DE60313469T2 - Für ein protein mit transglutaminaseaktivität kodierende nukleotidsequenz aus mais und verwendung davon - Google Patents
Für ein protein mit transglutaminaseaktivität kodierende nukleotidsequenz aus mais und verwendung davon Download PDFInfo
- Publication number
- DE60313469T2 DE60313469T2 DE60313469T DE60313469T DE60313469T2 DE 60313469 T2 DE60313469 T2 DE 60313469T2 DE 60313469 T DE60313469 T DE 60313469T DE 60313469 T DE60313469 T DE 60313469T DE 60313469 T2 DE60313469 T2 DE 60313469T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- protein
- nucleotide sequence
- tgase
- activity
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 29
- 101710123874 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 29
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 17
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 claims description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 claims description 3
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 claims description 3
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 claims description 2
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 31
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 19
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 abstract description 13
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 abstract description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 33
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 32
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 6
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000008892 Helianthus tuberosus Species 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100030944 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- CCSGGWGTGOLEHK-OBJOEFQTSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(5-aminopentyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCN)SC[C@@H]21 CCSGGWGTGOLEHK-OBJOEFQTSA-N 0.000 description 2
- 102100032252 Antizyme inhibitor 2 Human genes 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108700016156 Arginine decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- 241000548230 Crassostrea angulata Species 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 2
- 241000709739 Enterobacteria phage f2 Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003230 Helianthus tuberosus Nutrition 0.000 description 2
- 101000666171 Homo sapiens Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 2
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000251571 Ciona intestinalis Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 208000012896 Peritoneal disease Diseases 0.000 description 1
- 101710182792 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Proteins 0.000 description 1
- -1 R-glutaminyl Chemical group 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 206010042602 Supraventricular extrasystoles Diseases 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101000837778 Tachypleus tridentatus Hemocyte protein-glutamine gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 102000007236 involucrin Human genes 0.000 description 1
- 108010033564 involucrin Proteins 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000020121 low-fat milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 244000129185 maize Species 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013573 potato product Nutrition 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019465 surimi Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 108010058734 transglutaminase 1 Proteins 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
- Die Erfindung betrifft die Identifizierung neuer Proteine mit TGase-Aktivität, die von Pflanzen stammen, und deren Verwendung auf dem Gebiet der Nahrungsmittelbearbeitung, -verarbeitung und -umwandlung und bei der Entwicklung transgener Pflanzen mit neuen Fähigkeiten.
- STAND DER TECHNIK
- Transglutaminasen (TGase; EC 2.3.13) (R-Glutaminylpeptidaminase-γ-Glutamyltransferase) katalysieren Amidbindungen zwischen einer primären Aminogruppe eines Polyamins oder eines Lysins (Aminodonator) und einer γ-Carboxyamidgruppe eines Glutamyls einiger Proteine (Aminorezeptor) durch eine Zwischenreaktion, bei der das Enzym durch Reaktion zwischen der γ-Carboxyamidgruppe des Glutamylrestes des Proteins und einer Sulfhydrylgruppe eines Cysteinrestes des aktiven Zentrums des Enzyms an das Substrat bindet (Serafini-Fracassini, D., Del Duca, S. & Beninati, S. 1995. Plant Transglutaminases. Phytochemistry 40: 355–365). Das Ergebnis der TGase-Aktivität ist: a) eine Modifikation der Konfiguration des Proteins selbst und b) andere ausgedehntere Konfigurationsänderungen als Ergebnis von Bindungen zwischen dem Protein selbst und zwischen anderen Proteinen, um Konjugate mit einem hohen Molekulargewicht zu bilden.
- Es gibt Untersuchungen über TGasen bei Menschen und auch bei Tieren, Pflanzen, niederen Vertebraten, einigen Bakterien, Algen und Hefe (Makarova, K. S., Aravind, L. & Koovin, E. V. 1999. A superfamily of archaeal, bacterial and eukaryotic Proteins homologous to animal transglutaminases. Protein Science 8: 1714–1719; Bergamini, C. M., Dean, M., Tanfani, F., Ferrari, C. & Scatturin. 1999. Conformational stability of human erythrocyte transglutaminase: Patterns of thermal unfolding at acid and alkaline pH. Eur. J. Biochem. 266: 575–582.; Cariello, L. Ristoratore, F. & Zanitti, L. 1997. A new transglutaminase-like from ascidian Ciona intestinalis. FERS Lett 408: 171–176; Lorand, L. & Conrad. S. M. 1984. Transglutaminases. Mol Cell Biochem 58: 9–35; Serafini-Fracassini, D., Del Duca S. & Beninati S. 1995. Plant Transglutaminases. Phytochemistry 40: 355–365; Tokunaga, F., Muta, T., Iwanaga, S., Ichinose, A., Davie, EW, Kuma, K. & Miyata, T. 1993. Limulus hemocyte transglutaminase. cDNA cloning, amino acid sequence and tissue localization. J Biol Chem 268: 262–268).
- Die meisten bekannten TGasen sind: der Blutgerinnungsfaktor XIII, bei dem es sich um ein Plasmaprotein handelt, und TGase K, die an der Bildung der Stratum corneum Epidermidis beteiligt ist. Andererseits sind einige der Gene, die für einige der angeführten TGasen verantwortlich sind, schon kloniert worden und die Beteiligung von TGasen an wichtigen Vorgängen wie zum Beispiel Zelldifferenzierung, Gewebestabilisierung oder programmiertem Zelltod wird allmählich bekannt (Ichinose, A., Bottenus, R. E. & Davie 1990. Structure of transglutaminases. J. of Biol. Chemistry. 265(23): 13411–13414; Bergamini, C. M., Dean, M., Tanfani, F., Ferrari, C. & Scatturin. 1999. Conformational stability of human erythrocyte transglutaminase: Patterns of thermal unfolding at acid and alkaline pH. Eur. J. Biochem. 266: 575–582; Nemes, Z., Marekov, L. N. & Steinert, P. M. 1999. Involucrin crosslinking by transglutaminase 1. J. of Biol. Chemistry. 274(16): 11013–11021). Diese Enzyme scheinen auch an neurodegenerativen Erkrankungen, Tumoren, Bauchhöhlenerkrankungen usw. beteiligt zu sein und deshalb handelt es sich bei ihnen um eine Gruppe sehr interessanter Enzyme bei klinischen Untersuchungen. In Anbetracht dieser klinischen Untersuchungen gibt es verschiedene Patente, die sich auf TGasen beziehen:
US 5,736,132 „Method of promoting adhesion between tissue surfaces" eingereicht von Orthogene, Inc., 1998;US-5,726,051 „Transglutaminase gene" eingereicht von der Oklahoma Medical Research Foundation, 1998. - Die Funktion von pflanzlichen TGasen ist weniger bekannt, obwohl die ersten Daten über deren Existenz vor einigen Jahren publiziert wurden (Icekson I. & Apelbaun, A. 1987. Evidences for transglutaminase activity in plant tissue. Plant Physiol. 84. 972–974; Serafini-Fracassini D., Del Duca S., & D'Orazi D. 1988. First evidence for Polyamine conjugation mediate by an enzyme activity in plants. Plant Physiol. 87: 757). Untersuchungen an Pflanzen haben sich in erster Linie auf biochemische Aspekte, die sich auf die Aktivität beziehen, Substrate, auf die sie wirkt, und Gewebe, in denen sie reichlich vorhanden ist, konzentriert, aber ihre funktionelle Rolle mit partiellen Daten über ihre Beteiligung, wie zum Beispiel Wachstum und Entwicklung, Morphogenese im Allgemeinen, Photosynthese und Zelltod, ist nicht untersucht worden (Margosiak, S. A., Drama, A., Bruce-Carver, M. R., Gonzalez, A. P. Louie, D. & Kuehn. 1990. Identification of the large subunit of ribulose 1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase as a substrate for transglutaminase in Medicago sativa L. (Alfalfa): Plant Physiol. 92: 88–96; Del Ducca, S., Tidu, V., Bassi, R., Exposito, C., & Serafini-Fracassini, D. 1994, Identification of chlorophyll-a/b proteins as substrates of transglutaminase activity in isolated chloroplasts of Helianthus tuberosus L. Planta 193: 283–289; Del Ducca, S., Della Mea, M., Muñoz de Rueda, P. & Serafini-Fracassini, D. 2000 Factors affecting transglutaminase activity catalyzing Polyamine conjugation to endogenous substrates in the entire chloroplast. Plant Physiol Biochem 38: 429–439).
