DE69231588T2

DE69231588T2 - Verwendung eines gens, das für oxalat oxidase kodiert zur transformation von pflanzen

Info

Publication number: DE69231588T2
Application number: DE69231588T
Authority: DE
Inventors: L. Hartman; S. Johal; R. Schmitt
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1991-02-25
Filing date: 1992-02-24
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2012-02-25
Also published as: BG61614B1; HU9302252D0; US5866778A; GR3035217T3; FI933718A0; DE69231588D1; GB9203929D0; FI933718A; HU214357B; ES2152225T3; ATE197814T1; FI112800B; RO114979B1; AU656761B2; EP0636181B1; EP0636181A1; BR9205664A; RU2136755C1; HUT67049A; CA2107804A1

Description

Diese Erfindung betrifft die genetische Verbesserung von Pflanzen durch die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken. Insbesondere aber nicht ausschließlich betrifft die Erfindung die Verbesserung der Verträglichkeit von Pflanzen gegenüber Krankheiten.
Vom Beginn der Landwirtschaft an waren Menschen mit dem Problem der Pflanzenkrankheiten konfrontiert. In der Geschichte wurden viele Fortschritte gegen Pflanzenkrankheiten gemacht, wie beispielsweise durch die Verwendung von Hybridpflanzen, Pestiziden und verbesserten landwirtschaftlichen Praktiken. Wie jedoch jeder Landwirt, Heimgärtner oder Anhänger von Zimmerpflanzen bestätigen kann, sind die Probleme der Pflanzenkrankheiten ein weiter bestehendes und stetiges Problem in der Pflanzenkultivierung. Diese Erfindung stellt einen großen Schritt vorwärts bei der Lösung des Problems von Pflanzenkrankheiten dar, indem eine langbekannte Tatsache hinsichtlich der Methode ausgenutzt wird, durch die bestimmte Mikroben, speziell Pilze, Pflanzen angreifen. Speziell betrifft diese Erfindung ein Mittel, durch das das ätiologische (krankheitsverursachende) Mittel verlangsamt oder daran gehindert wird, tatsächlich in das Pflanzengewebe einzudringen, wodurch die Krankheit verhindert wird. Alternativ liefert die vorliegende Erfindung in den Fällen, in den ein vollständiger Befall nicht verhindert wird, den Pflanzen ein Mittel zur Reduzierung der Infektionswirkungen, wodurch die Pflanzensterblichkeit aufgrund der Krankheit reduziert oder verhindert wird.
Damit ein Pflanzenpathogen eine Pflanze infizieren kann, muß es in der Lage sein, Zugang in und anschließend über die Pflanze zu erlangen. Pflanzenpathogene erreichen dies auf unterschiedlichen Wegen. Allgemein wird dies durch die Absonderung chemischer Substanzen erreicht, die bestimmte Komponenten und/oder Stoffwechselmechanismen der anzugreifenden Pflanze, d. h. des Wirtes für das Pathogen, beeinflussen. Die Hauptgruppe von Verbindungen, die von Pflanzenpathogenen abgesondert werden und die den krankheitsverursachenden Mechanismus betreffen, sind Toxine, Enzyme, Polysaccharide und/oder andere Wachstumseffektoren. Eine solche chemische Verbindung ist Oxalsäure oder Oxalat, die durch das Enzym Oxalatoxidase abgebaut werden können. Obwohl die durch Oxalatoxidase katalysierte Reaktion wohlbekannt ist, werden die physikochemischen Eigenschaften des Enzyms, wie es durch Gersten-Oxalatoxidase veranschaulicht wird, in der Literatur falsch wiedergegeben.
Die Absonderung von Oxalsäure als ein Mittel, durch das Pflanzenpathogene Pflanzenwirte angreifen, wird gemeinhin in einer Anzahl von Pilzgattungen und speziell in den Gattungen Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia und Schizophyllum gefunden. Diese Pilzgattungen, speziell die Pilze der Gattung Sclerotinia, sind dafür bekannt, daß sie zerstörerische und tödliche Krankheiten zahlreicher hochkultivierter Pflanzen verursachen, einschließlich Feldkulturen wie Sonnenblume, Sojabohne, Bohnen im allgemeinen, Raps/Canola, Luzerne, Lein, Saflor, Erdnuß und Klee, Gemüsepflanzen wie Salat, Tomate, Kürbisgewächse, Kartoffel, Karotte, Rettich, Erbse, Linse, Kohl, Brokkoli und Rosenkohl, Blumen wie Petunie und Pyrethrum und Baumarten wie Pfirsich.
Die Krankheiten schließen nicht nur Vorerntekrankheiten auf dem Feld, sondern ebenfalls Nacherntekrankheiten während der Verladung und Lagerung ein.
Die durch die zuvor genannten Pilzgattungen verursachten Symptome variieren mit der Wirtspflanze und den Teilen der mit der Krankheit infizierten Wirtspflanze und sind ebenso abhängig von Umweltbedingungen zum Zeitpunkt des Pathogenbefalls. Z. B. ist ein Merkmal aller Sclerotinia- Krankheiten das Welken und Zusammenfallen der Blätter, worauf der Pilz schnell in das "Herz" der Pflanze und in den Stamm eindringt. Die Krankheit ist tödlich.
In Flüssigkulturen von Sclerotinia wurden Oxalsäure-Gehalte im Bereich von einigen Tausend bis Zehntausend ppm beobachtet, abhängig vom Wachstumsmedium, Alter der Kultur und anderen Parametern. Bestimmte Pflanzengewebe wie Blätter von Bohne und Sonnenblume, die geringen Oxalsäure- Konzentrationen ausgesetzt werden, zeigen schnell Zeichen von Welken und Zelltod, was die Bedeutung von Oxalsäure in den späteren Stadien der Krankheit vermuten läßt. Der präzise Mechanismus der krankheitsverursachenden Funktion von Oxalsäure nach der Infektion unbekannt, obwohl Theorien von der Komplexierung zweiwertiger Metalle, die mit pflanzlichen Zellwänden und/oder Stoffwechsel-Schlüsselenzymen wechselwirken, bis zur Bereitstellung einer optimalen Mikroumgebung für die Wirkung von Hydrolyseenzymen reichen, die von diesen Pilzen abgesondert werden. Unabhängig davon ist es aus dem vorhandenen Beweis ersichtlich, daß Oxalsäure ein integraler Bestandteil des krankmachenden Befalls ist. Nachweis für diesen Schluß wurde aus mehreren Studien erhalten, die Untersuchungen mit Oxalat-Minus- Mutanten von Sclerotinia einschließen, die das normale Komplement für Hydrolyseenzyme und andere Faktoren zu besitzen scheinen, aber nicht die Krankheitssymptomatik erzeugen. Revertanten dieser Oxalat-Minus-Mutanten zeigten normale Krankheitsentwicklung und -eigenschaften.
Der hohe Virulenzgrad der mit den vorgenannten Pilzgattungen verbundenen Krankheiten ist wohlbekannt. Z. B. zeigen Blätter von im Gewächshaus herangezogenen Sonnenblumenpflanzen, die mit Sclerotinia sclerotorum infiziert sind, häufig 3 bis 5 Tage nach der Beimpfung Welken und Interkostalnekrose. Eine Untersuchung dieser Pflanzen hat eine das Welken induzierende Substanz in Wasserextrakten aus Hypokotylläsionen gezeigt (Hypokotyl = der Teil der Achse eines Pflanzenembryos oder -keimlings unterhalb der Kotyledone). Chemische Untersuchungen einschließlich Dünnschichtchromatographie und Gas-Flüssigchromatographie haben gezeigt, daß diese das Welken induzierende Substanz Oxalsäure enthielt, und daß welke Blätter von infizierten Pflanzen über 15-mal mehr Oxalsäure enthielten als Blätter gesunder Pflanzen. Wie schon angegeben bewegt sich die Oxalsäure systemisch durch die Pflanze, wobei sie Krankheitssymptome in Geweben verursacht, die sowohl vom Ursprungspunkt der Infektion entfernt als auch nicht notwendigerweise mit Pilzhyphen infiziert sind.
Vor diesem Hintergrund erkannten die Erfinder, daß eine entsprechende Identifizierung, Isolierung und Expression eines Oxalat-abbauenden Enzyms, wie einer Oxalatoxidase, Oxalatdecarboxylase oder eines ähnlichen Enzyms, durch eine Pflanze sehr gut die Pathogenität von Pilzen vermindern könnte, die Oxalsäure als eine Schlüsselkomponente der Pathogenität absondern. Entsprechend begannen die Erfinder und erreichten das Ziel der richtigen Identifizierung und Isolierung eines Gens für ein Protein, das zu Einführung von Oxalatoxidase-Aktivität in Pflanzen und Mikroben geeignet ist, wobei sie Techniken der Gentechnik einsetzten.
Oxalate treten ebenfalls üblicherweise in einigen Pflanzenarten als Produkte auf, die auf natürliche Weise durch die Pflanze selbst erzeugt werden: Natürlich auftretendes Oxalat reichert sich in manchen grünblättrigen Gemüsepflanzen wie Spinat und Rhabarber und in manchen Futterleguminosen an.
Obwohl solche Fruchtarten potentielle Quellen für Nahrungsvitamine und Mineralstoffe sind, ist die Aufnahme großer Mengen toxisch für den Menschen, bei dem es mit Calcium-Ionen bindet und als unlösliches Calciumoxalat in den Nieren ausfällt, wodurch es zu Hyperoxalurie und Zerstörung von Nierengewebe führt.
Es ist ebenfalls bekannt, daß Oxalsäure mit anderen Pflanzenmetaboliten unter Bildung von Oxalat-Derivaten reagieren kann, die hochtoxisch sind. In einem Beispiel wird die Verbindung b-N-Oxalyl-L-a-b-diaminopropionsäure gebildet, die ein Neurotoxin ist.
Daher schließt die Gegenwart von Oxalsäure in manchen Pflanzenarten ihre Verwendung als menschliches oder tierisches Nahrungsmittel aus. Insbesondere haben die Erfinder ein bei der Vereitelung der Pathogenität betreffend Oxalsäure nützliches Enzym charakterisiert. Dieses einzigartig charakterisierte Oxalatoxidase-Enzym katalysiert oder trägt in anderer Weise zu einer Reaktion bei, die den oxidativen Abbau von Oxalat unter Erzeugung von Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid beinhaltet. Die allgemeine Form dieser Reaktion lautet:
Die Untersuchung dieses Enzyms hat nicht nur in seiner Identifizierung, Isolierung und Expression resultiert, sondern ebenfalls in seiner Charakterisierung und Klonierung, so daß ein Gen zur Expression des Enzyms vorhanden ist, in Pflanzen eingeführt und durch Pflanzen exprimiert werden kann, wodurch Krankheitsresistenz gegen Pilze verliehen wird, bei denen Oxalsäure ein kritischer Bestandteil ist. Solch eine Pflanzentransformation würde die transformierten Pflanzen vor den schädlichen, krankheitsverursachenden Wirkungen von Oxalsäure schützen.
Es ist ersichtlich, daß die Anwendungen der vorgenannten Erfindungen nicht auf Pflanzenpathogenese beschränkt sind. Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung ist die Einführung eines Oxalatoxidase-Gens in eine Pflanze zur Erzeugung einer Pflanze mit wenig Oxalsäure. Dies könnte speziell vorteilhaft bei Pflanzen mit viel Oxalat sein, wie Erdnüssen, Rüben, Spinat, Rhabarber, Gerste, Kokospalme ("Cocoa") und vielen Gräsern. Siehe Libert und Franceschi (1987), J. Agric. Food Chem., 35: 926-938. Ebenfalls besitzt die Erfindung Anwendbarkeit für die Erzeugung von Oxalat-abbauenden Enzymen in großem Maßstab. Der Bedarf für solche Oxalat-abbauenden Enzyme in großem Maßstab ist in einer Anzahl von Gebieten bekannt, einschließlich des Bedarfs zu ihrer Verwendung in Testkits zur Bestimmung der Gegenwart und/oder Menge von Oxalsäure und zur Verwendung im Abbau von Oxalsäure, die in Nahrungsmitteln, Getränken und kommerziellen Verfahren vorhanden ist. Z. B. wurde die mikrobielle Oxalatdecarboxylase von der Brauindustrie verwendet (US-A-4 652 452), und wie hier bekannt gemacht kann Oxalat ebenfalls unter Verwendung von Oxalatoxidase abgebaut werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel zum Abbau von Oxalsäure in Pflanzen bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Übertragen der Fähigkeit zum Abbau von Oxalat auf eine Pflanze bereitgestellt, umfassend das Insertieren eines eine Oxalatoxidase kodierenden Gens in das Genom der Pflanze durch genetische Transformation.
Bevorzugt wird das Pflanzengenom durch ein Genkonstrukt mit einer Promotorsequenz, einem Transitpeptid, einer Strukturgen-Sequenz, die das Oxalatoxidase-Enzym kodiert, und einer Gen-Terminatorsegenz transformiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Strukturgen-Sequenz die DNA-Sequenz der Fig. 1.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Methode der Bekämpfung von Pflanzenpathogenese durch Infektion mit einem Pilz bereit, der Oxalsäure absondert, umfassend das stabile Einbauen eines Oxalatoxidase-kodierenden Gens durch Transformation in das Genom der Pflanze.
Der Pilz kann ein Vertreter aus einer Gattung sein, ausgewählt aus der Gruppe aus Oxalsäure-absondernden Pilzen, umfassend Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia und Schizophyllum.
Am meisten bevorzugt ist der Pilz Sclerotinia sclerotorum.
In einer bevorzugten Anwendung der Erfindung ist die Pflanze die Sonnenblume (Helianthus annuus).
Die Erfindung stellt ebenfalls eine daraus stammende Pflanze, die ein durch Transformation stabil in ihr Genom eingeführtes, Oxalatoxidase kodierendes Gen aufweist, und ebenfalls eine Pflanzenzelle bereit, die ein durch Transformation stabil in ihr Genom eingeführtes, Oxalatoxidase kodierendes Gen aufweist.
Somit richtet sich die vorliegende Erfindung in allgemeinen Begriffen ganzheitlich auf das Verständnis und die Anerkennung der Verwendung eines Oxalat-abbauenden Enzyms, wie es durch Oxalatoxidase veranschaulicht wird, für kommerzielle Anwendungen wie in der Brauindustrie oder für landwirtschaftliche Anwendungen wie zur Reduzierung der Anfälligkeit einer Pflanze gegenüber Oxalsäure oder zur Reduzierung der endogenen Oxalsäure-Konzentration in einer Pflanze. Die Erfinder würdigen und lehren hier, insbesondere für die landwirtschaftliche Anwendung, die Verwendung Oxalat-abbauender Enzyme zur Reduzierung der Pflanzensterblichkeit oder -zerstörung durch Krankheiten oder andere Phänomene, in denen Oxalsäure eine kritische invasive Rolle spielt. Die Erfinder würdigen ebenfalls, daß die Verwendung dieser Erfindung in der Verhinderung der Pflanzensterblichkeit und -infektion durch Krankheiten resultieren kann, in denen Oxalsäure kritisch ist. Solche Krankheiten werden unter anderem besonders durch die hier aufgeführten spezifischen Pilzgattungen verursacht.
Die Würdigung der neuen Verwendungen der Erfinder von Oxalatabbauenden Enzymen wird besonders gesteigert durch die Erkenntnis und Erfindung der Erfinder, daß die physikochemischen Eigenschaften von Gersten-Oxalatoxidase, wie sie in der Literatur angegeben werden, unzutreffend waren. Entsprechend haben die Erfinder substantiell ein zuvor nicht beschriebenes Oxalatoxidase-Enzym gereinigt und charakterisiert. Tatsächlich wird hier gezeigt, daß die behaupteten substantiellen Reinigungen des Enzyms, wie sie in der Literatur angegeben werden, inkorrekt sind. Speziell offenbaren die Erfinder eine im wesentlichen reine Oxalatoxidase mit einer besonderen Aminosäure-Gesamtzusammensetzung, gezeigt in Fig. 2, einem pH-Optimum von 3,5, einem neutralen isoelektrischen Punkt, einer positiven Wärmestabilität, Proteasestabilität und einer einzelnen Untereinheit mit ca. 25 kDa.
Ebenfalls bekanntgemacht wird hierin die Erfindung des im wesentlichen Ganzen eines im wesentlichen reinen, ein Oxalatoxidase-Enzym kodierenden Gens mit einer wie in Fig. 1 gezeigten spezifischen DNA-Sequenz. Das Gen kodiert das Oxalatoxidase-Enzym mit den Eigenschaften wie oben aufgeführt. Insbesondere kodiert das Gen ein Oxalatoxidase-Aktivität aufweisendes Enzym mit einer einzelnen Untereinheit von ca. 25 kDa, das spezifisch mit gegen gereinigte Gerste-Oxalatoxidase herangezogenen Antikörpern reagiert und eine in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz hat.
Eine transformierte Pflanzenzelle wird hier ebenfalls offenbart, wobei die Zelle durch ein Gen transformiert wird, das die Expression von Oxalatoxidase oder einem anderen Oxalat-abbauenden Enzym kodiert. Das ein solches Enzym kodierende Gen kann die in Fig. 1 aufgeführte DNA-Sequenz einschließen, die im wesentlichen dem Oxalatoxidase-Enzym entspricht, das von den Erfindern substantiell gereinigt wurde.
Die gereinigte Oxalatoxidase dieser Erfindung, ihre Verwendung als ein Mittel zur Bekämpfung der Pathogenese und ihre Verwendung in der Pflanzenzellentransformation stellt einen inovativen und einzigartigen Ansatz zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten dar, in denen Oxalsäure eine kritische Komponente entweder während der Pathogenese oder im invasiven Stadium spielt. Es ist natürlich wohlbekannt, daß die Aktivität des Enzyms Oxalatoxidase darin besteht, daß es zum Abbau von Oxalsäure beiträgt. Jedoch waren es die derzeitigen Erfinder, die zuerst würdigten, daß durch Angreifen der Oxalsäure durch chemischen Abbau, z. B. durch enzymatischen Abbau, ein wesentlicher landwirtschaftlicher Vorteil bei der Verleihung von Krankheitsresistenz gegen diejenigen Krankheiten resultieren würde, in denen Oxalsäure eine kritische Rolle spielt. Diese Erfindung läßt hoffen, weil eine Hauptplage bei der kommerziellen Kultivierung von landwirtschaftlich bedeutsamen Pflanzen, z. B. Feldfrüchten wie Sonnenblumen, durch Pilzarten wie Sclerotinia verursacht wird, die Oxalsäure absondern.
Obwohl der Stand der Technik vorgeblich Oxalatoxidase reinigte und sie charakterisierte, haben die Erfinder gefunden, daß solche Literaturberichte unzutreffend waren, und daß das Enzym tatsächlich niemals richtig gereinigt und charakterisiert wurde. Es ist ersichtlich, daß "Oxalatoxidase" wie hier verwendet die gereinigte und charakterisierte Form des Enzyms bezeichnet, wie es hier aufgeführt ist, wenn nicht anders angegeben. Die Unterschiede zwischen den vorhandenen Literaturberichten und dem gereinigten und charakterisierten Enzym der vorliegenden Erfindung werden hier im einzelnen aufgeführt und können kurz aus Tabelle 1 erfahren werden. Die Verunreinigung handelsüblicher Oxalatoxidase-Zubereitungen ebenso wie die unzutreffende Charakterisierung des Enzyms in der Literatur wurde sichtbar, als die Erfinder zuerst Oxalatoxidase aus Gerstenkeimwurzel reinigten. Zwei Verfahren wurden verwendet. In einem Fall beinhaltete die Reinigung der Gerstenkeimwurzel-Oxalatoxidase die Homogenisierung von gefrorenem Gewebe in 1 bis 4 Volumina Wasser und Reinigung des wäßrigen Extrakts im Anschluß an Filtration durch ein Seihtuch zur Entfernung von Gewebstrümmern. Die Lösung wurde ferner gereinigt durch Zentrifugieren bei 18 000 g für 30 min. gefolgt von Wärmebehandlung bei 80ºC für 3 min, wobei die Ausfällungen in beiden Schritten verworfen wurden; Protein-Ausfällung aus dem Überstand zwischen 30% und 70% Sättigung bezüglich Ammoniumsulfat (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; wurde durch Zentrifugieren aufgefangen und gegen Wasser dialysiert. Die Protein-Resolubilisierung aus dem Ammoniumsulfat-Ausfällungsschritt wurde an einem Pharmacia FPLC unter Verwendung einer Mono S 10/10- Säule, äquilibriert mit 25 mM Kaliumacetat, pH 4,8, fraktioniert und mit einem Gradienten im gleichen Puffer von 0,0 auf 0,4 M NaCl eluiert. Oxalatoxidase-Aktivität wurde durch die Methode von Sugiura et al. gemessen, Chem. Pharma. Bull. (1979) 27(9): 2003. Spitzenfraktionen der Oxalatoxidase-Aktivität wurden vereinigt, mit dem salzarmen Kaliumacetat-Puffer pH 4,8 äquilibriert und erneut am FPLC unter Verwendung einer Mono S 5/5- Säule chromatographiert und mit den Puffern und dem NaCl-Gradienten wie oben eluiert. Spitzenfraktionen aus dem Mono S 5/5-Schritt wurden vereinigt, mit 25 mM Tris-Cl pH 7,6 äquilibriert, auf eine Mono Q 5/5-Säule aufgetragen und mit einem Gradienten von 0,0 auf 0,4 M NaCl eluiert. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Fraktionen mit Spitzen-Oxalatoxidase-Aktivität zeigte markante Protein-Banden nach Silberanfärbung bei ca. 25 und 38-40 kDa.
Anschließende Größenfraktionierung des nativen Proteins an einer Superose-12-Gelfiltrationssäule (äquilibriert mit 50 mM Kaliumacetat, pH 4,8) am FPLC zeigte eine wohldefinierte Aktivitätsspitze, die zu einem dem Molekulargewicht von ca. 25 000 entsprechenden Zeitpunkt eluierte.
Keine Oxalatoxidase-Aktivität wurde bei Elution in irgendeiner anderen der Fraktionen gefunden, die mit anderen Molekulargewichten verbunden sind. Eine zweite Methode beinhaltete die Verwendung der Detergens- Extraktion. Vier bis sieben Tage alte Gerstenkeimwurzeln wurden in Gegenwart von flüssigem Stickstoff gepulvert und bei -80ºC gelagert. Lagerung unter diesen Bedingungen resultierte in keinem erkennbaren Aktivitätsverlust. Das gelagerte Gewebe wurde mit 0,5% Taurodesoxycholat- Natriumsalz enthaltendem destilliertem Wasser homogenisiert, filtriert und zentrifugiert. Oxalatoxidase-Untersuchungen an den zwei Fraktionen (Überstand und Pellet) zeigten, daß beide Fraktionen Aktivität besaßen. Entsprechend wurde das Pellet mit 0,5% Taurodesoxycholat-haltigem destilliertem Wasser extrahiert. Im Anschluß an erschöpfende Dialyse gegen destilliertes Wasser wurde Ammoniumsulfat zum Konzentrat gegeben und der lösliche Überstand fraktioniert. Die ausgefällten Proteine (30 bis 70%ige Ammoniumsulfat-Fraktionen) wurden dann erneut in einem kleinen Volumen Detergens-haltigem Wasser suspendiert und an einer kleinel Gel-Permeationssäule (Sephadex G25) entsalzt. Die aktive Fraktion wurde auf eine Anionenaustauschersäule (DEAE) unter Verwendung eines Tris-HCl-Puffers, pH 7,5 aufgetragen und die Elution des gebundenen Proteins unter Verwendung eines Natriumchlorid-Gradienten bewirkt. Die enzymatisch aktive Fraktion wurde aufkonzentriert, entsalzt und dann auf eine Mono-Q-Säule (Pharmacia) aufgetragen. Ein Natriumchlorid-Gradient wurde erneut zur Elution der Proteine eingesetzt. Aktivitätsuntersuchungen zeigten, daß die Oxalatoxidase in drei Fraktionen konzentriert war. Nach Analyse dieser Fraktionen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde festgestellt, daß die Aktivität mit einem Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ca. 25 kDa verbunden ist.
Im Anschluß an die Reinigung wurde die Charakterisierung der gereinigten, homogenen Oxalatoxidase-Zubereitung durchgeführt. Wie schon angegeben und in Tabelle 1 gezeigt, unterscheiden sich die Eigenschaften des aus dieser Reinigung resultierenden Proteins ganz einfach von den in der Literatur beschriebenen. Dies läßt vermuten, daß trotz der Versuche anderer Fachleute, das Oxalatoxydase-Enzym zu reinigen, dieses Enzym bis zu den derzeitigen Anstrengungen der Erfinder nicht richtig beschrieben und durch die Aufklärung seiner physikochemischen Eigenschaften charakterisiert war. Die Ergebnisse der von den Erfindern vorgenommenen physikochemischen Charakterisierung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Mittels Vergleich wird ebenfalls die zuvor angegebene Literaturcharakterisierung aufgeführt. Tabelle 1 Oxalatoxidase - Eigenschaften
Eine weitere Verdeutlichung der Unterscheidung des Oxalatoxidase- Aktivität aufweisenden Enzyms der Erfinder ist in Tabelle 2 ersichtlich. Wie Tabelle 2 ganz einfach nachweist, führt diese Erfindung zu einer unterschiedlichen Aminosäure-Zusammensetzung als sie in der Literatur angegeben ist. Siehe J. Chiriboga (1966) Archives of Biochemistry and Biophysics 116, 516-523. Tabelle 2
Teilweise gereinigte Gerstenkeimwurzel-Oxalatoxidase wurde solubilisiert, einer Kationen-Austauscherchromatographie unter Verwendung einer Mono S-Säule (25 mM Kaliumacetat, pH 4,8) unterworfen und mit einem Kaliumchlorid-Gradienten im gleichen Puffer von 0 auf 400 mM eluiert. Das gewonnene enzymatisch aktive Protein wurde weiter durch präparative Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Eine einzelne Protein-Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 25 kDa wurde gefunden und anschließend aus dem Gel geschnitten.
Die nassen Gelscheiben wurden fragmentiert, mit Freund'schem Adjuvans vermischt und intramuskulär in die Rückseite des Schenkelmuskels nahe der Hüfte der Kaninchen injiziert. Die Kaninchen wurden mit zusätzlichen Protein-Mengen gefördert, und Blutproben wurden überwacht, um die Produktion von Oxalatoxidase-spezifischen Antikörpern sicherzustellen. Nach ca. 4 Monaten wurde den Tieren das Blut entzogen. Die produzierten polyklonalen Kaninchen-Antikörper besaßen einen sehr hohen Titer.
Das für aus Gerste stammende Oxalatoxidase kodierende Gen mit der in Fig. 1 gezeigten Struktur wurde wie in Fig. 4 unter Verwendung einer aus Gerstenwurzel konstruierten cDNA-Bibliothek kloniert. Gesamt-RNA wurde aus Gerstenwurzel hergestellt. Polyadenylierte RNA wurde dann aus der Gesamt- RNA gewonnen und zur Synthese von cDNA verwendet. Sowohl Gesamt- als auch polyadenylierte RNA wurden unter Verwendung handelsüblicher RNA- Extraktions- und mRNA-Reinigungs-Kits gemäß den mit den Kits gelieferten Standardanweisungen hergestellt (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.). Die Konstruktion der Bibliothek wurde kommerziell durchgeführt (Clontech Laboratories). Der für die Bibliothek gewählte Vektor war lamda gt 22. Die Verwendung dieses Expressionsvektors wurde beruhend auf dem hohen Titer und der hohen Spezifizität des Oxalatoxidase-Antiserums ausgewählt. Unabhängig vom für die Verwendung mit dieser Konvertierung ausgewählten Expressionsvektor ist es vorteilhaft, daß der Vektor die Verwendung einer immunologischen Durchmusterung auf das Proteinprodukt von OxalatoxidasecDNA-Klonen erlaubt. Auf der Basis der durchschnittlichen Insertionsgröße von 1,8 Kilobasen für die cDNA-Bibliothek und der guten Vertretung bezüglich der Anzahl unabhängiger Klone (1,7 · 10&sup6;) wurde geschlossen, daß die Bibliothek einen cDNA-Klon für das Oxalatoxidase-Protein mit einer Größe von ca. 25 kDa enthalten sollte.
Die Anfangsdurchmusterung der Bibliothek wurde mit Antiserum gegen Oxalatoxidase gemäß Standardvarfahren durchgeführt, wie sie z. B. aufgeführt sind in T. Huynh et al. (1985), DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, Herausgeber D. Glover, IRL Press, Oxford. Da Informationen über die N-terminale Aminosäuresequenz des reifen Oxalatoxidase-Proteins erhalten worden war (ausgenommen den N-terminalen Rest), wurde die N-terminale Sequenz ebenfalls verwendet, um die Identität jedes der gewonnenen cDNA-Klone als positiv in der immunologischen Anfangsdurchmusterung zu bestätigen. 1,2 · 10&sup6; Plaques aus der cDNA-Bibliothek wurden mit dem Antiserum durchmustert. 14 potentiell positive Signale wurden erhalten, von denen eines viel stärker als die anderen war. Zwei aufeinanderfolgende Durchläufe von erneuter Durchmusterung mit dem Antiserum wurden an diesen 14 Klonen durchgeführt, um bestätigte positive, einzelne Plaque-Isolate zu erhalten, die im molekularen Maßstab charakterisiert wurden. Der Plaque mit der Nr. 12 ergab wiederum das stärkste Signal innerhalb dieser anschließenden Durchmusterungen. Plaque Nr. 12 wurde dann zur Reinigung des Oxalatoxidase-Antikörpers als Test der Spezifizität des Plaque-Signals gemäß dem Standardverfahren verwendet, wie es z. B. beschrieben wird in T. Hunyh et al., siehe oben. Aus Plaque 12 gereinigter Antikörper wurde als Sonde auf einem Western-Blot eines Acrylamid-Gels aus Oxalatoxidase-Protein verwendet. Der Plaque-gereinigte Antikörper reagierte spezifisch mit Oxalatoxidase, wobei er ein identisches Muster zu demjenigen zeigte, das mit gereinigtem Antikörper als Sonde beobachtet wird.
Die Insertion (das in den Vektor lamda gt 22 klonierte cDNA-Produkt) aus Plaque 12 wurde unter Verwendung von Standardmethoden der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) gewonnen, wie sie veranschaulicht werden in F. M. Ausubel et al. (Herausgeber) (1988) "The Polymerase Chain Reaction", in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, New York, Seiten 15.0.1-15.4.6. Die Insertion in Plaque Nr. 12 wurde auf 650 bis 750 Basenpaare abgeschätzt. Die Größe der Insertion in Plaque 12 stimmte mit einem Protein von ca. 25 kDa ein. Beruhend auf der anfänglichen Größenabschätzung für die cDNA-Insertion und dem Ergebnis aus der Plaque-Reinigung des Antikörpers wurde Plaque Nr. 12 als bester Kandiat für die weitere molekulare Analyse betrachtet. Die durch PCR hergestellte Nr. 12-Insertion wurde dann erneut in einen der Analyse zugänglicheren Plasmid-Vektor kloniert. Die cDNA-Insertion aus Klon 12 wurde ebenfalls als Sonde für einen Northern-Blot von Gerstenwurzel-RNA zur Abschätzung der Größe der mRNA für Oxalatoxidase verwendet. Formaldehyd- Gelelektrophorese und Übertragung auf eine Nylonmembran wurden gemäß den vom Lieferanten der Membranen, Schleicher und Schüll, empfohlenen Verfahren durchgeführt. Die Nr. 12-Sonde hybridisierte zu einer einzelnen mRNA- Spezies von ca. 800 bis 850 Basen Länge.
Didesoxynukleotid-Sequenzierung wurde an der erneut klonierten Plaque 12-Insertion durchgeführt. Ein handelsübliches T7-Sequenzierungskit (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) und das vom Hersteller empfohlene Verfahren wurden verwendet. Die Gersten-cDNA-Insertion wurde zu einer Länge von ca. 690 Basen bei einer gewissen Unsicherheit in zwei kleinen Regionen, die nicht mehr als jeweils 10 Basenpaare abdecken, im C-Terminus und in der Identität der drei N-terminalen Basen bestimmt. Die Nukleotidsequenz der Klon 12-Insertion ist schematisch in Fig. 1 gezeigt. Die teilweise Proteinsequenz wurde dann aus der Nukleotidsequenz von Klon 12 vorhergesagt und mit der direkt aus der gereinigten Oxalatoxidase erhaltenen N-terminalen Aminosäuresequenz verglichen. Dieser Vergleich ist in Fig. 3 gezeigt.
Das Gen mit der in Fig. 1 gezeigten Struktur, das die kodierende Sequenz für das reife Oxalatoxidase-Enzym enthält, würde an genetische Regulationselemente gebunden sein, die zur Expression des Strukturgens in einer definierten Wirtszelle benötigt werden. Der erste Typ erforderliches Regulationselement ist eine Gen-Promotorregion, die DNA-Sequenzen enthält, die vom biologischen Mechanismus der Pflanzenzelle erkannt werden, und die die Transkription der DNA-Sequenz zu Messenger-RNA (mRNA) induziert. Die mRNA wird dann in das Proteinprodukt übersetzt, das durch die Strukturgen- Region kodiert wird. Der Promotor wird vor dem Gen oder 5' zum Gen für Oxalatoxidase angeknüpft, was gemäß auf diesem Gebiet bekannten Standardverfahren durchgeführt werden kann. Siehe z. B. T. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Seiten 104-106. Promotorregionen, die zur Expression des Oxalatoxidase-Gens in Pflanzenzellen verwendet werden könnten, schließen Promotoren ein, die in einem weiten Bereich von unterschiedlichen Pflanzengeweben aktiv sind. Z. B. kann der 355-Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus für diesen Zweck geeignet sein. Ein anderer Typ von Promotor, der in Pflanzenzellen verwendet werden könnte, ist einer, der unter eingeschränkteren Bedingungen exprimiert. Eingeschlossen in dieser Klasse würden Promotoren sein, die nur in bestimmten Geweben der Pflanze aktiv sind und/oder durch bestimmte Reize wie Verwundung zur Aktivität induziert werden. Ein Beispiel für diese Art Promotor würde die 5'-Regulationsregion aus dem Gen für Phenylalanin- Ammoniak-Lyase (PAL) sein. Dieser Typ Promotor wird erörtert in X. Liang et al. (1989), PNAS, USA, 8: 9284-9288. Expression des Oxalatoxidase-Gens in mikrobiellen Wirten könnte erreicht werden durch Verwendung von aus mikrobiellen Quellen erhaltenen Promotoren. Beispiele für solche Promotoren würden den trp-Promotor für die Expression in Bakterien wie E. coli einschließen, wie es veranschaulicht wird in E. Amann et al. (1983), Gene, 25: 167-178, oder den Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase-(GAPD)-Promotor für die Expression in Hefe, wie er veranschaulicht wird in L. Edens et al. (1984), "Synthesis and Processing of the Plant Protein Thaumatin in Yeast", Cell 37: 629-633. Die Gen-Promotorsequenzen können ebenfalls teilweise oder vollständig aus Promotorsequenzen stammen, die in anderen Zellen als denjenigen der Wirtszelle gefunden werden, solange sie die obigen Kriterien zur Transkription und Translation erfüllen.
Ein zweites genetisches Regulationselement, das in wünschenswerter Weise an das Oxalatoxidase-Gen geknüpft werden könnte, aber nicht braucht, ist eine Terminator- oder Polyadenylierungssequenz, die die wirksame Terminierung der Transkription des Gens unterstützt und in Eukaryonten ebenfalls die Polyadenylierung unterstützt, d. h. die Addition einer beliebigen Anzahl von Adenosin-Nukleotiden am 3'-Ende der mRNA. Auf diesem Gebiet bekannte Standardmethoden können zur Anknüpfung der Terminatorregion hinter dem Gen oder 3' zum Gen verwendet werden. (Siehe z. B. T. Maniatis et al., siehe oben, Seiten 104-106). Ein Beispiel für eine solche Terminator-/Polyadenylierungssequenz zur Expression in Pflanzen würde diejenige aus dem Octopinsynthase-Gen aus einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens sein, wie sie offenbart wird in H. DeGreve et al. (1982), "Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene", J. Mol. Appl. Genet., 1: 499-511. Ein Beispiel für einen solchen Terminator zur Expression in mikrobiellen Wirten ist die rho-unabhängige Transkriptionsterminatorsequenz aus Salmonella typhimurium. Siehe z. B. M. E. Winkler (1987), "Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology", hauptsächlicher Herausgeber F. C. Neidhardt; American Society of Microbiology. Die Gen-Terminatorsequenzen können ebenfalls teilweise oder vollständig aus Terminatorsequenzen stammen, die in anderen Zellen als denjenigen der Wirtszelle gefunden werden, solange sie die obigen Kriterien zur Transkriptionsterminierung und Polyadenylierung erfüllen, die von der Wirtszelle gefordert werden.
Ein anderer Typ Regulationselement, das an das Gen für Oxalatoxidase gebunden werden kann, ist eine für ein Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz. Das Signalpeptid wird an den Aminoterminus des Proteins gebunden und erlaubt es dem Protein, an der Zellwand lokalisiert zu sein oder aus der Wirtszelle abgesondert zu werden. Während dieses Lokalisierungsprozesses wird das Signalpeptid abgespalten, wodurch ein Protein-Produkt mit der Sequenz des reifen Proteins erzeugt wird. Die DNA-Sequenz für das Signalpeptid wird zwischen dem Promotor und der kodierenden Region insertiert. Auf diesem Gebiet bekannte Standardmethoden können zur Anbindung der DNA- Sequenz für das Signalpeptid verwendet werden (siehe z. B. T. Maniatis et al., siehe oben, Seiten 104-106). Beispiele für solche Signalsequenzen würden das Signalpeptid aus einem Extensionsgen von Pflanzen (J. Chen und J. E. Varner, "An extracellular matrix protein in plants: characterization of a genomic clone for carrot extension", EMBO J 4: 2145-2151, 1985), aus dem bakteriellen pelB- (Pectatlyase-) Gen von Erwinia carotovora (S. P. Lei et al. (1987), J. Bacteriol. 169 4379) und aus dem Perpro-Faktor von Hefe (R. A. Smith et al., Science 229: 1219-1229, 1985) einschließen. Die Signalpeptidsequenzen können ebenfalls vollständig oder teilweise aus Terminatorsequenzen stammen, die in anderen Zellen als denjenigen der Wirtszelle gefunden werden, solange sie die obigen Kriterien zur Verarbeitung und Lokalisierung des Proteins in der Wirtszelle erfüllen.
Jede der verschiedenen, zur Einführung fremder Gene in Pflanzen bekannten Methoden könnte zur Insertion des Oxalatoxidase-Gens in eine Wirtspflanze verwendet werden. Die zur Erreichung der Pflanzentransformation mit dem Oxalatoxidase-Gen gewählte Methodik würde in Abhängigkeit von der Wirtspflanze variieren. Beispielsweise wäre eine gut charakterisierte Methodik, die zur Pflanzentransformation mit dem Oxalatoxidase-Gen nützlich wäre, die von Agrobacterium vermittelte Transformation.
Die von Agrobacterium vermittelte Transformation unter Verwendung des Oxidase-Gens folgt den für diese Methodik wohlbekannten Verfahren. Zuerst wird eine zur Expression in Pflanzen geeignete Gen-Kassette in einen unschädlich gemachten Stamm von Agrobacterium tumefaciens als Zwischenwirt eingeführt. Die Oxalatoxidase-Genkassette wird in die T-DNA-Region eines rekombinanten Plasmids eingeführt, das ein Selektionsmarkergen enthält, wie ein Gen, das für Neomycinphosphotransferase II, Phosphinothricinacetyltransferase oder dgl. kodiert. Diese Methodik ist in vielen Literaturveröffentlichungen aufgeführt, einschließlich Horsch et al. (1985), "A Simple and General Method for Transferring Genes Into Plants", Science 227: 1229-1231. Stücke von Pflanzengewebe, z. B. Blatt, Kotyledone oder Hypokotyl, werden zusammen mit den Bakterien für zwei bis drei Tage inkubiert, bevor die Bakterien unter Verwendung von Antibiotika wie Carbenicillin abgetötet werden. Zusätzliche, dem eingesetzten Selektionsmarkergen entsprechende Antibiotika werden im Pflanzengewebe-Kulturmedium eingeschlossen, so daß nur transformierte Pflanzenzellen wachsen.
Aus den transformierten Zellen regenerierte Pflanzen werden dann auf Gegenwart und Expression des Oxalatoxidase-Gens untersucht. Immuno-Assays und Untersuchung auf Oxalatoxidase-Aktivität können zur Identifizierung individueller Transformanten verwendet werden. Die Verträglichkeit gegenüber exogener Oxalsäure kann ebenfalls als Funktionstest für intakte Gewebe verwendet werden.
Wie angemerkt sind verschiedene andere Methodiken zur Pflanzentransformation neben der Agrobacterium-Transformation erhältlich. Beispiele für diese anderen DMA-Übertragungsmethoden schließen Elektroporation, d. h. chemisch induzierte Übertragung in Protoplasten, Mikroinjektion, Biolostika ("biolastics") und andere ein. Ein Beispiel für einen Typ Pflanze, der nicht speziell für die Agrobacterium vermittelte Transformation geeignet ist, sind Sojabohne und bestimmte Getreidearten, einschließlich Mais. Diese Pflanzen würden ganz einfach Nutzen ziehen aus Pflanzentransformationsversuchen unter Verwendung anderer Methodiken als der Agrobacterium- vermittelten Transformation.
Die Abbildungen, die diese Beschreibung begleiten, sind wie folgt:
Fig. 1 zeigt eine aus der für Gerstenkeimling-Oxalatoxidase kodierenden mRNA revers konstruierte cDNA-Sequenz.
Fig. 2 zeigt die aus der in Fig. 1 gezeigten cDNA übersetzte Aminosäuresequenz.
Fig. 3 zeigt schematisch die zur Klonierung des Oxalatoxidase-Gens verwendete und im Detail nachfolgend in Beispielen 1 und 2 beschriebene Klonierungsstrategie.
Fig. 4 zeigt schematisch die in Beispielen 3 und 4 unten beschriebene Klonierungsstrategie.
Fig. 5 zeigt die Struktur von Plasmid pVB1, und
Fig. 6 zeigt die Struktur von Plasmid pBin19i.
Die Erfindung wird nur zur Veranschaulichung in den folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Konstruktion eines Oxalatoxidase-Nichtsekretionsvektors zur Tomaten- Transformation.
(a) Rekonstruktion eines offenen Oxalatoxidase-Leserahmens voller Länge (ORF = "open reading frame").
Oligonukleotide 1219901A und 1219901 (compl) wurden entworfen und zur Bildung eines Linkers mit einer HindIII-Stelle am 5'-Ende und einer BsaI- Stelle am 3'-Ende synthetisiert. Oligonukleotid 1219901A:
Die Oligonukleotide wurden verschmolzen und in Klon #22 kloniert, geschnitten mit HindIII und teilweise mit BsaI, um den Klon pOXOX1 zu erzeugen, der den ORF für reife Oxalatoxidase enthielt, wie gezeigt durch Peptidsequenzierung.
Nach Klonierung des in Klon #22 gebundenen HindIII/BsaI wurde die Integrität des ORF für reife Oxalatoxidase durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
(b) Insertion des Oxalatoxidase- ORF in einen Expressionsvektor.
Die kodierende Region für reife Oxalatoxidase wurde aus Agarose als HindIII/BamHI-Fragment mit 700 bp isoliert, und die Enden wurden mit T4- DNA-Polymerase abgestumpft. pNB33A wurde mit XbaI und Pst2 geschnitten, das Vektor-Fragment wurde aus Agarose isoliert und die Enden mit T4-Polymerase abgestumpft.
Diese zwei stumpfendigen Fragmente wurden unter Erzeugung des Klons pNBOXOX1 miteinander ligiert. Die korrekte Orientierung der Oxalatoxidasekodierenden Region in pNBOXOX1 wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
(c) Übertragung der Oxalatoxidase-Expressionskassette in pBin19Ri.
pBNOXOX1 wurde mit HindIII und teilweise mit EcoRI geschnitten. Die Expressionskassette mit 1,9 kb wurde aus Agarose isoliert und in pBin19Ri (Fig. 6) kloniert, geschnitten mit EcoRI und Hindill, um Klon pNOX1 zu ergeben.
Die Gegenwart der Oxalatoxidase-Expressionskassette in Klon pNOX1 wurde durch Restriktion der Plasmid-DNA mit EcoRI und HindIII bestätigt.

Beispiel 2

Konstruktion eines Oxalatoxidase-Nichtsekretionsvektors zur Sonnenblumentransformation.
(a) Übertragung der Oxalatoxidase-Expressionskassette in pVB1.
Das EcoRI/HindIII-Fragment mit 2,1 kb, das die aus pNBOXOX1 isolierte Oxalatoxidase-Expressionskassette enthielt, beschrieben oben in Beispiel 1, wurde in pVB1 (Fig. 5) kloniert, geschnitten mit EcoRI und Hindill, um Klon pVBOX1 zu ergeben.
Die Gegenwart der Oxalatoxidase-Expressionskassette in Klon pVBOX1 wurde durch Restriktion der Plasmid-DNA mit EcoRI und Hindill bestätigt.
(b) Insertion des Hygromycin-Resistenz-Gens in pVBOX1.
Ein HindIII-Fragment mit 2,3 kb, das die Hygromycin-Resistenz- Kassette enthielt, wurde aus p19HYG isoliert und in pVBOX1 kloniert, geschnitten mit HindIII, um Klon pHOX1 zu ergeben.
Die Gegenwart und Orientierung der Hygromycin-Kassette in Klon pHOX1 wurde durch Verdauung der Plasmid-DNA mit EcoRI bestätigt.

Beispiel 3

Konstruktion eines Oxalatoxidase-Sekretionsvektors zur Tomatentransformation.
(a) Erzeugung einer Extensin-Transitpeptid/Oxalatoxidase-Fusion durch PCR.
Um die reife Oxalatoxidase an ein Extensin-Transitpeptid zu fusionieren, wurden die Oligonukleotide EXTOX-5 und EXTOX-3 entwickelt und synthetisiert.
Die Oligonukleotide wurden als PCR-Primer mit pNBOX1 als Schablone verwendet. Das resultierende EXTOX-PCR-Produkt mit 771 bp, das ein Extensin-Transitpeptid mit 23 Aminosäuren enthielt, fusioniert im Rahmen mit der reife Oxalatoxidase kodierenden Region, wurde mit KpnI geschnitten.
(b) Insertion des EXTOX-PCR-Produkts in pJR1(pUC).
Das oben beschriebene, KpnI-verdaute EXTOX-PCR-Produkt wurde in pJR1(pUC) kloniert, geschnitten mit KpnI, um den Klon pJEXTOX1 zu ergeben. Die Orientierung und Sequenz des EXTOX-PCR-Produkts in pJEXTOX1 wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
(c) Übertragung der EXTOX-Expressionskassette in pBin19i.
Die Extensin/Oxalatoxidase-Expressionskassette wurde aus pJEXTOX1 als EcoRI/HindIII-Fragment mit 1,5 kb isoliert und in pBin19i kloniert, geschnitten mit EcoRI und Hindill, um den Klon pNEXTOX1 zu erzeugen. Die Gegenwart der Expressionskassette in pNEXTOX1 wurde durch Verdauung der Plasmid-DNA mit EcoRI und HindIII bestätigt.

Beispiel 4

Konstruktion eines Oxalatoxidase-Sekretionsvektors zur Sonnenblumentransformation
(a) Isolierung der Sekretionsexpressionskassette und Insertion in pVB1.
Die Extensin/Oxalatoxidase-Expressionskassette wurde aus pJEXTOX1 als EcoRI/HindIII-Fragment mit 1,5 kb isoliert und in pVB1 kloniert, geschnitten mit EcoRI und HindII, um den Klon pVEXTOX1 zu erzeugen. Die Gegenwart der Expressionskassette in pVEXTOX1 wurde durch Verdauung der Plasmid-DNA mit EcoRI und HindIII bestätigt.
(b) Insertion des Hygromycin-Resistenz-Gens in pVEXTOX1.
Ein HindIII-Fragment mit 2,3 kb, das die Hygromycin-Resistenz- Kassette enthielt, wurde aus p19HYG isoliert und in PVEXTOX1 kloniert, geschnitten mit HindIII, um den Klon pHEXTOX1 zu ergeben.
Die Gegenwart und Orientierung der Hygromycin-Kassette im Klon pHEXTOX1 wurde durch Verdauung der Plasmid-DNA mit EcoRI bestätigt.

Claims

1. Verfahren zum Übertragen der Fähigkeit zum Abbau von Oxalat auf eine Pflanze, umfassend das Insertieren eines Gens, das eine Oxalatoxidase kodiert, in das Genom der Pflanze durch genetische Transformation.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Pflanzengenom durch ein Genkonstrukt mit einer Promotorsequenz, einem Transitpeptid, einer Strukturgen-Sequenz, die das das Oxalatoxidase-Enzym kodiert, und einer Genterminator-Sequenz transformiert wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Strukturgen-Sequenz die DNA-Sequenz der Fig. 1 umfaßt.

4. Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenpathogenese durch Infektion mit einem Pilz, der Oxalsäure absondert, umfassend das stabile Einbauen eines Oxalatoxidase kodierenden Gens durch Transformation in das Genom der Pflanze.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der Pilz aus einer Gattung stammt, die aus der Gruppe Oxalsäure absondernder Pilze ausgewählt ist, umfassend Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia und Schizophyllum.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin der Pilz Sclerotinia sclerotorum ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, worin die Pflanze die Sonnenblume ist (Helianthus annuus).

8. Pflanze mit einem in ihrem Genom durch Transformation stabil eingebauten, Oxalatoxidase kodierenden Gen.

9. Pflanzenzelle mit einem in ihrem Genom durch Transformation stabil eingebauten, Oxalatoxidase kodierenden Gen.