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Die
Erfindung betrifft die Identifizierung neuer Proteine mit TGase-Aktivität, die von
Pflanzen stammen, und deren Verwendung auf dem Gebiet der Nahrungsmittelbearbeitung,
-verarbeitung und -umwandlung und bei der Entwicklung transgener
Pflanzen mit neuen Fähigkeiten.
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STAND DER TECHNIK
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Transglutaminasen
(TGase; EC 2.3.13) (R-Glutaminylpeptidaminase-γ-Glutamyltransferase) katalysieren
Amidbindungen zwischen einer primären Aminogruppe eines Polyamins
oder eines Lysins (Aminodonator) und einer γ-Carboxyamidgruppe eines Glutamyls
einiger Proteine (Aminorezeptor) durch eine Zwischenreaktion, bei
der das Enzym durch Reaktion zwischen der γ-Carboxyamidgruppe des Glutamylrestes
des Proteins und einer Sulfhydrylgruppe eines Cysteinrestes des
aktiven Zentrums des Enzyms an das Substrat bindet (Serafini-Fracassini,
D., Del Duca, S. & Beninati,
S. 1995. Plant Transglutaminases. Phytochemistry 40: 355–365). Das
Ergebnis der TGase-Aktivität
ist: a) eine Modifikation der Konfiguration des Proteins selbst
und b) andere ausgedehntere Konfigurationsänderungen als Ergebnis von
Bindungen zwischen dem Protein selbst und zwischen anderen Proteinen,
um Konjugate mit einem hohen Molekulargewicht zu bilden.
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Es
gibt Untersuchungen über
TGasen bei Menschen und auch bei Tieren, Pflanzen, niederen Vertebraten,
einigen Bakterien, Algen und Hefe (Makarova, K. S., Aravind, L. & Koovin, E. V.
1999. A superfamily of archaeal, bacterial and eukaryotic Proteins
homologous to animal transglutaminases. Protein Science 8: 1714–1719; Bergamini,
C. M., Dean, M., Tanfani, F., Ferrari, C. & Scatturin. 1999. Conformational
stability of human erythrocyte transglutaminase: Patterns of thermal
unfolding at acid and alkaline pH. Eur. J. Biochem. 266: 575–582.; Cariello,
L. Ristoratore, F. & Zanitti,
L. 1997. A new transglutaminase-like from ascidian Ciona intestinalis.
FERS Lett 408: 171–176;
Lorand, L. & Conrad.
S. M. 1984. Transglutaminases. Mol Cell Biochem 58: 9–35; Serafini-Fracassini,
D., Del Duca S. & Beninati
S. 1995. Plant Transglutaminases. Phytochemistry 40: 355–365; Tokunaga,
F., Muta, T., Iwanaga, S., Ichinose, A., Davie, EW, Kuma, K. & Miyata, T. 1993.
Limulus hemocyte transglutaminase. cDNA cloning, amino acid sequence
and tissue localization. J Biol Chem 268: 262–268).
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Die
meisten bekannten TGasen sind: der Blutgerinnungsfaktor XIII, bei
dem es sich um ein Plasmaprotein handelt, und TGase K, die an der
Bildung der Stratum corneum Epidermidis beteiligt ist. Andererseits sind
einige der Gene, die für
einige der angeführten
TGasen verantwortlich sind, schon kloniert worden und die Beteiligung
von TGasen an wichtigen Vorgängen
wie zum Beispiel Zelldifferenzierung, Gewebestabilisierung oder
programmiertem Zelltod wird allmählich
bekannt (Ichinose, A., Bottenus, R. E. & Davie 1990. Structure of transglutaminases.
J. of Biol. Chemistry. 265(23): 13411–13414; Bergamini, C. M., Dean,
M., Tanfani, F., Ferrari, C. & Scatturin.
1999. Conformational stability of human erythrocyte transglutaminase:
Patterns of thermal unfolding at acid and alkaline pH. Eur. J. Biochem.
266: 575–582;
Nemes, Z., Marekov, L. N. & Steinert, P.
M. 1999. Involucrin crosslinking by transglutaminase 1. J. of Biol.
Chemistry. 274(16): 11013–11021).
Diese Enzyme scheinen auch an neurodegenerativen Erkrankungen, Tumoren,
Bauchhöhlenerkrankungen
usw. beteiligt zu sein und deshalb handelt es sich bei ihnen um
eine Gruppe sehr interessanter Enzyme bei klinischen Untersuchungen.
In Anbetracht dieser klinischen Untersuchungen gibt es verschiedene
Patente, die sich auf TGasen beziehen:
US 5,736,132 „Method of promoting adhesion
between tissue surfaces" eingereicht
von Orthogene, Inc., 1998;
US-5,726,051 „Transglutaminase
gene" eingereicht
von der Oklahoma Medical Research Foundation, 1998.
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Die
Funktion von pflanzlichen TGasen ist weniger bekannt, obwohl die
ersten Daten über
deren Existenz vor einigen Jahren publiziert wurden (Icekson I. & Apelbaun, A.
1987. Evidences for transglutaminase activity in plant tissue. Plant
Physiol. 84. 972–974;
Serafini-Fracassini
D., Del Duca S., & D'Orazi D. 1988. First evidence
for Polyamine conjugation mediate by an enzyme activity in plants.
