DE69233653T2 - Herstellung gegen sclerotinia sclerotiorum resistenter pflanzendurch einführung eines für oxalatoxydase kodierenden gens - Google Patents

Herstellung gegen sclerotinia sclerotiorum resistenter pflanzendurch einführung eines für oxalatoxydase kodierenden gens Download PDF

Info

Publication number
DE69233653T2
DE69233653T2 DE69233653T DE69233653T DE69233653T2 DE 69233653 T2 DE69233653 T2 DE 69233653T2 DE 69233653 T DE69233653 T DE 69233653T DE 69233653 T DE69233653 T DE 69233653T DE 69233653 T2 DE69233653 T2 DE 69233653T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
promoter
germin
protein
gene
oxalate oxidase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69233653T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69233653D1 (de
Inventor
Georges Freyssinet
Alain Sailland
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogemma SAS
Original Assignee
Biogemma SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogemma SAS filed Critical Biogemma SAS
Publication of DE69233653D1 publication Critical patent/DE69233653D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69233653T2 publication Critical patent/DE69233653T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
    • C12Y102/03004—Oxalate oxidase (1.2.3.4)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Networks Using Active Elements (AREA)

Description

  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Gens, das für eine Oxalatoxidase kodiert, des von diesem Gen kodierten Proteins, chimärer Gene, welche das Gen umfassen für die Transformation von Pflanzen mit dem Ziel, diesen eine Resistenz gegenüber Pilzerkrankungen zu verleihen.
  • Die Sclerotiniose ist eine folgenreiche Pilzerkrankung, die eine große Zahl von Dikotyledonen erfasst. Der Verursacher, Sclerotinia sclerotiorum, ist ein polyphager Pilz, der eine geringe Wirtsspezifität zeigt.
  • Der Pilz kann die Pflanze entweder direkt im Bereich des Stängels, im Bereich der Blätter, wobei er daraufhin den Stängel einnimmt, oder im Bereich des Blütenstands befallen. In den beiden ersten Fällen verwelkt die Pflanze durch Unterbrechung der Versorgung. Im letzten Fall verwelkt die Blüte, was die Ernte gefährdet.
  • Der Pilz stellt lytische Enzyme her, welche die Zellwand der infizierten Pflanze abbauen und seine Ausbreitung in der Pflanze erleichtern. Diese Enzyme spielen eine bedeutende Rolle bei der Pathogenität, scheinen jedoch nicht zu genügen. Der Pilz stellt ebenfalls Oxalsäure her (Godov et al., 1990). Die Oxalsäure bewirkt eine Absenkung des pH-Werts in den infizierten Geweben, was die Hydrolyse der Zellwand durch die lytischen Enzyme erleichtert. Eine Verringerung der Herstellung von Oxalsäure oder ein Abbau der Oxalsäure sollte eine Verzögerung oder selbst eine Hemmung der Ausbreitung des Pilzes gestatten.
  • Zur Entwicklung einer Pflanze, die gegenüber „nos" resistent ist, kann die Strategie der Entgiftung von Oxalsäure genutzt werden. Der Abbau dieses Enzyms begrenzt die Herabsetzung des intrazellulären pH-Werts des befallenen Pflanzengewebes, wodurch die lytischen Enzyme dann zu weit entfernt von ihrem pH-Optimum wirken, um wirklich aktiv und wirksam zu sein. Daraus resultiert ein Rückgang der Pathogenität des Pilzes.