- Außerdem muss betont werden, dass Transglutaminase für biotechnologische Zwecke einen Mehrwert hat. Diese neue ergänzende Facette als interessanter Metabolit stammt von ihrer Fähigkeit, kovalente Bindungen zwischen verschiedenen Proteinen zu erzeugen. Diese Eigenschaft ist zum Beispiel verwendet worden, um die Struktur von Waren wie zum Beispiel Fisch und Fleisch zu erhalten, was den Bedarf zum Verwenden von Salzen (Surimi usw.) verringert. Zur Formulierung von Gelatinen mit einer anderen Dichte usw. Zum Herstellen vorgekochter Nahrungsmittel mit weniger Fett (Tofu). Es ist auch möglich, die Konsistenz, Elastizität, Feuchtigkeit oder Viskosität eines Produkts bei verschiedenen Temperaturen zu erhalten. Auf ähnliche Weise wird sie bei verschiedenen in einer Molkerei verarbeiteten Nahrungsmitteln verwendet: Käse, Joghurt, Speiseeis usw. In einem solchen Maß, dass sie derzeit als ein „Zusatz" bei vielen biologisch verarbeiteten Nahrungsmitteln verwendet wird, die für diesen Zweck in den USA empfohlene Dosis beträgt 65 ppm.
- Alle diese Möglichkeiten der TGase haben die Erzeugung verschiedener Patente über Verfahren zur Beschaffung, Verwendung usw. produziert und sie haben aus dieser Substanz ein kommerzielles Produkt gemacht, wie zum Beispiel diejenigen, welche die Firma Ajinomoto unter dem Namen Activa TG® vertreibt. Die Firmen, die das Produkt vermarkten, sind Ajinomoto Co., Inc. aus Tokio (auch in den USA verbreitet) und Rohm Enzyme aus den USA (www.skidmore-sales.com/whatsnew/newsletter/summer2001.pdf). In Spanien ist jedoch keine Firma gefunden worden, die sich der industriellen Herstellung von TGase verschrieben hat.
- Die erste TGase, die für kommerzielle Zwecke, wie zum Beispiel die vorstehend angeführten, überexprimiert worden ist, wurde durch die Firma Ajinomoto mit Bakterien (Streptoverticillium sp.) ausgeführt, die das Verfahren und die anschließenden verschiedenen Verbesserungen dieses anfänglichen Protokolls patentierte (
US-5,156,956 „Transglutaminase" (1992)). Auf ähnliche Weise hat diese gleiche Firma ein anderes, ähnliches System patentiert, aber durch eine Transformation von Crassostrea gigas (US-5,736,356 „Trans glutaminase originating from Crassostrea gigas (1998)) und von Bacillus subtilis (US-5,948,662 „Bacillus-derived transglutaminase" (1999)). - Über die letzten Jahre hin hat die Forschungsgruppe, die Autor der vorliegenden Erfindung ist, auf ähnliche Weise vorherige Untersuchungen auf biochemischer Ebene über die Beteiligung von TGase an der Morphogenese von Maiscalli und ihre Beziehung zu Licht durchgeführt (Bernet, E., Claparols, I., Dondini, L., Santos, M. A., Serafini-Fracassini, D. & Torné, J. Ma. 1999. Changes in polyamine content, arginine and ornithine decarboxylases and transglutaminase activities during light/dark phases (of initial differentiation) in maize calluses and their chloroplast. Plant Physio Biochem. 37(12): 899–909). Außerdem ist die Immunlokalisierung dieses Enzyms in verschiedenen Maiszellsystemen in Beziehung zur Entwicklung von Chloroplasten kürzlich publiziert worden (Villalobos, E. Torné, J. M., Ollés, C., Claparols, I. & Santos, M. A. 2001, Subcellular localization of a transglutaminase related to grana development in different maize cell types. Protoplasma. 216: 155–163). Es sind jedoch keine Ergebnisse zur molekularen Identifizierung und funktionellen Aktivität von pflanzlichen Transglutaminasen gefunden worden, deshalb sind neue Erkenntnisse über die Transglutaminasen von höchstem kommerziellem Interesse.
- BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Kurze Beschreibung
- Die Erfindung steht vor dem mit der Seltenheit der aus Pflanzen stammenden TGase, die auf dem Gebiet der Nahrungsmittelbearbeitung und -umwandlung und bei der Entwicklung transgener Pflanzen mit neuen Fähigkeiten benötigt wird, zusammenhängenden Problem.
- Die durch dieses Erfindung bereitgestellte Lösung beruht auf der Tatsache, dass die Erfinder einige DNA-Sequenzen mit TGase-Aktivität (TGase; EC 2.3.2.13) aus Mais identifiziert haben. Die TGase-Aktivität von Proteinen, die durch die DNA-Sequenzen kodiert werden, ist bei Experimenten mit Extrakten dieser Proteine klar geworden.
- Deshalb handelt es sich bei einer Aufgabe dieser Erfindung um die DNA-Moleküle.
- Bei einer anderen, zusätzlichen Aufgabe dieser Erfindung handelt es sich um einen Vektor, der mindestens eines der DNA-Moleküle umfasst.
- Eine andere, zusätzliche Aufgabe dieser Erfindung umfasst die Verwendung der DNA-Moleküle oder der Vektoren, um transformierte Zellen herzustellen, die fähig sind, rekombinante Proteine mit TGase-Aktivität zu exprimieren, oder diese kodierende Sequenz eines Proteins mit TGase-Aktivität in pflanzliche Zellen einzuführen. Die Zeilen von Mikroorganismen und die so erhaltenen transgenen Pflanzen machen auch zusätzliche Aufgaben dieser Erfindung aus.
- Bei einer anderen, zusätzlichen Aufgabe der vorliegenden Erfindung handelt es sich um die Proteine mit TGase-Aktivität, die von den DNA-Sequenzen aus exprimiert werden, und deren Verwendung bei der Nahrungsmittelbearbeitung und -umwandlung.
- Ausführliche Beschreibung der Erfindung
- Die Erfindung stellt ein DNA-Molekül, hierin nachstehend erfindungsgemäßes DNA-Molekül, bereit, das aus Pflanzen stammt und ein Protein mit TGase-Aktivität kodiert, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:
- a) der als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder einem Fragment davon identifizierten Nucleotidsequenz und
- b) einer Nucleotidsequenz, die der in a) definierten Sequenz ähnlich ist.
- In dem in dieser Beschreibung verwendeten Sinn soll der Begriff „ähnlich" jede DNA-Sequenz einschließen, die, zum Beispiel durch Einführen konservativer oder nicht konservativer Nucleotidsubstitutionen, einschließlich der Einfügung von einem oder mehreren Nucleotiden, dem Hinzufügen von einem oder mehreren Nucleotiden an einem der Enden des Moleküls oder der Deletion von einem oder mehreren Nucleotiden an einem Ende oder innerhalb der Sequenz, auf der Grundlage der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigten Nucleotidsequenz isoliert oder hergestellt werden kann.
- Im Allgemeinen ist ein ähnliches DNA-Molekül im Wesentlichen homolog zu der als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 identifizierten Nucleotidsequenz. In dem in dieser Beschreibung verwendeten Sinn bedeutet der Ausdruck „im Wesentlichen homolog", dass die fraglichen Nucleotidsequenzen auf der Nucleotidebene einen Identitätsgrad von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 85% oder stärker bevorzugt von mindestens 95% aufweisen.
- Das erfindungsgemäße DNA-Molekül stammt aus Mais und kann in ähnlicher Form in anderen Arten höherer Pflanzen, unter anderem Reis, Weizen, Arabidopsis, usw. gefunden werden, wobei sie in natürlicher Form vorliegen können oder andernfalls auch das Ergebnis eines Gentransformationsverfahrens sein können, wobei der transformierte Organismus die DNA-Moleküle reproduziert. Das erfindungsgemäße DNA-Molekül kann durch herkömmliche Techniken aus der DNA jeder Pflanze, die es enthält, durch die Ver wendung von Sonden oder Oligonucleotiden isoliert werden, die dank der in dieser Erfindung bereitgestellten Nucleotidsequenzinformation des DNA-Moleküls hergestellt werden.
- Das erfindungsgemäße DNA-Molekül schließt Fragmente davon ein, welche die TGase-Aktivität aufweisen.
- In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen DNA-Molekül um ein DNA-Molekül von Mais mit der SEQ ID NO: 1 oder mit der SEQ ID NO: 3.
- Das erfindungsgemäße DNA-Molekül kann im Allgemeinen bei der Erzeugung eines Expressionsvektors, hierin nachstehend erfindungsgemäßen Expressionsvektors, verwendet werden, der eine Expression dieser Proteine mit TGase-Aktivität in einer großen Auswahl von Wirtszellen gestattet. Im Allgemeinen umfasst der erfindungsgemäße Expressionsvektor mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz und mindestens einen Promotor, der die Transkription des Gens von Interesse steuert, mit dem er funktionell verbunden ist, und andere Sequenzen, die zur Transkription des Gens von Interesse und seiner geeigneten Regulation bezüglich Zeit und Ort notwendig und angemessen sind, zum Beispiel Signale zum Anfangen und zur Termination, Schnittstellen, Polyadenylierungsstellen, einen Replikationsursprung, transkriptionelle Enhancer, transkriptionelle Silencer usw. Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können in Übereinstimmung mit den Bedingungen und dem Bedarf jedes spezifischen Falles unter Plasmiden, künstlichen Hefechromosomen (YACs), künstlichen Bakterienchromosomen (BACs), künstlichen Chromosomen, die auf dem Bakteriophagen P1 beruhen (PACs), Cosmiden oder Viren ausgewählt werden, die auch einen bakteriellen oder Hefe-Replikationsursprung enthalten können, so dass er in Bakterien oder Hefen amplifiziert werden kann, sowie einen Marker, der verwendet werden kann, um transfizierte Zellen zu selektieren, bei dem es sich um einen anderen als das Gen oder die Gene von Interesse handelt. Deshalb bezieht sich die Erfindung auch auf einen Vektor, der ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül umfasst. Die Auswahl des Vektors hängt von der Wirtszelle ab, in die der Vektor später eingeführt wird. Zum Beispiel kann es sich bei dem Vektor, in den die DNA-Sequenz eingeführt wird, um ein Plasmid handeln, dass, wenn es in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom der Zelle integriert und zusammen mit dem Chromosom der Wirtszelle repliziert wird.
- Der erfindungsgemäße Vektor kann durch herkömmliche, Fachleuten bekannte Verfahren erhalten werden (Kovesdi et al. 1997. Curr Opin Biotech 8: 583–589. Transgenic Res. 10: 83–103; Coffin et al. 1998. Retroviruses, CSHLP; Robbins et al. 1998. Trends Biotech. 16: 35–40; Anderson. 1998. Nature 392: 25–30; Schindelhauer. 1999. BioEssays 21: 76–83). Eine besondere Aufgabe der Erfindung umfasst die Plamide pGEMT15 und pGEMT21, welche die SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO: 3 enthalten.
- Die Erfindung stellt auch eine Zelle bereit, die ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor umfasst. Bei Wirtszellen, die mit dem Expressionsvektor transformiert werden können, kann es sich zum Beispiel um GRAS-Bakterienzellen und -Hefen handeln. Die Zellen, die den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthalten können zur Überproduktion von Proteinen mit TGase-Aktivität verwendet werden, die durch die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle kodiert werden. Eine besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist unter anderem ein Protein, das TGase-Aktivität aufweist, mit einer wie in SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 beschriebenen Aminosäuresequenz.