Plant Physiol. 87: 757). Untersuchungen an Pflanzen haben sich in
erster Linie auf biochemische Aspekte, die sich auf die Aktivität beziehen, Substrate,
auf die sie wirkt, und Gewebe, in denen sie reichlich vorhanden
ist, konzentriert, aber ihre funktionelle Rolle mit partiellen Daten über ihre
Beteiligung, wie zum Beispiel Wachstum und Entwicklung, Morphogenese
im Allgemeinen, Photosynthese und Zelltod, ist nicht untersucht
worden (Margosiak, S. A., Drama, A., Bruce-Carver, M. R., Gonzalez,
A. P. Louie, D. & Kuehn.
1990. Identification of the large subunit of ribulose 1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase
as a substrate for transglutaminase in Medicago sativa L. (Alfalfa): Plant
Physiol. 92: 88–96;
Del Ducca, S., Tidu, V., Bassi, R., Exposito, C., & Serafini-Fracassini,
D. 1994, Identification of chlorophyll-a/b proteins as substrates
of transglutaminase activity in isolated chloroplasts of Helianthus
tuberosus L. Planta 193: 283–289;
Del Ducca, S., Della Mea, M., Muñoz de Rueda, P. & Serafini-Fracassini,
D. 2000 Factors affecting transglutaminase activity catalyzing Polyamine
conjugation to endogenous substrates in the entire chloroplast.
Plant Physiol Biochem 38: 429–439).
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Außerdem muss
betont werden, dass Transglutaminase für biotechnologische Zwecke
einen Mehrwert hat. Diese neue ergänzende Facette als interessanter
Metabolit stammt von ihrer Fähigkeit,
kovalente Bindungen zwischen verschiedenen Proteinen zu erzeugen.
Diese Eigenschaft ist zum Beispiel verwendet worden, um die Struktur
von Waren wie zum Beispiel Fisch und Fleisch zu erhalten, was den
Bedarf zum Verwenden von Salzen (Surimi usw.) verringert. Zur Formulierung
von Gelatinen mit einer anderen Dichte usw. Zum Herstellen vorgekochter
Nahrungsmittel mit weniger Fett (Tofu). Es ist auch möglich, die
Konsistenz, Elastizität,
Feuchtigkeit oder Viskosität
eines Produkts bei verschiedenen Temperaturen zu erhalten. Auf ähnliche Weise
wird sie bei verschiedenen in einer Molkerei verarbeiteten Nahrungsmitteln
verwendet: Käse,
Joghurt, Speiseeis usw. In einem solchen Maß, dass sie derzeit als ein „Zusatz" bei vielen biologisch
verarbeiteten Nahrungsmitteln verwendet wird, die für diesen
Zweck in den USA empfohlene Dosis beträgt 65 ppm.
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Alle
diese Möglichkeiten
der TGase haben die Erzeugung verschiedener Patente über Verfahren
zur Beschaffung, Verwendung usw. produziert und sie haben aus dieser
Substanz ein kommerzielles Produkt gemacht, wie zum Beispiel diejenigen,
welche die Firma Ajinomoto unter dem Namen Activa TG® vertreibt.
Die Firmen, die das Produkt vermarkten, sind Ajinomoto Co., Inc.
aus Tokio (auch in den USA verbreitet) und Rohm Enzyme aus den USA
(www.skidmore-sales.com/whatsnew/newsletter/summer2001.pdf). In
Spanien ist jedoch keine Firma gefunden worden, die sich der industriellen
Herstellung von TGase verschrieben hat.
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Die
erste TGase, die für
kommerzielle Zwecke, wie zum Beispiel die vorstehend angeführten, überexprimiert
worden ist, wurde durch die Firma Ajinomoto mit Bakterien (Streptoverticillium
sp.) ausgeführt,
die das Verfahren und die anschließenden verschiedenen Verbesserungen
dieses anfänglichen
Protokolls patentierte (
US-5,156,956 „Transglutaminase" (1992)). Auf ähnliche
Weise hat diese gleiche Firma ein anderes, ähnliches System patentiert,
aber durch eine Transformation von Crassostrea gigas (
US-5,736,356 „Trans glutaminase originating
from Crassostrea gigas (1998)) und von Bacillus subtilis (
US-5,948,662 „Bacillus-derived transglutaminase" (1999)).
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Über die
letzten Jahre hin hat die Forschungsgruppe, die Autor der vorliegenden
Erfindung ist, auf ähnliche
Weise vorherige Untersuchungen auf biochemischer Ebene über die
Beteiligung von TGase an der Morphogenese von Maiscalli und ihre
Beziehung zu Licht durchgeführt
(Bernet, E., Claparols, I., Dondini, L., Santos, M. A., Serafini-Fracassini,
D. & Torné, J. Ma. 1999. Changes in polyamine content, arginine
and ornithine decarboxylases and transglutaminase activities during
light/dark phases (of initial differentiation) in maize calluses
and their chloroplast. Plant Physio Biochem. 37(12): 899–909). Außerdem ist
die Immunlokalisierung dieses Enzyms in verschiedenen Maiszellsystemen
in Beziehung zur Entwicklung von Chloroplasten kürzlich publiziert worden (Villalobos,
E. Torné,
J. M., Ollés,
C., Claparols, I. & Santos,
M. A. 2001, Subcellular localization of a transglutaminase related
to grana development in different maize cell types. Protoplasma.
216: 155–163). Es
sind jedoch keine Ergebnisse zur molekularen Identifizierung und
funktionellen Aktivität
von pflanzlichen Transglutaminasen gefunden worden, deshalb sind
neue Erkenntnisse über
die Transglutaminasen von höchstem
kommerziellem Interesse.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Kurze Beschreibung
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Die
Erfindung steht vor dem mit der Seltenheit der aus Pflanzen stammenden
TGase, die auf dem Gebiet der Nahrungsmittelbearbeitung und -umwandlung
und bei der Entwicklung transgener Pflanzen mit neuen Fähigkeiten
benötigt
wird, zusammenhängenden
Problem.
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Die
durch dieses Erfindung bereitgestellte Lösung beruht auf der Tatsache,
dass die Erfinder einige DNA-Sequenzen mit TGase-Aktivität (TGase;
EC 2.3.2.13) aus Mais identifiziert haben. Die TGase-Aktivität von Proteinen,
die durch die DNA-Sequenzen kodiert werden, ist bei Experimenten
mit Extrakten dieser Proteine klar geworden.
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Deshalb
handelt es sich bei einer Aufgabe dieser Erfindung um die DNA-Moleküle.
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Bei
einer anderen, zusätzlichen
Aufgabe dieser Erfindung handelt es sich um einen Vektor, der mindestens
eines der DNA-Moleküle
umfasst.
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Eine
andere, zusätzliche
Aufgabe dieser Erfindung umfasst die Verwendung der DNA-Moleküle oder der
Vektoren, um transformierte Zellen herzustellen, die fähig sind,
rekombinante Proteine mit TGase-Aktivität zu exprimieren, oder diese
kodierende Sequenz eines Proteins mit TGase-Aktivität in pflanzliche
Zellen einzuführen.
Die Zeilen von Mikroorganismen und die so erhaltenen transgenen
Pflanzen machen auch zusätzliche Aufgaben
dieser Erfindung aus.
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Bei
einer anderen, zusätzlichen
Aufgabe der vorliegenden Erfindung handelt es sich um die Proteine mit
TGase-Aktivität,
die von den DNA-Sequenzen aus exprimiert werden, und deren Verwendung
bei der Nahrungsmittelbearbeitung und -umwandlung.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein DNA-Molekül,
hierin nachstehend erfindungsgemäßes DNA-Molekül, bereit, das
aus Pflanzen stammt und ein Protein mit TGase-Aktivität kodiert,
das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:
- a)
der als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder einem Fragment davon identifizierten
Nucleotidsequenz und
- b) einer Nucleotidsequenz, die der in a) definierten Sequenz ähnlich ist.
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In
dem in dieser Beschreibung verwendeten Sinn soll der Begriff „ähnlich" jede DNA-Sequenz einschließen, die,
zum Beispiel durch Einführen
konservativer oder nicht konservativer Nucleotidsubstitutionen, einschließlich der
Einfügung
von einem oder mehreren Nucleotiden, dem Hinzufügen von einem oder mehreren
Nucleotiden an einem der Enden des Moleküls oder der Deletion von einem
oder mehreren Nucleotiden an einem Ende oder innerhalb der Sequenz,
auf der Grundlage der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigten
Nucleotidsequenz isoliert oder hergestellt werden kann.
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Im
Allgemeinen ist ein ähnliches
DNA-Molekül
im Wesentlichen homolog zu der als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:
3 identifizierten Nucleotidsequenz. In dem in dieser Beschreibung
verwendeten Sinn bedeutet der Ausdruck „im Wesentlichen homolog", dass die fraglichen
Nucleotidsequenzen auf der Nucleotidebene einen Identitätsgrad von
mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 85% oder stärker bevorzugt
von mindestens 95% aufweisen.
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Das
erfindungsgemäße DNA-Molekül stammt
aus Mais und kann in ähnlicher
Form in anderen Arten höherer
Pflanzen, unter anderem Reis, Weizen, Arabidopsis, usw. gefunden
werden, wobei sie in natürlicher Form
vorliegen können
oder andernfalls auch das Ergebnis eines Gentransformationsverfahrens
sein können, wobei
der transformierte Organismus die DNA-Moleküle reproduziert. Das erfindungsgemäße DNA-Molekül kann durch
herkömmliche
Techniken aus der DNA jeder Pflanze, die es enthält, durch die Ver wendung von Sonden
oder Oligonucleotiden isoliert werden, die dank der in dieser Erfindung
bereitgestellten Nucleotidsequenzinformation des DNA-Moleküls hergestellt
werden.
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Das
erfindungsgemäße DNA-Molekül schließt Fragmente
davon ein, welche die TGase-Aktivität aufweisen.
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In
einer besonderen Ausführungsform
handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen DNA-Molekül um ein
DNA-Molekül
von Mais mit der SEQ ID NO: 1 oder mit der SEQ ID NO: 3.
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Das
erfindungsgemäße DNA-Molekül kann im
Allgemeinen bei der Erzeugung eines Expressionsvektors, hierin nachstehend
erfindungsgemäßen Expressionsvektors,
verwendet werden, der eine Expression dieser Proteine mit TGase-Aktivität in einer
großen
Auswahl von Wirtszellen gestattet. Im Allgemeinen umfasst der erfindungsgemäße Expressionsvektor
mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz
und mindestens einen Promotor, der die Transkription des Gens von
Interesse steuert, mit dem er funktionell verbunden ist, und andere
Sequenzen, die zur Transkription des Gens von Interesse und seiner
geeigneten Regulation bezüglich Zeit
und Ort notwendig und angemessen sind, zum Beispiel Signale zum
Anfangen und zur Termination, Schnittstellen, Polyadenylierungsstellen,
einen Replikationsursprung, transkriptionelle Enhancer, transkriptionelle
Silencer usw. Beispiele für
geeignete Expressionsvektoren können
in Übereinstimmung
mit den Bedingungen und dem Bedarf jedes spezifischen Falles unter
Plasmiden, künstlichen
Hefechromosomen (YACs), künstlichen
Bakterienchromosomen (BACs), künstlichen
Chromosomen, die auf dem Bakteriophagen P1 beruhen (PACs), Cosmiden
oder Viren ausgewählt
werden, die auch einen bakteriellen oder Hefe-Replikationsursprung
enthalten können,
so dass er in Bakterien oder Hefen amplifiziert werden kann, sowie
einen Marker, der verwendet werden kann, um transfizierte Zellen
zu selektieren, bei dem es sich um einen anderen als das Gen oder
die Gene von Interesse handelt. Deshalb bezieht sich die Erfindung
auch auf einen Vektor, der ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül umfasst.
Die Auswahl des Vektors hängt
von der Wirtszelle ab, in die der Vektor später eingeführt wird. Zum Beispiel kann
es sich bei dem Vektor, in den die DNA-Sequenz eingeführt wird,
um ein Plasmid handeln, dass, wenn es in eine Wirtszelle eingeführt wird,
in das Genom der Zelle integriert und zusammen mit dem Chromosom
der Wirtszelle repliziert wird.
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Der
erfindungsgemäße Vektor
kann durch herkömmliche,
Fachleuten bekannte Verfahren erhalten werden (Kovesdi et al. 1997.
Curr Opin Biotech 8: 583–589.
Transgenic Res. 10: 83–103;
Coffin et al. 1998. Retroviruses, CSHLP; Robbins et al. 1998. Trends Biotech.
16: 35–40;
Anderson. 1998. Nature 392: 25–30; Schindelhauer.
1999. BioEssays 21: 76–83).
Eine besondere Aufgabe der Erfindung umfasst die Plamide pGEMT15
und pGEMT21, welche die SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO:
3 enthalten.
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Die
Erfindung stellt auch eine Zelle bereit, die ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül oder einen
erfindungsgemäßen Expressionsvektor
umfasst. Bei Wirtszellen, die mit dem Expressionsvektor transformiert
werden können,
kann es sich zum Beispiel um GRAS-Bakterienzellen und -Hefen handeln.
Die Zellen, die den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthalten
können
zur Überproduktion
von Proteinen mit TGase-Aktivität
verwendet werden, die durch die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle kodiert
werden. Eine besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist unter
anderem ein Protein, das TGase-Aktivität aufweist, mit einer wie in SEQ
ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 beschriebenen Aminosäuresequenz.
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Diese
Ergebnisse gestatten die Erzeugung neuer Möglichkeiten, um ein GRAS (Generally
Recognized as Safe) Bakteriensystem oder eine Hefe zu transformieren,
die nützlich
sein würden,
um durch heterologe Expression die angeführten neuen TGase-Proteine
herzustellen. Wie vorstehend angegeben wurde, kann ein Protein mit
TGase-Aktivität
dank seiner Fähigkeit,
kovalente Bindungen zwischen verschiedenen Proteinen zu erzeugen,
in vielfachen Nahrungsmittelbearbeitungs-, -verarbeitungs und -umwandlungsverfahren
verwendet werden. Dieses Kennzeichen ist zum Beispiel verwendet
worden, um die Struktur von Nahrungsmitteln wie zum Beispiel Fisch
und Fleisch zu erhalten, was den Bedarf, Salze zu verwenden, verringert,
siehe US-Patent
US 5928689 „Method
for treating PSE meat with transglutaminase",
WO
0162888 „Improved
composition of marine product";
zum Herstellen von Gelatinen mit unterschiedlicher Dichte; zum Herstellen
vorgekochter Nahrungsmittel mit weniger Fett (Tofu), siehe
US 6342256 „Tofu products
excellent in freeze resistance and process for producing the same",
US-6042851 „Process for producing packed
tofu". Es ist auch
möglich,
die Konsistenz, Elastizität,
Feuchtigkeit oder Viskosität
eines Produktes bei verschiedenen Temperaturen zu erhalten. Auf ähnliche
Weise wird es in verschiedenen in einer Molkerei verarbeiteten Nahrungsmitteln
verwendet: Käse (
US-6270814 „Incorporation
of whey into process cheese",
Anmeldung
US 20010053398 „Cheese
whey Protein having improved texture process for producing the same
and use thereof"),
Joghurt, Speiseeis, Mayonnaise, Saucen und beim Herstellen von Nudeln
(
EP-0948905 „Enzyme
preparations comprising transglutaminase and process for producing
noodles",
US-6106887 „Process
for obtaining a modified cereal flour), für Schokolade (
US-6063408 "Process for producing chocolate"), für Produkte,
die von Kartoffeln abgeleitet sind (
US-Anmeldung 20020004085 „Methods
for producing potato products"),
von Zucker (
JP 200354498 „Production
of sugar from cereal flour material by transglutaminase treatment"). Die verschiedenen
Verwendungen, die unter anderem in den vorhergehenden Patenten für TGasen
beschrieben worden sind, sind Beispiele für die möglichen Verwendungen der erfindungsgemäßen TGasen.
Deshalb ist eine besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung die
Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen
mit TGase-Aktivität,
unter anderem der Proteine SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4, oder Lösungen,
die sie enthalten, bei der Nahrungsmittelbearbeitung, -verarbeitung
und -umwandlung. Hierin wird nachstehend der Übersichtsartikel von Chiya
Kuraishi et al., 2001 (Transglutaminase: Its utilization in the
food industry. Food Reviews International 17 (2): 221–246) als
ein Beispiel für
die Verwendungen der erfindungsgemäßen Proteine mit TGase-Aktivität angegeben.
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Schließlich gibt
es andere Verwendungen, die sich von denjenigen der erfindungsgemäßen Proteine mit
TGase-Aktivität,
die vorstehend kommentiert wurden, unterscheiden, und von denjenigen,
die als eine Veranschaulichung der Verwendungen angegeben werden,
gibt es die folgenden Patente, unter anderem: „Method for enzymatic treatment
of wool"
US-Patentanmeldung Nr. 161824 (1998)
MacDevitt et al., April 2000; „Enzymatically
Protein encapsulating oil particles by complex coacervation" Anmeldung Nr.
791953 (1997). Soper, Jon
C. et al. März
2000; „Crosslinked
gelatin gels and method of making them" Anmeldung Nr.
641463 (1996). Bishop, P. D. et al.
ZymoGenetics, Inc. (Seattle, EA, USA); „Process for obtaining a modified
cereal flour" Anmeldung
Nr.
977575 Ajinomoto
Co. Inc. (Tokyo, Japan). Yamazaki et al. August 2000; „Microbial
transglutaminase, their production and use" Anmeldung Nr.
294565 (1999). NovoNordisk NS (Bagsvaerd,
DK) Bech et al. Feb. 2001.
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Außerdem kann
das erfindungsgemäße DNA-Molekül oder der
erfindungsgemäße Expressionsvektor bei
genetischen Transformationsverfahren für Pflanzen zur Grundlagenforschung
sowie zur Entwicklung transgener Pflanzen mit neuen Fähigkeiten
verwendet werden, die durch die Manipulation von Funktionen, die
der TGase zugeschrieben werden (Pflanzenwachstum und -entwicklung,
Morphogenese, Photosynthese und Zelltod), durch Ändern der Expression der Proteine
hergestellt werden.
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BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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1. – TGase-Aktivität (gemessen
in pmol eingebautes Put) eines Proteinextrakts, der jedem der Produkte
einer Phagenlyse entspricht, die im Methodikteil beschrieben wird,
den positiven Phagen f1 und f2 (die jeweils eine andere cDNA für Mais-TGase enthalten:
f1 = SEQ ID NO: 1 und f2 = SEQ ID NO: 3) und dem negativen Phagen
f3 (der keine cDNA für
TGase enthält)
entsprechend. Außerdem
wird die Wirkung von verschiedenen Faktoren, welche die TGase-Aktivität der Extrakte
beeinflussen, die in anderen System als der enzymatischen TGase-Aktivität innewohnend
beschrieben werden, gezeigt: Calcium = der Proteinextrakt in Abwesenheit
von Calcium. GTP = Zugabe von 1 mM GTP. MDC = Zugabe von 1 mM MDC.
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2. – Aktivität der beiden
Proteinextrakte, die den beiden unabhängigen Phagen entsprechen, welche
die beiden cDNAs für
TGase enthalten (f1 = SEQ ID NO: 1; f2 = SEQ ID NO: 2) mit Bezug
auf einen Phagen, der keine dieser cDNAs enthält (f3), mit Bezug auf die
Proteinmenge des Tests. Die Aktivität wird in Millieinheiten (mU)
TGase gemessen, indem Biotincadaverin eingeschlossen wird, wie im
Methodikteil beschrieben ist. a = 40 mg Protein/ml. b = 60 mg Protein/ml.
c = 80 mg Protein/ml.
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BEISPIELE DER ERFINDUNG
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Beispiel 1. – Isolieren und Klonieren von
zwei cDNAs, die zwei Proteine der Familie von Mais-Transglutaminasen
kodieren, mittels Immunoscreening
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Expressionsbank
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Die
cDNAs der vorliegenden Erfindung wurden aus einer cDNA-Expressionsbank
in Lambda-ZAPII® isoliert,
die aus EcoRI und XhoI-Zielmolekülen
hergestellt wurde, beginnend mit einer messenger-RNA von zwei Wochen
alten Zea mays subsp. mays Pflänzchen,
wachsend als Homozygot B73, die man unter Gewächshausbedingungen wachsen
ließ (geschenkt
von Dr. Alice Barkan von der University of Oregon, USA).
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Beim Immunoscreening verwendeter Antikörper
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Eine
pflanzliche Transglutaminase mit 58 kDa, die mit Extrakten von Chloroplasten
aus Helianthus tuberosus Blättern
gereinigt wurde, wurde als Antigen verwendet. Ein polyklonaler Antikörper wurde
in einem Huhn erhalten (Villalobos, E., Torné, J. M., Ollés, C.,
Claparols, I. & Santos,
M. A. 2001. Subcellular localization of a transglutaminase related
to grana development in different maize cell types. Protoplasma.
216: 155–163). Die
Spezifität
des Antikörpers
wurde durch die Dot-Blot-Technik unter Verwendung von kommerzieller
Schweineleber-Transglutaminase, sowie durch Western-Blot mit gereinigtem
Protein bestimmt (Dondini, L. 1998. „Poliammine legate e transglutaminasi
nelle plante" Doktorarbeit.
Universität
Bologna, Italien). Eine Titration wurde durch die Western-Blot-Technik
ausgeführt.
(Die vollständige
Methodik wird ausführlich
spezifiziert in Villalobos, E., Torné, J. M., Ollés, C.,
Claparols, I. & Santos,
M. A. 2001. Subcellular localization of a transglutaminase related
to grana development in different maize cell types. Protoplasma.
216: 155–163)
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Immunoscreening der Bank
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Sobald
der Titer der verwendeten Bank bekannt ist, wird eine Kolonie des
Stammes XL-Blue® in
flüssiges
LG-Medium, das MgSO4 (1 M) und 20% Maltose
enthält,
angeimpft.
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Nachdem
man die Bakterien wachsen lässt,
bis eine OD von 2,0 (600 nm) erreicht ist, wird ein Gemisch der
Bakterienkultur mit 4,5 × 104 pfu der Bank hergestellt, zu dem 10 mM
IPTG zugegeben wird. Nach dem Infizieren und Animpfen von Petrischalen
mit dem LB-Kulturmedium
+ 10 mM MgSO4 wird eine mit 10 mM IPTG gesättigte Nitrocellulosescheibe über sie
gelegt. Nach 4 Stunden langem Inkubieren der Petrischalen mit dem
Filter werden sie gekühlt
und der Filter wird mit PBS gewaschen. Schließlich wird die Membran, sobald sie
mit fettarmer Milch oder BSA blockiert worden ist, mit einem Antikörper entwickelt
und markiert. Um Lyse nachzuweisen, wo die positiven Phagen, die
mit dem gegen H. tuberosus Transglutaminase gerichteten Antikörper in
Wechselwirkung getreten sind, gefunden werden, wird eine Western-Blot-Analyse
der Membran durchgeführt
und sie wird durch das ECL-Reagens auf einer photographischen Platte
entwickelt.
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In-vivo-Exzision von Phagemids in pBluescript
SK- und Selektion positiver Kolonien
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Sobald
die beiden Phagen, welche die cDNAs enthalten, die jeweils ein Protein
kodieren, das mit dem Antikörper
in Wechselwirkung tritt, isoliert und gereinigt worden sind, werden
sie dann durch den „ExAssistTM Interference-Resistant Helper Phage (Stratagene)" ausgeschnitten.
Das Koinfizieren wird in XL1-Blue-Stämmen durchgeführt, und
das Infizieren wird in XLOLR®-Stämmen durchgeführt. Ausplattieren
wird in einem selektiven Medium durchgeführt, das der verwendete Vektor
bestimmt (pBluescript). In unserem Fall handelt es sich bei dem
Kulturmedium, das transformierende Kolonien auswählt um LB-Agar, zu dem Ampizillin
(50 μg/ml),
1 mM IPTG und das Substrat des Enzyms β-Galactosidase, X-Gal (40 μg/ml), dessen
Gen durch das Insert oder die cDNA unterbrochen wird, gegeben wird.
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Isolierung von Plasmiden in kleinem Maßstab (MINIPREP)
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Für jede Exzision
wird die Isolierung der Plasmid-DNA, welche die cDNA von Interesse
enthält,
durch eine MINIPREP-Technik bakterieller Lyse in kleinem Maßstab unter
Verwendung von SDS und NaOH, Neutralisieren mit Kaliumacetat und
Reinigen mit einem Gemisch aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol
(25:24:1) und Präzipitieren
mit Ethanol ausgeführt.
Dann wird sie mit 1 × TE-Puffer
resuspendiert, der mit dem RNAse-Enzym zugegeben wird.
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Überprüfen der
Anwesenheit von cDNA im pBluescript-Vektor
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In
jedem Fall wird das Überprüfen der
Anwesenheit des Inserts in pBluescript durch Verdauen einer Probe
der Plasmid-DNA durchgeführt,
die mit den gleichen Endonucleaseenzymen erhalten wird, mit denen die
Bank hergestellt wurde (EcoRI und XhoI). Verdauen wird gemäß den Erfordernissen
jedes Restriktionsenzyms (Puffer und Temperatur) durchgeführt. Sobald
das Verdauen ausgeführt
worden ist, wird die cDNA oder das Insert aus dem Vektor freigesetzt.
Dies wird mit herkömmlicher
Elektrophorese in einem 0,5%igen Agarosegel in 1 × TBE- oder
1 × TAE-Puffer überprüft.
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Sequenzierung (Sequenzierservice des IBMB, „CSIC" von Barcelona)
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Sobald
die Proben der Minipräparate,
welche die cDNAs von Interesse enthalten, identifiziert worden sind,
was in unserem Falle ergab, dass es zwei waren, werden sie präzipitiert
und vor dem Sequenzierverfahren durch Verwendung des Gemisches von
Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol und reinem Chloroform gereinigt.
Die zu sequenzierenden Proben wurden in Wasser aufgelöst.
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Bestimmung der vollständigen kodierenden
Sequenz durch die RACE-Technik
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Die
Exzisionen der beiden Phagen in pBluescript SK- machten es möglich, zwei
partielle cDNAs zu erhalten, deren vollständige kodierende Sequenz durch
die RACE-Technik definiert wurde. Zu diesem Zweck wird aus der aus
dem Maisblatt entnommenen Gesamt-RNA durch eine polydT-Säule gereinigte
messenger-RNA erhalten, die als Matrize für die Synthese einzelsträngiger DNA
verwendet wird. Um dies zu tun, wird ein spezifisches, aus der bekannten
cDNA-Sequenz abgeleitetes Oligonucleotid (Oligo E1, 3'-5': GATTCTCCCTGATAAG,
SEQ ID NO: 5) und das Enzym reverse Transkriptase verwendet. Nach
Zufügen
eines polyT-Schwanzes an die einzelsträngige DNA durch das Enzym terminale
Desoxytransferase (TdT) wurde dann die zweite DNA-Kette erhalten.
Dies wird durch die PCR-Technik unter Verwendung des Oligonucleotids
5' RACE Abridged
Anchor Primer (GIBCO BRL®), das für DNA mit
einem polyT-Schwanz spezifisch ist (Oligo ANCHOR 5'-3': GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG,
SEQ ID NO: 6) und eines zweiten spezifischen Oligonucleotids der
partiellen cDNA mit der vorstehend spezifizierten bekannten Sequenz,
die dem Oligo E2 (3'-5': GTTCTCCAGCATCTCCAG,
SEQ ID NO: 7) entspricht, durchgeführt.
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Mit
den anschließenden
PCR-Zyklen wird die DNA vermehrt. Die Abfolge der Zyklen war die
Folgende: zuerst 2 Minuten bei 94°C
und dann 34 Zyklen von: 30 Sekunden bei 94°C für Oligo Nr. 1, aber 30 Sekunden bei
60°C für Oligo
Nr. 2, gefolgt in beiden Fällen
durch 7 Minuten bei 72°C.
Schließlich
wird sie einige Stunden lang bei 5°C gelassen.
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Das
PCR-Produkt wird unter Verwendung des Enzyms Ligase in einen geeigneten
Vektor (wie zum Beispiel pGEMT) kloniert. Dann werden E. coli-Stämme des
Typs DH5-alpha transformiert
und man lässt
die Bakterien in einem selektiven Kulturmedium wachsen. Die Plasmid-DNA
wird durch die vorstehend beschriebene Miniprep-Technik entnommen,
gereinigt, und das erhaltene Fragment wird sequenziert. In unserem
Fall erwies sich, dass das Fragment, das zum Vervollständigen der
kodierenden Sequenz benötigt
wurde, für
beide partielle cDNA-Sequenzen nur 4 Nucleotide lang war. Die vollständigen kodierenden
Nucleotidsequenzen, einschließlich
der vier Nucleotide, die durch die RACE-Technik erhalten wurden,
werden in SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO: 3 beschrieben.
Bei den Expressionsvektoren, welche die Sequenzen SEQ ID NO: 1 und
SEQ ID NO: 3 enthalten und zum Transformieren der Wirtszellen verwendet
werden, handelt es sich um die Plasmide pGEMT15 beziehungsweise
pGEMT21.
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Die
von den Nucleotidsequenzen erhaltenen Aminosäuresequenzen haben im Bereich,
der den Aminosäuren
431–474
für das
Protein von SEQ ID NO: 2 (60,97 kDa) und 485–528 für das Protein von SEQ ID NO:
4 (67 kDa) entspricht, Homologien zu den Domänen des aktiven Zentrums des
Transglutaminase-Typs von anderen beschriebenen, nicht pflanzlichen
Systemen. In beiden Fällen
wird ein Cystein (Cys), das als unentbehrliche Aminosäure für die Aktivität des Enzyms
beschrieben wird (Cys439 in SEQ ID NO: 2 und Cys493 in SEQ ID NO:
4), in diesen Bereichen gefunden. Konsultierte Datenbank: (www.ncbi.nlm.nih/).
Außerdem
werden einige Regionen von 27 Nucleotiden, die in beiden Sequenzen,
SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3, in Tandem wiederholt werden, beobachtet,
wie in den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 angegeben wird, obwohl
in verschiedenen Mengen, von 15 beziehungsweise 21 Wiederholungen,
und mit kleinen Variationen der Nucleotide bei einigen von ihnen.
Es sollte betont werden, dass diese angeführten wiederholten Regionen in
bekannten TGasen vorher nicht beschrieben worden sind. Deshalb sind
sie kennzeichnend für
das erfindungsgemäße DNA-Molekül.
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Beispiel 2. – Überprüfen der Transglutaminaseaktivität der durch
die cDNAs exprimierten Proteine.
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Bestimmung der TGase-Aktivität des durch
die cDNA exprimierten Proteins
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Mit
jedem der beiden Klone der Phagen, welche die cDNAs von Interesse
enthalten, wird eine E. coli-Kultur (Stamm XL-Blue) in flüssigem LB-Kulturmedium
infiziert, zu dem 10 mM IPTG gegeben werden. Nach einer Lyse bei
37°C wird
die Gesamtproteinkonzentration des Extrakts durch das Lowry-Verfahren
quantifiziert (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr, AL & Randall RJ. 1951.
Protein measurement with the Folin Phenol reagent. J. Biol. Chem.
193: 265–275)
und die hierin nachstehend beschriebenen Tests werden damit ausgeführt, um die
Transglutaminaseaktivität
im Gegensatz zu einem Lyseextrakt mit einem Phagen, der die cDNA
von Interesse nicht enthält,
zu bestimmen.
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1. – Verfahren
zum Nachweisen von TGase-Aktivität
durch Bestimmen der mit tritiiertem Putrescin markierten Proteine
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Mit
jedem der Lyseextrakte, die mit beiden Phagen (f1, der die TGase
von SEQ ID NO: 2 enthält,
und f2, der die TGase von SEQ ID NO: 4 enthält) erhalten werden, wird ein
Enzymextrakt in einer Gesamtproteinkonzentration von 600 μg hergestellt,
und ein Enzymtest wird 30 Minuten lang bei 30°C ausgeführt. Das Enzymgemisch enthält, neben
dem Proteinextrakt, 0,6 mM Putrescin, 185 kBq tritiiertes Putrescin
(0,85 TBq/nmol), 20 mM Tris- HCl*,
pH-Wert 8 und 3 mM CaCl2. Die Reaktion wird
mit 10% Trichloressigsäure,
die 2 mM Putrescin enthält,
blockiert. Die Proben werden mehrmals präzipitiert und die Radioaktivität des Pellets wird
gemessen (Bernet, E., Claparols, L., Dondini, L., Santos, M.A.,
Serafini-Fracassini,
D.- & Torné, J. Ma 1999: Changes in polyamine content, arginine
and ornithine decarboxylases and transglutaminase activities during
light/dark phases (of initial differentiation) in maize calluses
and their chloroplast. Plant Physio Biochem. 37(12): 899–909). Die
TGase-Aktivität
wird in pmol Putrescin pro Milligramm Protein pro Stunde gemessen, und
sie war in Bezug auf den Extrakt von einem Phagen, der keine cDNAs
für diese
TGase enthält,
in den Proteinextrakten, die von den Phagen f1 und f2 erhalten wurden,
höher.
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2. Verfahren zum Nachweisen von TGase-Aktivität durch
einen Test des Elisa- Typs
unter Verwendung von CBZ-Gln-Gly als erstem Substrat und Biotincadaverin
als zweitem Substrat.
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Dieser
Test besteht aus einem Kit, das von der Firma Covalab® bereitgestellt
wird, das aus kleinen Mengen Gesamtprotein die TGase-Aktivität der Probe
in Bezug auf eine kommerzielle Schweineleber-TGase bestimmt. Das
Verfahren weist die Glutamylderivate, die von dem Peptid und von
dem Polyaminsubstrat durch TGase-Aktivität der Probe gebildet werden,
durch einen kolorimetrischen Test nach. Die Aktivität wird in
TGase-Einheiten gemessen, wobei man berücksichtig, das 0,6 mU kommerzielle
TGase einer Absorption von 1 ± 0,05
OD bei 450 nm entspricht.
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Die
beiden Proteinextrakte, die den beiden Lyseprodukten entsprechen,
zeigen eine Aktivität
des TGase-Typs in den beiden Verfahren, die zum Nachweisen der Aktivität verwendet
und vorstehend beschrieben wurden (f1 und f2) im Vergleich zu dem
Extrakt, der von einem Phagen stammt, der keine dieser cDNAs enthält. Die
Ergebnisse werden in den 1 und 2 gezeigt.
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Außerdem zeigt 1 die
Wirkung verschiedener Faktoren auf die TGase-Aktivität der Extrakte, die als der
TGase-Enzymaktivität
innewohnend beschrieben wird. Daher verringert sich die Aktivität des exprimierten
Proteins signifikant: a] in Abwesenheit von Calcium, b] in Anwesenheit
von 1 mM GTP, c] in Anwesenheit von 1 mM Denodansylcadaverin (MDC)
und d] im Lyseextrakt mit einem Phagen, der die cDNA von Interesse nicht
hat (f3).
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Ein
Paar Kulturen der von Escherichia coli, Typ DH5α, abgeleiteten Bakterien, transformiert
mit einem Plasmid (pBluescript), das eine Mais-cDNA enthält, und
Trägern
eines Plasmids, welches das Gen enthält, welches das Protein mit
der Sequenz SEQ ID NO: 2 beziehungsweise SEQ ID NO: 4 von Mais,
identifiziert als 15TGZM02 und 21TGZM02 kodiert, sind bei der Spanischen
Typus-Kultursammlung („Colección Española de Cultivos
Tipo (CECT)"), Universität Valencia,
Forschungsgebäude,
Burjasot Campus, 46100 Burjasot, Valencia, Spanien, am 7. (?) Mai
2002 hinterlegt worden. Die ihnen zugeteilte „CECT"-Hinterlegungsnummer: 5705 für 15TGZM02
beziehungsweise 5706 für
21TGZM02. SEQUENZPROTOKOLL