  • Um dieses Ziel zu erreichen, kann Oxalatoxidase verwendet werden, welche die folgende Reaktion katalysiert:
    Figure 00020001
  • Oxalatoxidase wird aus verschiedenen Pflanzen isoliert, im allgemeinen aus Monokotyledonen (Pieta et al., 1982): beispielsweise kann das Protein aus Gerste unter Verwendung klassischer chromatographischer Techniken aufgereinigt werden (Superdex G75 Filtrationsgele und MonoQ Ionenaustauschgele, Pharmacia), wobei die enzymatische Aktivität nach dem folgenden kolorimetrischen Protokoll bestimmt wird (Obzansky und Richardson, 1983)
    Figure 00020002
    • MBTH = 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon
    • DMA = N,N-Dimethylalanin
  • Dadurch wurde die Aufreinigung eines Proteins ermöglicht, welches auf einem Acrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen eine Molekularmasse von 26000 Dalton aufweist. Ein Anteil der auf gereinigten Oxalatoxidase wurde verwendet, um Anti-Oxalatoxidase Antikörper aus dem Kaninchen zu erhalten, der Rest des Proteins wurde verwendet, um eine Sequenzierung des nativen Proteins (N-terminal) oder, nach Bromcyanverdau, eine Sequenzierung bestimmter interner Peptide durchzuführen. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
    Figure 00030001
  • Durch Vergleich der oben beschriebenen Peptidsequenzen mit den in der Proteindatenbank Swiss-Prot enthaltenen Einträgen konnte ein Protein aus Weizen identifiziert werden, das Germin benannt und 1989 durch Dratewka-kos et al. veröffentlicht wurde. Es wurden Versuche durchgeführt und es konnte ermittelt werden, dass die von den Autoren veröffentlichte cDNS für ein Protein, das 201 Aminosäuren und eine Oxalatoxidaseaktivität aufweist, kodiert. Für die folgende Beschreibung der in diesem Patent vorgestellten Versuche wurde die Nummerierung der Nukleotide von 2 des Artikels der Autoren übernommen, der in J. Biol. Chem., 264, 4896–4900 veröffentlicht wurde.
  • Die Sequenz der cDNS weist eine Länge von 1075 Nukleotiden auf, mit einem nicht translatierten 5' Ende von 85 Nukleotiden, einem offenen Leseraster von 672 Nukleotiden (von Position 86 bis 757) und einem darauf folgenden nicht translatierten 3' Ende von 318 Nukleotidresten.
  • Der Vergleich der von der cDNS-Sequenz abgeleiteten Proteinsequenz mit jener, die durch Sequenzierung des nativen Proteins erhalten wurde zeigt, daß die cDNS nicht nur für die reife Oxalatoxidase kodiert, sondern auch für ein Signalpeptid von 23 Aminosäuren im N-terminalen Anteil. Die Oxalatoxidase wird somit in Form eines Präproteins (Signalpeptid plus reifes Peptid) synthetisiert, das durch Beseitigung des Signalpeptids reift, um das aktive, reife Enzym freizusetzen.
  • In der Folge wird entweder der für das Präprotein (Nukleotide 86 bis 757) kodierende Anteil, oder nur der Anteil, der für das reife Protein (von Position 155 bis 757) kodiert, verwendet. Im letzten Fall muß ein AUG Kodon (kodiert für ein Methionin) vor das ACC Kodon (kodiert für ein Threonin, erste Aminosäure des reifen Proteins) gesetzt werden.
  • Da die Angriffe von Sclerotinia sclerotiorum auf Pflanzen im wesentlichen über den Stängel oder über die Pflanze erfolgen, ist es vorteilhaft die Oxalatoxidase entweder in chlorophyllischen Geweben exprimieren zu können, wofür der Promotor der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase von Helianthus annuus (PSUHa, Waksman et al., 1987) verwendet werden kann, oder in verschiedenen Pflanzengeweben, wofür der ubiquitäre Promotor der 35S RNS des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV 35S) verwendet wird, bei dem ein Anteil verdoppelt wurde und der „doppelter CaMV" benannt wird.
  • Das Dokument WO 88/08450 erwähnt ein chimäres Gen, das eine Oxalatoxidase enthält, jedoch wird dessen Exprimierung in Pflanzengeweben zur Verleihung einer Resistenz gegenüber Sclerotinia weder erwähnt noch vorgeschlagen.
  • Die erfindungsgemäß verwendbaren chimären Gene können beispielsweise ausgehend von den folgenden Elementen aufgebaut werden:
    • A. Doppelter CaMV Promotor gefolgt von dem für das Präprotein (Signalpeptid plus reifes Peptid) kodierenden Anteil der cDNS der Oxalatoxidase und vom „nos" Terminator, der aus dem Nopalinsynthasegen von pTi 37 (Bevan et al., 1983) erhalten wurde.
    • B. Doppelter CaMV Promotor gefolgt von dem nur für das reife Peptid kodierenden Anteil der cDNS der Oxalatoxidase gefolgt vom „nos" Terminator.