- Diese Ergebnisse gestatten die Erzeugung neuer Möglichkeiten, um ein GRAS (Generally Recognized as Safe) Bakteriensystem oder eine Hefe zu transformieren, die nützlich sein würden, um durch heterologe Expression die angeführten neuen TGase-Proteine herzustellen. Wie vorstehend angegeben wurde, kann ein Protein mit TGase-Aktivität dank seiner Fähigkeit, kovalente Bindungen zwischen verschiedenen Proteinen zu erzeugen, in vielfachen Nahrungsmittelbearbeitungs-, -verarbeitungs und -umwandlungsverfahren verwendet werden. Dieses Kennzeichen ist zum Beispiel verwendet worden, um die Struktur von Nahrungsmitteln wie zum Beispiel Fisch und Fleisch zu erhalten, was den Bedarf, Salze zu verwenden, verringert, siehe US-Patent
US 5928689 „Method for treating PSE meat with transglutaminase",WO 0162888 US 6342256 „Tofu products excellent in freeze resistance and process for producing the same",US-6042851 „Process for producing packed tofu". Es ist auch möglich, die Konsistenz, Elastizität, Feuchtigkeit oder Viskosität eines Produktes bei verschiedenen Temperaturen zu erhalten. Auf ähnliche Weise wird es in verschiedenen in einer Molkerei verarbeiteten Nahrungsmitteln verwendet: Käse (US-6270814 „Incorporation of whey into process cheese", AnmeldungUS 20010053398 „Cheese whey Protein having improved texture process for producing the same and use thereof"), Joghurt, Speiseeis, Mayonnaise, Saucen und beim Herstellen von Nudeln (EP-0948905 „Enzyme preparations comprising transglutaminase and process for producing noodles",US-6106887 „Process for obtaining a modified cereal flour), für Schokolade (US-6063408 "Process for producing chocolate"), für Produkte, die von Kartoffeln abgeleitet sind (US-Anmeldung 20020004085 „Methods for producing potato products"), von Zucker (JP 200354498 - Schließlich gibt es andere Verwendungen, die sich von denjenigen der erfindungsgemäßen Proteine mit TGase-Aktivität, die vorstehend kommentiert wurden, unterscheiden, und von denjenigen, die als eine Veranschaulichung der Verwendungen angegeben werden, gibt es die folgenden Patente, unter anderem: „Method for enzymatic treatment of wool"
US-Patentanmeldung Nr. 161824 (1998) MacDevitt et al., April 2000; „Enzymatically Protein encapsulating oil particles by complex coacervation" Anmeldung Nr.791953 (1997). Soper, Jon C. et al. März 2000; „Crosslinked gelatin gels and method of making them" Anmeldung Nr.641463 (1996). Bishop, P. D. et al. ZymoGenetics, Inc. (Seattle, EA, USA); „Process for obtaining a modified cereal flour" Anmeldung Nr.977575 Ajinomoto Co. Inc. (Tokyo, Japan). Yamazaki et al. August 2000; „Microbial transglutaminase, their production and use" Anmeldung Nr.294565 (1999). NovoNordisk NS (Bagsvaerd, DK) Bech et al. Feb. 2001. - Außerdem kann das erfindungsgemäße DNA-Molekül oder der erfindungsgemäße Expressionsvektor bei genetischen Transformationsverfahren für Pflanzen zur Grundlagenforschung sowie zur Entwicklung transgener Pflanzen mit neuen Fähigkeiten verwendet werden, die durch die Manipulation von Funktionen, die der TGase zugeschrieben werden (Pflanzenwachstum und -entwicklung, Morphogenese, Photosynthese und Zelltod), durch Ändern der Expression der Proteine hergestellt werden.
- BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
-
1 . – TGase-Aktivität (gemessen in pmol eingebautes Put) eines Proteinextrakts, der jedem der Produkte einer Phagenlyse entspricht, die im Methodikteil beschrieben wird, den positiven Phagen f1 und f2 (die jeweils eine andere cDNA für Mais-TGase enthalten: f1 = SEQ ID NO: 1 und f2 = SEQ ID NO: 3) und dem negativen Phagen f3 (der keine cDNA für TGase enthält) entsprechend. Außerdem wird die Wirkung von verschiedenen Faktoren, welche die TGase-Aktivität der Extrakte beeinflussen, die in anderen System als der enzymatischen TGase-Aktivität innewohnend beschrieben werden, gezeigt: Calcium = der Proteinextrakt in Abwesenheit von Calcium. GTP = Zugabe von 1 mM GTP. MDC = Zugabe von 1 mM MDC. -
2 . – Aktivität der beiden Proteinextrakte, die den beiden unabhängigen Phagen entsprechen, welche die beiden cDNAs für TGase enthalten (f1 = SEQ ID NO: 1; f2 = SEQ ID NO: 2) mit Bezug auf einen Phagen, der keine dieser cDNAs enthält (f3), mit Bezug auf die Proteinmenge des Tests. Die Aktivität wird in Millieinheiten (mU) TGase gemessen, indem Biotincadaverin eingeschlossen wird, wie im Methodikteil beschrieben ist. a = 40 mg Protein/ml. b = 60 mg Protein/ml. c = 80 mg Protein/ml. - BEISPIELE DER ERFINDUNG
- Beispiel 1. – Isolieren und Klonieren von zwei cDNAs, die zwei Proteine der Familie von Mais-Transglutaminasen kodieren, mittels Immunoscreening
- Expressionsbank
- Die cDNAs der vorliegenden Erfindung wurden aus einer cDNA-Expressionsbank in Lambda-ZAPII® isoliert, die aus EcoRI und XhoI-Zielmolekülen hergestellt wurde, beginnend mit einer messenger-RNA von zwei Wochen alten Zea mays subsp. mays Pflänzchen, wachsend als Homozygot B73, die man unter Gewächshausbedingungen wachsen ließ (geschenkt von Dr. Alice Barkan von der University of Oregon, USA).
- Beim Immunoscreening verwendeter Antikörper
- Eine pflanzliche Transglutaminase mit 58 kDa, die mit Extrakten von Chloroplasten aus Helianthus tuberosus Blättern gereinigt wurde, wurde als Antigen verwendet. Ein polyklonaler Antikörper wurde in einem Huhn erhalten (Villalobos, E., Torné, J. M., Ollés, C., Claparols, I. & Santos, M. A. 2001. Subcellular localization of a transglutaminase related to grana development in different maize cell types. Protoplasma. 216: 155–163). Die Spezifität des Antikörpers wurde durch die Dot-Blot-Technik unter Verwendung von kommerzieller Schweineleber-Transglutaminase, sowie durch Western-Blot mit gereinigtem Protein bestimmt (Dondini, L. 1998. „Poliammine legate e transglutaminasi nelle plante" Doktorarbeit. Universität Bologna, Italien). Eine Titration wurde durch die Western-Blot-Technik ausgeführt. (Die vollständige Methodik wird ausführlich spezifiziert in Villalobos, E., Torné, J. M., Ollés, C., Claparols, I. & Santos, M. A. 2001. Subcellular localization of a transglutaminase related to grana development in different maize cell types. Protoplasma. 216: 155–163)
- Immunoscreening der Bank
- Sobald der Titer der verwendeten Bank bekannt ist, wird eine Kolonie des Stammes XL-Blue® in flüssiges LG-Medium, das MgSO4 (1 M) und 20% Maltose enthält, angeimpft.
- Nachdem man die Bakterien wachsen lässt, bis eine OD von 2,0 (600 nm) erreicht ist, wird ein Gemisch der Bakterienkultur mit 4,5 × 104 pfu der Bank hergestellt, zu dem 10 mM IPTG zugegeben wird. Nach dem Infizieren und Animpfen von Petrischalen mit dem LB-Kulturmedium + 10 mM MgSO4 wird eine mit 10 mM IPTG gesättigte Nitrocellulosescheibe über sie gelegt. Nach 4 Stunden langem Inkubieren der Petrischalen mit dem Filter werden sie gekühlt und der Filter wird mit PBS gewaschen. Schließlich wird die Membran, sobald sie mit fettarmer Milch oder BSA blockiert worden ist, mit einem Antikörper entwickelt und markiert. Um Lyse nachzuweisen, wo die positiven Phagen, die mit dem gegen H. tuberosus Transglutaminase gerichteten Antikörper in Wechselwirkung getreten sind, gefunden werden, wird eine Western-Blot-Analyse der Membran durchgeführt und sie wird durch das ECL-Reagens auf einer photographischen Platte entwickelt.
- In-vivo-Exzision von Phagemids in pBluescript SK- und Selektion positiver Kolonien
- Sobald die beiden Phagen, welche die cDNAs enthalten, die jeweils ein Protein kodieren, das mit dem Antikörper in Wechselwirkung tritt, isoliert und gereinigt worden sind, werden sie dann durch den „ExAssistTM Interference-Resistant Helper Phage (Stratagene)" ausgeschnitten. Das Koinfizieren wird in XL1-Blue-Stämmen durchgeführt, und das Infizieren wird in XLOLR®-Stämmen durchgeführt. Ausplattieren wird in einem selektiven Medium durchgeführt, das der verwendete Vektor bestimmt (pBluescript). In unserem Fall handelt es sich bei dem Kulturmedium, das transformierende Kolonien auswählt um LB-Agar, zu dem Ampizillin (50 μg/ml), 1 mM IPTG und das Substrat des Enzyms β-Galactosidase, X-Gal (40 μg/ml), dessen Gen durch das Insert oder die cDNA unterbrochen wird, gegeben wird.
- Isolierung von Plasmiden in kleinem Maßstab (MINIPREP)
- Für jede Exzision wird die Isolierung der Plasmid-DNA, welche die cDNA von Interesse enthält, durch eine MINIPREP-Technik bakterieller Lyse in kleinem Maßstab unter Verwendung von SDS und NaOH, Neutralisieren mit Kaliumacetat und Reinigen mit einem Gemisch aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und Präzipitieren mit Ethanol ausgeführt. Dann wird sie mit 1 × TE-Puffer resuspendiert, der mit dem RNAse-Enzym zugegeben wird.
- Überprüfen der Anwesenheit von cDNA im pBluescript-Vektor
- In jedem Fall wird das Überprüfen der Anwesenheit des Inserts in pBluescript durch Verdauen einer Probe der Plasmid-DNA durchgeführt, die mit den gleichen Endonucleaseenzymen erhalten wird, mit denen die Bank hergestellt wurde (EcoRI und XhoI). Verdauen wird gemäß den Erfordernissen jedes Restriktionsenzyms (Puffer und Temperatur) durchgeführt. Sobald das Verdauen ausgeführt worden ist, wird die cDNA oder das Insert aus dem Vektor freigesetzt. Dies wird mit herkömmlicher Elektrophorese in einem 0,5%igen Agarosegel in 1 × TBE- oder 1 × TAE-Puffer überprüft.
- Sequenzierung (Sequenzierservice des IBMB, „CSIC" von Barcelona)
- Sobald die Proben der Minipräparate, welche die cDNAs von Interesse enthalten, identifiziert worden sind, was in unserem Falle ergab, dass es zwei waren, werden sie präzipitiert und vor dem Sequenzierverfahren durch Verwendung des Gemisches von Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol und reinem Chloroform gereinigt. Die zu sequenzierenden Proben wurden in Wasser aufgelöst.
- Bestimmung der vollständigen kodierenden Sequenz durch die RACE-Technik
- Die Exzisionen der beiden Phagen in pBluescript SK- machten es möglich, zwei partielle cDNAs zu erhalten, deren vollständige kodierende Sequenz durch die RACE-Technik definiert wurde. Zu diesem Zweck wird aus der aus dem Maisblatt entnommenen Gesamt-RNA durch eine polydT-Säule gereinigte messenger-RNA erhalten, die als Matrize für die Synthese einzelsträngiger DNA verwendet wird. Um dies zu tun, wird ein spezifisches, aus der bekannten cDNA-Sequenz abgeleitetes Oligonucleotid (Oligo E1, 3'-5': GATTCTCCCTGATAAG, SEQ ID NO: 5) und das Enzym reverse Transkriptase verwendet. Nach Zufügen eines polyT-Schwanzes an die einzelsträngige DNA durch das Enzym terminale Desoxytransferase (TdT) wurde dann die zweite DNA-Kette erhalten. Dies wird durch die PCR-Technik unter Verwendung des Oligonucleotids 5' RACE Abridged Anchor Primer (GIBCO BRL®), das für DNA mit einem polyT-Schwanz spezifisch ist (Oligo ANCHOR 5'-3': GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG, SEQ ID NO: 6) und eines zweiten spezifischen Oligonucleotids der partiellen cDNA mit der vorstehend spezifizierten bekannten Sequenz, die dem Oligo E2 (3'-5': GTTCTCCAGCATCTCCAG, SEQ ID NO: 7) entspricht, durchgeführt.
- Mit den anschließenden PCR-Zyklen wird die DNA vermehrt. Die Abfolge der Zyklen war die Folgende: zuerst 2 Minuten bei 94°C und dann 34 Zyklen von: 30 Sekunden bei 94°C für Oligo Nr. 1, aber 30 Sekunden bei 60°C für Oligo Nr. 2, gefolgt in beiden Fällen durch 7 Minuten bei 72°C. Schließlich wird sie einige Stunden lang bei 5°C gelassen.
- Das PCR-Produkt wird unter Verwendung des Enzyms Ligase in einen geeigneten Vektor (wie zum Beispiel pGEMT) kloniert. Dann werden E. coli-Stämme des Typs DH5-alpha transformiert und man lässt die Bakterien in einem selektiven Kulturmedium wachsen. Die Plasmid-DNA wird durch die vorstehend beschriebene Miniprep-Technik entnommen, gereinigt, und das erhaltene Fragment wird sequenziert. In unserem Fall erwies sich, dass das Fragment, das zum Vervollständigen der kodierenden Sequenz benötigt wurde, für beide partielle cDNA-Sequenzen nur 4 Nucleotide lang war. Die vollständigen kodierenden Nucleotidsequenzen, einschließlich der vier Nucleotide, die durch die RACE-Technik erhalten wurden, werden in SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO: 3 beschrieben. Bei den Expressionsvektoren, welche die Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 enthalten und zum Transformieren der Wirtszellen verwendet werden, handelt es sich um die Plasmide pGEMT15 beziehungsweise pGEMT21.
- Die von den Nucleotidsequenzen erhaltenen Aminosäuresequenzen haben im Bereich, der den Aminosäuren 431–474 für das Protein von SEQ ID NO: 2 (60,97 kDa) und 485–528 für das Protein von SEQ ID NO: 4 (67 kDa) entspricht, Homologien zu den Domänen des aktiven Zentrums des Transglutaminase-Typs von anderen beschriebenen, nicht pflanzlichen Systemen. In beiden Fällen wird ein Cystein (Cys), das als unentbehrliche Aminosäure für die Aktivität des Enzyms beschrieben wird (Cys439 in SEQ ID NO: 2 und Cys493 in SEQ ID NO: 4), in diesen Bereichen gefunden. Konsultierte Datenbank: (www.ncbi.nlm.nih/). Außerdem werden einige Regionen von 27 Nucleotiden, die in beiden Sequenzen, SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3, in Tandem wiederholt werden, beobachtet, wie in den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 angegeben wird, obwohl in verschiedenen Mengen, von 15 beziehungsweise 21 Wiederholungen, und mit kleinen Variationen der Nucleotide bei einigen von ihnen. Es sollte betont werden, dass diese angeführten wiederholten Regionen in bekannten TGasen vorher nicht beschrieben worden sind. Deshalb sind sie kennzeichnend für das erfindungsgemäße DNA-Molekül.
- Beispiel 2. – Überprüfen der Transglutaminaseaktivität der durch die cDNAs exprimierten Proteine.
- Bestimmung der TGase-Aktivität des durch die cDNA exprimierten Proteins
- Mit jedem der beiden Klone der Phagen, welche die cDNAs von Interesse enthalten, wird eine E. coli-Kultur (Stamm XL-Blue) in flüssigem LB-Kulturmedium infiziert, zu dem 10 mM IPTG gegeben werden. Nach einer Lyse bei 37°C wird die Gesamtproteinkonzentration des Extrakts durch das Lowry-Verfahren quantifiziert (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr, AL & Randall RJ. 1951. Protein measurement with the Folin Phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265–275) und die hierin nachstehend beschriebenen Tests werden damit ausgeführt, um die Transglutaminaseaktivität im Gegensatz zu einem Lyseextrakt mit einem Phagen, der die cDNA von Interesse nicht enthält, zu bestimmen.
- 1. – Verfahren zum Nachweisen von TGase-Aktivität durch Bestimmen der mit tritiiertem Putrescin markierten Proteine
- Mit jedem der Lyseextrakte, die mit beiden Phagen (f1, der die TGase von SEQ ID NO: 2 enthält, und f2, der die TGase von SEQ ID NO: 4 enthält) erhalten werden, wird ein Enzymextrakt in einer Gesamtproteinkonzentration von 600 μg hergestellt, und ein Enzymtest wird 30 Minuten lang bei 30°C ausgeführt. Das Enzymgemisch enthält, neben dem Proteinextrakt, 0,6 mM Putrescin, 185 kBq tritiiertes Putrescin (0,85 TBq/nmol), 20 mM Tris- HCl*, pH-Wert 8 und 3 mM CaCl2. Die Reaktion wird mit 10% Trichloressigsäure, die 2 mM Putrescin enthält, blockiert. Die Proben werden mehrmals präzipitiert und die Radioaktivität des Pellets wird gemessen (Bernet, E., Claparols, L., Dondini, L., Santos, M.A., Serafini-Fracassini, D.- & Torné, J. Ma 1999: Changes in polyamine content, arginine and ornithine decarboxylases and transglutaminase activities during light/dark phases (of initial differentiation) in maize calluses and their chloroplast. Plant Physio Biochem. 37(12): 899–909). Die TGase-Aktivität wird in pmol Putrescin pro Milligramm Protein pro Stunde gemessen, und sie war in Bezug auf den Extrakt von einem Phagen, der keine cDNAs für diese TGase enthält, in den Proteinextrakten, die von den Phagen f1 und f2 erhalten wurden, höher.
- 2. Verfahren zum Nachweisen von TGase-Aktivität durch einen Test des Elisa- Typs unter Verwendung von CBZ-Gln-Gly als erstem Substrat und Biotincadaverin als zweitem Substrat.
- Dieser Test besteht aus einem Kit, das von der Firma Covalab® bereitgestellt wird, das aus kleinen Mengen Gesamtprotein die TGase-Aktivität der Probe in Bezug auf eine kommerzielle Schweineleber-TGase bestimmt. Das Verfahren weist die Glutamylderivate, die von dem Peptid und von dem Polyaminsubstrat durch TGase-Aktivität der Probe gebildet werden, durch einen kolorimetrischen Test nach. Die Aktivität wird in TGase-Einheiten gemessen, wobei man berücksichtig, das 0,6 mU kommerzielle TGase einer Absorption von 1 ± 0,05 OD bei 450 nm entspricht.
- Die beiden Proteinextrakte, die den beiden Lyseprodukten entsprechen, zeigen eine Aktivität des TGase-Typs in den beiden Verfahren, die zum Nachweisen der Aktivität verwendet und vorstehend beschrieben wurden (f1 und f2) im Vergleich zu dem Extrakt, der von einem Phagen stammt, der keine dieser cDNAs enthält. Die Ergebnisse werden in den
1 und2 gezeigt. - Außerdem zeigt
1 die Wirkung verschiedener Faktoren auf die TGase-Aktivität der Extrakte, die als der TGase-Enzymaktivität innewohnend beschrieben wird. Daher verringert sich die Aktivität des exprimierten Proteins signifikant: a] in Abwesenheit von Calcium, b] in Anwesenheit von 1 mM GTP, c] in Anwesenheit von 1 mM Denodansylcadaverin (MDC) und d] im Lyseextrakt mit einem Phagen, der die cDNA von Interesse nicht hat (f3). - Ein Paar Kulturen der von Escherichia coli, Typ DH5α, abgeleiteten Bakterien, transformiert mit einem Plasmid (pBluescript), das eine Mais-cDNA enthält, und Trägern eines Plasmids, welches das Gen enthält, welches das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 beziehungsweise SEQ ID NO: 4 von Mais, identifiziert als 15TGZM02 und 21TGZM02 kodiert, sind bei der Spanischen Typus-Kultursammlung („Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)"), Universität Valencia, Forschungsgebäude, Burjasot Campus, 46100 Burjasot, Valencia, Spanien, am 7. (?) Mai 2002 hinterlegt worden. Die ihnen zugeteilte „CECT"-Hinterlegungsnummer: 5705 für 15TGZM02 beziehungsweise 5706 für 21TGZM02. SEQUENZPROTOKOLL
Claims (12)
- Nucleotidsequenz, die ein Protein mit TGase-Aktivität kodiert, gekennzeichnet dadurch, dass sie aus der Gruppe, bestehend aus a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und einem Fragment davon b) einer Nucleotidsequenz mit einem Identitätsgrad auf der Nucleotidebene von mindestens 60% zu einer der in a) definierten Sequenzen, ausgewählt ist.
- Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass sie aus Mais stammt.
- Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass es sich um eine Nucleotidsequenz mit einem Identitätsgrad auf der Nucleotidebene von mindestens 85% handelt, und dadurch, dass sie ein Protein mit TGase-Aktivität kodiert.
- Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass es sich um eine Nucleotidsequenz mit einem Identitätsgrad auf der Nucleotidebene von mindestens 95% handelt, und dadurch, dass sie in Protein mit TGase-Aktivität kodiert.
- Expressionsvektor, gekennzeichnet dadurch, dass er eine Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
- Expressionsvektor gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass er unter anderem zu der folgenden Gruppe gehört: die Plasmide pGEMT15 und pGEMT21.
- Protein mit TGase-Aktivität, gekennzeichnet dadurch, dass es durch eine Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert wird.
- Protein mit TGase-Aktivität gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, dass es unter anderem zu der folgenden Gruppe gehört: SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4.
- Transformierte Zelle, gekennzeichnet dadurch, dass sie einen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 5 und 6 enthält, und dadurch, dass sie die Expression von Proteinen mit TGase-Aktivität gestattet, unter anderem die E. coli-Stämme, die bei „CECT" als 5705 und 5706 hinterlegt sind.
- Verwendung der transformierten Zelle gemäß Anspruch 9 in Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins mit TGase-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 7 und 8.
- Verwendung des Proteins mit TGase-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 7 und 8 bei der Nahrungsmittelbearbeitung, -verarbeitung und -umwandlung, unter anderem bei Verfahren, um die Struktur, Konsistenz, Elastizität, Feuchtigkeit oder Viskosität von Nahrungsmitteln wie Fisch, Käse, Joghurt, Speiseeis, Mayonnaise und Fleisch zu erhalten oder zu verbessern, zur Formulierung von Gelatine mit einer anderen Dichte und zum Herstellen vorgekochter Nahrungsmittel mit weniger Fett.
- Verwendung der Expressionsvektoren gemäß einem der Ansprüche 5 und 6 bei der Entwicklung transgener Pflanzen mit neuen Fähigkeiten, die durch die Manipulation der Funktionen, die der TGase zugeschrieben werden, verursacht werden, unter anderem Wachstum und Entwicklung der Pflanze, Morphogenese, Photosynthese und Zelltod.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200201253 | 2002-05-31 | ||
| ES200201253A ES2223227B1 (es) | 2002-05-31 | 2002-05-31 | Secuencia de nucleotidos de maiz codificante de una proteina con actividad transglutaminasa, y su uso. |
| PCT/ES2003/000247 WO2003102128A1 (es) | 2002-05-31 | 2003-05-23 | Secuencia de nucleotidos de maiz codificante de una proteina con actividad transglutaminasa, y su uso |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE60313469D1 DE60313469D1 (de) | 2007-06-06 |
| DE60313469T2 true DE60313469T2 (de) | 2008-01-03 |
Family
ID=29595112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE60313469T Expired - Fee Related DE60313469T2 (de) | 2002-05-31 | 2003-05-23 | Für ein protein mit transglutaminaseaktivität kodierende nukleotidsequenz aus mais und verwendung davon |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7262057B2 (de) |
| EP (1) | EP1535992B1 (de) |
| JP (1) | JP2005528104A (de) |
| CN (1) | CN1329515C (de) |
| AT (1) | ATE360681T1 (de) |
| AU (1) | AU2003227778A1 (de) |
| DE (1) | DE60313469T2 (de) |
| ES (2) | ES2223227B1 (de) |
| MX (1) | MXPA04011918A (de) |
| WO (1) | WO2003102128A1 (de) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITBO20020714A1 (it) * | 2002-11-13 | 2004-05-14 | Plantechno Srl | Farine ad uso alimentare con specifiche caratteristiche tecnologiche a bassa allergenicita'. |
| WO2009156360A1 (en) | 2008-06-26 | 2009-12-30 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0665280B2 (ja) | 1987-03-04 | 1994-08-24 | 味の素株式会社 | タンパクゲル化剤及びそれを用いるタンパクのゲル化方法 |
| EP0555649B1 (de) * | 1992-01-14 | 2004-12-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Gen, das für eine Fisch-Transglutaminase kodiert |
| WO1994010296A1 (en) | 1992-11-03 | 1994-05-11 | Oklahoma Medical Research Foundation | Transglutaminase gene |
| US5549904A (en) | 1993-06-03 | 1996-08-27 | Orthogene, Inc. | Biological adhesive composition and method of promoting adhesion between tissue surfaces |
| EP0693556B1 (de) * | 1994-01-28 | 2004-10-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Transglutominase aus japanischer auster |
| JP3720363B2 (ja) | 1994-08-26 | 2005-11-24 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 微生物のトランスグルタミナーゼ、それらの産生及び使用 |
| JP3669390B2 (ja) | 1995-02-09 | 2005-07-06 | 味の素株式会社 | バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ |
| CN1230529C (zh) * | 1995-02-09 | 2005-12-07 | 味之素株式会社 | 杆菌衍生的转谷氨酰胺酶 |
| JP3637718B2 (ja) | 1996-04-10 | 2005-04-13 | 味の素株式会社 | チョコレートの製造方法 |
| US5834232A (en) | 1996-05-01 | 1998-11-10 | Zymogenetics, Inc. | Cross-linked gelatin gels and methods of making them |
| US5928689A (en) | 1996-06-05 | 1999-07-27 | Kraft Foods, Inc. | Method for treating PSE meat with transglutaminase |
| JP3582265B2 (ja) | 1996-11-28 | 2004-10-27 | 味の素株式会社 | 改質穀粉及びこれを使用した穀粉加工食品 |
| US6039901A (en) | 1997-01-31 | 2000-03-21 | Givaudan Roure Flavors Corporation | Enzymatically protein encapsulating oil particles by complex coacervation |
| DK0889133T3 (da) * | 1997-07-04 | 2004-04-13 | Ajinomoto Kk | Proces til frembringelse af mikrobiel transglutaminase |
| US6042851A (en) | 1997-12-03 | 2000-03-28 | Kikkoman Corporation | Process for producing packed tofu |
| JP3867261B2 (ja) | 1998-04-08 | 2007-01-10 | 味の素株式会社 | 酵素製剤及び麺類の製造方法 |
| TR200003419T2 (tr) | 1998-05-20 | 2001-03-21 | Novo Nordisk Biochem North America, Inc. | Yünün enzimatik işleme tabi tutulması için yöntem |
| JP3733748B2 (ja) | 1998-06-24 | 2006-01-11 | 味の素株式会社 | 食感が改善されたチーズホエイ蛋白、その製造方法及びその利用 |
| US6342256B1 (en) | 1998-10-13 | 2002-01-29 | Fuji Oil Company, Limited | Tofu products excellent in freeze resistance and process for producing the same |
| CN1203173C (zh) * | 1998-12-28 | 2005-05-25 | 味之素株式会社 | 转谷氨酰胺酶的制备方法 |
| US20090087878A9 (en) * | 1999-05-06 | 2009-04-02 | La Rosa Thomas J | Nucleic acid molecules associated with plants |
| US6270814B1 (en) | 1999-06-03 | 2001-08-07 | Kraft Foods, Inc. | Incorporation of whey into process cheese |
| JP2000354498A (ja) | 1999-06-14 | 2000-12-26 | Ajinomoto Co Inc | トランスグルタミナーゼ処理による穀粉原料からの糖類の製造方法 |
| WO2001062888A2 (en) | 2000-02-23 | 2001-08-30 | Hindustan Lever Limited | Improved composition of marine product |
| DE60140385D1 (de) | 2000-04-14 | 2009-12-17 | Novozymes Inc | Pektinase-Behandlung von Kartoffelprodukten |
-
2002
- 2002-05-31 ES ES200201253A patent/ES2223227B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-05-23 ES ES03725225T patent/ES2286430T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-23 DE DE60313469T patent/DE60313469T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-23 CN CNB038175525A patent/CN1329515C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-23 MX MXPA04011918A patent/MXPA04011918A/es active IP Right Grant
- 2003-05-23 JP JP2004510370A patent/JP2005528104A/ja active Pending
- 2003-05-23 WO PCT/ES2003/000247 patent/WO2003102128A1/es active IP Right Grant
- 2003-05-23 EP EP03725225A patent/EP1535992B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-23 AU AU2003227778A patent/AU2003227778A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-23 AT AT03725225T patent/ATE360681T1/de not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-11-30 US US11/000,530 patent/US7262057B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-08-27 US US11/895,752 patent/US20100092606A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE360681T1 (de) | 2007-05-15 |
| ES2286430T3 (es) | 2007-12-01 |
| DE60313469D1 (de) | 2007-06-06 |
| US20100092606A1 (en) | 2010-04-15 |
| AU2003227778A1 (en) | 2003-12-19 |
| ES2223227B1 (es) | 2006-04-16 |
| CN1671846A (zh) | 2005-09-21 |
| US7262057B2 (en) | 2007-08-28 |
| CN1329515C (zh) | 2007-08-01 |
| US20060005266A1 (en) | 2006-01-05 |
| EP1535992B1 (de) | 2007-04-25 |
| EP1535992A1 (de) | 2005-06-01 |
| MXPA04011918A (es) | 2005-03-31 |
| ES2223227A1 (es) | 2005-02-16 |
| WO2003102128A1 (es) | 2003-12-11 |
| JP2005528104A (ja) | 2005-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sachs et al. | Anaerobic gene expression and flooding tolerance in maize | |
| EP0765393B1 (de) | Dna-moleküle, die für einen plastidären 2-oxoglutarat/malat-translokator codieren | |
| DE69533606T2 (de) | Transglutaminase aus japanischer auster | |
| DE69634875T2 (de) | Kälteindusierbare promotorsequenzen | |
| DE69424601T2 (de) | Modifizierter Ölgehalt in Samen | |
| DE69333718T2 (de) | Gen, das für eine Fisch-Transglutaminase kodiert | |
| DE10208132A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Maispflanzen mit erhöhtem Blattstärkegehalt und deren Verwendung zur Herstellung von Maissilage | |
| DE69231588T2 (de) | Verwendung eines gens, das für oxalat oxidase kodiert zur transformation von pflanzen | |
| Brooker et al. | Mechanisms of tannin resistance and detoxification in the rumen | |
| SK148498A3 (en) | Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate | |
| DE19652284A1 (de) | Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung | |
| Hu et al. | Genome-wide identification of citrus ATP-citrate lyase genes and their transcript analysis in fruits reveals their possible role in citrate utilization | |
| CN114745945A (zh) | 通过禁用黑芥子酶/硫代葡萄糖苷系统改变消费作物的风味特征 | |
| DE19502053A1 (de) | Verfahren und DNA-Moleküle zur Steigerung der Photosyntheserate in Pflanzen, sowie Pflanzenzellen und Pflanzen mit gesteigerter Photosyntheserate | |
| EA008669B1 (ru) | Способ увеличения содержания общих или растворимых углеводов или сахаристости эндогенных углеводов путем каталитического превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар | |
| Mirmazloum et al. | Identification of a novel UDP-glycosyltransferase gene from Rhodiola rosea and its expression during biotransformation of upstream precursors in callus culture | |
| DE60313469T2 (de) | Für ein protein mit transglutaminaseaktivität kodierende nukleotidsequenz aus mais und verwendung davon | |
| DE3686007T2 (de) | Gen fuer kornphosphoenolpyruvatcarboxylase. | |
| DE19853778C1 (de) | DNA-Sequenzen kodierend einen Glutamat/Malat-Translokator, Plasmide Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter | |
| CN105671074B (zh) | 一种提高植物甲硫氨酸含量的载体及其构建方法和用途 | |
| DE102004032216A1 (de) | Polypeptide mit Tannase- und/oder Lipase-Aktivität | |
| US20210180036A1 (en) | Recombinant algae having high lipid productivity | |
| Lasseur et al. | Impact of defoliation frequency on regrowth and carbohydrate metabolism in contrasting varieties of Lolium perenne | |
| DE60012451T2 (de) | Mutante Kanamycin-Nukleotidyltransferase und deren Verwendung zum screening thermophiler Bakterien | |
| Sharma et al. | Symbiotic characterization of mutants defective in proline dehydrogenase in Rhizobium sp. Cajanus under drought stress condition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |