que degradan API y a composiciones y métodos para desintoxicación in vivo o degradación de fumonisina o su producto de hidrólisis API. Este método tiene amplia aplicación en biotecnología agrícola y agricultura de cultivo y en el mejoramiento de la calidad de klO granos alimenticios. Las enfermedades de hongos son problemas comunes en la agricultura de cultivo. Se han dado muchos avances en contra de las enfermedades de plantas como se ejemplifica por el uso de plantas híbridas, pesticidas y prácticas agrícolas 15 mejoradas. Sin embargo, como cualquier agricultor o jardinero casero puede confirmar, los problemas de enfermedad de hongos en plantas continúan causando dificultades en la cultivación de vegetales. Así, existe una necesidad continua de nuevos métodos y materiales para resolver los problemas causados por las 20 enfermedades por hongos de plantas. Estos problemas pueden satisfacerse a través de una diversidad de propuestas. Por ejemplo, los organismos infecciosos pueden ' controlarse a través del uso de agentes que son selectivamente biocidas para los patógenos. Otro método es la interferencia con el mecanismo por el cual el patógeno invade a la planta huésped de cultivo. Aún otro método, en el caso de patógenos que causan pérdidas de cultivo, es la interferencia con el mecanismo por el cual el patógeno causa daño a la planta huésped de cultivo. Aún otro método, en el caso de patógenos que producen toxinas que son indeseables a los mamíferos u otros animales que se alimentan de plantas de cultivo, es la interferencia con la producción de toxina, almacenamiento o actividad. Esta invención cae dentro de las últimas dos categorías. Desde su descubrimiento y elucidación estructural en 1988 (Bezuidenhout et al . , Journal Chem Soc, Chem Commun 1988: 743-745 (1988)), las fumonisinas se han reconocido como un problema potencialmente serio en ganado alimentado con maíz. Están unidos a diversas toxicosis animales que incluyen leucoencefalomalacia (Marasas et al . , Onderstepoort Journal of Veterinary Research 55: 197-204 (1988); ilson, et al , American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians : Abstracts 33rd Annual Meeting, Denver, Colorado, October 7-9, 1990, Madison, Wisconsin, USA) y edema pulmonar de porcino (Colvin, et al , Mycopa thologia 117: 79-82 (1992)). También se sospecha que las fumonisinas son carcinógenas (Geary W (1971) Coord Chem Rev 7: 81; Gelderblom, et al . , Carcinogenesis 12: 1247-1251 ' (1991); Gelderblo , et al . , Carcinogenesis 13: 433-437 (1992)).

Aislados de Fusarium en sección Liseola producen fumonisinas en cultivo a niveles de 2 a >4000 ppm (Leslie, et al , Phytopathology 82: 341-345 (1992)). Aislados de maíz (predominantemente población de apareamiento A) están entre los productores más altos de fumonisina. (Leslie et al . , supra ) . Los niveles de fumonisina detectados en maíz cultivado en campo han fluctuado ampliamente dependiendo de la ubicación y periodo de crecimiento, pero los estudios precosecha y postcosecha del maíz de campo han indicado que existe potencial para niveles altos de fumonisinas (Murphy, et al , J Agr Food Chem 41: 263-266 (1993)) . Los " estudios de productos alimenticios y de alimentación también han detectado fumonisina (Holcomb, et al . , Food J Agr Chem 41: 764-767 (1993); Hopmans, et al . , Food J Agr Chem 41: 1655-1658 (1993); Sydenham, et. al , J Agr Food Chem 39: 2014-2018 (1991)). La etiología del moho de la mazorca Fusarium está deficientemente entendida, aunque el daño físico a la mazorca y ciertas condiciones ambientales pueden contribuir a su presencia (Nelson, Mycopa thologia 117: 29-36 (1992) ) . Fusarium puede aislarse desde la mayoría del maíz cultivado, aún cuando no esté visible el moho. La relación entre la infección de la planta de semilla y las enfermedades del tallo y la mazorca causadas por Fusarium no está clara. La resistencia genética al moho visible de almendra se ha identificado (Gendloff, et al . , Pytopa thology 76: 684-88 (1986); Hdlley, et al . , Plant Dis 73: 578-580 (1989)), pero la relación entre el moho visible y la producción de fumonisina debe aún ser elucidada.

Las fumonisinas han mostrado en estudios de células de mamíferos in vitro que inhiben la biosíntesis de esfingolípidos a través de la inhibición de la enzima esfingosin N-acetil transferasa, lo que resulta en la acumulación del precursor esfinganina (Norred, et al . , Mycopa thlogia 117: 73-78 (1992); Wang, et al . , Biol Chem 266: 14486 (1991); Yoo, et al , Toxicol Appl Pharmacol 114: 9-15 (1992); Nelson, et al . , Annu Rev Phytpa thol 31 :233-252 (1993)) . Es probable que la inhibición de esta ruta explique al menos algo de la toxicidad de la furnomicina, y el apoyo para esto viene de las medidas de esfinganina: relaciones de esfingosina en animales alimentados con fumonisina purificada (Wang, et al , J Nutr 122: 1706 1716 (1992)). Las fumonisinas también afectan el crecimiento de células vegetales (Abbas, et al . , Weed Technol 6: 548-5S2 (1992); Vanasch, et al , Phytopa thology 82: 1330-1332 (1992); Vesonder, et al . , Arch Environ Contam Toxicol 23: 464-467 (1992)). Kuti et al . , (Abstract, Annual Meeting American Phytopathological Society Memphis TN APS Press 1993) reportó sobre la capacidad de las fumonisinas agregadas exógenamente para acelerar el desarrollo de la enfermedad e incrementar la esporulación de Fusarium moniliforme y Fusarium oxysporum en tomate. Las enzimas que degradan la toxina fumonisina de hongo en su forma desesterificada (por ejemplo API de FBI) han sido identiricadas en la patente Norteamericana no. 5,716,820, expedida el 10 de febrero de 1998, la patente Norteamericana no. 5,792,931 expedida el 11 de agosto de 1998; y las solicitudes norteamericanas pendientes nos. 08/888,950 y 08/888,949, ambas presentadas el 7 de julio de 1997, y todas incorporadas por este medio para referencia. Se entiende que API como se usa en la presente designa la forma hidrolizada de cualquier fumonisina, FBI, FB2, FB3, FB4, o cualesquier otros compuestos similares a API, que incluyen compuestos similares a API producidos sintéticamente, que contienen un grupo amina C-2 o C-1 y uno o más grupos hidroxilo adyacentes. Las plantas que expresan una enzima de fumonisina esterasa, infectadas por hongos que producen fumonisina, y probados por fumonisina y API se encontraron por que tienen niveles bajos de fumonisina pero niveles altos de API. API es menos tóxica que la fumonisina a las plantas y probablemente también a los animales, pero la contaminación con API es aún una preocupación (Lamprecht, et al . , Phytopathology, 84:383-391^ (1991)). El resultado preferido sería la desintoxicación completa de fumonisina en una forma no tóxica. Por consiguiente, las enzimas capaces de degradar API son necesarias para la desintoxicación adicional de fumonisina. La presente invención proporciona polinucleótidos polipéptidos relacionados, recientemente descubiertos de aminopoliol amino oxidasa (abreviada APAO, anteriormente conocida como API catabolasa, patente Norteamericana no. 5,716,820, supra , patente Norteamericana no. 5,792,931, supra ; solicitudes norteamericanas pendientes nos. 08/888,950 y 08/888,949, supra ; trAPAO es la abreviatura para una truncada, pero aún funcional APAO) , capaz de desaminar oxidativamente la API a un compuesto identificado como el derivado 2-oxo de la 5 API o su forma cetal cíclica (abreviada como 2-OP, anteriormente llamada AP1-N1, patente Norteamericana no. 5,716,820, y patente Norteamericana no. 5,792,931 supra; solicitudes norteamericanas pendientes nos. 08/888,950 y 08/888,949, supra ) , aislada de Exophiala spinifera , ATCC 74269. ^lO La enzima APAO parcialmente purificada de Exophiala spinifera tiene poca o ninguna actividad sobre la FBI intacta, una forma de fumonisina. Sin embargo, la enzima APAO recombinante de Exophiala spinifera expresada en E. coli, tiene actividad significante pero reducida sobre FBI intacta y otras fumonisinas serie B. La APAO o trAPAO de este modo podría usarse potencialmente sin fumonisina esterasa puesto que el grupo amina es el objetivo principal de la para la desintoxicación. Alternativamente, la fumonisina esterasa y APAO (o trAPAO) pueden usarse juntas para degradar toxinas. 20 La APAO es un tipo de flavin amino oxidasa (nomenclatura de clase de enzima (EC 1.4.3.4, véase Enzyme Nomencla ture 1992, Recommendations of the Nomenclature Committee of the IUBMB on the Nomenclature and Classification of Enzymes, Academic Press, Ine (1992) ) . Las flavin amin oxidasas son conocidas en mamíferos como monoaminoxidasas, en donde participan en la conversión de aminas involucradas en la función neuronal. Una flavin amino oxidasa procariótica que desamina la putrecina, se ha descrito (Ishizuka et al . , J. Gen Microbiol . 139:425-432 (1993)). Un gen de hongo sencillo de Aspergillus niger se ha clonado (Schilling et al , Mol Gen Genet 247:43-438 (1995)). Desamina una diversidad de alquil y aril aminas, pero cuando se probó por su capacidad para oxidar API, se encontró no contener actividad oxidante de API . La toxicidad de las fumonisinas y su ocurrencia potencial ampliamente generalizada en alimentos y alimentación las hace imperativas para encontrar estrategias de desintoxicación o eliminación para eliminar el compuesto de la cadena alimenticia. La presente invención proporciona polinucleótidos, polipéptidos relacionados, y todos las variantes modificadas conservadoramente de las APAO recientemente descubiertas. Las secuencias de nucleótido de las APAO comprende la secuencia mostrada en SEC. DE IDENT. NOS: 35, 37, 39, 41, 43, y 45. Para expresión en una planta, el polinucleótido de la presente invención puede unirse operablemente a una secuencia de selección. Es un objeto de la presente invención proporcionar plantas transgénicas que comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención; (b) un polinucleótido que comprende al menos 20 bases contiguas de los polinucleótidos de la presente invención; (c) un polinucleótido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con los polinucleótidos de la presente invención; (d) un polinucleótido que comprende al menos 25 nucleótidos de longitud que hibridizan bajo condiciones de severidad baja con los polinucleótidos de la presente invención; y (e) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de (a) hasta (e) . El ácido nucleico aislado puede ser ADN. El ácido nucleico aislado también puede ser ARN. En otro aspecto, la presente invención se refiere a los vectores que comprenden los polinucleótidos de la presente invención. También la presente invención se refiere a los cassettes de expresión recombinante, que comprenden un ácido nucleico de la presente invención unido operablemente a un promotor. En otro aspecto, la presente invención se dirige a una célula huésped dentro de la cual se ha introducido el cassette de expresión recombinante. En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta o célula vegetal transgénica que comprende un cassette de expresión recombinante con un promotor unido operablemente a cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de la presente invención. Las plantas preferidas que contienen el cassette de expresión recombinante de la presente invención incluyen, pero no se limitan a maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, tomate, y mijo. * La presente invención también proporciona semillas transgénicas a partir de la planta transgénica. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una proteina aislada seleccionada del grupo que consiste de (a) un polipéptido que comprende al menos 25 aminoácidos contiguos de SEC. DE IDENT. NOS: 36, 38, 40, 42, 44, y 46; (b) un polipéptido que comprende al menos 55% de identidad de secuencia con SEC. DE IDENT. NOS: 36, 38, 40, 42, 44, y 46; (c) un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la presente invención; (d) un polipéptido caracterizado por SEC. DE IDENT. NOS: 36, 38, 40, 42, 44, y 46; y (e) una variante conservadoramente modificada de SEC. DE IDENT. NOS: 36, 38, 40, 42, 44, y 46. Las modalidades preferidas de la invención objeto incluyen una célula huésped establemente transformada por una construcción de polinucleótido como se describió anteriormente, y un método para producir un polipéptido de un gen recombinante que comprende expresar un polinucleótido de la presente invención en una célula diseñada recombinantemente y purificando el polipéptido resultante. Un número de sistemas de expresión que usan las células huésped pueden usarse, tales como, pero no se limitan a, microbios, bacterias, mamíferos, insectos, células vegetales, levaduras, o virus. En una modalidad las enzimas que degradan fumonisina pueden aislarse y purificarse de las semillas o partes vegetales de una planta que expresa la enzima . Otra modalidad de la invención objeto, comprende un método para reducir la patogenicidad de un hongo que produce fumonisina transfiriendo a una planta los ácidos nucleicos de la presente invención ya sea por sí mismos o en combinación con un ácido nucleico que codifica una fumonisina esterasa. Esta invención proporciona adicionalmente métodos para degradar fumonisina, un producto de degradación de fumonicina, o una micotoxina estructuralmente relacionada, que comprende la etapa de hacer reaccionar la micotoxina con las enzimas de degradación de la presente invención. Adicionalmente, las fumonisinas pueden degradarse a una forma menos tóxica por aplicación de enzimas de fumonisina esterasa y enzima APAO. Las micotoxinas pueden degradarse en grano cosechado durante el procesamiento de grano cosechado, en alimentación animal, o en tejido vegetal como, por ejemplo, durante el uso de la planta para ensilaje o como una aspersión sobre grano, frutas o vegetales. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden usarse como un marcador seleccionable para transformación de planta. Al transformar células vegetales con un cassette de la expresión que contiene el polinucleótido de la presente invención y colocando después las células vegetales sobre el medio que contiene FBI, API o un análogo fitotóxico, solamente las células vegetales que expresan el polinucleótido de la presente invención sobrevivirían. Otra modalidad de la presente invención es el uso de la enzima de fumonisina esterasa y APAO por si mismas o en combinación como reactivos para detectar fumonisina y toxinas estructuralmente relacionadas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia común en la técnica a la cual pertenece esta invención. A menos que se mencione de otra forma, las técnicas empleadas o contempladas en la presente son metodologías estándar bien conocidas por alguien con experiencia común en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no limitantes. Lo siguiente se presenta a manera de ilustración y no se intenta limitar el alcance de la invención . La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de botánica, microbiología, cultivo de tejido, biología molecular, química, bioquímica y tecnología de ADN recombinante, los cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, J. H. Langenheim and K. V. Thímann, Botany : Plant Biology and Its Rela tion to Humman Affairs (1982) John Wiley; Cell Cul ture and Soma tic Cell Genetics of Plants, Vol.l (I. K. Vasil, ed. 1984); R V. Stanier, J., L. Ingraham, M., L. Wheelis, y P. R Painter, The Microbial World, (1986) 5 Ed., Prentice-Hall; O. D. Dhringra and J. B. Sinclair, Basic Plant Panthology Methods, (1985) CRC Press; Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laborotory Manual (1982) ; DNA Cloning, Vols. I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds 1984); and the series Methods in Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc. ) . Las unidades, prefijos y símbolos pueden denotarse en su forma aceptada SI. A menos ue se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente. Los rangos numéricos son inclusivos de los números que definen el rango. En la presente, los aminoácidos pueden referirse por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IÜB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, igualmente, pueden referirse por sus códigos de letra sencilla comúnmente aceptados. Los términos definidos posteriormente se definen más completamente en referencia a la especificación como un total . Al describir la presente invención, los siguientes términos se emplearán, y se intentan definir como se indica posteriormente . Por "microbio" se quiere^. decir cualquier microorganismo (que incluye microorganismos eucarióticos y procarióticos), tales como hongos, levaduras, bacterias, actinomicetos, algas y protozoarios, así como otras estructuras unicelulares . Un "microbio que produce fumonisina" es cualquier microbio capaz de producir la micotoxina fumonisina o análogos de la misma. Tales microbios son generalmente miembros del género de hongos Fusarium, así como _ organismos recombinantemente derivados, los cuales han sido alterados genéticamente para permitirles producir fumonisina o análogos de la misma. Por "que degrada fumonisina" se quiere decir cualquier modificación de fumonisina, API, o cualquier derivado de fumonisina o API que causa una disminución o pérdida en su actividad tóxica, tal como la degradación a menos de 1%, 5%, 10%, ó 50% de toxicidad original, prefiriéndose con menos del 10%. Tal cambio puede comprender el desdoblamiento de cualquiera de los diversos enlaces, oxidación, reducción, la adición o supresión de una porción química, o cualquier otro cambio que afecte la actividad de la molécula. En una modalidad preferida, la modificación incluye la hidrólisis del enlace éster en la molécula como una primera etapa y después desaminación oxidativa. Además, la fumonisina químicamente alterada puede aislarse de cultivos de microbios que producen una enzima de esta invención, como cultivando los organismos sobre medios que contienen fumonisina marcada radioactivamente, trazando la marca y aislando la toxina degradada para estudio adicional. La fumonisina degradada puede compararse al compuesto activo por su fitotoxicidad o toxicidad a mamífero en especies sensibles conocidas, tales ' como porcinos, conejos, y equinos o én pruebas de cultivo de células o tejidos. Tales pruebas de toxicidad son conocidas en la técnica. Por ejemplo, en plantas puede usarse un bioensayo de hoja completa en el cual las soluciones del compuesto activo e inactivo se aplican a las hojas de plantas sensibles. Las hojas pueden tratarse in situ o, alternativamente, pueden usarse hojas cortadas. La toxicidad relativa de los compuestos puede estimarse clasificando el daño que sobreviene a los tejidos vegetales y midiendo el tamaño de las lesiones formadas dentro de un periodo de tiempo dado. Otras pruebas conocidas pueden realizarse a nivel celular, que emplean metodologías de cultivo de tejidos estándar, por ejemplo usando cultivos de suspensión de células . Por "fumonisina esterasa" quiere decir cualquier enzima capaz de hidrolizar el enlace éster en la fumonisina o una molécula estructuralmente similar tal como la toxina AAL. Dos ejemplos de tales enzimas son ESP1 y BEST1 encontradas en la solicitud de patente Norteamericana no. 5,716,820, expedida el 10 de febrero de 1998, la patente Norteamericana no. 5,792,931, expedida el 11 de agosto de 1998; y las solicitudes norteamericanas pendientes nos. 08/888,950 y 08/888,949, ambas presentadas el 7 de julio de 1997. Por "micotoxina estructuralmente relacionada" se quiere decir cualquier micotoxina que tiene una estructura química relacionada a una fumonisina o API tal como la toxina AAL, fumonisina Bl, fumonisina B2, fumonisina B3, fumonisina B4, fumonisina Cl, fumonisina Al y A2, y su análogos o formas hidrolizadas, así como otras micotoxinas que tienen estructuras químicas celulares que incluyen análogos hechos sintéticamente que contienen un grupo amina C-2 o C-1 y uno o más grupos hidroxilo adyacentes, que se esperan ser degradados por la actividad de una enzima de la presente invención. La presente invención es la primer flavin amino oxidasa conocida que ataca una amina primaria no ubicada en C-1 (es decir C-2 de API) y que resulta en un producto aceto más que en uno aldehido. Se entiende que "API" o "aminopoliol" como se usa en la presente es para designar la forma hidrolizada de cualquier fumonisina, FBI, FB2, FB3, FB4, AAL, o cualquier otro compuesto similar a API, que incluye un compuesto hecho sintéticamente, que contiene un grupo amina C-2 o C-1 y uno o más grupos hidroxilo adyacentes. Por "amplificado" se quiere decir la construcción de copias múltiples de una secuencia de ácido nucleico o copias múltiples complementarias de la secuencia de ácido nucleico que usa al menos una de las secuencias de ácido nucleico como una plantilla. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de polimerasa (PCR) , sistema de reacción en cadena de ligasa (LCR) , amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) , sistemas de Q-Beta Replicase, sistema de amplificación basado en transcripción (TAS) , y la amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) . Véase, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applica tions, D. H. Persing et al . , Ed., American Society for Microbiology, Washington, DC (1993) . El producto de amplificación se denomina un amplicón. El término "variantes conservadoramente modificadas" se aplica a ambas secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o conservadoramente modificadas de las secuencias de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. Así, en cada posición en donde una alanina está especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación conservadoramente modificada. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cualquier posible variación silenciosa del ácido nucleico. Alguien con experiencia común reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG el cual es ordinariamente el único codón para metionina, una excepción es Micrococcus rubens, para la cual GTG es el codón metionina (Ishizuka, et al., J. Gen'l Microbiol, 139:425-432 (1993)) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención, está implícita en cada secuencia de polipéptido descrita e incorporado en la presente para referencia. Según las secuencias de aminoácidos, alguien con experiencia reconocerá que .las sustituciones individuales, supresiones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína, la cual altera, agrega o suprime un aminoácido sencillo o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada que es una "variante conservadoramente modificada", cuando la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Así, cualquier número de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo de números enteros que consisten de 1 hasta 15 puede alterarse así. De este modo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 7, o 10 alteraciones pueden hacerse. Las variantes conservadoramente modificadas proporcionan típicamente actividad biológica similar como la secuencia de polipéptidos sin modificar de la cual se derivan. Por ejemplo, especificidad de sustrato, actividad enzimática, o enlace ligando/receptor es generalmente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ó 90%, preferiblemente 60-90% de la proteína nativa por su sustrato nativo. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidos en la técnica . Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras de uno por otro: 1) Alanina (A) , Serina (S) , Treonina (T) ; 2) Acido aspártico (D) , Acido glumático (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4)Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptofan (W) Véase también, Creighton (1984) Proteins W.H. Freeman and Company. Como se usa en la presente, "que consiste esencialmente de" significa la inclusión de secuencias adicionales a un polinucleótido objeto en donde las secuencias adicionales no se hibridizan selectivamente, bajo condiciones de hibridización severas, al mismo ADNc como el polinucleótido y en donde las condiciones de hibridización incluyen una etapa de lavado en 0. IX SSC y 0.1% de dodeciisulfato sódico a 65°C. Por "que codifica" o "codificado", con respecto a un ácido nucleico específico, se puede decir que comprende la información para la traducción dentro de la proteína específica. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico, o pueden faltar tales secuencias no traducidas de intervención (por ejemplo, como en ADNc) . La información por la cual se codifica una proteína se especifica por el uso de condones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos se codifica por el ácido nucleico usando el código genético "universal". Sin embargo, las variantes del código universal, tal como el que está presente en cierta planta, animal, y mitocondria de hongos, la bacteria Mycoplasm capricolum { Proc . Na ti . Acad Sci . (USA) , 82: 2306-2309 (1985)), o el ciliado Macronucleus, pueden usarse cuando el ácido nucleico se expresa usando estos organismos. Cuando el ácido nucleico se prepara o altera sintéticamente, puede tomarse ventaja de las preferencias de codones conocidas del huésped pretendido en donde el ácido nucleico se expresará. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden expresarse en especies vegetales monocotiledoneas y dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para explicar las preferencias de codón específicas y las preferencias de contenido GC de plantas monocotiledoneas o plantas dicotiledóneas puesto que estas preferencias han mostrado diferir (Murray et al . Nucí. Acids Res. 17: 477-498 (1989) y se incorporan en la presente para referencia) . Así, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular pudiera derivarse de secuencias de gen conocidas del maíz. El uso de codón de maíz para 28 genes de plantas de maíz se lista en la Tabla 4 de Murray et al . , supra . Como se usa en la presente, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina de una especie extraña, o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificado de su forma nativa en composición y/o ubicación genómica por deliberada intervención humana. Por ejemplo, un promotor unido operablemente a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de la cual el gen estructural se derivó, o, si es de la misma especie, . uno o ambos están sustancialmente modificados de su forma original. Una proteína heteróloga puede originarse de una especie extraña, o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original por deliberada intervención humana. Por "célula huésped" o "célula diseñada recombinantemente" se quiere decir una célula, la cual contiene un vector y apoya la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procarióticas tales como E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, Pichia , insecto, planta, anfibio, o mamífero. Preferiblemente, las células huésped son células de vegetales monocotiledoneos o dicotiledóneos, que incluyen pero no se limitan a maíz, sorgo, girasol, soja, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cañóla, cebada, mijo, y tomate. Una célula huésped particularmente preferida monocotiledonea es una célula huésped de maíz. El término "complejo de hibridización" incluye referencia a una estructura de ácido nucleico dúplex formada por dos secuencias de ácidos nucleicos de hebra sencilla hibridizada selectivamente entre si. El término "introducido" en el contexto de insertar un ácido nucleico dentro de una célula, significa "transfección" o "tansformación" o "transducción" e incluye referencia a la incorporación de un ácido nucleico dentro de una célula eucariótica o procariótica en donde el acido nucleico puede incorporarse dentro del genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertido en un replicón autónomo, o temporalmente expresado (por ejemplo ARNm transfectado) . El término "aislado" se refiere a un material, tal como un ácido nucleico o una proteína, el cual está sustancial o esencialmente libre de componentes, los cuales acompañan normalmente o interactúan con el mismo, como encontrado en su ambiente que ocurre naturalmente. El material aislado opcionalmente comprende material no encontrado con el material en su ambiente natural. Los ácidos nucleicos que están "aislados" como se define en la presente, también son referidos como ácidos nucleicos "heterólogos". A menos que se indique lo contrario, el término "ácido nucleico APAO" significa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido APAO") que codifica un polipéptido APAO. El término APAO, a menos que se indique lo contrario, puede abarcar tanto APAO como la versión funcional truncada de APAO designada trAPAO. Como se usa en la presente, "ácido nucleico" incluye referencia a un polímero de desoxiribonucleótido o ribonucleótido en forma de hebra doble o sencilla, y a menos que se limite lo contrario, abarca análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en que se hibridizan a ácidos nucleicos de hebra sencilla en una forma similar a los nucleótidos que ocurren naturalmente (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos). Por "biblioteca de ácidos nucleicos" se quiere decir una colección de moléculas de ADN o ARN aisladas, las cuales comprenden y representan substancialmente la fracción transcrita completa de un genoma de un organismo especificado. La construcción de ejemplos de bibliotecas de ácidos nucleicos, tales como bibliotecas genómicas y ADNc, se enseña en referencias de biología molecular estándar tales como Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Tecnhiques , Methods in Enzymology, Vol 152 Academic Press Inc., San Diego CA (Berger); Sambrook et al . , Molecular Cloning ' -A Laboratory Manual , 2nd ed., vol 1-3 (1989); and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausbel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and Jhon Wiley & Sons, Inc. (1994 Supplement) . Como se usa en la presente "unido operablemente" incluye referencia a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y medía la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Generalmente, unido operablemente significa que las secuencias de acidas nucleicos que se enlazan son contiguas y, donde es necesario para unir dos regiones que codifican proteína, contiguas y en la misma estructura de lectura. Como se usa en la presente, el término "planta" incluye referencia a plantas completas, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células vegetales y progenie de las mismas. Célula vegetal, como se usa en la presente incluye, sin limitación, cultivos de suspensión de semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, retoños, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas . La clase de plantas, que puede usarse en los métodos de la invención, es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores sujeta a técnicas de transformación, que incluyen plantas monocotiledoneas y dicotiledóneas que incluyen especies del género: Cucúrbi ta , Rosa , Vi tis, Juglans , Fragaria , Lotus, Medicago, Onobrychis , Trifolium, Trigonella , Vigna , Cí trus , Linum, Geranium, Manihot , Daucus, Arabidopsis , Brassica , Raphanus , Sinapis , Atropa , Capsicum, Da tura , Hioscyamus, Lycopersicon, Nicotiana , Solanum, Petunia , Digi talis , Majorana , Ciahorium , Helian thus , Lactuca , Rromus , Asparagus , Antirrhinum, Heterocallis , Nemesis , Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranuncul us , Senecio, Salpiglossis , Cucumis , Browaalia , Glycine , Pisum , Phaseol us , Lolium, Oryza , Avena , Hordeum, Sécale, Allium, y Tri ticum . Una planta particularmente preferida es Zea mays . Como se usa en la presente, "polinucleótido" incluye referencia a un desoxiribopolinucleótido, ribopolinucleótido, o análogos de los mismos que tiene la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en que se hibridizan, bajo condiciones de hibridización severas a sustancialmente la misma secuencia de nucleótido como nucleótidos que ocurren naturalmente y/o permite la traducción dentro de los mismos aminoácido (s) como el nucleótido (s) que ocurre naturalmente. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen nativo o heterólogo estructural o regulatorio. A menos que se indique lo contrario, el término incluye referencia a la secuencia especificada así como la secuencia complementaria del mismo. Así, los ADN o ARN con columnas vertebrales modificadas para estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como ese término se pretende en la presente. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, para nombrar solamente dos ejemplos, son polinucleótidos como el término se usa en la presente. Se apreciará que una gran diversidad de modificaciones se han hecho al ADN y ARN que sirven muchos propósitos útiles conocido para aquéllos de experiencia en la técnica. El término polinucleótido como se emplea en la presente abarca tales formas químicamente, enzimáticamente, o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, que incluyen inter alia , células simples y complejas. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente que ocurre naturalmente, así como polímeros de aminoácido que ocurren naturalmente . Como se usa en la presente "promotor" incluye referencia a una región de ADN hacia el extremo 5' desde el inicio de la transcripción e involucrado en el reconocimiento y enlace de ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales. Ejemplos de promotores de planta incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se obtienen de plantas, virus de plantas, y bacterias que comprenden genes expresados en células vegetales tales como Agrobacterium o Rhizobium . Los ejemplos son promotores que preferencialmente inician la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos de xilema, traqueidas, o esclerenquima . A tales promotores se les refiere como "tejido preferido". Un promotor específico "tipo de la célula" impulsa principalmente la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un promotor "inducible" o "regulable" es un promotor, el cual está bajo control ambiental. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor ambientalmente regulado, por ejemplo, un promotor que impulsa la expresión durante el desarrollo de polen. Los promotores de tejido preferido, específicos de tipo de célula, ambientalmente regulados, e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivo". Un promotor "constitutivo" es un promotor el cual está activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales . El término "polipéptido APAO o polipéptido trAPAO" se refieren a una o más secuencias de aminoácidos. El término es también inclusivo de fragmentos, variantes homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproproteinas o proproteínas) de los mismos. Una "proteína APAO o trAPAO" comprende un polipéptido APAO o trAPAO. , Como se usa en la presente "recombinante" incluye referencia a una célula o vector, que se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, los genes que expresan células recombinantes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresa genes nativos que de otra forma se expresan anormalmente, bajo expresión o no expresión como resultado de la deliberada intervención humana. El término recombinante como se usa en la presente no abarca la alteración de la célula o el vector por eventos que ocurren naturalmente (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural) tales como aquéllos que ocurren sin la deliberada intervención humana. Como se usa en la presente, un "cassette de expresión recombinante" es una construcción de ácido nucleico, generada recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados, que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El cassette de expresión recombinante puede incorporarse dentro de un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plástido, virus, o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del cassette de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico a ser transcrito, y un promotor. El término "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a un aminoácido que se incorpora dentro de una proteína, polipéptido, o péptido (colectivamente "proteína") . El aminoácido puede ser un aminoácido que ocurre naturalmente y, a menos que se limite lo contrario, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar en forma similar a los aminoácidos que ocurren naturalmente. El término "hibridiza selectivamente" incluye referencia a la hibridización, bajo condiciones de hibridización severas, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo de ácido nucleico especificado hasta un grado detectablemente más grande (por ejemplo, al menos 2 veces sobre la base) que su hibridización a secuencias de ácido nucleico no objetivo y a la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no objetivos. Las secuencias de hibridización selectiva tienen típicamente aproximadamente al menos 40% de identidad de secuencia, preferiblemente 60-90% de identidad de secuencia, y de mayor preferencia 100% de identidad de secuencia (es decir, complementaria) entre si. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridización severas" incluyen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se híbridizará a su secuencia objetivo, hasta un grado detectablemente más grande que otras secuencias (por ejemplo al menos 2 veces sobre la base) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al v controlar la severidad de las condiciones de hibridización y/o lavado, puede identificarse secuencias objetivo que pueden ser hasta 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad pueden ajustarse para permitir algún desajuste en las secuencias de manera que se detecten los grados inferiores de similaridad (sondeo heterólogo) . De manera óptima, la sonda es de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, pero puede variar grandemente en longitud de menos de 500 nucleótidos hasta igual a la longitud completa de la secuencia objetivo. Típicamente, las condiciones severas serán aquéllas en las cuales la concentración de sal sea menor que aproximadamente 1.5 M de ion Na, típicamente alrededor 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (u otras sales) en pH 7.0 a 8.3 y la temperatura sea al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida o de Denhardt. Ejemplos de condiciones de severidad baja incluyen la hibridización con una solución reguladora de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl," 1% de SDS (dodeciisulfato sódico) a 37°C, y un lavado en IX a 2X de SSC (20X de SSC = 3.0 M de NaCl/0.3 M de citrato trisódico) a 50 a 55°C. Ejemplos de condiciones de severidad moderada incluye la hibridización en 40 a 45% de formamida, 1M de^ NaCl, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en 0.5X a IX de SSC a 55 hasta 60°C. Ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen la hibridización en 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en 0. IX de SSC a 60 a 65°C. La especificidad es típicamente la función de los lavados pos-hibridización, siendo los factores críticos, la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos ADN-ADN, la Tm puede aproximarse desde la ecuación de Meinkoth y Wahl, Anal Biochem . , 138:267-284 (1984): Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridización, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tra es la temperatura (bajo fuerza iónica definida y pH) a la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se hibridiza a una sonda perfectamente igualada. Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de desajuste; así, las condiciones Tm de hibridización y/o lavado pueden ajustarse para hibridizar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con 90% de identidad se buscan, la Tm, puede disminuirse 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica definida y pH. Sin embargo, las condiciones rigurosamente severas pueden utilizar una hibridización y/o lavado a 1, 2, 3, o 4 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridización y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones de severidad baja pueden utilizar hibridización y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) . Usando la ecuación, las composiciones de hibridización y lavado, y la Tm deseada, aquellos de experiencia común entenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de la hibridización y/o soluciones de lavado. Si el grado deseado de desajuste resulta en una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC de manera que pueda usarse una temperatura más alta. Una guía extensiva a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen Laborotory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization wi th Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, New York (1993), and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al . , Eds Greene Publishing and Wiley-Interscencie, New York (1995) . A menos que se indique lo contrario, en la presente solicitud severidad alta se define como hibridización en 4X de SSC, 5X de Denhardt (5g de Ficoll, 5g, de polivinilpirrolidona, 5g de albúmina de suero bovino en 500 ml de agua), 0.1 mg/ml de ADN de esperma de salmón hervido, y 25 mM de fosfato de Na a 65°C, y un lavado en 0. IX de SSC, 0.1% de SDS a 65°C. Como se usa en la presente, "planta transgénica" incluye referencia a una planta la cual comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra establemente dentro del genoma de tal forma que el polinucleótido se pasa a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede integrarse dentro del genoma solo o como parte de un cassette de expresión recombinante. "Transgénico" se usa en la presente para incluir cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de la planta o planta, el genotipo del cual ha sido alterado por la presencia de ácido nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos inicialmente así alterados así como aquellos creados por cruzas sexuales o propagación asexual del transgénico inicial. El término "transgénico" como se usa en la presente no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos de propagación de planta convencionales o por eventos que ocurren naturalmente tales como fertilización cruzada al azar, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante, o mutación espontánea. Como se usa en la presente, "vector" incluye referencia a un ácido nucleico usado en la transfección de una célula huésped y dentro de la cual puede insertarse un polinucleótido. Los vectores son frecuentemente replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertada en el mismo. Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia ", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad sustancial" . (a) Como se usa en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como una base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especifica; por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o una secuencia de gen, o la secuencia del gen o ADNc completo. (b) Como se usa en la presente, "ventana de k10 comparación" significa que incluye referencia a un contiguo y especificado segmento de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido puede compararse a una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, vacíos) comparado con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

Generalmente, la ventana de comparación es al menos 20 l nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser 30, 40, 50, 100, o más largas. Aquéllos de experiencia en la técnica entienden que para evitar una alta similaridad hacia una secuencia de referencia debido a la inclusión de vacíos en la secuencia de polinucleótidos se introduce típicamente un sanción de vacío y se sustrae del número de iguales. 25 Los métodos de alineación de secuencias de nucleótido y aminoácido para comparación son bien conocidos en la técnica. El algoritmo de homología local (Best Fit) de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math puede conducir el alineamiento óptimo de secuencias para comparación. 2: 482 (1981); por el algoritmo de homología de alineación (GAP) de Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . 48: 443 (1970); por la búsqueda por el método de similaridad (Tfasta y Fasta) of Pearson and Lipman. Proc . Na ti . Acad. Sci . 85: 2444 (1988); por implementaciones computarizadas de estos algoritmos, que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, California, GAP BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA; el programa CLUSTAL se describe bien por Higgins and Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al . , Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, et al . , Computer Applica tions in the Biosciences 8: 155-65 (1992), and Pearson et al . , Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994) . El programa preferido para usarse para la alineación global óptima de secuencias múltiples es PileUp (Feng and Doolittle, Journal of Molecular Evolution, 25:351-360 (1987) el cual es similar al método descrito por Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989) e incorporado por la presente para referencia) . La familia de programas BLAST el cual puede usarse para búsquedas de similaridad de base de datos incluye: BLASTN para secuencias de interrogación de nucleótido en contra de secuencias de base de datos de nucleótido; BLASTX para secuencias de interrogación de nucleótido en contra de secuencias de base de datos de proteína; BLASTP para secuencias de interrogación de proteína en contra de secuencias de base de datos de proteína; TBLASTN para secuencias de interrogación de proteína en contra de secuencias de base de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de interrogación de nucleótidos en contra de secuencias de base de datos de nucleótidos. Véase, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al . , Eds Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de iguales y disminuya el número de vacíos. GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de vacíos y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los vacíos más pocos. Permite la provisión de una creación de sanción de vacío y una extensión de la sanción de vacío en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer una ganancia de la creación del número de vacíos de sanción de iguales para cada vacío que se inserta. Si se escoge una extensión de la sanción de vacío más grande que cero, GAP debe, además, hacer una ganancia por cada vacío insertado de la longitud del vacío por la extensión de la sanción de vacío. Valores de omisión de creación de vacíos de sanción y creación de los valores de vacíos de sanción en Versión 10 del Winsconsin Genetics Software Package son 8 y 2, respectivamente. La creación de vacíos y las sanciones de extensión de vacíos pueden expresarse como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 0 a 100. Así, por ejemplo, la creación de vacíos y las sanciones de extensión de vacíos puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, o más grande. GAP presenta un miembro de la familia de las mejores alineaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una calidad mejor. GAP presenta cuatro figuras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad, y Similaridad. La Calidad es la métrica maximizada para alinear la secuencia. La Relación es la calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. El porciento de Identidad es el., porciento de los símbolos que actualmente coinciden. El porciento de similaridad es el porciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los vacíos se ignoran. Una similaridad se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similaridad. La matriz de registro usada . en la Versión 10 del Wisconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 { véase Henikoff & Henikoff (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:10915).

A menos que se establezca lo contrario, los valores de identidad/similaridad de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido usando la serie BLAST 2.0 de programas que usan parámetros de omisión. Altschul et al . , Nucleic Acids Res . 25:3389-3402 (1997). Como aquéllos de experiencia común en la técnica entenderán, BLAST busca asumir que proteínas pueden modelarse como secuencias al azar. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no al azar, las cuales pueden ser hechas homopoliméricas, repeticiones de periodo corto, o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad pueden alinearse entre proteínas sin relacionar aún cuando otras regiones de la proteína sean completamente desiguales. Un número de programas filtro de baja complejidad pueden emplearse para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad SEG (Wooten and Federhen, Comput . Chem . , 17:149-163 (1993)) y XNU (Claverie and States, Comput Chem . , 17: 191-201 (1993)) pueden emplearse solos o en combinación. (c) Como se usa en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas incluye referencia a los residuos en las dos secuencias, las cuales son las mismas cuando se alinean para máxima correspondencia sobre una ventana de comparación específica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a las proteínas, se reconoce que las posiciones residuales que no son idénticas frecuentemente difieren en sustituciones de aminoácidos conservadoras, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. En donde las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el por ciento de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservadoras, se dice que tienen "similaridad de secuencia" o "similaridad". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos a aquellos de experiencia en la técnica. Típicamente esto involucra registrar una sustitución conservadora como una parcial más que un desajuste completo, incrementando con eso el porcentaje de identidad de secuencia. Así¿ por ejemplo, en donde un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y una sustitución no conservadora se le da un registro de cero, una substitución conservadora se le da un registro entre cero y 1. El registro de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, de acuerdo al algoritmo de Meyers and Miller, Computer. Applic . Biol . Sci . , 4: 11-17 (1988) por ejemplo, como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA.). (d) Como se usa en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir vacios) comparado con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales las bases de ácidos nucleicos idénticas o residuos de aminoácidos ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia . (e) (i) El término "identidad sustancial" de las secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene entre 50-100% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 50% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 60% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 70%, de mayor preferencia al menos 80%, de mayor preferencia al menos 90% y de mayor preferencia al menos 95%, comparado con una secuencia de referencia que usa uno de los programas de alineación descrito usando parámetros estándar. Uno de experiencia reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en cuenta la degeneración del codón, similaridad de aminoácidos, posición de la estructura de lectura y similares. La identidad sustancial de la secuencia de aminoácidos para estos propósitos normalmente significa una identidad de secuencia de entre 40-100%, preferiblemente al menos 55%, preferiblemente al menos 60%, de mayor preferencia al menos 70 %, 80%, 90%, y de mayor preferencia al menos 95%. Otra indicación de que las secuencias de nucleótido son substancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridizan entre si bajo condiciones severas. La degeneración del código genético permite muchas sustituciones de aminoácidos que conducen a una diversidad en la secuencia de nucleótidos que codifican para el mismo aminoácido, en consecuencia, es posible que la secuencia de ^ ADN pueda codificar el mismo polipéptido pero no hibridizarse entre si bajo condiciones severas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la máxima degeneración de codón permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido, que codifica el primer ácido nucleico, es reacción inmunológicamente cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. (e) (ii) Los términos "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia de entre 55-100% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia preferiblemente al menos 55% de identidad de secuencia, preferiblemente 60%, preferiblemente 70%, de mayor preferencia 80%, de mayor preferencia al menos 90% ó 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia sobre una ventana de comparación específica. Preferiblemente, la alineación óptima se conduce usando el algoritmo de homología de alineación de Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . 48: 443 (1970). Una indicación de que dos secuencias peptídicas son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos erigidos en contra del segundo péptido. Así, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren solamente por una sustitución conservadora. Además, un péptido puede ser sustancialmente idéntico a un segundo péptido cuando difieren por un cambio no conservador si el epítope que el anticuerpo reconoce es sustancialmente idéntico. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como, se anotó anteriormente, excepto que las posiciones residuales que no son idénticas, pueden diferir por cambios de aminoácidos conservadores. Organismos que degradan Fumonisina La presente invención se basa en el descubrimiento de organismos con la capacidad para degradar la micotoxina fumonisina. En una búsqueda por medios biológicos para desintoxicar fumonisinas, se aislaron diversos hiphomicetos dematiaceos de almendras de maíz crecido en el campo. Los hongos se encontraron capaces de crecer sobre fumonisina Bl o B2 (FBI o FB2) como única fuente de carbono, degradándola parcial o completamente en el proceso. Una especie, identificada como Exophiala spinifera, una "levadura negra", se recuperó de semillas de maiz de diversas ubicaciones en el sur este y centro sur de Estados Unidos. La cepa enzima activa de Exophiala spinifera (ATCC 74269) se depositó (véase solicitud de patente Norteamericana no. 5,716,820, expedida el 10 de febrero de 1998, patente Norteamericana no. 5,792,931 expedida el 11 de agosto de 1998; y las solicitudes norteamericanas pendientes nos. 08/888,950 y 08/888,949, ambas presentadas el 7 de julio de 1997). Otras cepas enzima activas de Exophiala spinifera se usaron para aislar polinucleótidos APAO. El aislado ESP002 se aisló de árboles de palma (ATCC 26089) y el aislado ESP003 se aisló de la semilla de maíz. Otro hongo del cual se aislaron polinucleótidos APAO fue Rhinocladiella al trovirens (RAT 011) . Ácidos Nucleicos La presente invención proporciona, inter alia , ácidos nucleicos aislados de ARN, ADN, y análogos y/o quimeras de los mismos, que comprenden un polinucleótido APAO o trAPAO.

La presente invención también incluye polinucleótidos optimizados para la expresión en diferentes organismos. Por ejemplo, para la expresión del polinucleótido en una planta de maíz, la secuencia puede alterarse para explicar preferencias de codón específicas y para alterar el contenido de GC de acuerdo a Murray et al . , supra . El uso de codón de maíz para 28 genes de vegetales de maíz se lista en la Tabla 4 de Murray, et al . , supra . Los ácidos nucleicos APAO o trAPAO de la presente invención comprenden polinucleótidos APAO o trAPAO aislados los cuales, son inclusivos de: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido APAO o trAPAO de las secuencias mostradas en SEC. DE I DENT. NOS: 36, 3S , 40, 42, 44, y 46, y conservadoramente modificadas y variantes polimórfic s de las mismas; (b) un polinucleótido que se hibridiza selectivamente a un polinucleótido de (a) o (b) ; (c) un polinucleótido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con los polinucleótidos de (a) o (b) ; (d) secuencias complementarias de polinucleótidos de (a) , (b) , o (c) ; y (e) un polinucleótido que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de un polinucleótido de (a) , (b) , (c) , o (d) . Además, se presentan polinucleótidos que son una fusión de un polinucleótido APAO o trAPAO y el polinucleótido de una fumonisina esterasa. La invención abarca las secuencias de Exophiala o Rhinocladiella así como las secuencias que tienen similaridad de secuencias con tales secuencias. Se reconoce que las secuencias de la invención pueden usarse para aislar secuencias correspondientes en otros organismos. Métodos tales como PCR, hibridización, y similares pueden usarse para identificar secuencias que tienen similaridad de secuencia sustancial a las secuencias de la invención. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al . , (1989) Molecular Cloning: A Labora tory Manual . (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Press Planview, New York) and Innis et al . , (1990) PCR Protocols : Guide to Methods and Appl ica tions (Academic Press, New York) . Las secuencias de codificación aisladas en base a su identidad de secuencia con las secuencias que codifican la degradación de fumonisina completa indicadas en la presente o a fragmentos de las mismas están abarcadas por la presente invención . Se reconoce que las secuencias de la invención pueden usarse para aislar secuencias similares de otros organismos que degradan fumonisina. De la misma forma, secuencias de otros organismos que degradan fumonisina pueden usarse en combinación con las secuencias de la presente invención. Véase, por ejemplo, la solicitud copendiente titulada "Compositions and Methods for Fumonisina Detoxification" solicitud Norteamericana número de serie 60/092,953, presentada concurrentemente con la misma e incorporada en la presente para referencia. Los plásmidos que contienen la secuencias de polinucleótido de la invención se depositaron con American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, Virginia, y se les asignó números de acceso 98812, 98813, 98814, 98815, 98816, y PTA-32. Estos depósitos se mantendrán bajo los términos del Budapest Teatry on the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure. Estos depósitos se hicieron meramente como una conveniencia para aquellos de experiencia en la técnica y no es una admisión que requiera un depósito bajo 35 U.S.C. § 112. Construcción de cidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden hacerse usando (a) métodos recombinantes estándar, (b) técnicas sintéticas, o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención serán clonados, amplificados o de otra forma construidos a partir de un hongo o bacteria. Los ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de multiclonación que 'comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa pueden insertarse dentro del ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. También, las secuencias traducibles pueden insertarse para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexahistidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención excluyendo la secuencia de polinucleótido - es opcionalmente un vector, adaptador, o enlazante para clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención. Pueden agregarse secuencias adicionales a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimar su función en clonación y/o expresión para ayudar en el aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido dentro de una célula. Típicamente, la longitud de un ácido nucleico de la presente invención menos la longitud de su polinucleótido de la presente invención es menor de 20 pares de kilobase, frecuentemente menos de 15 kb, y frecuentemente menos de 10 kb . El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores, y enlazantes es bien conocido en la técnica. Ejemplos de ácidos nucleicos incluyen vectores tales como: M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gtlO, lambda gtll, pBK-CMV pBK-RSV, pBluescrípt II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTk, p3'SS, pGEM, pSK+/ -, pGEX, pSPORTI y II, Poprsvi CAT, p013 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pOG44, pOG45, pFRTßGAL, pNEOßGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSlox, y lambda MOSElox. Los vectores opcionales para la presente invención incluyen pero no se limitan a lambda ZAP II y pGEX . Para una descripción de diversos ácidos nucleicos véase, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La jolla, CA) ; y Amersham, Life Sciences, Ine, Catalog197 (Arlington Heigsths, IL) . Métodos Sintéticos para Construir cidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también pueden prepararse por síntesis química directa por métodos tales como el método fosfotriéster de Narang et al . , Meth Enzyrmol . 68: 90-99 (1979); el método fosfodiéster Brown et al . , Meht Enzymol 68: 109-151 (1979); el método dietilfosforamidita de Beaucage et al . , Tetra Lett . 22(20) 1859-1862 (1981); el método fosforamidita triéster de fase sólida descrito por Beaucage and Caruthers, Tetra . Letts . 22(20): 1859-1862 (1981), por ^ejemplo, usando un sintetizador automatizado, por ejemplo, como se describe en Needham-VanDevanter et al . , Nucleic Acids Res . , 12: 6159-6168 (1984); y, el método de soporte sólido de la Patente Norteamericana no. 4,458,066. La síntesis química produce generalmente un oligonucleótido de hebra sencilla. Este puede convertirse en ADN de doble cadena por hibridización con una secuencia complementaria, o por polimerización con un ADN polimerasa usando la hebra sencilla como una plantilla. Alguien con experiencia reconocerá qué mientras la síntesis química de ADN se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas por la ligadura de secuencias más cortas . UTRs y Preferencia de Codón En general, la eficiencia de traducción se ha encontrado ser regulada por elementos de secuencia específicos en la región 5! no codificada o sin traducir (5' UTR) del ARN. Los motivos de la secuencia positiva incluyen secuencias de consenso de iniciación de traducción (Kozak, Nucleic Acids Res . 15:8125 (1987)) y la estructura de capuchón 5 <G> 7 methyl GpppG ARN (Drummond et al . , of Nucleic Acids Res . 13:7375 (1985) ) . Los elementos negativos incluyen estructuras de bucle-tallo 5' UTR intramoleculares estables (Muesing el al . , Cell 48:691 (1987)) y secuencias de AUG o estructuras de lectura abierta cortas precedidas por una AUG apropiada en la 5 ' UTR (Kozak, supra Rao et al . , Mol and Cell Biol . 8:284 (1988)). En consecuencia, la presente invención proporciona regiones 5' y/o 3' UTR para la modulación de la traducción de secuencias de codificación heterólogas. Adicionalmente, los segmentos que codifican polipéptidos de los polinucleótidos de la presente invención pueden modificarse para alterar el uso de codón. El uso de codón alterado puede emplearse para alterar la eficiencia de traducción y/o para optimizar la secuencia de codificación para expresión en un huésped deseado o para optimizar el uso de codón en una secuencia heteróloga para expresión en maíz. El uso de codón en las regiones de codificación de los polinucleótidos de la presente invención pueden analizarse estadísticamente usando paquetes de software disponibles comercialmente, tales como "Codon Preference" disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (véase Deveraux et al . , Nucleic Acids Res . 12: 387-395(1984)) o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co . , New Haven, Conn . ) . Así, la presente invención proporciona una frecuencia de uso de codón característica de la región codificadora de al menos uno de los polinucleótidos de la presente invención. El número de polinucleótidos (3 nucleótidos por aminoácido) que puede usarse para determinar una frecuencia de uso de codón puede ser cualquier número entero de 3 hasta el número de polinucleótidos de la presente invención como se proporciona en la presente. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un ejemplo de número de secuencias para análisis estadístico puede ser al menos 1, 5, 10, 20, 50, o 100. Redistribución de Secuencias La presente invención proporciona métodos para redistribución de secuencias usando polinucleótidos de la presente invención, y composiciones que resultan de los mismos. La redistribución de secuencias se describe en la publicación PCT no. 96/19256. Véase también, Zhang, J.- H., et al . Proc .

Na ti Acad Sci . USA . 94:4504-4509 (1997) y Zhao, et al . , Na ture Biotech 16:258-261 (1998) . Generalmente, la redistribución de secuencias proporciona un medio para generar bibliotecas de polinucleótidos que tienen una característica deseada, la cual puede seleccionarse o escogerse. Las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan de una población de secuencias relacionadas de polinucleótidos las cuales comprenden regiones secuenciales, que tienen identidad secuencial sustancial y pueden recombinarse homólogamente in vi tro o in vivo . La población de polinucleótidos de secuencia recombinados comprenden una subpoblación de polinucleótidos los cuales poseen características deseadas o ventajosas y que pueden seleccionarse por un método de selección de elección adecuado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo capaz de ser seleccionado para o detectado en un sistema de elección, y puede incluir propiedades de: una proteína codificada, un elemento transcripcional, una secuencia que controla transcripción, procesamiento de ARN, estabilidad de ARN, conformación de cromatina, traducción, u otra propiedad de expresión de un gen o transgen, un elemento replicativo, un elemento de enlace a proteína, o similar, tal como cualquier característica que confiera una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, la característica seleccionada será una Km y/o Kcat alterada la proteína tipo nativa como se proporciona en la presente. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado de la redistribución de secuencias tendrá una afinidad de enlace a sustrato más grande que el polinucleótido tipo nativo no redistribuido. En aún otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado de la redistribución de secuencias tendrá un pH óptimo alterado comparado con el polinucleótido tipo nativo no redistribuido. El incremento en tales propiedades puede ser al menos 110%, 120%, 130%, 140% o mayor que 150% del valor de tipo nativo. Cassettes de Expresión Recombinante La presente invención proporciona adicionalmente cassettes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo un ADNc o una secuencia genómica que codifica un polipéptido suficientemente largo para codificar una proteína activa „de la presente invención, puede usarse para construir un cassette de expresión recombinante el cual puede introducirse dentro de la célula huésped deseada. Un cassette de expresión recombinante comprenderá típicamente un polinucleótido de la presente invención unido operablemente a secuencias reguladoras de iniciación de transcripción lo cual dirigirá la transcripción del polinucleótido en la célula huésped intentada, tal como tejidos de una planta transformada. Por ejemplo, los vectores de expresión vegetal pueden incluir (1) un gen vegetal clonado bajo el control de transcripción de secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión vegetal también pueden contener, si se desea, una región promotora reguladora (Por ejemplo, una que confiera la expresión inducible o constitutiva, ambientalmente o relativa al desarrollo-regulada, o célula - o tejido específica/selectiva) , un sitio de comienzo de iniciación de transcripción, un sitio de enlace a ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de transcripción, y/o una señal de poliadenilación. Puede emplearse un fragmento promotor vegetal qué dirigirá la expresión de un polinucleótido de la presente invención en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores se refieren en la presente como promotores "constitutivos" y son activos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y „ estados de desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 1'- o 2'- derivado de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, el promotor Smas, el promotor cinamil alcohol deshidrogenasa (Patente Norteamericana no. 5,683,439), el promotor Nos, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S del virus mosaico de coliflor (CaMV), como se describe en Odell et al, (1985), Na ture, 313:810-812, actina de arroz (McElroy et al . , (1990), Plant Cell , 163-171); ubiquitin (Christensen et al., (1992), Plant Mol . Biol . 12:619-632; y Christensen, et al., (1992), PJant Mol . Biol . 18:675-•689); pEMU (Last, et al., (1991), Theor. Appl . Genet . 81:581-588); más (Velten et al., (1984), EMBO J. 3 : 2723-2730) ; e histona H3 de maíz (Lepetit et al., (1992), Mol . Gen . Genet . 231:276-285; y Atanassvoa et al., (1992), Plant Journal 2(3) :291-300), el Rsyn7 como se describe en la solicitud PCT publicada WO 97/44756, promotor ALS, como se describe en la solicitud PCT publicada WO 96/30530, y otras regiones de iniciación de transcripción de diversos genes vegetales conocidos por aquellos de experiencia. Para la presente invención ubiquitin es el promotor preferido para la expresión en plantas monocotiledoneas. Alternativamente, el promotor vegetal puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en un tejido específico o puede ser de otra forma bajo control ambiental o de desarrollo má§ preciso. Tales promotores se refieren en la presente como promotores "inducibles". Las condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción por promotores inducibles incluyen ataque de patógenos, condiciones anaeróbicas, o la presencia de luz. Ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adhl, el cual es inducible por hipoxia o tensión de frío, el promotor Hsp70, el cual es inducible por tensión de calor, y el promotor PPDK, el cual es inducible por luz.

Ejemplos de promotores bajo control de desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solamente, o de preferencia, en ciertos tejidos tales como hojas, raíces, frutas, semillas, o flores. La operación de un promotor también puede variar dependiendo de su ubicación en el genoma. Así, un promotor inducible puede volverse completa o parcialmente constitutivo en ciertas ubicaciones . Si se desea la expresión del polipéptido, es generalmente deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región que codifica polinucleótidos. La región de poliadenilación puede derivarse de una diversidad de genes vegetales, o de T-ADN. La secuencia extremo 3' que se agregará puede derivarse de, por ejemplo, los genes nopalinsintasa o genes octopinsintasa, o alternativamente de otros genes vegetales, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico. Ejemplos de tales elementos reguladores incluyen, pero no se limitan at regiones de terminación 3' y/o poliadenilación tales como aquellas del gen Agrobacterium tumefaciens nopalinsintasa (nos) (Bevan et al., (1983), Nucí . ñcids Res 12:369-385); el gen inhibidor de proteinasa de papa II (PINII) (Keil, et al., (1986), Nucí . Acids Res . 14:5641-5650; y An et al., (1989), Plant Cell 1:115-122); y el gen CaMV 19S (Mogen et al., (1990), Plant Cell 2:1261-1272). Una secuencia intron puede agregarse a la región sin traducir 5' o la secuencia de codificación de la secuencia de codificación parcial para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intron empalmable en la unidad de transcripción en las construcciones de expresión vegetal y animal han mostrado incrementar la expresión del gen en los niveles de ARNm y proteína hasta 1000 veces. Buchman and Berg, Mol . Cell Biol . 8: 4395-4405 (1988); Callis et al . , Genes Dev. 1: 1183-1200 (1987). Tal mejoría de intro'n de la expresión del gen es típicamente más grande cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de intrones de maíz de intron Adhl-S 1, 2, y 6, el intron Bronze-1 son conocidos en la técnica. Véase generalmente, The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994). Las secuencias de señal de planta, que incluyen, pero no se limitan a, secuencias ADN/ARN que codifican el péptido-señal cuyas proteínas objetivo en la matriz extracelular de la célula vegetal (Dratewka-Kos, ^ et al., (1989), J. Biol . Chem 264:4896 4900), el gen de extensión de Nicotiana plumbaginifol±a (DeLoose, et al., (1991), Gene 99:95-100), péptidos de señal que seleccionan proteínas a la vacuola como el gen sporamin de papa dulce (Matsuka, et al., (1991), PNAS 88:834) y el gen de lectina de cebada (Wilkins et al., (1990), Plant Cell, 2:301-313), péptidos de señal que causan que se secreten las proteínas tales como esa de PRIb (Lind, et al., (1992), Plant Mol . Biol . 18:47-53), o la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah, et al . , Plant Mol Biol . 12:119 (1989)) y por la presente incorporada para referencia) , o de la presente invención, el péptido de señal del gen ESP1 o BESTl, o peptido de señal que seleccionan proteínas a los plástidos tales como ese de linasa enoyl-Acp reductasa (Verwaert, et al., (1994), plant Mol . Biol . 26:189-202) son útiles en la invención. La secuencia de señal de alfa anilasa de cebada fusionada al polinucleótido trAPAO o APAO es la construcción preferida para la expresión en maíz para la presente invención. El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención comprenderán típicamente un gen marcador, el cual confiere un fenotipo seleccionable sobre células vegetales. Normalmente, el gen marcador seleccionable codificará resistencia a antibióticos, con genes adecuados que incluyen genes que codifican para resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada) , el gen estreptomicin fos^fotransferasa (SPT) que codifica la resistencia a estreptomicina, el gen neomicin fosfotransferasa (NPTII) que codifica la resistencia a canamicina o geneticina, el gen higromicin fosfotransferasa (HPT) que codifica la resistencia a higromicina, genes que codifican la resistencia a herbicidas los cuales actúan para inhibir la acción de acetolactato sintasa (ALS) , en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo el gen acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia en particular las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamin sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , u otros genes tales conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, y el gen ALS codifica la resistencia al herbicida clorosulfuron. Alternativamente, la invención, en sí misma, podría usarse como un método para la selección de transformantes, en otras palabras como un marcador seleccionable. Un polinucleótido APAO o trAPAO unido operablemente a un promotor y después transformado dentro de una célula vegetal por cualquiera de los métodos descritos en la presente invención expresaría la enzima degradativa. Cuando las células vegetales se colocan en la" presencia de fumonisina, API, o un análogo fitotóxico en cultivos solamente las células transformadas serían capaces de crecer. En otra modalidad, las células vegetales podrían transformarse con un polinucleótido para APAO y un polinucleótido para fumonisina esterasa. El agente selectivo en este caso podría ser ya sea API o fumonisina o cualquier análogo estructural. Así, el crecimiento de las células vegetales en la presencia de una micotoxina favorece la sobrevivencia de células vegetales que han sido transformados para expresar la secuencia de codificación que codifica para una de las enzimas de esta invención y degrada la toxina.

Cuando el cassette APAO o trAPAO con o sin el polinucleótido fumonisina esterasa, se cotransfor a con otro gen de interés y después se coloca en la presencia de fumonisina, API o un análogo fitotóxico, de esta invención permitiría la selección de solamente aquellas células vegetales que contienen el gen de interés. En el pasado se han usado genes de resistencia antibióticos como marcadores seleccionables. Dadas las preocupaciones actuales de los consumidores y ambientalistas sobre el uso de genes antibióticos y la posibilidad de el surgimiento de microorganismos resistentes debido a este uso, un sistema marcador seleccionable resistente no antibiótico tal como la presente invención, satisface esta muy importante necesidad. Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido que induce tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers et al . , Meth. In Enzymol., 153:253-277 (1987). Estos vectores son vectores de integración vegetal en que en la transformación, los vectores integran una porción del vector ADN dentro del genoma de la planta huésped. Ejemplos de vectores de A. tumefaciens útiles en la presente son los plásmidos de pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl et al . , Gene, 61: 1-11 (1987) y Berget et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 86:8402-8406 (1989). Otro vector útil en la presente es el plásmido pB1101.2 que está disponible de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) . Expresión de Proteínas en Células Huésped Usando los ácidos nucleicos de la presente invención, uno puede expresar una proteína de la presente invención en una célula diseñada recombinantemente tal como células de bacterias, levaduras, insectos, mamíferos, o preferiblemente plantas. Las células producen la proteína en una condición no natural (por ejemplo, en cantidad, composición, ubicación, y/o tiempo) , debido a que han sido genéticamente alteradas a través de la intervención humana para hacerlo así. Se espera que aquellos de experiencia en la técnica sean conocedores de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. No se hará el intento para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariótidos o eucariótidos En breve resumen, la expresión de ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de la presente invención se obtendrá típicamente uniendo operablemente, por ejemplo, el ADN o ADNc a un promotor (el cual es ya sea constitutivo o inducible) , seguido por la incorporación dentro de un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en _ procariótidos o eucariótidos. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifica una proteína de la presente invención. Para obtener alto nivel de expresión de un gen clonado, es deseable construir vectores de expresión que contengan, a lo mínimo, un promotor fuerte, tal como ubiquitin, para dirigir la transcripción, un sitio de enlace a ribosoma para la iniciación de traducción, y un terminador de transcripción/traducción. Los promotores constitutivos se clasifican como proporcionando un rango de expresión constitutiva. Así, algunos son promotores constitutivos débiles, y otros son promotores constitutivos fuertes. Generalmente, por "promotor débil" se intenta un promotor que impulsa la expresión de una secuencia de codificación a un bajo nivel. Por "bajo nivel" se intenta a niveles de aproximadamente 1/10,000 copias hasta aproximadamente 1/100,000 copias hasta aproximadamente 1/500,000 copias. Recíprocamente, un "promotor fuerte" impulsa la expresión de una secuencia de codificación a un "alto nivel", o aproximadamente 1/10 copias hasta aproximadamente 1/100 copias hasta aproximadamente 1/1,000 copias. Uno de experiencia reconocerá que las modificaciones pueden hacerse a una proteína de la presente invención sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones pueden hacerse para facilitar la clonación, expresión, o incorporación de la molécula objetivo dentro de una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, incluyen , por ejemplo, una metionina agregada en el término amino para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo poli His) colocadas en cada término para crear sitios de restricción ubicados convenientemente o codones de terminación o secuencias de purificación. A. Expresión en Procariótidos Las células procarióticas pueden usarse como huéspedes para la expresión. Los procariotidos se representan más frecuentemente por diversas cepas de E. coli ; sin embargo, otras cepas microbianas también pueden usarse. Secuencias de control procarióticas comúnmente usadas, las cuales se definen en la presente para incluir promotores para la iniciación de transcripción, opcionalmente con un operador, junto con las secuencias de sitio de enlace a ribosoma, incluyen tales promotores comúnmente usados, como los sistemas promotores beta lactamase (penicillinase) y lactosa (lac) (Chang et al., Nature 198:1056 (1977)), el sistema promotor triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)) y el promotor PL lambda derivado y el sitio de enlace a ribosoma N-gen (Shimatake et al . , Nature 292:128 (1981)). La inclusión de marcadores de selección en vectores de ADN transfectados en E. coli también es útil. Ejemplos de tales marcadores incluyen genes que especifican resistencia a la ampicilina, tetraciclina, o cloranfenicol.

El vector se selecciona para permitir la introducción del gen de interés dentro de la célula huésped apropiada. Los vectores bacterianos son típicamente de origen plásmido o fago. Las células bacterianas apropiadas se infectan con partículas de vector fago o se transfectan con el vector fago desnudo de ADN. Si se usa un vector plásmido, las células bacterianas se transfectan con un vector de plásmido ADN. Los sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente invención están disponibles usando Bacillus sp. y Salmonella (Palva et al . , Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach, et al . , Na ture 302: 543-545 (1983)). El vector plásmido pGEX-4T-l de Pharmacia es el vector de expresión E. coli preferido para la presente invención . B . Expresión en Eucariótidos Una diversidad de sistemas de expresión eucarióticos tales como células de levadura, líneas de célula de insecto, plantas y mamíferos, son conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Como se explica brevemente en lo siguiente, la presente invención puede expresarse en estos sistemas eucarióticos. En algunas modalidades, las células vegetales transformadas/transfectadas, como se discute infra, se emplean como sistemas de expresión para la producción de las proteínas de la invención actual. La síntesis de proteínas heterólogas en levaduras es bien conocida. Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) es un trabajo bien reconocido que describe los diversos métodos disponibles para producir la proteína en levadura. Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucarióticas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris . Vectores, cepas y protocolos para la expresión en Saccharomyces Pichia son conocidos en la técnica y disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen) . Los vectores adecuados normalmente tienen secuencias de control de expresión, tales como promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato cinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares como se desee. Una proteína de la presente invención, una vez expresada, puede aislarse de la levadura al lizar las células y aplicar técnicas de aislamiento de proteínas estándar a los lizados o los granulos. El monitoreo de los procesos de purificación pueden lograrse usando técnicas de tinción Western o radioinmunoensayo u otras técnicas de inmunoensayo estándar. Las secuencias que codifican las proteínas de la presente invención también pueden ligarse a diversos vectores de expresión para uso en transfectar cultivos celulares de, por ejemplo, origen mamífero, insecto, o vegetal. Los sistemas celulares de mamíferos frecuentemente estarán en la forma de monocapas de células aunque también pueden usarse suspensiones de células de mamífero. Un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de expresar proteínas intactas se han desarrollado en la técnica e incluyen las líneas de células HEK293, BHK21, y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o un promotor pgk (fosfoglicerato cinasa)), un mejorador (Queen et al . , Immunol . Rev. 89: 49 (1986)), y los sitios de información de procesamientos necesarios, tales como sitios de enlace a ribosoma, sitios de empalme ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición T Ag poly A SV40), y secuencias de terminador transcripcional. Otras células animales útiles para la producción de proteínas de la presente invención están disponibles, por ejemplo, del American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hibridomas (7th edition, 1992) . Los vectores apropiados para expresar las proteínas de la presente invención en células de insectos se derivan normalmente del baculovirus SF9. Las líneas de células de insectos adecuadas incluyen líneas de células de larva de mosquito, gusano de seda, gusano guerrero, polilla y líneas Drosophila tales como una línea de células Schneider (Véase Schneider, J. Embryol . Exp . Morphol . 27: 353-365 (1987). Como con la levadura, cuando se emplean células huésped vegetales o de animales superiores, las secuencias de poliadenilación o secuencias de terminador de transcripción se incorporan típicamente dentro del vector. Un ejemplo de una secuencia de terminador es la secuencia de poliadenilación del gen de hormona de crecimiento bovino. Las secuencias para el empalme preciso de la copia también pueden incluirse. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VPl de SV40 (Sprague, et al . , J. Virol . 45: 773-781 (1983)).

Adicionalmente, las secuencias de gen para controlar la replicación en la célula huésped pueden incorporarse dentro del vector tales como aquellas encontradas en los vectores tipo virus de papiloma bovino. Saveria-Campo, M., Bobine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector in DNA Cloning Vol . II a Practical Approach, D.M. Glover, Ed, IRL Press, Arlington, Virginia pp . 213-238 (1985) . Además, uno de los genes para fumonisina esterasa o la APAO o trAPAO colocado en el vector de expresión vegetal apropiado puede usarse para transformar las células vegetales. La enzima puede después aislarle de callo vegetal o las células transformadas pueden usarse para regenerar plantas transgénicas. Tales plantas transgénicas pueden cosecharse, y los tejidos apropiados (semilla u hojas, por ejemplo) pueden someterse a una extracción de proteína a gran escala y técnicas de purificación, y las enzimas de degradación de fumonisina o APAO pueden aislarse para uso en procesos de desintoxicación del producto de hidrólisis de fumonisina. Métodos de Transformación Vegetal Se conocen numerosos métodos para introducir genes extraños en plantas y pueden usarse para insertar un polinucleótido APAO o trAPAO dentro de un huésped vegetal, incluyendo protocolos de transformación vegetal biológicos y físicos. Véase, por ejemplo Miki et al., (1993), "Procedure for Introducing Foreing DNA into Plants", In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glik and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Ratón, páginas 67-88. Los métodos escogidos varían con el vegetal huésped, e incluyen métodos de transfección química tales como fosfato de calcio, transferencia de gen mediado por microorganismos tales como Agrojacteriujíi (Horsch, et al., (1985), Science 227:1229-1231), electroporación, micro-inyección, y bombardeo biolístico. Son conocidos y disponibles cassettes de expresión y vectores dy en métodos de cultivo in vitro para células vegetales o transformación de tejidos y regeneración de plantas. Véase, por ejemplo, Qruber, et al., (1993), "Vectors for Plant Transformation" In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds. CRC Press, Inc., Boca Ratón, 89-119. Transformación mediada por Agrobacterium El método más ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión dentro de plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium . A . tumefaciens y A . rhizogenes son bacterias del suelo patogénicas de plantas, las cuales transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, transportan genes responsables de la transformación genética de plantas. Véase, por ejemplo Kado, (1991), Cri t . Rev. Plant Sci . 10:1. Descripciones de los sistemas del vector Agrobacterium y los métodos para la transferencia de gen mediada por Agrobacterium se proporcionan en Gruber et al., supra ; Miki, et al., supra ; y Moloney et al., (1989), Plant Cell Reports 8:238. De manera similar, el gen puede insertarse dentro de la región T-ADN de un plásmido Ti o Ri derivado de A. tumefaciens o A . rhizogenes, respectivamente. Así, los cassettes de expresión pueden construirse como en lo anterior, usando estos plásmidos. Se conocen muchas secuencias de control las cuales cuando se acoplan a una secuencia de codificación heteróloga y se transforman dentro de un organismo huésped muestran fidelidad en la expresión del gen con respecto a la especificidad de tejido/órgano de la secuencia de codificación original. Véase, por ejemplo, Benfey, P. N., y Chua, N., H. (1989) Science 244: 174-181. Las secuencias de control particularmente adecuadas para uso en estos plásmidos son promotores para la expresión específica de hoja constitutiva del gen en las diversas plantas objetivo. Otras secuencias de control útiles incluyen un promotor y un terminador del gen nopalin sintasa (NOS) . El promotor y terminador NOS están presentes en el plásmido pARC2, disponible de American Type Culture Collection y designado ATCC 67238. Si se usa un sistema tal, el gen virulencia (vir) del plásmido Ti o Ri también debe estar presente, junto con la porción T-ADN, o por medio de un sistema binario en donde el gen vir está presente en un vector separado. Tales sistemas, vectores para uso en los mismos, y métodos para transformar células vegetales se describen en la Patente Norteamericana no. 4,658,082; solicitud Norteamericana no. de Serie 913,914, presentada el 1 de octubre de 1986, como se hace referencia en la Patente Norteamericana 5,262,306, expedida el 16 de noviembre de 1993 a Robeson, et al.; y Simpson, R. B., et al. (1986) Plant Mol . Biol . 6:403-415 (también se hace referencia en la patente '306); todas incorporadas para referencia en su totalidad. Una vez construidos, estos plásmidos pueden colocarse dentro de A. rhizogenes o A. tumefaciens y estos vectores pueden usarse para transformar células efe especies vegetales, las cuales son ordinariamente suceptibles a la infección de Fusarium o Al ternaria . Diversas plantas transgénicas también se contemplan por la presente invención que incluyen pero no se limitan a soja, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, col, plátano, café, apio, tabaco, especie de garbanzo, algodón, melón y pimiento. La selección de A . tumefaciens o A. rhizogenes dependerá del vegetal transformado con el mismo. En general A. tumefaciens es el organismo preferido para la transformación. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, algunos gimnospermas, y algunas plantas monocotiledoneas (por ejemplo ciertos miembros de las Lil iales y Árales) son susceptibles a la infección con A. tumefaciens . o A . rhizogenes también tienen un amplio rango de huéspedes, que abarcan la mayoría de las dicotiledóneas y algunas gimnospermas, lo cual incluye miembros de Leguminosae, Compositae, y Chenopodiaceae . Las plantas monocotiledoneas pueden ahora transformarse con algún éxito. Publicación de la Solicitud de Patente Europea no. 604 662 Al para Hiei et al . describe un método para transformar monocotiledoneas usando Agrobacterium . Saito et al . describe un método para transformar monocotiledoneas con Agrobacterium usando el escutelo de embriones inmaduros (Solicitud Europea 672 752 Al) . Ishida et al . discute un método para transformar maíz al exponer embriones inmaduros a A . tumefaciens (Ishida et al . , Na ture Biotechnology, 1996, 14:745-750). Una vez transforinada^, estas células pueden usarse para regenerar vegetales transgénicos, capaces de degradar fumonisina. Por ejemplo, plantas completas pueden infectarse con estos vectores hiriendo el vegetal o introduciendo después el vector dentro del sitio de la herida. Cualquier parte del vegetal puede herirse, incluyendo hojas, tallos y raíces. Alternativamente, tejido vegetal, en la forma de un explante, tal como tejido cotiledonario de discos de hojas pueden inocularse con estos vectores, y cultivarse bajo condiciones, las cuales promueven la regeneración vegetal. Las raíces o retoños transformados por inoculación del tejido vegetal con A. rhizogenes o A . tumefaciens, conteniendo el gen que codifica para la enzima de degradación de fumonisina, puede usarse como una fuente de tejido vegetal para regenerar plantas transgénicas resistentes a fumonisina, ya sea por medio de embriogénesis somática u organogénesis. Ejemplos de tales métodos para regenerar tejido vegetal se describen en Shahin, E. A. (1985) Theor. Appl . Genet . 69:235-240; Patente Norteamericana no. 4,658,082; Simpson, R. B., et al. (1986) Plant Mol . Biol . 6: 403415; y las solicitudes de Patente Norteamericana no. de Serie 913,913 y 913,914, ambas presentadas el 1 de octubre de 1986, como se hace referencia en la Patente Norteamericana 5,262,306, expedida el 16 de noviembre de 1993 para Robeson, et al.; las descripciones completas en la misma incorporadas en la presente para referencia . Transferencia Directa de Gen A pesar del hecho de que el rango de huéspedes para la transformación mediada por Agrobacterium es amplia, algunas variedades principales de cereal de cosecha y gimnospermas han sido generalmente recalcitrantes a este modo de transferencia de gen, aún cuando algún éxito se ha logrado recientemente en arroz (Hiei et al., (1994), The Plant Journal 6:271-282). Diversos métodos de transformación vegetal, colectivamente referidos como transferencia directa de gen, se han desarrollado como una alternativa para la transformación mediada por Agrobacterium . Un método generalmente aplicable de transformación vegetal es la transformación mediada por microproyectiles, en donde el ADN se lleva a efecto sobre la superficie de microproyectiles que miden aproximadamente de 1 a 4 µm. El vector de expresión se introduce dentro de los tejidos vegetales con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/s lo cual es suficiente para penetrar las paredes y membranas de la célula vegetal. (Sanford et al., (1987), Part . Sci . Technol . 5:27; Sanford, 1988, Trends Biotech 6:299; Sanford, (1990), Physiol . Plant 79:206; Klein et al., (1992), Biotechnology 10:268). Otro método para el suministro físico del ADN a plantas es la sonicación de células objetivo como se describe en Zang et al., (1991), BioTechnology 9:996. Alternativamente, las fusiones de liposoma o esferoplastos se han usado para introducir vectores de expresión dentro de vegetales. Véase, por ejemplo Deshayes et al., (1985), EMBO J. 4:2731; y Christou et al., (1987), PNAS USA 84:3962. También se ha reportado la toma directa del ADN dentro de los protoplastos usando precipitación con CaCl2, alcohol polivinílico, o poli-L-ornitina. Véase, por ejemplo, Hain et al., (1985), Mol . Gen . Genet . 199:161; y Draper et al., (1982), Plant Cell Phisiol . 23:451. También se ha descrito la electroporación de protoplastos y células y tejidos completos. Véase, por ejemplo Donn et al., (1990), In: Abstracts of the Vllth Int 'l . Congress on Plants Cell and Tissue Cul ture IAPTC, A2-38, página 53; D'Halluin et al., (1992), Plant Cell 4: 1495-1505; and Spencer et al., (1994), Plant Mol . Biol . 24:51 -61. Así, un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de inactivar fumonisina o API puede aislarse y clonarse en un vector apropiado e insertarse dentro de un organismo normalmente sensible a Fusarium o sus toxinas. Además, el polinucleótido que imparte actividad de degradar fumonisina o API puede transferirse dentro de un plásmido adecuado, y transformado dentro de una planta. Así, una planta transgénica que degrada fumonisina o API puede producirse. Los organismos que expresan el polinucleótido pueden identificarse fácilmente por su capacidad para degradar^ fumonisina o API. La proteína capaz de degradar fumonisina o API puede aislarse y caracterizarse usando técnicas bien conocidas en el arte. APAO o trAPAO en una planta transgénica La fumonisina esterasa reduce pero no elimina la toxicidad de fumonisina. Por lo tanto una segunda modificación enzimática para reducir adicionalmente o abolir la toxicidad es deseable. La enzima APAO parcialmente purificada de Exophiala spinifera tiene poca o ninguna actividad en FBI intacta, una forma de fumonisina. Sin embargo, la enzima APAO recombinante de Exophiala spinifera, expresada en E. coli, tiene actividad significante pero reducida en FBI intacta y otras fumonisinas serie B. APAO o trAPAO podría así potencialmente usarse sin fumonisina esterasa puesto que el grupo amino es el objetivo principal de la desintoxicación. Alternativamente, los dos genes, fumonisina esterasa y APAO (o trAPAO) pueden usarse juntos para degradar toxinas. Se predice que APAO es una enzima que, cuando por sí misma o co-expresada en un sistema de expresión heterólogo junto con fumonisina esterasa (ya sea ESP1 o BEST1), resultará en la producción de 2-oxo pentol (2-OP) de fumonisina Bl . El rango de sustrato de APAO expresada en E. coli recombinante se limita a fumonisinas y sus productos de hidrlólisis y no incluye aminoácidos, precursores de esfingolípidos tales como fitosfingosina, o poliaminas tales como espermidina. Así, APAO es altamente específica para aminas parecidas a fumonisina, y así tendría poco efecto perjudicial sobre otros metabolitos celulares. Además, si se localiza extracelularmente, limitará cualquier contacto con aminas biológicamente importantes que también pudieran ser sustratos. El resultado final será una desintoxicación más efectiva de fumonisina de la que pueda lograrse con esterasa sola. La actividad de oxidasa de APAO se predice para resultar en la generación de peróxido de hidrógeno en cantidades estequiométricas relativas a API o fumonisina oxidada. Esto puede probar ser un beneficio adicional de esta enzima, puesto que el peróxido de hidrógeno es antimicrobiano y se piensa que contribuye al surgimiento de una respuesta de defensa en los vegetales (Przemylaw, Biochem J. , 322:681-692 (1997), Lamb, et al . , Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Bio 48:251-275 (1997), y Alverez, et al . , Oxida tive Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses, Cold Spring Harbor Press, 815-839 (1997)). Puesto que una de las modalidades de la presente invención es tener un polinucleótido fumonisina esterasa y un polinucleótido APAO o trAPAO presentes err una planta, existen diversas formas para introducir más de un polinucleótido en una planta. Una forma es transformar tejido vegetal con los polinucleótidos para fumonisina esterasa y APAO o trAPAO al mismo tiempo. En algunos sistemas de cultivo de tejido es posible transformar el callo con un polinucleótido y después establecer una línea de cultivo estable que contenga el primer polinucleótido, transformar el callo una segunda vez con el segundo polinucleótido. Uno también puede transformar tejido vegetal con un polinucleótido, regenerar plantas completas, después transformar el segundo polinucleótido dentro de un tejido vegetal y regenerar plantas completas. La etapa final sería entonces cruzar una planta que contenga el primer polinucleótido con una planta que contenga el segundo polinucleótido y seleccionar la progenie que contiene ambos polinucleótidos . Otro método es crear una proteína de fusión entre esterasa y APAO o trAPAO, preferiblemente con una región espaciadora entre los dos polipéptidos. Ambas enzimas serían activas aunque trabadas entre si. Además, un sitio de desdoblamiento enzimático diseñado en la región espaciadora, permitiría el desdoblamiento por una proteasa endógena o introducida . Las plantas transgénicas que contienen una enzima fumonisina esterasa y/o la enzima APAO y capaces así de degradar fumonisina o una micotoxina estructuralmente relacionada serían capaces de reducir o eliminar la patogenicidad de cualquier microorganismo que usa fumonisina o una micotoxina estructuralmente relacionada como un modo de entrada para infectar una planta. Los hongos patógenos frecuentemente usan toxinas para dañar plantas y debilitar la integridad celular para ganar entrada y expandir la infección en una planta. Al prevenir el daño inducido por una toxina, una planta sería capaz de prevenir el establecimiento del patógeno y con eso volverse tolerante o resistente al patógeno. Otro beneficio de la degradación de fumonisina es la producción de peróxido de hidrógeno. Cuando la fumonisina o API se desamina oxidativamente en C-2, como ocurre por la exposición a la enzima APAO o trAPAO, se produce peróxido de hidrógeno como un subproducto. La producción de peróxido de hidrógeno puede disparar respuestas de resistencia mejoradas en un número de formas. 1) El peróxido de hidrógeno tiene actividad antimicrobiana directa. 2) El peróxido de hidrógeno actúa como un sustrato para peroxidasas asociadas con la polimerización de lignina y en consecuencia el reforzamiento de la pared celular. 3) Por medio de mecanismos que todavía van a ser determinados, el peróxido de hidrógeno actúa como una señal para la activación de la expresión de genes relacionados a la defensa, que incluyen aquellos que resultan en la estimulación de la acumulación de ácido salicílico. Se piensa que el ácido salicílico actúa como una molécula de señal endógena que dispara la expresión de genes que codifican diversas clases de proteína relacionadas a patogénesis. Además, el ácido salicílico puede dar principio a la ráfaga oxidativa y así actuar en un bucle de retroalimentación mejorando su propia síntesis. El ácido salicílico £ambién puede estar involucrado en la muerte celular hipersensible actuando como un inhibidor de catalasa, una enzima que elimina peróxido de hidrógeno. 4) El peróxido de hidrógeno puede disparar la producción de compuestos de defensa adicionales compuestos de defensa adicionales tales como fitoalexinas, compuestos antimicrobianos de bajo peso molecular. Para una revisión del papel de la ráfaga oxidativa y SA por favor véase Lamb, C. and Dixon, RA, Ann . Rev. Plant Phisiol . Plant Mol . Biol . , 48: 251-275 (1997).

Desintoxicación de Grano Cosechado, el Ensilaje o Cultivo Alimenticio Contaminado La presente invención también se refiere a un método para desintoxicar una fumonisina o una micotoxina estructuralmente relacionada con una enzima APAO durante el procesamiento del grano para consumo animal o alimento humano, durante el procesamiento del material vegetal para el ensilaje o cultivos alimenticios contaminados con un microbio que produce toxina, tal como pero no limitado a, tomate. Puesto que la amoniación atmosférica del maíz ha probado ser un método inefectivo de desintoxicación (véase B. Fitch Haumann, INFORM 6:248-257 (1995)), tal metodología durante el procesamiento es particularmente crítica cuando la desintoxicación transgénica no es aplicable. En una modalidad de la presente invención, las enzimas que degradan fumonisina se presentan al grano, material vegetal para el ensilaje, o un cultivo alimenticio contaminado o durante el procedimiento del procesamiento, en etapas apropiadas de procedimiento y en cantidades efectivas para la desintoxicación de fumonisina y micotoxinas estructuralmente relacionadas. La desintoxicación por las enzimas, cepas microbianas, o un microorganismo diseñado pueden ocurrir no solamente durante el procesamiento de, sino también en cualquier momento antes o durante la alimentación del grano o materiales vegetales a un animal o incorporación del grano o cultivo alimenticio dentro de un producto alimenticio humano, o antes o durante la ingestión del cultivo alimenticio. Otra modalidad de la presente invención es el diseño de una bacteria u hongo para expresar las enzimas de desintoxicación y después usar la bacteria u hongo más que la enzima en sí misma. Existe un número de microbios que podrían diseñarse para expresar los polinucleótidos de la presente invención. Alguno también pudiera activar, ya sea induciblemente o constitutivamente, los genes endógenos para fumonisina esterasa o APAO. Al sobreexpresar las anzimas degradativas y después tratando las plantas, semillas o el ensilaje con el mocroorganismo, sería posible degradar la fumonisina ín si tu . Los polinucleótidos de la invención pueden introducirse dentro de microorganismos que se mutipliquen sobre plantas (epífitos) para suministrar las enzimas a los cultivos objetivo potenciales. Los epífitos pueden ser bacterias gram positivas o gram negativas, por ejemplo. Los microorganismos que han ^ sido genéticamente alterados para contener al menos un polinucleótido degradativo y el polipéptido resultante pueden usarse para proteger cultivos y productos agrícolas. En un aspecto de la invención, células completas, es decir no usadas del organismo transformado se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la enzima producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de una planta objetivo. Un líder de secreción puede usarse en combinación con el gen de interés tal que la enzima resultante se secrete fuera de la célula huésped para su presentación a la planta objetivo. Las enzimas degradativas pueden fermentarse en un huésped bacteriano y las bacterias resultantes procesadas y usadas como un aspersor microbiano. Cualquier microorganismo adecuado puede usarse para este propósito. Véase, por ejemplo Gaertner, et al. (1993) in Advance Engineered Pesticides, (ed. Kim, Marcel Dekker, New York) . Las enzimas o microorganismos pueden introducirse durante el procesamiento en formas apropiadas, por ejemplo como un lavado o aspersión, o en forma seca o liofilizada o en forma de polvo, dependiendo de la naturaleza del proceso de molienda y/o la etapa de procesamiento en la cual se lleva a cabo el tratamiento enzimático. Véase, generalmente Hoseney, R.C., Principies of Cereal Science and Technology, American Assn. of Cereal Chemists, Inc., 1990 (sobre todo Capítulos 5, 6 y 7); Jones, J.M., Food Safety, Eagan Press, St. Paul, MN, 1992 (sobre todo Capítulos 7 y 9) ; y Jelen, P., Introduction to Food Processing, Restan Publ. Co., Reston, VA, 1985. El grano procesado o el ensilaje puede usarse para alimentación animal, puede tratarse con una cantidad efectiva de las enzimas en la forma de un inoculante o aditivo probiótico, por ejemplo, o en cualquier forma reconocida por aquellos expertos en la técnica para uso en alimentación animal. Las enzimas de la presente invención se espera que sean particularmente útiles en la desintoxicación durante el procesamiento y/o en alimentación animal antes de su uso, puesto que las enzimas presentan rango relativamente amplio de actividad de pH . La esterasa de Exophiala spinifera, ATCC 74269, muestra un rango de actividad de aproximadamente pH 3 hasta aproximadamente pH 6, y la esterasa de la bacteria de ATCC 55552 muestra un rango de actividad de aproximadamente pH 6 hasta aproximadamente pH 9 (Patente Norteamericana no. 5,716,820, supra ) . La enzima APAO de Exophiala spinifera (ATCC 74269) tiene un rango pH de actividad de pH 6 hasta pH 9. Diseño Genético de Microorganismos Rumiantes Los microorganismos rumiantes pueden diseñarse genéticamente para contener y expresar ya sea las enzimas fumonisina esterasa o APAO, o una combinación de las enzimas. La ingeniería genética de microorganismos es ahora una técnica reconocida, y los microorganismos rumiantes así diseñados pueden agregarse al alimento en cualquier forma de técnica reconocida, por ejemplo, como un probiótico o inoculante. Además, los microorganismos capaces de funcionar como bioreactores pueden diseñarse para ser capaces de producir masa ya sea la fumonisina esterasa o las enzima APAO Uso de la Fumonisina Esterasa y Enzimas APAO Para la Detección de Reactivos Para Fumonisinas y Compuestos Relacionados Otra modalidad de la presente invención es el uso de las enzimas de la presente invención como reactivos de detección para Fumonisinas y compuestos relacionados. Las enzimas de la presente invención pueden usarse como reactivos de detección debido a la elevada especificidad de las enzimas esterasa y desaminasa, y el hecho de que la hidrólisis seguida por la oxidación de amina puede monitorearse por la detección de peróxido de hidrógeno o amoníaco usando reactivos estándar (análogos a una prueba de detección de glucosa usando glucosa oxidasa) . El peróxido de hidrógeno se mide frecuentemente al enlazar una reacción de peroxidasa dependiente de peróxido de hidrógeno a un producto de peroxidasa coloreado o detectable de otra forma (por ejemplo Demmano, et al . , European Journal of Biochemistry 238 (3) : 785-789 (1996) ) . El amoniaco puede medirse usando electrodos ion-específicos: Fritsche, et al . , Analytica Chimica Acta 244(2): 179-182 (1991); West, et al . , Analytica Chemistry 64(5): 533-540 (1992), y todas incorporadas en la presente para referencia) o por GC u otro método cromatográfico . Por ejemplo, las proteínas fumonisinesterasa (SPI o BEST) y APAO recombinantes o no recombinantes se agregan en cantidades catalíticas a un tubo de muestra que contiene una cantidad desconocida de fumonisinas (FBI, FB2, FB3, FB4, o productos de hidrólisis parcial o completa de los mismos) . El tubo se incuba bajo condiciones de pH y temperaturas suficientes para convertir cualquier fumonisina en la muestra en API, y correspondientemente la API a 2-OP, amoníaco, y peróxido de hidrógeno. Alternativamente, APAO o trAPAO se agregan en cantidades catalíticas a un tubo de muestra que contiene una cantidad desconocida de fumonisinas (FBI, FB2, FB3, FB4 o productos de hidrólisis parcial o completa de los mismos) . El tubo se incuba bajo condiciones de pH y temperaturas suficientes para convertir cualquier fumonisina en la muestra en 2-oxo FBI, amoniaco y peróxido de hidrógeno. Después se agregan reactivos adecuados para la cuantificación del peróxido de hidrógeno o amoniaco que fueron generados estequiométricamente a partir de las fumonisinas. En comparación con los tubos control que no recibieron enzima esterasa o APAO, la cantidad de fumonisina presente puede calcularse en proporción molar directa al peróxido de hidrógeno o amoniaco detectados, en relación a una curva estándar. Esta invención puede entenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que otras modalidades de la invención pueden practicarse sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se describe y reclama en la presente . Ejemplo 1 Aislados de hongos y de bacterias. Aislados de Exophiala de maíz se aislaron como se describe en la Patente Norteamericana no. 5,716,820 expedida el 10 de febrero de 1998 y las solicitudes Norteamericanas pendientes nos. 08/888,950 y 08/888,949, ambas presentadas el 7 de julio de 1997 e incorporadas en la presenta para referencia. Métodos de aislamiento. El aislamiento directo de levaduras negras de semillas se logró sembrando 100 mícrolitros de fluido de lavado de semilla sobre agar YPD o Sabouraud aumentado con cicloheximida (500 mg/litro) y cloranfenicol (50 mg/litro) . Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 7-14 días y se contaron las colonias pigmentadas individuales y se cultivaron para análisis de capacidad de degradación de fumonisina como se describe en la Patente Norteamericana no. 5,716,820 expedida el 10 de febrero de 1998, y las solicitudes Norteamericanas pendiente nos. 08/888,950 y 08/888,949, ambas presentadas el 7 de julio de 1997. Análisis de fumonisinas y productos de metabolismo. Se llevó a cabo cromatografía de capa fina analítica sobre placas de sílice C18 100% silanizadas (Sigma #T-7020; 10 x 10 cm; 0.1 mm de espesor) por una modificación del método publicado de Rottinghaus (Rottinghaus et al . , J Vet Diagn Invest, 4: 326 (1992), e incorporado en la presente para referencia) . Para analizar la actividad de fumonisina esterasa, líneas de muestra se pre-humedecieron con metanol para facilitar la aplicación de la muestra. Después de la aplicación de 0.1 a 2 µl de muestra acuosa, las placas se secaron al aire y se revelaron en MeOH: 4% KCl (3:2) o MeOH: 0.2 M KOH (3:2) y después se rociaron sucesivamente con 0.1 M de borato de sodio (pH 9.5) y fluorescamina (0.4 mg/ml en acetonitrilo). Las placas se secaron al aire y se observaron bajo UV de onda larga . Para análisis de la actividad APAO, se usó un método alternativo. Volúmenes iguales de muestra y 14C-AP1 (1 mg/ml, pH 8, 50 mM de fosfato de sodio) se incubaron a temperatura ambiente durante uno a seis días. La cromatografía de capa fina analítica se llevó a cabo sobre placas de gel de sílice C60 HPK (Whatman #4807-700; 10 x 10 cm; 0.2 mm de espesor) . Después de la aplicación de 0.1 hasta 2 (1 de muestra acuosa, las placas se secaron al . aire y se revelaron en CHCl3:MeOH:CH3COOH:H20 (55:36:8:1) . Las placas se secaron después al aire y se expusieron a pantalla Phosphorlmager (Molecular Dynamics) o película autoradiográfica . Se^ usó un Phosphorlmager Storm™ (Molecular Dynamics) para examinar la imagen producida sobre la pantalla . Hidrólisis alcalina de FBl en API. FBI o material de C8 de fumonisina sin refinar, se suspendió en agua a 10-100 mg/ml y se agregaron a un volumen igual de 4N de NaOH en un tubo de taparrosca. El tubo se selló y se incubó a 60°C durante 1 hora. El hidrolizado se enfrió a TA y se mezcló con un volumen igual de acetato de etilo, se centrifugó a 1000 RCF durante 5 minuto y la capa orgánica (superior) se recuperó. Las capas reunidas de acetato de etilo de dos extracciones sucesivas se secaron bajo N2 y se resuspendieron en H20 destilada. El material resultante (el aminopentol de FBI o "API") se analizó por TLC. Actividad enzimática de iltrado cultivado y micelio .

Aislado de Exophiala spinifera 2141.10 creció sobre agar YPD durante 1 semana, y se cosechó conidia, suspendida en agua estéril, y se usó a 105 conidias por ml para inocular medio de sales minerales Fries estéril que contiene 1 mg/ml de FBI purificado (Sigma Chemical Co.). Después de 2 semanas de incubación a 28 °C en la oscuridad, los cultivos se filtraron a través de filtros de acetato de celulosa de 0.45 micrones, y se lavaron con sales minerales de Fries. El micelio del hongo se suspendió en 15 mL de 0.1% de FBI, pH 5.2 + 1 mM de EDTA + 3 (g/mL de Pepstatina A + 1.5 (g/mL de Leupeptina y se desorganizaron en un Bead Beater™ usando cuentas de 0.1 mn y pulsos de un minuto, con enfriamiento por hielo. Se recolectaron las piezas Hyphal por filtración a través de Spin X™ (0.22 (m) , y los filtrados de cultivo original y del micelio sobrenadante se probaron por modificación de fumonisina por los métodos reseñados anteriormente. Preparación del filtrado cultivado sin refinar. Los cultivos de agar crecidos como anteriormente se usaron para inocular cultivos de caldo YPD (500 ml) en matraces cónicos a 17 una concentración final de 105 conidias por ml de cultivo. Los cultivos se incubaron 5 días a 28 °C sin agitación y el micelio se cosechó por filtración a través de filtros de 0.45 micrones bajo vacío. El filtrado se desechó, el enredo de micelio se lavó y se resuspendió en un medio bajo en sales minerales libre de carbono (1 g/litro de NH3N04; 1 g/litro de NaH2P04; 0.5 g/litro de MgCl2; 0.1 g/litro de NaCl; 0.13 g/litro de CaCl2; 0.02 g/litro de FeS04-7H20, pH 4.^5) que contiene 0.5 mg/ml hidrolizado alcalino de FBI sin refinar. Después de 3-5 días a 28°C en la oscuridad sin agitación los cultivos se filtraron a través de filtros de 0.45 micrones de bajo enlace a proteína para recuperar el filtrado cultivado. Se agregó fluoruro de fenilmetil sulfonilo (PMSF) a una concentración de 2.5 mm y el filtrado cultivado se concentró usando una membrana Amicon™ YM10 en una célula agitada a temperatura ambiente, y resuspendido en acetato de sodio 50 mM, pH 5.2 que contiene 10 mM de CaCl2. El filtrado cultivado sin refinar (concentrado aproximadamente 200 veces) se almacenó a -20°C. Para obtener cantidades preparativas de fumonisina hidrolizada por enzimas, 10 mg de FBI (Sigma) se disolvieron en 20 mL de acetato de sodio 50 mm a un pH 5.2 + 10 m de CaCl2, y se agregaron 0.25 mL de filtrado cultivado sin refinar concentrado 200x de 2141..10. La solución se incubó a 37 °C durante 14 horas, y después se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se llevó a aproximadamente pH 9.5 por adición de 0.4 mL de KOH 4N, y la mezcla se extrajo dos veces con 10 mL de acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron bajo N2 y se resuspendieron en dH20. 2.5 miligramos del material orgánico extraído se analizaron por espectrometría de masas con Bombardeo de Átomos Rápidos (FAB) . El espectro de masa resultante mostró un ion principal en M/z (+1)=406 unidades de masa, indicando que el producto principal de la hidrólisis enzimática fue API la cual tiene un peso molecular calculado de 405. Ejemplo 2 Preparación de micelio inducido y no iducido por API . Los ' cultivos líquidos de aislado de Exophiala spinifera 2141.10 se prepararon de placas de agar YPD (Extracto de Levadura 10 gm, Bacto-Peptona 20 gm, Dextrosa 0.5 gm, y Bacto-Agar 15 gm por litro de agua) . Alícuotas (400-500 (L) de una suspensión acuosa de células de E. spinifera de agar YPD se rocearon uniformemente sobre placas de agar de YPD de 150 x 15 mm con cuentas de vidrio estériles de 4 mm. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 6-7 días. Los micelios/conidias se transfirieron desde las placas de agar en un Medio de Sales Minerales (MSM) (Na2HP04 • 7H20 0.2 gm, 1.0 gm de NH4C1, Ó.01 gm de CaCl2-2H20, 0.02 gm de FeS04.7H20 por litro de agua destilada, pH 4.5) y .centrifugados a 5000 x g, 4°C, 20 minutos para peletizar las células. La pella de células se lavó una vez en 40 ml de MSM y se recentrifugó . La pella de células lavada se usó para inocular MSM a una relación de 1:19 de células empacadas: MSM. El cultivo que va a ser inducido se complementó con API a una concentración final de 0.5-1.0 mg/ml y se incubó a 28 °C, 100 rpm, en la oscuridad para inducir enzimas catabólicas. Los cultivos no inducidos no recibieron API pero se colocaron en un medio que contiene 4-ABA a las mismas concentraciones conforme API . Los sobrenadantes se eliminaron por filtración a través de acetato de celulosa a 0.45. El enredo restante de micelio se lavó con MSM estéril y después se congeló en nitrógeno líquido para almacenamiento. Ejemplo 3 Efecto de FBI y API sobre coleoptiles de maiz Coleoptiles de maíz de semillas de maiz germinadas crecidas en la oscuridad 4 días se cortaron arriba del punto de crecimiento y se colocaron en placas microtítuladas de 96 pozos en la presencia de 60 microlitros de agua destilada estéril que contiene FBI o API a concentraciones aproximadamente equimolares de 1.5, .5, .15, .05, .015, .005, .0015, o .0005 milimolar, junto con controles de agua. Después de 2 días en la oscuridad a 28°C los coleoptiles se colocaron a la luz y se incubaron otros 3 días. El daño o falta de los mismos se evaluó como sigue : 0 .0005 .0015 .005 ..015 .05 .15 .5 1.5 mM FBI - - - - + /- + + + + API + + = descoloración necrótica café de coleoptilo - = sin síntomas (lo mismo que el control de agua) Los resultados (véase tabla anterior) indican que •existe al menos una diferencia de 30 veces en toxicidad entre FBI y API a los coleoptilos de maíz de este genotipo. Este está en acuerdo general con otros estudios en donde la toxicidad de los dos compuestos se comparó para tejidos vegetales: En tejidos Lemna, API fue aproximadamente 40 veces menos tóxica (Vesonder et al . , " Arch Environ Contam Toxicol 23: 464-467 (1992) .) . Los estudios con toxina AAL y FBI en tomate también indican que la versión hidrolizada de la molécula es mucho menos tóxica (Gilchrist et al . , Mycopa tho logia 117:57-64 (1992)) . Lamprecht et al . , también observó una reducción aproximadamente de 100 veces en la toxicidad para tomate por API versus FBI (Lamprecht et al . , Ph Hopa tho logy 84:383391 (1994) ) . Ejemplo 4 Efecto de FBI y API sobre células cultivadas de tejido de maiz (Dulce Mexicano Negro, BMS) Se agregó FBI o API a diversas concentraciones a suspensiones de células BMS creciendo en un medio de cultivo líquido en placas de poliestireno de 96 pozos. Después de 1 semana la densidad de células en los pozos se observó bajo un poder de amplificación bajo y los pozos tratados con toxinas se compararon con los pozos control que recibieron agua. El crecimiento de las células BMS se inhibió significativamente a 0.4 micromolares de FBI, pero no se observó inhibición hasta 40 micromolares de API. Esto representa una diferencia aproximada de 100 veces en la toxicidad a las células cultivadas en tejido de maíz. Similarmente, Van Asch et al., (VanAsch et al . , Phi topa thology 82: 1330-1332 (1992)) observó inhibición significativa del callo de maíz crecido sobre medio sólido a 1.4 micromolares de FBI. Sin embargo, API no se probó en ese estudio. Ejemplo 5 Actividad de APAO Un extracto libre de células que contiene la actividad de desaminasa se obtuvo sometiendo células de Exophiala spinifera inducidas por sustrato a desorganización usando un Bead Beater™ en 50 mM de fosfato Na, pH 8.0, y recuperando el sobrenadante libre de células por centrifugación y filtración .45 micrones. Se^ probó la actividad catabólica incubando los extractos con API (columna de base hidrolizada de fumonisina Bl) o API marcado con 14C con el extracto y evaluando por TLC sobre sílice C18 o C60. El producto 2-OP tiene un Rf menor que API y se detecta ya sea por examen de radiomarcado o por rocío de H2S04/carbonización de la placa TLC. 2-OP no reacciona con el reactivo amina, fluorescamina que se usa rutinariamente para detectar API sobre placas TLC sugiriendo que el grupo amina está perdido o químicamente modificado. La actividad es más grande a 37 °C que a temperatura ambiente, pero después de 30 minutos a 65°C o 100°C (no permaneció actividad catabolica de API) . La actividad es máxima a pH 9. A pH 9, la conversión completa a 2-OP ocurrió en 30 minutos. La actividad se retiene por una membrana de corte de 30,000 daltons de peso molecular, pero sólo se retiene parcialmente por una membrana de corte de 100,000 daltons de peso molecular. Se probaron otros sustratos que contienen amina por modificación por extracto sin refinar. _ La fumonisina, con ácidos tricarboalílicos unidos, no se modificó por el extracto, inicando que debe ocurrir primero ester-hidrólisis para la APAO para ser capaz de ser efectiva en la modificación de FBI (como se denota posteriormente, la enzima APAO recombinante, expresada en E. coli de hecho oxida FBI aunque a una velocidad menor que API) . Otras bases de cadena larga (esfingosina, esfinganina, y fitoesfingosina) no se modificaron aparentemente por la APAO sin refinar, sugiriendo que la enzima (s) es específica para la columna de base de fumonisina. Las cantidades preparativas del producto, nombrado 2-OP, también han sido purificadas y analizadas por C13 rmn. Los resultados indican que 2-OP tienen un grupo ceto en el carbono 2 en lugar de una amina, consistente con una desaminación oxidativa por una amina oxidasa. Los datos de C13 rmn también indican que 2-OP espontáneamente forma un hemicetal interno entre C-1 y C-5, resultando en un anillo de 5 miembros con un nuevo centro quiral en C-2. Todas las otras asignaciones de carbono son como en API, así 2-OP es un compuesto de composición C22H44?6, FW 404. El producto de la enzima que actúa sobre la fumonisina hidrolizada no se espera que presente ninguna toxicidad significativa . Otras enzimas se probaron por su capacidad para modificar API. Todas las enzimas se probaron por TLC radiomarcado, como se describió anteriormente, bajo condiciones óptimas a 37°C Celsius, durante la noche o más tiempo. Los resultados son como sigue: Desaminación EC Fuente Resultado Monoamino oxidasa 1.4.3.4 p | lasma de bovino negativo D-amino oxidasa 1.4.3.3 riñon de porcino; Tipo X negativo L-amino oxidasa 1.4.3.2 Veneno de C adamanteus; Tipo I negativo Tiramino oxidasa 1.4.3.4 Athrobacter spp negativo Metilamino deshidrogenasa 1.4.99.3 Paracoccus denitrificans negativo Aralquilamino deshidrogenasa 1.4.99.4 Alcaligenes faecalis negativo Fenilalanina amoniaco liasa 4.3.1.5 Rhodotorula glutinis; Tipo I negativo Histidinamonialiasa 4.3.1.3 Pseudomonas fluorescens negativo L-aspartasa 4.3.1.1 Hafnia alvei (Bacterium cadaveris) negativo Tirosina oxidasa 1.14.18.1 cepa negativo Lisina oxidasa 1.4.3.14 Trichoderma viride negativo Diamina oxidasa 1.4.3.6 riñon de porcino negativo Los resultados fueron negativos para cada enzima probada. Por lo tanto se recolectaron aislados de la American Type Culture Collection (ATCC) . Los aislados de ATCC seleccionados se enlistaron como conteniendo de enzimas que modifican amina o fueron capaces de crecimiento/utilización de sustratos que contienen amina. Los aislados se probaron para determinar si podrían crecer sobre o utilizar API como la única fuente de carbono, y si alguna podía modificar API en un nuevo compuesto (s) . Las fuentes de nitrógeno que se usaron en los cultivos líquidos fueron 0.1% de API (peso/volumen), 0.1% de s-butilamina (volumen/volumen), 0.1% de n-butilamina (volumen/volumen), y 0.2% de nitrato de amonio (peso/volumen).

Se prepararon en Medios Mínimos de Vogel (sin NH4N03) que contiene 2% de sacarosa. Los aislados se inocularon dentro de diversos medios y se observaron por crecimiento durante 2-3 semanas . También se probaron con la prueba de TLC radiomarcado C14 para la modificación de API. En resumen, ninguno de los aislados probados presentaron modificación de API in vivo . Claramente la enzima APAO es única e inusual en su capacidad para modificar la toxina API.

EJEMPLO 6 Aislamiento del polinucleótido trAPAO El polinucleótido trAPAO se identificó usando un método de copia de imágenes patentado que compara los patrones de copia en dos muestras y permite la clonación de los fragmentos diferencialmente expresados. Esta tecnología se desarrolló por CuraGen® (New Haven, CT) . (véase solicitud de patente PCT Publicada no. WO 97/15690, publicada el 1 de mayo de 1997, e incorporada por la presente para referencia) fragmentos de ADNc amplificados PCR marcado fuorescentemente que representan copias expresadas pueden visualizarse como bandas o picos sobre un gel trazador, y el ADNc de banda diferencialmente expresadas (inducidas o suprimidas) pueden recuperarse de un gel duplicado, clonado y secuenciado. Los ADNcs pueden identificarse sin la necesidad de clonación, al igualar el tamaño predicho y la secuencia parcialmente conocida de bandas específicas sobre el trazador. En la presente invención dos muestras de ARN se obtuvieron de cultivos de E. spinifera crecidos durante un periodo específico en medio de sales minerales que contiene ya sea API (condición inducida) , o ácido gamma-aminobutírico (ABA; a condición no inducida) como la única fuente de carbono. En la condición inducida, las actividades de las enzimas fumonisinesterasa y APAO se detectaron, mientras que en la condición no inducida estas actividades no se detectaron. Los métodos usados para la inducción de APAO y la detección de la actividad se describieron anteriormente (véase Ejemplo 2 y Ejemplo 5) . El ARN se extrajo de micelio inducido por métodos Tri-reactivos (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, 5 Ohio) solamente moliendo una suspensión congelada de tejido y tri-reactivo con un mortero y manilla hasta casi fusión y agregando una extracción adicional después de la separación de fases extrayendo la fase acuosa una vez con fenol, y dos veces con una mezcla de fenol : cloroformo: alcohol isoamílico. Los ARN ilO se sometieron a copia de imágenes CuraGen® para detectar fragmentos de ADNc que se inducen específicamente en la presencia de API. En el trazado de gel resultante se encontraron diversas bandas que mostraron inducción de al menos 2 veces y hasta 79 veces o aún 100 veces o más en API. En el trazado del gel resultante se encontraron diversas bandas que mostraron inducción de al menos 10 veces en células crecidas en API comparadas con células crecidas en ABA. La secuencia de dos bandas altamente inducidas puede encontrarse en la Tabla 1 TABLA 1 20 Secuencia de nucleótidos de dos bandas CuraGen® que se identificaron como fuertemente inducidas API en cultivos de Exoph±ala sp±n±fera . >k0n0.395.5_b(SEC DE IDENT. NO: 1) GGGCCCCGGCGTTCTCGTAGGCTGCGCGGAGTTGGTCCCAGACAGACTTTTGTCGTACCTGCT TGGACTGTTGGGACCACTTCCGTCCCGGGTCTCCGACCATGAAACAGGTAATGGACCATTGTC GATCGACGTCGATGCTGGTATCTCTGGCAAATGAGATGGGGTCACAGCTCGATTGGAGGACGC CCGAGAGCCTTGTTCGCGCCACCACGGCTTGTCCCATACGAAGACTATCTTGCTATAGTAGCC CAGGATAGAATTTTCCGCCAATGCTTGCTTCTCGGCGGGAAGAGGTGGTGAAAATGTCAAGGT GGGATACAAGGTTGTCGGTAACGAAACCANCACCTTTTTGCTTCGGAACACGGCGC >rOcO-182.3_6(SEC. DE IDENT. NO: 2) GAATTTTCCGCCAATGCTTGCTTCTCGGCGGGAAGAGGTGGTGAAAATGTCAAGGTGGGATAC AAGGTTGTCGGTAACGAAACCACCACCTTTTTGCTTCGGAACACGGCGCCCGAGGCCGATCGT ACTGTACAGCCGGATGCCGACTGCTCAATTTCAGCGACGGGGGTGTTGAGGTGCAC Dos de las bandas más altamente inducidas kOnO-395.5, y rOcO-182.3 mostraron homología de secuencias significativa a una familia de enzimas, aminooxidasas que contienen flavina (EC 1.4.3.4), que oxidan aminas primarias a un aldehido o cetona, liberando amoníaco y peróxido de hidrógeno (Tabla 2) . TABLA 2 Identificación de una flavina aminooxidasa putativa de E. spinifera : fragmentos de copia inducidos por API con homología de aminooxidasa . Parámetros de omisión BLAST 2.0.

La estructura química del producto principal de la desaminación de API se considera que es un compuesto 2-ceto el cual se cicliza en un hemicetal en los carbonos 2 y 5. Por lo tanto se predice que esta enzima inducida es responsable de la desaminación de API. Usando la secuencia derivada de k0n0-395.5, se obtuvo un ADNc parcial por 31 y 5'. RACE-PCR (Chenchik, et. al., (Chenchik, et al., CLONTECHniques X 1:5-8 (1995); Chenchik, et al. Un nuevo método para clonar ADNc de longitud completa por PCR. En A Labora tory Guide to RNA: Isolation , Analysis , and Synthesis . Ed. Krieg, P. A. (Wiley-Liss, Inc . ) , 273-321 (1996)). Un equipo de clonación RACE de CLONTECH se uso, para obtener los amplicones RACE. Brevemente, se transcribe poli A+ ARN para hacer la primera hebra de ADNc usando un cebador de síntesis de ADNc poli T, "de reducción cerrada", la segunda hebra se sintetiza y el adaptador de ADNc de Marathón se liga en ambos extremos del ADNc. La plantilla diluida se usa después con el cebador adaptador de Marathón y en reacciones separadas ya sea un Cebador Específico de Gen 5' (GSP) o un 3 ' GSP se usa para producir el 3' o amplicón RACE 5'. Después de la caracterización del producto o los productos ADNc RACE y secuenciación completa, pueden generarse por 1) PCR de extremo a extremo usando los GSPs con el adaptador ligado a ADNc como plantilla, o 2) los fragmentos clonados 5' y 3' RACE pueden digerirse con una enzima de restricción que corta únicamente en la región de translapamiento, los fragmentos se aislan y ligan. Subsecuentemente, los ADNcs de longitud completa generados por RACE 1) y 2) pueden clonarse dentro de un vector adecuado. En combinación con el cebador adaptador suministrado se usaron los siguientes cebadores específicos de gen: para 3' RACE el oligbnucleótido N21965: 5'-TGGTTTCGTTACCGACAACCTTGTATCCC-3' (SEC. DE IDENT NO.:3.) y para 5' race, el oligonucleótido N21968: 5'-GAGTTGGTCCCAGACAGACTTTTGTCGT-3 ' (SEC. DE IDENT. NO.: 4. La secuencia de polinucleótidos ¿del polinucleótido trAPAO, kOnO-395_6.5, de Exophiala spinifera se muestra en la SEC. DE IDENT. NO.: 5. La secuencia de polipéptidos de trAPAO se muestra en SEC. DE IDENT. NO . : 6 Un segundo clon de APAO que contiene un intrón sin empalme también se encontró. La secuencia de polinucleótido trAPAO-I, k0n0-395_5.4, el intrón que contiene clon, de Exophiala spinifera, puede encontrarse en la SEC. DE IDENT. NO.: 7. La secuencia de polipéptido de trAPAO-I con el intrón empalmado se muestra en la SEC. DE IDENT NO.: 8. La secuencia de polipéptidos de trAPAO-I sin el intrón empalmado se muestra en la SEC. DE IDENT. NO.: 9. EJEMPLO 7 Expresión Heteróloga de trAPAO Las alineaciones de proteínas generadas con PileUp (GCG) indican que k0n0-395_6.5 (trAPAO) es similar en tamaño a otra flavina aminooxidasa y está cerca de ser de longitud completa con respecto al término amino de su clase de proteína. La secuencia k0n0-395_6.5 contiene un dobles ß-a-ß completo que se requiere para el enlace de dinucleótido (FAD) cerca del extremo amino. La secuencia kOnO-395 parece carecer solamente de un segmento amino terminal variable que varía en longitud de 5 aminoácidos en monoaminoxidasas de rata A & B hasta 40 aminoácidos de longitud en Aspergill us MAO-N. La función de éstas extensiones amino terminales no es conocida; no son reconocibles como señales de secreción. En base a la probabilidad de localización de la Exophiala APAO fuera de la membrana celular, la predicción es que kOnO-395 tendría una secuencia de señal similar a aquella de fumonisin esterasa clonada del mismo organismo (patente Norteamericana no. 5,716,820, supra ) . Usando GenomeWalker™, es posible clonar el extremo 5' de la copia y elementos regulatorios genómicos hacia el extremo 5' . Sin embargo, la secuencia de señal no se espera que sea crítica a la funcionalidad de la enzima; de hecho, la estrategia preferida para la expresión heteróloga en maíz y Pichia pastoris involucra la reposición de la secuencia de señal endógena (si está presente) con una secuencia de señal optimizada para el organismo, por ejemplo alfa amilasa de cebada para maíz y la señal de secreción factor alfa de levadura para Pichia . En maíz transformado con fumonisina esterasa, la secuencia de señal de alfa amilasa de cebada dio cantidades más altas de proteína funcional que la señal de hongo nativa, por lo tanto la reposición de la secuencia de señal de hongo nativa es una etapa lógica de optimización. Puesto que muchas de las aminooxidasas tienen un aminoácido positivamente cargado cerca de la N-terminal y hacia el extremo 5' del sitio de enlace de dinucleótido, una etapa de optimización adicional incluye agregar un codón para la lisina (K) a la N-terminal del clon de la trAPAO (k0n0-395_6.5, SEC. DE IDENT. NO.:5). Este clon se designa K:trAPAO y puede verse en las SEC. DE IDENT. NOS.: 10 y 11. La lisina extra está en el aminoácido 1 y los nucleótidos 1-3. EJEMPLO 8 Expression en Pichia de trAPAO Para la expresión óptima de trAPAO en Pichia pas toris el péptido señal del factor de equivalencia alfa se fusionó en la estructura con la secuencia de codificación K: trAPAO y puede verse en las SEC. DE IDENT. NOS.: 16 y 17. La secuencia de nucleótidos del clon pPicZalphaA: K: trAPAO contiene un inserto amplificado por PCR que comprende la estructura de lectura abierta kOnO-395 con un residuo de lisina adicional en el término amino, con un sitio 5' EcoRI y un sitio 3' Notl para clonación dentro de la estructura dentro del vector de secreción factor alfa pPicZalphaA. Los nucleótidos 1-267 contienen la señal de secreción del factor de equivalencia alfa de levadura. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. DE IDENT. NO.: 17 contiene el polipéptido trAPAO producido de pPicZalphaA:K: trAPAO después de la transformación dentro de Pichia pastoris . Para clonación dentro de los vectores de expresión, se usaron dos estrategias de clonación. El ADNc k0n0-395_5.4 se generó al usar PCR de extremo a extremo usando las GSPs 5 ' y 3 ' distales con el ADNc de doble hebra ligado al adaptador como una plantilla. Cada cebador oligonucleótido se diseñó con sitios enzimáticos de restricción 5' que contienen una secuencia de gen andanada de^23-25 pb. El cebador 3' también incluye el codón sin sentido. Las secuencias cebadoras son N23256: 5 ' ggggaattcAAAGACAACGTTGCGGACGTGGTAG-3 ' (SEC. DE IDENT. NO: 12) y N23259: 5 ' ggggcggccgcCTATGCTGCTGGCACCAGGCTAG-3 ' (SEC. DE IDENT. NO.: 13) . Se uso un segundo método para generar kOnO-395_6.5. 5' RACE y 3' RACE usando un cebador distal que contiene los sitios enzimáticos de restricción necesarios, codón sin sentido, etc., como se describió anteriormente y emparejado con un GSP "medial". Los "cebadores mediales" N21965: 5 ' -TGGTTTACGTTACCGACAACCTTGTATCCC-3 ' (SEC. DE IDENT. NO.: 14) para 31 RACE y el oligonucleótido N21968: 5'-GAGTTGGTCCCAGACAGACTTTT-3 * (SEC. DE IDENT. NO.:15). El ADNc de doble hebra ligado al adaptador se uso tal como plantilla. Los fragmentos aislados 5' y 3 ' -RACE se digirieron con una enzima de restricción que corta' únicamente en la región de translapamiento, en este caso Bgl 1, se aislaron y ligaron dentro del vector de expresión. Los sitios de restricción digeribles permiten la inserción de los insertos en la estructura dentro de EcoRI/Notl digerido pPicZalphaA. pPicZalphaA es un vector de expresión de E. coli compatible con Pichia que contiene una señal de secreción de factor alfa de levadura funcional y sitios de procesamiento péptidicos, permitiendo alta eficiencia de secreción inducible dentro del medio de cultivo de Pichia . Las bandas de 1.4 kb resultantes se clonaron dentro del plásmido EcoRI/Notl digerido pPicZalphaA. La SEC. DE IDENT. NO.: 16 contiene la secuencia de polinucleótidos del clon pPicZalphaA:K: trAPAO, un inserto PCR amplificado que comprende la estructura de lectura abierta kOnO-395 con un residuo de lisina adicional en el término amino, y un sitio EcoRI y un sitio 3' Notl para clonación en la estructura dentro del vector de secreción de factor alfa pPicZalphaA. La SEC. DE IDENT. NO.: 17 contiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido trAPAO producido de pPicZalphaA:K: trAPAO después de la transformación dentro de Pichia pastoris . Se agregan la señal de secreción del factor alfa y una lisina. Pichia se transformó como se describe en Invitrogen Manual, Easy Select™ Pichia Expression kit, Versión B, #161219, con el polinucleótido trAPAO como se describió anteriormente ya sea con un intron (trAPAO-I, control negativo, sin expresión de trAPAO activa puesto que Pichia no empalma intrones muy eficientemente) o sin un intrón (capaz de hacer una proteína APAO activa) Los fluidos y pellas de cultivo de Pichia se probaron por actividad de APAO como se describió anteriormente. El conjunto de pellas de células de cultivo de Pichia de seis días congeladas contienen dos muestras con intrón (SEC.

DE IDENT. NO. :7) en las construcciones de gen #11, #14, y dos muestras sin intrón en la construcción de gen (SEC. DE IDENT. NO.: 5), #6, #52. Los fluidos de cultivo de seis días de los mismos cultivos se usaron para sembrar con la enzima de hongos sin refinar para controles positivos. Las pellas celulares de 50 µl se resuspendieron en 150 µl de fosfato-Na-50mM frío, pH 8.0, y dividido en dos tubos de 500 µl recientes. Un tubo se mantuvo sobre hielo sin tratamiento, la suspensión de pella, y un tubo se usó para lisis. Un volumen igual de cuentas de circonia-sílice de 0.1 mm se agregó a cada tubo. Los tubos se BeadBeat™ durante 15 minutos y después se enfriaron sobre hielo 5 minutos. Esto se repitió tres veces. El lisado sin refinar se transfirió después a otro tubo para prueba o suspensión de lisado. Las pruebas TLC se realizaron como sigue, las muestras son 1) suspensiones de pella; 10 µl; 2) suspensiones de lisado; 10 µl; 3) 5 µl de medio mezclados con controles de medios con 5 µl de enzima de hongo sin refinar; 10 µl; 4) enzima sin diluir de hongo sin refinar usado para control positivo; 10 µl; 5) fosfato de Na 50mM usado para control de sustrato, pH 8.0; 10 µl. Diez microlitros de cada muestra más 10 µl de C-AP1 (1 mg/ml, fosfato de Na 50mM, pH 8) se incubaron a temperatura ambiente durante 6 días. Un microlitro de la muestra se colocó sobre las placas C18 y C60 de TLC. Las placas de C18 se revelaron en MeOH:4% KCl (3:2). Las placas C60 se desarrollaron en CHCl3:MeOH :CH3COOH : H20 (55:36:8:1). Las placas se secaron después al aire y se expusieron después a una PhosphorScreen™ durante 2-3 días. Se uso un Storm™ Phosphorlmager para revelar las imágenes Un resultado de TLC positivo se obtiene si una mancha radiactiva adicional aparece a una Rf menor de la modificación API producida anteriormente identificada como 2-OP, un producto desaminado de API. En las muestras #6 y #52 (sin intrón) la actividad enzimática modificante API (conversión de API a 2-OP) se detectó en suspensiones de pella, aunque la mayoría de la actividad se asoció con las suspensiones de pella. En las muestras #11 y #14 (con intrón) una cantidad mínima de actividad enzimática modificante API se detectó en el lisado de pella de #14 solamente, lo cual indica que Pichia no puede procesar el intrón eficientemente. Este experimento verificó que la actividad de APAO puede detectarse en transformantes de Pichia lo cual comprueba que trAPAO como se describe funciona correctamente para degradar API. La actividad se asocia con suspensiones de células, las cuales muestran actividad mayor que los lisados de pella. Los lisados de pella pueden mostrar menos actividad debido a la liberación de proteasas endógenas durante la lisis de las células. EJEMPLO 9 Expresión de trAPAO en E. coli El vector para expresar K: trAPAO en E. coli es pGEX-4T-1. Este vector es un vector de fusión de glutatión S-transferasa (GST) procariótico para la expresión intracelular de alto nivel inducible de genes o fragmentos de genes como fusiones con Schistosoma japonicum . Los vectores de fusión de genes GST incluyen las siguientes características, un promotor lac para expresión de alto nivel inducible; un gen lac Iq interno para uso en cualquier huésped E. coli ; y el factor Xa trombina o los sitios de reconocimiento de Proteasa PreScission para el desdoblamiento de la proteína deseada del producto de fusión. El inserto de interés, k0n0-395_6.5 (K: trAPAO) , se subclonó dentro del sitio 5' EcoRI y un sitio 3' Notl permitiendo la expresión en la estructura del péptido de fusión GST :K: trAPAO o GST:APAO. La secuencia de polionucleótidos de la fusión GST :K: trAPAO pueden encontrarse en la SEC. DE IDENT. NO.: 18. La fusión GST con polienlazante puede encontrarse en los nucleótidos 1 a 687. El K: trAPAO puede encontrarse en los nucleótidos 688 a 2076. El polipéptido resultante para la fusión GST:K:trAPAO puede verse en la SEC. DE IDENT. NO.:19. Los aminoácidos 1 a 229 representan la fusión GST más el polienlazante y los aminoácidos 230 a 692 representan la porción K: trAPAO de la fusión. E. coli se transformó con el vector pGEX-4T-l que contiene K: trAPAO o GST:APAO o como se describe en el catalogo, BRL, Life Technologies, Ine; Hanahan, D., J. Mol Biol 166:557 (1983) Jessee, J., Focus 6:4 (1984); King, P. V. and Blakesley, R. , Focus 8:1, 1 (1986), e incorporado en la presente para referencia. La E. coli transformada se indujo por adición de IPTG (isopropil b-D-tiogalactopiranosido) . Cuatro muestras de extracto soluble y cuatro muestras de cuerpos de inclusión insolubles se probaron para trAPAO o actividad de GST:APAO como se describe en el Ejemplo 9. La actividad APAO estuvo presente en todas las muestras solubles y dos muestras insolubles. La actividad más alta se encontró a 10 µM IPTG. Así el vector pGEX-4T-l que contiene la construcción k0n0-395_6.5 es capaz de producir enzima APAO activa en E. coli . EJEMPLO 10 La Secuencia de Nucleótidos Completa del Gen Exophiala APAO Usando el Genoma Walker, la secuencia de nucleótidos completa del gen Exophiala APAO se recuperó. La secuencia del • nucleótido descrita en la SEC. DE IDENT. NO.: 5 pierde una porción del extremo 5' del gene nativo. La porción pérdida del extremo 5' del gen nativo no es necesaria para la expresión de una enzima APAO activa, como puede verse en los Ejemplos 9 y 10. La secuencia de nucleótidos completa de APAO puede verse en la SEC. DE IDENT. NO.:22. La traducción de la SEC. DE IDENT.

NO.:22 puede encontrarse en la SEC. DE IDENT. NO.-.23. EJEMPLO 11 Expresión de APAO y ESPl en el callo de maiz transgénico Una de las construcciones preferidas para la expresión en maíz es la secuencia de nucleótidos de la trAPAO fusionada a la secuencia de señal de alfa amilasa de cebada. La secuencia de nucleótidos de la fusión de traducción de K: trAPAO con la secuencia de señal de alfa amilasa de cebada, para la expresión y secreción de la trAPAO madura en maíz puede verse en la SEC. DE IDENT. NO.:20. Los nucleótidos 1-72, representan la secuencia de señal de alfa amilasa de cebada; los nucleótidos 73-75, representan el recibo de lisina agregado; y los nucleótidos 76-1464, representan el ADNc de la trAPAO. La traducción de la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO.: 20 puede encontrarse en la SEC. DE IDENT. NO.:21. Los aminoácidos 1 a 24 representan la secuencia señal de alfa amilasa de cebada y los aminoácidos 25 a 463 son la secuencia de K: trAPAO. Los embriones de maíz se transformaron con ADN lineal (inserto, que carece de un marcador de resistencia a antibiótico bacterial) , derivado de construcciones que contienen tres unidades de transcripción: 1) un gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben et al . , Gene 70, 25-37 (1988)), 2) fumonisinaa ESPl fusionada a la secuencia de señal de alfa amilasa de cebada, y 3) APAO de longitud completa con o sin una secuencia señal de alfa amilasa de cebada amino terminal, (P13603, que comprende un marcador seleccionable PAT fusionado a un promotor 35S, fumonisina esterasa ESP1 fusionada a una secuencia de señal de alfa amilasa de cebada y el promotor ubiquitin, y APAO fusionado al promotor ubiquitin y P13611, que comprende un marcador seleccionable PAT 35S, promotor, fumonisina esterasa ESP1 fusionado a una secuencia de señal de alfa amilasa de cebada y el ^promotor ubiquitin y la APAO fusionada a una secuencia de señal de alfa amilasa de cebada y el promotor ubiquitin) . En estas construcciones se ESP1 y APAO se enlazaron al promotor de ubiquitin de maíz y el primer intrón. En una tercera construcción, las mismas tres unidades transcripcionales se clonaron dentro de un vector Agrobacterium Tl vector (P15258, la construcción comprende un marcador seleccionable PAT, fumonisina esterasa ESP1 fusionada a un secuencia de señal de alfa amilasa de cebada y APAO) . El callo transformado establemente o plantas TO regeneradas de ESP1 se probaron por actividad de ESPl y APAO en extractos regulados de tejidos de hojas, usando FBI radiomarcado y/o API y cromatografía^ de capa fina C 18. Los controles positivos consisten de tejido no transformado sembrado con ESP1 recombinante expresado en E. coli o _ APAO. Los resultados indican que las actividades de ESP1 y APAO pueden detectarse en plantas y callo de maíz transgénico.

Las plantas transgénicas se regeneraron del callo transgénico positivo para ambas actividades de ESPL y APAO por métodos estándar conocidos en la técnica. La actividad enzimática se probó como se describió previamente. Como puede verse posteriormente, los vegetales de maíz transgénico pueden expresar exitosamente ambas enzimas ESP1 y APAO. Expresión de ESP1 yAPAO en plantas de maíz trasgénicas (TO) Otra construcción preferida para la expresión de APAO en una planta es seleccionar la APAO para la perixosoma. Los embriones de maíz se bombardearon con insertos que contienen APAO unidos operablemente al promotor ubiquitin y una secuencia de selección peroxisomal (Gould, et al . , J Cell Biol 108:1657- 1664 (1989)); ESP1 unido Operablemente al promotor ubiquitin y *• la secuencia señal de alfa amilasa de cebada; y un marcador seleccionable de PAT unido operablemente al promotor 35S (número de construcción 114952) . Los controles negativo fueron embriones/callo no bombardeados. Los controles positivos fueron embriones/callo no bombardeados sembrados con enzima purificada. El callo transformado se probó después para actividad de ESPl o APAO como se describió previamente. Fuera de las 67 muestras probadas 18 muestras contienen actividad ESP1 y actividad APAO. La APAO seleccionada Peroxisomalmente y la fumonisina esterasa seleccionada apoplasto pueden expresarse exitosamente en una célula vegetal. Otra construcción preferida para la expresión de APAO en una planta es seleccionar la APAO para la membrana mitocondrial. Una extensión C-terminal se requiere para seleccionar monoaminooxidasas MAO-A y MAO-B para membranas mitocodriales externas de mamíferos. Una MAO-A, MAO-B, o extensión C-terminal funcionalmente similar puede fusionarse en la estructura APAO o trAPAO para facilitar la localización de esta enzima en la membrana mitocondrial del maíz u otras especies transformadas. EJEMPLO 12 Comparación de la Secuencia APAO Con Otras Secuencias La Exophiala ADNc de APAO (SEC. DE IDENT. NO.:22) contiene 1800 pb de codificación de estructura de lectura abierta para un polipéptido 600 aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO.: 23) con homología divergente a dos clases de proteínas. El carboxi tres cuarto de APAO (aminoácidos 137 a 593) es fuertemente homólogo a flavina aminooxidasas, un grupo de enzimas que catalizan la desaminación oxidativa de aminas primarias en carbono 1. La función aminooxidasa del dominio carboxi terminal se confirmó por la expresión de un polipéptido APAO truncado (de 137 a 600) en Pichia pastoris y E coli, usando API como un sustrato (ver Ejemplo 9) . La porción amino terminal de APAO, en contraste, (de aproximadamente 5 a 134) muestra homología significativa a un grupo de pequeñas estructuras de lectura abierta reducidas (ORF) reportadas en diversas bacterias y algas azul-verdes, así como diversos organismos superiores. Estas ORF codifican para pequeñas proteínas de función desconocida, que varían en tamaño de 14 a 17 kDA. La yuxtaposición de estas homologías divergentes en un polipéptido sencillo no se ha reportado previamente. Las flavina aminooxidasas (E.C 4.1.4.3) son un grupo - de flavoenzimas encontradas en organismos superiores e inferiores, y sirven una diversidad de funciones en el catabolismo. Catalizan la desaminación oxidativa de grupos amino primarios ubicados en la posición C-1 de una diversidad de sustratos, que resultan en un producto aldehido más amoniaco y peróxido de hidrógeno. Las enzimas APAO de la presente invención son la primera flavina aminooxidasa conocida que ataca una amina primaria no ubicada én el C-1 (es decir C-2 de API) y que resulta en un producto ceto más que en uno aldehídico. Sin embargo, las aminoácido oxidasas, mientras que no están cercanamente relacionadas a las flavina aminooxidasas, son flavoenzimas que oxidan una amina de C-2 adyacente a un grupo carboxílo de C-1. Las monoaminooxidasas MAO A & B, (de humano, bovino y trucha) , se localizan en la membrana exterior mitocondrial de los organismos superiores y regulan el nivel de neurotransmisores . Ejemplos microbianos incluyen una aminooxidasa de hongo {Aspergill us niger (niger) MAO-N) involucrada en el catabolismo de aminas, y una putrecina oxidasa bacteriana de una bacteria gram (+) {Micrococcus rubens) . Los polipéptidos principales varían en longitud de 478 a 527 aminoácidos, y comparten regiones de alta conservación de secuencia de aminoácidos en el extremo 5 ' así como en diversos puntos a través de la región de codificación. Las alineaciones de proteínas generadas con (GCG) indican que trAPAO contiene todos los dominios conservados encontrados en esta clase de proteínas que incluyen aquéllos cerca del extremo 5 ' . El dominio aminooxidasa de trAPAO contiene diversas características clave compartidas por esta clase de enzimas, que incluyen una región de enlace de dinucleótido amino terminal (ADP) caracterizada por una dilatación beta-alfa-beta que contiene tres glicinas invariables (G-X-G-X-X-G) en la vuelta beta-alfa. En trAPAO, está secuencia es ( DVVVVGAGLSG) . Esta región está involucrada en el enlace FAD. Están ausentes diversas características únicas a la aminooxidasa de mamíferos, que incluyen residuos de cisteína esencial (Wu et al . , Mol Pharm 43:888 (1993)), uno de los cuales (Cys-406 de MAO-A) está involucrado en el enlace covalente de FAD y una extensión carboxi terminal que ha sido demostrada que está involucrada en el transporte y anclado de MAO en la membrana mitocondrial exterior. La enzima de Aspergillus MAO-N se ha demostrado que contiene FAD no covalente, y también carece de cisteína conservada. Por lo tanto es posible que la enzima APAO tenga una FAD no covalente. La MAO-N de Aspergill us tiene un tripéptido carboxi terminal Ala-Arg-Leu que está involucrado en la selección y localización peroxizomal; esta secuencia está ausente de MAO Exophiala . El dominio aminooxidasa de trAPAO contiene un total de siete cisteínas, en comparación a diez para la enzima de Aspergillus y solamente dos para la enzima de Micrococcus . Las <* enzimas MAO de mamíferos contienen números variables de cisteinas (al menos diez) , algunas de las cuales se conservan altamente (que incluye el residuo de enlace a FAD mencionado anteriormente) . La secuencia trAPAO también tiene dos sitios de glicosilación putativos (NDS, NQS) hacia el extremo amino. El propósito de la extensión amino terminal de APAO y la base para su homología a un grupo de proteínas de 14-17 kDa no está claro. En Synechocystis , un polipéptido ORF similar se ubica inmediatamente hacia el extremo 5' de la glutamina desidrogenasa (gdhA) dependientes de NADP y se ha demostrado que se requiere para la expresión funcional de gdhA (Chavez et al, 1995) . Sin embargo, en trAPAO el dominio es claramente no necesario para la actividad enzimática, como se muestra por los resultados de los experimentos de expresión usando APAO truncada. Una pista interesante viene de la asociación frecuente de este pequeño ORF con racimos de genes involucrados en la actividad de óxido reductasa en bacterias, o inducido por tensión de calor en ratones, sugiriendo un rol posible en la protección redox. Un subproducto de la actividad de aminooxidasa es el peróxido de hidrógeno. Las flavoenzimas y otras enzimas redox son frecuentemente susceptibles a la inactivación por peróxido de hidrógeno (Schrader et al . , App Microb Biotechnol 45:458; Aguiree, et al , J Bacteriol 171:6243 (1989)), y es posible que esta proteína tenga un papel de 5 protección en contra de oxidantes tales como peróxido de hidrógeno. Alternativamente, este dominio pudiera estar involucrado en la función enzimática, localización o asociación de la enzima con otras estructuras. Ninguna región de péptido de señal puede detectarse en está región amino terminal . ___10 En la alineación de secuencia múltiple usando GCG PileUp, trAPAO es más similar a la putrecina oxidasa de Micrococcus rubens, número de acceso Swissprot P40974, (30% de aminoácidos idénticos, 40% similares) . La homología con diversas monoamin oxidasas A y B de mamífero, números de acceso Swissprot P21397 { Homo Sapiens mao a), P19643 { Ra t tus norvegicus mao b) , P21396 {Ra ttus norvegicus mao a) , y P21398 {Bos taurus mao a) , es algo menor, variando de 25 a 28% de identidad y 36 a 40% de similaridad. La homología a la única otra flavina aminooxidasa de hongo conocida, MAO-N de Aspergillus niger (número de acceso Swissprot P46882), es algo menor (24% idéntica, 34% similar) . Las enzimas microbianas son considerablemente divergentes la una de la otra, mientras que las monoaminooxidasas de mamífero comparten 65 a 87% de identidad. 25 El dominio amino terminal (ATD) de APAO también muestra homología a una proteína 14.5 kD de fagocitos humanos y de rata que muestra inhibición de actividad translacional in vitro (número de acceso Swissprot #P52758, P52759) Schmiedeknecht, et al . , Eur J Biochem 242(2), 339-351 (1996)), e incluye una proteína responsiva al calor de ratón (Samuel, et al . , Hepa tology 25 (5), 1213-1222 (1997)). Esto sugiere, que esta familia de proteínas está involucrada en la regulación del metabolismo celular. No existe ejemplo en el cual este dominio se fusione a un dominio de proteína más grande, sin embargo, haciendo a APAO única. Sin intentar estar limitado por la teoría, todo esto sugiere, que este dominio juega un papel regulador en la expresión del gen APAO, posiblemente para prevenir la traducción del mensaje cuando no se necesita. Esto eleva la pregunta de cómo se restablece la traducción del mensaje cuando la enzima activa se requiere por la célula Exophiala . Posiblemente existen sitios de inicio alternativos que comienzan hacia el extremo 3' del dominio inhibidor; o proteólisis, formación de complejo, degradación, o fosforilación/desfosforilación del dominio inhibidor cuando no se necesita. La primera posibilidad es menos probable debido a que no existen otros codones ATG antes del ATG en 122-124 que constituye el sitio de inicio predicho de APAO. La segunda posibilidad no puede probarse fácilmente, aunque existe un sitio de caseína cinasa en el ATD. Los papeles alternativos para la ATD incluyen la oligomerización de la proteína APAO, o anclar la proteína a algún sitio intracelular, tal como la membrana . Un ejemplo paralelo de control regulador sobre otra flavoenzima, flavina monooxigenasa 4 (FMO-4) humana, por una extensión C-terminal se ha reportado (Itagaki, et al . , J of Biol Chem 271(33): 20102-20107 (1996)). En este caso la introducción de un codón sin sentido antes de la base 81 de extensión C-terminal permite la expresión de la enzima activa en sistemas heterólogos. Sin embargo el papel de la porción C-terminal no fue elucidado. En otro ejemplo, el empalme alternativo conduce a un producto de gen más corto que el que se forma complejo con e interfiere con la función de la versión empalmada normalmente (Quinet, et al . , J of Biol Chem 268(23) : 16891-16894 (1993) ) . En otro caso, un inserto generado por empalme alternativo en otra proteína conduce a la inhibición del crecimiento celular (Bhat, et al., Protein Engineering 9(8): 713-718 (1996)). En aún otra variación, las variantes de empalme fas/Apol previenen apoptosis, aparentemente a través de un dominio de 49 aminoácidos compartidos por todas las variantes ( (Papoff; et al . , J de Inmunology 156(12): 4622-4630 (1996) ) . EJEMPLO 13 Haciendo una proteína de fusión que contiene actividad de fumonisina esterasa y AP amino oxidasa en el mismo polipéptido Las actividades enzimáticas de fumonisina esterasa y APAO pueden combinarse en un polipéptido sencillo usando las estructuras de lectura abierta junto con o sin una región espaciadora entre los dos polipéptidos. Esto crea una proteína híbrida con actividades enzimáticas duales que puede exportarse como una unidad al apoplasto, y permitirá que ambas actividades enzimáticas se localicen convenientemente en la misma área de la pared celular. Las dos ADNc pueden combinarse en cualquier orden, pero el método preferido es enlazarlas en el orden NH3-Esterasa :APAO-COOH . El espaciador, si está presente, puede consistir de una dilatación corta de aminoácidos tales como GGGSGGGS, o un conjunto de aminoácidos que comprenden un sitio de desdoblamiento de proteasa que puede influirse sobre una proteasa apoplástica. Esto resultaría en la producción de cantidades estequiométricas de ambas enzimas esterasa y APAO en el apoplasto. La proteína de fusión esterasa-APAO puede hacerse ya sea con la fumonisina esteraba de E. spinifera (ESPI) o la fumonisina esterasa de la bacteria (BESTI) . Puesto que el rango de pH para la actividad máxima de BEST1 es similar a la de APAO (rango 6.0 a 8.0), éstas pueden presentar la combinación más efectiva en forma fusionada. Además, cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para un fusión esterasa-APAO. Como se describió en ejemplos previos estas secuencias de fusión pueden colocarse en los vectores de expresión apropiados y usarse para expresar proteínas en bacterias o plantas . La secuencia de nucleótidos de ESP1 contiene tres diferencias de nucleótido y tres que corresponden a diferencias de aminoácidos para la secuencia ESP1 descrita en las solicitudes Norteamericanas pendientes nos. 08/888,950 y 08/888,949, ambas presentadas el 7 de julio de 1997. Ambas secuencias descritas en la presente solicitud y las secuencias descritas en las solicitudes Norteamericanas pendientes contienen genes fumonisina esterasa funcionales. Para los propósitos de la presente invención, las secuencias ESP1 originales o las secuencias ESP1 pueden usarse en combinación con las secuencias APAO o en secuencias de fusión. La secuencia de nucleótidos de una construcción BAA: ESP1 : trAPAO para una expresión vegetal puede encontrarse en la SEC. DE IDENT. NO.: 24 y la traducción en la SEC. DE IDENT. NO.: 25. La secuencia de nucleótidos para una contrucción BAA: BESTl :K: trAPAO para expresión vegetal puede encontrarse en la SEC. DE IDENT. NO.:26 y la traducción en la SEC. DE IDENT. NO.:27. La secuencia del nucleótido de una fusión de GST : ESPl :K: trAPAO para la expresión bacteriana en un pGEX-4T-l o el vector similar puede encontrarse en la SEC. DE IDENT. NO.: 28 y la traducción en la SEC. DE IDENT. NO.: 29. La secuencia del nucleótido para una fusión GST : BEST1: K: trAPAO para la expresión bacteriana en un pGEX-4T-l o el vector similar puede verse en la SEC. DE IDENT. NO.: 30 y la traducción en SEC. DE IDENT. NO.:31.

EJEMPLO 14 Estudios de Sustrato APAO La siguiente prueba se uso para determinar la especificidad de sustrato de la enzima APAO. Mezcla de reacción: 436 µl de fosfato-Na 200 mM, pH8.0; 50 µl de sustrato (10 mM) ; 2 µl de Amplex Red '(1 mg en 200 µl DMSO); y 2 µl de Peroxidasa (5000 U/ml) . La enzima de APAO fue una enzima recombinante producida como fusión GST en E . coli, purificada sobre una columna de afinidad de glutatión y desdoblada con trombina para eliminar el GST. Todos los componentes se mezclaron á temperatura ambiente. La velocidad inicial se determinó en un espectrofotómetro a 572 nm durante un minuto por unidades de absorbancia/segundo (BLANK) . 10 microlitros de APAO a 70 ug/ml se agregó y mezclo. La velocidad inicial se determinó de nuevo a 572 nm durante un minuto en unidades de absorbancia/segundo (SAMPLE) . Las velocidades se convirtieron en unidades de absorbancia/minuto. El valor BLANK se substrajo del valor de SAMPLE. Las unidades de absorbancia se convirtieron en µM H202 de 1 µM H202 equivale a 0.138 unidades de absorbancia a pH 8.0. SUSTRATOS PARA APAO SUSTRATOS VELOCIDAD M H202/min 1 mM Fumonisina Bl 0 . 1429 1 mM API 0 . 8876 p.5mg/mL Fumonisina B2 0.3058 1 mM Fumonisina B3 0.1449 0.5mg/mL Fumonisina B4 0.1728 1 mM norepinefrina 0.0087 1 mM epinefrina 0.0071 1 mM dopamina 0.0040 1 mM espermina. 0.0002 NINGÚN SUSTRATO PARA APAO (definidos como compuestos que resultan en menos de 1% de conversión en peróxido de hidrógeno por APAO en relación a API bajo condiciones similares de tiempo, pH, temperatura, y concentración de sustrato) : 2-feniletilamina, espermidina, EDTA-Na2., triptamina, putrecina, benzamidina, serotonina, cadaverina, Pefabloc SC, tiramina, 1, 3-diaminopropano, leupeptina, histamina, hidroxilamino, aprotinina, deprenil, Fumoninisina C4, isoniazida, esfingosina, fenelzina, esfinganina, fitoesfingosina, D-alanina, DL-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido aspártico, D-ácido aspártico, L-cisteina, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, DL-lisina, L-metionina, DL-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina. EJEMPLO 15 Eliminación de sitios de glicosilación de APAO. Algunas enzimas citosólicas, cuando se diseñan para secreción por fusión con un péptido de señal heteróloga, carecen de fusión debido a la glicosilación en uno o más sitios de glicosilación potenciales (secuencia de consenso de aminoácidos N-X-S/T) que no están normalmente glicosilados en el ambiente nativo (Farrell LB, Beachy RN, Plant Mol Biol 15(6):821-5 (1990)). Puesto que APAO carece de una secuencia de señal reconocible, puede ubicarse citoplásmicamente en Exophiala spinifera , aunque la secreción por algún otro método que no involucre un péptido de señal no puede excluirse. APAO contiene dos sitios de glicosilación potenciales, los cuales pueden ser glicosilados potencialmente, cuando APAO se secreta en un vegetal u otra célula eucariótica. Estos sitios de glicosilación pueden eliminarse sin aceptar la función de la proteína por medio de mutagénesis dirigida al sitio usando protocolos estándar (tales como equipos disponibles de Laboratorios de CLONTECH, Inc. (Palo Alto, CA) ) . La SEC. DE IDENT. NO.:32 muestra la secuencia de aminoácidos de un GST:APAO en el cual dos aminoácidos del APAO se han cambiado por mutagénesis de sitio dirigido para eliminar dos sitios de glicosilación potenciales. La primera mutación cambia asparagina en el aminoácido 201 de APAO en serina, y la segunda mutación cambia serina en el aminoácido 206 de APAO en asparagina. Otras mutaciones ya sea en los aminoácidos 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, o 207 de APAO, o una combinación de los mismos, también puede diseñarse para lograr la eliminación de la señal de glicosilación (Mellquist, J. L.

Kasturi, L., Spitalnilc, S. L., y Shakin-Eshelman, S. H., 1998. El aminoácido que sigue a una secuencia de Asn-X-Ser/Thr es un determinante importante de eficiencia de glicosilación de núcleo n-enlazado Biochemistry 37:6833). Otras modificaciones para APAO puede hacerse para mejorar su expresión en un sistema vegetal, que incluye mutagénesis dirigida al sitio para eliminar residuos de cisteína seleccionados, los cuales pueden ser perjudiciales al doblamiento apropiado cuando la proteína se secreta dentro del sistema de endomembrana para entregar al apoplasto. Las cisteínas están presentes en los residuos 64, 109, 167, 292, 351, 359, 387, 461, y 482, y pueden o no estar involucrados en el reticulado de disulfuro en APÁO doblada madura. Usando métodos estándar de mutagénesis dirigida al sitio, uno o más de estos residuos pueden sustituirse con alanina u otros aminoácidos adecuados, resultando en una versión modificada de APAO que retiene su actividad y especificidad pero exhibe mejor actividad y estabilidad en un ambiente extracelular. Es posible que una o más cisteinas estén envolucradas en la unión covalente de la porción de FAD a la proteína APAO y se esperaría que la eliminación de está cisteina reduzca o derogue la actividad. EJEMPLO 16 Otros Polinucleótidos APAO del Exophiala spinifera y Rhinocladella atrovirens Usando cebadores diseñados de la APAO aislada de Exophiala spinifera ATCC 74269 (Tabla 15), se aislaron tres nuevos polinucleótidos de APAO de Exophiala spinifera (aislados ESP002 y ESP003), designados ESP002_C2, ESP002_C3 y ESP003_C12 y tres nuevos polinucleótidos APAO de Rhinocladiella a trovirens (aislado RAT011) designados RAT011_C1, RAT011_C2, RAT011_C4. Las cepas usadas para aislar los polinucleótidos se describen posteriormente .

- - Condiciones de crecimiento y producción del material de cultivo 1. Placas Streak de 150 x 15 mm con YPD con una alícuota de glicerón de los asilados anteriores. 2. Cultivar a 28 °C en la oscuridad hasta que exista suficiente crecimiento para inocular el medio líquido normalmente al menos dos semanas. 3. Se rasparon los micelios y esporas de las placas o cubos de agar usados para inocular 50 mis de caldo YPD en matraces de 250 ml con placas de desviación. 4. Los matraces de material de cultivo se cultivaron a 28°C en la oscuridad a -125 rpm. 5. Después que se obtuvo suficiente crecimiento los cultivos se cosecharon peletizando el cultivo en tubos de centrífuga de 50 ml a 3400 rpm durante 15 minutos. 6. El sobrenadante se desechó y las pellas se congelaron a -20°C. Caldo YFD y medio de agar Cantidad por litro: Extracto de levadura 10 g Bactopectona 20 g Dextrosa 0.5 g Bactoagar 15*' g (solamente para medio de agar) Aislamiento de ADN El ADN se aisló de acuerdo a una versión modificada de un protocolo de extracción CTAB ADN vegetal (Saghai-Maroof MA, et al . , Proc Na ti Acad Sci, USA, 81:8014-8018 (1984)) como sigue . 1. Colocar 0.2-0.5 g (peso seco) de micelio de hongo liofilizado en un tubo de centrífuga desecable de 50 ml, romper la estera con una espátula o varilla de vidrio. Agitar brevemente . 2. Agregar 10 ml (por 0.5 g de estera) de regulador de extración CTAB. Mezclar suavemente para humedecer toda la estera en polvo. 3. Colocar en baño de agua a 65°C durante 30 minutos. 4. Enfriar. Agregar un volumen igual de fenol: cloroformo. Agitar brevemente para mezclar 5. Centrifugar 20 minutos a 3400 rpm. 10 6. A la fase acuosa agregar un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). Agitar brevemente para mezclar. 7. Centrifugar 15 minutos a 3400 rpm. 8. A la fase acuosa agregar un volumen igual de 15 isopropanol. 9. Centrifugar durante 30 minutos a 3400 rpm para peletizar el ADN precipitado. 10. Elevar la pella de ADN con etanol al 70%. W 11. Secar la pella al aire. 20 12. Resuspender la pella en 1-5 ml de TE que contenga 20 ug/ml de ARNasa A. Regulador de Extración CTAB Tris 0.1 M, pH 7.5. 1% de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio ,- 25 mezclado) NaCl 0.7 M 10 mM de EDTA 2-mercaptoetanol al 1%. Agregar proteinasa K hasta una concentración final de 0.3 mg/ml antes de usarse. Diseño de Cebador Los cebadores usados fueron cebadores específicos de gen en base a la secuencia de polinucleótidos de APAO SEC. DE IDENT. NO.: 22 con sitios de restricción de enzimas para clonación. El cebador 5', 26194, contiene el sitio de reconocimiento de restricción de enzima, EcoRI . El cebador 3" complementario, 23259, contiene el sitio de reconocimiento de restricción de enzima, Notl. 26194 5' ggggaattcATGGCACTTGCACCGAGCTACATCAATC3 ' , 37-mer (SEC. DE IDENT. NO. :34) 23259 5' gggGCGGCCGCCTATGCTGCTGGCACCAGGCTAG3 ' , 34-mer (SEC. DE IDENT. NO. : 13) Condiciones PCR 1. El cóctel PCR: 10 mM dNTPs 1 ul por reacción de 50 ul regulador de polimerasa 10X Advantage 5 ul por tubo de 0.2 ml Agua HPLC 38 ul 10 uM cebador 26194 2 ul 10 uM cebador 23259 2 ul mezcla de polimerasa 50X Advantage (Clontech) 1 ul Plantilla, ADN genómico 50 ng/ul 1 ul 2. Condiciones termocíclicas : MJ PTC-100 g AgV Termociclador: Etapa 1 95°C 2 minutos 2 95°C 30 segundos 3 60°C 1 minuto 4 72°C 1 minuto 30 segundos 5 ir a la etapa 2, 3 X más 6 72°C 5 minutos 7 4°C Retener 8 Fin 3. Los productos PCR se analizaron sobre un gel de agarosa-1% de LE, TAE más bromuro de etilo. Se vieron bandas de aproximadamente 1900 pb sobre el gel. La banda no está presente en la reacción de control sin ADN. Protocolos de Clonación. 1. El ADN se extrajo de fragmentos de gel cortados usando un QIAGEN Gel Extraction Kit (número de catálogo 28704, QIAGEN, Santa Clara, CA) . 2. Los fragmentos de PCR se digirieron con EcoRI y Notl para liberar los sitios . para clonación dentro del vector digerido EcoRI y Notl, pGEX4Tl (Phamacia) o pGEMHZf+ (Promega) .

Los digeridos se limpiaron y desalaron usando un QIAquick PCR Purification Kit (número de catálogo 28104) . 4. El fragmento aislado se cuantificó y comprobó por pureza sobre un gel de agarosa de LE al 1%, TAE + bromuro de etilo. 5. Los fragmentos se ligaron en sitios compatibles en PGEX4T1 (Phamacia) o pGEMHZf+ (Promega) . 6. Después de la inactivación _ por calor de la eficiencia de biblioteca DH5 de E . coli competente se transformó con una pequeña cantidad de la reacción de ligadura. 7. Placas de LB + carbenicilina, 50 ug/ml, se rociaron con una alícuota de la mezcla de transformación, y se cultivaron durante la noche a 37 °C. 8. Las colonias se seleccionaron para el inserto de longitud completa usando un método miniprep de PCR utilizando cebadores vectoriales que flanquean la región de clonación múltiple . 9. Los clones positivos se identificaron y los •i cultivos de la noche se cultivaron para aislamiento de plásmidos y verificación por secuenciación. 10. Los clones positivos se identifican como sigue: DH5: pGEX4Tl:ESP002FL_c2 (de aislado de árbol de palma) DH5: pGEX4Tl:ESP002FL_c3 (de aislado de árbol de palma) DH5: pGEX4Tl:ESP003FL_cl2 (de aislado de maíz) DH5: pGEMllZf+ :RAT01lFL_cl (de aislado de maíz) DH5: pGEMHZf+:RAT011FL_c4 (de aislado de maíz) DH5: pGEX4Tl:RAT0HFL_c2(de aislado de maíz) **Nota importante: Estos son clones genómicos que contiene dos intrones. Resultados de Secuencias Se aislaron tres polinucleótidos APAO y polipéptidos relacionados de Exophiala spinifera (aislados ESP002 y ESP003) , designados ESP002_C2, (SEC. DE IDENT. NOS.: 35 y 36) ESP002_C3 (SEC. DE IDENT. NOS.:" 37 y 38) y ESP003_C12 (SEC. DE IDENT. NOS.: 39 y 40). Se aislaron tres polinucleótidos APAO de Rhinocladiella a trovirens (aislado RATOll) designado RAT011_C1 (SEC. DE IDENT. NOS.: 41 y 42), RAT011_C2 (SEC. DE IDENT. NOS.: 43 y 44), y RAT011_C4 (SEC. DE IDENT. NOS.: 45 y 46). Los intrones se detectaron en comparación .de la secuencia genómica con la secuencia ADNc de APAO de E. spinifera 214.10 (SEC. DE IDENT. NO.: 22), y por identificación de las uniones empalmadas de intrones putativos en los dominios de vacío (Shah, et al . , Journal of Molecular and Applied Genetics 2:111-126 (1983)) . Los plásmidos que *' contienen las secuencias de polinucleótidos de la invención se depositaron en American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, Virginia y se les asignó el Número de Acceso 98812, 98813, 98814, 98815, 98816, (todos depositados el 15 de julio de 1998) y PAT-32 (depositado el 7 de mayo de 1999) . Los depósitos serán mantenidos bajo los términos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. Los depósitos se hicieron meramente como una conveniencia para aquellos con experiencia en la técnica y no son una admisión de que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. § 112. Los resultados de secuencias preliminares se metieron dentro de GCG, y las alineaciones de nucleótidos y proteínas se hicieron en un pileup usando un programa de software llamado Genedoc para las comparaciones de sombreado y homologías. (Nicholas, et al . , EMBNEW. NEWS 4:14 (1997; o en el sitio de Internet http://www.cris.com/~Ketchup/genedoc.shtml). Las primeras secuencias APAO (SEC. DE IDENT. NO.: 22) se incluyeron para comparación. Comparando la secuencia de referencia SEC. DE IDENT. NO.:, 22 con las otras secuencias homologas las identidades varían de 96 a 99% (las identidades son menores" puesto que los intrones APAO no se incluyeron) . Las homologías son ligeramente más altas en comparación con las secuencias de genes Exophiala . A nivel de la secuencia de aminoácidos la comparación de la secuencia de referencia (SEC.

DE IDENT. NO.: 23) con los otros homólogos produjo identidades de secuencia de aproximadamente 97%. Todas las publicaciones y solicitudes de patente en esta especificación son indicativas del nivel de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente para referencia en el mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específica e individualmente indicada para referencia.

La invención ha sido descrita con referencia a diversas modalidades y técnicas especificas y preferidas. Sin embargo, debe entenderse que pueden hacerse muchas variaciones y modificaciones al mismo tiempo que permanece dentro del espíritu y alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende un miembro seleccionado de: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado de SEC. DE IDENT. NOS: 36, 38, 40, 42, 44, y 46; (b) un polinucleótido que comprende al menos 20 bases contiguas de un polipéptido seleccionado de SEC. DE IDENT. NOS: 35, 37, 39, 41, 43, y 45; (c) un polinucleótido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a un polipéptido seleccionado de SEC. DE
IDENT. NOS: 35, 37, 39, 41, 43, y 45; (d) un polinucleótido que comprende al menos 25 nucleótidos en longitud los cuales se hibridizan bajo condiciones severas a un polinucleótido seleccionado de SEC. DE IDENT. NOS: 35, 37, 39, 41, 43, y 45; (e) un polinucleótido que comprende un polinucleótido seleccionado de SEC. DE IDENT. „NOS : 35, 37, 39, 41, 43, y 45; y (f) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de (a) hasta (e) . 2. El vector está caracterizado porque comprende al menos un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.
3. El cassette de expresión recombinante, que comprende un miembro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico está en orientación de sentido o contrasentido.
4. La célula huésped está caracterizada porque comprende el cassette de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 3.
5. La célula vegetal transgénica está caracterizada porque comprende el cassette de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 3.
6. La planta transgénica está caracterizada porque comprende el cassette de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 3.
7. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la planta es maíz, soya, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, tomate, y mijo.
8. La semilla transgénica de la planta transgénica de conformidad con la reivindicación 6.
9. La proteína aislada que comprende un miembro seleccionado de: (a) un polipéptido que comprende al menos 55% de identidad de secuencia a un polipéptido seleccionado de SEC. DE IDENT. NOS: 36, 38, 40, 42, 44, y 46; (b) un polipéptido codificado por un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1; (c) un polipéptido caracterizado por un polipéptido seleccionado de SEC. DE IDENT. NOS: 36,38, 40, 42,44, y 46; y (d) una variante conservadoramente modificada de un polipéptido seleccionado de SEC. DE IDENT. NOS: 36, 38, 40, 42, 44, y 46 .
10. Un polipéptido caracterizado porque comprende al menos 25 aminoácidos contiguos de un polipéptido seleccionado de SEC. DE IDENT. NOS: 36, 38, 40, 42, 44, o 46.
11. El método para reducir patogenicidad de una fuminosina que produce hongos o una micotoxina relacionada estructuralmente, caracterizada porque comprenden: a) transformar una célula vegetal con un vector que comprende ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, unido operablemente a un promotor. b) cultivar la célula vegetal bajo condiciones de crecimiento de plantas; y c) inducir la expresión del ácido nucleico durante un tiempo suficiente para cantidades del producto de proteína para acumular a niveles que pueden inhibir los hongos.
12. El método para degradar una fumonisina, o una micotoxina relacionada estructuralmente, caracterizado porque comprende aplicar el polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, solo o en combinación con una enzima fuminosina esterasa para una planta o grano cosechado.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la _ degradación ocurre durante el proceso de grano cosechado.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la degradación ocurre en el grano procesado que será usado como alimento de animal.
15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la degradación ocurre en el ensilaje.
16. El método para hacer una enzima APAO caracterizado porque comprende las etapas de: a) expresar el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, en una célula recombinantemente diseñada; y b) purificar la enzima.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula recombinantemente diseñada se selecciona de mamífero, microbio, vegetal, e insecto.
18. El método para hacer una enzima APAO caracterizado porque comprende las etapas de: a) expresar el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, en una planta; y b) purificar la enzii?a de la semilla vegetal u otras partes de la planta.
19. El método para identificar células vegetales transformadas caracterizado porque comprende las etapas de: a) introducir dentro de las células o tejidos de una planta objetivo seleccionada en cultivo a por lo menos una copia de un cassette de expresión que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1; b) introducir API o un análogo fitotóxico dentro del medio de cultivo; y c) identificar las células transformadas como las células sobrevivientes en el cultivo.
20. El método para detectar una fumonisina, una micotoxina estructuralmente relacionada, el producto hidrolizado de una fumonisina, o el producto hidrolizado de una micotoxina estructuralmente relacionada, el método está caracterizado porque comprende: a) agregar los po?ipéptidos de conformidad con la reivindicación 9, a una muestra que contiene fumonisina, una toxina estructuralmente relacionada, el producto hidrolizado de una fumonisina o el producto hidrolizado de una micotoxina estructuralmente relacionada; b) permitir que ocurra la reacción hasta que la toxina se convierta en 2-OP; y c) detectar el peróxido de hidrógeno producido.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la fumonisina esterasa también se agrega a la_ muestra.
22. El método para detectar una fumonisina, una micotoxina estructuralmente relacionada, el producto hidrolizado de una fumonisina, o el producto hidrolizado de una micotoxina estructuralmente . relacionada, el método está caracterizado porque comprende: d) agregar el polipéptido de conformidad con la J ^ reivindicación 9, a una muestra que contiene fumonisina, una toxina estructuralmente relacionada, el producto hidrolizado de una fumonisina, o el producto hidrolizado de una micotoxina • estructuralmente relacionada; e) permitir que ocurra la reacción hasta que la toxina se convierta en 2-OP; y f) detectar el amoníaco producido.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la fumonisina esterasa también se i ,10 agrega a la muestra.