    • C. Zu „A" identisches Gen, jedoch mit dem Promotor der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase der Sonnenblume (PSUHa) anstelle des doppelten CaMV.
    • D. Zu „B" identisches Gen, jedoch mit dem Promotor der PSUHa anstelle des doppelten CaMV.
  • Jedes chimäre Gen wird in die Pflanzenzelle durch ein System unter Verwendung von Agrobacterium oder jedes andere gewöhnlich zur Transformation von Pflanzenzellen bekannte System eingeführt. Aus diesen transformierten Zellen werden Pflanzen regeneriert. Sie zeigen eine gesteigerte Toleranz gegenüber Sclerotinia sclerotiorum.
  • Beispiel 1: Herstellung zweier kodierender Sequenzen
    • A. Präprotein: Es wird aus der mit HindIII (an Position 66) verdauten zuvor beschriebenen cDNS erhalten. Das erhaltene kohäsive Ende wird durch Behandlung mit Klenow Polymerase stumpf gemacht. Diese DNS wird anschließend mit NheI (an Position 811) verdaut.
  • Parallel dazu wird das Plasmid pUC 19 (Yanisch-Perron et al., 1985) mit SacI verdaut. Das erhaltene kohäsive Ende wird durch Behandlung mit Klenow Polymerase stumpf gemacht. Anschließend wird das Plasmid mit XbaI (kompatibel mit NheI) verdaut.
  • Das im obigen hergestellte cDNS Fragment und das Plasmid werden ligiert. Das so erhaltene neue Plasmid wird pRPA-oxo-01 benannt und seine Karte wird in 1 dargestellt.
    • B. Reifes Protein: Es wird aus der im obigen beschriebenen cDNS nach Verdau mit BstNI (an Position 173) erhalten. Das erhaltene Fragment und der Linker mit der Sequenz:
      Figure 00060001
      werden ligiert. Dies führt zu einer Veränderung der N-terminalen Sequenz des reifen Proteins, die von TDPDPLQ zu MTDPDPLQ wird.
  • Dieses cDNS Fragment wird daraufhin mit NheI (an Position 811) verdaut, um anschließend mit dem wie im obigen Abschnitt beschriebenen Plasmid pUC 19 ligiert zu werden. Das auf diese Weise gebildete neue Plasmid wird pRPA-oxo-02 benannt und seine Karte wird in 1 dargestellt.
  • Beispiel 2: Herstellung chimärer Gene
  • a. Herstellung von Vektoren, die den Promotor und den nos Terminator umfassen:
    • – Beispiel doppelter CaMV: Dieser Vektor wird aus dem Plasmid pRPA-BL-410 erhalten, das auf folgende Weise erhalten wurde:
  • Fusion Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA:
  • Das Transitpeptid der PSU des Gens der RuBisCO aus Mais stammt aus einem EcoRI-SphI Fragment von 192 bp; hervorgegangen aus der dem PSU Gen des RuBisCO Gens aus Mais entsprechenden cDNS, beschrieben von Lebrun et al. (1987), die eine NcoI Schnittstelle besitzt, welche das Transkriptionsstartkodon abdeckt sowie eine SphI Schnittstelle, die der Schnittstelle des Transitpeptids entspricht.
  • Durch Behandlung des SphI Endes mit Polymerase aus dem Bakteriophagen T4 und durch Ligation dieser mit dem mit Klenow Polymerase behandelten NcoI Ende des Gens AroA aus pRPA-BL 104, das nochmals mit EcoRI geschnitten wurde, wird die translationelle Fusion zwischen dem Transitpeptid aus Mais und dem bakteriellen EPSPS Gen erhalten.
  • Fusion Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA
  • Auf ähnliche Weise wird ein EcoRI-HindII Fragment von 228 bp der cDNS der PSU des RuBisCO Gens aus Mais mit dem mit Klenow Polymerase behandelten NcoI Ende des Gens AroA aus pRPA-BL 104, das nochmals mit EcoRI geschnitten wurde, ligiert. Es wird eine translationelle Fusion zwischen dem Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais, der 22 Aminosäuren des reifen Anteils der PSU der RuBisCO aus Mais und dem bakteriellen EPSPS Gen erhalten.
  • Transitpeptid der PSU der RuBisCO der Sonnenblume:
  • Das Fragment geht aus der durch Waksman und Freyssinet (1987) isolierten cDNS hervor. Es wurde eine SpHI Schnittstelle nach der Methode von Zoller und Smith (1984) an der Schnittstelle des Transitpeptids eingeführt. Das auf diese Weise erhaltene Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus der Sonnenblume ist ein EcoRI-SphI Fragment von 171 bp.
  • Fusion Transitpeptid der PSU der RuBisCO der Sonnenblume/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA
  • Aus dem Konstrukt, welches die Fusion Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils des Maisgens der PSU der RuBisCO aus Mais enthält, wurden 171 bp mit EcoRI-SphI herausgeschnitten, die dem Transitpeptid der PSU des RuBisCO Gens der Sonnenblume entsprechen. Ein daraus resultierendes Konstrukt zeigt einen Ersatz der EcoRI-SphI Fragmente und ist eine translationelle Fusion Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus der Sonnenblume/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA.
  • Das EcoRI-SalI Fragment wurde mit dem SalI-SstI Fragment ligiert, welches die nos 3' Sequenz und die rechte Grenze der T-DNS enthält. Das daraus resultierende EcoRI-SstI Fragment, welches das Transitpeptid der PSU der RuBisCO der Sonnenblume/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA/nos 3'/rechte Grenze der T-DNS umfasst wird durch das EcoRI-SstI Fragment ersetzt, das die rechte Grenze der T-DNS des Plasmids 150 A alpha 2 enthält, welche den doppelten CaMV Promotor enthält. Die transkriptionelle Fusion doppelter CaMV Promotor/Transitpeptid der PSU der RuBisCO der Sonnenblume/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA/nos 3' im Vektor 150 A alpha 2 wurde pRPA-BL 294 benannt.
  • Fusion Transitpeptid der PSU der RuBisCO der Sonnenblume/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO aus Mais/Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA
  • Das obige Konstrukt wird mit NcoI-HindIII geschnitten, was das AroA Gen freisetzt. Daraufhin wird es mit einem 1,5 Kbp NcoI-HindIII Fragment ligiert, welches die Fusion Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA enthält. Ein daraus resultierendes Konstrukt zeigt einen Ersatz des NcoI-HindIII Fragments und ist eine translationelle Fusion Transitpeptid der PSU der RuBisCO der Sonnenblume/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO des Maisgens/Tran sitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA.
  • Das EcoRI-SalI Fragment wurde mit dem SalI-SstI Fragment ligiert, welches die nos 3' Sequenz und die rechte Grenze der T-DNS enthält. Das daraus resultierende EcoRI-SstI Fragment, welches das Transitpeptid der PSU der RuBisCO der Sonnenblume/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO des Maisgens/Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA/nos 3'/rechte Grenze der T-DNS umfasst, wird durch das EcoRI-SstI Fragment ersetzt, das die rechte Grenze der T-DNS des Plasmids 150 A alpha 2 enthält, welche den doppelten CaMV Promotor enthält. Die transkriptionelle Fusion doppelter CaMV Promotor/Transitpeptid der PSU der RuBisCO der Sonnenblume/22 Aminosäuren-Sequenz des reifen Anteils der PSU der RuBisCO des Maisgens/Transitpeptid der PSU der RuBisCO aus Mais/Gen AroA/nos 3' im Vektor 150 A alpha 2 wurde pRPA-BL 410 benannt. Dieses Plasmid wird mit EcoRI und SalI verdaut, um das Strukturgen „optimiertes Transitpeptid- kodierender Bereich der reifen EPSPS" zu entfernen, pRPA-BL-410 deletiert (siehe 1).
    • – Beispiel PSUHa: Dieser Vektor wird ausgehend von dem Plasmid pRPA-BL-207 (beschrieben in der Europäischen Patentanmeldung 0 377 899) erhalten, indem dieser mit EcoRI und HindIII verdaut wird, um den für die Nitrilase kodierenden Bereich zu entfernen, pRPA-BL-207 deletiert (siehe 1).
  • b. Konstruktion chimärer Gene:
    • pRPA-oxo-03: Wird durch Verdau von pRPA-oxo-01 mit EcoRI und SalI erhalten. Das erhaltene Fragment, das für das Präprotein kodiert, wird anschließend zwischen die EcoRI beziehungsweise SalI Schnittstellen stromabwärts des doppelten CaMV Promotors und stromaufwärts des nos Terminators eingefügt.
    • pRPA-oxo-04: Wird durch Verdau von pRPA-oxo-02 mit EcoRI und SalI erhalten. Das erhaltene Fragment, das für das reife Protein kodiert, wird anschließend zwischen die EcoRI beziehungsweise SalI Schnittstellen stromabwärts des doppelten CaMV Promotors und stromaufwärts des nos Terminators eingefügt.
    • pRPA-oxo-05: Wird durch Verdau von pRPA-oxo-01 mit EcoRI und HindIII erhalten. Das erhaltene Fragment, das für das Präprotein kodiert, wird anschließend zwischen die EcoRI beziehungsweise HindIII Schnittstellen stromabwärts des PSUHa und stromaufwärts des nos Terminators eingefügt.
    • pRPA-oxo-06: Wird durch Verdau von pRPA-oxo-02 mit EcoRI und HindIII erhalten. Das erhaltene Fragment, das für das reife Protein kodiert, wird anschließend zwischen die EcoRI beziehungsweise HindIII Schnittstellen stromabwärts des PSUHa und stromaufwärts des nos Terminators eingefügt.
  • Tabelle 1: Schematische Darstellung der vier chimären Gene:
    Figure 00100001
  • Beispiel 3: Gewinnung von transgenem Raps
  • a. Transformation
  • Jeder wie im obigen beschriebene Vektor wird in den nicht-onkogenen Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA 101 (Hood et al., 1987) eingeführt, der Träger des Cosmids pTVK 291 (Komari et al., 1986) ist.
  • Die Transformationstechnik der Rapsvarietät Westar folgt im Wesentlichen der durch Boulter et al. (1990) beschriebenen, wobei eine Bakterienkonzentration von 2,5 × 109 pro ml (OD 600 nm = 1) eingesetzt wird.
  • b. Regeneration
  • Die Regenerationstechnik folgt im Wesentlichen der durch Boulter et al. (1990) beschriebenen. Die Pflanzen werden auf dem Medium von De Block et al. (1989) bewurzelt. Anschließend wurden sie im Gewächshaus zur Blüte gebracht.
  • Beispiel 4: Messung der Resistenz von Raps gegenüber Sclerotinia sclerotiorum
  • In vitro:
    • – Blattscheiben: Die Resistenz wird durch Einwaage der Masse von drei Blattscheiben nach 11 Tagen Wachstum auf mit 1 mM Oxalsäure versetztem Murashige und Skoog (MS) Medium mit Hormonen gemessen.
  • Unter diesen Bedingungen wird beobachtet, dass sich bei denen aus mit einem der chimären Gene pRPA-oxo-03, pRPA-oxo-04, pRPA-oxo-05 und pRPA-oxo-06 modifizierten Rapspflanzen stammenden Blattscheiben die Masse der Blattscheiben deutlich erhöht, während die Masse bei den aus nicht modifizierten Rapspflanzen stammenden Blattscheiben gleichbleibt oder sich sogar verringert.
    • – Wurzelverlängerung: Die Resistenz wird auch in vitro durch Messung der Wurzelverlängerung nach zwei Tagen Wachstum in mit 5 mM Oxalsäure versetztem Wasser gemessen. Es wird nun beobachtet, dass die Wurzeln der mit einem der chimären Gene pRPA- oxo-03, pRPA-oxo-04 modifizierten Rapspflanzen in der Lage sind zu wachsen und sich zu verlängern, während die Wurzeln der nicht modifizierten Rapspflanzen unter diesen Bedingungen keinerlei Wachstum zeigen.
  • In vivo:
  • Die in vivo Resistenz wird im Gewächshaus nach Kontamination der regenerierten Rapspflanzen bei Erscheinen der ersten Blüten entweder durch Auftragen von Sporen von S. sclerotiorum auf den Petalen gemessen, wobei die Infektion der Blätter dann natürlicherweise beim Verblühen erfolgt, oder durch direktes Auftragen des Myceliums oder einer von Mycelium durchdrungenen Petale auf die Blätter. Die mit einem der chimären Gene pRPA-oxo-03, pRPA-oxo-04, pRPA-oxo-05 und pRPA-oxo-06 modifizierten Pflanzen lassen keine Entwicklung des Pilzes zu und zeigen keinerlei für Sclerotiniose charakteristisches Fäulnissymptom, während die nicht modifizierten Pflanzen schnell von der Fäulnis befallen sind, was für die Entwicklung von Sclerotinia sclerotiorum charakteristisch ist.
  • Legende der Figur:
    • Verfahren zum Erhalt von vier chimären Genen aus den zwei Strukturgenen, pRPA-oxo-01 und pRPA-oxo-02; H, HindIII; B, BstN; N, NheI; E, EcoRI; Sc, SacI; S, SalI und X, XbaI.

Claims (15)

  1. Verfahren zur Verbesserung der Resistenz von Pflanzen gegenüber Pilzerkrankungen, insbesondere solchen, die von Sclerotinia sp. hervorgerufen werden, dadurch gekennzeichnet, dass in den Pflanzen ein Protein exprimiert wird, welches eine Oxalatoxidaseaktivität aufweist, wobei die Expression durch genetische Transformation der Pflanzen mit einem chimären Gen erzielt wird, das eine Sequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, welches eine Oxalatoxidaseaktivität aufweist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein in Form eines Präproteins vorliegt, welches ein Signalpeptid und ein reifes Peptid umfasst, wobei das reife Peptid eine Oxalatoxidaseaktivität aufweist, die von demselben Oxalatoxidasegen herrührt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Präprotein um ein Germin handelt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Germin um ein Germin aus Weizen handelt.
  5. Gentechnisch modifizierte Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass diese einen Vektor enthält, der ein chimäres Gen umfasst, welches eine Sequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, welches eine Oxalatoxidaseaktivität aufweist.
  6. Zelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein in Form eines Präproteins vorliegt, welches ein Signalpeptid und ein reifes Peptid umfasst, wobei das reife Peptid eine Oxa latoxidaseaktivität aufweist, die von demselben Oxalatoxidasegen herrührt.
  7. Zelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Präprotein um ein Germin handelt.
  8. Zelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Germin um ein Germin aus Weizen handelt.
  9. Zelle nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, welche für das Protein kodiert, das eine Oxalatoxidaseaktivität aufweist, mit einem Promotor und einem Terminatorelement verbunden ist.
  10. Zelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ausgewählt ist aus dem Promotor der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase von Helianthus annuus (PSUHa) und dem duplizierten 35S RNA Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (doppelter CaMV).
  11. Zelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Terminatorelement um die Sequenz nos handelt.
  12. Zelle nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das chimäre Gen ausgewählt ist aus den folgenden chimären Genen: a. chimäres Gen, das den doppelten CaMV Promotor, die Sequenz, welche für Germin in Form des Präproteins kodiert, sowie den nos Terminator umfasst, b. chimäres Gen, das den doppelten CaMV Promotor, die Sequenz, welche nur für Germin in Form des reifen Peptids kodiert, sowie den nos Terminator umfasst, c. chimäres Gen, das den PSUHa Promotor, die Sequenz, welche für Germin in Form des Präproteins kodiert, sowie den nos Terminator umfasst, d. chimäres Gen, das den PSUHa Promotor, die Sequenz, welche nur für Germin in Form des reifen Peptids kodiert, sowie den nos Terminator umfasst.
  13. Transformierte Pflanze, die aus einer Zelle nach einem der Ansprüche 5 bis 12 hervorgeht.
  14. Pflanze nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Dicotyledone handelt.
  15. Pflanze nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Raps handelt.
DE69233653T 1991-03-05 1992-03-04 Herstellung gegen sclerotinia sclerotiorum resistenter pflanzendurch einführung eines für oxalatoxydase kodierenden gens Expired - Lifetime DE69233653T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9102874A FR2673644A1 (fr) 1991-03-05 1991-03-05 Sequence adn codant pour une oxalate oxydase et plantes transformees contenant cette sequence et resistantes au sclerotinia.
FR9102874 1991-03-05
PCT/FR1992/000195 WO1992015685A1 (fr) 1991-03-05 1992-03-04 Production de plantes resistantes aux attaques de sclerotinia sclerotiorum par introduction d'un gene codant pour une oxalate oxydase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69233653D1 DE69233653D1 (de) 2006-10-12
DE69233653T2 true DE69233653T2 (de) 2007-10-04

Family

ID=9410559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69233653T Expired - Lifetime DE69233653T2 (de) 1991-03-05 1992-03-04 Herstellung gegen sclerotinia sclerotiorum resistenter pflanzendurch einführung eines für oxalatoxydase kodierenden gens

Country Status (24)

Country Link
EP (1) EP0531498B1 (de)
JP (1) JPH05506582A (de)
KR (1) KR930700665A (de)
CN (1) CN1051576C (de)
AT (1) ATE338129T1 (de)
AU (1) AU660976B2 (de)
BG (1) BG61275B1 (de)
BR (1) BR9204788A (de)
CA (1) CA2082042C (de)
CZ (1) CZ289623B6 (de)
DE (1) DE69233653T2 (de)
DK (1) DK0531498T3 (de)
EG (1) EG21465A (de)
ES (1) ES2273329T3 (de)
FR (1) FR2673644A1 (de)
HU (1) HUT65677A (de)
IE (1) IE920691A1 (de)
IL (1) IL101117A (de)
MX (1) MX9200917A (de)
NZ (1) NZ241829A (de)
PT (1) PT100203B (de)
UA (1) UA43308C2 (de)
WO (1) WO1992015685A1 (de)
ZA (1) ZA921647B (de)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RO114979B1 (ro) * 1991-02-25 1999-09-30 Ici Plc Oxalat oxidaza avand capacitatea de a degrada acidul oxalic si procedeu pentru obtinerea oxalat oxidazei in plante
WO1994012622A1 (en) * 1992-11-30 1994-06-09 Zeneca Limited Oxalate decarboxylase
ATE221121T1 (de) * 1992-12-07 2002-08-15 Biogemma Fr Verwendung einer dna sequenz, kodierende für ein protein mit der fäligkeit oxalsäure abzubauen, zur genselektion
AUPM379294A0 (en) * 1994-02-10 1994-03-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
ZA986308B (en) * 1997-07-18 1999-11-24 Pioneer Hi Bred Int The induction of stress-related factors in plants.
US6166291A (en) 1997-07-18 2000-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of pathogen resistant plants
AU8919098A (en) * 1997-08-26 1999-03-16 North Carolina State University Fumonosin resistance
FR2844142B1 (fr) 2002-09-11 2007-08-17 Bayer Cropscience Sa Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
CN100383239C (zh) * 2004-07-21 2008-04-23 华南农业大学 从小麦麸皮中提取草酸氧化酶的方法
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
CA2786001A1 (en) 2009-12-31 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Engineering plant resistance to diseases caused by pathogens
CN103060350A (zh) * 2011-10-21 2013-04-24 华中农业大学 核盘菌草酸脱羧酶基因SsOXDC2及其在大豆抗病改良中的应用
CN103911384B (zh) * 2014-01-21 2016-05-25 江苏大学 一种控制油菜菌核病的基因及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988008450A1 (en) * 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
RO114979B1 (ro) * 1991-02-25 1999-09-30 Ici Plc Oxalat oxidaza avand capacitatea de a degrada acidul oxalic si procedeu pentru obtinerea oxalat oxidazei in plante

Also Published As

Publication number Publication date
FR2673644B1 (de) 1994-12-02
AU1682092A (en) 1992-10-06
PT100203A (pt) 1993-07-30
DK0531498T3 (da) 2007-01-02
BG97042A (bg) 1993-12-24
CZ289623B6 (cs) 2002-03-13
CA2082042A1 (en) 1992-09-06
WO1992015685A1 (fr) 1992-09-17
IL101117A (en) 2004-09-27
IL101117A0 (en) 1992-11-15
HUT65677A (en) 1994-07-28
EP0531498B1 (de) 2006-08-30
JPH05506582A (ja) 1993-09-30
KR930700665A (ko) 1993-03-15
DE69233653D1 (de) 2006-10-12
BG61275B1 (en) 1997-04-30
FR2673644A1 (fr) 1992-09-11
CA2082042C (en) 2007-05-29
UA43308C2 (uk) 2001-12-17
CZ336992A3 (en) 1994-01-19
ATE338129T1 (de) 2006-09-15
ZA921647B (en) 1992-11-25
PT100203B (pt) 1999-06-30
MX9200917A (es) 1992-11-01
HU9203473D0 (en) 1993-01-28
CN1051576C (zh) 2000-04-19
IE920691A1 (en) 1992-09-09
NZ241829A (en) 1994-04-27
BR9204788A (pt) 1993-07-27
ES2273329T3 (es) 2007-05-01
EG21465A (en) 2001-11-28
CN1065683A (zh) 1992-10-28
AU660976B2 (en) 1995-07-13
EP0531498A1 (de) 1993-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69033957T2 (de) Herstellung von hybridem saatgut
DE69233653T2 (de) Herstellung gegen sclerotinia sclerotiorum resistenter pflanzendurch einführung eines für oxalatoxydase kodierenden gens
DE69635995T2 (de) Mutierte 5-enol-pyruvylshikimat-3-phosphat- synthase, für dieses protein kodierendes gen und dieses gen enthaltende transformierte pflanzen
DE69636392T2 (de) Polypeptide und polynukleotide bezüglich alpha-und-beta-glutamat-dehydrogenase-untereinheiten und deren verwendung
DE69028479T2 (de) Genetische Manipulationen mit von RNA-Viren abgeleiteten Sequenzen enthaltendem rekombinantem DNA
DE3751338T2 (de) Verfahren zum verleihen bei pflanzen eines widerstands gegen krankheiten und pest sowie neue gene in pflanzen die hierfür kodieren.
DE69034190T2 (de) Molekulare verfahren zur vermehrung von hybriden saaten
DE3689802T2 (de) "Hervorrufung somatischer Veränderungen in Pflanzen durch Verwendung von minussträngigen RNAs".
DE69736006T2 (de) Verbesserungen des stärkegehaltes von pflanzen
DE3889546T2 (de) Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
DE68915282T2 (de) Expressionskassette für pflanzen.
EP0616035B1 (de) Transgene Pilz-resistente Pflanzen
DE4004800C2 (de) Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
DE69231588T2 (de) Verwendung eines gens, das für oxalat oxidase kodiert zur transformation von pflanzen
DD294040A5 (de) Chimaeren-gen zur verleihung von herbizidresistenz an pflanzen, verfahren zum transformieren von pflanzenzellen und regenerierte transformierte pflanzen
DE4447387A1 (de) Debranching-Enzyme aus Pflanzen und DNA-Sequenzen kodierend diese Enzyme
WO1991013995A1 (fr) Virus herpes recombinants notamment pour la realisation de vaccins, leur procede de preparation, les plasmides realises au cours de ce procede et les vaccins obtenus
DE69332148T2 (de) Verwendung einer dna sequenz, kodierende für ein protein mit der fäligkeit oxalsäure abzubauen, zur genselektion
DE69231940T2 (de) Rekombinant DNS kodierend für eine Endochitinase
DE60131075T2 (de) Durch freisetzung in geschlossener, zirkulärer form aus einer grösseren nukleotidsequenz charakterisiertes konstrukt, welches die ortsspezifische und/oder entwicklungsspezifische, regulierte expression selektierter, genetischer sequenzen erlaubt
DE69932343T2 (de) Spezifische genetische modifikation der aktivität von trehalose-6-phosphat synthase und expression in homologer und heterologer umgebung
EP0492536B1 (de) Verfahren zur Erzeugung von pathogen-resistenten Pflanzen
DE60008962T2 (de) Klonierung einer N-Methyltransferase, die an der Koffeinbiosynthese beteiligt ist
DE69132874T2 (de) Für ein protein mit endochitinase-aktivität kodierendes rekombinantes gen
HU218110B (hu) Antimikrobiális hatású fehérjék, ilyen fehérjéket tartalmazó készítmények és eljárás ezek előállítására

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition